JP2003530543A - 検出試薬としてのヒト抗体 - Google Patents

検出試薬としてのヒト抗体

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Abstract

(57)【要約】 本発明はヒト抗体を用いたインビトロ検出法を提供する。本方法はHAMAまたは異好性抗体を含むヒト試料を解析するために特に有用である。ヒト抗体は試料中に存在するHAMAまたは異好性抗体に結合することなくそのような試料中の分析物に結合することが可能である。本方法は、サンドイッチ形式を用いて、他のものの間で実施することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願の相互参照 本出願は1999年12月6日に出願された米国特許出願第09/456,090号の一部継続
出願である。
【０００２】 背景 治療的用途においてヒト抗体がマウス抗体より優れていることは長い間認識さ
れてきたが、インビトロ診断においては逆が当てはまると考えられている。ヒト
およびマウス抗体の認識されている異なる役割は、その特性および調製法の差異
を反映している。マウス抗体に対するヒト抗体の現在までに認識されている最も
重要な利点は、患者に投与された場合に、ヒト抗マウス（HAMA）応答が欠如して
いること、インビボ半減期がより長いこと、およびヒト補体とより良い相互作用
を行うことである。これらの利点は全て、治療的用途においてマウス抗体に対す
るヒト抗体の優位点を説明するが、いずれもインビトロ診断試薬として抗体を使
用することにおいては重要ではない。
【０００３】 ヒト抗体に対するマウス抗体の重要な利点の1つは、単離が容易であることで
ある。近年のヒト抗体生産法の改良にもかかわらず、特にスクリーニングされな
ければならない抗体の全範囲の中で所望の抗体が僅かにしか提示されていない場
合には、一般的に、ヒト抗体よりもマウス抗体を生産することがより簡便である
と依然として考えられている。マウス抗体の別の利点は、マウス抗体の定常領域
が、検出部分として典型的にはヤギなどの他の種から調製された標識抗マウス抗
体を用いて検出可能なことである。そのような抗体は、試料中に存在するヒト抗
体に結合することなくマウス抗体に特異的に結合する。二次標識部分を使用する
ことにより、ヒト組織試料中の分析物を検出するための有用な形式が提供される
。ヒト定常領域に対する抗体は、試料中のヒト抗体に反応することにより偽陽性
を生じると考えられることから、同様な形式をヒト抗体に使用することができな
い。単離の容易さと二次標識部分を用いた検出の互換性のため、ならびにHAMA応
答の生成、インビボ半減期、および補体活性化などの特性がインビトロ診断目的
においては無関係であるために、ヒト抗体を事実上または完全に排除して、マウ
ス抗体はインビトロ診断に使用されてきた。
【０００４】 マウス抗体は現在、診断試薬として広範に使用されているが、そのような抗体
がヒト試料中の分析物を検出するために使用される場合に、問題がいくつか生じ
ている。いくつかのヒト試料において、試料中にHAMAまたは異好性抗体が存在す
るために偽陽性または偽陰性結果が得られている。試料を獲得された患者が（診
断に用いられたマウス抗体とは無関係の）マウス抗体を用いて以前治療されたこ
と、またはマウス抗原に環境上で暴露されたことにより、HAMA抗体はヒト試料中
に存在する可能性がある。数人の患者においては、異好性抗体はエプスタイン-
バーウイルス（Epstein-Barr virus）等のある種の病原体感染への応答として存
在する。試料中のHAMAまたは異好性抗体のいずれかは、診断試薬として使用され
たマウス抗体に結合することによって、偽陽性シグナルを生じることがある。サ
ンドイッチアッセイ形式においては、他の形式でそうであるように、HAMAまたは
異好性抗体は固定化抗体と溶液抗体と間で架橋を形成することによって、偽陽性
を生じることがある。または、サンドイッチアッセイ形式においては、HAMAまた
は異好性抗体は溶液抗体に結合することなく固定化抗体に結合し（またはその逆
）、それにより固定化抗体および溶液抗体が分析物を介して互いに架橋を形成す
ることを阻止し、したがって偽陰性を生じることがある。結論として、診断試薬
としてマウス抗体を用いる、ヒト臨床試料に対して実施される有意な数のアッセ
イ法は不正確な結果を生じる。
【０００５】 1999年12月1日に出願されたタウンセンド＆タウンセンド＆クルー-（Townsend
and Townsend and Crew）ドケット番号020015-000110、1999年10月2日に出願さ
れた米国特許出願第60/157415号、1998年4月3日に出願されたPCT98/06704号、19
97年4月4日に出願された米国特許出願第08/835,159号、および1997年4月4日に出
願された米国特許出願第08/832,985号は関連した主題に向けられたものであり、
全ての目的のために各々はその全体が参照として組み入れられる。
【０００６】 発明の概要 本発明はヒト抗体を用いた分析物の検出法を提供する。そのような方法は、試
料と支持体に固定されたヒト抗体とを接触させる段階であって、抗体が分析物に
対して少なくとも108M-1の親和性を有する段階、および分析物に対するヒト抗体
の結合を検出して、試料中の分析物の存在および/または量を示す段階を包含す
る。いくつかの方法では、ヒト抗体は少なくとも1010M-1または1011M-1の結合親
和性を有する。いくつかの方法では、支持体が複数の異なるヒト抗体を有し、異
なるヒト抗体が支持体上で既知の異なる位置を占有している。いくつかの方法で
は、試料と複数の支持体に固定された複数のヒト抗体とを接触させ、ヒト抗体の
それぞれが少なくとも108M-1の親和性を有し、且つ検出段階が少なくとも2つの
分析物に対する少なくとも2つのヒト抗体の結合を検出して、試料中の分析物の
存在および/または量を示す段階を含む。いくつかの方法では、ヒト抗体は標識
されている。いくつかの方法では、ヒト抗体は標識されず、検出段階が質量分析
法または表面プラズモン共鳴により実施される。いくつかの方法では、試料が検
出すべき非標識型分析物と標識型分析物とを含み、且つ検出段階が標識型分析物
に対するヒト抗体の結合を検出し、結合の程度が試料中の非標識型分析物の量と
反比例する。いくつかの方法では、ヒト抗体が標識されており、試料が検出すべ
き試験型分析物とヒト抗体に対する結合に対して試験型分析物と競合する対照型
分析物とを含み、且つ検出段階が試験型分析物に対する標識抗体の結合を検出す
る。いくつかの方法では、試料と、溶液中のヒト抗体、固定化ヒト抗体、および
同一の分析物の異なるエピトープに結合する溶液中のヒト抗体とさらに接触させ
、且つ検出段階が分析物に対する固定化ヒト抗体および/または溶液中のヒト抗
体の結合を検出する段階を含む。いくつかの方法では、検出段階が、試料中の少
なくとも2つの分析物に対する少なくとも2つの抗体の結合を検出する段階を含む
。いくつかの方法では、試料が、第1の標識によって標識された異なる分析物を
有する第1の試料と、第2の標識によって標識された異なる分析物を有する第2の
試料との混合物であって、且つ検出段階が、複数の抗体に結合した第2の標識に
対する第1の標識の比を検出して、第1および第2の試料中に存在する分析物の量
の比を示す段階を含む。いくつかの方法では、ヒトにおいて500ngまたは100ng未
満である。いくつかの方法では、複数のヒト抗体が、試料中に存在する可能性を
有する異なる分析物に対して特異的親和性を有する少なくとも100個の異なる抗
体を含む。いくつかの方法では、複数のヒト抗体が、試料中に存在する可能性を
有する異なる分析物に対して特異的親和性を有する少なくとも1000個の異なる抗
体を含む。いくつかの方法では、異なる分析物に対する異なる抗体の特異的親和
性が互いに10倍以内である。いくつかの方法では、試料がヒト被検者に由来する
試料である。いくつかの方法では、試料がHAMAおよび/または異好性抗体を含む
。
【０００７】 本発明はさらに、異なる対応する分析物に対してそれぞれ少なくとも108M-1の
親和性を有し、1つまたは複数の支持体上で既知の異なる位置を占有する複数の
ヒト抗体を提供する。1つの態様において、同一の支持体上で既知の異なる位置
を占有する、異なる抗体である請求項20に記載の複数のヒト抗体である。選択的
には既知の位置は0.01cm2、0.001cm2、0.0001cm2、0.00001cm2または0.0000001c
m2未満の面積を占有する。
【０００８】 本発明はヒト以外の種に由来する抗体に特異的に結合するヒト抗体を含むヒト
試料中において分析物を検出する方法を提供する。そのような方法は、試料とヒ
ト抗体とを接触させる段階を包含する。ヒト抗体は、ヒト以外の種に由来する抗
体（例えば試料中に存在するHAMAまたは異好性抗体）に特異的に結合するヒト抗
体に特異的に結合することなく、分析物と特異的に結合する。その後、ヒト抗体
と分析物との結合が検出される。いくつかの方法では、試料と支持体に固定され
た第1のヒト抗体および溶液中の第2のヒト抗体とを接触させ、第1および第2のヒ
ト抗体が分析物上の異なるエピトープに結合し、且つ検出段階が分析物に対する
第1および/または第2のヒト抗体の結合を検出する。そのような方法では第2の抗
体は典型的には標識されている。いくつかの方法では、試料と支持体に固定され
たヒト抗体の第1の集団、および溶液中のヒト抗体の第2の集団とを接触させ、第
1および第2の集団に由来する構成因子が分析物上の異なるエピトープに結合する
。
【０００９】 そのような方法で使用されるヒト抗体は、典型的には分析物に対して少なくと
も108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1の親和性を有する。本方法で使
用されるいくつかのヒト抗体は、大腸菌中での組換え構築物の発現により生産さ
れる。いくつかのそのような抗体は少なくとも90％の免疫反応性を有する。
【００１０】 本発明はさらに、試料中の分析物を検出する方法を提供する。そのような方法
は、試料と固相に固定された第1のヒト抗体および溶液中の第2のヒト抗体とを接
触させる段階を含み、分析物が試料中に存在する場合に、第1および第2の抗体が
分析物の異なるエピトープに結合する。分析物の第1および/または第2の抗体に
対する結合が、その後検出される。結合は試料中に分析物が存在することを示す
。そのような方法では2次抗体は典型的には標識され、且つ検出段階は分析物に
対する第2の抗体の結合を検出する。いくつかの方法では、試料と支持体に固定
されたヒト抗体の第1の集団および溶液中のヒト抗体の第2の集団とを接触させ、
第1および第2の集団に由来する構成因子が分析物上の異なるエピトープに結合す
る。いくつかの方法では、分析物に対する第1および/または第2のヒト抗体の結
合は1時間以内に平衡に達する。
【００１１】 定義 抗体または他の結合物質と、抗原との間の特異的結合は、少なくとも106 M-1
の親和性を意味する。好ましい結合物質は、少なくとも約107 M-1、好ましくは1
08 M-1から109 M-1、1010 M-1、1011 M-1、または1012 M-1の親和性で結合する
。エピトープという用語は、抗体に特異的に結合する能力のある抗原決定基を意
味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖のような化学的に活性な表面
の基からなり、通常は特異的な3次元構造の特徴、および特異的な電荷の特徴を
持つ。コンフォメーション依存性エピトープおよび非コンフォメーション依存性
エピトープは、変性溶媒の存在下で、前者への結合は失われるが後者への結合は
失われないことで区別される。
【００１２】 基本的な抗体の構造ユニットは、四量体を含むことが知られている。各四量体
は、2つの同一のポリペプチド鎖ペアからなり、各ペアは1つの「軽鎖」（約25 k
Da）および1つの「重鎖」（約50〜70 kDa）を持つ。各鎖のアミノ末端部分には
、約100アミノ酸〜110アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸の可変領域が含まれ、
このアミノ酸は主に抗原認識の役割を果たす。各鎖のカルボキシル末端部分は、
主にエフェクターの機能を果たす定常領域を定める。
【００１３】 軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、また
はεに分類され、それぞれ抗体のアイソタイプIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEと
なる。軽鎖及び重鎖の中では、可変領域と定常領域は、約12アミノ酸またはそれ
以上のアミノ酸の「J」領域で結合され、重鎖はさらに約10アミノ酸またはそれ
以上のアミノ酸の「D」領域も含む（一般に、「基礎免疫学（Fundamental Immun
ology）」(Paul, W.編、第2版、Raven Press、N.Y.、1989、第4版(1999)、Paul
William E.編)、Raven Press、N.Y.（全ての目的のために全体が参照として組み
入れられる）参照）。免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の可変領域を
コードする遺伝子は、それぞれVHおよびVLと呼ばれる。体細胞変異のために（図
7参照）、免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列は、それをコードするVH遺伝子また
はVL遺伝子から予測されるものと全く一致するわけではないが、免疫グロブリン
の予測される配列と実際の配列の間には十分な類似性があるので、実際の配列は
対応するVHまたはVL遺伝子に特徴的であり、これを認識できる。定常領域という
用語は、全長の天然の定常領域、およびCH1、ヒンジ、CH2およびCH3またはその
断片のようなそのセグメントの両方を意味する。通常は、抗体の軽鎖および重鎖
のセグメントは、重鎖および軽鎖の間の鎖間結合に寄与するために十分な長さを
持つ。
【００１４】 各軽鎖/重鎖ペアの可変領域は、抗体の結合部を形成する。したがって、完全
な抗体には2つの結合部位がある。2機能性または2特異性抗体を除いて、2つの結
合部位は同一である。鎖はすべて、4つの比較的保存されたフレームワーク(FR)
領域が、相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる3つの超可変領域で結合されるという
、同一の一般的構造を持つ。各ペアの2つの鎖のCDRは、フレームワーク部によっ
て整列されるため、特異的なエピトープに結合できる。CDRおよびFR残基は、カ
バット（Kabat）ら、上記、の標準的な配列定義にしたがって、記述されている
。別の構造的定義は、コティア（Chothia）ら、J. Mol. Biol.196:901-917 (198
7); Nature 342:878-883 (1989);およびJ.Mol. Biol.186:651-663 (1989)によっ
て提案されている。
【００１５】 抗体という用語は、抗体全体およびその結合断片を意味する。結合断片には、
一本鎖断片、Fv断片およびFab断片が含まれる。Fab断片という用語は、当技術分
野において、完全な抗体のパパイン開裂の結果得られる結合断片を意味するよう
に使用される場合がある。Fab'およびF(ab')2という用語は、当技術分野におい
て、ペプシン開裂によって生成する完全な抗体の結合断片を示すように使用され
る場合がある。ここで、Fabは包括的に、完全な抗体の二重鎖結合断片で、抗原
特異的結合に十分な、少なくとも実質的に完全な軽鎖及び重鎖の可変領域、およ
び軽鎖及び重鎖の会合を維持するために十分な軽鎖及び重鎖の定常領域の一部を
持つものを示す。通常、Fab断片は、全長または実質的に全長の軽鎖と、可変領
域および定常領域の少なくともCH1ドメインとを含む重鎖を結合して形成される
。
【００１６】 単離された種または種の集団とは、存在する支配的な種（組成物中で、モルベ
ースで他の種と比較して最も豊富）である対象の種（例えば、本発明の結合ポリ
ペプチド）を意味する。好ましくは、単離された種は、存在する全ての巨大分子
種の少なくとも約50％、80％または90％（モルベース）を構成する。最も好まし
くは、対象の種は基本的に均一（通常の検出方法では、組成物中に不純物が検出
できない）に精製される。標的は、標的に特異的な結合親和性を持つパートナー
を単離することが望ましい任意の分子である。
【００１７】 関心対象の標的には、抗イディオタイプ抗体および、糖尿病、多発性硬化症、
慢性関節リウマチの様な自己免疫疾患に存在する自己抗体を含む、抗体が含まれ
る。関心対象の他の標的は、増殖因子受容体（例えば、FGFR、PDGFR、EFG、NGFR
およびVEGF）およびそのリガンドである。他の標的は、Gタンパク質受容体で、
サブスタンスK受容体、アンジオテンシン受容体、 および アドレナリン受容体
、セロトニン受容体、およびPAF受容体が含まれる。例えば、ギルマン（Gilman
）、Ann. Rev. Biochem. 56:625-649(1987)を参照されたい。他の標的には、イ
オンチャネル（例えば、カルシウムチャネル、ナトリウムチャネル、カリウムチ
ャネル）、ムスカリン受容体、アセチルコリン受容体、GABA受容体、グルタミン
酸受容体、およびドーパミン受容体が含まれる（Harpold、5,401,629および米国
特許第5,436,128号参照）。他の標的は、インテグリン、セレクチン、および免
疫グロブリンスーパーファミリーメンバーなどの接着タンパク質である（Spring
er、Nature346:425-433 (1990)；Osborn、Cell 62:3 (1990); Hynes、Cell 69:1
1 (1992)参照）。他の標的は、インターロイキンIL-1からIL-13、腫瘍壊死因子
および 、インターフェロン 、 および 、腫瘍増殖因子β（TGF- ）、コロニー
刺激因子(CSF)および顆粒球単球コロニー刺激因子(GM-CSF)などのサイトカイン
である。「ヒトサイトカイン：基礎および臨床研究のためのハンドブック（Huma
n Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research）」（Aggrawalら編、B
lackwell Scientific、Boston、MA 1991）を参照されたい。他の標的は、アデニ
ルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ、およびホスホリパーゼＣなどの、ホルモン
、酵素、および細胞内および細胞間メッセンジャーである。薬剤も、関心対象の
標的である。標的分子は、ヒト、哺乳類、または細菌のものでありえる。他の標
的は、ウイルスおよび細菌性の微生物病原体のタンパク質、糖タンパク質および
炭化水素などの抗原、および腫瘍である。さらに別の標的は、米国特許第4,366,
241号に記述されている。標的によってスクリーニングされた物質には、単に標
的に結合するのみのものもあるが、標的を刺激したりこれと拮抗するものもある
。
【００１８】 全長ポリペプチドのコード配列を持つ提示ライブラリーメンバーは、ベクター
の増殖前に提示ベクターにもともと挿入されたコード配列と、同じ長さのコード
配列を持つ。
【００１９】 ファージという用語は、感染性のあるゲノムを持つファージと、ヘルパーファ
ージとのみパッケージされる欠陥ゲノムを含むファージの両方を示す。そのよう
なファージはファージミドと呼ばれることもある。
【００２０】 「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可
変領域および定常領域（存在する場合には）を持つ抗体を含む。本発明のヒト抗
体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列にコードされていないアミノ酸残基を
含む場合がある（例えば、インビトロのランダムもしくは位置指定突然変異誘発
、またはインビボの体細胞変異によって導入された変異）。しかし、「ヒト抗体
」という用語は、マウスのような別の哺乳類種の生殖細胞系に由来するCDR配列
が、ヒトのフレームワーク配列に接続された抗体（ヒト化抗体）は含まない。
【００２１】 再配列された重鎖または軽鎖の免疫グロブリン遺伝子座では、VセグメントがD
-JまたはJセグメントに直接連結して、それぞれ基本的に完全なVHまたはVLドメ
インがコードされるような構造になっている。再配列された免疫グロブリン遺伝
子座は、生殖細胞系DNAと比較して同定できる；再配列された遺伝子座は、少な
くとも1つの組換え7量体/9量体相同配列を持っている。逆に、再配列されていな
いまたは生殖細胞系の配列は、Vセグメントが、DまたはJセグメントに直接に隣
接するように組換えられてはいない配列を指す。
【００２２】 「アイソタイプスイッチング」とは、抗体のクラスまたはアイソタイプが、1
つのIgクラスから他のIgクラスに変わることを指す。
【００２３】 「スイッチしていないアイソタイプ」とは、アイソタイプスイッチングが起き
なかったときに産生される重鎖のアイソタイプクラスを指す；スイッチしていな
いアイソタイプをコードするCH遺伝子は、通常は機能的に再配列されたVDJ遺伝
子のすぐ下流にある最初のCH遺伝子である。アイソタイプスイッチングは、古典
的または非古典的アイソタイプスイッチングに分類されている。古典的アイソタ
イプスイッチングは、導入遺伝子中の少なくとも1つのスイッチ配列領域の関与
する組換え事象によって起きる。非古典的アイソタイプスイッチングは、例えば
、ヒトσμおよびヒトΣμ（δ関連欠失）の間の相同組換えによって起こること
がある。導入遺伝子間および/または染色体間組換えのような、別の非古典的ス
イッチング機構も起き、アイソタイプスイッチングが生じる可能性がある。
【００２４】 「スイッチング配列」という用語は、スイッチ組換えを担うDNA配列を指す。
通常はμスイッチ領域である「スイッチドナー」配列は、スイッチ組換え中に削
除される定常領域の5'（上流）にある。「スイッチアクセプター」領域は、削除
される定常領域と、代わりの定常領域（例えば、γ、ε等）の間にある。必ず組
換えが発生する特異的な部位はないため、最終的な遺伝子配列は、通常は構築物
から予測することはできない。
【００２５】 抗体の体細胞変異および親和性成熟によって、抗体の可変領域の結合親和性に
基づいた進化的選択が可能になる。しかし、この工程には、別々に選択された有
益な変異を組み合わせる機構がないため、これは性的に生殖する種の個体の天然
の進化的選択とは異なっている。個々のB細胞間の組換えがないため、有益な変
異は逐次的に選択される必要がある。理論的には、コンビナトリアルライブラリ
ーではそのような組み合わせが可能である（少なくとも、2つの変異がそれぞれ
重鎖および軽鎖に存在する場合）。しかし、天然の供給源からのコンビナトリア
ルライブラリーには、非常に多様な異なる重鎖/軽鎖のペアが含まれるため、ク
ローンの大部分は同一のB細胞骨髄前駆細胞に由来するものではない。そのよう
なペア形成は、標的抗原を認識する安定な抗体分子を形成しにくい。
【００２６】 所定の標的に対する参照抗体の特異的結合を、試験下の抗体が阻害するアッセ
イ法により、競合を判断する。多数の型の競合的結合アッセイ法が知られている
。例えば（HarlowおよびLane、「抗体、実験室マニュアル（Antibodies、A Lab
oratory Manual）」、コールドスプリングハーバー出版（1988）を参照のこと
）。典型的にはそのようなアッセイ法は、精製された標的、非標識試験抗体、お
よび標識参照抗体を使用することを含む。競合阻害は、試験抗体存在下で標的に
結合した標識の量を決定することにより測定される。通常、試験抗体は過剰量存
在する。競合アッセイ法により同定される抗体（競合抗体）は参照抗体と同一の
エピトープに結合する抗体、および立体障害が生じるために参照抗体が結合する
エピトープに十分近接しているエピトープに結合する抗体を含む。競合抗体が過
剰量存在する場合には、標的に対する参照抗体の特異的結合を50％阻害すると思
われる。
【００２７】 詳細な説明 I．概論 本発明は検出試薬としてヒト抗体を使用する検出法を提供する。本方法は部分
的には、ヒト抗体の使用によりいくつかのヒト試料に存在するHAMAおよび/また
は異好性抗体のために測定された分析物の濃度に大きなゆがみを生じることを回
避しうるという知見を前提とする。そのようなゆがみの程度を示すデータ、およ
びヒト抗体の使用によりそれらがいかにして克服されたかは、実施例28に提供さ
れる。
【００２８】 マウス抗体との比較における、ヒト抗体を生成する従来法の非効率性および限
界は、桁外れに高い結合親和性および複数のエピトープ特異性を有する無数のヒ
ト抗体を生産する新規方法の開示により克服される。これらの方法により生産さ
れたヒト抗体の親和性の例は、実施例21に記載される。抗体が多数の異なるエピ
トープに結合する証拠は、実施例27により提供される。検出試薬として高親和性
抗体を使用することは、洗浄をより高いストリンジェンシーで実施することを可
能にし、結果としてより高いシグナル-ノイズ比を生じることから望ましい。異
なるエピトープに結合する抗体を使用することは、サンドイッチ検出形式におい
て有用である。1999年10月2日に出願された米国特許出願第60/157415号において
開示され、本出願において再現された方法を使用して、高親和性ヒト抗体（選択
的には異なるエピトープに結合する）はミルスタイン-コーラー（Milstein-Kohl
er）技術により生成されるマウス抗体のものと同等に容易に生成することが可能
である。
【００２９】 本出願において開示されたインビトロ検出アッセイ法のためのヒト抗体のさら
なる優位点は、大腸菌などの細菌において組換え発現により生産されるヒト抗体
が、マウス抗体に典型的な効率よりも、抗原に対して特異的に免疫反応性である
抗体を高効率に生産するように折り畳まれたためである。大腸菌で発現されたヒ
ト抗体の免疫反応性の程度に関する例は、表4に提供される。高免疫反応性抗体
の使用は、インビトロ検出アッセイ法においてシグナル-ノイズ比を増加させる
点で有用である。
【００３０】 II．ヒト抗体の生産 A．概論 ヒト抗体の生産法は1999年10月2日に出願された同時係属中の出願である米国
特許出願第60/157415号に記載されている。これらの方法は、Ostbergら（1983）
Hybridoma 2：361〜367のトリオーマ（Trioma）技術、およびEngelmanらの米国
特許第4,634,666号、ファージ提示法、およびヒト免疫系遺伝子を発現する非ヒ
トトランスジェニックマウスを含む。好ましい方法が以下に再現される。本方法
は典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動
物を免疫化することにより機能する。動物は抗原に結合する広範囲のヒト抗体を
発現する。そのような抗体の抗体鎖成分をコードする核酸は、続いて動物から提
示ベクターにクローニングされる。典型的には、重鎖配列および軽鎖配列をコー
ドする別々の核酸集団がクローニングされ、その後、別々の集団がベクターに挿
入されることにより組換えが行われ、その結果、所定の任意のベクターコピーは
重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせを受け取る。ベクターは抗体鎖を発現す
るように設計され、従って、抗体鎖が組み立てられて、ベクターを含む提示パッ
ケージの外表面に提示されうる。例えば抗体鎖はファージ外表面由来のファージ
コートタンパク質と共に融合タンパク質として発現されうる。その後、提示パッ
ケージは、標的に結合する抗体の提示についてスクリーニングすることができる
。
【００３１】 いくつかの方法では、提示パッケージがプレスクリーニング段階に供される。
そのような方法では、提示パッケージは、パッケージから提示される抗体鎖と共
に融合タンパク質として発現されるタグをコードしている。提示パッケージは、
タグに対する受容体との結合についてプレスクリーニングされる。プレスクリー
ニングは、タグに連結された抗体鎖を多コピー提示している提示パッケージを濃
縮するのに役立ち、続くスクリーニング段階において標的に結合する提示パッケ
ージの亜集団であると考えられている。しかしながら本発明の実施はこの機構が
正しいかどうかには依存することはない。
【００３２】 受容体を用いたプレスクリーニング（存在する場合）および標的を用いたスク
リーニングの後で、標的に結合する提示パッケージが単離され、選択的には、受
容体に対するプレスクリーニングが選択的に先行実施される各回において、標的
に対するさらなるスクリーニングに供される。提示パッケージは典型的には標的
に対するスクリーニングの各回において増幅されるが、プレスクリーニングおよ
びスクリーニング段階の間には増幅されない。1回または数回の標的に対するス
クリーニングの後で、残っている提示パッケージは標的に対する高親和性結合体
として非常に濃縮されている。例えば実施例13に示されるように、109または101 0 M-1より高い親和性を有する多数の異なる抗体を単離することが可能である。さ
らにスクリーニング条件は、選択した閾値以上の親和性を有する抗体を選択する
ように調整することができる。
【００３３】 いくつかの方法では、ヒト抗体鎖をコードする核酸は、選抜で生き残った提示
ベクターから発現ベクターに一括にサブクローニングされる。典型的には、提示
パッケージから提示されているある抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする核
酸は発現ベクターにサブクローニングされ、それにより選抜で生き残った提示パ
ッケージに存在していたものと同一の組み合わせの重鎖および軽鎖が発現ベクタ
ー内で保持される。発現ベクターは、挿入された抗体鎖を、Fab断片、完全な抗
体、または他の断片として発現するように設計することが可能である。抗体鎖を
コードする核酸を一括で発現ベクターにクローニングすること、および続いて宿
主細胞においてベクターを発現することにより、結果として完全なヒト抗体また
はその断片のポリクローナルな集団が産生される。そのような集団は、通常は標
的内の異なるエピトープに対するものとはいえ、大部分が同一の標的に対して非
常に高親和性を示す型である、異なる抗体型の多様な混合物を含む。
【００３４】 本発明は、任意の所望の標的に対しても著しい高親和性を有する事実上無限の
数のヒト抗体を提供することに成功しており（実施例21参照）、これは、部分的
には、提示法とトランスジェニック動物法の組み合わせに起因すると考えられる
。提示法は所望の特性に関して、無数の抗体をスクリーニングする方法を提供す
る。しかし、提示ベクターへクローニングする際に生じる軽鎖および重鎖のラン
ダムな会合により、機能を有さない可能性のある重鎖および軽鎖に不自然な組み
合わせが生じる。重鎖および軽鎖が天然型であるヒトからクローニングする場合
に、重鎖および軽鎖の置換数は非常に高く、おそらくこれらが非常に大きな割合
で非天然に生じており、高親和性結合能を有していないと思われる。したがって
、高親和性抗体は、そのようなライブラリーでは非常に小さな割合で構成され、
単離することが困難である。ヒト免疫グロブリン遺伝子を持つ非ヒトトランスジ
ェニック動物は典型的には、天然型のヒトに存在するヒト免疫グロブリン遺伝子
の完全な補体を含んでいない。そのような動物に存在するヒト免疫グロブリン遺
伝子のより限定された補体は、高親和性結合能がない重鎖および軽鎖の非天然型
ランダム置換の割合を減少させることになると考えられる。したがって、提示選
抜の強力な力が、従来法に固有の多数の非天然型組み合わせの負荷なしに適用さ
れる場合、無限に多数の高親和性のヒト免疫グロブリンが生じる。
【００３５】 抗体遺伝子の体細胞変異および親和性成熟により、結合親和性に基づく変異型
配列の進化的選抜が可能となる。しかしながら、この過程は、別々に選択された
有用変異の組み合わせを可能にする機構が存在しないために、有性生殖種に由来
する個体の進化的自然選択とは異なる。個々のB細胞間で組換えが存在しないこ
とにより、有用変異は段階的に選抜される必要がある。理論的には、コンビナト
リアルライブラリーによりそのような組み合わせが可能となる（少なくとも2つ
の変異が各々重鎖および軽鎖上に存在する場合）。しかし、天然供与源に由来す
るコンビナトリアルライブラリーは、大部分のクローンが同一のB細胞骨髄前駆
細胞には由来していない広範囲の多様性を有する異なる重鎖/軽鎖組を含む。そ
のような組み合わせは、標的抗原を認識する安定な抗体分子を形成する可能性が
より低い。より少ない数の骨髄前駆細胞に由来するB細胞集団を含むトランスジ
ェニック動物は、各鎖が同一起源の前B細胞の子孫に由来する、新規の体細胞変
異を受けた重鎖/軽鎖組を含むライブラリーを生成するために特に有用である可
能性がある。
【００３６】 上記の機構は本発明を用いて達成される結果を説明すると考えられるが、本発
明の実施はこれらの概念が正しいかどうかに依存することはない。
【００３７】 B．ヒト免疫系を持つトランスジェニック動物 本発明で使用されるトランスジェニック動物は、異種のヒト免疫系を持ち、通
常、ノックアウトされた内在性免疫系を持つ。マウスは、好ましい非ヒト動物種
である。HuMAbマウスと呼ばれることもあるトランスジェニックマウスは、再配
列されていないヒト重鎖（μ鎖およびγ鎖）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列を
コードする、ヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座、ならびに内在性μ鎖およ
びκ鎖遺伝子座を不活化する標的化した変異を含む（Lonbergら(1994) Nature 3
68 (6474):856-859および米国特許第5,770,429号）。したがって、このマウスの
マウスIgMまたはκ鎖の発現は低下しており、免疫に応答して、導入されたヒト
重鎖およびヒト軽鎖の導入遺伝子がクラススイッチングおよび体細胞変異を経て
、高親和性のヒトIgGκモノクローナル抗体を生成する（Lonbergら(1994)、上記
；Lonberg, N. (1994) 「実験薬学のハンドブック（Handbook of ExperimentalP
harmacology）」113:49-101に総説；LonbergおよびHuszar (1995) Intern. Rev.
Immunol. Vol. 13:65-93、およびHardingおよびLonberg (1995) Ann. N.Y. Acad
.Sci 764:536-546）;Taylor, L.ら(1992) Nucleic Acids Research 20:6287-629
5;Chen, Jら(1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillonら(1993) P
roc.Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choiら(1993) Nature Genetics 4:11
7-123;Chen, Jら(1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillonら(1994) J. Immunol.15
2:2912-2920; Lonbergら(1994) Nature 368 (6474):856-859; Lonberg, N. (199
4)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L.ら(1994)In
ternational Immunology 6:579-591; Lonberg, N.およびHuszar, D. (1995)Inte
rn. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; Harding F.およびLonberg, N. (1995) Ann.
N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D.ら(1996) Nature Biotechnology14:
845-851;米国特許第5,625,126号および第5,770,429号、第5,545,807号、第5,939
,598号、国際公開公報第98/24884号、国際公開公報第94/25585号、国際公開公報
第93/1227号、国際公開公報第92/22645号、国際公開公報第92/03918号、これら
は全てその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００３８】 トランスジェニック非ヒト動物の中には、V-D-J組換えおよびアイソタイプス
イッチングを経て、抗原に対して複数のヒトモノクローナル抗体アイソタイプ（
例えば、IgG、IgAおよび/またはIgE）を産生する能力を持つものがある。アイソ
タイプスイッチングは、例えば、古典的または非古典的アイソタイプスイッチン
グによって起きる。
【００３９】 トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニック動物に含まれるヒト免
疫グロブリン導入遺伝子が、B細胞の発生経路全体にわたって正しく機能するよ
うに設計されている。マウスの中には、異種重鎖導入遺伝子の正しい機能にアイ
ソタイプスイッチングが含まれるものもある。したがって、本発明の導入遺伝子
は、アイソタイプスイッチングおよび以下のうちの1つまたは複数を生成するよ
うに作製されている：(1) 高レベルおよび細胞型特異的発現、(2) 機能的遺伝子
再配列、(3) 対立遺伝子排除の活性化およびこれに対する応答、(4) 十分なプラ
イマリーレパートリーの発現、(5) シグナル伝達、(6) 体細胞超変異、(7) 免疫
応答中の導入遺伝子抗体遺伝子座の支配。
【００４０】 トランスジェニック動物の内在性免疫グロブリン遺伝子座が破壊されているト
ランスジェニック動物では、導入遺伝子は対立遺伝子排除を活性化する必要がな
い。また、導入遺伝子が機能的に再配列された重鎖および/または軽鎖免疫グロ
ブリン遺伝子を含むトランスジェニック動物では、少なくともすでに再配列され
ている導入遺伝子に関しては、機能的な遺伝子再配列という第2の基準は不要で
ある。
【００４１】 ヒトモノクローナル抗体の産生のために使用されたトランスジェニック非ヒト
動物の中には、トランスジェニック動物の生殖細胞系中に、再配列された、再配
列されていない、または再配列されたおよび再配列されていないものの組み合わ
せの、異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖導入遺伝子を含むものがある。また、
重鎖導入遺伝子は、機能的なアイソタイプスイッチ配列を含むことがあり、これ
はトランスジェニック動物のB細胞中で複数のCH遺伝子をコードする異種導入遺
伝子のアイソタイプスイッチングを支持する能力を持つ。そのようなスイッチ配
列は、導入遺伝子CH遺伝子の供給源となる種の生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子
座中に天然に存在するものであるか、導入遺伝子構築物を受け取る種（トランス
ジェニック動物）において発生するものに由来するスイッチ配列である可能性が
ある。例えば、トランスジェニックマウスの産生に使用されるヒト導入遺伝子構
築物は、マウス重鎖遺伝子座で自然に存在するもの類似したスイッチ配列を組み
込んでいれば、アイソタイプスイッチング事象の頻度が高くなる可能性がある。
これは、おそらくマウスのスイッチ配列は、マウスのスイッチレコンビナーゼ酵
素系で機能するように最適化されているが、ヒトのスイッチ配列はそうではない
ためである。スイッチ配列は、通常のクローニング方法によって単離およびクロ
ーニングできる。または、免疫グロブリンスイッチ領域の配列に関する公表され
た配列情報に基づいて設計された、重複する合成オリゴヌクレオチドから、新た
に合成することもできる（Millsら、Nucl. Acids Res. 15:7305-7316 (1991); S
iderasら、Intl. Immunol.1:631-642 (1989)、参照として組み入れられる）。通
常、機能的に再配列された異種重鎖および軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子は、上
述のトランスジェニック動物のB細胞中に、かなりの割合で見られる（少なくと
も10％）。
【００４２】 本発明のトランスジェニック動物の作製に使用される導入遺伝子には、少なく
とも1つの可変遺伝子セグメント、1つの多様性遺伝子セグメント、1つの接合遺
伝子セグメント、および少なくとも1つの定常領域遺伝子セグメントをコードす
るDNAを含む重鎖導入遺伝子が含まれている。免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子に
は、少なくとも1つの可変遺伝子セグメント、1つの接合遺伝子セグメント、およ
び少なくとも1つの定常領域遺伝子セグメントをコーニック非ヒト動物以外の種
、通常はヒトの免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セグメントをコードするDN
Aに由来する、または対応するという点で、トランスジェニック非ヒト動物に対
して異種である。
【００４３】 通常、導入遺伝子は、個々の遺伝子セグメントが再配列されていない形で作製
される。すなわち、機能的な免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするように
再配列されていない。そのような再配列されていない導入遺伝子は、V遺伝子、D
遺伝子、およびJ遺伝子のセグメントの組換え（機能的再配列）を支持し、好ま
しくは、抗原に曝露されたときに、トランスジェニック非ヒト動物内で、再配列
された免疫グロブリン重鎖中のD領域遺伝子セグメント全体または一部の組み込
みを支持する。そのような導入遺伝子は、通常、C、D、およびJセグメントのか
なりの部分、ならびにV遺伝子セグメントのサブセットを含む。
【００４４】 そのような導入遺伝子構築物では、例えば、プロモーター、エンハンサー、ク
ラススイッチ領域、RNAプロセッシングのためのスプライスドナーおよびスプラ
イスアクセプター配列、組換えシグナル等のような種々の調節配列は、異種DNA
由来の対応する配列を含む。そのような調節配列は、本発明で使用される非ヒト
動物と同一または関連した種から、導入遺伝子に組み込むことができる。例えば
、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、導入遺伝子内で齧歯動物の免疫グロ
ブリンエンハンサー配列と組み合わせて、トランスジェニックマウスで使用でき
る。または、哺乳類のゲノム中で自然に存在することが知られている機能的なDN
A配列と相同ではないような、合成調節配列を導入遺伝子中に組み込むこともで
きる。合成調節配列は、例えば、スプライスアクセプター部位またはプロモータ
ー/エンハンサーモチーフの許容配列を指定するような、コンセンサスルールに
したがって設計される。導入遺伝子はミニ遺伝子座を含み得る。
【００４５】 ヒト抗体の作製に使用されるトランスジェニック動物の中には、米国特許第5,
770,429号の実施例37に記述される導入遺伝子、または実施例24（例えば、HCo12
）に記述される導入遺伝子のコピーを少なくとも1つ、通常は2〜10個、および時
折25〜50個またはそれ以上、米国特許第5,770,429号の実施例38に記述される軽
鎖導入遺伝子のコピーを少なくとも1つ、実施例23に記述されるCμ欠失のコピー
を2つ、および米国特許第5,770,429号の実施例9に記述されるJκ欠失のコピーを
2つ、含むものがある。上記の各々は全ての目的のためにその全体が参照として
本明細書に組み入れられる。
【００４６】 トランスジェニック動物の中には、かなりのレパートリーを持つ免疫グロブリ
ン産生を示すものがある。したがって、例えば、内在性Ig遺伝子が不活化した動
物において、免疫グロブリンの合計のレベルは、約0.1〜10mg/ml血清、好ましく
は0.5〜5mg/mlの範囲である。トランスジェニックマウスの発現する免疫グロブ
リンは、通常、抗原性の高いタンパク質、例えば、ブドウ球菌プロテインAの約
半分またはそれ以上を認識する。
【００４７】 トランスジェニック非ヒト動物は、抗原および/または抗原を発現する細胞の
、精製または濃縮した調製物で免疫できる。この動物は、導入遺伝子内のスイッ
チ組換え（シス-スイッチング）によるクラススイッチングを受けるB細胞を産生
し、免疫化された抗原と反応する免疫グロブリンを発現する。免疫グロブリンは
、ヒト導入遺伝子によって重鎖および軽鎖ポリペプチドがコードされているヒト
配列の抗体の可能性があるが、このヒト導入遺伝子配列には、体細胞変異および
V領域の組換え結合で得られた配列、ならびに生殖細胞系にコードされた配列が
含まれ得る。体細胞変異および異なるV-JおよびV-D-J組換え結合の結果として、
他の非生殖細胞系配列が存在していても、これらのヒト配列の免疫グロブリンは
、ヒトVLまたはVH遺伝子セグメントおよびヒトJLまたはJLセグメントによってコ
ードされるポリペプチド配列と実質的に同一であると言える。そのようなヒト配
列抗体に関して、各鎖の可変領域は、通常、ヒト生殖細胞系V、J、および重鎖の
場合はD遺伝子セグメントによって少なくとも80％コードされている；しばしば
可変領域の85％は、導入遺伝子上に存在するヒト生殖細胞系配列によってコード
されている；しばしば可変領域配列の90％または95％またはそれ以上が、導入遺
伝子上に存在するヒト生殖細胞系配列によってコードされている。しかし、体細
胞変異およびVJおよびVDJ結合によって非生殖細胞系配列が導入されているので
、ヒト配列抗体は、しばしば、マウスの生殖細胞系中のヒト導入遺伝子に見られ
るヒトV遺伝子、D遺伝子、またはJ遺伝子のセグメントによってコードされてい
ない、いくらかの可変領域配列（およびそれより頻度は低いが定常領域配列）を
持つ。通常、そのような非生殖細胞系配列（または各ヌクレオチド位置）は、CD
R内もしくはその付近、または体細胞変異が密集することが知られている領域中
に密集している。
【００４８】 あらかじめ決められた抗原に結合するヒト配列抗体は、ヒト配列γ鎖（γ1鎖
、γ2鎖、γ3鎖、またはγ4鎖のような）、およびヒト配列軽鎖（κ鎖またはλ
鎖のような）を含む抗体が生成する、アイソタイプスイッチングから得られる。
そのようなアイソタイプスイッチングをしたヒト配列抗体はしばしば、抗原によ
るB細胞の親和性成熟および選択の結果、特に2次（およびその後の）抗原の攻撃
後には、通常は可変領域およびCDR中またはそれから10残基以内に、1つまたは複
数の体細胞変異を含む。図7は、本発明の種々の免疫グロブリンにおける体細胞
変異の頻度を示す。
【００４９】 HuMAbトランスジェニック動物は、フロイント完全アジュバント中の抗原によ
って腹腔内(IP)に免疫化され、その後、数ヶ月にわたって、2週間ごとまたは毎
月、フロイント不完全アジュバント中の抗原によってIP免疫化された。また、ア
ジュバントなしの細胞全体が、高い抗原性を示すことが分かった。免疫応答は、
眼窩後方の採血によって得られた血漿試料を用いて、免疫プロトコールの期間を
通してモニターされた。マウスは、屠殺して脾臓を摘出する3日前に、抗原を静
脈内に追加投与できる。典型的には、免疫化に対してそれぞれ2〜3回の融合を行
う。
【００５０】 少なくとも重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸は、免疫化されたトラン
スジェニック動物または未感作のトランスジェニック動物のいずれかからクロー
ニングすることが可能である。核酸はそのような動物のリンパ細胞からゲノムDN
AまたはcDNAとしてクローニングすることが可能である。脾臓はそのような細胞
の好ましい供給源である。免疫グロブリン配列のクローニングに先だってそのよ
うな細胞の不死化は必要とされない。通常mRNAが単離され、ポリdTプライマーを
用いた逆転写反応により増幅される。その後、cDNAはヒト免疫グロブリンの保存
領域に対するプライマーを用いて増幅される。軽鎖および重鎖の集団は各々から
別々に増幅されるが、軽鎖集団内の軽鎖は一括で増幅され、重鎖集団内の重鎖も
同様である。典型的には軽鎖の増幅された集団は、少なくとも100、1,000、10,0
00、100,000または1,000,000個の異なる軽鎖を備えている。同様に重鎖の増幅さ
れた集団は、少なくとも100、1,000、10,000、100,000または1,000,000個の異な
る重鎖を備えている。
【００５１】 C．提示ライブラリー 1．提示パッケージ 複製可能な遺伝パッケージと呼ばれることもある提示パッケージは、ポリペプ
チドをコードする核酸に結合した、スクリーニングされるポリペプチドを含む、
スクリーニング可能なユニットである。核酸はインビボ（例えば、ベクターとし
て）またはインビトロ（例えば、PCR、転写および翻訳による）のいずれかで複
製可能である。インビボ複製は、自律的（細胞など）、宿主因子の補助を受けて
（ウイルスなど）、または、宿主およびヘルパーウイルスの補助を受けて（ファ
ージミドなど）、行われる。細胞、胞子、またはウイルスは、提示パッケージの
例である。複製可能な遺伝パッケージは、真核生物または原核生物系でよい。提
示ライブラリーは、提示される外来ポリペプチドをコードする核酸を、提示パッ
ケージのゲノムに導入して、通常は提示パッケージの外表面に発現される内在性
タンパク質との融合タンパク質を形成して、作製される。融合タンパク質の発現
、外表面への輸送、および会合によって、遺伝パッケージの外表面から外来ポリ
ペプチドが提示されることになる。
【００５２】 提示パッケージの別の種類は、ポリペプチドをコードする核酸に結合したポリ
ペプチドを含む。そのような配置は、いくつかの方法で可能である。米国特許第
5,733,731号は、DNA結合ポリペプチドおよびスクリーニングされるポリペプチド
を含む融合タンパク質が発現されるように、プラスミドを作製する方法を記述し
ている。発現後、融合タンパク質は、DNA結合ポリペプチド成分を介して、それ
をコードするベクターに結合する。融合タンパク質を発現するベクターは、標的
への結合によってスクリーニングし、更なるスクリーニングまたは解析のために
、ベクターが回収される。別の方法では、ポリペプチドは、スクリーニングされ
るポリペプチド、ポリペプチドをコードするmRNA、およびmRNAとポリペプチドを
結合させているリボソームを含む提示パッケージの成分として、スクリーニング
される。（HanesおよびPluckthun、PNAS 94、4937-4942 (1997); Hanesら、PNAS 95、14130-14135(1998); Hanesら、FEBS Let、450、105-110 (1999); 米国特許
第5,922,545号参照）。選択された複合体のmRNAは、逆転写およびPCR、およびイ
ンビトロ転写によって増幅され、mRNAから翻訳されるタンパク質とリボソームに
結合してさらなるスクリーニングが行われる。別の方法では、スクリーニングの
ために、RNAはそのRNAによってコードされるポリペプチドと融合される（Robert
sおよびSzostak、PNAS 94、12297-12302(1997)、Nemotoら、FEBS Letters 414、
405-408 (1997)）。スクリーニングで残った複合体のRNAは、逆転写PCRおよびイ
ンビトロ転写によって増幅される。。
【００５３】 提示ライブラリーに最もよく使用される遺伝パッケージは、バクテリオファー
ジ、特に繊維状ファージで、特にファージM13、FdおよびF1である。大部分の研
究では、これらのファージのgIIIまたはgVIII中に、提示されるポリペプチドを
コードするライブラリーが挿入され、融合タンパク質を形成する。例えば、ドウ
ナー（Downer）、国際公開公報第91/19818号; デブリン（Devlin）、国際公開公
報第91/18989号;マクカフェリティ（MacCafferty）、国際公開公報第92/01047号
（遺伝子III）; フーゼ（Huse）、国際公開公報第92/06204号; カン（Kang）、
国際公開公報第92/18619号（遺伝子VIII）を参照されたい。そのような融合タン
パク質には、通常はファージコートタンパク質以外の分泌タンパク質のシグナル
配列、提示されるポリペプチド、および遺伝子IIIもしくは遺伝子VIIIタンパク
質のいずれかまたはその断片が含まれている。外来のコード配列は、しばしば遺
伝子IIIまたは遺伝子VIIIのN末端またはその付近に挿入されるが、他の挿入部位
も可能である。繊維状ファージベクターの中には、遺伝子IIIまたは遺伝子VIII
の第2のコピーを産生するように加工されたものもある。そのようなベクターで
は、外来配列は、2つのコピーの1つのみに挿入される。他のコピーが発現される
と、ファージ粒子に組み込まれた融合タンパク質の比率を効果的に下げるので、
ファージの成長に有害なポリペプチドに対する選択を低下させるという点で有益
であり得る。別の変法では、外来ポリペプチド配列は、ファージコートタンパク
質およびファージパッケージング配列をコードするが、複製が不可能なファージ
ミドベクター中にクローニングされる。ファージミドは細胞にトランスフェクト
され、ヘルパーファージの感染によってパッケージングされる。ファージミド系
を使用すると、やはりコートタンパク質および提示されるポリペプチドから形成
される融合タンパク質を、ヘルパーファージから発現されるコートタンパク質の
野生型コピーで希釈する効果がある。ガラード（Garrard）、国際公開公報第92/
09690号を参照されたい。
【００５４】 真核細胞ウイルスは、同様な方法でポリペプチドを提示するために使用できる
。例えば、マウスのモロニー白血病ウイルスのgp70に融合されたヒトヘレグリン
の提示は、ハン（Han）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)
に報告されている。提示パッケージとして胞子も使用できる。この場合、ポリペ
プチドは胞子の外表面から提示される。例えば、枯草菌（B. subtilis）の胞子
が適当であることが報告されている。これらの胞子のコートタンパク質の配列は
、Donovanら、J. Mol. Biol. 196:1-10 (1987)に提供されている。提示パッケー
ジとして細胞も使用できる。提示するポリペプチドは、細胞表面に発現される細
胞タンパク質をコードする遺伝子に挿入される。ネズミチフス菌（Salmonella t
yphimurium）、枯草菌（Bacillus subtilis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginos
a）、ビブリオコレラ（Vibrio cholerae）、ニューモニアクレブシェラ肺炎杆菌
（Klebsiella pneumonia）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、ナイセリアメニ
ンギチジス（Neisseria meningitidis）、バクテロイデスノドサス（Bacteroide
s nodosus）、牛モラクセラ菌(Moraxella bovis)、および特に大腸菌（Escheric
hia coli）を含む細菌細胞が好ましい。外表面タンパク質の詳細は、ラドナー（
Ladner）ら、米国特許第5,571,698号、およびジョージオ（Georgiou）ら、Natur
eBiotechnology 15:29-34 (1997)および、本明細書中に引用されている参照に論
述されている。例えば、大腸菌lamBタンパク質が適当である。
【００５５】 2．提示される抗体 抗体鎖は1本鎖または2本鎖の形で提示される。1本鎖抗体ライブラリーは、抗
体の重鎖または軽鎖のみ、またはその可変領域を含み得る。しかし、より一般的
には、1本鎖抗体ライブラリーのメンバーは、単一のつながったタンパク質内で
ペプチドスペーサーによって隔てられた重鎖および軽鎖可変領域の融合から形成
されている。ラドナー（Ladner）ら、国際公開公報第88/06630号；マクカフェリ
ティ（McCafferty）ら、国際公開公報第92/01047号を参照されたい。2本鎖抗体
は、重鎖および軽鎖またはその結合断片が非共有結合して形成されている。2本
鎖抗体は、重鎖可変領域、リンカー、および軽鎖可変領域をそれぞれ含む2つの1
本鎖抗体の会合によっても形成され得る。ダイアボディ（diabody）として知ら
れる抗体では、1つの1本鎖抗体の重鎖は他の1本鎖抗体の軽鎖に結合し、逆もま
た同じで、2つの同一の抗原結合部位が形成される（Hollingerら、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90、6444-6448 (1993)およびCarterおよびMerchan、Curr. Op.
Biotech. 8、449-454 (1997)）。したがって、1本鎖抗体を提示するファージは
、ダイアボディとして2つの1本鎖抗体を会合させることによって、ダイアボディ
を形成できる。
【００５６】 抗体ライブラリーの多様性は、免疫または非免疫B細胞のモノクローナル集団
のような、天然の供給源から抗体をコードする配列を入手することで得られる。
または、またはそれに加えて、多様性は、提示ベクターへの挿入前または挿入後
に、抗体鎖をコードする核酸に人工的変異誘発を行なっても、得られる。そのよ
うな変異誘発は、PCR過程中、PCRの前または後で導入できる。
【００５７】 選択的にスペーサーの隣接する、提示される抗体鎖をコードする核酸は、上述
のように、標準的な組換えDNA手法によって、提示パッケージのゲノム中に挿入
される（一般的に、Sambrookら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual）」第2版、Cold Spring HarborLaborator
y Press、Cold Spring Harbor、NY、1989、参照として本明細書に組み入れられ
る）。核酸は、抗体鎖（スペーサーもしくはフレームワーク残基あり、またはな
し）として最終的に発現される。ファージ、細菌、および胞子ベクターでは、抗
体鎖は、複製可能パッケージの外表面タンパク質の全体または一部に融合されて
いる。ライブラリーはしばしば約103個、104個、106個、107個、108個、または
それ以上のメンバーを持つ。
【００５８】 2本鎖抗体提示ライブラリーは、上述の提示ライブラリーの種を表す。そのよ
うなライブラリーの作製は、例えば、ドウナー（Downer）、米国特許第5,427,90
8号；米国特許第5,580,717号、フーゼ（Huse）、国際公開公報第92/06204号；フ
ーゼ（Huse）「抗体エンジニアリング(Antibody Engineering)」(Freeman 1992)
、第５章；カン（Kang）、国際公開公報第92/18619号；ウィンター（Winter）ら
、国際公開公報第92/20791号；マクカフェリティ（MacCafferty）、国際公開公
報第92/01047号；フーゲンブーム（Hoogenboom）、国際公開公報第93/06213号；
ウィンター（Winter）ら、Annu. Rev.Immunol. 12:433-455 (1994); フーゲンブ
ーム（Hoogenboom）ら、Immunological Reviews 130:41-68(1992); ソダーリン
ド（Soderlind）ら、Immunological Reviews 130:109-124 (1992)に記述されて
いる。例えば、2本鎖抗体ファージ提示ライブラリーでは、1本鎖ライブラリーと
同様に、1つの抗体鎖がファージのコートタンパク質に融合される。パートナー
抗体鎖は、第1の抗体鎖と複合体を形成するが、パートナーはファージコートタ
ンパク質に直接結合はしていない。重鎖または軽鎖のどちらかがコートタンパク
質に融合されている鎖でありえる。コートタンパク質に融合されていないほうの
鎖が、パートナー鎖になる。この配置は、通常は、1つの抗体鎖遺伝子をコード
する核酸セグメントを、ファージ提示ベクターのgIIIまたはgVIIIのいずれかに
組み込んで、シグナル配列、抗体鎖、およびファージコートタンパク質を含む融
合タンパク質を形成させることによって、行われる。パートナー抗体鎖をコード
する核酸は、第1の抗体鎖をコードするのと同じベクターに挿入できる。選択的
に、重鎖および軽鎖は、同一のプロモーターに結合した同一の提示ベクターに挿
入し、ポリシストロン性のメッセージとして転写されることができる。または、
パートナー抗体鎖をコードする核酸は、別のベクター（ファージベクターである
場合もない場合もある）に挿入できる。この場合、2つのベクターは同一の細胞
中で発現される（国際公開公報第92/20791号参照）。パートナー鎖をコードする
配列は、パートナー鎖がシグナル配列に結合するが、ファージコートタンパク質
には融合しないように、挿入される。両方の抗体鎖は発現され、細胞の周辺細胞
質に輸送され組み立てられて、ファージ粒子に組み込まれる。
【００５９】 通常は、ヒト軽鎖および重鎖の可変領域のみが、トランスジェニック非ヒト動
物からクローニングされる。そのような場合、提示ベクターは、挿入された配列
から発現される重鎖および軽鎖可変領域とインフレームで、重鎖および軽鎖の定
常領域、またはその断片を発現するように設計できる。通常は、定常領域は天然
に存在するヒト定常領域である；少数の保守的な置換は許容されるが、好ましく
はない。Fab断片では、重鎖定常領域は、通常CH1領域、および選択的にヒンジ領
域の一部または全体を含んでおり、軽鎖定常領域は、CκまたはCλのような完全
な軽鎖定常領域である。定常領域のアイソタイプの選択は、部分的に補体依存性
の細胞毒性が最終的に必要かどうかに依存する。例えば、ヒトアイソタイプIgG1
およびIgG4はそのような細胞毒性を支持するが、IgG2およびIgG3は支持しない。
または、提示ベクターは非ヒト定常領域を提供することもできる。そのような場
合には、通常、抗体鎖の可変領域のみが提示ベクターからサブクローニングされ
、ヒト定常領域は、挿入された抗体配列とインフレームの発現ベクターによって
提供される。
【００６０】 別の変法では、トランスジェニック動物から定常領域および可変領域の両方が
クローニングされる。例えば、Fab断片の発現のために、重鎖可変領域はCH1定常
領域に結合して、軽鎖可変領域は完全な軽鎖定常領域に接続して、クローニング
できる。この場合、提示ベクターは定常領域をコードする必要はない。
【００６１】 抗体をコードする配列は、トランスジェニック非ヒト動物のリンパ細胞から得
られる。通常は、細胞は免疫化されるが、この場合、免疫は細胞を採集する前に
インビボで行なうか、細胞の採集後にインビトロで行なうか、その両方が可能で
ある。免疫化された動物の脾臓細胞が、好ましい供給材料である。免疫は、任意
の種類の抗原で行なうことができる。抗原は、しばしばヒトのタンパク質である
。
【００６２】 再配列された免疫グロブリン遺伝子は、ゲノムDNAまたはmRNAからクローニン
グできる。後者の場合、細胞からmRNAが抽出され、逆転写酵素およびポリdTオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて、cDNAが調製される。抗体をコードする配列
のクローニングのためのプライマーは、ラリック（Larrick）ら、Bio/Technolog
y 7:934 (1989)、ダニエルソン（Danielsson）およびボレバセイック（Borrebac
eick）、「抗体エンジニアリング：実用ガイド(Antibody Engineering: A Pract
ical Guide)」 (Freeman、NY 1992) p89、およびフーゼ（Huse）、同書、第５章
に論述されている。
【００６３】 抗体断片のレパートリーは、増幅されたVHおよびVL配列を、いくつかの方法で
組み合わせることによって作製された。軽鎖及び重鎖を、異なるベクターに挿入
し、ベクターをインビトロ（Hogrefeら、Gene 128:119-126 (1993)）またはイン
ビボ（Waterhouseら、Nucl. Acids. Res. :2265-66 (1993)）で組み合わせるこ
とができる。または、軽鎖および重鎖は順次、同じベクターにクローニングした
り（Barbasら、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 88:7987-82 (1991)）、またはPCRに
よって組立て、ベクター中に挿入できる（Clacksonら、Nature 352：624-28 (19
91)）。重鎖のレパートリーは単一の軽鎖と組み合わせるか、その逆もできる。
フーゲンブーム（Hoogenboom）ら、J. Mol. Biol. 227:381-88 (1992)。
【００６４】 通常は、抗体重鎖及び抗体軽鎖をコードするセグメントは、軽鎖および軽鎖の
さらなる集団からサブクローニングされるため、各ベクター中の集団からの重鎖
および軽鎖のランダムなペアの結合が生じる。したがって、改変されたベクター
は、通常、天然に存在する抗体中では見られない、重鎖および軽鎖可変領域の組
み合わせを含む。これらの組み合わせの中には、通常、選択過程で残り、以下の
ポリクローナルライブラリー中にも存在するものがある。
【００６５】 重鎖および軽鎖をコードする配列の集団のクローニングのための典型的なベク
ターおよび手順は、フーゼ（Huse）、国際公開公報第92/06204号に記述されてい
る。Hcポリペプチドをコードする配列の多様な集団が、M13IX30にクローニング
され、Lcポリペプチドをコードする配列がM13IX11にクローニングされる。この
集団はM13IX30中のXhoI-SeeIまたはStuI制限酵素部位の間、およびM13IX11のSac
I-XbaIまたはEcoRV部位の間に挿入される（それぞれHuseの図1AおよびB）。両方
のベクターは、HcおよびLcコード配列およびその関連ベクター配列の結合のため
に、MluI-HindIII制限酵素部位（Huseの図1AおよびB）を2対含んでいる。2つの
ペアは、クローニング部位について対称的な方向になっており、発現される配列
を含むベクタータンパク質のみが、単一のベクター中に正確に組み合わされるよ
うになっている。
【００６６】 抗体鎖の繊維状ファージへのクローニングのための他の典型的ベクターおよび
手法は、本発明の実施例に記述されている。
【００６７】 D．多価提示メンバーの濃縮 1．本方法の理論 提示ライブラリーでは、好ましくは、ポリペプチドの複数のコピーを提示する
メンバーを濃縮するべきであるという考えは、一部の初期の報告と矛盾した所見
であるように見える。Cwirlaら、上記を参照されたい。提示ライブラリーに関す
る大部分の研究は、核酸ライブラリーを繊維状（filamentous）ファージのpIII
またはpVIII中に挿入して行われた。pIIIはファージ当たり4コピーまたは5コピ
ー存在し、pVIIIはファージ当たり数百コピー存在するので、初期の報告では、
外来ポリペプチドはファージ当たり対応する数で提示されると仮定された。しか
し、より最近の研究では、ファージ当たりに提示されるポリペプチドの実際のコ
ピー数は、おそらく、ポリペプチドのタンパク質分解切断のために、理論的な期
待値よりもはるかに少ないことが明らかになった。Winterら、Ann. rev. Immuno
l. 12:433-55 (1994)。また、ファージ提示に使用されるベクター系は、しばし
ばファージコートタンパク質を2コピーコードしており、その内の1つは野生型タ
ンパク質、他は提示される外来ポリペプチドと融合タンパク質を形成する。両方
のコピーが発現され、野生型コートタンパク質は、ファージコートにおける融合
タンパク質の割合を減少させる。
【００６８】 Fabが繊維状ファージのpVIIIから発現される場合に、ファージ当たりに提示さ
れるFabの典型的な比率は、約0.2である。ファージ当たりの平均発現頻度がnの
場合に、y個のFabがファージ粒子上で発現される確率Pr(y)は、ポアソン分布
【数１】 Pr(y)＝e-nny/y! で与えられる。
【００６９】 ファージ当たり0.2のFabという出現率では、ファージ当たり0個、1個、2個、
および3個のFabが発現する確率は、0.82、0.16、0.016、および0.0011である。
したがって、2つまたはそれ以上のFabを提示するファージ粒子の比率は、0.017
に過ぎない。
【００７０】 ファージ提示ライブラリーで複数のFab断片を提示するメンバーの割合が少な
いことは、そのようなライブラリーメンバーの中で、ごくわずかな割合のみが、
固定化した結合パートナーへの親和性選択で残ることと関連する。特定の標的に
対して高い結合親和性を持つことが知られている、同一のFab断片を全てのメン
バーがコードするようなライブラリーが作製された。結合したファージから遊離
のものを除去するための、ごく穏やかな分離条件下でさえも、ファージ全体の約
0.004以上を結合させることは不可能だった。この割合は、少なくとも2つのFab
断片を提示するファージの比率と、同じ桁であり、固定化した標的に結合するた
めには、ファージは少なくとも2つのFab断片を提示する必要があることが示唆さ
れる。おそらく、剪断力によって、単一のFab断片のみを提示しているファージ
が固相から解離されると考えられる。したがって、ファージFabライブラリーメ
ンバーが、遊離ファージからの結合ファージの分離が可能なほど十分な親和力で
固定化した標的に結合するためには、少なくとも2つの結合事象が必要である。
他の形の提示ライブラリーでも、同様な制限が適用されると予想される。
【００７１】 したがって、本発明の好ましい戦略は、ライブラリーをスクリーニング標的に
接触させる前に、提示された抗体鎖に融合されたレポーターへ結合するライブラ
リーメンバーを濃縮することである。プレスクリーニングにより、タグのコピー
を少なくとも2つ提示し、そのためにタグに結合した抗体鎖を少なくとも2コピー
提示するライブラリーメンバーが濃縮されると考えられる。したがって、2つ以
上の抗体鎖を持たないライブラリーメンバーで、固定化したスクリーニング標的
に対する提示された抗体の結合を介した親和性選択で残ることができないが、そ
のような標的またはその支持体に複数の非特異的結合を形成することによって親
和性選択で残ることができるものは、標的へのライブラリーのスクリーニングの
前に、実質的に除去される。
【００７２】 2．タグおよび受容体 上記の戦略は、対になったタグと受容体を使用して実施される。タグは、ライ
ブラリーの異なるメンバーに共通で、提示パッケージには異種である任意のペプ
チド配列でよく、提示パッケージから提示されるポリペプチドに融合される。例
えば、タグは合成ペプチド配列、抗体の定常領域であり得る。いくつかの方法で
は、軽鎖または重鎖可変領域の一方のみが、メンバー間で異なるような1本鎖抗
体が提示される。そのような場合には、特に、異なるメンバー間で同一の可変領
域をタグとして使用できる。適当なタグ-受容体の組み合わせには、エピトープ
と抗体が含まれる；例えば、多くの高親和性ヘキサペプチドリガンドが、抗ダイ
ノルフィンmAb 32.39として知られており（Barrettら、Neuropeptides 6:113-12
0 (1985)およびCullら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869 (1992)参照
）、種々の短いペプチドは、MAb 3E7に結合することが知られている（Schatz、B
iotechnology11:1138-43 (1993)）。タグと抗体の別の組み合わせは、Blanarお
よびRutter、Science 256:1014-1018 (1992)に記述されている。
【００７３】 タグ-受容体ペアの別の例は、FLAG（商標）システム(Kodak)である。FLAG（商
標）分子タグは、標的結合部に連結された8アミノ酸FLAGペプチドマーカーから
なる。FLAGコード配列を含む24塩基対のセグメントを、提示されるポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列の隣に挿入できる。FLAGペプチドには、C末端の5
アミノ酸に対応する、エンテロキナーゼ認識部位が含まれている。FLAGペプチド
マーカーと共に使用するために適したキャプチャー部分には、抗FLAG M1、M2お
よびM5抗体が含まれ、これらは市販されている。
【００７４】 ペプチドおよび抗体のさらに別の組み合わせは、通常のファージ提示法によっ
て同定することができる。ペプチド配列と受容体の別の適当な組み合わせには、
ポリヒスチジンおよびアガロース上に固定されたNi2+を含む金属キレートリガン
ド（Hochuli、「遺伝子エンジニアリング：原理と方法 (Genetic Engineering:
Principles and Methods)」（JK Setlow編、Plenum Press、NY）、第18章、pp87
-96）およびマルトース結合タンパク質（Mainaら、Gene 74:365-373 (1988)）が
含まれる。
【００７５】 受容体は、しばしばビオチンで標識され、アビジンでコートされた支持体に受
容体を固定することが可能になる。ビオチン標識は、ビオチン化酵素BirA（Scha
tz,Biotechnology 11:1138-43 (1993)参照）を用いて行なうことができる。
【００７６】 タグをコートする核酸配列は、提示されるポリペプチドおよび提示パッケージ
の外表面タンパク質を含む融合タンパク質の一部としてタグが発現するように、
提示ベクター中に挿入される。タグと提示されるポリペプチドの両方とも、パッ
ケージの外表面に露出していれば、これらの成分の相対的順序は、特に重要では
ない。例えば、タグは外表面タンパク質と提示されるポリペプチドの間に位置し
たり、融合タンパク質の露出した末端またはその付近に位置することが可能であ
る。
【００７７】 Fabを提示する提示パッケージでは、Fab重鎖又はFab軽鎖のいずれにも融合で
き、どちらの鎖がファージコートタンパク質に連結しているかは関係ない。選択
的に、重鎖および軽鎖に各々1つずつ融合した2つの異なるタグを使用することも
できる。1つのタグは、通常ファージコートタンパク質とこれに連結した抗体鎖
の間に位置し、他方はパートナー鎖のN末端またはC末端に位置する。
【００７８】 3．多価ライブラリーメンバーの選択 多価ライブラリーメンバーの選択は、ライブラリーメンバーのタグ成分の受容
体をライブラリーに接触させて実行される。通常は、固相に固定された受容体を
ライブラリーに接触させ、ライブラリーメンバーのタグを介した受容体への結合
が平衡状態に達するようにする。その後、結合した受容体およびライブラリーメ
ンバーを、受容体が親和性を持つ固相を添加することによって（例えば、ビオチ
ン標識された受容体を固定するために、アビジン標識された固相が使用できる）
、溶液から取り出す。または、ライブラリーに溶液中の受容体を接触させ、その
後、受容体を固定することもできる。受容体の濃度は、通常、液相結合でのタグ
/受容体のKdまたはそれ以上で、そのため標識されたタグの大部分は、平衡状態
で受容体に結合する。受容体-ライブラリーメンバーが固相と接触すると、固相
と溶液中のライブラリーメンバーを分離した後では、少なくとも2つの提示され
たタグを介して受容体に結合したライブラリーメンバーのみが、固相に結合した
ままになる。1つのタグを介して受容体に結合したライブラリーメンバーは、固
相の分離および洗浄の間に、固相から離れると考えられる。結合しなかったライ
ブラリーメンバーを除去した後、イオン強度またはpHの変化、または受容体への
結合においてタグと競合する物質を添加することによって、結合したライブラリ
ーメンバーを、受容体および固相から分離することができる。例えば、アガロー
ス上に固定されNi2+を含む金属キレートリガンドのヘキサヒスチジン配列への結
合は、溶液にイミダゾールを添加して、金属キレートリガンドの結合に対して競
合させることで、容易に逆行できる。抗体-ペプチド結合は、pHを10.5またはそ
れ以上に上昇させることで、しばしば分離できる。
【００７９】 この方法で選択されたライブラリーメンバー当たりのポリペプチドの平均数は
、いくつかの要素による影響を受ける。液相結合中の受容体濃度を低下させると
、選択されたライブラリーメンバーの平均ポリペプチド数が上昇する。洗浄条件
のストリンジェンシーを上げても、やはり選択されたライブラリーメンバー当た
りの平均ポリペプチド数が上昇する。ライブラリーメンバーおよび固相の間の物
理的関係も操作して、ライブラリーメンバー当たりの平均ポリペプチド数を増加
させることができる。例えば、固相として分離した粒子が使用される場合、粒子
サイズを低下させると、結合の立体的制約が増加し、ライブラリーメンバー当た
り提示されるポリペプチドの密度が高くなる必要がある。
【００８０】 それぞれが1つの抗体鎖に結合した2つのタグを持つFabライブラリーでは、2回
の類似した選択を実行でき、1回目の産物が、2回目の出発材料になる。1回目の
選択は、第1のタグに対する受容体を用いて行い、2回目は第2のタグに対する受
容体を用いる。両方のタグで選択を行なうと、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方を2
コピー（2つのFab断片）提示するライブラリーメンバーを濃縮できる。
【００８１】 上述の多価濃縮方法の元になる理論は正しいと考えられているが、本発明の実
施は、この理論の正しさには依存しない。タグに結合するメンバーを提示ライブ
ラリーから予備スクリーニングした後、標的に結合するメンバーをスクリーニン
グすると、予備スクリーニング段階なしで行なった場合よりも、標的に対する親
和性を持ったメンバーをさらに高度に濃縮できる。したがって、本方法は上述の
ように実施可能であり、基となる機構を理解せずに、高度に濃縮されたライブラ
リーという望ましい結果を得ることができる。
【００８２】 4．標的に対する親和性による選択 タグ受容体に対する予備スクリーニングを伴いまたは伴わずに、抗体鎖を提示
するライブラリーメンバーは、標的に対する結合によってスクリーニングされる
。標的は、結合パートナーを同定することが望ましい、関心対象の任意の分子で
ありうる。標的は、タグ（使用する場合）に対する特異的な結合親和性を持たな
いようにする。これは、この段階でスクリーニングするのは提示されたポリペプ
チドであって、標的に結合するタグではないためである。この段階のスクリーニ
ング手順は、親和性試薬がタグに対する受容体ではなく、関心対象の標的である
ということ以外は、予備スクリーニング段階と非常に類似している。通常は、固
定化できるような方法で標識（例えば、ビオチンを使用）された標的に、濃縮さ
れたライブラリーメンバーを接触させる。平行に達するまで結合させた後、パン
ニングとして知られる過程において、固相と接触させることで標的を溶液からと
りだす（ParmleyおよびSmith、Gene73:305-318 (1988)）。選択過程を通じて固
相に結合したままのライブラリーメンバーは、ライブラリーメンバーと固定化さ
れた標的分子の間の多価の結合のために、結合したままとなる。結合しなかった
ライブラリーメンバーは、固相から洗い流される。いくつかの方法では、ライブ
ラリーメンバーは関心対象の受容体を提示する細胞への結合によって、スクリー
ニングされる。その後、遠心によって細胞集団全体を回収するか、ファージ特異
的抗体で標識し、磁気ビーズまたはFACS（商標）を用いて細胞に結合した標識フ
ァージを分離することによって、ファージに結合した画分を単離する。
【００８３】 通常、ライブラリーメンバーは、次のスクリーニングを行なう前に増幅してお
く。しばしば、結合したライブラリーメンバーは、支持体から分離することなく
増幅できる。例えば、ビーズに固定化された遺伝子VIIIファージライブラリーメ
ンバーは、大腸菌の培養液にビーズを浸すことで増幅できる。同様に、細菌の提
示ライブラリーも、結合したライブラリーメンバーに増殖培地を添加することで
、増幅できる。または、その後の選択、増幅、または増殖を行なう前に、結合し
たライブラリーメンバーを固相から分離（例えば、イオン強度またはpHの変化に
よる）しても良い。
【００８４】 親和性選択の後、結合したライブラリーメンバーで、関心対象の標的に対する
特異的な親和性を持つ抗体鎖（および予備スクリーニング段階が行われている場
合には多価提示メンバー）の濃縮を行なう。その後の増幅の後では、2次ライブ
ラリーの作製のため、2次ライブラリーでは標的に対する特異的親和性を持つポ
リペプチドの提示については濃縮されているが、増幅の結果として、ポリペプチ
ドの多価提示に関しては濃縮されていない。したがって、2回目の多価濃縮を行
ない、その後、スクリーニング標的に対する2回目の親和性濃縮を行なうことが
できる。望ましい度合いの濃縮が得られるまで、選択的に、スクリーニング標的
に対する更なる親和性濃縮と、増幅および多価提示の濃縮とを交互に行なうこと
ができる。
【００８５】 ある変法では、標的に対する親和性スクリーニングは、標的に類似しているが
同一ではない化合物との競合して行われる。そのようなスクリーニングは、その
化合物には存在しない、標的エピトープに結合するライブラリーメンバーを優先
的に選択する。別の変法では、結合したライブラリーメンバーは、標的と既知の
交差反応性を持つ化合物と、抗原に対して競合して、固相から分離できる。標的
に対して既知の化合物と同一または類似した結合特異性を持つライブラリーメン
バーは、優先的に溶出される。その化合物の認識するエピトープとは異なるエピ
トープを通して、標的に対する親和性を持つライブラリーメンバーは、固相に結
合したままになる。
【００８６】 標的に対する異なる１価の親和性を持つ抗体鎖間の選択における識別は、ライ
ブラリーメンバーの結合価および固相結合における標的の濃度によって、影響さ
れる。ライブラリーメンバーを固相に固定するために、ライブラリーメンバーに
は少なくともi個の標識標的分子が結合しなければならないと仮定すると、n個の
ポリペプチドを提示するライブラリーメンバーの固定化の確率が計算できる。質
量作用の法則から、結合/総抗体鎖の割合Fは、K[targ]/(1+ K[targ])で、[targ]
は溶液中の標的の総濃度である。したがって、1つのライブラリーメンバーにつ
きiまたはそれ以上の提示された抗体鎖が標識抗体に結合する確率は、二項確率
分布によって与えられる：
【数２】
【００８７】 確率はKおよび[target]の関数であるので、それぞれ標的に対して一価の親和
性Kを持つ多価提示メンバーは、標的の濃度を変えることによって選択できる。
ライブラリーメンバーが一価の親和性0.1/[Ag]、1/[Ag]、および10/[Ag]を示し
、メンバー当たりn個のポリペプチドを提示している場合に、i=1、2、または3の
ときの固相固定化の確率は、以下の通りである。 固定化の確率（i＝1） 固定化の確率（i＝2） 固定化の確率（i＝3）
【００８８】 上記の表は、異なる一価の結合親和性を持つポリペプチドの固定化の識別が、
ライブラリーメンバーの結合価(n)および溶液結合相の標的の濃度によって影響
されることを示す。n（ファージ当たり提示されるポリペプチドの数）がi（固相
結合に必要な最低の結合価）に等しいときに、識別が最大化する。液相結合中の
標的濃度を下げることによっても、識別が増加する。通常、標的濃度は、単離し
ようとするポリペプチドのKd付近である。10-8〜10-10Mの標的濃度が典型的であ
る。
【００８９】 上記の方法で作製された濃縮されたライブラリーは、標的に対する特異的親和
性を持つポリペプチドをコードするメンバーの割合が高いという特徴を持つ。例
えば、メンバーの少なくとも10％、25％、50％、75％、80％、90％、95％または
99％が、標的に対する特異的親和性を持つ抗体鎖をコードする。いくつかのライ
ブラリーでは、メンバーの少なくとも10％、25％、50％、75％、80％、90％、95
％または99％が、少なくとも108 M-1、109 M-1、または1010 M-1の親和性を持つ
。二重鎖抗体のライブラリーでは、抗体の重鎖および軽鎖をコードするセグメン
ト対が、ライブラリーメンバーと考えられる。増幅すると遺伝的欠失の割合を上
昇させるので、標的に親和性を持つメンバーの正確な割合は、選択後にライブラ
リーが増幅されたかどうかに依存する。しかし、全長のポリペプチドコード配列
を持つメンバーの中では、標的に対する特異的親和性を持つポリペプチドをコー
ドする割合は、非常に高い（例えば、少なくとも50％、75％、80％、90％、95％
または99％が108M-1、109 M-1、または1010 M-1の親和性を持つ）。標的に対す
る特異的親和性を持つ抗体鎖をコードする全てのライブラリーメンバーが、必ず
しも抗体鎖を提示するわけではない。例えば、全長のコード配列を持つメンバー
の95％が、標的に対する特異的親和性を持つ抗体鎖をコードするライブラリーで
は、通常は抗体鎖を実際に提示するのは半分以下である。通常は、そのようなラ
イブラリーは少なくとも4、10、20、50、100、1000、10,000または100,000の異
なるコード配列を持つ。通常、そのようなコード配列の任意の1つは、ライブラ
リーにおけるコード配列全体の、50％、25％または10％未満である。
【００９０】 F．抗体鎖の発現ベクターへのサブクローニング 提示ライブラリーメンバーのスクリーニングでは、通常、標的に対する特異的
な親和性を持つライブラリーメンバーの亜集団が得られる。この時点で、いくつ
かの選択肢がある。いくつかの方法では、ライブラリーメンバーのクローン単離
株が得られ、各単離株が直接に使用される。他の方法では、ライブラリーメンバ
ーのクローン単離株が得られ、各単離株から抗体鎖をコードするDNAが増幅され
る。通常、発現ベクターへの導入の前に、同一のDNA分子の成分として、重鎖お
よび軽鎖が増幅され、提示ベクター中に存在する重鎖および軽鎖の組み合わせは
発現ベクター中で保存される。ヒト可変領域およびヒト定常領域の両方を含む提
示された抗体鎖では、通常、可変領域および定常領域の両方をコードする核酸が
サブクローニングされる。別の方法では、各メンバーのクローン単離をせずに、
ライブラリーメンバーのプールから抗体鎖をコードする核酸は増幅され、発現ベ
クターの複数のコピーへまとめてサブクローニングされる。
【００９１】 ここで提示ベクターから発現ベクターへの核酸の混合集団の導入について、サ
ブクローニング過程を詳述する。個々の提示ベクターのクローン単離株から得ら
れた核酸にも、基本的に同じ過程を使用できる。
【００９２】 サブクローニングされる抗体鎖をコードする核酸を、隣接配列の制限酵素消化
により切り出すか、またはコード配列に隣接する部位に対するプライマーを用い
てPCRで増幅する。一般的に「PCR技術：DNA増幅のための原理と応用(PCR Techno
logy:Principles and Applications for DNA Amplification)」(H.A. Erlich編
、Freeman Press、NY、NY、1992)；「PCRプロトコール：方法と応用の手引き(PC
R Protocols: A Guide to Methods and Applications)」(Innisら編、Academic
Press、San Diego、CA、1990)；Mattilaら、Nucleic Acids Res. 19:967 (1991)
; Eckertら、PCR Methods and Applications 1:17 (1991); PCR (McPhersonら編
、IRL Press、Oxford)を参照されたい。PCRプライマーは、発現ベクターに導入
されたときに増幅された断片の陽性選択をするために、マーカー配列を含むこと
がある。PCRプライマーは、発現ベクターへのクローニングのために、制限酵素
部位も含むことがあるが、これは必須ではない。Fabライブラリーでは、提示ベ
クター中で重鎖および軽鎖が互いに隣接または近くに挿入されていれば、2つの
鎖は一緒に増幅または切り出しできる。いくつかのFabライブラリーでは、抗体
鎖の可変領域のみが切り出されるか、増幅される。Fabライブラリーの重鎖又は
軽鎖が別々に切り出されるか増幅される場合は、その後、同一または異なる発現
ベクターに挿入できる。
【００９３】 提示された抗体鎖をコードする断片を切り出しまたは増幅したら、断片は通常
、アガロースゲルまたはショ糖勾配上で大きさによって精製される。通常、断片
はコード配列の種々の欠失型に対応する低分子側にスミアを伴う、単一の鮮明な
全長のバンドとなる。全長のコード配列に対応するバンドは、ゲルまたは勾配か
ら取り出され、これらの配列がその後の段階で使用される。
【００９４】 次の段階は、全長のコード配列をコードする核酸を、発現ベクターに連結して
、異なる挿入物を持つ発現ベクターの改変型の集団を作製する段階である。これ
は、切断した発現ベクターと、適合する末端を持つように切断した挿入物の混合
物との通常の連結で行われうる。または、挿入物DNAに対する制限酵素の使用を
避けることができる。挿入物配列内に天然にコードされる制限酵素部位が存在す
る可能性があり、従って、制限酵素で処理するとその配列を破壊することになる
ため、このクローニング法は有利である。制限酵素なしでクローニングするには
、挿入物と直線状にしたベクター配列の混合集団を、T4DNAポリメラーゼまたは
エキソヌクレアーゼIIIのような3'-5'エキソヌクレアーゼで簡単に処理する。Sa
mbrookら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual）」(第2版、CSHP、NY、1989)を参照されたい。消化によって生
成した挿入物の突出した5'末端は、ベクターの消化によって生成した一本鎖突出
と相補的である。この突出をアニーリングさせ、アニーリングしたベクターをレ
シピエントの宿主細胞にトランスフェクトする。3'-5'エキソヌクレアーゼのか
わりに5'-3'エキソヌクレアーゼを用いても、同じ結果が得られる。
【００９５】 好ましくは、発現ベクターへの挿入物の連結は、アニーリングしたベクターと
未切断のベクターを識別できるような条件下で行なう。非許容温度でアニーリン
グしたベクターを排除する選択を可能にする、条件致死遺伝子を含むベクターが
いくつか知られている。例えば、ConleyおよびSaunders、Mol. Gen. Genet. 194
:211-218(1984)を参照されたい。これらのベクターは、挿入物を受け取ったベク
ターの陽性選択を可能にする。選択は、陽性選択マーカー（例えば、抗生物質耐
性）の一部が削除されるような方法で、発現ベクターを切断しても実施できる。
失われた部分は、全長の挿入物によって供給される。この部分は、提示ベクター
のポリペプチドコード配列の3'末端に導入されるか、挿入物の増幅に使用される
プライマーに含まれてもよい。pBR誘導体ベクターのHindIII切断によって削除さ
れたテトラサイクリン耐性遺伝子プロモーターの一部を挿入物が提供する、典型
的選択スキームは、実施例14に記述されている。
【００９６】 発現ベクターの選択は、ベクターを発現する予定の宿主細胞に依存する。通常
は、ベクターはプロモーターおよび他の調節配列が、挿入されるコード配列に機
能的に連結していて、後者が発現されるようになっている。誘導条件以外では挿
入された配列の発現を妨げるためには、誘導性プロモーターを利用するのが都合
が良い。誘導性プロモーターには、アラビノース、lacZ、メタロチオネインプロ
モーター、または熱ショックプロモーターが含まれる。非誘導条件では、宿主細
胞の発現産物に対する忍容性がより高いコード配列の集団に偏向することなく、
形質転換された生物体の培養物の増殖が可能になる。ベクターは、挿入された配
列にコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成する、分泌シグナル配
列位置を提供することもあるが、挿入されるポリペプチドは、ベクターへ導入さ
れる前にシグナル配列に連結されることも多い。抗体軽鎖及び抗体重鎖の可変領
域をコードする配列を受け取るために使用されるベクターは、挿入される鎖との
融合タンパク質として発現され得る定常領域またはその一部をコードする場合も
あり、それによって完全な抗体またはその断片が産生されるようになる。通常は
、そのような定常領域はヒトのものである。保守的な変異は、好ましくはないも
のの、許容される。例えば、提示パッケージがCH1定常領域に連結された重鎖可
変領域、および完全な軽鎖定常領域に連結された軽鎖可変領域を提示し、完全な
抗体鎖が提示ベクターから発現ベクターに導入される場合、発現ベクターは、ヒ
ト重鎖定常領域ヒンジである、CH2およびH3領域を、挿入された重鎖核酸のCH1領
域とインフレームでコードするように設計でき、その結果、完全な抗体が発現さ
れることになる。もちろん、ヒト重鎖定常領域のどのセグメントが提示パッケー
ジによって供給され、どの部分が発現ベクターによって供給されるかという点で
は、多くの小さな変法が可能である。例えば、提示パッケージはCH1領域、およ
びヒンジ領域の一部または全体を含むように設計できる。この場合は、完全な抗
体の発現のためには、発現ベクターはヒンジ領域の残りの部分（存在する場合）
、およびCH2およびCH3領域を供給するように設計される。
【００９７】 大腸菌は特に本発明のポリヌクレオチドのクローニングに有用な1つの原核細
胞宿主である。使用に適当な他の微生物宿主には、Bacillus subtilis（枯草菌
）のようなバチルス属、およびSalmonella(サルモネラ)、Serratia（セラチア）
および種々のPseudomonas（シュードモナス）種のような、他の腸内細菌が含ま
れる。これらの原核細胞宿主では、発現ベクターも作製でき、これには通常、宿
主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製開始点）が含まれる。さらに、ラ
クトースプロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系、βラクタマー
ゼプロモーター系、またはλファージのプロモーター系のような、任意の数の周
知のプロモーターの変種が存在する。通常、プロモーターは選択的にオペレータ
ー配列と共に発現を制御し、転写および翻訳の開始および完了のために、リボソ
ーム結合部位配列などを持っている。
【００９８】 酵母のような他の微生物も、発現に使用できる。Saccharomyces（サッカロミ
セス）は好ましい宿主であり、3-ホスホグリセレートキナーゼまたは他の糖分解
酵素を含むプロモーターのような発現制御配列、および複製開始点、終結配列や
、所望の類似物を有するベクターを持つ。バキュロウイルスベクターと組み合わ
せて、昆虫細胞も使用できる。
【００９９】 本発明のポリペプチドの発現および産生に、哺乳類組織細胞培養も使用できる
（Winnacker、「遺伝子からクローンへ(From Genes to Clones)」(VCH Publishe
rs、N.Y.、N.Y.、1987)。CHO細胞株、種々のCos細胞株、HeLa細胞、骨髄腫細胞
株、形質転換したB細胞およびハイブリドーマを含め、完全な免疫グロブリンを
分泌する能力を持ついくつかの適切な宿主細胞株が開発されている。これらの細
胞のための発現ベクターには、複製開始点、プロモーター、およびエンハンサー
のような発現制御配列（Queenら、Immunol. Rev. 89:49-68 (1986)）、およびリ
ボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結
配列のような必要なプロセッシング情報部位が含まれ得る。好ましい発現制御配
列は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、ま
たはサイトメガロウイルス由来のプロモーターである。
【０１００】 関心対象のポリヌクレオチド配列を含むベクターの導入方法は、細胞宿主の種
類に依存する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核細胞によ
く利用されるが、他の細胞宿主には、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポ
レーションが使用される場合がある（一般にSambrookら、上記、参照）。
【０１０１】 発現されると、培地または宿主細胞から、抗体の集団が精製される。通常、抗
体鎖はシグナル配列を伴って発現され、培地中に放出される。しかし、抗体鎖が
宿主細胞によって自然に分泌されない場合には、穏やかな界面活性剤処理によっ
て、抗体鎖を放出できる。その後、抗体鎖を、硫酸アンモニウム沈殿、固定化し
た標的に対する親和性クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ゲル電
気泳動などを含む、通常の方法によって精製できる（一般に、Scopes、「タンパ
ク質の精製(Protein Purification)」(Springer-Verlag、N.Y.、1982)）参照）
。
【０１０２】 上述の方法で、選択した標的に対する特異的な親和性を持つ抗体鎖をコードす
る核酸配列の新規のライブラリーが得られる。核酸ライブラリーは、通常、少な
くとも5、10、20、50、100、1000、104または105の異なるメンバーを持つ。通常
、ライブラリー中の全体の配列の25％または50％以上を構成する単一のメンバー
はない。通常は、ライブラリーメンバーの少なくとも25％、50％、75％、90％、
95％、99％または99.9％が、標的分子に対する特異的親和性を持つ抗体鎖をコー
ドする。二重鎖抗体ライブラリーの場合は、それぞれ重鎖および軽鎖をコードす
る核酸セグメントのペアがライブラリーメンバーと考えられる。核酸ライブラリ
ーは、遊離の形態で、任意のベクターの成分として、またはベクターの成分とし
て宿主細胞にトランスフェクトされて存在しうる。
【０１０３】 核酸ライブラリーを発現して、標的に特異的親和性を持つ抗体のポリクローナ
ルライブラリーを作製することができる。そのようなライブラリーの組成は、ヌ
クレオチドライブラリーの組成によって決まる。したがって、通常そのようなラ
イブラリーは、異なるアミノ酸組成を有する、少なくとも5、10、20、50、100、
1000、104または105のメンバーを持つ。通常、ライブラリー中の全体のポリペプ
チドの25％または50％以上を構成する単一のメンバーはない。抗体鎖ライブラリ
ー中で標的に対する特異的親和性を持つ抗体鎖の割合は、通常、抗体鎖をコード
する対応する核酸の割合よりも低い。この差は、適切な折畳みを支持するような
適切なアミノ酸の１次構造を持っているにもかかわらず、すべてのポリペプチド
が結合に適切な構造に折り畳まれるわけではないという事実に起因する。いくつ
かのライブラリーでは、抗体鎖の少なくとも25％、50％、75％、90％、95％、99
％または99.9％が、標的分子に対する特異的親和性を持つ。また、複数の鎖を持
つ抗体のライブラリーでは、各抗体（Fabまたは完全な抗体）が、ライブラリー
メンバーと考えられる。異なる抗体鎖は、標的に対する細かい結合特異性および
親和性の点で互いに異なっている。そのようなライブラリーのいくつかは、同一
の抗体上の異なるエピトープに結合するメンバーを含む。そのようなライブラリ
ーのいくつかは、互いに競合することなく、同一の抗原に結合する少なくとも2
つのメンバーを含む。
【０１０４】 上述の方法で得られたヒト抗体のポリクローナルライブラリーは、本ライブラ
リー中では高親和性の結合をするメンバーの割合が高く、本ライブラリーは通常
、天然の集団に存在するのと同じ抗体の多様性を示さないという点で、ヒト抗体
の天然の集団から区別される。本ライブラリーの多様性が低下しているのは、材
料を提供するトランスジェニック非ヒト動物が、全てのヒト免疫グロブリン遺伝
子を含んでいるわけではないためである。例えば、ポリクローナル抗体ライブラ
リーの中には、λ軽鎖を持つ抗体がないものがある。本発明のいくつかのポリク
ローナル抗体ライブラリーは、10、20、30または40未満のVH遺伝子によってコー
ドされる抗体重鎖を持つ。本発明のいくつかのポリクローナル抗体ライブラリー
は、10、20、30または40未満のVL遺伝子によってコードされる抗体軽鎖を持つ。
【０１０５】 III．検出法1．検出試薬用ヒト抗体の特性 本発明の検出法用のヒト抗体は好ましくは上記の方法を用いて生産される。こ
の方法は結果として、任意のエピトープ結合特異性および任意の所望の標的に対
して著しい高親和性を有する事実上無限の数のヒト抗体を生じる。一般的には標
的に対する抗体の結合親和性が高いほど、標的抗原を取り去ることなく非特異的
に結合している物質を除去するために、免疫アッセイ法においてより高ストリン
ジェントな洗浄条件を実施することが可能である。したがって、上記アッセイ法
に使用されるヒト抗体は通常少なくとも108、109、1010、1011または1012M-1の
結合親和性を有する。さらに検出試薬として使用される抗体は、実施例28に記載
されているような標準条件下で少なくとも12時間、好ましくは少なくとも5時間
、およびより好ましくは少なくとも1時間で平衡に達するような十分な速度（on-
rate）を有していることが望ましい。
【０１０６】 本方法で使用されるヒト抗体は、好ましくは高い免疫反応性を有しおり、その
ため、それらの標的抗原に対して特異的に結合することが可能なように適切に折
り畳まれる抗体分子の割合が高い。そのようなことは、上記のように大腸菌内で
抗体をコードする配列を発現させることにより達成されうる。そのような発現は
通常少なくとも80％、90％、95％または99％の免疫反応性を生じる（表4参照）
。
【０１０７】 本発明のいくつかの方法は、検出試薬としてヒト抗体のポリクローナル調製物
を利用し、他の方法はモノクローナル単離物を利用する。ポリクローナル混合物
の使用は、1つのモノクローナル抗体からなる組成物に対して多数の有利な点を
有する。標的の複数部位に結合することにより、ポリクローナル抗体または他の
ポリペプチドは、単一部位に結合するモノクローナルよりもより強い（検出用）
シグナルを発生することができる。さらに、ポリクローナル調製物はプロトタイ
プ標的配列の多数の変異体（例えば、対立遺伝子変異体、種変異体、系統変異体
、薬剤誘導性回避変異体）に結合することが可能であり、一方モノクローナル抗
体はそのプロトタイプ配列またはそれに対するより狭い範囲の変異体にのみ結合
する可能性がある。しかし、モノクローナル抗体は密接に関連した抗原存在下ま
たは存在の可能性がある条件下で、単一の抗原を検出する用途において利点があ
る。
【０１０８】 上記の方法に従い調製されたヒトポリクローナル抗体を利用する方法において
、調製物は典型的には意図している標的抗原に対して異なるエピトープ特異性を
有する抗体の組み合わせを含む。これは実施例26に記載されている方法により立
証することができる。モノクローナル抗体を利用するいくつかの方法では、異な
るエピトープ結合特異性を持つ2つの抗体を有することが望ましい。エピトープ
結合特異性の差異は、競合アッセイ法により決定することができる。
【０１０９】2．試料および標的 ヒト抗体は検出試薬として任意の種類の試料に対して使用することができるが
、ヒト試料用検出試薬として最も有用である。試料は患者の任意の組織または体
液から獲得することが可能である。試料の好ましい供与源は、全血液、血漿、精
液、唾液、涙、尿、糞便物質、汗、口腔、皮膚または髪を含む。試料はまた、内
部臓器の生検または癌から獲得することが可能である。試料は、診断もしくは研
究用として臨床患者から、または対照または基礎研究用として疾患を有さない個
体から獲得することが可能である。同一個体に由来する単一または複数の試料は
、複数の標的抗原に対する結果の広範囲なパネルを生成するために、1つまたは
複数の標的抗原に対してアッセイすることができる。複数の標的抗原に対する結
果の多変量解析は、特定の目的のためのパネルの感度および特異性を改善するた
めに使用することができる。1個体からの複数の標的に対する1つまたは複数の試
料のアッセイ法により、サンプリング時に個体の表現型の特徴を明らかにするこ
とが可能となる。健常人の集団に由来する複数の標的抗原に対するアッセイ結果
により、標準表現型を定義付けることが可能になり、且つ確立された標準範囲を
逸脱する1つまたは複数の標的抗原に対するアッセイ結果により、表現型的に正
常と異なる個体が同定される。そのような差異は、疾患診断、疾患予後または特
定の薬物治療に対する個体の応答を決定するために使用することができる。
【０１１０】 本方法は任意の型の標的抗原を検出するために使用することができる。代表的
な標的抗原は、IV、肝炎（A、BおよびC型）、インフルエンザ、ヘルペス、ジア
ルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌等のヒト疾患を引
き起こす細菌、カビ、およびウイルス性病原体を含む。他の標的抗原は、発現レ
ベルまたは組成がヒト疾患または他の表現型と相関しているヒトタンパク質であ
る。そのような抗原の例は、接着タンパク質、ホルモン、増殖因子、細胞受容体
、自己抗原、自己抗体、およびアミロイド沈着を含む。対象となるその他の標的
は癌胎児性抗原等の腫瘍細胞抗原である。対象となるその他の抗原は、クラスI
およびクラスII MHC抗原である。対象となるその他の標的は、組織試料、全血液
、血漿、血清、脳脊髄液、精液、唾液、涙、尿、糞便物質、汗、口腔、皮膚、お
よび髪中のヒトタンパク質を分離および特徴付けするために二次元ゲル電気泳動
と質量分析法と組み合わせて適用することにより同定することができる全てのタ
ンパク質を含む。
【０１１１】3．HAMAおよび異好性抗体 少なくともいくつかのヒト試料は、異なる種に由来する抗体に特異的に結合す
るヒト抗体を含んでいる。いくつかのそのようなヒト抗体は、ヒト以外の種に由
来する抗体のアイソタイプに結合し、他のヒト抗体はヒト以外の種に由来する抗
体のイディオタイプに結合する。そのようなヒト抗体は様々な機構により生じう
る。例えば、ヒト患者に対するマウス抗体（例えば食品薬品局認可済みOKT3）の
投与は、典型的にはヒト抗マウス応答を生じる。同様の応答はマウス抗原への環
境暴露によっても生じうる。他の種、例えばウサギまたはウシなどに由来する抗
体に特異的に結合するヒト抗体は、同様にウサギまたはウシに由来する抗原の環
境暴露によっても生じうる。さらにヒトを、特定のウイルス、特に感染性単球増
加症の原因病原体であるエプスタイン-バーウイルスに暴露することは、ヒト以
外の種に由来する抗体に結合する異好性抗体と名づけられている特定のクラスの
抗体を生成する。
【０１１２】 ヒト患者試料中のヒト以外の種に由来する抗体に反応性であるヒト抗体の頻度
は、様々な報告において課題となっている。例えば、ヒト抗マウスIgGの推定頻
度は異なる研究において0.72％から80％に変動しており、ヒト抗ウサギIgGの推
定は0.09％から5％に変動している（Krickaら、Clinical Chemistry 45：942
〜956（1999）を参照のこと）。頻度が正確であるかに関わらず、任意のヒト試
料が、いくつかの非ヒト動物由来の抗体に反応するヒト抗体を含んでいるという
重大な危険性が明らかである。したがって検出試薬としてヒト以外の種に由来す
る抗体を使用することで、不正確な結果が生じる危険を冒している。不正確性は
キメラ抗体を使用することにより減少させることができるが、消し去ることはで
きない。キメラ抗体のイディオタイプに結合するヒト抗体の存在のために、いく
らかの不正確性は残存する。しかしながら不正確性は、診断試薬としてヒト抗体
を使用することにより消去される。完全にヒト型の抗体に結合する抗体は典型的
なヒト試料中には存在しない。
【０１１３】4．検出アッセイ法の形式 ヒト抗体は様々な標準的アッセイ形式において所定の標的を検出するために使
用することができる。そのような形式は、免疫沈降法、ウエスタンブロッティン
グ、ELISA、放射免疫アッセイ法、競合およびアイソメトリックアッセイ法を含
む。HarlowおよびLane、「抗体、実験室マニュアル（Antibodies, A Laboratory
Manual）」（CSHP、NY、1988）、米国特許第3,791,932号、同第3,839,153号、
同第3,850,752号、同第3,879,262号、同第4,034,074号、同第3,791,932号、同第
3,817,837号、同第3,839,153号、同第3,850,752号、同第3,850,578号、同第3,85
3,987号、同第3,867,517号、同第3,879,262号、同第3,901,654号、同第3,935,07
4号、同第3,984,533号、同第3,996,345号、同第4,034,074号、および同第4,098,
876号を参照のこと。
【０１１４】 アイソメトリックまたはサンドイッチアッセイ法は好ましい形式である（米国
特許第4,376,110号、同第4,486,530号、同第5,914,241号、および同第5,965,375
号を参照のこと）。そのようなアッセイ法は、固相に固定された単一の抗体また
は抗体集団、および溶液中の別の抗体または抗体集団を使用する。典型的には、
溶液抗体または抗体集団は標識化される。ある抗体集団が使用される場合に、集
団は典型的には、標的抗原内の異なる特異的エピトープ特異性で結合する抗体を
含んでいる。したがって同一の集団を固相および溶液抗体の両方に使用すること
ができる。モノクローナル抗体を使用する場合、異なる結合特異性を有する第1
および第2のモノクローナル抗体を固相および液相に使用する。固相および溶液
抗体を、いずれかの順番で、または同時に標的抗原に接触させることができる。
固相抗体を最初に接触させる場合には、アッセイ法はフォワードアッセイ法と見
なされる。逆に、溶液抗体を最初に接触させる場合には、アッセイ法はリバース
アッセイ法と見なされる。標的を同時に2つの抗体に接触させる場合には、アッ
セイ法は同時アッセイ法と見なされる。標的と抗体とを接触させた後に、通常は
約10分から約24時間の間、通常は約1時間、試料とインキュベーションされる。
その後、検出試薬として使用されている抗体に非特異的に結合している試料成分
を除去するために、洗浄段階が実施される。固相および溶液抗体が別々の段階で
結合される場合には、洗浄はいずれかのまたは両方の結合段階での後で実施して
もよい。洗浄後、典型的には標識化溶液抗体の結合を介して固相に連結された標
識を検出することにより、結合を定量化する。通常は所定の抗体の対または抗体
集団および所定の反応条件のために、既知濃度の標的抗原を含む試料から検量線
が作製される。その後、試験される試料中の抗原濃度が、検量線に挿入されるこ
とにより測定される。分析物は、平衡状態で結合している標識化溶液抗体の量か
ら、または平衡に達する前に一連の時点において結合している標識化溶液抗体を
反応速度論的に測定することのいずれかにより測定されうる。そのような曲線の
傾きが試料中の標的濃度の指標となる。
【０１１５】 競合アッセイ法もまた好ましい形式である。いくつかの方法においては、試料
中の標的抗原は、抗体検出試薬に対する結合において、外因性に供給された標識
化標的抗原と競合する。抗体に結合している標識化標的抗原の量は試料中の標的
抗原の量に反比例する。抗体は、検出に先立ち試料から結合複合体を分離するこ
とを容易にするために固定されてもよく（異種遺伝子型アッセイ法）、または同
種遺伝子型アッセイ形式で実施されているように分離は不要である可能性がある
。他の方法では検出試薬として使用される抗体は標識化される。抗体が標識化さ
れる場合に、その結合部位は試料中の標的抗原、および外因性に供給された型の
標的抗原（例えば固相に固定された標的抗原であってもよい）に対する結合を競
合する。標識化抗体はまた、また別の競合形式において、標識化抗体と同じ標的
抗原に結合する試料中の抗体を検出するために使用することができる。上記の各
形式において、検出試薬として使用される抗体は、大まかには、アッセイされる
標的と同じ程度の濃度で限られた量が存在する。競合アッセイ形式における検出
試薬としてのヒト抗体の使用は、試料中に存在する可能性を有するHAMAまたは異
好性抗体が原因となる干渉を減少または除去する。
【０１１６】 上記方法で使用される適切な検出可能標識は分光学的手段、光化学的手段、生
化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、化学的手段、またはそ
の他の手段により検出可能である任意の部分を含む。例えば適切な標識は、標識
化ストレプトアビジン結合体を用いて染色されるビオチン、蛍光色素（例えばフ
ルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、およびその
同等物）、放射性標識（例えば3H、125I、35S、14Cまたは32P）、酵素（例えば
西洋ワサビペルオキシターゼ、アルカリフォスファターゼ、およびELISAにおい
て一般的に使用される他のもの）、ならびに金コロイドまたは有色ガラスまたは
プラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスビーズ）など
の比色標識を含む。そのような標識の使用を記載した特許は、米国特許第3,817,
837号、同第3,850,752号、同第3,939,350号、同第3,996,345号、同第4,277,437
号、同第4,275,149号、および同第4,366,241号を含む。「蛍光プローブおよび研
究化学物質ハンドブック（Handbook of Fluorescent Probes and Research Chem
icals）」（第6版、モリキュラープローブ社、ユージン、オレゴン州）も参照の
こと。放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーション計測器を用いて検出
することが可能であり、蛍光マーカーは、放射光を検出するための光検出器を用
いて検出することが可能である。酵素標識は、典型的には酵素に基質を提供し、
基質に対する酵素反応により生産される反応産物を検出することにより検出され
、比色標識は、有色標識を単に可視化することにより検出される。
【０１１７】 検出試薬として使用される抗体は、使用される検出形式によって標識されても
されなくてもよい。例えば、典型的には固相に固定されている抗体により標的抗
原が結合された後に、標的抗原を検出するために、質量分析法または表面プラズ
モン共鳴が使用されるような形式においては、標識を使用することなく、抗体検
出試薬は直接的に使用することができる。質量分析法は、固定化抗体から結合し
ている標的抗原を脱着させるためにレーザーエネルギーを使用し、荷電した標的
抗原を検出することにより、直接的に使用することが可能である（米国特許第6,
027,942号、同第6,020,208号）。または、抗体に結合している標的抗原は、標的
抗原を同定するために質量分析法により検出することができるペプチドファミリ
ーを生成するためにトリプシン消化に供することができる。既知の濃度の標的抗
原を含む標準試料を同一の分析に供することにより、任意の試料中の標的抗原の
濃度を決定することが可能である。非ヒト固定化抗体検出試薬に対するHAMAまた
は異好性抗体の結合は、質量分析法に供される試料中の阻害抗体またはそのペプ
チド断片の存在ために、結果として得られる質量分析のピークの同定に干渉する
可能性がある。本発明において記載されているようにヒト抗体は実質的にまたは
完全にこれらの干渉を取り除く。
【０１１８】 表面プラズモン共鳴（SPR）は、表面に抗体が結合している表面のSPRに対する
標的抗原の質量効果から、抗体に対する標的抗原の結合を直接的に検出する方法
である（Fagerstam、J. Chromatography 597, 397〜410（1992））。試料中にHA
MAまたは異好性抗体が存在すると、そのような抗体がヒト以外の動物種に由来す
る固定化抗体へ決合する結果を生じると思われ、この結合は標的抗原の結合とし
てSPRにより誤って検出されると思われる。標的抗原を検出するために、SPR固相
へ固定するために本発明で記載されているようなヒト抗体を使用することは、こ
の干渉を減少または除去する。
【０１１９】 上記方法に使用するために適している支持体は、たとえば、ニトロセルロース
膜、ナイロン膜、および誘導化ナイロン膜、およびアガロース、デキストラン-
ベース-ゲル、計量棒、粒子状物質、微細球、磁性粒子、試験管、マイクロタイ
ターウェル、セファデックス（SEPHADEX）（商標）（アマシャムファルマシアバ
イオテク、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州）などの粒子、ならびにその
同等物を含む。固定化は吸着または共有結合によってもよい。選択的には、抗体
はアビジンなどの表面結合リンカーに接着させるためのビオチンなどのリンカー
分子に連結されることが可能である。
【０１２０】 ヒト抗体は臨床診断試験を実施するための、および研究目的を含む他のインビ
トロ検出アッセイ法を実施するための検出試薬として使用することができる。い
くつかのインビトロアッセイ法は、アッセイ法の応答が試料中の標的抗原の存在
または非存在に関連するが、アッセイ法が試料中の標的抗原の濃度を決定するよ
うには設計されていない定性的様式で、1つまたは複数の標的抗原の存在を検出
する。通常、定性的アッセイ法は、各標的抗原に対するアッセイ法の検出限界に
通常相当する、試料中における最低限検出可能な抗原量より多い1つまたは複数
の標的抗原の存在を示すように設計されている。しばしば定性的アッセイ法の結
果は、比色応答を用いて視覚的に解釈され、視覚的に検出可能な結果は抗原の存
在を示し、視覚的に検出可能な結果が存在しないことは試料が標的抗原を含まな
いことを示すか、またはその濃度がアッセイ法の感度限界以下であることを示す
。
【０１２１】 他のアッセイ法において、ヒト抗体は試料中の標的抗原の量を準定量的または
相対的な意味で決定するために使用される。例えば、複数の標的抗原が検出され
、アッセイ応答が規定された濃度範囲に渡って試料中の各標的抗原の濃度に比例
しているアッセイ形式において、第1のの標的抗原の濃度は相対的に不変であり
、特定の試料型に対しては既知であってもよい。各標的抗原に対するアッセイ応
答を計測することにより、第1の標的抗原に対する相対的な濃度を決定すること
が可能である。または、2つの試料が1つまたは複数の標的抗原に関してアッセイ
される場合には、1つの試料中のアッセイされる任意の標的抗原の量が、第2の試
料中の同一の標的抗原の量に対して相対的に決定されうる。そのようなアッセイ
法により、核酸アレイを用いた転写プロファイルまたは遺伝子発現実験に類似の
結果を達成することができる。一般的には、転写プロファイルは、両標識が独立
に測定されるように1つの試料中の標的分子をある1つの型の蛍光物質で標識し、
別の試料中の標的分子を別の型の蛍光物質で標識することにより実施される。遺
伝子発現または転写プロファイル解析の例では、標識化標的分子を含む2つの試
料を標的分子に特異的な固定化オリゴヌクレオチドと反応させる。標識化標的分
子は、固定化オリゴヌクレオチドへの結合に対して競合し、特定の固定化オリゴ
ヌクレオチドに結合した各蛍光物質の相対量により、2つの試料中の標的分子の
相対量を決定する。本方法は2つの試料中の標的抗原の相対量を決定する。これ
は第1の試料中の全てのタンパク質を第1の蛍光物質で標識し、第2の試料中の全
てのタンパク質を第1の蛍光物質と識別可能な第2の蛍光物質で標識し、その後2
つの標識試料を対象となる標的抗原に対する固定化結合体と接触させることで達
成することができる（米国特許第5,807,522号参照）。特定の標的抗原に対する
各固定化結合体は、各蛍光物質の量が決定される場合に、標的抗原に対する固定
化結合体から空間的に分離され、他の標的抗原に対する固定化結合体と区別する
ことが可能であるように、固定されうる。これは特定の標的抗原に対する特異的
結合体を、他の標的抗原に特異的な固相上の他領域から識別可能な領域内の固相
に固定することにより達成されうる。または、空間的に分離されるか、または混
合物中で互いに識別もしくは分離されうるように、標的抗原に対する特異的結合
体を異なる固相に固定して、対象となる各標的抗原に対するアッセイ応答を測定
することができる。
【０１２２】 試料中の1つまたはそれ以上の標的抗原の定量化はまた、本発明のヒト抗体を
用いて達成することが可能である。標的抗原を定量化するために、測定される応
答はある濃度範囲にわたり標的抗原濃度に関連している。その相関は、測定と同
時または未知濃度の標的抗原を含む試料をアッセイするために使用されるものと
同一の条件下で、既知濃度の標的抗原を含む標準試料を用いてアッセイ法を実施
することにより通常は達成される。標的抗原濃度の関数としてのアッセイ応答は
、標準試料から決定され、未知試料中の標的抗原濃度はこの関数から決定される
。試料中の複数の標的抗原に対する定量アッセイ法は、各標的抗原に特異的な固
定化結合体を、それらが空間的に分離され、他の標的抗原に対する固定化結合体
から識別することが可能であるように提供することにより、決定することが可能
である。これは特定の標的抗原に対する特異的な結合体を、他の標的抗原に特異
的な固相上の他領域から識別可能である領域内の固相に固定することにより達成
することが可能である。または、対象となる各標的抗原に対するアッセイ応答の
測定を可能にするように、空間的に分離されるか、または混合物中で互いに識別
もしくは分離されうるように、異なる固相に標的抗原に対する特異的結合体を固
定することができる。
【０１２３】5．抗体アレイの形式 転写プロファイルまたは遺伝子発現に使用されるアレイ、および一塩基多型を
検出するためのアレイは、異なる既知の場所に異なる核酸を固定している。一般
的には、そのようなアレイは、相同な標的に高親和性で結合するように設計され
た多くの固定化オリゴヌクレオチドを含む（例えば「マイクロアレイバイオチッ
プ技術（Microarray Biochip Technology）」M. Schena編、Eaton Publishing M
assachusetts、2000）を参照のこと）。DNAハイブリッド中の2本鎖の親和性は互
いに結合する2つのタンパク質の親和性よりも実質的に高いため、結合現象が特
異的であることを確実にするために利用可能な条件を極めてストリンジェントに
して、非特異的結合の最小化を確実にすることができる。加えて、ハイブリダイ
ゼーション反応における既知の温度効果が特異性を増加させるために利用される
。抗体アレイを用いる場合に、達成可能な選抜のストリンジェンシーは抗体試薬
に対するその標的への親和性に依存する。したがって高親和性抗体はそのような
アレイにおいて有用である。例えば、いくつかのアレイは少なくとも108、109、
1010、1011、または1012M-1の親和性を有する抗体を有する。高親和性抗体の使
用により、同一抗原に対する多量体結合により提供される結合活性が増加される
ために、多量体型抗体を使用する必要がなくなる。多量体型抗体の使用は、抗体
により結合されるあるエピトープの複数のコピーを有する標的型に限定される。
質量作用の法則が平衡状態で標的抗原に結合する抗体の割合を決定するため、抗
体濃度は一般的にはその抗体/標的抗原対の解離定数以上に維持される。免疫ア
ッセイ法においては、標的抗原濃度は試料中ではしばしば解離定数またはそれ以
下であり、利用可能な標的抗原の十分な画分に結合するためには解離定数より過
剰に抗体濃度が存在することが必要である。そのような高濃度の抗体の使用によ
り、他の非特異的な結合反応が有意になり、標的抗原のアッセイ法において誤っ
て上昇した応答が引き起こされる。固定化抗体の混合物（およびいくつかの形式
では検出用の標識化抗体）が単一溶液中で試料に接触されてもよいアレイにおい
ては、非特異的結合問題はすべて高濃度で使用される抗体の多重度により複雑に
なる。HAMAまたは異好性抗体問題は典型的にはアレイで使用される高濃度の抗体
により特に増大される。標的抗原検出用の抗体アレイにおいてヒト抗体を使用す
ることは、ヒト試料をアッセイする時に直面するHAMAまたは異好性抗体問題を十
分に減少または除去する。
【０１２４】 非ヒト抗体を用いた多数の抗体アレイ形式が提唱されてきた。米国特許第5,92
2,615号はアレイ中で複数の標的抗原を検出するために膜上に固定された抗体の
複数の別々の領域を利用する装置が記載されている。米国特許第5,458,852号、
同第6,019,944号、同第6,143,576号、および米国特許出願第08/902,775号は、複
数の標的抗原をアッセイするために、膜上ではなく装置中に固定された複数の別
々の抗体領域を用いた診断装置が記載されている。国際公開公報第99/67641号は
、微細球が光ファイバーの末端に固定された後、個々の微細球に固定された特異
的結合体（抗体を含む）を解読および同定を可能にするタグを用いて、微細球が
生成されるアレイを記載している。米国特許第5,981,180号においては、微細球
は再び結合体（抗体を含む）を固定するために使用され、微細球に付着している
特異的結合体を同定するために、微細球に含まれる2つの異なる蛍光色素の相対
量を検出することにより、試料から分離することなく微細球が互いに識別される
。抗体のアレイ化用のこれらの全ての方法は、ヒト試料のアッセイ中のHAMAおよ
び異好性抗体により引き起こされる非特異的結合事象により制限されていた。本
発明に記載されているヒト抗体の使用はこれらの干渉を減少または除去し、多数
の標的抗原のアッセイのためにこれらの形式を使用することを可能にする。
【０１２５】 いくつかのアレイにおいては、抗体は基質上の既知の小部位に固定される。高
親和性抗体の使用は、所定の濃度の分析物を検出するために各部位においてより
少ない抗体が必要とされる点で、小面積を達成するために有利である。例えば、
いくつかのアレイにおいては、各既知の部位に固定される抗体の量は、500ngま
たは100ng未満である。HAMAおよび異好性抗体による干渉は、既知部位内の抗体
分子密度では有意に増加することはないので、ヒト抗体の使用は小面積内の固定
において有利である。結果として抗体は、各々が0.01、0.001、0.0001、0.00001
、0.000001cm2未満の面積を有する既知部位に固定することができる。異なる各
ヒト抗体により占有される支持体上が小面積であることにより、同一支持体上に
固定することができる異なるヒト抗体の数を増やすことができる。例えば、50、
100、1,000、100,000、または1,000,00個のヒト抗体が同一の支持体上に固定さ
れうる。
【０１２６】 本発明は明確な理解のために詳細に記載されているが、特許請求の範囲内であ
る変更が実施されてもよいことは明らかであると思われる。本明細書中で引用さ
れている全ての刊行物および特許書類は、各々が個々に示されているのと同様に
全てその全体が参照として組み入れられる。7F11生産細胞株（HB-12443、1997年
12月5日）はブダペスト条約の下、記載された日に記載された所定のアクセショ
ン番号で、アメリカン-タイプ-カルチャー-コレクション（American Type Cultu
re Collection）、ロックビル、メリーランド州）に寄託された。保管所が試料
公開の要請を受けてから少なくとも5年間の期間、寄託日から少なくとも30年間
の期間、関連特許の強制実施期間中、これらの中で最長の期間に渡り、寄託物は
認可された保管所において維持され、突然変異、利用不可時または破壊時には置
換される。これらの細胞株の公共利用に関する全ての制限は、出願の特許審査時
に取消不能な形で取り除かれることになる。
【０１２７】 実施例1：マウス脾臓からのRNAの精製 インターロイキン8に対する抗体ファージライブラリーを作るために、3つの異
なるヒト重鎖遺伝子組を有するマウスが使用された。マウスの製造は実施例23お
よび24に記載されている。マウスをインターロイキン8で免疫化した（実施例19
）。マウスを0.713mg/mlの25μgの抗原を用いて免疫化した。最初の方法では、
マウスを、月に1回のCFAにより開始し、続いてIFAにより、高いヒトγ力価（約6
500）に達するまで免疫化した。さらに6週間後、マウスを腹腔内注射で-7、-6、
-5日に増強し、5日後に屠殺した。別の方法では、マウスを、2週間に1回、CFAに
より開始し、続いてIFAにより免疫化した。高いヒトγ力価に到達した後で、マ
ウスは-3、-2日に増強され、2日後に屠殺した。
【０１２８】 脾臓を層流フード（laminarflow hood）内で回収し、ペトリ皿に移し、細断し
、脂肪および結合組織を廃棄した。すばやく、脾臓を1.0mlの溶液D（25.0gのグ
アニジンチオシアネート（Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN）
、29.3mlの滅菌水、1.76mlの0.75Mのクエン酸ナトリウム（pH7.0）、2.64mlの10
％サルコシル（sarkosyl）（Fisher Scientific、Pittsburgh、PA）、0.36mlの2
-メルカプトエタノール（Fisher Scientific、Pittsburgh、PA）存在下で滅菌5c
cシリンジのピストンを用いて浸軟させた。脾臓懸濁液を粘性になるまで18ゲー
ジ針に通して、全ての細胞を溶解させ、その後微小遠心管に移した。ペトリ皿は
残った脾臓を全て回収するために100μlの溶液Dを用いて洗浄され、チューブに
移された。懸濁液をその後さらに5〜10回、22ゲージ針に通した。試料を均等に2
つの微小遠心管に分け、各添加ごとに転倒混和しながら、以下のものを順番どお
りに添加した：100μlの2M酢酸ナトリウム（pH4.0）、1.0mlの水飽和フェノール
（Fisher Scientific、Pittsburgh、PA）、200μlのクロロホルム/イソアミルア
ルコール49：1（Fisher Scientific、Pittsburgh、PA）。溶液は10秒間ボルテッ
クス（Vortex）され、氷上で15分間インキュベートされた。2℃〜8℃にて14krpm
で20分間遠心分離した後、水層を新しいチューブに移した。等量の水飽和フェノ
ール/クロロホルム/イソアミルアルコール（50：49：1）を添加し、チューブを1
0秒間ボルテックスした。氷上で15分間インキュベートした後、試料を2℃〜8℃
にて20分間遠心分離し、水層を新しいチューブに移し、等量のイソプロパノール
を用いて-20℃で少なくとも30分間の間沈殿させた。4℃、14000rpmで20分間遠心
分離した後、上清を吸引除去し、チューブを軽く回転させ、全ての微量の液体を
除去した。RNAペレットを各々300μlの溶液Dに溶解させ、1つに合わせて、等量
のイソプロパノールを用いて-20℃で少なくとも30分間の間沈殿させた。4℃、14
000rpmで20分間遠心分離した後、上清を前記のように吸引除去し、試料を100μl
の氷冷70％エタノールで洗浄した。試料を再度4℃、14000rpmで20分間遠心分離
し、70％エタノール溶液を吸引除去し、RNAペレットをインバキュオ（in vacuo
）で乾燥させた。ペレットは100μlの滅菌蒸留水に再懸濁された。濃度は、吸光
度1.0が40μg/mlの濃度としてA260により決定された。RNAを-80℃で保存した。
【０１２９】 実施例2：相補的DNA（cDNA）の調製 前記のように精製された全RNAが、直接cDNAの鋳型として使用された。RNA（50
μg）を滅菌水で100μlに希釈し、10μlの130ng/μLオリゴdT12（バイオサイト
ダイアグノスティックス（Biosite Diagnostics）にてアプライドバイオシステ
ムズ（Applied Biosystems）モデル392DNA合成機で合成された）を添加した。試
料は70℃で10分間加熱され、その後氷上で冷却された。40μLの5×一本鎖緩衝液
（Gibco/BRL、Gaithersburg、MD）、20μLの0.1Mジチオスレイトール（Gibco/BR
L、Gaithersburg、MD）、10μLの20mMデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTPs、R
oche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN）および10μLの水を、氷上で
添加した。試料をその後37℃で2分間インキュベートした。10μLの逆転写酵素（
スーパースクリプト（SuperScript）（商標）II、Gibco/BRL、Gaithersburg、MD
）を添加し、インキュベーションを37℃で1時間続けた。cDNA産物をポリメラー
ゼ連鎖反応（PCR）に直接用いた。
【０１３０】 実施例3：PCRによるヒト抗体配列cDNAの増幅 HCo7遺伝子型を有する4匹のマウスのcDNAが、重鎖配列に対する3個の5'オリゴ
ヌクレオチドおよび1個の3'オリゴヌクレオチド（表A）、κ鎖配列に対する10個
の5'オリゴヌクレオチドおよび1個の3'オリゴヌクレオチド（表B）を用いて増幅
された。HCo12遺伝子型を有する1匹のマウスのcDNAが、重鎖配列に対する5個の5
'オリゴヌクレオチドおよび1個の3'オリゴヌクレオチド（表C）、表Bに示される
、κ鎖配列に対するオリゴヌクレオチドを用いて増幅された。HCo7/HCo12遺伝子
型を有する2匹のマウスのcDNAが、表Aおよび表Cに示される、重鎖配列に対する
オリゴヌクレオチド配列、および表Bに示される、κ鎖配列に対するオリゴヌク
レオチドを用いて増幅された。5'プライマーを、M13ウラシル鋳型に相補的な20
ヌクレオチド配列が各プライマーの5'側に合成されるように作製した。この配列
は重鎖プライマーおよび軽鎖プライマー間で異なっており、軽鎖プライマーでは
PelBシグナル配列の3'側の20ヌクレオチドに相当し、重鎖プライマーではアルカ
リフォスファターゼシグナル配列の20ヌクレオチドに相当した。定常領域ヌクレ
オチド配列は重鎖およびκ軽鎖に各々1つの3'プライマーを必要とした（表Aおよ
び表B）。各5'プライマーおよび3'プライマー組に関して別々にPCR増幅を実施し
た。50pmolの5'プライマー、50pmolの3'プライマー、0.25μL Taq DNAポリメラ
ーゼ（5U/μL、Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN）、3μLのcD
NA（実施例2に記載）、5μLの2mM dNTPs、MgCl2を含む5μLの10×Taq DNAポリメ
ラーゼ緩衝液（Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN）に水を加え
て50μLにして、各プライマー組に対して50μL反応を実施した。GeneAmp（登録
商標）9600サーマルサイクラー（Perkin Elmer、Foster City、CA）を用いて、
以下のプログラムで増幅を実施した：94℃1分間、そして94℃20秒、55℃30秒、7
2℃30秒を30サイクル、72℃で6分間、そして4℃。
【０１３１】 （表Ａ） Hco7マウスのcDNA増幅に使用された重鎖オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチド188、944および948は5'プライマーであり、オリゴヌクレ
オチド952は3'プライマーである。
【０１３２】 （表Ｂ） Hco7マウス、Hco12マウス、およびHco7/Co12マウスのcDNA増幅に使用
されたκ鎖オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチド973は3'プライマーであり、残りは5'プライマーである。
【０１３３】 （表Ｃ） Hco12マウスのcDNA増幅に使用された重鎖オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチド944、945、946、947および948は5'プライマーであり、オ
リゴヌクレオチド952は3'プライマーである。944、948および952の配列は表Aに
示されている。
【０１３４】 PCR過程のdsDNA産物をその後、標的遺伝子のアンチセンス鎖のみを実質的に生
成するために3'プライマーのみを用いて非対称性PCRに供した。オリゴヌクレオ
チド953がκ鎖の非対称性PCRの3'プライマーとして（表D）およびオリゴヌクレ
オチド952が重鎖の非対称性PCRの3'プライマーとして（表A）として使用された
。各脾臓において、プライマー189、931、932、933、934、936、955および956に
関するκ鎖PCR産物に対して2つの非対称性反応が行われ、プライマー935に対す
るκ鎖PCR産物に対して4つの非対称性反応が行われ、プライマー937に対するκ
鎖PCR産物に対して8つの非対称性反応が行われた。各重鎖PCR産物に対して使用
された非対称性反応の数はマウス遺伝子型に依存した。Co7マウスでは各PCR産物
について8つの非対称性反応が行われた。Co12マウスでは、プライマー944からの
PCR産物について8つの非対称性反応が行われ、他のプライマーからのPCR産物に
ついて4つの非対称性反応が行われた。Co7/Co12マウスでは、プライマー944およ
び948からのPCR産物について6つの非対称性反応が行われ、他のプライマーから
のPCR産物について3つの非対称性反応が行われた。200pmolの3'プライマー、2μ
lのds-DNA産物、0.5μL Taq DNAポリメラーゼ、10μLの2mM dNTPs、MgCl2を含む
10μLの10×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液に水を加えて100μLにして、全体で100
μLの反応を実施した。重鎖反応は前記の温度プロファイルにて増幅され、κ鎖
反応は30サイクルの代わりに25サイクルが使用された同じ温度プロファイルにて
増幅された。
【０１３５】 （表Ｄ） κ鎖非対称性PCRに使用されたオリゴヌクレオチド配列
【０１３６】 実施例4：高速液体クロマトグラフィーによるss-DNAの精製とss-DNAのキナーゼ
化 重鎖ss-PCR産物および軽鎖ss-PCR産物を別々にプールし、2.5容量のエタノー
ルおよび0.2容量の7.5M酢酸アンモニウムを添加し、-20℃で少なくとも30分間イ
ンキュベートすることによりエタノール沈殿した。DNAは2℃〜8℃にて15000rpm
で15分間遠心分離することによりペレット化された。上清を注意深く吸引除去し
、チューブを2度軽く回転させた。上清の最後の1滴はピペットで除去された。DN
Aを中温度に加温し10分間インバキュオで乾燥させた。重鎖産物を210μLの水に
溶解させ、軽鎖産物を別々に210μLの水に溶解させた。ss-DNAはヒュレットパッ
カード（Hewlett Packard）の1090HPLCおよびGen-Pak（商標）FAX陰イオン交換
カラム（Millipore Corp.、Milford、MA）を用いて高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）により精製された。ss-DNA精製に用いた勾配を表1に示し、オーブン温
度は60℃であった。吸光度は260nmでモニターされた。HPLCから溶出されたss-DN
Aは0.5分の画分で収集された。ss-DNAを含む画分がプールされ、エタノールペレ
ット化され、ペレットにされ、前記の通り乾燥された。乾燥させたDNAペレット
を200μlの滅菌水に再懸濁させた。
【０１３７】
【表１】 ss-DNA精製のためのHPLC勾配 緩衝液Aは25mMトリス、1mM EDTA、pH8.0 緩衝液Bは25mMトリス、1mM EDTA、1M NaCl、pH8.0 緩衝液Cは40mMリン酸
【０１３８】 ss-DNAは変異誘発のための調製において、5'末端がキナーゼ化された（Kinase
d）（実施例7）。24μlの10×キナーゼ緩衝液（United States Biochmicals、Cl
eveland、OH）、10.4μlの10mM アデノシン-5'-三リン酸（Boehringer Mannheim
、Indianapolis、IN）および2μlのポリヌクレオチドキナーゼ（30U/μl、Unite
d States Biochmicals、Cleveland、OH）を各試料に添加し、チューブを37℃で1
時間インキュベートした。チューブを70℃で10分間インキュベートすることで反
応を停止させた。DNAは平衡化フェノール（pH＞8.0、United States Biochmical
s、Cleveland、OH）-クロロホルム-イソアミルアルコール（50：49：1）の1回の
抽出とクロロホルム：イソアミルアルコール（49：1）の1回の抽出で精製された
。抽出後DNAをエタノール沈殿し、前記の通りペレットにした。DNAペレットを乾
燥させ、そして50μlの滅菌水に溶解させた。260nmでのDNAアリコートの吸光度
を測定することにより、吸光度1.0が33μg/mLとして、濃度を決定した。試料を-
20℃で保存した。
【０１３９】 実施例5：ヒト抗体定常領域配列を有する抗体ファージ提示（antibody pharge d
isplay）ベクターの構築 抗体をクローニングするための抗体ファージ提示ベクターはイクシス（Ixsys
）から供与された668-4と名づけられたM13ベクターに由来した。ベクター668-4
はヒューズ（Huse）、国際公開公報第92/06024号により記載されたベクターに挿
入された、マウスモノクローナルFab断片の重鎖および軽鎖をコードするDNA配列
を含んでいた。このベクターはLacプロモーター、マウス抗体の軽鎖可変領域の5
'側に融合されたpelBシグナル配列、マウス抗体のκ鎖全体、マウス抗体の重鎖
可変領域の5'末端のアルカリフォスファターゼシグナル配列、重鎖の可変領域全
体および最初の定常領域、およびIgG重鎖のヒンジ領域の5個のコドンを有してい
た。デカペプチド配列は重鎖のヒンジ領域の3'末端に位置し、アンバー終止コド
ンがデカペプチド配列を偽遺伝子（pseudo-gene）VIII配列から分離していた。
アンバー終止コドンはXL1blue（Stratagene、San Diego、CA）等の大腸菌サプレ
ッサー系統において遺伝子VIIIタンパク質との重鎖融合タンパク質の発現を可能
にするが、MK30等の非サプレッサー細胞系統においては可能にしない（図1を参
照されたい）。
【０１４０】 最初の誘導体クローニングベクターを作製するために、ウラシル鋳型を用いた
オリゴヌクレオチド定方向変異誘発（directed mutagenesis）（Kunkel、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA82：488（1985）、Kunkelら、Methods.Enzymol.154：367
（1987））により重鎖および軽鎖の可変領域内に欠失を作製した。これらの変異
は各鎖のCDR1の5'末端からCDR3の3'末端の領域を欠失させ、変異はタンパク質翻
訳が停止するであろうDNA配列を付加した（変異誘発オリゴヌクレオチドに関し
ては図2を参照されたい）。これにより、挿入物を有さないクローンにおいて、
重鎖または軽鎖定常領域が発現されなくなり、したがって、挿入物が存在するプ
ラークをスクリーニングすることが可能となった。得られたクローニングベクタ
ーをBS11と呼んだ。
【０１４１】 本スクリーニング方法において使用されるクローニングベクターを生成する前
に多くの変更がBS11に行われた。重鎖と偽遺伝子VIII配列の間にあるアンバー終
止コドンが取り除かれ、すべての重鎖が遺伝子VIIIタンパク質との融合タンパク
質として発現された。これはBS11と比べて、ファージ上の抗体のコピー数を増加
させた。軽鎖の3'末端とアルカリフォスファターゼシグナル配列の5'末端の間の
配列に存在するHindIII制限酵素部位が欠失され、抗体がpBR322誘導体にサブク
ローニングされることが可能になった（実施例14）。Lおよび重鎖のカルボキシ
ル末端の鎖間ジスルフィド残基がセリン残基に変更された。これは抗体の発現レ
ベルを増加させ、抗体の安定性に影響することなく、ファージ上の抗体のコピー
数を増加させた。lacプロモーターの5'側および偽遺伝子VIII配列の3'側の非必
須DNA配列はM13ベクターのサイズおよび再構成の可能性を減少させるために欠失
された。翻訳終止を置換する形で軽鎖クローニング部位において転写終結DNA配
列がベクターに付加され、パニング（panning）において非特異的に増幅される
かもしれない重鎖タンパク質しかファージ表面に有さないファージが作製されな
いようになった。最後にタンパク質タグのDNA配列が異なるベクターに付加され
、金属キレートクロマトグラフィー（ポリヒスチジン配列）により、またはデカ
ペプチドタグおよびデカペプチドタグに結合する固定化抗体を有する磁性ラテッ
クスを用いて親和性精製により、多価ファージが濃縮されることができるように
なった。BS45は重鎖定常領域の末端と偽遺伝子VIII配列の間にポリヒスチジン配
列を、κ鎖定常領域の3'末端にデカペプチド配列を有していた。
【０１４２】 オリゴヌクレオチド定方向変異誘発によりBS45からマウス重鎖およびκ鎖の定
常領域配列が欠失された。オリゴヌクレオチド864がマウスκ鎖を欠失させるた
めに使用され、オリゴヌクレオチド862がマウス重鎖を欠失させるために使用さ
れた。
【０１４３】
【０１４４】 両定常領域配列の欠失は、オリゴヌクレオチド5および197を用いたPCRにより
両定常領域配列を含むDNA配列を増幅し、DNAアガロースゲルにてPCR産物のサイ
ズを測定することにより決定された。PCRは二重鎖DNAに対して、cDNAの代わりに
1μlのファージが鋳型とされた点を除いて、実施例3に記載されているように実
施された。所望の欠失を有するファージは、1つの欠失または無欠失と比べてよ
り短いPCR産物を有した。実施例6に記載されるように両欠失を有するファージス
トックからウラシル鋳型が作製された。この鋳型BS46はκ鎖およびIgG1に対する
ヒト定常領域配列を挿入するために使用された。
【０１４５】
【０１４６】 ヒト定常領域DNA配列はヒト脾臓cDNA（Clontech、Palo Alto、California）か
ら増幅された。オリゴヌクレオチド869および870がκ定常領域配列を増幅するた
めに使用され、オリゴヌクレオチド867および876がIgG1定常領域配列およびヒン
ジ領域の6アミノ酸コドンを増幅するために使用された（Kabatら、「免疫学的関
心対象のタンパク質配列（Sequence of Proteins of Immunological Interest）
」、1991年）。
【０１４７】
【０１４８】 PCR（各鎖に対して1つの50μlの反応）はエクスパンド（Expand）高精度PCRシ
ステム（Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN）を用いて実施され
た。各50μl反応は、50pmolの5'プライマー、50pmolの3'プライマー、0.35ユニ
ットのエクスパンドDNAポリメラーゼ、5μLの2mM dNTPs、5μLの10×エクスパン
ド反応緩衝液、鋳型としての1μl cDNAを、水を加えて50μlにしたものを含んで
いた。反応はパーキンエルマーサーマルサイクラー（モデル9600）で、κ鎖に関
しては以下の温度プロファイルを用いて実施された。1サイクルの94℃での変性
（1分）、10サイクルの変性（15秒、94℃）、アニーリング（30秒、55℃）、伸
長（60秒、72℃）、そして15サイクルの変性（15秒、94℃）、アニーリング（30
秒、55℃）、伸長（80秒で各サイクル毎に20秒増加、72℃）、その後伸長（6分
、72℃）、浸漬（4℃、無制限）。重鎖反応に使用された温度プロファイルは、
温度プロファイルの2番目の部分が15サイクルの変わりに20サイクルであった。
【０１４９】 PCR過程のdsDNA産物はその後ヒト定常領域遺伝子のアンチセンス鎖のみを実質
的に生成するために、実施例3に記載されているように、3'プライマーのみを用
いて非対称性PCRに供された。κ鎖に対して5反応が、重鎖に対して10反応が実施
された（各反応100μl）。両定常領域遺伝子に対する温度プロファイルは実施例
3で記載されている通りであり、重鎖非対称性PCRは30サイクルで、κ鎖非対称性
PCRは25サイクルで行われたことを含んでいた。一本鎖DNAは実施例4に記載され
ているようにHPLCにより精製された。HPLC精製されたκ鎖DNAは55μlの水に溶解
され、HPLC精製重鎖は100μlの水に溶解された。DNAは実施例4に記載されている
ように260nmの吸光度で定量され、その後DNAは、50μlのκ鎖DNAに6μlの10×キ
ナーゼ緩衝液、2.6μlの10mM ATP、0.5μlのポリヌクレオチドキナーゼが加えら
れた点を除いて実施例4に記載されているようにキナーゼ化された。これらの2倍
の容量のキナーゼ試薬が100μlの重鎖DNAに添加された。
【０１５０】 抽出によるDNA精製を行わずに、キナーゼ化されたDNAはBS46に変異誘発するた
めに使用された。変異誘発は2μgスケールで以下のものを0.2mL PCR反応チュー
ブ内で混合することにより実施された。8μlのBS46ウラシル鋳型（250ng/μl）
、8μlの10×アニーリング緩衝液（200mMトリス pH7.0、20mM MgCl2、500mM NaC
l）、2.85μlのキナーゼ化一本鎖重鎖挿入物（94ng/μl）、6.6μlのキナーゼ化
一本鎖κ鎖挿入物（43.5ng/μl）、滅菌水を80μlになるまで加える。DNAはGene
Amp（登録商標）9600サーマルサイクラーで以下の温度プロファイルでアニール
された。94℃20秒、85℃60秒、85℃から55℃に30分以上かけて減少させ、55℃で
15分保った。プログラム終了後DNAは氷に移された。伸長/ライゲーションは8μl
の10×合成緩衝液（各dNTP 5mM、10mM ATP、100mMトリス pH7.4、50mM MgCl2、2
0mM DTT）、8μlのT4DNAリガーゼ（1U/μl、Roche Molecular Biochemicals、In
dianapolis、IN）、8μlの希釈されたT7 DNAポリメラーゼ（1U/μl、New Englan
d Biolabs、Beverly、MA）を添加して、37℃で30分間インキュベートすることに
より実施された。反応は296μlの変異誘発停止緩衝液（10mMトリスpH8.0、10mM
EDTA）により停止された。変異誘発DNAは、平衡化フェノール（pH＞8.0）：クロ
ロホルム：イソアミルアルコール（50：49：1）にて1回とクロロホルム/イソア
ミルアルコール（49：1）にて1回抽出され、DNAは-20℃で少なくとも30分間エタ
ノール沈殿された。DNAはペレット化され、上清が前記のように慎重に除去され
た。試料を再び軽く回転させ、エタノールの残液を全てピペットマンで除去した
。ペレットがインバキュオで乾燥された。DNAは4μlの滅菌水に再懸濁された。1
μlの変異誘発DNA（500ng）が40μlのエレクトロコンピテント（electocompeten
t）大腸菌DH12S（Gibco/BRL、Gaithersburg、MD）40μlに、実施例8のエレクト
ロポレーション条件を用いて導入された。形質転換された細胞は1.0mLの2×YT培
地（Sambrookら、前記）と混合され、15mLの滅菌培養チューブに移された。形質
転換細胞のアリコート（10-3希釈から10-4希釈を10μl）は実施例11に記載され
ているように100mmLB寒天プレート上にプレーティングされた。37℃で6時間増殖
後、20個の別々のプラークがプレートから選択され2.75mLの2×YTおよび0.25ml
の一晩培養したXL1Blue細胞に加えられた。個々のプラークからのファージを増
幅するために培養物は37℃にて300rpmで一晩増殖された。ファージ試料は、オリ
ゴヌクレオチド197および5（前記のBS46解析を参照されたい）を用いたPCRによ
り、続いてアガロースゲル電気泳動にてPCR産物のサイズを測定することにより
、2つの定常領域の挿入が解析された。アガロースゲル電気泳動により2つの挿入
物と考えられるものを含んでいる2つのクローンの配列が、セクアサーム（Sequa
therm）シークエンシングキット（Epicenter Technologies、Madison、WI）およ
びLI-COR4000L自動シークエンサー（LI-COR、Lincoln、NE）を用いて、MacConne
ll Research（マックコネルリサーチ）（San Diego、CA）にてダイデオキシ鎖終
結法により確認された。κ鎖および重鎖の各々3'側に結合するオリゴヌクレオチ
ドプライマー885および5が使用された。両クローンは正しい配列を有していた。
BS46と呼ばれるヒト定常領域配列を有するウラシル鋳型は実施例6に記載される
ように調製された。
【０１５１】
【０１５２】 実施例6：脾臓抗体ファージライブラリー作製のために使用されるウラシル鋳型
の調製 一晩培養した1mLの大腸菌CJ236（BioRAD、Hercules、CA）と10μlの1/100希釈
ベクターファージストックが250mLの溝付振盪フラスコ中の50mLの2×YTに添加さ
れた。培養物は37℃で6時間増殖された。約40mLの培養液が4℃にて12000rpmで15
分間遠心分離された。上清（30mL）が新しい遠心分離チューブに移され、15μl
の10mg/mlのRNaseA（Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN）を添加後15分間
室温にてインキュベートされた。7.5mlの20％ポリエリチレングリコール8000（F
isher Scientific、Pittsburgh、PA）/3.5M硫酸アンモニウム（Sigma Chemicals Co.、St. Louis、MO）を添加し、氷上で30分間インキュベーションすることに
よりファージを沈殿させた。試料は2℃〜8℃にて12000rpmで15分間遠心分離され
た。上清が注意深く廃棄され、チューブは軽く回転され、全ての微量の上清が除
去された。ペレットは400μlの高塩濃度緩衝液（300mM NaCl、100mMトリス pH8.
0、1mM EDTA）に再懸濁され、1.5mLチューブに移された。ファージストックは白
い中間層の残存物が見えなくなるまで、等量の平衡化フェノール：クロロホルム
：イソアミルアルコール（50：49：1）にて繰り返し抽出され、その後等量のク
ロロホルム：イソアミルアルコール（49：1）にて抽出された。DNAを、2.5容量
のエタノールおよび1/5容量の7.5M酢酸アンモニウムを添加し、-20℃で30分間イ
ンキュベートすることによりペレット化した。DNAを4℃、14000rpmで10分間遠心
分離し、ペレットを冷70％エタノールで一度洗浄し、インバキュオで乾燥させた
。ウラシル鋳型DNAは100μlの滅菌水に溶解され、濃度は吸光度1.0が40μg/mlの
濃度としてA260により決定された。鋳型は滅菌水で250ng/μlに希釈され、分注
され、-20℃で保存された。
【０１５３】 実施例7：抗体ファージライブラリーを生成するためのss-DNAを用いたウラシル
鋳型への変異誘発および大腸菌へのエレクトロポレーション 抗体ファージ提示ライブラリーはウラシル鋳型のファージ提示ベクター上に同
時に一本鎖重鎖および軽鎖遺伝子を導入することにより生成された。典型的な変
異誘発は2μgスケールで以下のものを0.2mL PCR反応チューブ内で混合すること
により実施された：8μlのBS46ウラシル鋳型（250ng/μl）（実施例5および6）
、8μlの10×アニーリング緩衝液（200mMトリス pH7.0、20mM MgCl2、500mM NaC
l）、3.33μlのキナーゼ化一本鎖重鎖挿入物（100ng/μl）、3.1μlのキナーゼ
化一本鎖軽鎖挿入物（100ng/μl）、滅菌水を80μlまで加える。DNAはGeneAmp（
登録商標）9600サーマルサイクラーで以下の温度プロファイルでアニールされた
。94℃20秒、85℃60秒、85℃から55℃に30分以上かけて減少させ、55℃で15分保
持された。プログラム終了後DNAは氷に移された。伸長/ライゲーションは8μlの
10×合成緩衝液（各dNTP 5mM、10mM ATP、100mMトリス pH7.4、50mM MgCl2、20m
M DTT）、8μlのT4DNAリガーゼ（1U/μl）、8μlの希釈T7 DNAポリメラーゼ（1U
/μl）を添加して、37℃で30分間インキュベートすることにより実施された。反
応は300μlの変異誘発停止緩衝液（10mMトリスpH8.0、10mM EDTA）により停止さ
れた。変異誘発されたDNAは、平衡化フェノール（pH＞8）：クロロホルム：イソ
アミルアルコール（50：49：1）にて1回、及びクロロホルム：イソアミルアルコ
ール（49：1）にて1回抽出され、かつDNAは-20℃で少なくとも30分間エタノール
沈殿された。DNAをペレット化し、上清を前記のように慎重に除去した。試料を
再び軽く回転し、エタノールの残液を全てピペットマンで除去した。ペレットが
インバキュオで乾燥された。DNAは4μlの滅菌水に再懸濁された。1μlの変異誘
発されたDNA（500ng）が40μlのエレクトロコンピテント大腸菌DH12S（Gibco/BR
L、Gaithersburg、MD）に、実施例8のエレクトロポレーション条件を用いて導入
された。形質転換された細胞を0.4mLの2×YT培地（Sambrookら、前記）及び0.6m
Lの一晩培養したXL1 Blue細胞と混合し、15mLの滅菌培養チューブに移した。初
回の抗体ファージ試料が、エレクトロポレーションされた試料を実施例11に記載
されているように150mmLBプレート上にプレーティングすることにより生成され
た。プレートを37℃にて4時間インキュベートした後、-20℃で一晩インキュベー
トした。10mLの2YT培地をピペットでローン（lawn）に添加し、プレートを室温
で20分間緩やかに振盪することで、初回の抗体ファージを150mmプレートから抽
出した。ファージを15mLのプラグシールキャップ付使い捨て滅菌遠心分離チュー
ブに移し、LBプレート由来の砕片を3500rpmで15分間遠心分離することによりペ
レット化した。初回の抗体ファージはその後新しいチューブに移された。
【０１５４】 エレクトロポレーションの効率は10-3希釈から10-4希釈した培養物10μlをLB
寒天プレートにプレーティングすることで測定された（実施例11を参照されたい
）。効率は10-3希釈プレートのプラーク数に105をかけることにより、又は10-4
希釈プレートのプラーク数に106をかけることにより決定された。
【０１５５】 実施例8：エレクトロポレーションによる大腸菌の形質転換 エレクトロコンピテント大腸菌は氷上で融解された。細胞を緩やかに2〜3回上
下させることでピペッティングし、気泡が入らないように注意しながら、20〜40
μlのエレクトロコンピテント細胞と、DNAを混合させた。移すときに再度気泡が
入らないように注意しながら、氷上で冷却されたジーンパルサーキュベット（Ge
ne Pulser cuvette、0.2cmギャップ、BioRAD、Hercules、CA）に細胞を移した。
キュベットは大腸菌パルサー（E. Coli Pulser、BioRAD、Hercules、CA）に設置
され、製造者の推奨に従い1.88kVに設定された電圧でエレクトロポレーションさ
れた。形質転換された試料は直ちに1mlの2×YT培地または、400μlの2×YT/600
μlのXL1 Blue細胞の1mlの一晩培養液で希釈され、記載された手順に進んだ。
【０１５６】 実施例9：ビオチン化インターロイキン8（IL8）の調製 IL8は少なくとも100容量の20mMホウ酸、150mM NaClpH8（BBS）に対して2℃〜8
℃で少なくとも4時間透析された。緩衝液はビオチン化の前に少なくとも1回取り
かえられた。IL8はビオチン-XX-NHSエステル（Molecular Probes、Eugene、OR、
ジメチルフォルムアミドに40mMで溶解させたストック溶液）と室温にて1時間、
最終濃度1mMで反応した。未反応の低分子を除くため1時間後IL8はBBSに対して十
分に透析された。
【０１５７】 実施例10：アビジン磁性ラテックスの調製 磁性ラテックス（スパーパラマグネチック・マイクロパーティクル（Superpar
amagnetic Paramicroparticles）、0.96μm、エスタポール、10％固体、Bangs L
aboratories、Carmel、IN）を完全に再懸濁し、2mlが15mlのコニカルチューブに
分注した。磁性ラテックスを12mlの滅菌水に懸濁し、磁石を使って10分間液相か
ら分離させた。磁石中で静置させながら、液体を10ml滅菌ピペットで慎重に除去
した。この洗浄過程はさらに3回繰り返された。最後の洗浄の後、ラテックスは2
mlの滅菌水に再懸濁された。別の50mlのコニカルチューブ中で、10mgのアビジン
-HS（ニュートラアビジン（NeutrAvidin）、Pierce、Rockford、IL）が、18mlの
40mMトリス、0.15M NaCl，pH7.5（TBS）に溶解された。ボルテックス中に、2ml
の洗浄された磁性ラテックスが、希釈されたアビジン-HSに添加され、混合液は
さらに30秒間ボルテックスされた。この混合液を30分毎に振盪させながら、45℃
で2時間インキュベートされた。アビジン磁性ラテックスは磁石を使って液体か
ら分離され、前記のように20mlのBBSで3回洗浄された。最後の洗浄の後、ラテッ
クスは10mlのBBSに再懸濁され、4℃で保存された。
【０１５８】 使用直前に、アビジン磁性ラテックスをパニング緩衝液（40mMトリス、150mM
NaCl，20mg/ml BSA、0.1％Tween20（Fisher Scientific、Pittsburgh、PA）、pH
7.5）中で平衡化した。パニング実験に必要なアビジン磁性ラテックス（200μl/
試料）が滅菌された15ml遠心分離チューブに添加され、パニング緩衝液で10mlに
された。ラテックスを分離するためにチューブは磁石上に10分間置かれた。溶液
を10mL滅菌ピペットを用いて前記のように慎重に除去した。2回目の洗浄を開始
するために、磁性ラテックスが10mLのパニング緩衝液に再懸濁された。磁性ラテ
ックスはパニング緩衝液を用いて総計3回洗浄された。最後の洗浄の後、ラテッ
クスをパニング緩衝液に再懸濁し、最初の分注量にした。
【０１５９】 実施例11：抗体ファージ提示ベクター変異誘発反応を用いて形質転換されたM13
ファージまたは細胞のプレーティング ファージ試料が15mlの滅菌培養チューブ中の100mmのLB寒天プレートにプレー
ティングされる時は200μLの一晩培養したXL1 Blue大腸菌に、150mmのプレート
にプレーティングされる時は600μLの一晩培養した細胞に添加された。エレクト
ロポレーションされたファージ試料は、150mmのプレートにプレーティングされ
る前に、実施例8に記載されているように1mLの2×YT/一晩培養したXL1細胞中に
入れられた。LBトップアガー（100mmのプレートに3mL、150mmのプレートに9mLの
、55℃で保存されたトップアガー、付録A1、「分子クローニング、実験室マニュ
アル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」（1989）、Sambrook J）を
添加した後、寒天表面のいかなる過剰な水分も除くために前加温された（37℃〜
55℃）LB寒天プレート上に混合液が均等に分布された。トップアガーが固化する
まで、プレートを室温で冷却した。プレートを逆さにし、示されるように37℃で
インキュベートした。
【０１６０】 実施例12：アルカリフォスファターゼ（AP）結合体を用いたニトロセルロースフ
ィルターの現像 ニトロセルロースフィルターをLB寒天プレート上で一晩インキュベートした後
、フィルターを膜ピンセットを用いて慎重にプレートから取り外し、ブロッキン
グ液（block）（1％ウシ胎児血清（30％ BSA由来、Bayer、Kankakee、IL）、10m
Mトリス、150mM NaCl、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、0.1％ポリビニルアルコール（
80％加水分解物、Aldrich Chemical Co.、Milwaukee、WI、pH8.0）中で2時間イ
ンキュベートされた。
【０１６１】 2時間後、フィルターをヤギ抗ヒトκAP（Southern Biotechnolpgy Associates
, Inc.、Birmingham、AL）と2〜4時間インキュベートさせた。AP結合体はブロッ
キング液中で最終濃度1μg/mlに希釈された。フィルターは40mMトリス、150mM N
aCl、0.05％Tween20、pH7.5（TBST）（Fisher Chemical、Pittsburgh、PA）で5
分間ずつ3回洗浄された。最後の洗浄の後、フィルターを0.2M 2-アミノ-2-メチ
ル-1-プロパノール（JBL Scientific、San Luis Obispo、CA）、0.5Mトリス、0.
33mg/mLニトロブルーテトラゾリウム（Fisher Scientific、Pittsburgh、PA）お
よび0.166mg/mLの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルーリン酸、p-トルイジン塩）
を含む溶液中で現像した。
【０１６２】 実施例13：κ鎖上のデカペプチドタグを用いたヒトインターロイキン8に対する
ポリクローナルファージの濃縮 初回の抗体ファージが、多価濃縮のためにκ鎖に融合されたデカペプチドタグ
を有するBS46ウラシル鋳型を用いて実施例7に記載されるように調製された。7個
の異なる脾臓由来の変異誘発DNAの14回のエレクトロポレーション（各脾臓につ
き2回のエレクトロポレーション）が行われ、14個の異なるファージ試料がもた
らされた。機能的パニングの前に、抗体ファージ試料が、κ鎖上のデカペプチド
および7F11磁性ラテックスを用いて多価提示のために濃縮された。結合実験によ
り、デカペプチドが比較的緩やかなpH10.5〜11にてモノクローナル抗体7F11（実
施例17を参照されたい）から溶出されるだろうことが以前に示された。7F11磁性
ラテックス（2.9mL）を、アビジン磁性ラテックスに関して記載されたように（
実施例10）パニング緩衝液により平衡化した。初回の各ファージストック（1mL
）が15mLチューブに分注された。7F11磁性ラテックス（ファージ試料につき200
μL）が室温にて10分間ファージと共にインキュベートされた。10分後9mLのパニ
ング緩衝液が添加され、チューブを磁石に10分間置くことにより、未結合ファー
ジから磁性ラテックスが分離された。磁石中で10分後、未結合ファージを10mLの
滅菌ピペットを用いて慎重に除去した。磁性ラテックスはその後1mLのパニング
緩衝液に再懸濁され、1.5mLチューブに移された。チューブを小さな磁石に5分間
置くことにより、未結合ファージから磁性ラテックスを分離し、その後上清を滅
菌ピペットを用いて慎重に除去した。ラテックスはさらに1回の1mLパニング緩衝
液洗浄により洗浄された。各ラテックスは1mLの溶出緩衝液（20mM 3-（シクロヘ
キシルアミノ）プロパンスルホン酸（United States Biochmicals、Cleveland、
OH）、150mM NaCl、20mg/mL BSA、pH10.5）に再懸濁され、室温で10分間インキ
ュベートされた。10分後、チューブを小さな磁石内に再び5分間置き、溶出され
たファージを新しい1.5mLチューブに移した。移したラテックスの最後の少量を
取り除くためファージ試料を磁石内に再び5分間置き、溶出されたファージを新
しい1.5mLチューブに移した。溶出されたファージを慎重に取り除いて新たなチ
ューブに移し、25μLの3MトリスpH6.8をファージを中和するために添加した。IL
8-ビオチンを用いたパニングは、900μLの7F11/デカペプチド濃縮ファージ、100
μLのパニング緩衝液、および10μLの10-7M IL8-ビオチンを混合することにより
各試料について準備され、2℃〜8℃で一晩インキュベートされた。
【０１６３】 抗体ファージ試料はアビジン磁性ラテックスを用いてパニングされた。平衡化
されたアビジン磁性ラテックス（実施例11を参照されたい）、各試料に付き200
μLのラテックスが、室温で10分間ファージとインキュベートされた。10分後、
約9mLのパニング緩衝液が各ファージ試料に添加され、磁性ラテックスが7F11磁
性ラテックスに関して前記のように洗浄された。9mLで1回、1mLで3回の全てのパ
ニング緩衝液を用いた洗浄が行われた。最後の洗浄後、各ラテックスは200μLの
2×YTに再懸濁され、その後各試料のラテックスが全て150mmのLBプレートにプレ
ーティングされ、2回目の抗体ファージが生成された。150mmプレートは37℃で4
時間、その後20℃で一晩インキュベートされた。
【０１６４】 生じた2回目の抗体ファージ試料は、別々の15mLのプラグシールキャップ付使
い捨て滅菌遠心分離チューブ中で900μLのパニング緩衝液、100μLの2回目の抗
体ファージおよび10μLの10-7Mインターロイキン8ビオチンを混合することによ
り、2回目の機能的パニングのために準備された。2℃〜8℃で一晩インキュベー
ションした後、ファージ試料は前記のようにアビジン磁性ラテックスを用いてパ
ニングされた。各脾臓由来の1つの試料のアリコートが100mm LB寒天プレートに
プレーティングされ、κ陽性の割合が決定された（実施例12）。2回目のパニン
グのκ陽性の割合は13試料について83％〜92％であった。1つの試料は63％κ陽
性であったので、廃棄された。
【０１６５】 残りの13試料は、950μLのパニング緩衝液、50μLの3回目の抗体ファージおよ
び10μLの10-6Mインターロイキン8ビオチンを用いて前記のように3回目の機能的
パニングのために準備された。2℃〜8℃で1.5時間インキュベーションした後、
ファージ試料はアビジン磁性ラテックスを用いてパニングされ、前記のようにニ
トロセルロースフィルターが各ファージ試料の上に置かれた。4回目の抗体ファ
ージ試料のκ陽性の割合は80％以上であると推定された。
【０１６６】 4回目の抗体ファージ試料は50μLの10-8希釈液を100mmのLBプレートにプレー
ティングすることにより力価が測定された。37℃で6時間後に各プレートのプラ
ーク数が計数され、プラーク数に2×109をかけることで力価が計算された。13個
の4回目のファージのプールが各ファージストックから同数のファージを混合し
、高力価のファージストックがプールを偏らせないように作製された。プールさ
れた抗体ファージは、950μLのパニング緩衝液、50μLの4回目のプールされた抗
体ファージを用いて前記のように4回目の機能的パニングのために二重に準備さ
れた。1つの試料（フォアグラウンド（foreground））は10μLの10-6Mインター
ロイキン8ビオチンを添加され、もう1つの試料（バックグラウンド（background
））はインターロイキン8ビオチンを添加されずファージの磁性ラテックスへの
非特異的な結合をモニターするためのブランクとして機能した。2℃〜8℃で1.5
時間インキュベーションした後、ファージ試料はアビジン磁性ラテックスを用い
て前記のようにパニングされた。翌日、5回目の抗体ファージが溶出され、プラ
ーク数がフォアグラウンドおよびバックグラウンドのプレートに関して計数され
た。フォアグラウンド：バックグラウンドの比率は58：1であった。
【０１６７】 5回目の抗体ファージは、各試料につき、950μLのパニング緩衝液、50μLの5
回目の抗体ファージを用いて三重に準備され、実験（フォアグラウンド）チュー
ブは10μLの10-7Mインターロイキン8ビオチンまたは、10μLの10-8Mインターロ
イキン8ビオチンをそれぞれ添加された。三番目のチューブはインターロイキン8
ビオチンを添加されなかった。この回のパニングすなわち親和性選択は、インタ
ーロイキン8ビオチンを最終濃度をそれぞれ10-9Mおよび10-10Mにて含めることに
より、≧109および≧1010の親和性の抗体を優先的に選択する。2℃〜8℃で24時
間以上インキュベーションした後、ファージ試料はアビジン磁性ラテックスを用
いて前記のようにパニングされ、処理された。10-9Mで切り捨てられた（cut）6
回目の抗体ファージ試料はフォアグラウンド：バックグラウンドの比率は1018：
1であり、10-10Mで切り捨てられたものはフォアグラウンド：バックグラウンド
の比率は225：1であった。
【０１６８】 1010の親和性の抗体数を増加させるために、10-10Mで切り捨てられた6回目の
抗体ファージについてさらにもう1回のパニングが行われた。6回目のファージは
、各試料につき、975μLのパニング緩衝液、25μLの6回目の抗体ファージを用い
て前記のように準備され、実験（フォアグラウンド）チューブに10μLの10-8Mイ
ンターロイキン8ビオチンが添加された。ブランクはインターロイキン8ビオチン
を添加されなかった。2℃〜8℃で一晩インキュベーションした後、ファージ試料
はアビジン磁性ラテックスを用いて前記のようにパニングされ、処理された。10-10 Mで切り捨てられた7回目の抗体ファージ試料はフォアグラウンド：バックグ
ラウンドの比率が276：1であった。抗体ファージ集団は発現ベクターにサブクロ
ーニングされ、実施例15に記載されるようにエレクトロポレーションされた。
【０１６９】 実施例14：pBR発現ベクターの構築 発現ベクターおよびファージ提示ベクターからのモノクローナル抗体遺伝子お
よびポリクローナル抗体遺伝子のサブクローニングの過程は、効率的であり、ポ
リクローナル集団を実質的に偏らせず、抗生物質耐性を保持した挿入物を含むベ
クターを選択するように開発された。ベクターは、アラビノースプロモーター、
アンピシリン耐性（βラクタマーゼ）遺伝子、部分的なテトラサイクリン耐性遺
伝子、pelB（ペクチン酸リアーゼ）シグナル配列、NcoIおよびHindIII制限酵素
部位を含む、pBRncoH3と名づけられたpBR322プラスミドの改変体である（図3）
。pBRncoH3ベクターはまたFab以外のシグナル配列を有するタンパク質をクロー
ニングするためにも使用することができる。2番目のベクターpBRnsiH3は、pelB
シグナル配列が欠失され、NcoI制限酵素部位がNsi部位で置換されている点を除
いては前記のベクターと全く同一であり、シグナル配列を有するまたは有さない
タンパク質のクローニングのために開発された。
【０１７０】 araC制御遺伝子（araBADプロモーターを含む）は大腸菌K12株NL31-001（UCSB
のNancy Lee博士より寄贈）から、プライマーAおよびB（表3）を用いてTaq DNA
ポリメラーゼ（Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN）を使用してPCR（実施
例3）により増幅された。プライマーAおよびBはそれぞれ、lacプロモーターの5'
側およびpelBシグナル配列の5'側に相当するBS39ベクターの20塩基対の配列をそ
の5'末端に含んでいる。プライマーAは、後でara挿入物をpBRベクターにライゲ
ーションする際に使用されるEcoRI制限酵素部位をその5'末端に含んでいる。ara
CparaBAD PCR産物はアガロースゲル電気泳動により確認され、挿入物のアンチセ
ンス鎖を生成するためにプライマー「B」を用いた非対称性PCRの鋳型として使用
された。一本鎖産物はアガロースゲル電気泳動され、切り出され、GeneClean（B
io101、San Diego、CA）により精製され、製造者の推奨に従い水に再懸濁された
。挿入物はT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて37℃で45分間キナーゼ化された
。T4ポリヌクレオチドキナーゼは70℃で10分間加熱することで失活され、挿入物
は等量のフェノール/クロロホルムを用いて抽出され、次にクロロホルムを用い
て抽出された。DNAは-20℃で30分間エタノール沈殿された。DNAは、4℃、14krpm
で15分間遠心分離されペレットとされ、氷冷70％エタノールを用いて洗浄され、
インバキュオで乾燥された。
【０１７１】 挿入物は水に再懸濁され、濃度は吸光度1.0を40μg/mlの濃度としてA260によ
り決定された。挿入物は配列確認およびpelBシグナル配列をアラビノースプロモ
ーターに対して同じ読み枠で導入するために（pelBシグナル配列もまた、その3'
末端に、後でara挿入物をpBRベクターにクローニングするために使用される、Nc
oI制限酵素部位を含む）BS39ファージ提示ベクターにクローニングされた。クロ
ーニングは、250ngのBS39ウラシル鋳型（実施例5）、150ngのキナーゼ化araCpBA
D挿入物、1.0μlの10×アニーリング緩衝液を最終容量10μl中で混合することに
より実施された。試料は70℃で2分間加熱され、挿入物およびベクターがアニー
ルできるように20分かけて室温に冷却された。挿入物とベクターは1μlの10×合
成緩衝液、1μlのT4DNAリガーゼ（1U/μl）、1μlのT7 DNAポリメラーゼ（1U/μ
l）を添加して、37℃で30分間インキュベートすることにより互いにライゲーシ
ョンされた。反応は90μlの停止緩衝液（10mMトリスpH8.0、10mM EDTA）により
停止され、1μlがエレクトロコンピテント大腸菌株DH10B（Life Technologies、
Gaithersburg、MD）にエレクトロポレーションされた（実施例8）。
【０１７２】 形質転換された細胞は1.0mLの2×YT培地を用いて希釈され、1μl、10μl、100
μlが実施例12に記載されているようにプレーティングされた。一晩37℃でイン
キュベートした後、各プラークが選択され、プライマーAおよびBを用いてPCRに
より増幅され、アガロースゲル電気泳動により挿入物全長があるかが調べられた
。挿入物全長を有するクローンがプライマーD、E、F、G（表3）を用いて配列決
定され、文献と比較された。正しいDNA配列を有する挿入物はBS39からプライマ
ーAおよびC（図4A）を用いてPCRにより増幅され（実施例3）、産物がアガロース
ゲル電気泳動された。
【０１７３】 全長産物はゲルから切り出され、以前に記載されたように精製され、EcoRIお
よびNcoI消化によりクローニングのために調製された。マウスFabを発現するpBR lacを基礎とする発現ベクターがこの挿入物を受容するためにEcoRIおよびNcoI
消化により調製された。この消化により、lacプロモーターおよび重鎖（CH1）定
常領域の5'末端までのコード領域全体が切り出された（図4A）。
【０１７４】 挿入物とベクターは（2：1のモル比）、1μlの10mM ATP、1μlのT4DNAリガー
ゼ（1U/μl）、1μlの10×リガーゼ緩衝液と最終容量10μl中で混合され、15℃
で一晩ライゲーションされた。ライゲーション反応物は20μlに希釈され、1μl
がエレクトロコンピテント大腸菌株DH10Bにエレクトロポレーションされ（実施
例8）、LBテトラサイクリン（10μg/ml）プレート上にプレーティングされ、37
℃で一晩増殖された。
【０１７５】 クローンが選択され、20μg/mlのテトラサイクリンを含む3ml LB培地中で一晩
増殖された。これらのクローンは、1μlの一晩培養物を鋳型としてプライマーA
およびCを用いてPCRにより増幅され（実施例3）、正しい挿入物を有するかが試
験された。PCR反応物のアガロースゲル電気泳動により全クローンがaraCparaB挿
入物を有することが明らかとなった。ベクター（プラスミド）は、ウイザード（
Wizard）ミニプレップカラム（Promega、Madison、WI）により製造者の推奨に従
い、各培養物から精製された。新ベクターは、araC遺伝子、araBプロモーター、
PelBシグナル配列、および本質的に重鎖のCH1領域全体を含んでいた（図4B）。
【０１７６】 ベクターは、EcoRIおよびNcoI消化により除去されたFab領域を再導入すること
により発現が試験された。その領域は14F8を発現するプラスミド（20ng）からプ
ライマーHおよびI（表3）を用いてPCR（実施例3）により増幅された。これらの
プライマーは、14F8特異的な配列を有することに加えて、PelBシグナル配列の3'
末端およびCH1領域の5'末端に相当する20塩基対のベクター配列をその5'末端に
クローニングのために含んでいた。PCR産物はアガロースゲル電気泳動され、全
長産物はゲルから切り出され、以前に記載されたように精製された。
【０１７７】 ベクターはNcoIを用いて直鎖状にされ、挿入物ともにT4DNAポリメラーゼの3'
から5'エキソヌクレアーゼ活性を介したクローニングのために調製された。挿入
物およびNcoI消化ベクターは、各1.0μgを別々のチューブに分注し、1.0μlの10
×制限エンドヌクレアーゼ緩衝液A（Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN）
を添加し、水で容量を9.0μlにすることにより、T4エキソヌクレアーゼ消化のた
めに調製された。試料は、1μlのT4DNAポリメラーゼ（1U/μl）を用いて30℃で5
分間消化された。T4DNAポリメラーゼは70℃で15分間加熱することで失活された
。試料は冷却され、軽く回転され、消化された挿入物（35ng）およびベクター（
100ng）が混合され、1mM MgCl2を用いて容量が10μlにされた。試料は70℃で2分
間加熱され、エキソヌクレアーゼ消化により生じた挿入物およびベクターの相補
的な5'一本鎖突出が互いにアニールできるように20分かけて室温に冷却された（
図5）。アニールされたDNA（1.5μl）は30μlのエレクトロコンピテント大腸菌
株DH10Bにエレクトロポレーションされた（実施例8）。
【０１７８】 形質転換された細胞は1.0mLの2×YT培地を用いて希釈され、1μl、10μl、100
μlがテトラサイクリン（10μg/ml）を含むLB寒天プレート上にプレーティング
され、37℃で一晩増殖された。翌日2つのクローンが選択され2×YT（10μg/mlの
テトラサイクリン）中で37℃で一晩増殖された。araプロモーターに駆動される
タンパク質発現を試験するために、これらの培養物は2×YT（テトラサイクリン
）中で1/50に希釈され、OD600が1.0になるまで増殖され、その時点でそれらは2
つの培養物に分割され、1つはアラビノースを最終濃度が0.2％（W/V）になるよ
うに添加されることにより誘導された。培養物は室温で一晩増殖させた後、ELIS
AによりFab産生が試験された。誘導された培養物はともに約20μg/mlのFabを産
生していた。非誘導培養物中ではFabは検出できなかった。
【０１７９】 Fabのポリクローン集団をクローニングしようとする最初の試みは3％〜13％に
渡る未消化ベクターのバックグラウンドにより妨害された。非発現クローンがFa
b発現クローンよりも選択的な優位性を持つため、未消化ベクターはFab発現クロ
ーンの消失を引き起こした。未消化ベクターをベクター調製物中から除去するた
めに様々な方法が試みられたが、わずかに部分的に成功しただけだった。例とし
ては、ベクターを一晩37℃でNcoI消化し、抽出し、その調製物を再消化する、ま
たはNcoI消化にスペルミジンを含める、またはNcoI消化に一本鎖結合タンパク質
（United States Biochmicals、Cleveland、OH）を含める、または予備のゲル電
気泳動を行うことが含まれる。その後テトラサイクリンプロモーターの5'末端か
ら19塩基対のところにpBR中のHindIII制限酵素部位が存在することが分かった。
これらの19塩基対を失ったベクターはテトラサイクリン存在下での増殖に耐える
ことができなくなり、未消化ベクターによるバックグラウンドは消失した。
【０１８０】 araに基づく発現ベクターは挿入物非存在下ではテトラサイクリン感受性にな
るように改変された。これはpBRncoベクターをNcoIおよびHindIII（Boehringer
Mannheim、Indianapolis、IN）で消化することにより達成され、抗体遺伝子カセ
ット全体およびtetプロモーターの一部を除去した（図4B）。NcoI/HindIII消化
により切り出された領域は、無関係なDNAスタッファー（stuffer）断片と前記の
ようにライゲーションにより置換された。ライゲーション反応物は20μlに希釈
され、1μlがエレクトロコンピテント大腸菌株DH10Bにエレクトロポレーション
され（実施例8）、LBアンピシリン（100μg/ml）プレート上にプレーティングさ
れ、37℃でインキュベーションされた。
【０１８１】 一晩インキュベーションした後、形質転換体が選択され、アンピシリン（100
μg/ml）を含むLB培地中で一晩増殖された。ベクター（プラスミド）は、ウイザ
ードミニプレップカラムにより製造者の推奨に従い、各培養物から精製された。
この改変されたベクターpBRncoH3はテトラサイクリン感受性であるが、ベクター
の増殖調製物では依然としてアンピシリン耐性を保持していた。
【０１８２】 抗体遺伝子挿入物は実施例3に記載されているようにプライマーIおよびJ（表3
）を用いてPCRにより増幅された。プライマーJは、アニーリングのためのHindII
Iの3'側の20塩基対のベクター配列に加えて、HindIII消化により除去されたtet
プロモーターの19塩基対を含んでいた。この改変されたベクターは、挿入物とと
もにNcoI/HindIIIで消化され、エクソヌクレアーゼ処理され、以前に記載された
ようにアニーリングされた。テトラサイクリン耐性は、tetプロモーターを完成
させることができた挿入物を含むクローンでのみ回復された。アニールされたFa
bベクター（1μl）が30μlのエレクトロコンピテント大腸菌株DH10Bにエレクト
ロポレーションされた（実施例8）。
【０１８３】 形質転換された細胞は1.0mLの2×YT培地に希釈され、10μlの10-2および10-3
希釈物が10μg/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天プレート上にプレーティング
され、サブクローニングされたポリクローナル集団の大きさが決定された。この
プレーティングはまた、必要であればポリクローンから個々のクローンを選択す
る機会を提供した。残りの細胞は37℃で1時間インキュベートされ、それから1％
グリセロールおよび20μg/mlのテトラサイクリンを含む2×YT 30mLに1/100希釈
され、37℃で一晩増殖された。一晩培養物は同じ培地に1/100希釈され、8時間増
殖させた後、-80℃で長期保存するためのグリセロール凍結ストックが作製され
た。
【０１８４】 新規のベクターは、挿入物を有するベクターと比べて、ベクターのみを含むク
ローン増殖の偏りを除去する。これはアラビノース非存在下で完全に抑制（repr
ess）されているアラビノースプロモーターとともに、誘導をかけるまでは大腸
菌によりよく許容される抗体を得るために、ポリクローナル抗体集団を偏らせる
ことなく形質転換生物の培養を拡大することを可能にする。
【０１８５】 このベクターの変異体もシグナル配列を有するまたは有さない、任意のタンパ
ク質のクローニングのために構築された。改変されたベクターにおいてはNcoI制
限酵素部位およびPelBシグナル配列全体が除去された。その場所にNsiI制限酵素
部位が導入され、NsiI消化の時およびT4消化の時に、ATG開始コドンのアデノシ
ン残基（A）になる一塩基が、araBADプロモーターにインフレームで付加された
。HindIII部位およびプライマーJ（表3）を用いたテトラサイクリンプロモータ
ーの回復はpBRncoH3ベクターについて記載されたものと同じである。さらにT4エ
キソヌクレアーゼクローニング過程も、挿入物を増幅するために使用された5'PC
RプライマーがPelBシグナル配列の3'末端ではなく、araBADプロモーターの3'末
端に相当する20bpのベクター配列を5'末端に有している点を除いては、前記と同
一であった。
【０１８６】 3種のPCRプライマーK、LおよびM（表3）がaraC制御遺伝子（araBADプロモータ
ーを含む）を増幅するために使用された。5'プライマー、プライマーKは、ara挿
入物をpBRベクターにライゲーションするためにその5'末端にEcoRI制限酵素部位
を含む。1つのプライマーでは合成するには大きすぎるため、挿入物の3'末端は2
つのプライマーを用いて増幅された。内側の3'プライマー（L）はaraBADプロモ
ーターに対してインフレームでNsiI制限酵素部位を導入し、外側の3'プライマー
（M）は挿入物をベクターにライゲーションするために使用されることになるHin
dIII制限酵素部位を導入する。
【０１８７】 PCR反応は実施例3のように100μlスケールで4個実施された。反応液は、100pm
olの5'プライマー（K）、1pmolの内側の3'プライマー（L）、および100pmolの外
側の3'プライマー（M）、10μlの2mM dNTPs、0.5μlのTaq DNAポリメラーゼ、Mg
Cl2を含む10μlの10×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液に水を加えて100μlにしたも
のを含んでいた。以前に記載されたように、araCparaBAD PCR産物はペレット化
され、アガロースゲル電気泳動により分画され、全長産物がゲルから切り出され
、精製され、水に再懸濁され、EcoRIおよびHindIII消化によりクローニングのた
めに調製された。pBRベクター（Life Technologies、Gaithersburg、MD）が、前
記のようにEcoRIおよびHindIII消化およびアガロースゲル電気泳動による精製に
より挿入物を受容するために調製された。
【０１８８】 挿入物とベクターは（2：1のモル比）、1μlの10mM ATP、1μlのT4DNAリガー
ゼ（1U/μl）、1μlの10×リガーゼ緩衝液と最終容量10μl中で混合され、15℃
で一晩ライゲーションされた。ライゲーション反応物は20μlに希釈され、1μl
がエレクトロコンピテント大腸菌株DH10Bにエレクトロポレーションされ（実施
例8）、LBテトラサイクリン（10μg/ml）プレート上にプレーティングされ、37
℃で一晩増殖された。クローンが選択され、テトラサイクリンを含む3ml LB培地
中で一晩増殖された。
【０１８９】 これらのクローンは、1μlの一晩培養物を鋳型としてプライマーKおよびMを用
いてPCRにより増幅され（実施例3）、正しい挿入物を有するかが試験された。PC
R反応物のアガロースゲル電気泳動により全クローンがaraCparaB挿入物を有する
ことが明らかとなった。ベクター（プラスミド）は、ウイザードミニプレップカ
ラムにより製造者の推奨に従い、各培養物から精製された。新規のベクターpBRn
siは、araC遺伝子、araBADプロモーター、およびNsiI制限酵素部位を含んでいた
。
【０１９０】 ベクターはマウスFabを再導入することにより発現が試験された。その領域は
マウスFabを含むプラスミド（20ng）からプライマーOおよびN（表3）を用いてPC
R（実施例3）により増幅された。プライマーは、Fabに特異的な配列を有するこ
とに加えて、araBADプロモーターの3'末端およびCH1領域の5'末端に相当する20
塩基対のベクター配列をその5'末端にクローニングのために含んでいた。pBRnsi
ベクターはNsiIおよびHindIIIを用いて直鎖状にされた。ベクターとPCR産物はア
ガロースゲル電気泳動され、全長産物はゲルから切り出され、以前に記載された
ように精製された。ベクターおよび挿入物は、以前に記載されたように、T4DNA
ポリメラーゼ消化され、アニーリングされた。アニールされたDNA（1μl）は30
μlのエレクトロコンピテント大腸菌株DH10Bにエレクトロポレーションされた（
実施例8）。形質転換された細胞は1.0mLの2×YT培地を用いて希釈され、1μl、1
0μl、100μlがテトラサイクリン（10μg/ml）を含むLB寒天プレート上にプレー
ティングされ、37℃で一晩増殖された。
【０１９１】 ニトロセルロースリフト（lifts）は寒天プレート表面上に1分間置かれ、記載
されているように（12.24節、分子クローニング、実験室マニュアル（1989）、S
ambrook J）処理された。フィルターはヤギ抗κAPを用いて現像され、陽性（κ
発現）クローンが選択され、2×YT（10μg/mlテトラサイクリン）において37℃
で増殖された。ベクター（プラスミド）は、ウイザードミニプレップカラム（Pr
omega、Madison、WI）により製造者の推奨に従い、培養物から精製された。Fab
領域はNcoI/HindIII消化により切り出され、無関係なDNAスタッファー断片と前
記のようにライゲーションにより置換された。ライゲーション反応物は20μlに
希釈され、1μlがエレクトロコンピテント大腸菌株DH10Bにエレクトロポレーシ
ョンされ（実施例8）、LBアンピシリン（100μg/ml）プレート上にプレーティン
グされ、37℃でインキュベーションされた。一晩インキュベーションした後、形
質転換体が選択され、アンピシリン（100μg/ml）を含むLB培地中で一晩増殖さ
れた。ベクター（プラスミド）は、ウイザードミニプレップカラムにより製造者
の推奨に従い、各培養物から精製された。改変されたベクターpBRnsiH3はテトラ
サイクリン感受性であるが、ベクターの増殖調製物中では依然としてアンピシリ
ン耐性を有していた。
【０１９２】 実施例15：ポリクローナルFab集団の発現ベクターへのサブクローニングと大腸
菌へのエレクトロポレーション 109および1010の親和性で切り捨てられたもの（実施例13を参照されたい）両
方に由来するポリクローナルIL8抗体ファージは2×YTで1/30に希釈され、1μlが
、プライマー197（実施例5）および970（以下を参照されたい）を用いて抗体遺
伝子挿入物をPCR増幅するための鋳型として使用された。PCR（3μl〜100μlの反
応）は、DNA産物に導入される誤りを最小限にするために高精度PCRシステム、エ
クスパンド（Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN）を用いて実施
された。各100μl反応は、100pmolの5'プライマー197、100pmolの3'プライマー9
70、0.7ユニットのエクスパンドDNAポリメラーゼ、10μLの2mM dNTPs、10μLの1
0×エクスパンド反応緩衝液、鋳型としての1μl希釈ファージストック、水を加
えて100μlにしたものを含んでいた。反応はパーキンエルマーサーマルサイクラ
ー（モデル9600）で以下の温度プロファイルを用いて実施された：1サイクルの9
4℃での変性（1分）；10サイクルの変性（15秒、94℃）、アニーリング（30秒、
55℃）、伸長（60秒、72℃）、15サイクルの変性（15秒、94℃）、アニーリング
（30秒、55℃）、伸長（80秒で各サイクル毎に20秒増加、72℃）；伸長（6分、7
2℃）；浸漬（4℃、無制限）。PCR産物は前記のように、エタノール沈殿され、
ペレットとされ、乾燥された。DNAは水に溶解され、アガロースゲル電気泳動に
より分画された。全長産物は以前に記載されたようにゲルから切り出され、水に
再懸濁された。
【０１９３】
【０１９４】 挿入物およびNcoI/HindIII消化pBRncoH3ベクターは、1.0μlの10×緩衝液Aを1
.0μgのDNAに添加し、水で最終容量を9μlにすることにより、T4エキソヌクレア
ーゼ消化のために調製された。試料は、1μlのT4DNAポリメラーゼ（1U/μl）を
用いて30℃で4分間消化された。T4DNAポリメラーゼは70℃で10分間加熱すること
で失活された。試料は冷却され、軽く回転され、100ngの消化抗体遺伝子挿入物
および1μlの10×アニーリング緩衝液が100ngの消化ベクターと1.5mLチューブで
混合された。水を用いて容量が10μlにされ、70℃で2分間加熱され、挿入物およ
びベクターがアニールできるように20分かけて室温に冷却された。挿入物および
ベクターは1μlの10×合成緩衝液、1μlのT4DNAリガーゼ（1U/μl）、1μlの希
釈T7 DNAポリメラーゼ（1U/μl）を添加して、37℃で15分間インキュベートする
ことにより互いにライゲーションされた。
【０１９５】 ライゲーションされたDNA（1μl）が2μlの水に希釈され、その後1μlの希釈
されたDNAが40μlのエレクトロコンピテント大腸菌株DH10Bにエレクトロポレー
ションされた（実施例8）。形質転換された細胞は1.0mLの2×YT培地を用いて希
釈され、10μlの10-1、10-2および10-3希釈物が10μg/mlのテトラサイクリンを
含むLB寒天プレート上にプレーティングされ、サブクローニングされたポリクロ
ーナル集団の大きさが決定された。109親和性ーのポリクローナルは約6000個の
異なるクローンを有し、1010親和性ーのポリクローナルは約10000個の異なるク
ローンを有した。残りの細胞は37℃、300rpmで1時間インキュベートされ、それ
から全培養物が、1％グリセロールおよび20μg/mlのテトラサイクリンを含む2×
YT 50mLに移され、37℃で一晩増殖された。一晩培養された培養物は同じ培地に1
/100希釈され、8時間増殖された後、-80℃で長期保存するためのグリセロール凍
結ストックが作製された。
【０１９６】 モノクローナル抗体は、サブクローニング効率を測定するために使用されたテ
トラサイクリンを含むLB寒天プレートから、またはグリセロール凍結ストックか
らストリークされた（streaked）プレートから個々のコロニーを選択することに
より、得られた。選択されたコロニーは、10μg/mLのテトラサイクリン及び2×Y
T培地を含む振盪フラスコ中で37℃、300rpmで一晩インキュベートされた。グリ
セロール凍結ストックが各モノクローナルについて-80℃で長期保存するために
作製された。全体で15個の異なるコロニーが109親和性ーで切り捨てられたもの
から選択され、IL8への結合に関して解析された。それらの15クローンのうち、2
つが非常に少ない量の抗体を発現しており、1つは抗体を発現していたがIL8に結
合せず、2つが機能的な抗体を発現していたが、恐らく配列鋳型の品質のせいでD
NA配列が不明瞭であり、1つは機能的な抗体を発現していたが配列決定されなか
った。9個のクローンが実施例22に記載されているように配列決定された。全体
で21個の異なるコロニーが1010親和性ーで切り捨てられたものから選択され、IL
8への結合が解析された。それらの21クローンのうち、4つが非常に少ない量の抗
体を発現しており、3つは抗体を発現していたがIL8に結合せず、4つは機能的な
タンパク質を発現していたが配列決定されなかった。10個のクローンが実施例22
に記載されているように配列決定された。
【０１９７】 実施例16：振盪フラスコ中でのIL8または抗体の発現および精製 振盪フラスコ接種物は-80℃細胞バンクまたはコロニー（実施例15）から、37
℃、300rpmに設定されたインキュベーション振盪器中に一晩入れて生成された。
細胞は前記で規定された培地中で培養された。接種物は37℃、300rpmで増殖され
る2Lのツネアー（Tunair）振盪フラスコ（Shelton Scientific、Schelton、CT）
に播種するために使用される。対数増殖期にL-（＋）アラビノースを2g/Lで添加
し、続いて、フラスコを23℃、300rpmに維持することにより発現が誘導される。
バッチ終了させた後、培養物はM-110Yマイクロフリューダイザー（Microfluidiz
er）（Microfluidics、Newton、MA）に17000psiにて通過される。
【０１９８】 精製には固相化金属親和性クロマトグラフィーが用いられる。キレート性セフ
ァロースファストフロー（Chelating Sepharose FastFlow）樹脂（Pharmacia、P
iscataway、NJ）は0.1M NiCl2を用いて充填され、20mMホウ酸、150mM NaCl、10m
Mイミダゾール、0.01％ NaN3、pH8.0緩衝液を用いて平衡化された。培養物を10m
Mイミダゾールにするためにストック溶液が使用される。上清がその後樹脂と混
合され、少なくとも1時間、室温にて150rpm〜200rpmに設定されたインキュベー
ション振盪器中でインキュベートされる。IL8または抗体はニッケルとタンパク
質上のヘキサヒスチジンタグの間の高い親和性相互作用により捕捉される。バッ
チ結合が完了した後、樹脂がビンの底に少なくとも10分間沈められる。培養物は
、樹脂が失われないように注意しながら、注意深くビンから注ぎ出された。残っ
た培養物および樹脂の混合物はクロマトグラフィーカラムに注がれる。洗浄後、
タンパク質は20mMホウ酸、150mM NaCl、200mMイミダゾール、0.01％ NaN3、pH8.
0緩衝液を用いて溶出された。必要であれば、タンパク質プールはセントリプレ
ップ-10（Centriprep-10）濃縮器（Amicon、Beverly、MA）中で3500rpmにて濃縮
される。その後、保存のため、12-14000のMWCQ透析チューブを用いて、20mMホウ
酸、150mM NaCl、0.01％ NaN3、pH8.0緩衝液に一晩透析される。
【０１９９】 IL8はさらに以下の方法で精製された。タンパク質は、10mMリン酸ナトリウム
、150mM NaCl、pH7.35に対して徹底的に透析され、10mMリン酸ナトリウム、pH7.
35を用いて1：3に希釈された。この物質が10mMリン酸ナトリウム、40mM NaClで
平衡化されたQ-セファロースカラム（Q-Sepharose）（Amersham Pharmacia Biot
ceh、Piscataway、NJ）にロードされた。IL8は流出（flow through）画分に含ま
れていた。SDSポリアクリルアミドゲル分析によれば、IL8は95％以上の純度であ
った。IL8は120mM NaClおよび0.01％ NaN3にされ、-80℃で保存された。
【０２００】 実施例17：7F11モノクローナル抗体の調製 アセチルチオプロピオン酸の合成 テトラヒドロフラン（THF、700ml）に3-メルカプトプロピオン酸（7ml、0.08
モル）およびイミダゾール（5.4g、0.08モル）を入れた攪拌溶液に、THF（100ml
）中の1-アセチルイミダゾール（9.6g、0.087モル）の溶液がアルゴン下で一滴
ずつ15分に渡って添加された。溶液は室温でさらに3時間攪拌され、その後THFが
インバキュオで除去された。残留物は氷冷水（18ml）で処理され、生じた溶液は
氷冷濃塩酸（14.5ml）でpH1.5〜pH2に酸性化された。混合物は水で（50mlで2回
）抽出され、硫酸マグネシウム上で乾燥され、脱水蒸発された。残留物の粗製の
黄色油状固形物（10.5g）は、クロロホルムーヘキサンから再結晶化され、4.8g
（41％の収率）の44〜45℃の融点を有する白色固体のアセチルチオプロピオン酸
が得られた。
【０２０１】 デカペプチド誘導体 デカペプチド （Chiron Mimotopes Peptide Systems、San Diego、CA）は、穏やかに攪拌しな
がらアルゴン下で丸底フラスコ中で無水DMF（5.4mL）中で溶解された（0.3g）。
イミダゾール（0.02g）は攪拌されている溶液中に添加された。別々にアセチル
チオプロピオン酸（0.041g）が、攪拌しながらアルゴン下で丸底フラスコ中で0.
55mLの無水DMF中に溶解され、0.056gの1,1'-カルボニルジイミダゾール（Aldric
h Chemical Co.、Milwaukee、WI）が攪拌されている溶液中に添加された。フラ
スコはアルゴン下で密閉され、少なくとも30分室温で攪拌された。この溶液がデ
カペプチド溶液に添加され、反応混合物は、溶媒がインバキュオで除去される前
に少なくとも6時間室温で攪拌された。フラスコ中の残留物は各回10mLのジエチ
ルエーテルを用いて2回研磨され、エーテルはデカントで捨てられた。塩化メチ
レン（20mL）がフラスコ中の残留物に添加され、固形物はフラスコからこすりと
られ、ファインフリット（fine fritted）のブーフナー漏斗を用いて濾過された
。固形物はさらに20mLの塩化メチレンを洗浄され、ブーフナー漏斗は真空下で乾
燥された。誘導体を加水分解し遊離チオールを生成するために、それは70％DMF
中に溶解され、激しく攪拌しながら1M水酸化カリウムが最終濃度0.2Mまで添加さ
れた。誘導体溶液は、0.5Mリン酸カリウム、0.1Mホウ酸、pH7.0に濃塩酸が最終
濃度1Mになるまで添加された溶液を添加して溶液が中和される前に、室温で5分
間放置された。加水分解されたデカペプチド誘導体のチオール濃度は、0.25mM 5
,5'-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB、Aldrich Chemical Co.、Milwauke
e、WI）および0.2Mホウ酸カリウム、pH8.0を含む990μl溶液に10μlの溶液を希
釈することにより、決定された。mM単位のチオール濃度はA412（100/13.76）に
等しかった。
【０２０２】 キーホールリンペットヘモシニアンおよびウシ胎児血清を用いたデカペプチド誘
導体の結合体の調製 15mgのスルフォスクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1
-カルボキシル酸（SULFO-SMCC）を添加し、攪拌しながら室温で1時間に渡り1N水
酸化カリウムを用いてpHを7から7.5の間に維持することにより、SULFO-SMCCとキ
ーホールリンペットヘモシニアン（KLH、14mg/mlを6ml、Calbiochem、San Diego
、CA）を反応させた。タンパク質は、0.1Mリン酸カリウム、0.02Mホウ酸カリウ
ム、および0.15M塩化ナトリウム、pH7.0中のゲル濾過クロマトグラフィーにより
未反応のSULFO-SMCCから分離され、24mlのKLH-マレイミドが3.1mg/mlの濃度で回
収された。加水分解されたデカペプチド誘導体は、存在すると推定されるマレイ
ミドの量に対して十分過剰なモル比でKLH-マレイミドの画分に別々に添加され、
溶液は4℃で4時間攪拌され、その後免疫前に各々が1Lの無発熱性物質のリン酸緩
衝食塩水、pH7.4に対して3回透析された。
【０２０３】 0.3mlアセトニトリル中6.7mgのSMCCを添加し、攪拌しながら室温で1時間の間
に渡り1N水酸化カリウムを用いてpHを7から7.5の間に維持することにより、SMCC
とウシ血清アルブミン（BSA、20mg/mlを3.5ml）を反応された。タンパク質は、0
.1Mリン酸カリウム、0.02Mホウ酸カリウム、および0.15M塩化ナトリウム、pH7.0
中のゲル濾過クロマトグラフィーにより未反応物から分離された。加水分解され
たデカペプチド誘導体は、存在すると推定されるマレイミドの量に対して十分過
剰なモル比でKLH-マレイミドの画分に別々に添加され、溶液は4℃で4時間攪拌さ
れた。溶液は、標準的技術によりデカペプチド誘導体に結合した抗体を検出する
ためのマイクロプレートをコートするために使用された。
【０２０４】 モノクローナル抗体の産生および一次選抜 Balb/cマウスの免疫はLiuら、Clin Chem 25：527〜538（1987）の方法に従っ
て実施された。脾臓細胞のSP2/0-Ag14骨髄腫細胞との融合、ハイブリドーマの増
殖、およびクローニングは標準的技術に従い実施された。さらなるクローニング
のためのハイブリドーマの選択は96ウェル段階の培養上清を用いて開始された。
標準的なELISA処理は、ELISAプレートに吸着されたデカペプチド誘導体のBSA結
合体を用いて実施された。典型的には、1つの融合物が20プレートにプレーティ
ングされ、各プレートにつき約10ウェル〜20ウェルがELISAアッセイ法で陽性で
あった。この段階では、もし連結アームのSMCC部分に対する抗体をさらに考慮に
いれなくてよくするためには、二次選択を実施することが可能であろう。デカペ
プチド誘導体に連結されていないSMCCを用いて誘導体化されたBSAを用いたELISA
分析により、BSA結合体に結合した陽性クローンのどれが実際にSMCC-BSAに結合
していたかを同定できた。SMCC-BSAに特異的な抗体はこの段階で除去されてもよ
い。デカペプチド誘導体に特異的なモノクローナル抗体7F11が産生され、この過
程で選択された。
【０２０５】 実施例18：7F11磁性ラテックスの調製 MAG/CM-BSA 6mLの5％磁性ラテックス（MAG/CM、740μm 5.0％、Seradyn、Indianapolis、I
N）に、21mLの水、続いて3mLの600mM 2-（4-モルフォリノ）-エタンスルホン酸
、pH5.9（MES、Fisher Scientific、Pittsburgh、PA）が添加された。ホモシス
テインチオラクトン塩酸（HCTL、480mg、Aldrich Chemical Co.、Milwaukee、WI
）および1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド（EDAC、660
mg、Aldrich Chemical Co.、Milwaukee、WI）が連続して添加され、反応混合液
は室温で2時間ゆり動かされた。誘導体化された磁性ラテックスは、粒子を再懸
濁するためのプローブ超音波処理（probe sonication）を用いて、30mLの水で3
回洗浄された（実施例14に示すように磁石を用いて）。洗浄された粒子は30mlの
水に再懸濁された。水酸化ナトリウム（2M）およびEDTA（1mM）を含む溶液3mLが
磁性ラテックス-HCTL懸濁液に添加され、反応は室温で5分間進行された。500mM
リン酸ナトリウムおよび100mMのホウ酸ナトリウム中の1M塩酸6.45mLを用いてpH
が6.9に調製された。加水分解された磁性ラテックス-HCTLは磁石を用いて上清か
ら分離され、その後33mLの50mMリン酸ナトリウム、10mMのホウ酸ナトリウム、0.
1mM EDTA、pH7.0に再懸濁された。磁性ラテックス懸濁液はその後36mg/mLのBSA-
SMCC（BSAに対してモル数で5倍以上過剰に用いて、実施例21に記載されているよ
うに作製された）2mLに添加され、反応混合液は室温で一晩ゆり動かされた。N-
ヒドロキシエチルマレイミド（NHEM、500mMを0.42mL、Organix Inc.、Woburn、M
A）が、残存しているチオールをキャップするために30分間添加された。30分後
、磁性ラテックス-BSAは30mLの50mMリン酸カリウム、10mMのホウ酸カリウム、15
0mM塩化カリウム、pH7.0（50/10/150）で2回洗浄され、30mLの10mMリン酸カリウ
ム、2mMのホウ酸カリウム、200mM チオシアン酸ナトリウム、pH7.0（10/2/200）
を用いて2回洗浄された。磁性ラテックス-BSAは30mLの10/2/200に再懸濁された
。
【０２０６】 7F11-SH（1：5） 18μlのSPDP（アセトニトリル中で40mM）が7F11溶液（5.85mg/mLを3.8mL）に
添加された。タウリン（Aldrich Chemical Co.、Milwaukee、WI）を最終濃度20m
Mまで添加した後、反応は室温で90分間進行された。15分後DTTが最終濃度2mMま
で添加され、還元反応が室温で30分間進行された。7F11-SHはG-50（40mL）で精
製され、0.1mM EDTAを添加した50/10/150で溶出された。精製された7F11-SHのプ
ールは、MAG/CM-BSA-SMCCへ連結反応のために保存された。
【０２０７】 MAG/CM-BSA-7F11 SMCC（10mg）が0.5mLの無水ジメチルフォルムアミド（Aldrich Chemical Co.
、Milwaukee、WI）に溶解され、この溶液が磁性ラテックス-BSA懸濁液に添加さ
れた。緩やかにゆり動かしながら、反応は室温で2時間進行された。タウリンが
最終濃度20mMまで添加された。20分後、磁性ラテックス-BSA-SMCCは磁石を用い
て上清から分離され、そして粒子を再懸濁するためのプローブ超音波処理を用い
て10/2/200（20mL）に再懸濁された。磁性ラテックスはスパーフロー6（SuperFl
ow-6、240mL、Sterogene Bioseparations Inc.、Carlebad、CA）カラムで精製さ
れ、10/2/200で溶出された。緩衝液が除去され、磁性ラテックスケークに30mLの
0.7mg/mLの7F11-SHが添加された。反応混合液は室温で一晩ゆり動かされた。20
時間後、反応物はメルカプトエタノール（2mM、Aldrich Chemical Co.、Milwauk
ee、WI）および続いてNHEM（6mM）を用いてクエンチングされた。MAG/CM-7F11は
、10/2/200、続いて50/10/150を用いて洗浄された。磁性ラテックスはその後30m
Lの50/10/150に再懸濁された。
【０２０８】 実施例19：成熟ヒトインターロイキン8抗原のクローニング PCRプライマーAおよびB（それぞれ5'および3'、表3）が、成熟ヒトインターロ
イキン8抗原の5'末端コード配列およびヒトインターロイキン8（ゲンバンクアク
セッション番号M28130）の3'末端コード配列に相当するように作製された。5'プ
ライマーはpBRncoH3ベクター（実施例14）の3'末端に相当する20塩基対のベクタ
ー配列をその5'末端に含んでいる。3'プライマーはまた、組換えタンパク質の金
属キレートクロマトグラフィーによる精製を助けるために、コード配列の最後と
終止コドンの間に挿入された6個のヒスチジンコドンを有している。3'プライマ
ーはまた、その5'末端に、HindIII消化によりpBRncoH3のtet耐性遺伝子から除去
されたtetプロモーターの19塩基対、およびHindIII部位の3'側の20塩基対のベク
ター配列を有している（実施例14）。
【０２０９】 成熟インターロイキン8遺伝子挿入物のPCR増幅が、各々が100pmolの5'プライ
マー（A）、100pmolの3'プライマー（B）、2.5ユニットのエクスパンドポリメラ
ーゼ、10μLの2mM dNTPs、10μLの10×エクスパンド反応緩衝液、鋳型として1μ
lのクロンテッククイッククローンヒト肝臓cDNA（Clontech、Palo Alto、CA）、
水を加えて100μlにしたものを含む、3個の100μl反応スケールで実施された。
反応はパーキン-エルマーサーマルサイクラーで実施例18に記載されているよう
に実施された。PCR産物はペレット化され、アガロースゲル電気泳動により分離
され、全長産物はゲルから切り出され、精製され、水に再懸濁された（実施例17
）。挿入物およびNcoI/HindIII消化pBRncoH3ベクターは、1.0μlの10×緩衝液A
を1.0μgのDNAに添加し、水で容量を9.0μlにすることにより、T4エキソヌクレ
アーゼ消化のために調製された。試料は、1μlのT4DNAポリメラーゼ（1U/μl）
を用いて30℃で4分間消化された。T4DNAポリメラーゼは70℃で10分間インキュベ
ーションンすることで加熱失活された。試料は冷却され、軽く回転され、15ngの
消化挿入物が100ngの消化pBRncoH3ベクターに新しいマイクロチューブ中で添加
された。1.0μlの10×アニーリング緩衝液を添加後、水を用いて容量が10μlに
された。混合液は70℃で2分間加熱され、挿入物およびベクターがアニールでき
るように20分かけて室温に冷却された。アニールされたDNAは滅菌水で4倍希釈さ
れ、30μlのエレクトロコンピテント大腸菌株DH10Bにエレクトロポレーションさ
れた（実施例8）。形質転換された細胞は1.0mLの2×YT培地を用いて希釈され、1
0μl、100μl、300μlがテトラサイクリン（10μg/ml）を含むLB寒天プレート上
にプレーティングされ、37℃で一晩増殖された。コロニーが選択され、2×YT（2
0μg/mlのテトラサイクリン）中で37℃で一晩増殖された。翌日、-80℃で長期保
存するためのグリセロール凍結ストックが作製された。これらのクローンの配列
は、セクアサームシークエンシングキット（Epicenter Technologies、Madison
、WI）、それぞれpBRベクター内の挿入物の5'および3'側に結合するオリゴヌク
レオチドプライマーCおよびD（表3）を用いて、LI-COR4000L自動シークエンサー
（LI-COR、Lincoln、NE）を用いて、MacConnell Research（マックコネルリサー
チ）（San Diego、CA）にてダイデオキシ鎖終結法により確認された。
【０２１０】
【表３】 PCRおよび配列決定プライマーの配列
【０２１１】 実施例20：ライブラリー多様性の推定 所与の標的抗原に対するライブラリー選抜を終了した時点では、ライブラリー
は、選抜過程で用いられた基準により決定されている親和性を示す抗体をコード
するメンバーを含んでいる。好ましくは、ライブラリーメンバーの大部分が所望
の特性を示す抗体をコードするようになるまで選抜過程は繰り返される。最も好
ましくは実質的に全てのライブラリーメンバーが標的抗原に対して所望の親和性
を示す抗体をコードするようになるまで選抜過程は繰り返される。選択されたラ
イブラリー中の異なる抗体の数を推定するために、個々のメンバーがランダムに
選択され、アミノ酸配列が異なるかを決定するために配列決定される。重鎖また
は軽鎖のいずれかの可変領域（好ましくはCDRs）において少なくとも少なくとも
1つのアミノ酸の差異を示す抗体が異なる抗体であると考えられる。そのような
様式でライブラリーのランダムサンプリングを行うことによりライブラリー内の
抗体のコピー数の頻度の推定が与えられる。もし10個の抗体がランダムにサンプ
リングされ、各抗体のアミノ酸配列が他にサンプリングされた抗体と異なるなら
ば、ライブラリー中で繰り返し抗体を観察した時に期待される頻度として1/10と
いう推定が適用可能である。数百または数千の全メンバーを有するライブラリー
はポイズン分布に非常に近似した、抗体コピー頻度の確率分布を示すであろう。
ポイズン分布
【数３】 Pr（y）＝e-ηηy/y！ では特定の頻度値yの確率は平均頻度ηにのみ依存する。10個の抗体をランダム
サンプリングして抗体の重複が見られなければηの推定値は0.1であり、ライブ
ラリーをランダムサンプリングした時にライブラリーメンバーのコピーを見出さ
ない確率は
【数４】 Pr（0）＝e-0.1＝0.9 により推定される。この確率をライブラリーメンバーの総数にかけることにより
、ライブラリー中の異なる抗体の総数の推定を提供することができる。
【０２１２】 実施例21：ビオチン化IL-8に対する抗体の親和性の決定 各モノクローナル抗体の平衡結合定数は、pH8.0に緩衝されたウシ血清アルブ
ミン1％溶液中にビオチン化IL-8が10-10M存在する中で結合平衡が達成された後
の総抗体濃度および遊離抗体濃度を解析することにより決定された。ニュートラ
アビジン（商標）、（脱グリコシル化アビジン、Pierce、Rockford、IL）コート
されたスーパーパラ磁性微粒子（superparamagnetic microparticles、0.96μM
、Bangs Laboratories、Carmel、IN）を添加し、10分間インキュベーションし、
永久磁石を用いて溶液から粒子を分離することにより溶液からビオチン化IL-8が
除去される前に、全実験において抗体はIL-8と混合され、室温で一晩インキュベ
ーションされた。上清溶液は磁性粒子を含むマイクロタイタープレートから除去
され、抗体濃度が決定された。個々のウェルに添加された総抗体濃度は、IL-8と
混合されていない試料中の抗体を定量することにより決定された。免疫反応性抗
体の濃度（IL-8に結合することができる抗体タンパク質の画分）は、大過剰量の
ビオチン化IL-8を濃度既知の抗体と平衡に達するのに十分な時間インキュベーシ
ョンし、前記のように磁性ラテックスを用いてIL-8を除去し、下記に示すアッセ
イを用いて溶液中に残された抗体濃度を定量することにより、決定された。過剰
量のIL-8に結合する抗体の画分が免疫反応性の画分であり、IL-8に結合しない画
分が非免疫反応性の画分であった。平衡混合物中で総抗体濃度を決定する時、抗
体濃度は下記で示すアッセイ法により決定された混合液中の総抗体量に免疫反応
性の分画を乗じたものである。同様にIL-8除去後の平衡混合物中で遊離抗体濃を
計算する時、下記のアッセイ法により決定された遊離抗体濃度から非免疫反応性
の抗体画分が引かれる。結合比率Bは、混合液中の免疫反応性の全抗体濃度から
遊離の免疫反応性の抗体濃度Fを引くことにより決定される。質量作用の法則よ
り、
【数５】 B/F＝-KB＋KT（Tは全抗原濃度） となる。B/FのBに対するプロットは-Kの傾きとKTのy切片を生じる。
【０２１３】 試料中の抗体濃度を決定するために、κ鎖のC末端に存在するデカペプチドタ
グに結合する固相化7F11モノクローナル抗体および各ヒト抗体のκ鎖に結合する
アルカリフォスファターゼ（Southern Biotechnolpgy Associates, Inc.、Birmi
ngham、AL）結合の親和性精製されたヤギ抗ヒトκ抗体を用いてサンドイッチア
ッセイ法が構築された。分析される抗体と同じκ鎖構造を有する既知濃度の精製
抗体が校正するために使用された。7F11抗体はビオチン化され標準的方法により
ストレプトアビジンでコートされたマイクロタイタープレートに固定された。ア
ッセイ法は、平衡化混合液由来の50μlの試料を各ウェルに添加し、室温で4時間
インキュベートすることにより実施された。結合体は最終濃度が約0.125μg/ml
になるように各ウェルに添加され、室温で一晩インキュベートされた。ウェルは
0.02％ポリオキシエチレン20ソルビタンモノラウリン酸、pH8.2を含むホウ酸塩
緩衝食塩水を用いて自動プレート洗浄機で洗浄され、ELISA増幅システム（Life
Technologies、Gaithersburg、MD）がアッセイを現像するために使用された。49
0nmでの吸光度がマイクロプレートリーダーを用いて測定され、未知の抗体濃度
が検量線から決定された。
【０２１４】
【表４】
【０２１５】 実施例22：ランダムクローンのDNA配列分析 解析される各モノクローナルFabに相当するグリセロール凍結ストック（実施
例15）が、プラスミド単離および引き続くIL8挿入物のDNAシークエンシングのた
めに50mL培地に接種するために使用された。2×YT（10μg/mlテトラサイクリン
）37℃で一晩増殖され、組換えプラスミドはキアゲンプラスミドミディ（Qiagen Plasmid Midi）キット（キアゲン（Qiagen）、バレンシア、カリフォルニア州
）を用いて製造者の指示にしたがい精製された。各モノクローナル抗体のκ鎖お
よび重鎖可変および定常領域に相当する配列が、MacConnell Research（マック
コネルリサーチ）（San Diego、CA）において決定された。抗体に用いられた命
名法は実施例21のものと同じである。配列決定はセクアサームシークエンシング
キット（Epicenter Technologies、Madison、WI）、pBRベクターのFabカセット
の5'および3'側に結合するオリゴヌクレオチドプライマーCおよびD（表3）の各
々、およびLI-COR4000L自動シークエンサー（LI-COR、Lincoln、NE）を用いて、
ダイデオキシ鎖終結法により行われた。
【０２１６】 実施例23：大腸菌培養物の増殖および組換え抗体および抗原の精製 振盪フラスコ接種物は37℃、300rpmに設定されたInnova4330恒温振盪装置（Ne
w Brunswick Scientific、Edison、NJ）中で-70℃細胞バンクから一晩で生成さ
れた。接種物は3g/LのL-ロイシン、3g/LのL-イソロイシン、12g/Lのカゼイン消
化物（Difco、Detroit、MI）、12.5g/Lのグリセロールおよび10mg/mlのテトラサ
イクリンを添加した規定の培養培地（Packら、Bio/Technology 11：1271〜1277
（1993））を含む20Lの発酵器（Applikon、Foster City、CA）に播種するために
使用される。発酵器の温度、pH、および溶解酸素はそれぞれ、26℃、6.0〜6.8％
および25％飽和に制御される。ポリプロピレングリセロール（Dow、Midland、MI
）を添加することにより泡が制御される。グリセロールは流加培養様式で発酵器
に添加される。Fab発現は、後期対数増殖相中に2g/LのL（+）アラビノース（Sig
ma、St. Louis、MO）を添加することにより誘導される。細胞密度は、UV-1201分
光測光器（Shimadzu、Columbia、MD）中600nmの光学的密度により測定される。
最終Fab濃度は典型的には100〜500mg/Lである。行程終了およびpHを6.0に調節し
た後、培養物はM-210B-EHマイクロフリューダイザー（Microfluidics、Newton、
MA）を17000psiで2度通過させる。細胞を高圧ホモジナイズすることにより、Fab
が培養上清に放出される。
【０２１７】 精製の第1の段階は、増殖用床固定化金属親和性クロマトグラフィー（expande
d bed immobilized metal affinity chromatography; EB-IMAC）である。ストリ
ームラインキレーティング樹脂（Pharmacia、Piscataway、NJ）を0.1M NiCl2を
用いて充填する。その後、上向きに流れる、50mM酢酸、200mM NaCl、10mMイミダ
ゾール、0.01％NaN3、pH6.0緩衝液中で増殖および平衡化される。培養ホモジネ
ートを10mMイミダゾールとするためにストック溶液が使用され、続いて、固体含
有物の湿重量を5％未満に減少させるために、2倍またはそれ以上で平衡緩衝液で
希釈する。その後、表面速度300cm/時間で上向きに流れるストリームラインカラ
ム上にロードする。細胞破壊片は妨げられることなく通過するが、FabはFab重鎖
上のヘキサヒスチジンタグとニッケルの高親和性相互作用により捕捉される。洗
浄後、増殖用床は充填用床に変換され、Fabは下向きに流れる20mMホウ酸、150mM
NaCl、200mMイミダゾール、0.01％NaN3、pH8.0緩衝液中で溶出される。精製の
第2の段階はイオン交換クロマトグラフィー（IEC）を使用する。Qセファロース
ファストフロー樹脂（Pharmacia、Piscataway、NJ）を20mMホウ酸、37.5mM NaCl
、0.01％NaN3、pH8.0緩衝液で平衡化する。EB-IMAC段階のFab溶出プールは、20m
Mホウ酸、0.01％NaN3、pH8.0中で4倍希釈され、IECカラム上にロードされる。洗
浄後、Fabは37.5〜200mMのNaCl塩勾配を用いて溶出される。溶出画分は、プール
する前にXcell II SDS-PAGEシステム（Novex、San Diego、CA）を用いて純度が
評価される。最終的には、Fabプールは濃縮され、20mMホウ酸、150mM NaCl、0.0
1％NaN3、pH8.0保存緩衝液中で限外濾過（diafiltered）される。これは、10,00
0 MWCOカセット（Sartorius、Bohemia、NY）を装着したSartocon Slice系中で達
成される。最終精製収量は、典型的には50％である。精製Fabの濃度は280nmのUV
吸光度により測定され、吸光度1.6が1mg/mL溶液として推定される。
【０２１８】 実施例24：Cmu標的化マウス 以下の実施例は、破壊された、したがって機能しない免疫グロブリン遺伝子を
有するマウスを作製することを記載する。
【０２１９】CMD標的化ベクターの構築 マウス免疫グロブリン遺伝子を破壊するために、マウスIg重鎖遺伝子座の断片
を含むベクターがマウス胚性幹細胞にトランスフェクトされる。マウスIg重鎖配
列は、ベクターをマウス免疫グロブリン遺伝子座に「標的化」する。以下にこの
免疫グロブリン遺伝子標的化ベクターの構築を記載する。
【０２２０】 プラスミドpICEmuは、Balb/Cゲノムラムダファージライブラリー（Marcuら、C
ell 22：187,1980）から得られた、mu遺伝子に渡るマウスIg重鎖遺伝子座のEcoR
I/XhoI断片を含む。このゲノム断片は、プラスミドpICEMI9H（Marshら、Gene 32
、481〜485、1984）のXhoI/EcoRI部位にサブクローニングされた。pICEmuに含ま
れる重鎖配列は、muイントロンエンハンサーのちょうど3'側に位置するEcoRI部
位の下流側に向かって、mu遺伝子の最後の膜貫通エクソンの約1kb下流に位置す
るXhoI部位まで及んでいる。しかしながらmuスイッチ反復領域の多くは大腸菌中
の継代により除去されている。
【０２２１】 標的化ベクターは以下のように構築された（図6参照）。1.3kbのHindIII/SmaI
断片はpICEmuから切り出され、HindIII/SmaI消化されたpBluescript（Stratagen
e、La Jolla、CA）にサブクローニングされた。このpICEmu断片は、Cmu1の約1kb
の5'側に位置するHindIII部位からCmu1内のSmaI部位まで及んでいる。得られた
プラスミドはSmaI/SpeI消化され、Cmu1の3'側のSmaI部位からCmuの最終エクソン
のすぐ下流に位置するXbaI部位にまで及ぶpICEmu由来の約4kbのSmaI/XbaI断片が
挿入された。
【０２２２】 得られたプラスミド、pTAR1はSmaI部位で直鎖状にされ、neo発現カセットが挿
入された。このカセットは、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（pgk）プロモ
ーターの転写制御下のneo遺伝子（XbaI/TaqI断片、Adraら（1987）Gene 60：65
〜74）を含み、pgkポリアデニル化部位（PvuII/HindIII断片、Boerら（1990）Bi
ochemical Genetics 28：299〜308）を含んでいる。このカセットは、neoカセ
ットがEcoRI/HindIII断片として切り出されたプラスミドpKJ1より得られ（Tybul
ewiczら（1991）Cell 65：1153〜1163に記載されている）、pGEM-7（KJ1）を生
成するためにEcoRI/HindIII消化されたpGEM-7Zf（+）にサブクローニングされた
。このneoカセットはpGEM-7（KJ1）からEcoRI/SalI消化により切り出され、平滑
末端化され、プラスミドpTARのSmaI部位にゲノムCmu配列と逆の向きにサブクロ
ーニングされた。
【０２２３】 得られたプラスミドはNotIを用いて直鎖状にされ、ヘルペス単純ウイルスチミ
ジンキナーゼ（tk）カセットが、Mansourら（1988）Nature 336：348〜352によ
り記載されているように、相同組換え体を有するESクローン（マウス胚由来幹細
胞）を濃縮できるように挿入された。このカセットは、Tybulewiczら（1991）Ce
ll 65：1153〜1163に記載されているように、マウスpgkプロモーターおよびポ
リアデニル化部位にはさまれたtk遺伝子のコード配列を含む。得られたCMD標的
化ベクターは、重鎖遺伝子座と全体で約5.3kbの類似性を有し、その中にCmuの最
初のエクソンの独特なSmaI部位内に、neo発現カセットが挿入されている変異mu
遺伝子を生成するように設計されている。標的化ベクターは、ES細胞へのエレク
トロポレーションの前にプラスミド配列内で切断するPvuIを用いて直鎖状にされ
る。
【０２２４】標的化ES細胞の生成および解析 マウスIg重鎖遺伝子断片を含むベクターは、その後、マウス胚性幹細胞（ES細
胞）に挿入される。以下のものは、免疫グロブリン遺伝子含有ベクターにより標
的化されたES細胞と、ベクターが細胞に挿入された（すなわちトランスフェクト
された）後でES細胞のDNAを解析することとを記載する。
【０２２５】 AB-1 ES細胞（McMahon、A.P.およびBradley、A.（1990）Cell 62：1073〜1085
）は、基本的には「奇形癌および胚性幹細胞：実践法（Teratocarcinoma and Em
bryonic Stem Cells： a Practical Approach）」、E.J.Robertson編、Oxford：
IRL出版、p71〜112に記載されるように（Robertson、E.J（1987））細胞分裂的
に不活性であるSNL76/7細胞フィーダー層（前掲）上で増殖される。直鎖状にさ
れたCMD標的化ベクターは、Hastyら（Hasty、P.R.ら（1991）Nature 350：243
〜246）に記載されている方法によりAB-1細胞にエレクトロポレーションされた
。エレクトロポレーションされた細胞は100mmディッシュに1〜2x106細胞/ディッ
シュの密度でプレーティングされた。24時間後、G418（活性成分で200マイクロ
グラム/ml）およびFIAU（5x10-7M）が培地に添加され、薬剤耐性クローンを8〜9
日間にわたって発生させた。クローンを回収して、トリプシン処理し、2つの部
分に分割して、さらに増殖させた。その後、各クローン由来の半分の細胞は凍結
され、別の半分はベクターおよび標的配列間の相同組換えに関して解析された。
【０２２６】 DNA解析をサザンブロットハイブリダイゼーションにより実施した。DNAをLair
dら（Laird. P. W.ら（1991）Nucleic Acids Res. 19：4293）に記載されている
ようにクローンから単離した。単離ゲノムDNAをSpeIで消化し、muイントロンエ
ンハンサーとmuスイッチ領域の間に存在する配列にハイブリダイズする、915bp
のSacI断片であるプローブA（図6）を用いてプロービングした。プローブAは野
生型遺伝子座に由来する9.9kbのSpeI断片、およびCMD標的化ベクター（neo発現
カセットがSpeI部位を含む）を用いて相同組換えされたmu遺伝子座由来の診断的
な7.6kbのバンドを検出する。サザンブロット解析によりスクリーニングされた1
132個のG418およびFIAU耐性クローンのうち3つがmu遺伝子座の相同組換えを示す
7.6kbのSpeIバンドを示した。これら3クローンはさらに酵素BglI、BstXIおよびE
coRIを用いて消化され、ベクターに相同的にmu遺伝子が組み込まれていることを
確認した。プローブAとハイブリダイズさせる場合に、BglI、BstXI、またはEcoR
I消化された野生型DNAのサザンブロットは、15.7、7.3、および12.5kbの断片を
各々生じ、一方、標的化mu対立遺伝子の存在は、各々7.7、6.6、および14.3kbの
断片により示される。SpeI消化により検出された3つの陽性クローン全てで、neo
カセットがCmu1エクソンに挿入されたことの特徴である予期されたBglI、BstXI
、およびEcoRI制限酵素切断断片が示された。
【０２２７】変異mu遺伝子を有するマウスの作製 264、272および408番と名づけられた3個の標的化ESクローンを融解して、Brad
leyら（Bradley、A.、「奇形癌および胚性幹細胞：実践法」（1987）、E.J.Robe
rtson編、Oxford：IRL出版、p113〜151）に記載されているようにC57BL/6J未分
化胚芽細胞に注入した。注入された未分化胚芽細胞は、偽妊娠雌の子宮に移植し
て、導入ES細胞および宿主未分化胚芽細胞に由来する細胞の混合物を示すキメラ
マウスを作製した。キメラに寄与しているES細胞の程度は、黒色C57BL/6Jのバッ
クグラウンドにおいてのES細胞由来のアグーチ毛色の程度から視覚的に推定する
ことが可能である。クローン272および408は低い割合のキメラ（すなわち低い割
合のアグーチ色素沈着）しか生産しなかったが、クローン264は高い割合の雄性
キメラを生産した。これらのキメラはC57BL/6J雌と交配され、ES細胞ゲノムの生
殖細胞系列伝達を示すアグーチの子孫が生産された。標的化mu遺伝子のスクリー
ニングは、尾生検由来のBglI消化DNAのサザンブロット解析により実施された（E
S細胞DNAの解析のために上述されているように）。約50％のアグーチ子孫が野生
型の15.7kbのバンドに加えて、7.7kbのハイブリダイズするBglIバンドを示し、
標的化mu遺伝子の生殖細胞系列伝達を示す。
【０２２８】mu遺伝子の機能的不活性化に関するトランスジェニックマウスの解析 neoカセット（Ig重鎖配列を含む）のCmu1への挿入がIg重鎖遺伝子を不活性化
しているかを決定するために、クローン264キメラが、JH遺伝子断片の欠失の結
果として重鎖発現を不活性化するJHD変異を同種接合で有するマウス（Chenら、
（1993）Immunol. 5：647〜656）と交配された。4匹のアグーチの子孫が生まれ
た。これらの動物から1ヶ月齢において血清が採取され、マウスIgMが存在に関し
てELISAでアッセイした。4匹の子孫の内2匹は完全にIgMを欠失していた（表2）
。BglI消化およびプローブAを用いたハイブリダイゼーション（図6）およびStuI
消化および475bpのEcoRI/StuI断片（前掲）を用いたハイブリダイゼーションに
よる尾生検由来のDNAのサザンブロット解析による4匹の動物の遺伝子型判定によ
って、血清IgMを発現できなかった動物が、重鎖遺伝子座の一つの対立遺伝子がJ
HD変異を有し、もう一つの対立遺伝子がCmu1変異を有することが証明された。JH
D変異の異種接合体であるマウスは、野生型レベルの血清Igを示す。これらのデ
ータはCmu1変異がmu遺伝子の発現を不活性化することを証明する。
【０２２９】
【表２】 CMDおよびJHD変異を共に有するマウス（CMD/JHD）；JHD変異の異種接
合体マウス（＋/JHD）；野生型（129SvxC57BL/6J）F1マウス（＋/＋）およびJHD
変異の同種接合体であるB細胞欠失マウス（JHD/JHD）のELISAにより検出された
血清IgMレベル
【０２３０】 実施例25：HCo12トランスジェニックマウスの作製 以下のものはヒト免疫グロブリンを作製することができるヒト免疫グロブリン
重鎖遺伝子配列を含むトランスジェニックマウスの作製を記載する。これらのマ
ウスは内因性の（すなわちマウスの）免疫グロブリンを作製することができない
ため、例えばヒトポリペプチドの抗原感作時にヒト配列免疫グロブリンのみがト
ランスジェニックマウスにより作製される。
【０２３１】HCo12ヒト重鎖導入遺伝子 HCo12導入遺伝子はpHC2の80kbの挿入物（Taylorら、1994、Int. Immnol.、6：
579〜591）およびpVx6の25kbの挿入物の共注入により作製された。プラスミドpV
x6は下記のように構築された。約2.5kbの5'隣接および約5kbの3'隣接ゲノム配列
とともに生殖細胞系列ヒトVH1-18（DP-14）遺伝子を含む、8.5kbのHindIII/SalI
DNA断片は、プラスミドp343.7.16を作製するためにプラスミドベクターpSP72
（Promega、Madison、WI）にサブクローニングされた。約5kbの5'隣接および約1
kbの3'隣接ゲノム配列と共に生殖細胞系列ヒトVH5-51（DP-73）遺伝子を含む、7
kbのBamHI/HindIII DNA断片を、pBR322を基礎とするプラスミドクローニングベ
クターpGP1f（Taylorら、1992、Nucleic Acids Res. 20：6287〜6295）にサブク
ローニングして、プラスミドp251fを作製した。
【０２３２】 pGP1fに由来するクローニングベクター、pGP1k（配列番号：1）はEcoRV/BamHI
を用いて消化され、約4kbの5'隣接および約5kbの3'隣接ゲノム配列と共に生殖細
胞系列ヒトVH3-23（DP47）遺伝子を含む10kbのEcoRV/BamHI DNA断片に連結され
た。得られたプラスミドp112.2RR.7がBamHI/SalI消化され、p251fの7kbの精製Ba
mHI/SalI挿入物に連結された。得られたプラスミドpVx4はXhoI消化され、p343.7
.16の8.5kbのXhoI/SalI挿入物に連結された。
【０２３３】 他の2つのV遺伝子と同じ方向のVH1-18を持つプラスミドが得られた。pVx6と名
づけられたこのクローンはその後NotIを用いて消化され、精製された26kb挿入物
をHoganら（B. Horganら、「マウス胚操作、実験室マニュアル（Manipulating t
he Mouse Embryo, A Laboratory Manual）」第2版、1994、コールドスプリング
ハーバーラボラトリー出版、プレインビュー、NY）に記載されているように1.5
日の（C57BL/6JxDBA/2J）F2胚の前核に、pHC2の精製された80kbのNotI挿入物と
共に1：1のモル比で共注入した。
【０２３４】 Vx6およびHC2の両者に由来する配列を含む3つの独立したトランスジェニック
マウス系統が、注入された胚から発生したマウスより確立された。これらのトラ
ンスジェニックマウス系統は（HCo12）14881、（HCo12）15083、および（HCo12
）15087と名づけられた。3系統の各々はその後、実施例23に記載されているCMD
変異、JKD変異（Chenら（1993）EMBO J. 12：811〜820）および（KCo5）9272導
入遺伝子（Fishwildら、1996、Nature Biotechnology 14：845〜851）を含むマ
ウスと交配された。得られたマウスは、内因性マウス重鎖およびκ軽鎖遺伝子座
が同種接合体で破壊されたバックグラウンドにおいて、ヒト重鎖およびκ軽鎖導
入遺伝子を発現する（およびヒト配列重鎖およびκ軽鎖抗体を産生する）。
【０２３５】 2つの異なる系統のマウスを使用して、ヒトIL-8反応性のハイブリドーマおよ
びモノクローナル抗体を作製した。（（CMD）＋＋；（JKD）＋＋；（HCo7）1195
2＋/＋＋；（KCo5）9272＋/＋＋）系統、および（（CMD）＋＋；（JKD）＋＋；
（HCo12）15087＋/＋＋；（KCo5）9272＋/＋＋）系統。これらの系統は各々内因
性重鎖（CMD）およびκ軽鎖（JKD）遺伝子座が同種接合体で破壊されている。両
系統はまた、＃11952の挿入が半接合体または同種接合体である個々の動物にお
いて、ヒトκ軽鎖導入遺伝子（HCo7）を含む。その2つの系統は、使用されてい
るヒト重鎖導入遺伝子が異なる。マウスはHCo7またはHCo12導入遺伝子のいずれ
かにおいて半接合体または同種接合体である。CMD変異は実施例23に前記されて
いる。（HCo12）15087マウスの作製は前記されている。JKD変異（Chenら、1993
、EMBO J.12：811〜820）および（KCo5）9272（Fishwildら、1996、Nature Bio
technology 14：845〜851）および（HCo7）11952マウスは、米国特許第5,770,42
9号（LonbergおよびKay、6/23/98）に記載されている。
【０２３６】 実施例26：ビオチン化抗体の調製 精製抗体を最低でも100倍容量のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4に対し
て少なくとも4時間透析した。抗体はPBSで終濃度2mg/mlに希釈された。40mMのビ
オチン-XX-NHSエステル（Molecular Probes、Eugene、OR）を含むストック溶液
はジメチルスルホキシドで調製された。ビオチン-XX-NHS溶液を抗体に終濃度0.4
mMで添加し、室温で90分間反応させた。アミノエタンスルホン酸は、終濃度20mM
になるように添加され、残存反応基を消滅させるために5分間インキュベーショ
ンされた。ビオチン化抗体は、ビオチンを含む低分子を抗体から取り除くために
十分に透析された。
【０２３７】 アルカリフォスファターゼ抗体結合体の調製 アルカリフォスファターゼ（AP、カルザイム研究所（Calzyme Laboratories
）、San Luis Obispo、CA）は少なくとも100倍量のカラム緩衝液（50mMリン酸カ
リウム、10mMホウ酸、150mM NaCl、1mM MgSO4、pH7.0）を用いて少なくとも4時
間の間2〜8℃にて透析に供された。APの使用に先立ち、緩衝液を少なくとも2回
交換した。APが透析から除かれ、室温にされ、吸光度0.77を1mg/mL溶液として使
用して、280nmの吸光度により濃度を決定した。APはカラム緩衝液で5mg/mLに希
釈された。APとスクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-
カルボキシレート（SMCC、Pierce Chemical Co.、Rockford、IL）との反応が、2
0：1比のSMCC：APを用いて実施された。SMCCをアセトニトリルに20mg/mLで溶解
し、ボルテックスまたは急速攪拌しながらAPに添加して84倍に希釈した。未反応
SMCCおよび低分子量反応物は、カラム緩衝液で平衡化されたカラム中でゲル濾過
クロマトグラフィー（G50ファイン、Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ）を用
いてAPから分離される前に、溶液は室温で90分間静置された。
【０２３８】 抗体を少なくとも100倍量のPBSで透析し、PBSで2mg/mLに希釈した。40mMのN-
スクシンイミジルS-アセチルチオプロピオネート（SATP、Pierce Chemical Co.
、Rockford、IL）を含む溶液をジメチルスルフォキシドで調製し、抗体溶液で終
濃度0.32mMに希釈し、室温で90分間インキュベートした。アミノエタンスルホン
酸を終濃度20mMになるまで添加し、反応を停止させるために5分間インキュベー
トした。修飾抗体は、少なくとも100倍量の50mMリン酸カリウム、10mMホウ酸、1
50mM NaCl、pH7.0を用いて、透析緩衝液が変更される前に少なくとも4時間の間
透析され、透析は少なくとも4時間続いた。抗体濃度は吸光度1.6が1mg/mL溶液に
相当するとして280nmの吸光度を用いて決定された。ヒドロキシアミンは、0.1M
リン酸カリウム、10mMエチレンジアミン四酢酸、pH7.2中で0.5Mの濃度になるよ
うに溶解された。この溶液を、ヒドロキシアミンの終濃度が50mMになるように抗
体溶液に希釈し、室温で2時間インキュベーションした。修飾抗体はSMCC-APと等
モル量混合され、βメルカプトエタノールを終濃度1mM添加する前に室温で1時間
インキュベーションし、5分間インキュベーションし、N-エチルマレイミドを終
濃度2mMで添加し、5分間インキュベーションした。抗体-酵素結合体は、未結合
抗体からSEPHACRYL（商標）S-200（Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ）を用
いたゲル濾過クロマトグラフィーによりカラム緩衝液中で分離された。結合体は
免疫アッセイ法に使用するブロッキング溶液に希釈された。
【０２３９】 実施例27：IL-8に対するヒトモノクローナル抗体のエピトープマッピング BIACORE（登録商標）3000装置（Biacore AB、Uppsala、Sweden）がエピトープ
結合を測定するために使用された。ヤギ抗ヒトκ鎖抗体（Fisher Scientific、P
ittsburgh、PA）が、ヤギ抗ヒトκ鎖抗体が10mM酢酸ナトリウム、pH4.0に希釈さ
れたことを除いては、ビアコアアプリケーションノート101（Biacore AB、Uppsa
la、Sweden）に記載されているようにCM5センサーチップ（Biacore AB、Uppsala
、Sweden）上に固定された。
【０２４０】 14種のヒトモノクローナル抗体（実施例15）が2部位アッセイ法（two-site as
say）（Johneら、Journal of Immunological Methods、160（1993）、191〜198
）を用いてIL-8エピトープをマッピングするために使用された。各抗体は100μg
/mLに希釈され、IL-8は10mM N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスル
ホン酸、150mM 塩化ナトリウム、3mM EDTA、0.005％ポリソルベート20、pH7.4
（HBS-EP、Biacore AB、Uppsala、Sweden）で1μMに希釈された。一次抗体（M1-
10）は、全4チャネルにわたり20μLを注入することによりCM5チップ上のヤギ抗
ヒトκ鎖抗体に結合された。IL-8（10μL）は、その後全4チャネルにおいて一次
抗体に結合された。一つの二次抗体（10μL）が各々一つのチャネルを通過させ
られた。二次抗体の共鳴ユニットは、注入終了後20秒後に測定された。各一次/
二次抗体の組み合わせのブランクの共鳴ユニット値はIL-8の代わりにHSA-EPを注
入することにより得られ、これらはIL-8と接触された相当する一次/二次抗体の
組み合わせについて測定された共鳴ユニットから減算された。ブロッキング抗体
の注入は行われなかった。M1-10自身に対するものを除いた、全抗体組み合わせ
に関する高レベルの共鳴値は、M1-10以外の全ての列記された抗体がM1-10が結合
するエピトープとは異なるエピトープに結合しており、これらの抗体の結合はM1
-10のIL-8への結合によりほとんど影響されないことを示している。示されてい
ないデータは、M1-10以外の列記された全ての抗体のIL-8に対する結合が、事前
に任意の一つをIL-8結合させることにより、IL-8への結合が大きく影響を受ける
ことを示している。
【０２４１】 実施例28：実験手順 連続的なサンドイッチ酵素結合抗体免疫吸着アッセイ法（ELISA）が、濃度に
対する応答の標準曲線を作製し、各抗体組のアッセイ感度を決定するために実施
された。全てのアッセイ法は、約50フェントモルビオチン/ウェルの平均結合能
を有する384ウェル黒色ポリスチレンストレプタアビジンコートマイクロプレー
ト（Pierce Chemical Co.、Rockford、IL）中で実施された。固定化抗体により
捕捉された抗原に結合させるために、アルカリホスファターゼ（AP）標識抗体が
使用され、結合はAttoPhos（アットフォス）基質（JBL Scientific、San Luis O
bispo、CA）を用いて検出された。解析された抗体組はポリクローナルマウス抗
体-ビオチン/ポリクローナルマウス抗体-AP、ポリクローナルヒト抗体-ビオチン
/ポリクローナルヒト抗体-AP、およびモノクローナルヒト抗体M1-10-ビオチン/
モノクローナルヒト抗体M1-25-APであった。ポリクローナルヒト抗体およびポリ
クローナルマウス抗体はともに、109M-1のより低い親和性のカットオフ値を用い
てIL-8への結合に関して選択された。両モノクローナル抗体は、ポリクローナル
ヒトライブラリーから選択された。ポリクローナルマウス抗体ライブラリーを、
1nMのビオチン化IL-8を用いた多数回の選択を行い、1998年4月3日に出願されたP
CT98/06704に記載のように得た。試薬のピペッティングはTECAN Genesis RSP200
/8ロボット試料処理機（TECAN U. S. Inc、Research Triangle Park、NC）を用
いて実施された。個々のマイクロプレートウェルはTECANコロンブス384ウェルス
トリップ洗浄機を用いて洗浄され、各マイクロプレートウェルの動力学的蛍光光
度はTECAN SpectraFluor Plusマイクロプレートリーダーにより430nmの励起波長
および570nmの発光波長を用いて決定された。全てのピペッティング法は、TECAN
Gemini3.0液体ハンドリングソフトウェアを用いてプログラムされた。全てのTE
CANロボットリソースをTECANマルチスケジューラーソフトウェアFACT4.5を用い
て制御した。
【０２４２】 解析される試料は、結合体希釈液（CD8；10mMトリス、150mM塩化ナトリウム、
1mM塩化マグネシウム、0.1mM塩化亜鉛、0.1％ポリビニルアルコール、1％ウシ血
清アルブミン、0.1％アジ化ナトリウム、ph8.15）中で1：4.5に希釈された。標
準曲線は結合体希釈液または添加された様々な濃度のインターロイキン8（IL-8
）を含むプール正常血漿のいずれかの試料を用いて作製された。2μg/mlのビオ
チン化ポリクローナルマウス抗体、ポリクローナルヒト抗体、またはモノクロー
ナルヒト抗体M1-10のCD8溶液40μlが、個々のマイクロプレートウェルにピペッ
ト分注された。マイクロプレートは25℃にて1時間インキュベートされ、個々の
ウェルは洗浄緩衝液（20mMホウ酸、150mM塩化ナトリウム、0.02％ポリオキシエ
チレン20-ソルビタンモノラウリレート、0.1％アジ化ナトリウム、pH8.2）を用
いてオーバーフロー様式で3回洗浄された。40μlの解析試料は、個々のマイクロ
プレートウェルにピペット分注され、プレートは25℃で1時間インキュベートさ
れた。個々のマイクロプレートウェルは洗浄緩衝液を用いて3回洗浄され、CD8中
の5μg/mlアルカリホスファターゼ標識抗体40μlが個々のマイクロプレートウェ
ルにピペット分注された。ポリクローナルマウス抗体-AP、ポリクローナルヒト
抗体-AP、およびモノクローナルヒト抗体M1-25-APが、それぞれポリクローナル
マウス抗体-ビオチン、ポリクローナルヒト抗体-ビオチン、およびモノクローナ
ルヒト抗体M1-10-ビオチンと組み合わせられた。マイクロプレートは25℃にて1
時間インキュベートされ、個々のウェルは洗浄緩衝液を用いて6回洗浄された。2
.4Mジエタノールアミン、0.057mMの塩化マグネシウム、0.005％のアジ化ナトリ
ウム、pH10.0中の1mMアットフォス基質40μlが各マイクロプレートウェルにピペ
ット分注され、動力学的蛍光光度が20分間計測された。ヒト抗マウス抗体（HAMA
）または異好性抗体を含むことが知られている試料は購入された（Scantibodies
、Inc、Santee、CA）。全てのHAMA陽性および標準曲線試料は4回の試験で解析さ
れた。
【０２４３】 データ解析に使用された全ての統計学的計算およびグラフはマイクロソフトエ
クセル97を用いて行われた。各ウェルの動力学的蛍光光度は、0.1xミリ-1秒当り
の相対蛍光ユニット（0.1xmRFU/秒）の単位を用いて応答の傾きを計算すること
により定量化された。標準曲線は濃度（X軸）に対してブランク補正傾き（0.1xm
RFU/秒、Y軸）をプロットすることにより各抗体組に対して作製された。曲線の
直線部分の相関計数が決定された。アッセイ感度は標準曲線から計算され、標準
偏差2倍分を加えた、アッセイブランク（陰性対照、分析物非存在下）の傾きと
等しい傾きに相当する分析物濃度として定義される。傾き（0.1xmRFU/秒）は、
添加された様々な濃度のIL-8を用いて血漿試料から作製された標準曲線を用いて
、全てのHAMA陽性試料に対して濃度（pM）に変換された。
【０２４４】 連続的なサンドイッチELISAを用いたヒト血漿試料中のIL-8濃度を検出するた
めのポリクローナルマウス抗体、ポリクローナルヒト抗体の感度はそれぞれ65.2
pM、30.7pMおよび1.3pMと計算された。連続的なサンドイッチELISAを用いたヒト
血漿試料中のIL-8濃度を検出するためのポリクローナルマウス抗体、ポリクロー
ナルヒト抗体の標準曲線のブランク補正後の直線部分の相関計数はそれぞれ0.91
2、0.993および0.998と計算された。
【０２４５】 表に提供されているデータは、ヒト抗体を使用した結果としてL-8濃度の値の
劇的な低下を示している。ヒト抗体ベースのアッセイ法はマウス抗体ベースのア
ッセイ法よりも十分感度が高いので、これらの結果はポリクローナルマウス抗体
ベースのアッセイ法を用いて決定された、アッセイ法の検出限界以上である見か
け上のこれら試料中のIL-8濃度は、試料中のHAMAまたは異好性抗体のために誤っ
て上昇していることを示している。
【０２４６】
【表５】
【０２４７】 実施例29：酸化トロポニンIの調製 心臓のトロポニンI（Bio-tech International社、シアトル、ワシントン州）
を、100 mM リン酸カリウム、50 mM ホウ酸カリウム、1 M NaCl、pH 7.0に対し
て十分透析を行った。透析後、1 M H2O2をタンパク質に最終濃度が20 mMになる
ように添加し、この混合物を室温で30分インキュベートした。トロポニンIの酸
化溶液を透析チューブに移し、100 mM リン酸カリウム、50 mM ホウ酸カリウム
、1 M NaCl、1.4 μg/ml カタラーゼ、pH 7.0に対して3時間室温で透析を行った
。3時間後、このタンパク質を、100 mM リン酸カリウム、50 mM ホウ酸カリウム
、1 M NaCl、pH 7.0に対して2回透析を行い、次に100 mMリン酸カリウム、50 mM ホウ酸カリウム、0.5 M NaCl、pH 7.0に対して少なくとも4時間かけて、それぞ
れ1回2〜8℃で透析を行った。
【０２４８】 実施例30：ビオチン化C反応性タンパク質、ビオチン化トロポニン複合体（TIC）
、およびビオチン化酸化トロポニンの調製 トロポニン複合体および酸化トロポニンを対象に、2 mM CaCl2を添加した最小
100容量の20 mM ホウ酸、150 mM NaCl、pH 8 （BBS）に対して2〜8℃で少なくと
も4時間透析を行った。この緩衝液は、ビオチン化する前に少なくとも1回交換し
た。トロポニン複合体および酸化トロポニンを、ビオチン-XX-NHSエステル（Mol
ecular Probes、ユージーン、オレゴン州、ジメチルホルムアミドを溶媒とする4
0 mMのストック溶液）と、最終濃度が、TICの場合は0.1 mMとなるように、また
酸化トロポニンの場合は0.2 mMとなるようにして1時間室温で反応させた。1時間
後、このタンパク質を2 mM CaCl2を添加したBBS中で十分透析を行い、未反応の
小分子を除去した。
【０２４９】 C反応性タンパク質（Scripps Laboratories、San Diego、CA）は、CaCl2が存
在しないこと以外は、上記と同様にビオチン化された。
【０２５０】 実施例31：TIC免疫マウスに由来するポリクローナルファージの濃縮 5つの脾臓に由来するcDNAをPCR法で増幅し（実施例3、HCo12）、実施例7の通
りにBS47ウラシル鋳型を用いて第1回目の抗体ファージを調製した。変異導入用D
NAの10回のエレクトロポレーション（各脾臓で2回のエレクトロポレーションを
行う）を行い、10種の異なるファージ試料を得た。0.92mLのファージ、30μLの3
00mg/mL BSA、2μLの1M CaCl2、50μLの1M TRIS、pH 8.0および10μLの10-7 Mの
TIC-ビオチン（実施例30）を混合して一晩2〜8℃でインキュベートすることで第
1回目のパニング用のファージを調製した。抗体ファージ試料を対象に、実施例1
3の通りにアビジン磁性ラテックスを用いてパニングを行った。唯一の差は、パ
ニング用緩衝液に2 mM CaCl2も含まれる点である。このパニング用緩衝液は、本
実施例に記載されたすべてのパニング段階に使用した。
【０２５１】 得られた第2回目の抗体ファージ試料を、実施例13の通りに7F11磁性ラテック
スを用いたパニング法で多価提示について濃縮した。TIC-ビオチンによるパニン
グ法は、900 μLの7F11/デカペプチド濃縮ファージ、2 μLの1 M CaCl2、100 μ
lのパニング用緩衝液、および10 μlの10-7 M TIC-ビオチンを混合することで各
試料に対して調製した。2〜8℃で一晩インキュベートした後に、ファージ試料を
対象に上述の通りにアビジン磁性ラテックスでパニングを行った。
【０２５２】 得られた第3回目の抗体ファージ試料を、多価提示について再び濃縮し、溶出
したファージを、上述の通りにTIC-ビオチンで調製した。2〜8℃で一晩インキュ
ベートした後に、ファージ試料を対象に、上述の通りにアビジン磁性ラテックス
でパニングを行った。各試料の一定分量を、100 mmのLB寒天プレートに播種して
、κ陽性の割合を決定した（実施例12）。第3回目のパニングにおけるκ陽性の
割合は91〜97％であった。
【０２５３】 第4回目の抗体ファージ試料の力価を実施例13の通りに測定した。プールされ
た抗体ファージは、900 μLのパニング用緩衝液、100 μLの第4回目でプールさ
れた抗体ファージを用いて上述の通りに第4回目の機能パニング用に2通りに調製
した。一方の試料（フォアグラウンド）は10 μLの10-7 M TIC-ビオチンを受容
し、もう一方の試料（バックグラウンド）はTIC-ビオチンを受容せず、ファージ
と磁性ラテックスの非特異的な結合をモニタリングするためのブランクとして用
いた。2〜8℃で一晩インキュベートした後に、ファージ試料を対象に、上述の通
りにアビジン磁性ラテックスでパニングを行った。翌日、第5回目の抗体ファー
ジを溶出し、フォアグラウンドプレートおよびバックグラウンドプレート上のプ
ラーク数を数えた。フォアグラウンド：バックグラウンドの比は149：1であった
。
【０２５４】 第5回目の抗体ファージ試料をトロポニン複合体に特異的な抗体を作製するた
めに、過剰量の非ビオチン化トロポニンICを用いてパニングした。パニングは、
10μLの10-7M TICビオチンに加えて、10μLの350μg/mLの非標識ICを添加した点
をのぞいては、上記の4回目のファージに関して記載されているものと本質的に
は同様に設定された。2〜8℃で一晩インキュベーションした後、ファージ試料を
上記のようにアビジン磁性ラテックスを用いてパニングした。翌日5回目の抗体
ファージが溶出され、プラークの数がフォアグラウンドおよびバックグラウンド
のプレートで計数された。フォアグラウンド：バックグラウンド比は約1500：1
であった。
【０２５５】 抗体ファージ集団は、オリゴヌクレオチド1161および1182が抗体遺伝子挿入物
を増幅するために使用された点を除いては、実施例15に記載されているように発
現ベクターのサブクローニングされエレクトロポレーションされた。
【０２５６】
【０２５７】 実施例32：C反応性タンパク質で免疫化されたマウスからのポリクローナルファ
ージの濃縮 C反応性タンパク質に特異的なポリクローナルファージは、以下の変更を行っ
て、概して実施例31に記載されているように選択された。ファージライブラリー
は3匹のHCo7マウスおよび2匹のHCo12マウスから単離されたRNAから作製され、C
反応性タンパク質ビオチン（実施例30）は各回の選抜において10-9Mの終濃度で
使用され、パニング用緩衝液はCaCl2を含まなかった。ファージライブラリーは5
回の機能的パニングの後、抗体カセットを増幅するためのオリゴヌクレオチド11
61および1182を用いて、サブクローニングされた。
【０２５８】 実施例33：酸化トロポニンIで免疫化されたマウスからのポリクローナルファー
ジの濃縮 酸化トロポニンIに特異的なポリクローナルファージは、以下の変更を行って
、概して実施例31に記載されているように選択された。ファージライブラリーは
5匹のHCo7マウスから単離されたRNAから作製され、酸化トロポニンビオチン（実
施例30）は各回の選抜において10-9Mの終濃度で使用され、高塩濃度結合体希釈
液（1％ウシ血清アルブミン（30％BSA由来、Bayer、Kankakee、IL）、10mM MOPS
、650mM NaCl、1mM MgCl2、0.1mM ZnCl2、0.25％カゼイン、0.1％ポリビニルア
ルコール（80％加水分解物、Aldrich Chemical Co.、Milwaukee、WI）pH7.0）が
パニング用緩衝液の代わりに使用された。ファージライブラリーは5回の機能的
パニングの後、抗体カセットを増幅するためのオリゴヌクレオチド1161および11
82を用いて、サブクローニングされた。
【０２５９】 実施例34：2つの標的抗原を検出するための16個の高親和性ヒト抗体のアレイ 連続的なサンドイッチ酵素免疫アッセイ法は、標的抗原を含む試料を解析する
ためにモノクローナルヒト抗インターロイキン-8（IL-8）抗体およびヒト抗C反
応性タンパク質（CRP）抗体の2つの8x8アレイを用いて実施された。いくつかの
試料においては既知濃度のIL-8がプール化された正常ヘパリン処理血漿に添加さ
れ、別の試料は既知濃度のCRP抗原を、10mM MOPS、pH7、650mM塩化ナトリウム、
1mM塩化マグネシウム、0.1mM塩化亜鉛、2mM塩化カルシウム、0.1％ポリビニルア
ルコール、1％ウシ血清アルブミン、および0.1％アジ化ナトリウムを含むマトリ
ックス（HSCD）に添加することにより作製された。5種の異なる濃度のIL-8およ
びCRP抗原が、校正物質溶液を調製するために使用された。IL-8が、抗IL-8抗体
を用いたアッセイ用のヘパリン処理血漿に添加された。CRPは、抗CRP抗体を用い
たアッセイ用のHSCDに添加された。レベル0は、抗原を添加せず、内因性のIL-8
をブロッキングするために1μg/mlの終濃度の未結合型ヒト抗IL-8抗体を有する
プール化ヘパリン処理血漿、または抗原を添加しないHSCDであった。レベル1は2
0pg/mlのIL-8または0.1ng/mlのCRPを含んでいた。レベル2は100pg/mlのIL-8また
は1ng/mlのCRPを含んでいた。レベル3は500pg/mlのIL-8または5ng/mlのCRPを含
んでいた。レベル4は1ng/mlのIL-8または10ng/mlのCRPを含んでいた。レベル5は
5ng/mlのIL-8または20ng/mlのCRPを含んでいた。全てのアッセイ法は384ウェル
黒色Maxi-Sorbポリスチレンマイクロプレート（Nalge Nunc International、Roc
hester、NY）中で実施された。ヒト抗IL-8抗体MED002.1.10、MED002.1.25.1.4、
MED002.1.25.1.5、MED002.1.25.1.9、MED002.1.25、MED002.1.4、MED002.1.3、
およびMED002.1.5、ならびにヒト抗CRP抗体CAR007.1.1、CAR007.1.11、CAR007.1
.12、CAR007.1.14、CAR007.1.16、CAR007.1.20、CAR007.1.6、およびCAR007.1.1
8が、各抗体がその標的抗原に対する他の全てのモノクローナル抗体と、全ての
可能な固相/液相の組み合わせで対にされている8x8アレイ中で使用された。試薬
のピペッティングはTECAN Genesis RSP200/8ロボット試料処理機（TECAN U.S. I
nc、Research Triangle Park、NC）を用いて実施された。個々のマイクロプレー
トウェルはTECANコロンブス384ウェルストリップ洗浄機を用いて洗浄され、各マ
イクロプレートウェルの動力学的蛍光光度はTECAN SpectraFluor Plusマイクロ
プレートリーダーにより430nmの励起波長および570nmの発光波長を用いて決定さ
れた。全てのピペッティング法はTECAN Gemini3.0液体ハンドリングソフトウェ
アを用いてプログラムされた。全てのTECANロボットリソースはTECANマルチスケ
ジューラーソフトウェアFACT4.5を用いて制御された。
【０２６０】 抗体を50mM炭酸緩衝液pH9.6で10μg/mlの終濃度に希釈した。384ウェルのマイ
クロプレートの各列は30μlの特殊な抗体を受領し、マイクロプレートはシール
され4℃にて一晩インキュベーションされた。全16個のモノクローナル抗体にお
いて、各々の標的抗原に対する8個がマイクロタイタープレートの列にわたり配
置された。抗体溶液は除去され、個々のウェルは室温にて2時間HSCD60μlを用い
てブロッキングされた。マイクロプレートのウェルは洗浄緩衝液（20mMホウ酸、
150mM塩化ナトリウム、0.02％ポリオキシエチレン20-ソルビタンモノラウリン酸
、0.1％アジ化ナトリウム、pH8.2）を用いてオーバーフロー様式で4回洗浄され
た。10μlの抗原（IL-8用ヘパリン処理血漿およびCRPアッセイ用HSCD）がマイク
ロプレートウェルに添加され、プレートは室温で1時間インキュベートされた。
マイクロプレートウェルは、洗浄緩衝液を用いて3回洗浄され、アレイは10μlの
HSCD中1μg/mlのビオチン化型の各抗体をマイクロプレートウェルの各行に添加
することにより完了された。マイクロプレートは室温で1時間インキュベーショ
ンされ、洗浄緩衝液を用いて3回洗浄された。10μlのHSCD中1：300希釈ニュート
ラライトアビジンアルカリホスファターゼ（Southern Biothchnology Associati
on、Birmingham、AL）が各ウェルに添加され、マイクロプレートは室温で1時間
インキュベーションされ、洗浄緩衝液を用いて9回洗浄された。2.4Mジエタノー
ルアミン、0.057mMの塩化マグネシウム、0.005％のアジ化ナトリウム、pH10.0中
の1mMアットフォス基質（Scientific、San Luis Obispo、CA）10μlが各マイク
ロプレートウェルにピペット分注され、動力学的蛍光光度が16分間計測された。
【０２６１】 データ解析に使用された全ての統計学的計算およびグラフはマイクロソフトエ
クセル97を用いて行った。各ウェルの動力学的蛍光光度は、0.1xミリ-1秒当りの
相対蛍光ユニット（0.1xmRFU/秒）の単位を用いて応答の傾きを計算することに
より定量化された。
【０２６２】 表6に提供されるデータは、各抗原レベルについて、アレイ中の各抗体組から
得られた生の反応速度データを示す。
【０２６３】 CRPに結合しCAR007と称されるモノクローナル抗体は、固定化および液相モノ
クローナル抗体の全ての可能な組み合わせでアレイ化された。標的抗原CRPの濃
度に比例するサンドイッチアッセイ応答は、評価された全ての固定化（一次）お
よび液相（二次）抗体の組み合わせで明確となった。固定化モノクローナル抗体
が標的抗原に結合し、その後、同一のモノクローナル抗体をサンドイッチアッセ
イ法に用いて標的抗原を検出可能にするためには、モノクローナル抗体により結
合されるエピトープは2またはそれ以上のコピー数が標的抗原上に存在しなけれ
ばならない。CRPの場合は、タンパク質は5個の同一のサブユニットからなり、そ
れゆえ5コピーの同一エピトープを有すると考えられることが知られている。こ
の知識がない場合にも、この実験より、アレイ中のモノクローナル抗体により結
合される各々のエピトープについて標的抗原が多量体であると導き出すことがで
きると思われる。
【０２６４】 IL-8に結合するモノクローナル抗体は2つの群に分類することができる。こら
らの抗体のいずれの組み合わせも標的抗原の濃度に比例したサンドイッチアッセ
イ応答を生じないので、抗体MED002.1.10、MED002.1.25.1.4、MED002.1.25.1.5
およびMED002.1.25.1.9を含む第1の群は、IL-8上の単一エピトープに結合する。
こららの抗体のいずれの組み合わせも標的抗原の濃度に比例したサンドイッチア
ッセイ応答を生じないので、抗体MED002.1.25、MED002.1.4、MED002.1.3およびM
ED002.1.5含む第2の群は、IL-8上の単一エピトープに結合する。第1の群の抗体
が結合するエピトープと第2のグループの抗体が結合するエピトープは異なり、
第1の群から一つおよび第2のグループから一つのモノクローナル抗体の全ての可
能な対の組み合わせにおいて、標的抗原の濃度に比例したサンドイッチアッセイ
応答を示すことができるほど、これら2つのエピトープは互いに十分に分離され
ている。
【０２６５】 アッセイ応答は標的抗原の濃度に比例しているため、本明細書に示された固定
化抗体アレイは試料中の複数の標的抗原を定量化できる能力を証明している。ア
レイはさらに、異なる対のモノクローナル抗体の結合特性を検討することに基づ
いて、標的抗原に関する貴重な情報を提供することが可能である。例えば同一の
モノクローナル抗体がCRPを捕捉し検出するために使用できることの証拠は、CRP
が多エピトープの抗原であることを示している。
【０２６６】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 イクシス社（Ixsys Inc）から入手し、Huseの国際公開公報第92
/06204号に記載されている、ファージ提示ベクターを生産するための出発材料を
提供するベクターを示す。以下の略語が使用される。 A 後に削除される非必須DNA配列 B Lacプロモーターおよびリボソーム結合部位 C ペクチン酸リアーゼシグナル配列 D κ鎖可変領域 E κ鎖定常領域 F κ鎖および重鎖間を分断するDNA配列は重鎖のリボソーム結合部位を含む G アルカリホスファターゼシグナル配列 H 重鎖可変領域 I ヒンジ領域の5アミノ酸を含む重鎖定常領域 J デカペプチドDNA配列 K 5'末端にアンバー停止コドンを有する偽遺伝子VIII配列 L 後に削除される非必須DNA配列
【図２】 ベクターの構築に使用されるオリゴヌクレオチド。
【図３】 pBRncoH3ベクターの地図。
【図４】 pBRを基礎とするベクターへのaraCの挿入（図4A）および得られ
たベクターpBRnco（図4B）。
【図５】 T4エクソヌクレアーゼ消化によるFabをコードするDNA断片のサブ
クローニング。
【図６】 mu1エクソンのSmaI部位へのneoカセットの標的化挿入。A.mu遺伝
子座のゲノム構造の概略図。黒塗りの箱はmuのエクソンを示す。B.CmuD標的化ベ
クターの概略図。点線は構築物中に含まれるmuゲノム配列を示す。プラスミド配
列は示さない。C.neoカセットがmu1に挿入されている標的化mu遺伝子座の概略図
。右側の箱は標的化構築物とmu遺伝子座との間の相同組換えにおけるRFLP診断を
示す。FGLPは、Cに示される915のSaI断片であるプローブAを用いたサザンブロッ
トハイブリダイゼーションにより検出された。
【図７】 非生殖細胞系列がコードする重鎖および軽鎖V遺伝子中のヌクレ
オチド配列。重鎖V遺伝子は体細胞において非常に変異していることが見出され
た。軽鎖V遺伝子は非生殖細胞系列がコードするヌクレオチドをほとんど有して
いなかった。
【図８】 サンドイッチアッセイ法におけるポリクローナルマウス抗体を用
いて検出される、異なるIL-8濃度の検量線。
【図９】 サンドイッチアッセイ法におけるポリクローナルヒト抗体を用い
て検出される、異なるIL-8濃度の検量線。
【図１０】 サンドイッチアッセイ法における2つのモノクローナルヒト抗
体を用いて検出される、異なるIL-8濃度の検量線。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年６月２５日（２００２．６．２５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】 （表Ａ） Hco7マウスのcDNA増幅に使用された重鎖オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチド188（配列番号：1）、944（配列番号：2）および948（配
列番号：3）は5'プライマーであり、オリゴヌクレオチド952（配列番号：4）は3
'プライマーである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】 （表Ｂ） Hco7マウス、Hco12マウス、およびHco7/Co12マウスのcDNA増幅に使用
されたκ鎖オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチド973（配列番号：15）は3'プライマーであり、残りは5'プ
ライマーである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】 （表Ｃ） Hco12マウスのcDNA増幅に使用された重鎖オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチド944（配列番号：2）、945（配列番号：16）、946（配列番 号：17） 、947（配列番号：18）および948（配列番号：3）は5'プライマーであ
り、オリゴヌクレオチド952は3'プライマーである。944（配列番号：2）、948（ 配列番号：3） および952（配列番号：4）の配列は表Aに示されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】 PCR過程のdsDNA産物をその後、標的遺伝子のアンチセンス鎖のみを実質的に生
成するために3'プライマーのみを用いて非対称性PCRに供した。オリゴヌクレオ
チド953がκ鎖の非対称性PCRの3'プライマーとして（表D）およびオリゴヌクレ
オチド952が重鎖の非対称性PCRの3'プライマーとして（表A）として使用された
。各脾臓において、プライマー189（配列番号：5）、931（配列番号：6）、932
（配列番号：7）、933（配列番号：8）、934（配列番号：9）、936（配列番号： 11） 、955（配列番号：13）および956（配列番号：14）に関するκ鎖PCR産物に
対して2つの非対称性反応が行われ、プライマー935（配列番号：10）に対するκ
鎖PCR産物に対して4つの非対称性反応が行われ、プライマー937（配列番号：12
）に対するκ鎖PCR産物に対して8つの非対称性反応が行われた。各重鎖PCR産物
に対して使用された非対称性反応の数はマウス遺伝子型に依存した。Co7マウス
では各PCR産物について8つの非対称性反応が行われた。Co12マウスでは、プライ
マー944（配列番号：2）からのPCR産物について8つの非対称性反応が行われ、他
のプライマーからのPCR産物について4つの非対称性反応が行われた。Co7/Co12マ
ウスでは、プライマー944（配列番号：2）および948（配列番号：3）からのPCR
産物について6つの非対称性反応が行われ、他のプライマーからのPCR産物につい
て3つの非対称性反応が行われた。200pmolの3'プライマー、2μlのds-DNA産物、
0.5μL Taq DNAポリメラーゼ、10μLの2mM dNTPs、MgCl2を含む10μLの10×Taq
DNAポリメラーゼ緩衝液に水を加えて100μLにして、全体で100μLの反応を実施
した。重鎖反応は前記の温度プロファイルにて増幅され、κ鎖反応は30サイクル
の代わりに25サイクルが使用された同じ温度プロファイルにて増幅された。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】 （表Ｄ） κ鎖非対称性PCRに使用されたオリゴヌクレオチド配列
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】 デカペプチド誘導体 デカペプチド （Chiron Mimotopes Peptide Systems、San Diego、CA）は、穏やかに攪拌しな
がらアルゴン下で丸底フラスコ中で無水DMF（5.4mL）中で溶解された（0.3g）。
イミダゾール（0.02g）は攪拌されている溶液中に添加された。別々にアセチル
チオプロピオン酸（0.041g）が、攪拌しながらアルゴン下で丸底フラスコ中で0.
55mLの無水DMF中に溶解され、0.056gの1,1'-カルボニルジイミダゾール（Aldric
h Chemical Co.、Milwaukee、WI）が攪拌されている溶液中に添加された。フラ
スコはアルゴン下で密閉され、少なくとも30分室温で攪拌された。この溶液がデ
カペプチド溶液に添加され、反応混合物は、溶媒がインバキュオで除去される前
に少なくとも6時間室温で攪拌された。フラスコ中の残留物は各回10mLのジエチ
ルエーテルを用いて2回研磨され、エーテルはデカントで捨てられた。塩化メチ
レン（20mL）がフラスコ中の残留物に添加され、固形物はフラスコからこすりと
られ、ファインフリット（fine fritted）のブーフナー漏斗を用いて濾過された
。固形物はさらに20mLの塩化メチレンを洗浄され、ブーフナー漏斗は真空下で乾
燥された。誘導体を加水分解し遊離チオールを生成するために、それは70％DMF
中に溶解され、激しく攪拌しながら1M水酸化カリウムが最終濃度0.2Mまで添加さ
れた。誘導体溶液は、0.5Mリン酸カリウム、0.1Mホウ酸、pH7.0に濃塩酸が最終
濃度1Mになるまで添加された溶液を添加して溶液が中和される前に、室温で5分
間放置された。加水分解されたデカペプチド誘導体のチオール濃度は、0.25mM 5
,5'-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB、Aldrich Chemical Co.、Milwauke
e、WI）および0.2Mホウ酸カリウム、pH8.0を含む990μl溶液に10μlの溶液を希
釈することにより、決定された。mM単位のチオール濃度はA412（100/13.76）に
等しかった。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１０】
【表３】 PCRおよび配列決定プライマーの配列（配列番号：31、32、33、およ
び34をそれぞれ示す）
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１５】 実施例22：ランダムクローンのDNA配列分析 解析される各モノクローナルFabに相当するグリセロール凍結ストック（実施
例15）が、プラスミド単離および引き続くIL8挿入物のDNAシークエンシングのた
めに50mL培地に接種するために使用された。2×YT（10μg/mlテトラサイクリン
）37℃で一晩増殖され、組換えプラスミドはキアゲンプラスミドミディ（Qiagen
Plasmid Midi）キット（キアゲン（Qiagen）、バレンシア、カリフォルニア州
）を用いて製造者の指示にしたがい精製された。各モノクローナル抗体のκ鎖お
よび重鎖可変および定常領域に相当する配列が、MacConnell Research（マック
コネルリサーチ）（San Diego、CA）において決定された。抗体に用いられた命
名法は実施例21のものと同じである。配列決定はセクアサームシークエンシング
キット（Epicenter Technologies、Madison、WI）、pBRベクターのFabカセット
の5'および3'側に結合するオリゴヌクレオチドプライマーCおよびD（表3）の各
々、およびLI-COR4000L自動シークエンサー（LI-COR、Lincoln、NE）を用いて、
ダイデオキシ鎖終結法により行われた。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 バルキース グナーズ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 エス コンディード パセオ デル ソル 2893 (72)発明者 グレイ ジェフ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ソラ ナ ビーチ ベイ メドーズ ウェイ 417 (72)発明者 ロンバーグ ニルス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ウッ ドサイド ウエスト カリフォルニア ウ ェイ 780 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA44 BA56 CA04 DA06 EA04 GA14 HA15 4H045 AA11 BA10 CA40 DA76 EA50 FA74 GA21

Claims (54)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の段階を含む、分析物を検出する方法： 試料と支持体に固定されたヒト抗体とを接触させる段階であって、抗体が分析
    物に対して少なくとも108 M-1の親和性を有する段階： 分析物に対するヒト抗体の結合を検出して、試料中の分析物の存在および／ま
    たは量を示す段階。
  2. 【請求項２】 分析物に対するヒト抗体の親和性が少なくとも1010 M-1であ
    る、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 分析物に対するヒト抗体の親和性が少なくとも1011 M-1であ
    る、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 支持体が複数の異なるヒト抗体を有し、異なるヒト抗体が支
    持体上で既知の異なる位置を占有する、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 試料と複数の支持体に固定された複数のヒト抗体とを接触さ
    せる請求項１記載の方法であって、ヒト抗体のそれぞれが少なくとも108 M-1の
    親和性を有し、且つ検出段階が少なくとも２つの分析物に対する少なくとも２つ
    のヒト抗体の結合を検出して、試料中の分析物の存在および／または量を示す段
    階を含む方法。
  6. 【請求項６】 ヒト抗体が標識される、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 ヒト抗体が標識されず、且つ検出段階が質量分析または表面
    プラズモン共鳴によって行われる、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 試料が検出すべき非標識型分析物と標識型分析物とを含み、
    且つ検出段階が標識型分析物に対するヒト抗体の結合を検出し、結合の程度が試
    料中の非標識型分析物の量と反比例する、請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】 ヒト抗体が標識され、試料が検出すべき試験型分析物とヒト
    抗体に対する結合に対して試験型分析物と競合する対照型分析物とを含み、且つ
    検出段階が試験型分析物に対する標識抗体の結合を検出する、請求項１記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】 試料と、溶液中のヒト抗体、固定化ヒト抗体、および同一
    の分析物の異なるエピトープに結合する溶液中のヒト抗体とさらに接触させ、且
    つ検出段階が分析物に対する固定化ヒト抗体および／または溶液中のヒト抗体の
    結合を検出する段階を含む、請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 検出段階が、試料中の少なくとも２つの分析物に対する少
    なくとも２つの抗体の結合を検出する段階を含む、請求項４または５記載の方法
    。
  12. 【請求項１２】 試料が、第1の標識によって標識された異なる分析物を有
    する第1の試料と、第2の標識によって標識された異なる分析物を有する第2の試
    料との混合物であって、且つ検出段階が、複数の抗体に結合した第2の標識に対
    する第1の標識の比を検出して、第1および第2の試料中に存在する分析物の量の
    比を示す段階を含む、請求項４または５記載の方法。
  13. 【請求項１３】 それぞれのヒト抗体の500 ng未満が既知の領域に存在する
    、請求項４記載の方法。
  14. 【請求項１４】 それぞれのヒト抗体の100 ng未満が既知の領域に存在する
    、請求項４記載の方法。
  15. 【請求項１５】 複数のヒト抗体が、試料中に存在する可能性を有する異な
    る分析物に対して特異的親和性を有する、少なくとも100個の異なる抗体を含む
    、請求項４または５記載の方法。
  16. 【請求項１６】 複数のヒト抗体が、試料中に存在する可能性を有する異な
    る分析物に対して特異的親和性を有する、少なくとも1000個の異なる抗体を含む
    、請求項４または５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 異なる分析物に対する異なる抗体の特異的親和性が互いに
    10倍以内である、請求項15記載の方法。
  18. 【請求項１８】 試料がヒト被験者に由来する試料である、請求項１記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】 試料がHAMAおよび／または異好性抗体を含む、請求項18記
    載の方法。
  20. 【請求項２０】 異なる対応する分析物に対してそれぞれ少なくとも108 M- 1 の親和性を有し、異なるヒト抗体が1つまたは複数の支持体上で既知の異なる位
    置を占有する、複数のヒト抗体。
  21. 【請求項２１】 異なる抗体が同じ支持体の既知の異なる位置を占有する、
    請求項20記載の複数のヒト抗体。
  22. 【請求項２２】 既知の位置の面積が0.01 cm2未満である、請求項21記載の
    複数のヒト抗体。
  23. 【請求項２３】 既知の位置の面積が0.001 cm2未満である、請求項21記載
    の複数のヒト抗体。
  24. 【請求項２４】 既知の位置の面積が0.0001 cm2未満である、請求項21記載
    の複数のヒト抗体。
  25. 【請求項２５】 既知の位置の面積が0.00001 cm2未満である、請求項21記
    載の複数のヒト抗体。
  26. 【請求項２６】 既知の位置の面積が0.0000001 cm2未満である、請求項21
    記載の複数のヒト抗体。
  27. 【請求項２７】 以下の段階を含む、ヒト以外の種に由来する抗体に特異的
    に結合するヒト抗体を含むヒト試料中において分析物を検出する方法： 試料とヒト抗体とを接触させる段階であって、ヒト抗体が、ヒト以外の種に由
    来する抗体に特異的に結合するヒト抗体に対して特異的に結合せずに、分析物に
    特異的に結合する段階、および ヒト抗体と分析物との結合を検出して、分析物の存在を示す段階。
  28. 【請求項２８】 ヒト試料がヒト抗マウス抗体を含む、請求項27記載の方法
    。
  29. 【請求項２９】 ヒト抗マウス抗体が抗マウスイディオタイプ抗体である、
    請求項28記載の方法。
  30. 【請求項３０】 ヒト試料が異好性抗体を含む、請求項27記載の方法。
  31. 【請求項３１】 試料と支持体に固定された第1のヒト抗体および溶液中の
    第2のヒト抗体とを接触させ、第1および第2のヒト抗体が分析物上の異なるエピ
    トープに結合し、且つ検出段階が分析物に対する第1および／または第2のヒト抗
    体の結合を検出する段階を含む、請求項27記載の方法。
  32. 【請求項３２】 検出段階が第2のヒト抗体と分析物との結合を検出する、
    請求項31記載の方法。
  33. 【請求項３３】 第2のヒト抗体が標識される、請求項32記載の方法。
  34. 【請求項３４】 試料と支持体に固定されたヒト抗体の第1の集団および溶
    液中のヒト抗体の第2の集団とを接触させる、請求項32記載の方法であって、第1
    および第2の集団に由来する構成因子が分析物上の異なるエピトープに結合する
    方法。
  35. 【請求項３５】 ヒト抗体の第2の集団が標識される、請求項34記載の方法
    。
  36. 【請求項３６】 ヒト抗体が分析物に対して少なくとも108 M-1の親和性を
    有する、請求項27記載の方法。
  37. 【請求項３７】 ヒト抗体が分析物に対して少なくとも109 M-1の親和性を
    有する、請求項27記載の方法。
  38. 【請求項３８】 ヒト抗体が分析物に対して少なくとも1010 M-1の親和性を
    有する、請求項27記載の方法。
  39. 【請求項３９】 ヒト抗体が分析物に対して少なくとも1011 M-1の親和性を
    有する、請求項27記載の方法。
  40. 【請求項４０】 第1および第2のヒト抗体がそれぞれ、分析物上のそれぞれ
    のエピトープに対して少なくとも109 M-1の親和性を有する、請求項27記載の方
    法。
  41. 【請求項４１】 分析物に対するヒト抗体の結合が１時間以内に平衡に達す
    る、請求項27記載の方法。
  42. 【請求項４２】 抗体が、大腸菌における組換え構築物の発現による発現に
    よって産生される、請求項27記載の方法。
  43. 【請求項４３】 少なくとも90％の抗体分子が免疫反応性である、請求項42
    記載の方法。
  44. 【請求項４４】 以下の段階を含む、試料中の分析物を検出する方法： 試料と固相に固定された第1のヒト抗体および溶液中の第2のヒト抗体とを接触
    させる段階であって、分析物が試料中に存在する場合に、第1および第2の抗体が
    分析物の異なるエピトープに結合する段階、 第1および／または第2の抗体に対する分析物の結合を検出し、結合が試料中の
    分析物の存在を示す段階。
  45. 【請求項４５】 第2の抗体が標識され、且つ検出段階が分析物に対する第2
    の抗体の結合を検出する、請求項44記載の方法。
  46. 【請求項４６】 試料と支持体に固定されたヒト抗体の第1の集団および溶
    液中のヒト抗体の第2の集団とを接触させて、第1および第2の集団に由来する構
    成因子が分析物上の異なるエピトープに結合する、請求項44記載の方法。
  47. 【請求項４７】 ヒト抗体の第2の集団が標識される、請求項46記載の方法
    。
  48. 【請求項４８】 第1および第2のヒト抗体がそれぞれ、分析物上のそれぞれ
    のエピトープに対して少なくとも109 M-1の親和性を有する、請求項44記載の方
    法。
  49. 【請求項４９】 第1および第2のヒト抗体がそれぞれ、分析物に対して少な
    くとも1010 M-1の親和性を有する、請求項44記載の方法。
  50. 【請求項５０】 ヒト抗体が分析物に対して少なくとも1011 M-1の親和性を
    有する、請求項44記載の方法。
  51. 【請求項５１】 分析物に対する第1および第2のヒト抗体の結合が１時間以
    内に平衡に達する、請求項44記載の方法。
  52. 【請求項５２】 第1および第2のヒト抗体が大腸菌における組換え構築物の
    発現による発現によって産生される、請求項44記載の方法。
  53. 【請求項５３】 少なくとも90％の抗体分子が免疫反応性である、請求項52
    記載の方法。
  54. 【請求項５４】 第1および第2のヒト抗体が、ヒト免疫グロブリン遺伝子を
    発現するトランスジェニックマウスに由来する第1および第2のヒト抗体をコード
    する核酸をファージ提示ベクターにサブクローニングする段階、ならびに所望の
    結合特異性に対して第1および第2のヒト抗体を示すファージをスクリーニングす
    る段階によって産生される、請求項44記載の方法。
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