JP2007516235A5

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Publication number: JP2007516235A5
Application number: JP2006534762A
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Filing date: 2004-10-14
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2024-10-14

Description

１．本物質のＫｖ１．５−カリウムチャネル遮断作用のインビトロ試験
本物質のＫｖ１．５−カリウムチャネル遮断作用を、自体公知の評価モデルにおいてか又はそれに類似する評価モデルにおいて証明する（Ｗ．フーら著、薬理学毒性学方法紀要３４号（１９９５年）１〜７頁（W. Hu et al., J.Pharmacol. Toxicol. Method 34 (1995) 1-7）参照のこと）。この評価モデルにおいては、単細胞に由来し、かつＫｖ１．５−カリウムチャネルを安定して発現させるチャイニーズハムスター卵巣細胞（＝「チャイニーズハムスター卵巣細胞」、「ＣＨＯ」）の細胞株を使用する。ＲｂＣｌを含有する培養培地中でか又は「負荷緩衝液」（値は全てｍＭ：ＲｂＣｌ５、ＮａＣｌ１４０、ＣａＣｌ₂２、ＭｇＳＯ₄１、ヘペス緩衝液１０、グルコース５）中での一晩のインキュベーションによって、前記の卵巣細胞に、Ｎａ⁺／Ｋ⁺ＡＴＰアーゼの影響下でＲｂ⁺を負荷させる。次いで、この卵巣細胞の一部を比較基準として阻害剤の不存在下でインキュベートする一方で、他の卵巣細胞を、阻害に有効なそれぞれの式Ｉの評価物質の存在下でインキュベートする。次いで、この卵巣細胞を、細胞外カリウムイオン濃度を高めることによって脱分極させ、これによりこの卵巣細胞のＫｖ１．５−カリウムチャネルが開口する。阻害剤の不存在下では、Ｒｂ⁺イオンはＫｖ１．５−カリウムチャネルを介して、その周囲の液体中に遊離する。それに対して、阻害に有効な式Ｉの評価物質の存在下では、Ｒｂ⁺イオンは卵巣細胞内部に閉じこめられて留まる。式Ｉの評価物質のＫｖ１．５−カリウムチャネル遮断作用の程度は、その周囲の液体中のＲｂ⁺イオン濃度を、原子吸収スペクトル分光法を用いて、比較標準に対して測定することによって決定する。

チャイニーズハムスター卵巣細胞（前記参照のこと）を、自体公知のＲｂＣｌを含有するＣＨＯ細胞用培養培地中で培養して、そして９６個の試料を収容する試験プレート（「９６ウエルプレート」）の試料位置に添加した。この卵巣細胞を一晩増殖させて、単層の卵巣細胞を得た。次いで、最初に培養培地をピペットで除去し、そしてそれぞれの試料位置を、カリウムイオン低濃度のプレインキュベーション緩衝液（値は全てｍＭ：ＫＣｌ５、ＮａＣｌ１４０、ＣａＣｌ₂２、ＭｇＳＯ₄１、ヘペス緩衝液１０、グルコース５）で、１００μｌずつ３回洗浄した。次いで、それぞれの試料位置に、それぞれの評価物質の溶液（ＤＭＳＯ中の原液、プレインキュベーション緩衝液で希釈、試験成分中の最終濃度１０μＭ）又は溶剤（ネガティブコントロールとして）を５０μｌずつ添加し、そしてそれぞれ１０分にわたって室温でインキュベートした。次いで、それぞれの試料位置に、カリウムイオン高濃度の刺激緩衝液（ＫＣｌ１４５ｍＭ、ＮａＣｌ０ｍＭ、更に例えばプレインキュベーション緩衝液）を５０μｌずつ添加して、次いでこの試料を更に１０分にわたって室温でインキュベートした。次いで、各試料位置から卵巣細胞周囲の液体を８０μｌずつそれぞれ取り出して、分析用試料プレートの試料位置に別々に移し、そしてその液体中で原子吸収スペクトル分光法によってＲｂ⁺イオン濃度を測定した。この評価物質をそれぞれ２回評価した。Ｋｖ１．５によるＲｂ⁺流出の成分を示すシグナル区分を、ポジティブコントロールとして自体公知のカリウムチャネル遮断薬４−ＡＰを高濃度（Ｋｖ１．５−チャネルについて１００×ＩＣ₅₀）で使用することによって定めた。これにより、どのくらいの割合のＲｂ⁺流出が４−ＡＰの影響に依存し、従ってＫｖ１．５−チャネルに帰属しうるのかを調査できた。濃度１０μＭで使用するとＲｂ⁺流出を少なくとも５０％だけ減少させる物質の場合には、半値で有効な濃度を決定できるようにするために、低濃度の評価物質での付加的な試験を実施した。特性パラメータとして、式Ｉの評価物質の半値の阻害濃度（ＩＣ₅₀）をそれぞれ示した。

２．本物質のＫｖ１．３−カリウムチャネル遮断作用のインビトロ試験
本物質のＫｖ１．３−カリウムチャネル遮断作用を、自体公知の評価モデル（例えば、Ｇｅｎｉｏｎ社、ハンブルク）においてか又はそれに類似する評価モデルにおいて証明する（Ｊ．プラセク、Ｋ．シグラー著、光化学・光生物学紀要３３号（１９９６年）１０１〜１２４頁（J.Plasek und K. Sigler, J. Photochem. Photobiol. 33 (1996) 101-124））を参照のこと）。このモデルにおいては、Ｋｖ１．３−カリウムチャネルが安定的にトランスフェクションされている自体公知のチャイニーズハムスター卵巣細胞（＝ＣＨＯ）を使用する。トランスフェクションされた細胞内での細胞質Ｋｖ１．３−カリウムチャネル活性の遮断は、約−４０ｍＶから約−３０ｍＶへの膜電位の正方向へのシフトに付随して現れた一方で、同時に試験された野生型ＣＨＯ細胞においては、大幅な膜電位シフトは誘発されなかった。従って、膜電位変化は、Ｋｖ１．３−カリウムチャネル活性の低下と関連している。例えば、式Ｉの物質を用いてのＫｖ１．３−カリウムチャネル遮断及びそれから得られた膜電位変化によって、膜電位感受性蛍光色素は卵巣細胞の細胞内区画に蓄積し、最終的に蛍光が増大する。従って、この卵巣細胞の膜電位変化は、膜電位感受性色素の蛍光増大を介して、間接的に測定する。

Ｋｖ１．３−プラスミドを用いる細胞のトランスフェクションを、自体公知のように市販のトランスフェクション試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社（ドイツ）のＤＭＲＩＥ−Ｃ）を用いて実施した。実施されたトランスフェクションを、免疫蛍光並びにカリウムイオン流の「パッチクランプ」試験によって検証した。この蛍光測定を、Ｔｅｃａｎ社（ドイツ）のＴｅｃａｎＳａｔｉｒｅ型蛍光リーダによって実施した。特性パラメータとして、卵巣細胞内でＫｖ１．３−カリウムチャネルを式Ｉの物質を１０μＭの濃度で用いて遮断することによって生ずる蛍光強度の増加をそれぞれ調査した。この蛍光強度の増加は、基準物質マルガトキシンによって生ずる蛍光強度の増加に対するパーセント（％）でそれぞれ示した。マルガトキシンは、選択的Ｋｖ１．３−カリウムチャネル遮断薬として公知である（例えばＭ．ガルシア−カルボら著、生物化学紀要２６８号（１９９３年）１８８６６〜１８８７４頁（M. Garcia-Calvo et al., J. Biol. Chem. 268(1993) 18866-18874）を参照のこと）。

Claims

一般式Ｉ

［式中、Ｒ¹は、Ｃ_1-4−アルキルであり、
Ｒ²は、Ｃ_1-4−アルキルであり
Ｒ³は、場合によりハロゲン、Ｃ_1-4−アルキル、Ｃ_1-4−アルコキシ又はトリフルオロメチルで１〜２箇所置換されたフェニル；ナフチル若しくはビフェニルであり、
Ｒ⁴は、水素；Ｃ_1-6−アルキル又はＣ_3-7−シクロアルキル−Ｃ_1-4−アルキルであり、
Ｒ⁵は、水素であり、かつ
Ｒ⁶は、Ｃ_1-6−アルキル；フェニル基が場合によりハロゲンで１箇所置換されたフェニル−Ｃ_1-4−アルキル；フリル−Ｃ_1-4−アルキル又はテトラヒドロナフチルであるか、若しくは、
Ｒ⁵又はＲ⁶は、それらが結合している窒素と一緒に、場合によりフェニルで置換されたピペラジン環を形成する］の化合物。
請求項１に記載の化合物であって、Ｒ¹及びＲ²が、それぞれメチルである化合物。
請求項１に記載の化合物であって、Ｒ³が、場合により１箇所置換されたフェニルである化合物。
請求項１に記載の化合物であって、Ｒ⁴が、水素、Ｃ_1-6−アルキル又はシクロプロピル−Ｃ_1-4−アルキルである化合物。
請求項１に記載の化合物であって、Ｒ⁶が、フェニル−Ｃ_1-4−アルキル又はテトラヒドロナフチルである化合物。
請求項１に記載の化合物であって、ピラン環内において、ヒドロキシ置換基を有する炭素（Ｃ−３）がＳ配置をとり、かつ窒素含有置換基を有する炭素（Ｃ−４）がＲ配置をとる化合物。
２−（４−｛［（４−エチルフェニル）スルホニル］アミノ｝−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル）−Ｎ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアセトアミド；
２−（（３Ｓ，４Ｒ）−４−｛［（４−エチルフェニル）スルホニル］アミノ｝−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル）−Ｎ−［（１Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イル］アセトアミド；
Ｎ−ベンジル−２−｛４−［［（４−エチルフェニル）スルホニル］（ネオペンチル）アミノ］−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル｝アセトアミド；
２−｛４−［［（４−エチルフェニル）スルホニル］（ネオペンチル）アミノ］−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル｝−Ｎ−（２−フェニルエチル）アセトアミド及び
２−（４−｛［（４−メチルフェニル）スルホニル］アミノ｝−３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−６−イル）−Ｎ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−１−イルアセトアミドからなる群から選択された、請求項１から６までの何れか１項に記載の式Ｉの化合物。
薬理学的に有効な量の請求項１に記載の式Ｉの化合物並びに慣用の製剤学的助剤及び／又は担体材料を含有する、心臓循環疾患治療用及び／又は増殖性炎、慢性炎及び自己免疫疾患治療用の医薬品。
式Ｉ

［式中、Ｒ¹は、Ｃ_1-4−アルキルであり、
Ｒ²は、Ｃ_1-4−アルキルであり、
Ｒ³は、場合によりハロゲン、Ｃ_1-4−アルキル、Ｃ_1-4−アルコキシ又はトリフルオロメチルで１〜２箇所置換されたフェニル；ナフチル若しくはビフェニルであり、
Ｒ⁴は、水素；Ｃ_1-6−アルキル又はＣ_3-7−シクロアルキル−Ｃ_1-4−アルキルであり、
Ｒ⁵は、水素であり、かつ
Ｒ⁶は、Ｃ^1-6−アルキル；フェニル基が場合によりハロゲンで１箇所置換されたフェニル−Ｃ_1-4−アルキル；フリル−Ｃ_1-4−アルキル又はテトラヒドロナフチルであるか、若しくは、
Ｒ⁵及びＲ⁶は、それらが結合している窒素と一緒に、場合によりフェニルで置換されたピペラジン環を形成する］の化合物の製造方法において、一般式ＩＩ

［式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶は、前記の意味を有する］の化合物と、一般式ＩＩＩ
Ｘ−ＳＯ₂−Ｒ³ ＩＩＩ
［式中、Ｒ³は、前記の意味を有し、かつＸは、分離可能な脱離基である］の化合物とを反応させることを特徴とする方法。
一般式ＩＩ

［式中、Ｒ¹は、Ｃ_1-4−アルキルであり、
Ｒ²は、Ｃ_1-4−アルキルであり、
Ｒ⁴は、水素；Ｃ_1-6−アルキル又はＣ_3-7−シクロアルキル−Ｃ_1-4−アルキルであり、
Ｒ⁵は、水素であり、かつ
Ｒ⁶は、Ｃ_1-6−アルキル；フェニル基が場合によりハロゲンで１箇所置換されたフェニル−Ｃ_1-4−アルキル；フリル−Ｃ_1-4−アルキル又はテトラヒドロナフチルであるか、若しくは、
Ｒ⁵及びＲ⁶は、それらが結合している窒素と一緒に、場合によりフェニルで置換されたピペラジン環を形成する］の化合物。