JP2007535485A - 抗体を作製するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)B細胞集団を捕捉剤に接触させるステップと、
b)捕捉されたB細胞を捕捉されていないB細胞から分離するステップと、
c)捕捉された複数のB細胞であって、培養の直前に一様なB細胞に選別されていない複数のB細胞を培養するステップと、
d)複数の培養細胞をスクリーニングして、所望の機能を有する抗体を産生することができる細胞を同定するステップと、
e)それらから所望の抗体を得るステップ
とを含む、所望の機能を有する抗体を得る方法が提供される。
a)B細胞集団を捕捉剤に接触させるステップと、
b)捕捉されたB細胞を捕捉されていないB細胞から分離するステップと、
c)捕捉された複数のB細胞を培養するステップであって、前記B細胞は培養の直前には単一のB細胞に選別されておらず、且つ、前記B細胞が一連の単位容器で培養されるステップと、
d)少なくとも1つの単位容器の内容物をスクリーニングして、それにより所望の機能を有する抗体を産生できる細胞の有無に関して陽性な少なくとも1つの単位容器を特定するステップと、
e)前記単位容器内の細胞から直接的又は間接的に所望の抗体を得るステップ
とを含む、所望の機能を有する抗体を得る方法を提供する。
a)B細胞集団を捕捉剤が結合されている一連の単位容器に接触させるステップと、
b)捕捉剤に結合しないB細胞を単位容器から除去する一方で、捕捉剤に結合しているB細胞を保持するステップと、
c)好ましくはクローン増殖に適した条件下で、捕捉された複数のB細胞を、それらが保持されている単位容器中で培養するステップと、
d)少なくとも1つの単位容器の内容物をスクリーニングして、それにより所望の機能を有する抗体を産生できる細胞の有無に関して陽性な少なくとも1つの単位容器を特定するステップと、
e)前記単位容器から直接的又は間接的に所望の抗体を得るステップ
とを含む、所望の機能を有する抗体を得る方法が提供される。
i)前述した、所望の機能を有する抗体又はその構成部分をコードする遺伝子を単離する方法と、
ii)所望の機能を有する抗体又はその構成部分をコードする遺伝子を含むベクターであって、その方法は前述されているベクターと、
iii)所望の機能を有する抗体又はその構成部分をコードする遺伝子で形質転換させた宿主細胞及びその子孫細胞であって、その方法は前述されている宿主細胞及びその子孫細胞と、
iv)iii)に記載の宿主細胞を培養するステップと宿主細胞により産生された抗体を得るステップとを含む、所望の機能を有する抗体を得る方法
とを含む。
固相化精製マウス共刺激分子上でのパンニング
ウサギにマウス共刺激分子−ラットCD4融合タンパク質を3週間間隔で4回皮下注射して免疫化し、末梢血液B細胞をLymphocyte−Rabbit CL−5050(Cedarlane Laboratories社)の単核球画分中で調製した。
以下のウェルを、さらに処理するために選択した。即ち、0.2mlに等価な血液プレートから得たA2、E3、F2、及びG6、並びに、1.0mlに等価な血液プレートから得たD6、F4、G3、及びH6(それぞれ1〜8の番号を付与した)。細胞培養プレートを−80℃のフリーザーから取り出し、100μlの温かい培地(1〜6%T細胞馴化培地を含むDMEM又はRPMI)を数回変え、穏やかに上下にピペッティングすることによってウェルを解凍した。細胞懸濁液を滅菌エッペンドルフ管に加え、次に、卓上型遠心分離機において2000rpmで1分間遠心し、180°回転させ、もう一度遠心した(これは、堅い沈殿物の形成に役立つ)。上清を取り除き、10μlの新鮮な培地(1〜6%T細胞馴化培地を含むDMEM又はRPMI)に沈殿物を再懸濁した。次に、PCR用にこれを2.5μlの分量4つに分割した。次に、MJ Research RobusT RT−PCRキット(カタログNo.F−580L)により、抗体の可変領域の遺伝子を単離するために試験管1本につき以下の混合物を使用して、1回目のRT−PCRを実施した。
μl
DEPC水 35.5
10倍緩衝液 5
dNTPS 1
10%NP−40 2.5
RNAasin(Promega社 カタログ#N2511) 0.5
RT 1
ポリメラーゼ 2
1回目用プライマーミックス (各プライマー10μM) 1
プライマーは、共通リーダー配列及び定常領域配列に基づいた。
MgCl2 1.5
合計体積: 50
PCRプログラム:
1.50℃ 30分
2.94℃ 2分
3.94℃ 1分
4.55℃ 1分
5.72℃ 1分
6.ステップ3に戻り合計40サイクル
7.72℃ 5分
8.4℃ 保管
次に、この反応物の1μlを用いて、KOD HiFi hot start kit(Novagen社、カタログNo.71086−3)、及び可変領域を増幅するための特有の制限部位を含むネスティッドプライマーを用いる2回目のPCR反応に、分離したVH及びVκを供給した。試験管1本につき以下の混合物を調製した。
μl
滅菌H2O 17.75
10倍KOD PCR緩衝液 2.5
KOD HiFi hot start 0.5
NTPs(2mM) 2.5μl
2回目用Primer Mix、Vk又はVH(各プライマー10uM)
0.75
MgSO4(25mM) 1
合計体積: 25
PCRプログラム
VH Vκ
1.96℃ 2分 1.96℃ 2分
2.96℃ 15秒 2.96℃ 15秒
3.68℃ 20秒 3.68℃ 5秒
4.ステップ2に戻る 合計40サイクル 4.ステップ2に戻る 合計40サイクル
5.4℃ 保管 5.4℃ 保管
Qiagen Qiaquick 8 PCR精製キット(カタログNo.28144)を用いてPCR断片を精製し、60μlの溶出緩衝液中に溶出させた。VH断片をXhoI及びHindIIIで消化し、発現ベクターpMRR14(ヒトγ4CH1、2及び3を含む哺乳動物の発現構築物)中にクローニングした。Vκ断片をBsiWI及びHindIIIで消化し、pMRR10.1(ヒトCκを含む哺乳動物の発現構築物)中にクローニングした。どちらの発現ベクターもWO/03093320に記載されている。これにより、ウサギ−ヒトキメラ抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子が形成される。8個のウェルのそれぞれから得た8倍量のVHクローン及び8倍量のVLクローン(形質転換された個々のコロニーから得たプラスミドDNA)を配列決定し、ウェル内でアライメントを行った。
5日発現させた後、CHO培養上清を回収し、IgGの有無及びマウス共刺激分子を結合するそれらの能力について検定した。
抗ヒトFc抗体で被覆した「BIAcore(登録商標)」チップ上で、CHO培養上清から得た組換えIgGを捕捉した。次に、マウス共刺激分子をチップに加え、親和性を測定した(表2)。この結果から、本発明の方法を使用すると、僅か2枚のマイクロタイタープレートをスクリーニングすることにより、高親和性抗体の一団を直接単離できることが明らかである。
固相化精製ヒトIL−17上でのパンニング
ラットにヒトIL−17を3週間間隔で4回腹腔内注射して免疫化し、脾臓から単一の細胞懸濁液を調製した。
Superscript III逆転写酵素(Invitrogen社)、並びにCH1、Cκ、及びCλに特異的なアンチセンスプライマーを用いて、選択した2つのウェルから得た細胞から相補DNAを直接合成した。反応混合物にNP−40(Calbiochem社)及びRNasin(Promega社)を補充し、50℃で60分間合成を行った後、70℃で15分間、変性ステップを行った。
抗Fab抗体で被覆した「BIAcore(登録商標)」チップ上で、CHO培養上清から得た組換えIgGを捕捉し、IL−17を液相に移し、親和性を測定した(表4)。どちらのクローンも高い親和性を示した。この実施例はさらに、本発明の方法を使用することにより、この場合ではただ1枚のマイクロタイタープレートから、高親和性抗体の一団を直接且つ簡単に得ることができることを実証している。
細胞で発現される抗原(マウス共刺激分子)上でのパンニング
ウサギにマウス共刺激分子−ラットCD4融合タンパク質を3週間間隔で4回皮下注射して免疫化し、末梢血液B細胞をLymphocyte−Rabbit CL−5050(Cedarlane Laboratories社)の単核球画分中で調製した。
Claims (28)
- a)B細胞集団を捕捉剤に接触させるステップと、
b)捕捉されたB細胞を捕捉されていないB細胞から分離するステップと、
c)捕捉された複数のB細胞であって、培養の直前には一様なB細胞に選別されていない複数のB細胞を培養するステップと、
d)複数の培養細胞をスクリーニングして、所望の機能を有する抗体を産生することができる細胞を同定するステップと、
e)それらから所望の抗体を得るステップ
とを含む、所望の機能を有する抗体を得る方法。 - 前記分離ステップがパンニングであり、前記捕捉された細胞をパンニング後に直接培養する、請求項1に記載の方法。
- 前記分離ステップがFACSによる細胞選別であり、前記細胞を培養前にプールする、請求項1に記載の方法。
- 前記B細胞を捕捉するのにビーズを使用し、前記捕捉された細胞を培養前にプールする、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉剤が抗原である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 一連の単位容器を用いてパンニングを実施することにより、前記捕捉された細胞を前記単位容器中に保持し、続いてその中で培養する請求項2に記載の方法。
- 一連の単位容器中に前記細胞を播種し、その中で培養する方法であって、少なくとも2個の細胞を各単位容器中に播種する、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記単位容器にそれぞれ5〜50個の細胞を播種する、請求項7に記載の方法。
- ステップc)が、目的抗原の存在下で細胞を培養することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ステップc)が、クローン増殖に適した条件下で細胞を培養することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 単位容器中で前記捕捉された細胞を培養し、ステップd)が、単位容器(複数を含む)中に存在する培養上清をスクリーニングすることにより、所望の機能を有する抗体を産生する細胞の存在について少なくとも1つの前記単位容器を検定することを含むことを要求する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 検定を実施して、目的抗原に対して高親和性の抗体を産生する細胞の存在に関して陽性である単位容器を特定する、請求項11に記載の方法。
- 単位容器中で前記捕捉された細胞を培養し、ステップe)において、その内容物がクローンである1つの単位容器から所望の抗体を得ることを要求する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 単位容器中で前記捕捉された細胞を培養し、ステップe)において、所望の機能を有する抗体を産生する細胞の存在に関して陽性と特定される単位容器から、前記単位容器中に存在する細胞又はその子孫細胞を培養することによって、前記抗体を得ることを要求する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 単位容器中で前記捕捉された細胞を培養し、ステップe)において、所望の機能を有する抗体を産生する細胞の存在に関して陽性と特定される1つの単位容器から、抗体又はその構成部分をコードする遺伝子(複数)を単離し、それら(又はそれらの改変型)を宿主細胞中で発現させることによって、前記抗体を得ることを要求する、請求項1から13までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体又はその構成部分をコードする遺伝子(複数)の単離が、前記抗体又はその構成部分をコードする遺伝子(複数)を増幅することを含む、請求項15に記載の方法。
- 増幅を、前記所望の機能を有する抗体を産生する細胞の有無に関して陽性と特定される1つの単位容器中に存在している、細胞又はその子孫細胞に対して直接行う、請求項16に記載の方法。
- 増幅の前に核酸の回収ステップがある、請求項16に記載の方法。
- 前記所望の機能を有する抗体を産生する細胞の存在に関して陽性と特定される単位容器から得た培養上清を使用して増幅を行う、請求項16、17、又は18に記載の方法。
- 前記抗体(又はその構成部分)のアミノ酸配列を決定し、それから前記抗体又はその構成部分をコードする核酸配列を推定することによって、前記抗体又はその構成部分をコードする前記遺伝子(複数)を単離する、請求項15に記載の方法。
- 前記抗体又はその構成部分をコードする前記遺伝子(複数)を発現前に改変する、請求項15から20までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉剤がIL−17である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記請求項のいずれか一項に記載の方法によって得られる抗体。
- 前記抗体が200pM、100pM、75pM、50pM、25pM、又は1pmol以下の親和性を有する、請求項23に記載の抗体。
- 前記抗体の解離速度(off rate)が1×106s−1未満である、請求項24に記載の抗体。
- 前記抗体が細胞表面で発現される抗原に対する抗体である、請求項23から25までのいずれか一項に記載の抗体。
- 疾患関連抗原に対する抗体である、請求項23から26までのいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項23から27までのいずれか一項に記載の2種以上の抗体を含む一団。
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