JP2007514434A5

JP2007514434A5 -

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Publication number: JP2007514434A5
Application number: JP2006544560A
Authority: JP
Filing date: 2004-12-20
Publication date: 2012-10-11

Description

本発明は幹細胞に関し、具体的には骨髄および血液から単離できる新型幹細胞に関する。

幹細胞の供給源として骨髄に努力が集中してきた。これまでの証拠から、骨髄は２種類の幹細胞を含むことが示唆された。すなわち血液の製造を担っている造血幹細胞(HSC)ならびに体組織の限定された領域に属す細胞を産生できる間葉幹細胞(MSC)である。MSCは、正確には定義することができず、また単離もできない。したがって多種類の細胞を産生するためにMSCには限界があることを示している。MSCは、培養中に刺激に反応して骨芽細胞（osteoblasts）、軟骨芽細胞（chondroblasts）および脂肪細胞（adipocytes）を形成するが、肝細胞といったMSCが産生できない多種類の細胞もある。MSCの長期にわたる培養の結果、組織再生に最も広い可能性を有するとこれまで考えられている多能性成体前駆細胞(multipotent adult progenitor cells;MAPC)と称される細胞亜集団が伸張することとなる。しかしながら、MAPCが出現する前に長期にわたる組織培養および多数回の細胞分裂が必要であるということは、第一に遺伝上の損傷を蓄積してしまうかも知れないこと、第二にそれらが骨髄の正常な細胞成分を表すということを確証することは不可能であることを意味する。実際にはそれらが組織培養の人工的な生成物であるかも知れない。これらの重要な考察は、MAPCの臨床的な使用を禁忌とすることになるであろう。MAPCは、内胚葉、外胚葉または中胚葉のマーカーを有する細胞を形成できるが、培養中に造血細胞を実質上、産生しない。

本発明者は成体の骨髄および血液、たとえば末梢血液から、直接に単離することができ、外胚葉細胞、中胚葉細胞および内胚葉細胞に分化することができる特異な能力を有する新型の幹細胞を同定したのである。これらの細胞は、もし全能性でなければ明らかに多分化能性である。よって本明細書に記載される幹細胞は、組織の移植において自家移植の形態（自身から自身へ）で使用される新規な細胞供給源を提供する。さらに後記するようにこれらの幹細胞は長期間の組織培養を必要としない。

本発明の幹細胞は、好ましくは成体の骨髄または成体由来の末梢血液といった、成体から採取されるサンプルより得ることができる。よって該細胞は、好ましくは成体の幹細胞である。かかる細胞は臍帯といった他のサンプルから得てもよい。よって本発明の細胞集団は、成体の細胞のみならず胎児の細胞を含む態様でもある。胎児からはたとえば胎児の肝臓または骨髄もまた使用される。
したがって本発明の一態様において、幹細胞の単離された細胞集団を提供する。該幹細胞は自己再生することができ、かつ外胚葉細胞、中胚葉細胞および内胚葉細胞、好ましくは造血細胞に分化することができ、ＣＤ34⁺である。そうした幹細胞は成体の幹細胞が好ましい。

前記細胞集団は、その集団が他の種類の細胞を実質的に含まないという点で、「単離」されている。CD33、CD38、HLA/DR、CD19およびCD3を発現する細胞の種類を実質的に含有しないことが好ましい。「実質的に含まない」とは、実施例で提示される実験データと矛盾しないと解されるべきである。また、前記細胞集団は、専らある特定の直系系譜にのみ属している細胞および/またはそれに関係するマーカーを担持する細胞を含まないことである。該細胞集団は、特定の直系細胞系譜に係わる細胞を20%未満、好ましくは10%未満、たとえば5%未満で有することが望ましい。本発明の幹細胞集団の単離において、消極的な選別(細胞の除去)と積極的な選別(細胞の単離)とを結合させることは役に立つ。いずれの場合も抗体の結合が利用される。「単離された細胞」には、サンプルから直接に単離された細胞のみならず、培養された細胞、またはそのようなサンプルに由来する細胞も含まれる。

幹細胞は、成体の骨髄で産生されると考えられているが、血液にも見出される。本発明の幹細胞は標準的な試料採取の技術に従ってこれらの供給源のいずれかから集めてもよい。血液サンプルは、循環系における幹細胞の数を増加させるためにG-CSFを用いて幹細胞を流動化させた後に入手することが好ましい。たとえば、5μg/kg体重/日を皮下に5日間投与してもよい。直接に骨髄サンプルを吸引で得ることも可能である。

骨髄細胞は、骨髄の源、たとえば腸骨稜、脛骨、大腿骨、脊椎または他の骨の窩から得てもよい。骨髄は、常法の技術に従って、骨髄から吸引することも便利である。他の幹細胞の供給源として、成体の末梢血液および臍帯血を含む血液が挙げられる。

該細胞は哺乳類起源であることが好ましく、すなわち哺乳類サンプルから単離してもよく、あるいはそのようなサンプルから単離された細胞に由来する。特に好ましい哺乳類は、ヒトおよびげっ歯類（マウス）である。好ましい哺乳類としてさらにウシ、ウマおよび伴侶動物（ペット動物）なども挙げられる。

このように放出されたCD34⁺細胞は、次に組織培養プラスチック容器内で適当な温度、たとえば35〜38℃、好ましくは37℃で、少なくとも2時間、好ましくは少なくとも3時間、たとえば3〜5時間、インキュベートすることができ、この際、非付着性細胞はHBSS(Hanks balanced塩溶液)で洗浄することにより除去される。付着性CD34⁺細胞は本発明の幹細胞であり、全CD34⁺集団の1％未満で含まれる。好ましくはそれらの細胞が実質的に均一な集団であり、他の幹細胞の亜集団によっては通常汚染されていない。典型的には収集された細胞の30％未満、好ましくは20％未満、より好ましくは5％未満、最も好ましくは3%未満が、本発明の幹細胞以外のものである。しかしながら、後記実施例が示すように、個々のマーカーの全部が必ずしも単離された集団におけるいずれの細胞にも見出されないかも知れず、「均一な集団」という用語は、このことを心に留めて解するべきである。本発明の幹細胞集団は、好ましくはCD34発現に関して均一であり、組織培養グレードのプラスチックに対して付着し、小さいリンパ球様の形態である。「付着性の」細胞は、３回の活発な洗浄に抵抗して、固体支持体(特に組織培養グレードのプラスチックまたはガラス)から離れない細胞として定義される。CD34⁺細胞のうち、付着性サブセットの有利な性質は、付着性細胞が培養用細胞を調製する場合に普通は廃棄されるために驚くべきことである。

本発明の幹細胞は、いずれの動物起源であってもよく、たとえば実験動物、家畜またはペット動物である。好ましくは霊長類であり、ヒトが最も好ましい。
さらなる態様で、本発明は、次の工程を含む培養物を提供する：
(i) 単離された成体の幹細胞集団で、この場合該幹細胞はCD34⁺であり、自己再生が可能であって、外胚葉、中胚葉および内胚葉の細胞に分化することができ、
(ii) 該幹細胞の成長を支え得る培地。

本発明幹細胞およびそれから由来する分化した細胞は、液体窒素中での凍結保存でも生き延び得る。
さらに別の態様において本発明は、成体の幹細胞集団を単離する方法を提供する。その幹細胞は、CD34⁺であって、自己再生可能であり、外胚葉、中胚葉および内胚葉の細胞に分化することができる。その方法において、血液または骨髄のサンプルを患者から採取し、その中から該細胞集団を抽出することを含む。本発明は、幹細胞集団を単離する方法を提供し、その幹細胞は、CD34⁺であって、自己再生可能であり、外胚葉、中胚葉および内胚葉の細胞に分化することができ、また組織培養グレードのプラスチックに付着することができることが好ましい。その方法において、血液または骨髄のサンプルを患者から採取し、その中から該細胞集団を抽出することを含む。好ましい抽出工程は上で論じられ、患者の血液をサンプリングする際には、幹細胞の可動化が典型的な最初のステップとなるが、これは患者にG-CSFを投与することによって実施されることが好ましい。
組織培養プラスチックへの付着は、骨髄間葉幹細胞、単球（monocytes）およびマクロファージを含む数種類の細胞の性質であるが、CD34陽性細胞の亜集団を確認するか単離するために使用されることはこれまでなかった。組織培養プラスチックへの付着は、原始幹細胞の選別にとり、複数抗体を標識する操作または他の手法に頼る必要もなく単純で、再現性があり、実用的な手段となることが見出された。本発明のCD34⁺細胞は、ガラスにも付着することができる。したがって本発明の方法において、組織培養グレードのプラスチックの代わりにガラスまたは他の適当な固体支持体を使用することもできる。

本発明の幹細胞は、研究関連、たとえば幹細胞再生に関係した成長因子の検出と評価において有用性がある。該幹細胞は、遺伝疾患の治療においても、自己の幹細胞における遺伝子の修飾または置換によって直接的な有用性があるであろう。本発明の幹細胞は、特に造血細胞、たとえばβ-地中海貧血（thalassemia）、鎌状細胞貧血症といった造血細胞に関係する疾患の治療に使用することができる。その場合、野生型の遺伝子が幹細胞に導入される。かくして、本発明の別の態様として、単離された成体の幹細胞集団を提供する。それらの幹細胞は、CD34⁺であって、自己再生可能であり、造血細胞および間葉細胞に分化することができる。これらの細胞は、治療に使用される場合、治療用遺伝子を取り込む。

ASC-34活性は成体の造血組織および臍帯血液に見出されるばかりでなく、成体の骨髄、満期出産の臍帯血、胎児肝臓(在胎週齢11.6〜13.8週間)および胎児骨髄(12.7〜15.4週間)においても検出される。これらの細胞は、胚性幹細胞と相違する。なぜなら胚は、受胎後の8週間において胎児になると見なされるからである。

ASC34および間葉幹細胞(MSC)間の相違のまとめ
間葉幹細胞は、成体の骨髄に由来している別個の細胞集団である。MSC(多能性成体前駆細胞-MAPCとも呼称される)およびASC-34細胞(本発明の細胞)は、下記に要約したように重要な差異を示している。MSC/MAPC細胞は、CD34を発現しないことも特筆される。

Claims

幹細胞集団の分化をひき起こす複数の成長因子と一緒に幹細胞集団を培養することを含み、該幹細胞集団は、CD34⁺であって、自己再生でき、外胚葉、中胚葉および内胚葉細胞に分化することができ、組織培養グレードプラスチックに付着することができることを特徴とする、標的とする内胚葉、外胚葉、間葉および／または血管内皮細胞集団を産生する方法。
前記標的とする細胞が膵臓，肝臓，神経，上皮，腺上皮，骨格筋，心筋，腎臓，肺，骨，皮膚および内分泌細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記標的とする細胞が肝細胞，神経細胞または乏突起膠細胞である、請求項２に記載の方法。
前記標的とする内胚葉、外胚葉、間葉または血管内皮細胞がCD133，PECAM，VWF，CXCR4，アンジオポイエチン-1，ネブリン，トロポニン1，VEGF，アンジオポイエチン-2，ICAM 2，アルファ-１-アンチトリプシン，サイトケラチン18，LDLR，アルブミン，HGF，HNF-3β，トランスフェリン，αフェトプロテイン，Pax-6，Pdx-1，インスリン，IGF-1，NeuroD-1 およびNGN3をコードする遺伝子を発現する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
前記標的とする内胚葉細胞がインスリン生産に関係する遺伝子を発現する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
前記幹細胞が、単離後3時間は組織培養グレードプラスチックに付着することができ、さらに少なくとも72時間は付着を持続できる能力を特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
前記幹細胞がCD33^-、CD38^-、HLA-DR^-、CD3^-およびCD19^-である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
前記幹細胞集団がThy-1⁺でもある細胞について富化されている、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
前記幹細胞集団がAC133⁺および/またはc-met⁺でもある細胞について富化されている、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
前記幹細胞集団がRex-1，Oct 4，Nanog，CD34，CD133，PECAM，VWF，Tal-1，CXCR4，アンジオポイエチン1，Tie 2，TNNT1，デスミン，ネブリン，コネクシン-43，GATA-4，VEGF，KDR，アンジオポイエチン2，ICAM-2，VEカドヘリン，アルファ-１-アンチトリプシン，サイトケラチン 18，ネスチン，ビメンチンおよびc-metをコードする遺伝子を発現する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
前記幹細胞が成人幹細胞であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
前記幹細胞集団が臍帯血サンプルという非胎児性サンプルから得られる胎児細胞を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
前記幹細胞が受託番号04092401号でECACCに寄託された細胞の特徴を有する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
前記幹細胞集団が哺乳類起源である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
前記幹細胞集団がヒト起源である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
前記幹細胞集団がげっ歯類、ウマまたはウシ起源であるか、あるいはペット動物から採取されたサンプルより単離され、または由来する、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
前記幹細胞集団が培養中に支持細胞層を必要としない、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
前記単離された幹細胞集団が以下の工程：
(i) 造血組織を密度勾配分離にかけること;
(ii) 低密度細胞をCD34用の親和性リガンドにさらす;
(iii) 該CD34リガンドに付着した細胞を取り戻す;
(iv) CD34⁺亜集団を、組織培養グレードプラスチックにさらす；
(v) そのプラスチックに付着したCD34⁺細胞を取り戻す。
によって得ることができることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
以下の工程：
(i) 造血組織を密度勾配分離にかけること;
(ii) 低密度細胞をCD34用の親和性リガンドにさらす;
(iii) 該CD34リガンドに付着した細胞を取り戻す;
(iv) CD34⁺亜集団を固体支持体にさらす；
(v) そのプラスチックに付着したCD34⁺細胞を取り戻す；
(vi) そのCD34 ⁺ 付着細胞を請求項１に記載された細胞の分化を引き起こす複数の成長因子と一緒に培養する
を含むことを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
前記固体支持体が組織培養グレードのプラスチックまたはガラスから選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
請求項１〜２０のいずれかに記載の方法によって生産された、内胚葉、外胚葉、間葉および／または血管内皮細胞集団。
膵臓，肝臓，神経，上皮，腺上皮，骨格筋，心筋，腎臓，肺，骨，皮膚および内分泌細胞からなる群より選択される、請求項２１に記載の細胞集団。
CD133，PECAM，VWF，CXCR4，アンジオポイエチン-1，ネブリン，トロポニン1，VEGF，アンジオポイエチン-2，ICAM 2，アルファ-１-アンチトリプシン，サイトケラチン18，LDLR，アルブミン，HGF，HNF-3β，トランスフェリン，αフェトプロテイン，Pax-6，Pdx-1，インスリン，IGF-1，NeuroD-1およびNGN3をコードする遺伝子を発現する、請求項２１または２２に記載の細胞集団。
凍結保存を生きぬくことが可能である、請求項２１〜２３のいずれかに記載の細胞集団。
前記細胞のゲノムが核酸の一領域を挿入することにより変更されたことを特徴とする、請求項２１〜２４のいずれかに記載の細胞集団。
前記幹細胞のゲノムが核酸の一領域を挿入することにより変更されたことを特徴とする、請求項１で規定された幹細胞集団。
前記ゲノムがDNAウィルス，RNAウィルスまたはレトロベクターを用いるDNAの挿入により変更されることを特徴とする請求項２５または２６に記載の細胞集団。
前記ゲノムの一部が、アンチセンス核酸分子、リボザイム配列または阻害的ＲＮＡ配列の存在によって不活性化されることを特徴とする、請求項２１〜２７のいずれかに記載の細胞集団または請求項１で規定された幹細胞集団。
治療に使用される、請求項２１〜２８のいずれかに記載の細胞集団または請求項１で規定された単離された幹細胞集団。
器官の再生または損傷された器官の修復に使用される、請求項２１〜２８のいずれかに記載の細胞集団または請求項１で規定された単離された幹細胞集団。
前記器官が免疫系，肝臓，肺，膵臓，骨，軟骨，筋肉，皮膚，脳または神経系および心臓または循環器系からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３０に記載の細胞集団。
前記細胞が追跡可能なマーカー、好ましくは酸化鉄または常磁性ビーズで標識されることを特徴とする、請求項２９〜３１のいずれかに記載の細胞集団。
患者への細胞移植用としての、請求項２１〜２８のいずれかに記載の細胞集団または請求項１で規定された単離された幹細胞集団の使用。
請求項２１〜２５のいずれかに記載の細胞を薬剤に曝すことにより器官特異的作用について薬剤をスクリーニングする方法。
前記薬剤が器官特異的な毒性を疑われる毒素であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
前記薬剤が器官特異的な毒性を疑われる薬剤もしくは治療剤、または器官特異的な利得作用を問題とされる薬剤もしくは治療剤であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
請求項２１〜２８のいずれかの細胞集団または請求項１で規定された幹細胞集団を培養すること、ならびに該細胞により発現される１以上のタンパク質を回収することを含む、タンパク質生産のインビトロ方法。
前記タンパク質がインスリンまたはアルブミンである、請求項３７に記載のタンパク質生産のインビトロ方法。