ES2626234T3 - Tratamiento de tejido cardiovascular - Google Patents

Abstract

Un medio cardiogénico que comprende un medio de cultivo condicionado, en donde el medio de cultivo condicionado se obtiene cultivando células endodérmicas ventrales en medio con el fin de generar el medio de cultivo condicionado, caracterizado porque las células endodérmicas ventrales son de un embrión no humano que ha sido tratado con TNF-α.

Description

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DESCRIPCION

Tratamiento de tejido cardiovascular Antecedentes

1. Campo tecnico

Este documento se relaciona con metodos y materiales involucrados en el tratamiento de tejido cardiovascular con, por ejemplo, celulas madre.

2. Informacion de antecedentes

Las lesiones del miocardio llevan a perdidas de cardiomiocitos, remodelacion ventricular y consecuente incapacidad del funcionamiento del miocardio. Desafortunadamente, la capacidad mitotica de los cardiomiocitos es demasiado limitada para soportar una regeneracion del miocardio adecuada. Ademas, las modalidades terapeuticas actuales atenuan la progresion de la enfermedad sin contribuir significativamente a la reparacion del miocardio.

Las celulas pluripotentes tales como las celulas madre de embriones pueden proliferar indefinidamente in vitro y pueden diferenciarse, in vitro, en celulas que recapitulan el fenotipo cardfaco expresando marcadores cardfacos caractensticos y demostrando acoplamiento de excitacion-contraccion funcional. Cuando se trasplantan a corazones lesionados, las celulas madre de embriones pueden generar cardiomiocitos que repueblan las regiones del miocardio disfuncionales y mejoran el rendimiento contractil. Las celulas madres pluripotentes, sin embargo, pueden formar celulas tumorales una vez retiradas del ambiente hematopoyetico original.

Resumen

Este documento describe metodos y materiales relacionados con el tratamiento de tejido cardiovascular (por ejemplo, tejido del corazon o tejido vascular). Por ejemplo, este documento describe celulas madre, composiciones que contienen celulas madre, metodos para obtener celulas madre, composiciones para generar celulas madre que expresan marcadores particulares y metodos para reparar tejido cardiovascular. Las celulas madre y las composiciones que contienen celulas madre descritas aqrn pueden ser utilizadas para reparar tejido cardiovascular. Tales celulas madre pueden permitir que los medicos traten, por ejemplo, lesiones del miocardio puesto que las celulas madre pueden tener la capacidad de diferenciarse en cardiomiocitos. En algunos casos, tales celulas madre y composiciones que contienen celulas madre pueden ser utilizadas para reparar tejido cardiovascular sin producir tumores dentro del tejido. Las composiciones descritas aqrn para generar celulas madre pueden permitir a los profesionales medicos producir grandes cantidades de celulas madre que pueden expresar marcadores particulares y pueden ser utilizadas para reparar tejido cardiovascular.

En general, este documento describe un metodo para tratar tejido del corazon o vascular. El metodo incluye administrar celulas madre al tejido del corazon o vascular bajo condiciones en donde las celulas madre no desarrollan celulas tumorales en el tejido del corazon o vascular. Las celulas madre pueden ser inyectadas en el corazon de un mairnfero (por ejemplo un humano). Las celulas madre pueden ser celulas madre de embriones o celulas madre que expresan uno o mas polipeptidos listados en la tercera columna de la Tabla 1. Las celulas madre pueden ser inyectadas en una cantidad menor de aproximadamente 1500 celulas madre por mg de tejido de corazon o vascular. El tejido de corazon o vascular puede ser tejido que fue puesto en contacto con TNF-a, TGF-p o y- interferon. El metodo puede incluir poner en contacto el tejido de corazon o vascular con TNF-a, TGF-p o y- interferon. Esta etapa de contacto puede ocurrir antes, durante o despues de que las celulas madre son administradas.

Las celulas madre de embrion pueden ser administradas al tejido del corazon o al tejido vascular de tal forma que no se desarrollen tumores. Por ejemplo, pueden necesitarse menos de 1000 celulas madre de embrion por 1 mg de tejido en un mamffero (por ejemplo, humano, primate, caballo, perro, gato, cerdo, vaca o roedor). En algunos casos, pueden administrarse aproximadamente 50 a 1500 celulas (por ejemplo, 100 a 1500, 200 a 1500, 500 a 1500, 200 a 1000, o 500 a 1000 celulas) por 1 mg de tejido de corazon a un mamffero sin riesgo de desarrollar tumores. Cuando se inyectan celulas madre de embrion en un raton, cuyo corazon pesa aproximadamente 300 mg, pueden administrarse 3 x 105 celulas. Al inyectar 3300 celulas por 1 mg de tejido de corazon puede dar como resultado un 15% de riesgo de tumor, mientras que al inyectar 10000 celulas por 1 mg de tejido de corazon puede dar como resultado un 72% de riesgo de tumor.

Este documento describe adicionalmente una celulas madre que expresa (a) al menos un polipeptido seleccionado del grupo consistente de Oct4; DEK; BRCA1; Ect2; y MYC; (b) al menos un polipeptido seleccionado del grupo consistente de Fosb; NRAP; MEF2A; Furin; TGFp1; receptor a de fibronectina; receptor 1 del dominio de discoidina; bag2; protema rica en cistema; CUGBP2; NDRG4; protema 1 inhibidora de CBP/p300; protema 1 inducible por interferon; tropomiosina 1, alfa; protema 1 activadora de Rho GTPasa; carboxipeptidasa D; profilina 2; transcripto inducido por el factor beta 1 de crecimiento transformante; tropomiosina 1, alfa; receptor de la hormona de crecimiento; vinculina; adenilato ciclasa 6; protema A1 de enlazamiento de calcio S100; tropomiosina 2, beta; protema 1 de enlazamiento del retinol, celular; Moesina; matriz de metaloproteinasa 2; glicoprotema rica en cistema

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acida secretada; manosidasa 1, alfa; lectina, de enlazamiento a galactosa, soluble 1; protema A6 de enlazamiento a calcio S100 (calciclina); epoxido hidrolasa 1, microsomico; gen similar a adenoma pleiomorfico 1; factor de crecimiento 2 similar a insulina; protema 4 similar a protema Tubby; protema prion; protema 10 de enlazamiento a FK506; ciclina D2; reticulocalbina 3, dominio de enlazamiento a calcio del lado EF; selenoprotema M; inhibidor 1A de quinasa dependiente de ciclina (P21); caldesmon 1; integrina beta 1 (beta receptor de fibronectina); transcobalamina 2; anexina A2; inhibidor 1A de quinasa dependiente de ciclina (P21); trombospondina 1; monocito para macrofago asociado a la diferenciacion; receptor AXL de tirosina quinasa; anexina A5; similar enlazador a musculos 2; anexina A1; procolageno, tipo IV, alfa 1; calpaina 2; protema 1 de membrana epitelial; proteasa serina, 11; tropomiosina 2, beta; lectina, enlazamiento a galactosa, soluble 9; y anexina A3; y (c) al menos un polipeptido seleccionado del grupo consistente de protema 2A de membrana integral; protema de enlazamiento al factor de crecimiento similar a insulina 4; antigeno 1 de celulas del timo, theta; selenoprotema P, plasma, 1; glicoprotema 38; sustrato 8 de la ruta del receptor del factor de crecimiento epidermico; protema 1A de choque cardiaco; protema 1 de enlazamiento del acido retinoico celular; y 8 espedfico para placenta; la celula madre puede tener 2, 3, 4 o mas de los polipeptidos listados en cada grupo. La celula madre puede expresar los polipeptidos listados en la tercera columna de la Tabla 1. Este documento caracteriza adicionalmente la progenie de estas celulas madre.

Ademas, se describen celulas madre, en donde las celulas madre exhiben traslocacion nuclear de los factores de transcripcion cardfaca tales como NKX2.5, Mes2C, y GATA4; y en donde las celulas madre no comprenden protemas sarcomericas tales como anexina A6, factor del crecimiento del tejido conectivo, Smad6, canal de Na+, tipo L canal de Ca2+, Ca2+ ATPasa, MLC2V, MLC2a, I-MHC, I-actina, I-actinina, troponina T2, o titina.

Este documento describe adicionalmente una composicion (esto es, un medio cardiogenico) que contiene TGF-p1; TGF-P2; BMP-1; BMP-2; BMP-5; BMP-6; FGF-4; FGF-5; FGF-12; FGF-13; FGF-15; FGF-20; factor inhibidor de leucemia; VEGF-C; factor 1 de crecimiento de insulina; e interleucina 6. El medio cardiogenico puede contener caspase-4; ligando 1 de quimioquina; ligando 2 de quimioquina; ligando 5 de quimioquina; ligando 7 de quimioquina; ligando 11 de quimioquina; ligando 20 de quimioquina; haptoglobina; factor estimulante de colonias 1; lectina; colesterol 25-hidroxilasa; sintaxina-8; sintaxina-11; ceruloplasmina; componente complementario 1; componente complementario 3; factor de crecimiento derivado de plaquetas; integrina alfa 6; lipasa 1 acida lisosomica; fl-2 microglobulina; ubiquitina; factor inhibidor de la migracion de macrofagos; acido retinoico; cofilina; ciclofilina A; FKBP12; NDPK; profilina 1; cistatina C; calciclina, o cualquier combinacion de los anteriores. El medio cardiogenico, bajo exposicion a celulas madres de embriones, puede producir que las celulas madre de embriones pierdan su tumorigenicidad. El medio cardiogenico por exposicion a celulas madre de embriones, puede hacer que las celulas madre de embriones se comprometan en la diferenciacion en cardiomiocitos.

Este documento describe adicionalmente un metodo para obtener celulas madre (por ejemplo, celulas madre cardiopoyeticas). El metodo incluye poner en contacto celulas madre de embriones con un medio cardiogenico. Las celulas madre pueden expresar uno o mas de los polipeptidos listados en la tercera columna de la Tabla 1. El metodo puede incluir aislar celulas madre cardiopoyeticas a partir de celulas madre de embriones o cardiomiocitos.

Este documento describe adicionalmente un metodo para determinar si las celulas son o no celulas madre. El metodo incluye determinar si las celulas expresan o no (a) al menos un polipeptido seleccionado del grupo consistente de Oct4; DEK; BRCA1; Ect2; y MYC; (b) al menos un polipeptido seccional del grupo consistente de Fosb; NRAP; MEF2A; Furin; TGFp1; receptor a de fibronectina; receptor 1 del dominio de discoidina; bag2; protema rica en cistema; CUGBP2; NDRG4; protema 1 inhibidora de CBP/p300; protema 1 inducible por interferon; tropomiosina 1, alfa; protema 1 activadora de Rho GTPasa; carboxipeptidasa D; profilina 2; transcripto inducido por el factor beta 1 de crecimiento transformante; tropomiosina 1, alfa; receptor de la hormona de crecimiento; vinculina; adenilato ciclasa 6; protema A1 de enlazamiento de calcio S100; tropomiosina 2, beta; protema 1 de enlazamiento del retinol, celular; Moesina; matriz de metaloproteinasa 2; glicoprotema rica en cistema acida secretada; manosidasa 1, alfa; lectina, de enlazamiento a galactosa, soluble 1; protema A6 de enlazamiento a calcio S100 (calciclina); epoxido hidrolasa 1, microsomico; gen similar a adenoma pleiomorfico 1; factor de crecimiento 2 similar a insulina; protema 4 similar a protema Tubby; protema prion; protema 10 de enlazamiento a FK506; ciclina D2; reticulocalbina 3, dominio de enlazamiento a calcio del lado EF; selenoprotema M; inhibidor 1A de quinasa dependiente de ciclina (P21); caldesmon 1; integrina beta 1 (beta receptor de fibronectina); transcobalamina 2; anexina A2; inhibidor 1A de quinasa dependiente de ciclina (P21); trombospondina 1; monocito para macrofago asociado a la diferenciacion; receptor AXL de tirosina quinasa; anexina A5; enlazador a musculos similar 2; anexina A1; procolageno, tipo IV, alfa 1; calpaina 2; protema 1 de membrana epitelial; proteasa, serina, 11; tropomiosina 2, beta; lectina, enlazamiento a galactosa, soluble 9; y anexina A3; y (c) al menos un polipeptido seleccionado del grupo consistente de protema 2A de membrana integral; protema de enlazamiento al factor de crecimiento similar a insulina 4; antfgeno 1 de celulas del timo, theta; selenoprotema P, plasma, 1; glicoprotema 38; sustrato 8 de la ruta del receptor del factor de crecimiento epidermico; protema 1A de choque cardiaco; protema 1 de enlazamiento del acido retinoico celular; y 8 espedfico para placenta.

Este documento describe ademas un metodo para hacer un medio cardiogenico. El metodo incluye (a) obtener celulas endodermicas ventrales o de tipo endodermico ventral; (b) cultivar las celulas en medio, generando de este modo medio de cultivo condicionado; y (c) recolectar el medio de cultivo condicionado, obteniendo por lo tanto un medio cardiogenico. El metodo puede incluir la adicion de uno o mas de los siguientes componentes: IGF-1, IL-6, FGF-4, TGF-p, BMP, LIF, y ha-trombina. El embrion del que se obtienen las celulas endodermicas ventrales puede

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ser estimulado con TNF-a. Las celulas similares a endodermicas ventrales pueden ser celulas de carcinoma embrionario.

En un primer aspecto, este documento presenta un medio cardiogenico que comprende un medio de cultivo condicionado, en donde el medio de cultivo condicionado se obtiene cultivando celulas endodermicas ventrales en medio con el fin de generar el medio de cultivo condicionado, caracterizado porque las celulas endodermicas ventrales son de un embrion no humano que ha sido tratado con TNF-a. El medio cardiogenico puede comprender ademas uno o mas componentes que se seleccionan del grupo que consiste de IGF-1, IL-6, fGF-4, TGF-p, BMP, LIF y ha-trombina. El medio cardiogenico puede comprender los siguientes componentes adicionales IGF-1 (50 ng/ml), IL-6 (100 ng/ml), FGF-4 (10 ng/ml), TGF-p, (25 ng/ml) BMP (5 ng/ml), LIF (100 U/ml), y ha-thrombin (40 nM).

Este documento describe adicionalmente una composicion que contiene celulas en donde al menos el 5% (por ejemplo, al menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, o 99 por ciento) de las celulas de la composicion son celulas madre que expresan (a) al menos un polipeptido seleccionado del grupo consistente de Oct4; DEK; BRCA1; Ect2; y MYC; (b) al menos un polipeptido seleccionado del grupo consistente de Fosb; NRAP; MEF2A; Furin; TGFp; receptor a de fibronectina; receptor 1 del dominio de discoidina; bag2; protema rica en cistema; CUGBP2; NDRG4; protema 1 inhibidora de CBP/p300; protema 1 inducible por interferon; tropomiosina 1, alfa; protema 1 activadora de Rho GTPasa; carboxipeptidasa D; profilina 2; transcripto inducido por el factor beta 1 de crecimiento transformante; tropomiosina 1, alfa; receptor de la hormona de crecimiento; vinculina; adenilato ciclasa 6; protema A1 de enlazamiento de calcio S100; tropomiosina 2, beta; protema 1 de enlazamiento del retinol, celular; Moesina; matriz de metaloproteinasa 2; glicoprotema rica en cistema acida secretada; manosidasa 1, alfa; lectina, de enlazamiento a galactosa, soluble 1; protema A6 de enlazamiento a calcio S100 (calciclina); epoxido hidrolasa 1, microsomico; gen similar a adenoma pleiomorfico 1; factor de crecimiento 2 similar a insulina; protema 4 similar a protema Tubby; protema prion; protema 10 de enlazamiento a FK506; ciclina D2; reticulocalbina 3, dominio de enlazamiento a calcio del lado EF; selenoprotema M; inhibidor 1A de quinasa dependiente de ciclina (P21); caldesmon 1; integrina beta 1 (beta receptor de fibronectina); transcobalamina 2; anexina A2; inhibidor 1A de quinasa dependiente de ciclina (P21); trombospondina 1; monocito para macrofago asociado a la diferenciacion; receptor AXL de tirosina quinasa; anexina A5; enlazador a musculos similar 2; anexina A1; procolageno, tipo IV, alfa 1; calpaina 2; protema 1 de membrana epitelial; proteasa, serina, 11; tropomiosina 2, beta; lectina, enlazamiento a galactosa, soluble 9; y anexina A3; y (c) al menos un polipeptido seleccionado del grupo consistente de protema 2A de membrana integral; protema de enlazamiento al factor de crecimiento similar a insulina 4; antfgeno 1 de celulas del timo, theta; selenoprotema P, plasma, 1; glicoprotema 38; sustrato 8 de la ruta del receptor del factor de crecimiento epidermico; protema 1A de choque cardiaco; protema 1 de enlazamiento del acido retinoico celular; y 8 espedfico para placenta.

Al menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados aqrn tienen el mismo significado que es entendido comunmente por una persona de experiencia normal en la tecnica para la cual es pertinente esta invencion. Aunque pueden utilizarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aqrn en la practica o prueba de la presente invencion, se describen a continuacion metodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente especificacion, incluyendo definiciones, prevalecera. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Otras caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y de las reivindicaciones.

Descripcion de los dibujos

La Figura 1A y la Figura 1B son fotograffas utilizando microscopfa de electrones de barrido con emision de campo (A) y trasmision (B) de celulas madre de embriones CGR8 no diferenciadas en cultivo. La Figura 1C es una fotograffa de cardiomiocitos con tincion con DAPI derivados in vitro a partir de la colonia de celulas madre de CGR8. La Figura 1D (superior) es una grafica que muestra que los cardiomiocitos derivados de celulas madre exhiben actividad potencial de accion bajo un modo de corriente-pinza, mientras que Figura 1D (inferior) es una grafica que muestra que la relacion corriente-voltaje fue obtenida bajo el modo voltaje-pinza en respuesta a un estimulo en rampa (rata de 1.2 de V/s). La Figura 1E muestra transientes de calcio sondeados por microscopfa confocal con laser asistida con Fluo3 de un cardiomiocito derivado de celulas madre (recuadro), y registrado a 35±2°C. La Figura 1F es una fotograffa que muestra la retencion local de celulas madre CGR8 despues de la administracion intramiocardio en un corazon de raton (recuadro) y la crioseccion (a una magnificacion de 40x) de miocardio con una superposicion de celulas madre fluorescentes. La Figura 1G es una fotograffa que muestra la carencia de dispersion de celulas madre en tejidos no cardfacos con ausencia de fluorescencia o hiperproliferacion celular en cerebro de raton (izquierda), rinon (centro), fngado (derecha), mostrados a magnificacion baja (arriba) y 40x (abajo).

La Figura 2 muestra el infarto de corazones de rata confirmado por la presencia de ondas Q anteriores y laterales en un electrocardiograma de 12 cables (Figura 2A) y mediante inspeccion visual despues de una toracotomfa (Figura 2B). En la Figura 2A, las flechas indican la localizacion de las ondas Q en la electrocardiogram. En la Figura 2B, las flechas indican los sitios de inyeccion de celulas madre en la base, ventnculo medio y apice en la zona periinfartada. El recuadro en la Figura 2B muestra la inyeccion de celulas madre en un corazon infartado.

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La Figura 3A es una grafica que muestra que a las 3 semanas despues de la inyeccion, la fraccion de eyeccion ventricular izquierda medida por ecocardiograffa en modo M fue significativamente mayor en corazones infartados tratados con celulas madre (n=4) versus tratados con simulacion (n=3) (barras gris claro; p<0.05). Despues del estres inducido por inyeccion intraperitoneal de isoproterenol, la fraccion de eyeccion ventricular izquierda se incremento en el grupo tratado con celulas madre pero no en el grupo con simulacion de tratamiento (barras gris oscuro; p<0.05). Un asterisco sencillo representa una diferencia significativa entre los grupos con celulas madre y de simulacion, mientras que un doble asterisco representa una diferencia significativa entre los grupos con celulas madre y de simulacion asf como una diferencia significativa en el grupo de celulas madre con y sin estres. La Figura 3B es una fotograffa que muestra una imagen en modo M representativa bajo tension en el corazon con tratamiento simulado en contraste con el corazon tratado con celulas madre. Las lmeas interrumpidas y continuas indican las dimensiones ventriculares izquierdas diastolica y sistolica, respectivamente. MI: infarto del miocardio.

La Figura 4A son imagenes en modo M representativas a las 12 semanas en corazones infartados con simulacion de tratamiento versus tratamiento con celulas madre. Las lmeas interrumpidas y continuas indican las dimensiones ventriculares izquierdas diastolicas y sistolicas, respectivamente. La Figura 4B muestra una grafica de mediciones ecocardiograficas en serie a 3, 6, 9 y 12 semanas despues de la terapia. La Figura 4C muestra una grafica a las 12 semanas en comparacion con los electrocardiogramas iniciales en el grupo tratado con celulas madre y tratado con simulacion (p<0.05). En las Figuras 4B-4C, los asteriscos indican diferencias significativas en las comparaciones entre los grupos tratados con celulas madre y los tratamientos de simulacion. Las Figuras 4D y 4E son electrocardiogramas representativos de ratas tratadas con simulacion (D) y tratadas con celulas madre (E) a las 12 semanas. Las flechas indican la localizacion de las ondas Q. MI: infarto del miocardio.

La Figura 5 muestra fotograffas de cardiomiocitos derivados de celulas madre. La presencia de cardiomiocitos derivados de celulas madre de embriones inyectadas puede ser demostrada a traves de la expresion de la protema cianofluorescente potenciada bajo el control del promotor a-actina. La fluorescencia no es vista en corazones no tratados no infartados o infartados tratados con simulacion (Fila 1), pero se ve dentro de la zona de infarto de los corazones tratados con celulas madre (Fila 4; magnificacion 10x). En comparacion con corazones no infartados, los espedmenes grandes y las secciones transversales con tincion con hematoxilina-eosina en la base de cada corazon dentro del grupo con tratamiento de simulacion demuestran cavidades ventriculares izquierdas dilatadas y cicatrices anterolaterales prominentes con aneurismas (Filas 2 y 3). En contraste, el tamano de la cavidad ventricular izquierda y el espesor de la pared se conservan fundamentalmente en los corazones tratados con celulas madre (Filas 5 y 6). MI: infarto de miocardio.

La Figura 6A muestra secciones de miocardio con tincion con hematoxilina-eosina representativas en corazones de control (arriba) o infartados con inyeccion de celulas madre (abajo). Las Figuras 6B-C muestran microscopfa confocal de fluorescencia con alta magnificacion de corazones tratados con celulas madre. Los cardiomiocitos derivados de celulas madre se organizan para formar fibras regulares (Figura 6B) orientadas a lo largo del mismo eje que los cardiomiocitos anfitriones (Figura 6B, 6C), despliegan estratificaciones sarcomericas tfpicas y forman uniones con cardiomiocitos anfitriones no fluorescentes (Figura 6C). Las Figuras 6D-E muestran imagenes de micrograffa electronica de trasmision representativas de biopsias tomadas de la zona de infarto en corazones con tratamiento de simulacion (Figura 6D) en comparacion con corazones tratados con celulas madres (Figura 6E).

La Figura 7A muestra microscopfa electronica de barrido de emision de campo de celulas madre de embriones (ES) murmicas en cultivo. La Figura 7b muestra microscopfa confocal con laser de una celula madre de embrion (arriba) y los cardiomiocitos derivados (abajo). Las Figuras 7C-E muestran el fenotipo cardiaco recapitulado en cardiomiocitos derivados de celulas madre incluyendo sarcomerogenesis (Figura 7C) actividad potencial de accion (Figura 7D), expresion del canal de calcio tipo L (Figura 7E) y localizacion nuclear sostenida del factor de transcripcion cardfaco Nkx2.5 (recuadro). Las barras corresponden a 5, 4 y 15 pm en A, B y C respectivamente. La barra en C aplicable tambien a E.

Las Figuras 8A-B muestra que la administracion de 103 celulas madre (ES) de embriones ingenuas/mg de tejido cardfaco o anfitrion da como resultado una implantacion y diferenciacion apropiada con la generacion de nuevos cardiomiocitos. Las barras corresponden a 2 mm y 12 pm en A y B, respectivamente. La Figura 8C muestra que una carga de celulas madre de embrion excesiva aloja un incremento de la tumorigenesis. La carga terapeutica fue establecida en 103 celulas madre de embrion/mg de tejido cardfaco anfitrion, lo cual da como resultado una implantacion segura sin formacion de tumor, y una estructura y funcionamiento cardfacos normal sostenidos (recuadro) La Figura 8D muestra una fotograffa de un teratoma generado despues de la administracion de una sobrecarga de celulas madre de embrion (>103/mg de tejido cardfaco anfitrion). La Figura 8E muestra un esquema de como un corazon anfitrion puede guiar la diferenciacion de las celulas madre de embrion.

Las Figuras 9A-D muestran una comparacion de corazon normal (Figura 9A) versus infartado bien sea no tratado (Figura 9B) o tratado despues de la administracion directa al miocardio (Figura 9C) de celulas madre (Figura 9D). La Figura 9E muestra la presencia de cardiomiocitos derivados de celulas madre. El recuadro representa un area grande de cardiogenesis de novo a traves de microscopfa confocal con baja magnificacion.

Las Figuras 10A-B muestran un seguimiento en modo M electrocardiografico que demuestra que el tratamiento con celulas madre da como resultado un movimiento normal de la pared anterior y una funcion contractil sostenida a

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traves de un periodo de observacion de 5 meses, sin evidencia de rechazo (Figura 10C) o arritmia (Figura 10D). Las lmeas punteadas y solidas indican las dimensiones ventriculares izquierdas diastolica y sistolica, respectivamente.

La Figura 11A es una grafica que muestra la sobrerregulacion de los factores de transcripcion cardfaca Nkx2.5, MEF2C y GATA4 precedidos por la expresion del gen sarcomerico pMHC sobre Q-RT-PCr. Las Figuras 11B-D muestra una poblacion de celulas no latentes con traslocacion nuclear (colocalizada DAPI) de factores de transcripcion cardfacos que carecen de sarcomeres (MEF2C (+), a-actinina (-)), aislado a siete dfas de la diferenciacion (D7), escintilacion formada de cardiomiocitos latentes (MEF2C (+), a-actinina (+) por D12. El recuadro en la Figura 11B muestra la contractibilidad celular por barrido de lrnea. Las Figuras 11E-F muestran fenotipos de embriones (ES), cardiopoyeticos (CP) y de cardiomiocitos (CM) resueltos con microscopfa electronica de barrido con emision de campo (Figura 11E) y microscopfa de fuerza atomica (Figura 11F). La Figura 11G muestra un dendograma de arreglo de genes de ES, CP y CM. La Figura 11H muestra perfiles de expresion distintivos de marcadores de pluripotencia (sobrerregulados en ES), cardiopoyesis (sobrerregulado en CP), cardiogenesis (sobrerregulados en CP y CM) y acoplamiento por excitacion-contraccion (sobrerregulados en CM). Menos: expresion de fondo; mas: expresion definitiva utilizada como lrnea base; doble mas: incremento de >2 veces en expresion. Barras de escala: 1 s (Figura 11B recuadro); 5 pm (Figura 11C, E, F para CP); 10pm (Figura 11F para ES); y 2 pm (Figura 11F para CM).

Las Figuras 12A-D demuestran que en cuerpo embrioides (EB), los factores de transcripcion cardfaca amplificados TNFa, que promueven la cardiogenesis y aumentan el contenido cardfaco visualizado por inmunofluorescencia con a-actinina. Las Figuras 12E-F muestran que el pico del efecto cardiogenico de TNFa correlacionado con la sobrerregulacion del secretoma endodermico. Las Figuras 12G-J demuestran la cardiogenesis guiada de monocapas de celulas madre de embriones que fue promovida por un medio condicionado endodermico cebado con TNFa, reclutando eficientemente celulas madre cardiopoyeticas (CP). La Figura 12K muestra que las celulas cardiopoyeticas reclutadas produjeron cardiomiocitos (CM derivados de CP) que recapitularon la estructura cardfaca por microscopfa confocal y electronica de transmision. Las Figuras 12L-O muestran que los CM derivados de CP demostraron transientes de calcio, corrientes ionicas hacia adentro sobre voltaje-pinza y actividad potencial de accion sobre corriente-pinza. Barras de escala: 10 pm (Figura 12G, K; confocal); 1 pm (Figura 12K, electronico); y 3 s (Figura 12M).

La Figura 13A muestra geles 2-D del secretoma a partir de endodermo ingenuo versus cebado con TNFa a multiples gradientes de pH. Cmculos coloreados: protemas sobrerreguladas con TNFa; triangulos negros: protemas subreguladas o no cambiadas. Recuadro molecula de TNFa en el secretoma cebado con citoquina. La Figura 13B muestra el coctel de protemas de secretoma sobrerreguladas identificadas por espectrometna de masas (profilina/cofilina: involucradas en sarcomerogenesis; calciclina; una protema de senalizacion del calcio; NDPK: asociado con reprogramacion de gen cardfaco; FKBP12/cistatina/ubiquitina: implicados en la formacion del corazon; y p2 microglobulina: un marcador de la estimulacion de TNFa); menos (secretoma no cebado); mas (secretoma cebado con TNFa). La Figura 13C muestra la programacion por TNFa del endodermo mostrado sobre un microarreglo de genes. La Figura 13D muestra el patron de expresion del factor de crecimiento del secretoma derivado del endodermo en respuesta al cebado con TNFa establecido por sondeo genetico y proteomico en tandem. Las Figuras 13E y F muestran la sobrerregulacion del factor beta de crecimiento transformante (TGF-p) en cuerpos embrioides cebados con TNFa (EB) o medio condicionado endodermico (ENDO) confirmado por inmunoensayos, asociados con la senalizacion aumentada de Smad3 dependiente de TGF-p en la diferenciacion de celulas madre de embriones. Las Figuras 13G y H muestran la adicion de TGF-p, la cual emula el cebado con TNF- a, la proliferacion incrementada y la diferenciacion cardfaca de celulas madre cardiopoyeticas purificadas.

Las Figuras 14A-C muestran las celulas madre de embriones (ES<3-105/corazon) trasplantadas por administracion de celulas guiada por ecocardiograffa que dan como resultado cardiomiocitos derivados de ES fluorescentes con cian embebidos en un corazon anfitrion positivo a actinina. Las Figuras 14D-F muestran que las ES inyectadas a >106/corazon incrementaron el riesgo de crecimiento incontrolado, generando teratomas, consistentes de osteoblastos (O), condrocitos (C), adipocitos (adip), endoteliales (en) o epiteliales (epi) tipos de celulas. La Figura 14C muestra que las celulas madre cardiopoyeticas derivadas de ES (CP), positivas para factores de transcripcion cardfaca, fueron reclutadas utilizando medio acondicionado endodermico cebado con TNFa. Las Figuras 14H-J demuestran que la administracion de CP a 3 x 106/corazon dieron como resultado un ritmo cardfaco sincronico y funcion vigorosa monitorizados por electrocardiogram multicable, ultrasonido (flecha de dos cabezas, plano de sonda en modo M; s, sfstole; d, diastole) y caracterizacion ventricular por micropresion (LVP, presion ventricular izquierda). Las Figuras 14K y L muestran que el tratamiento con CP dio como resultado una implantacion apropiada y una diferenciacion cardfaca dentro del corazon anfitrion. Las Figuras 14M y N muestran que en contraste con ES, la administracion de 3 x 106 CP no estuvo asociada con la formacion tumoral y llevo a un injerto potenciado. La Figura 14o demuestra que en comparacion con corazones ingenuos tipo silvestre (WT), la recapitulacion transgenica del cebado con TNFa, a traves de la sobreexpresion cardiaca restringida (TNFa- TG), redujo el riesgo de tumorigenesis asociado con el trasplante de ES aumentando la expresion en el miocardio de TGF-p, determinada por inmunoprecipitacion Western (recuadro). La interrupcion de la senalizacion cardiopoyetica en celulas ES, a traves de la eliminacion del dominio de quinasa del receptor de TGF-p (ATGFpRII) o la sobreexpresion de la nogina inhibidora de BMP, incrementa el riesgo de tumor. Barras de escala: 2 mm (Figura 14A); 70 pm (Figura 14B, L); y 10pm (Figura 14B recuadro, Figura 14C, 1 recuadro).

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Descripcion detallada

Este documento describe metodos y materiales relacionados con el tratamiento de tejido cardiovascular (por ejemplo, tejido de corazon o tejido vascular). Por ejemplo, este documento describe celulas madre, composiciones que contienen celulas madre, metodos para obtener celulas madre, composiciones para generar celulas madre que expresan marcadores particulares, y metodos para reparar tejido cardiovascular.

El termino “celula madre” tal como se utiliza aqm se refiere a celulas que son no especializadas, se pueden renovar asf mismas y pueden desarrollarse en celulas mas maduras, especializadas. En algunos casos, una celula madre puede ser no especializada mientras esta comprometida a diferenciarse en ultimo particular de celula especializada con la exclusion de otro tipo de celulas especializadas. Por ejemplo, una celula madre puede ser comprometida para desarrollarse en cardiomiocitos y no en neuronas. Las celulas madre pueden ser obtenidas a partir de diversos tejidos. Por ejemplo, las celulas madre tales como celulas madre de embriones pueden ser obtenidas a partir de embriones, cuerpos embrioides, o tejido fetal, mientras que las celulas madre tales como celulas madre adultas pueden ser obtenidas a partir de tejido de adultos.

Las celulas madre descritas aqm pueden tener la capacidad de diferenciarse en cardiomiocitos. Tales celulas madre pueden ser utilizadas para reemplazar tejido del corazon enfermo o danado (por ejemplo, miocardio). En algunos casos, las celulas madre descritas aqm pueden dar como resultado la produccion de cardiomiocitos sin producir celulas tumorales durante un periodo de tiempo que sigue, por ejemplo, a la implantacion. Tal periodo de tiempo puede ser uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o mas meses. En algunos casos, el periodo de tiempo puede ser uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas anos. Por ejemplo, las celulas madre descritas aqm pueden dar como resultado la produccion de cardiomiocitos sin producir celulas tumorales durante al menos uno, dos, tres o mas anos despues de la implantacion en un humano.

Las celulas madre descritas aqm pueden expresar cualquier combinacion de polipeptidos. Por ejemplo, las celulas madre descritas aqm pueden expresar uno o mas polipeptidos (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o cinco polipeptidos) que son expresados por celulas madre de embriones pero no cardiomiocitos. Tales polipeptidos incluyen, sin limitacion, polipeptidos Oct4; DEK; BRCA1; Ect2; y MYC. Las celulas madre descritas aqm pueden contener todos estos polipeptidos o cualquier combinacion de los mismos (por ejemplo, polipeptidos Oct4, BRCA1, Ect2, y MYC; o polipeptidos Oct4, DEK, BRCA1, y MYC; o polipeptidos Oct4, DEK, BRCAI, y Ect2).

En algunos casos, las celulas de madre descritas aqm pueden expresar uno o mas polipeptidos (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho. nueve, diez o mas polipeptidos) que tambien son expresados por cardiomiocitos pero no celulas madre de embriones. Tales polipeptidos incluyen, sin limitacion Fosb; NRAP; MEF2A; Furina; TGFp; receptor a de fibronecita; receptor 1 del dominio de discoidina; bag2; protema rica en cistema; CUGBP2; NDRG4; protema 1 inhibidora de CBP/p300; protema 1 inducible por interferon; tropomiosina 1, alfa; protema 1 activadora de Rho GTPasa; carboxipeptidasa D; profilina 2; transcripto inducido por el factor beta 1 de crecimiento transformante; tropomiosina 1, alfa; receptor de la hormona del crecimiento; vinculina; adenilato ciclasa 6; protema A1 de enlazamiento de calcio S100; tropomiosina 2, beta; protema 1 de enlazamiento del retinol, celular; Moesina; matriz de metaloproteinasa 2; glicoprotema rica en cistema acida secretada; manosidasa 1, alfa; lectina, de enlazamiento a galactosa, soluble 1; protema A6 de enlazamiento a calcio S100 (calciclina); epoxido hidrolasa 1, microsomico; gen similar a adenoma pleiomorfico 1; factor de crecimiento 2 similar a insulina; protema 4 similar a protema Tubby; protema prion; protema 10 de enlazamiento a FK506; ciclina D2; reticulocalbina 3, dominio de enlazamiento a calcio del lado EF; selenoprotema M; inhibidor 1A de quinasa dependiente de ciclina (P21); caldesmon 1; integrina beta 1 (beta receptor fibronectina); transcobalamina 2; anexina A2; inhibidor 1A de quinasa dependiente de ciclina (P21); trombospondina 1; monocito para macrofago asociado a la diferenciacion; receptor AXL de tirosina quinasa; anexina A5; enlazador a musculos similar 2; anexina A1; procolageno, tipo IV, alfa 1; calpaina 2; protema 1 de membrana epitelial; proteasa, serina, 11; tropomiosina 2, beta; lectina, enlazamiento a galactosa, soluble 9; y anexina A3 polipeptidos. Las celulas madre descritas aqm pueden contener todos estos polipeptidos o cualquier combinacion de los mismos (e.g., vinculina, anexina A5, CuGbP2, NDRG4, y polipeptidos de 2 profilina; o NRAP, MEF2A, Furina, TGFa1, y polipeptidos del receptor de fibronectina a; o protema 1 activadora de Fosb, Rho GTPasa, protema 10 de enlazamiento a FK506, anexina A3, y polipeptidos de NDRG4.

En algunos casos, las celulas madre descritas aqm pueden expresar uno o mas polipeptidos (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o mas polipeptidos) que no son expresados por celulas madre de cardiomiocitos o de embrion. Tales polipeptidos incluyen, sin limitacion, protema 2A de membrana integral; protema 4 de enlazamiento con el factor de crecimiento similar a insulina; antfgeno 1 de celulas de timo, theta; selenoproteina P, plasma, 1; glicoprotema 38; sustrato 8 de la ruta del receptor de factor de crecimiento epidermico, protema 1A de choque por calor; protema I de enlazamiento del acido retinoico celular; y polipeptidos 8 espedficos de placenta. Las celulas madre descritas aqm pueden contener todos estos polipeptidos o cualquier combinacion de los mismos (por ejemplo, protema 4 de enlazamiento al factor de crecimiento similar a insulina, protema 1A de choque al calor, y polipeptidos de la protema 2A de membrana integral; o polipeptidos de protema 2A de membrana integral, de protema I de enlazamiento al acido retinoico celular y 8 espedficos de placenta; o polipeptidos de glicoprotema 38, del sustrato 8 de la ruta del receptor del factor de crecimiento epidermico, de protema 1 de enlazamiento de acido retinoico celular y 8 espedfico de placenta).

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Las celulas madre descritas aqu pueden expresar cualquier numero de polipeptidos diferentes y pueden expresar los polipeptidos en cualquier nivel en comparacion con los niveles observado en otras celulas. Por ejemplo, una celula madre que tiene la capacidad de diferenciarse en cardiomiocitos puede expresar los polipeptidos Oct4, DEK, BRCA1, Ect2 y MYC en niveles menores que los niveles observados en celulas madre de embriones. En algunos casos, una celula madre que tiene la capacidad de diferenciarse en cardiomiocitos puede expresar los polipeptidos de la matriz de metaloprotemasa 2; de glicoprotema rica en cistema acida secretada; manosidasa 1, alfa; lectina, de enlazamiento a galactosa, soluble 1; protema 6 de enlazamiento a calcio S100 (calciclina); epoxido hidrolasa 1, microsomica; adenoma pleiomorfico 1 similar a gen; factor 2 de crecimiento similar a insulina; protema 4 similar a protema Tubby; y de protema prion a niveles inferiores a los niveles observados en cardiomiocitos. El nivel de otros polipeptidos con respecto a los niveles observados en otras celulas (por ejemplo, celulas madre de embriones o cardiomiocitos) se provee en la Tabla 1.

Puede utilizarse cualquier metodo para obtener celulas madre. Por ejemplo, celulas madre que tienen la capacidad de producir cardiomiocitos sin dar como resultado la produccion de celulas tumorales asf como celulas madres que expresan uno o mas de los polipeptidos listados como estan presentes en la tercera columna de la Tabla 1 pueden ser obtenidas poniendo en contacto celulas madres tales como celulas madre de embriones con un medio cardiogenico. Celulas madre tales como celulas madre de embriones pueden ser puestas en contacto con un medio cardiogenico durante una, dos, tres, cuatro, cinco o mas horas (por ejemplo uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas dfas bajo condiciones de cultivo.

Un medio cardiogenico puede ser una solucion que contiene, sin limitacion, uno de los siguientes polipeptidos: TGF- p1; TGF-p2; BMP-1; BMP-2; BMP-5; BMP-6; FGF-4; FGF-5; FGF-12; FGF-13; FGF-15; FGF-20; factor inhibidor de leucemia (LIF); VEGF-C; interleucina 6; caspasa-4; ligando de quimioquina 1; ligando de quimioquima 2; ligando de quimioquina 5; ligando de quimioquina 7; ligando de quimioquina 11; ligando de quimioquina 20; haptoglobina; factor 1 de estimulacion de colonias; lectina; colesterol 25-hidroxilasa; sintaxina-8; sintaxina-11; ceruloplasmina; componente de complemento 1; componente de complemento 3; factor de crecimiento derivado de plaquetas; alfa integrina 6; lipasa 1 acida lisosomica; interleucina 6; p-2 microglobulina; ubiquitina; factor inhibidor de la migracion de macrofagos; acido retinoico; BMP-4; cofilina; ciclofilina A; FKBP12; NDPK; profilina 1; cistatina C; y calciclina. Por ejemplo, un medio cardiogenico puede contener TGF-p1; TGF- p2, BMP-1; BmP-2; BMP-5; BMP-6; FGF- 4; FGF-5; FGF-12; FGF-13; FGF-15; FGF-20; factor inhibidor de leucemia (LIF), VEGF-C; e interleucina 6.

Cualquier metodo puede ser usado para hacer un medio cardiogenico. Por ejemplo, el medio de cultivo puede ser suplementado con preparaciones de polipeptidos comercialmente disponibles tales como polipeptidos de TEG-p-1 o IL-6 comercialmente disponibles. En algunos casos, un medio cardiogenico puede ser obtenido cultivando celulas endodermicas ventrales o celulas similares a las endodermicas ventrales y recolectando el medio acondicionado resultante, el cual puede contener un coctel de polipeptidos que tiene la capacidad de causar, por ejemplo, que las celulas de embriones pierdan su tumorigenicidad y se comprometan en la diferenciacion en cardiomiocitos. Las celulas endodermicas ventrales pueden ser obtenidas partir de un embrion no humano tal como un embrion de raton, rata, bovino o porcino. El endodermo puede ser cebado cardiotroficamente por tratamiento del embrion con un agente potenciador cardiotrofico (por ejemplo, un polipeptido de TNF-a) para inducir una expresion incrementada de los componentes del medio cardiogenico. En celulas similares a endodermicas ventrales representativas incluyen, sin limitacion, celulas de carcinoma de embrion. En algunos casos, los polipeptidos exogenos de IGF-1, IL-6, FGF-4, TGF-p, BMP, LIF y ha-trombina (o cualquier combinacion de los mismos) pueden ser agregados al medio acondicionado. Por ejemplo, el medio acondicionado al cual se han agregado aproximadamente 50 ng/mL IGF-1, aproximadamente 100 ng/mL IL-6, aproximadamente 10 ng/mL FGF-4, aproximadamente 25 ng/mL TGFp, aproximadamente 5 ng/mL BMP, aproximadamente 100 U/mL LIF, y aproximadamente 40 nM de ha-trombina puede utilizarse como medio cardiogenico para guiar la cardiogenesis de las celulas madre (por ejemplo, celulas madre de embriones).

Despues de poner en contacto las celulas madre (por ejemplo, celulas madre de embriones) con un medio cardiogenico, las celulas madre pueden diferenciarse en celulas madre que tienen la capacidad de producir cardiomiocitos y no otro tipo de celula (por ejemplo, una celula tumoral). Tales celulas pueden ser denominadas como celulas madre cardiopoyeticas. Las celulas madre cardiopoyeticas pueden exhibir una translocacion nuclear de factores de transcripcion cardfaca (por ejemplo, Nkx2.5, MEF2C y GATA4), demostrativo del compromiso definitivo al destino cardfaco. Las celulas madre cardiopoyeticas tambien pueden carecer de plasticidad celular, lo cual puede ser demostrado, en parte por la expresion subregulada de marcadores tanto de pluripotencia como de oncogenesis. Las celulas madre cardiopoyeticas pueden exhibir inhibicion por contacto en cultivo, un fenomeno no observado con celulas madre de embriones pluripotentes. Las celulas madre cardiopoyeticas pueden representar un estado transicional durante la metamorfosis cardiogenica a partir de un fenotipo de alta relacion nucleo a citosol, tfpico de las celulas madre de embriones, hacia la adquisicion de una estructura de cardiomiocito estriado. A diferencia de su fuente pluripotente o progenie de cardiomiocitos, las celulas madre cardiopoyeticas pueden exhibir caractensticas de compromiso definitivo con el programa cardfaco incluyendo sobrerregulacion de los factores de transcripcion cardfaca en la ausencia de componentes de excitacion-contraccion. Las celulas madre cardiopoyeticas pueden ser altamente proliferativas, probablemente porque no son impedidas por la carga mitotica de la organizacion sarcomerica.

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Cualquier metodo puede ser utilizado para obtener una celula madre que exprese una combinacion particular de polipeptidos. Por ejemplo, una celula madre cardiopoyetica puede ser obtenida cultivando celulas madre de embriones con un medio cardiogenico. Una vez obtenida, la celula madre cardiopoyetica puede ser tratada con oligonucleotidos antisentido, ribozimas, constructos de ARN de interferencia, o una combinacion de los anteriores para reducir la expresion de uno o mas polipeptidos particulares. En algunos casos, puede utilizarse la tecnologfa de anulacion de gen estandar para hacer celulas, embriones, o mairnferos que carecen de la expresion de uno o mas polipeptidos particulares. Tales celulas, embriones, y mamfferos pueden ser utilizados entonces como una fuente de celulas madre de embrion que pueden ser tratadas con un medio cardiogenico para obtener, por ejemplo, celulas madre cardiopoyeticas que carecen de expresion de uno o mas polipeptidos en particular.

Cualquier metodo puede ser utilizado para determinar si una muestra (por ejemplo una muestra biologica tal como un cuerpo embrioide) contiene o no una celula madre que tiene una o mas de las caractensticas descritas aqrn. Por ejemplo, las celulas pueden ser examinadas utilizando RT-PCR o inmunocitoqmmica para determinar si las celulas expresan o no uno o mas de los polipeptidos listados en la tercera columna de la Tabla 1. Los experimentos in vitro o in vivo similares a los descritos aqrn pueden ser utilizados para identificar celulas madre capaces de diferenciarse en cardiomiocitos sin producir celulas tumorales.

Las celulas madre descritas aqrn pueden ser utilizadas para hacer una composicion que contiene celulas madre. Tal composicion puede contener la poblacion enriquecida de celulas madre descritas aqrn. Por ejemplo, una composicion puede contener celulas tales como al menos 3, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 o 100 por ciento de las celulas de la composicion y de las celulas madre descritas aqrn. Cualquier metodo puede ser utilizado para hacer una poblacion enriquecida de celulas madre. Por ejemplo, pueden utilizarse tecnicas de cultivo para expandir una poblacion de celulas madre en oposicion a otras celulas dentro del cultivo. En algunos casos, pueden utilizarse tecnicas de separacion (por ejemplo gradientes Percoll) para separar celulas madre cardiopoyeticas de otras celulas tales como celulas madre de embriones y cardiomiocitos. Una composicion que contiene una poblacion enriquecida de celulas madre descritas aqrn pueden contener componentes adicionales tales como un medio cardiogenico o un medio de cultivo disenados para mantener el estado de diferenciacion de las celulas madre.

Las celulas madre descritas aqrn pueden ser utilizadas para tratar tejido cardiovascular. Por ejemplo, las celulas madre descritas aqrn pueden ser administradas a tejido cardiovascular lesionado (por ejemplo, tejido cardfaco) dentro de un marnffero tal como un humano, mono, caballo, oveja, vaca, cerdo, perro, gato o roedor. Tal tejido lesionado puede ser un tejido danado por isquemia y/o infarto. En algunos casos, el tejido lesionado puede ser tejido danado por causas congenitas. En estos casos, las celulas madre descritas aqrn pueden ser administradas inmediatamente despues del nacimiento o en estado prenatal.

Mientras que no estan limitadas a ningun modo particular de accion, las celulas madre administradas pueden diferenciarse en cardiomiocitos que se incorporan en tejido cardfaco o vascular lesionado, reparando por lo tanto la lesion. En algunos casos, las celulas madre pueden expresar los polipeptidos listados en la tercera columna de la Tabla 1. Puede utilizarse cualquier metodo para administrar las celulas madre a tejido cardiovascular. Por ejemplo, puede usarse un cateter para administrar las celulas madre a una region lesionada de tejido cardfaco o vascular. En algunos casos, las celulas madre pueden ser inyectadas directamente en el tejido lesionado o pueden ser colocadas directamente sobre o dentro del corazon si el receptor ya esta, por ejemplo, experimentando un procedimiento a corazon abierto.

Este documento tambien describe metodos para tratar tejido cardiovascular con celulas madre de embriones bajo condiciones en donde los tumores no se desarrollan durante un periodo de tiempo despues de la implantacion. Tal periodo de tiempo puede ser uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o mas meses. En algunos casos, el periodo de tiempo puede ser uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas anos. Tfpicamente, las celulas madre de embriones pueden ser administradas a un receptor utilizando un numero relativamente pequeno de celulas madre de embriones de tal manera que las celulas madre de embriones administradas pueden dar como resultado la produccion de celulas (por ejemplo cardiomiocitos) sin producir celulas tumorales. Por ejemplo, las celulas madre de embriones pueden ser administradas en una cantidad menor de aproximadamente 1500 celulas madre de embriones por mg de tejido cardiovascular (por ejemplo menos de aproximadamente 1400, 1200, 1000, 800, 500 o 300 de celulas madre de embriones por mg de tejido cardiovascular).

Cualquiera de los metodos descritos aqrn para tratar tejido cardiovascular pueden incluir tratamientos adicionales. Por ejemplo, pueden administrarse factores de crecimiento o citoquinas tales como TNFa o Y-interferon o cualquier combinacion de los mismos al tejido cardiovascular que esta siendo tratado. Los factores de crecimiento o citoquinas pueden ser administrados a tejido cardiovascular antes o despues de que son administradas las celulas madre (por ejemplo, las celulas madre descritas aqrn, celulas madre de embriones, o una combinacion de las mismas). En algunos casos, los factores de crecimiento o citoquinas pueden ser administrados con las celulas madre (por ejemplo, las celulas madre descritas aqrn, celulas madre de embriones, o una combinacion de las mismas). Mientras que no se limita a ningun modo particular de accion, los factores de crecimiento y las citoquinas tales como TNFa o Y-interferon pueden producir tejido cardiovascular (por ejemplo tejido del corazon) para producir polipeptidos que crean un ambiente favorable para la diferenciacion de las celulas madre en cardiomiocitos sin producir celulas tumorales.

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La invencion sera descrita adicionalmente en los siguientes ejemplos, los cuales no limitan el alcance de la invencion descrito en las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Materiales y metodos para terapia con celulas madre de embriones en infarto del miocardio

Celulas madre de embriones. La lmea de celulas madre de embriones CGR8 murmica fue preparada en medio BHK21 o Glasgow MEM suplementado con piruvato, aminoacidos no esenciales, mercaptoetanol, suero de ternera fetal al 7.5% y el factor inhibidor de leucemia (Meyer et al., 2000, FEBS Lett., 478:151-158; Perez-Terzic et al., 2003, Circ. Res., 92:444-452). Se manipulo un clon de celulas CGR8 para expresar la protema fluorescente amarilla (YFP) o la protema fluorescente cian potenciada (ECFP) bajo el control del promotor de a-actina espedfico del sistema cardfaco corriente arriba de ECFP utilizando los sitios de restriccion XhoI y HindIII del vector pECFP sin promotor (Clontech). Este constructo del promotor de la a-actina fue lineal lisado utilizando XhoI, y sometido a electroporacion en celulas madre CGR8 como esta descrito (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566; Meyer et al., 2000, FEBS Lett., 478:151-158). Para generar imagenes de celulas madre por microscopfa electronica de barrido con emision de campo, las celulas fueron fijadas en solucion salina regulada con fosfato que contema 1% de glutaraldelddo y 4% de formaldehido (pH 7.2), se deshidrato con etanol y se seco en un secador de punto cntico. Las celulas, recubiertas con platino utilizando un sistema de aspersion de haz de iones de argon indirecto ion Tech (VCR Group), operando a voltajes de aceleracion de 9.5 kV y 4.2 mA, fueron examinados en un microscopio electronico de emision de campo Hitachi 4700 (Perez-Terzic et al., 2001, J. Biol. Chem., 276:20566-20571). Para la microscopfa electronica de barrido por transmision, las celulas madre fueron postfijadas en OsO4 al 1% regulado con fosfato, tenidas en bloc con acetato de uranilo al 2%, deshidratada en etanol y oxido de propileno, y embebidas en resina epoxi de baja viscosidad. Se tineron secciones delgadas (90-nm) con citrato de plomo, y las micrograms fueron tomadas en un microscopio electronico JEOL 1200 EXII (Hodgson et al., 2003, EmBo J., 22:1732-1742).

Cardiomiocitos derivados de celulas madre. Las celulas madre de embriones CGR8 fueron diferenciadas in vitro utilizando el metodo de gota colgante previamente establecido para generar cuerpos embrioides (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566; Maltsev et al., 1994, Circ. Res., 75:233-244). Despues de la disociacion con enzimas de los cuerpos embrioides, se utilizo el gradiente Percoll para aislar una poblacion altamente enriquecida de cardiomiocitos derivados de celulas madre como se describe (Perez-Terzic et al., 2003, Circ. Res., 92:444-452). La presencia de marcadores cardiacos en celulas purificadas fue sondeada mediante microscopfa confocal de laser (Zeiss LSM 510 Axiovert) utilizando anticuerpos anti-MEF2C (Cell Signaling Technology) y anti-a actinina (Sigma). La actividad electrica de la membrana fue determinada por pinza de parche registrando la configuracion de la celula completa utilizando el modo de pinza de corriente o voltaje (Axopatch 1C, Axon Instruments). Los perfiles potenciales de accion y la relacion voltaje corriente fueron adquiridos y analizados con el software Bioquest de celulas superfusionadas con solucion Tyrode en (en mM: NaCl 137, KCl 5.4, CaCh 2, MgCh 1, HEPES 10, glucosa 10; pH 7.4 con NaOH) utilizando pipetas de parche (5-10 MW) que conteman (in mM) KCl 140, MgCh 1, HEPES 10, EGTA 5, y suplementado con aTp 5 mM (ajustada a pH 7.2 con KOH). Las mediciones electrofisiologicas fueron llevadas a cabo a 31±1°C, utilizando un controlador de temperatura (HCC-100A, Dagan Corp.) equipado con un Termopaff Peltier (Zingman et al., 2002, J. Biol. Chem., 277:14206-14210). Para establecer la dinamica intracelular Ca2+ se cargaron las celulas con la sonda fluorescente para Ca2+ Fluo3-AM (Molecular Probes), escaneado en lmea con un microscopio confocal laser Zeiss y se analizaron utilizando un software para imagenes (Zeiss LSM Image Browser) como esta descrito (Perez-Terzic et al., 2003, Circ. Res., 92:444-452; Zingman et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:13278-13283).

Modelo de infarto del miocardio. Se indujo infarto del miocardio a las 6 semanas de edad por ligacion de la arteria coronaria descendente anterior izquierda en ratas Sprague Dawley macho dando como resultado un modelo establecido con un ventnculo izquierdo infartado aproximadamente en 30% (Charles River). Consecuentemente, la fraccion de eyeccion ventricular izquierda fue deprimida desde 75±2% en la lmea base hasta 47±3% postinfarto. Los animales infartados fueron aleatorizados en grupos de tratamiento simulado y con celulas madre de embriones. Ocho semanas despues del infarto, los animales fueron anestesiados con isofluorano (3% de induccion, 1.5% de mantenimiento), se llevo a cabo electrocardiogram de 12 cables, y el corazon fue expuesto por toracotoirna. Se inyecto medio (20 pL Glasgow MEM) sin celulas (simulacion) o celulas madre de embriones cGR8 (3x105 en 20 pL de medio), manipulados para expresar la protema fluorescente cian potenciada (ECFP) bajo control del promotor de actina espedfico cardfaco, fueron inyectados a traves de una aguja de calibre 28 en tres sitios (en la base ventricular izquierda justo por debajo del atrio izquierdo, en la region anterior media, y en al apice) a lo largo del lfmite de las areas ventriculares izquierdas infartadas.

Electrocardiogram. Se llevo a cabo electrocardiogram de doce cables bajo anestesia con isofluorano utilizando electrodos y agujas subcutaneos (Grass Instruments) y un amplificador electrocardiografico diferencial (Modelo RPS312, Grass Instruments). Se registraron los cables estandar y aumentados en miembros (I, II, III, aVR, aVL, aVF) asf como cables precordiales (V1 - V6) antes de la inyeccion de la simulacion/celulas madre y serialmente despues de la misma.

Ecocardiograffa. Bajo anestesia con isofluorano, se obtuvieron dos imagenes ecocardiograficas en modo M bidimensional de la vista de eje corto parasternal con una sonda de 5 MHz en la base ventricular (Vingmed System

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FiVe, GE Medical Systems). Utilizando la convencion de borde de gma de la American Society of Echocardiography, la fraccion de eyeccion (EF) fue calculada como EF = 100(D2-S2)/D2 donde D es el diametro de la cavidad diastolica terminal y S es el diametro de la cavidad sistolica terminal (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566; Hodgson et al., 2003, EMBO J., 22:1732-1742).

Histopatologfa. En la autopsia se llevo a cabo un examen patologico superficial sobre corazones cortados transversalmente fijados en formalina al 4%, seguido por microscopfa de luz de secciones en parafina de 0.5 pm de espesor tenidas con hematoxilina-eosina (Zingman et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:13278-13283). La fraccion de la circunferencia de camara con cicatriz ventricular izquierda residual postinfarto fue determinada en secciones estandarizadas traves de la base ventricular izquierda y el nivel medio del infarto. Se realizo microscopfa de fluorescencia (Zeiss) sobre secciones de parafina sin tincion. Para la microscopfa electronica de transmision, los espedmenes de miocardio fueron postfijados en OsO4 al 1% regulado con fosfato, tenido en bloc con acetato de uranilo al 2%, deshidratados en etanol y oxido de propileno, y embebidos en resina epoxica de baja viscosidad. Se cortaron secciones delgadas (90 nm) con un ultramicrotomo (Reichert Ultracut E), se colocaron sobre rejillas de cobre de malla de 200 pm, y se tineron con citrato de plomo. Las micrograffas fueron tomadas en un microscopio electronico JEOL 1200 EXII que operaba a 60 kV (Hodgson et al., 2003, EMBO J., 22:1732-1742).

Estadfstica. Los valores son expresados como media ± error estandar. Los grupos tratados con celulas madre de embriones versus los de tratamiento de simulacion fueron comparados utilizando la prueba t de Student con un valor p <0.05 considerado significativo. La prueba de rango logantmico Wilcoxon fue utilizada para la evaluacion no parametrica de la aleatorizacion.

Ejemplo 2 - Terapia con celulas madre de embriones en infarto de miocardio

Potencial cardiogenico de celulas madre de embriones y administracion en un corazon infartado. La colonia de celulas madre de embriones CGR8, utilizada aqu (Figura 1A), demostro caractensticas tfpicas de celulas no diferenciadas incluyendo una relacion nucleo a citosol alta, nucleolos prominentes y mitocondrias con unas pocas crestas (Figura 1 B). La capacidad cardiogenica de esta lmea de celulas madre de embriones fue sondeada por diferenciacion in vitro, con celulas facilmente derivadas que expresan el factor de transcripcion cardfaco MEF2C (Lin et al., 1997, Science, 276:1404-1407), la protema a-actinina contractil cardfaca y estnas sarcomericas (Figura 1C). Consistente con la diferenciacion apropiada hacia la lmea cardfaca, los cardiomiocitos derivados de las celulas madre demostraron actividad potencial de accion asociada con corrientes prominentes hacia dentro de Na+ y Ca2+ (Figura 1D) cnticos para el acoplamiento de excitacion-contraccion manifestado como transientes intracelulares de Ca2+ ntmicos (Figura 1E). La inyeccion de celulas CGR8 en el miocardio dio como resultado la retencion local de estas celulas madre de embriones (Figura 1F) sin dispersion detectable en tejidos no cardfacos (Figura 1G). Para determinar el resultado de la terapia con celulas madre para la reparacion cardfaca en infarto de miocardio, las ratas fueron asignadas aleatoriamente a grupos de tratamiento con celulas madre o con simulacion. Ocho semanas despues de la ligacion de la arteria coronaria descendente interior izquierda el infarto fue confirmado por evidencia electrocardiografica de necrosis del miocardio (Figura 2A), asf como por inspeccion visual directa del miocardio despues de una toracotoirna (Figura 2B). Las celulas madre CGR8 de embriones provenientes de la colonia preprobada o de preparaciones acelulares (controles de simulacion) fueron inyectadas entonces en la zona del periinfarto (Figura 2b), para establecer el impacto funcional y estructural con el tiempo.

Beneficio funcional sostenido de los corazones infartados tratados con celulas madre versus los de simulacion. La funcion contractil cardfaca, establecida por ecocardiograffa a las 3 semanas postinyeccion fue superior en corazones infartados tratados con celulas madre en comparacion con los tratamientos de simulacion (Figura 3A). En promedio, la fraccion de eyeccion ventricular izquierda fue de 0.80±0.05 versus 0.52±0.05 en el grupo con celulas madre versus el de simulacion, respectivamente (p<0.05). Ademas, mientras que los corazones infartados tratados con simulacion fallaron en aumentar la funcion bajo el desafm inotropico, los corazones infartados tratados con celulas madre demostraron una respuesta inotropica positiva significativa. Las pruebas de estres farmacologico por inyeccion del agonista p-adrenergico isoproterenol (3 pg/kg), produjo un incremento de 12% en la fraccion de eyeccion de los corazones infartados tratados con celulas madre versus la respuesta no significativa observada en el grupo con tratamiento de simulacion (Fig. 3A). Las imagenes en modo M bajo estres demostraron adicionalmente que en contraste con las paredes ventriculares izquierdas anteriores hipocineticas o acineticas en corazones infartados tratados con la simulacion, los corazones infartados tratados con inyeccion de celulas madre exhibe un movimiento de paredes anteriores dinamico con funcion ventricular vigorosa (Figura 3B). Un seguimiento a largo plazo no encontro descenso en la ventaja contractil de la terapia con celulas madre (Figura 4). En efecto, el beneficio del rendimiento contractil de los corazones infartados tratados con celulas madre versus el tratamiento de simulacion se mantuvo a las 3, 6, 9 y 12 semanas postinyeccion, de tal forma que a los 3 meses despues de la administracion de las celulas la fraccion de eyeccion izquierda fue de 83±4% y 62±4%, respectivamente (p<0.05; Figuras 4A y 4B). En imagenes en modo M 3 meses posterapia, las anormalidades en la dilatacion ventricular izquierda y en el movimiento de la pared regional anterior persistieron en el grupo de simulacion pero no fueron vistas en el grupo tratado con celulas madre (Figura 4A). Adicionalmente, la electrocardiogram llevada a cabo 3 meses posterapia revelo en el grupo tratado con celulas madre un descenso del 33% en el numero total de cables anteriores y laterales con ondas Q, reflejando una reduccion neta en la necrosis del miocardio (P<0.05), no visto en el grupo de simulacion (Figuras 4C-4E). A lo largo del periodo siguiente, los electrocardiogramas en serie no documentaron ectopia ventricular ni los animales experimentaron muerte cardfaca subita. Asf, la administracion de celulas madre

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de embriones en corazones infartados estuvo asociada con un beneficio funcional en la lmea base y con estres, y fue sostenido durante el seguimiento sin evidencia de proarritmia en este modelo.

Injerto de celulas madre asociado con cardiogenesis de novo y arquitectura del miocardio normalizada. En el examen patologico, el grupo completo de corazones infartados tratados con celulas madre (n=4) demostro una poblacion de miocitos cianofluorescentes dispersados dentro del miocardio anfitrion no fluorescente (Figura 5, filas 1 y 4). Esta poblacion fluorescente, ausente del grupo inyectado con la simulacion (n=3), indica el origen de las celulas madre de embriones a traves de la expresion de la protema cian fluorescente bajo el control del promotor de actina cardfaco (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566). En contraste con los corazones infartados tratados con simulacion que demostraron una arquitectura ventricular marcadamente alterada con paredes libres adelgazadas y cicatriz fibrotica o areas con aneurismas que comprendfa 34±11% del ventnculo, la presencia de cardiomiocitos derivados de celulas madre fue asociada con una remodelacion residual adversa de solamente 6±4% al ventnculo (p<0.05) y una apariencia del miocardio mas compatible con el corazon no infartado de control (Figura 5, filas 2-3 y 5-6). Los corazones inyectados con celulas madre no demostraron infiltrados inflamatorios que de alguna otra manera sugerinan una respuesta inmune hacia las celulas injertadas (Figura 6A). En magnificacion alta, el patron fluorescente de los cardiomiocitos derivados de celulas madre revelo estnas sarcomericas distinguibles que indican el desarrollo del aparato contractil (Figuras 6B y 6C). Los sarcomeros en el area de infarto de los corazones tratados con celulas madre demostraron una ultraestructura cardfaca normal por microscopfa electronica, en contraste con las areas infartadas acelulares de corazones tratados con la simulacion (Figuras 6D y 6E). Asf las celulas madre de embriones fueron capaces de incorporarse en el territorio infartado del huesped, demostrar diferenciacion cardiogenica y contribuir a la reparacion del miocardio.

Los resultados descritos aqrn demuestran un impacto favorable estable de la terapia con celulas madre de embriones. Este se manifesto como un beneficio sostenido sobre el rendimiento contractil cardfaco y la remodelacion ventricular asociados con la cardiogenesis documentada en la zona de infarto a partir de celulas madre inyectadas. Estos hallazgos indican que la ventaja de la administracion de celulas madre de embriones ocurre de manera temprana, como se evidencio primero en el diseno actual a las 3 semanas posterapia y no esta comprometido por un fallo espontaneo de los cardiomiocitos derivados de las celulas madre y/o por rechazo de este trasplante alogenico por parte del anfitrion. La carencia de efecto de disminucion con el tiempo sugiere el potencial del uso terapeutico de celulas madre de embriones en el manejo cronico de lesiones del miocardio.

Sin estar limitados a ningun modo particular de accion, pueden tenerse en cuenta varios mecanismos potenciales para el beneficio demostrado de la terapia con celulas madre de embriones. Los cardiomiocitos derivados de celulas madre de embriones, a traves de acoplamiento electrico y mecanico con miocardio nativo, podna contribuir a un incremento neto en el tejido contractil. Los cardiomiocitos derivados de celulas madre se alinearon con y dentro de las fibras de miocardio anfitriones. En efecto, el miocardio anfitrion habfa mostrado secretar factores de crecimiento cardiogenico que interactuan en una forma paracrina con receptores sobre las celulas madre que soportaban la diferenciacion cardfaca con expresion de protemas de union contractil cardfaca y de brecha (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566; Mery et al., 2003, J. Muscle Res. Cell. Motil., 24:269-274). El fallo presente en observar ectopia es adicionalmente consistente con la integracion electrica de los cardiomiocitos derivados de celulas madre y el tejido anfitrion. El efecto de los cardiomiocitos derivados de celulas madre sobre las propiedades del miocardio activas es evidenciado adicionalmente aqrn por una respuesta inotropica mejorada al reto p-adrenergico. Un mecanismo potencial sinergico para la mejora funcional por cardiomiocitos derivados de celulas madre es a traves de la alteracion de las propiedades mecanicas pasivas del miocardio (Askari et al., 2003, Lancet, 362:697-703), como se muestra aqrn por la aparicion limitada de cicatrices y menos dilatacion del ventnculo izquierdo en comparacion con los corazones infartados tratados con simulacion. Esto puede ocurrir a traves de la repoblacion directa de la cicatriz por cardiomiocitos derivados de celulas madre, asf como por la limitacion de una remodelacion adversa (Britten et al., 2003, Circulation, 108:2212-2218; Mangi et al., 2003, Nat. Med., 9:1195-201). Ademas, la fusion celular despues del injerto in vivo ha sido documentada recientemente con celulas madre de adulto en tejido no cardiaco, asf como con celulas progenitoras cardfacas en el corazon mismo (Oh et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:12313-12318; Vassilopoulos et al., 2003, Nature, 422:901-904; Wang et al., 2003, Nature, 422:897901). Mientras que se carece de evidencia directa para la propension de las celulas madre de embriones para fusionarse con miocardio residente, tal posibilidad podna en principio contribuir adicionalmente a la reparacion cardfaca prestando una capacidad proliferativa al musculo cardfaco anfitrion. De esta manera, la fusion celular complementana la cardiogenesis de novo que ocurre con la diferenciacion cardfaca de las celulas madre. Como mecanismo potencial adicional, podnan surgir directamente otros tipos celulares cardiovasculares a partir de celulas madre inyectadas o a traves del reclutamiento in situ llevando a una neovascularizacion y asf a un soporte metabolico aumentado del miocardio anfitrion (Aicher et al., 2003, Nat. Med., 9:1370-1376; Levenberg et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:4391-4396; Yang et al., 2002, J. Appl. Physiol., 93:1140-1151). Mientras que el mecanismo de reparacion cardfaca basado en celulas madre es asf probablemente multifactorial, los resultados provistos aqrn indican que mas bien una reorganizacion transiente que es de vida corta debido al rechazo o fallo en el trasplante, el beneficio reparador inicial de la terapia con celulas madre es estable. En efecto, no se encontro evidencia de rechazo de las celulas trasplantadas a pesar del xenotrasplante de celulas madre de embrion munnico en corazon de rata. Esta carencia de reaccion del anfitrion versus el injerto puede ser dependiente del injerto y/o del anfitrion debido a la baja expresion de antfgenos inmunogenicos por celulas madre, generacion de quimerismo mixto, subregulacion de respuesta inmune del anfitrion y/o induccion de tolerancia mejorada (Drukker et al., 2002,

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Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:9864-9869; Frandrich et al., 2002, Nat. Med., 8:171-178; Lila et al., 2002, Circulation, 105:1949-1954). Finalmente, la diferenciacion desorganizada que lleva a la formacion de tumores no fue observada, aunque las celulas madre pluripotentes llevan el riesgo (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566; Thomson et al., 1998, Science, 282:1145-1147) cuando interaction con el anfitrion (Erdo et al., 2003, J. Cereb. Blood Flow Metab., 23:780-785). Como se demostro previamente, la proteccion frente a la tumorigenesis es conferida por el mantenimiento de una senalizacion en el huesped apropiada que gma la diferenciacion especifica cardfaca de las celulas madre previniendo asf un crecimiento incontrolado (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566; Mery et al., 2003, J. Muscle Res. Cell. Motil., 24:269-274).

Asf, el beneficio estable y de la terapia con celulas madre de embriones sobre la estructura y funcion de miocardio en este modelo experimental soporta el potencial del tratamiento reparativo basado en celulas madre del infarto de miocardio. Al regenerar el miocardio enfermo y promover la reparacion cardfaca, las celulas madre de embriones proveen una modalidad terapeutica unica que tiene el potencial de reducir la morbilidad y mortalidad de esta enfermedad cardfaca prevalente.

Ejemplo 3 - Materiales y metodos para celulas madre alogenicas dosificadas para asegurar cardiogenesis

Celulas madre de embriones y cardiomiocitos derivados. La microscopfa electronica de barrido con emision de campo fue utilizada para visualizar celulas madre de embriones murrnicos en cultivo (Perez-Terzic et al., 2003, Circ. Res., 92:444-452; Hodgson et al., 2004, Am. J. Physiol., 287:H471-H479). La diferenciacion in vitro fue lograda utilizando el metodo de gota colgante para generar cuerpos embrioides a partir de los cuales, despues de la disociacion enzimatica, se aislo una poblacion altamente enriquecida de cardiomiocitos con un protocolo de gradiente de densidad (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566; Perez-Terzic et al., 2003, Circ. Res., 92:444452). La expresion de marcadores cardfacos fue sondeada mediante microscopfa confocal con laser, con actividad potencial de accion capturada por el metodo de parche-pinza en el modo de corriente pinza (Hodgson et al., 2004, Am. J. Physiol., 287:H471-H479).

Trasplante de celulas madre en corazon anfitrion. Para seguir las celulas trasplantadas in vivo, se manipularon celulas madre de embriones para expresar la proterna fluorescente cian potenciada (ECFP) bajo control del promotor de a-actina espedfico cardfaco (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566; Meyer et al., 2000, FEBS Lett., 478:151-158). Utilizando una aguja de calibre 28, se suministraron celulas madre manipuladas directamente en paredes ventriculares izquierdas saludables o infartadas de ratones o ratas anestesiados con isofluorano, respectivamente (Hodgson et al., 2004, Am. J. Physiol., 287:H471-H479). Los resultados funcionales fueron monitorizados por ecocardiograffa 2D de eje corto y en modo M o por registros de presion ventricular utilizando un cateter de micropresion (Behfar et al., 2002, FaSeB J., 16:1558-1566; Hodgson et al., 2004, Am. J. Physiol., 287:H471-H479; O'Cochlain et al., 2004, Hum. Mol. Genet., 13:2505-2518). De cuatro a diez y seis semanas despues de la inyeccion, los corazones fueron seccionados y examinados con microscopfa de luz y de campo amplio epifluorescente para establecer la estructura y presencia de cardiomiocitos derivados de las celulas madre, asf como para registrar la actividad electrica del miocardio utilizando la tecnica electrocardiografica de 12 cables (Hodgson et al., 2004, Am. J. Physiol., 287:H471-H479).

Estadfsticas. Los valores se expresan como media ± error estandar. Los grupos tratados con celulas madre de embriones versus los de tratamiento simulado fueron comparados utilizando la prueba t de Student con un valor p <0.05 considerado como significativo. La prueba de clasificacion logantmica Wilcoxon fue utilizada para la evaluacion no parametrica de la aleatorizacion.

Ejemplo 4 - Celulas madre alogenicas dosificadas para asegurar la cardiogenesis

Potencial cardiogenico de celulas madre de embriones in vitro. Una vez establecidas en cultivo, las celulas madre de embriones tienen la capacidad de diferenciarse a partir de un fenotipo pluripotente a uno cardfaco (Figuras 7A-B). Esto esta demostrado aqu puesto que las celulas derivadas recapitularon las caractensticas de cardiomiocitos tfpicas incluyendo traslocacion nuclear de factores de transcripcion cardfacos, el Factor Potenciador de Miocitos Iniciales 2C (MEF2C) y el factor de transcripcion de homeodominio (Nkx2.5) que lleva a sarcomerogenesis (Figuras 7B-C) y a formacion de potencial de accion asociado con la expresion del canal de Ca2+ tipo L (Figuras 7C-E). Asf, las celulas madre de embriones sirven como una fuente basada en celulas confiable para cardiogenesis de novo.

La administracion de celulas madre tituladas asegura la cardiogenesis in vivo. La administracion de celulas madre de embriones, manipuladas para hacer seguimiento por fluorescencia in vivo, dio como resultado la incorporacion en un corazon anfitrion de nuevas celulas cardfacas fluorescentes cian dentro del area de trasplante de las celulas madre (Figuras 8A-B). El injerto de cardiomiocitos derivados de celulas madre fue asociado con morfologfa (Figuras 8A) y funcion (Figura 8C, recuadro) cardfacas normales. Fue establecido un umbral en la capacidad del corazon anfitrion para aceptar la implantacion de celulas madre, por encima del cual una carga de celulas madre excesiva compromete la cardiogenesis postrasplante debido a una diferenciacion no controlada que da como resultado tumorigenesis (Figuras 8C-D). Asf, el corazon anfitrion tiene una capacidad finita para guiar la cardiogenesis en soporte de la diferenciacion e injerto de celulas madre in vivo (Figura. 8E).

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Reparacion de infarto con trasplante de celulas madre produce resultados estables. Un modelo de infarto de miocardio fue generado por ligacion coronaria, dando como resultado una pared aneurismica y cicatrizada anterior con compromiso significativo en el rendimiento contractil (Figuras 9A-B). Para probar la eficacia de la regeneracion basada en celulas madre de embriones de un miocardio enfermo, las celulas madre de embriones manipuladas para generar fluorescencia por cardiogenesis fueron administradas por trasplante directo al miocardio en el area periinfarto (Figura 9C). El examen histopatologico mostro beneficios en los corazones infartados tratados con celulas madre con areas de reparacion pobladas por celulas cardfacas fluorescentes que indican una cardiogenesis de novo basada en celulas madre (Figuras 9D-E). En contraste con miocardio de contraccion pobre en corazones infartados no tratados, los corazones tratados con celulas madre demostraron funcionalidad sincronica recuperada del musculo cardfaco mediante el seguimiento por ecocardiograffa (Figura 10A). La reparacion estructural se tradujo en mejora en la fraccion de eyeccion global en el grupo tratado con celulas madre, un beneficio mantenido durante el periodo de observacion de cinco meses, sin evidencia de infiltrados inflamatorios (Figuras 10B-C) o arritmogenesis (Figura 10D).

Ejemplo 5 - Materiales y metodos para la obtencion de cardioprogenitores

Diferenciacion cardfaca dependiente de cuerpos embrioides. Se diferenciaron celulas madre de embriones murmicos en cuerpos embrionicos, con cardiogenesis monitorizada por epifluorescencia utilizando el anticuerpo de a-actinina (1:1,000) y microscopfa en vivo (Behfar et al., 2002, FAsEb J., 16:1558-1566; Perez-Terzic et al., 2003, Circ. Res., 92:444-452). El ArN fue procesado por Q-RT-PCR, en tiempo real utilizando el Light Cycler (Roche) y el kit QuantiTect SYBR Green (Qiagen), para cuantificar Nkx2.5 (cebadores de avance, reversos: 5'-TGC AGA AGG CAG TGG AGC TGG ACA AGC C-3' (SEQ ID NO:1), 5'-TTG CAC TTG TAG CGA CGG TTC TGG AAC CA-3' (SEQ ID NO:2)), MEF2C (5'-AGA TAC CCA CAA CAC ACC ACG CGC C-3' (SEQ ID NO:3), 5'-ATC CTT CAG AGA CTC GCA TGC GCT T-3' (SEQ ID NO:4)), GATA4 (5'-GGA ATT CAA GAT GAA CGG CAT CAA C-3' (SEQ ID NO:5), 5'- TGA ATT CTC AAC CTG CTG GCG TCT TAG A-3' (SEQ ID NO:6)) y pMHC (5'-GCC AAA ACA CCA ACC TGT CCA AGT TC-3' (SEQ ID NO:7), 5'-CTG CTG GAG AGG TTA TTC CTC G-3' (SEQ ID NO:8)) de expresion de ARNm normalizada a p-tubulina (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566).

Diferenciacion cardfaca libre de cuerpos embrioides. Una poblacion similar a endodermo visceral (Mummery et al., 2003, Circulation, 107:2733-2740) fue derivada a partir de celulas F9 (ATCC) con acido retinoico (1 |jM), dbcAMP (0.5 mM) y teofilina (0.5 mM). El medio condicionado fue obtenido despues de 24 horas de cultivo para estimular la cardiogenesis de celulas madre de embriones (cultivadas hasta 100 celulas/cm2) monitorizado por microscopfa confocal.

Aislamiento de celulas madre cardiopoyeticas. A partir de cuerpos embrionicos de 7 dfas, se aislaron celulas madre cardiopoyeticas por purificacion Percoll y se visualizaron a traves de examen confocal por laser utilizando MEF2C (1:400, Cell Signaling Technologies), Nkx2.5 (1:300), GATA4 (1:300, Santa Cruz Biotech), a-actinina (1:1,000, Sigma) y anticuerpos fosfo-Smad3 (1:2,000). Alternativamente cuando se recluto a partir de una monocapa de celulas madre de embriones la poblacion cardiopoyetica fue enriquecida utilizando un gradiente Percoll de doble interfase para separar cardiomiocitos de alta densidad ricos en sarcomeros (Perez-Terzic et al., 2003, Circ. Res., 92:444-452) a partir del fenotipo cardiopoyetico pobre en sarcomeros de densidad mas baja. La proliferacion y pureza de las celulas madre cardiopoyeticas fue establecida mediante microscopfa automatizada de fluorescencia de canal multiple de alto rendimiento ArrayScan (Cellomics) utilizando anticuerpos de MEF2C y a-actinina, junto con tincion con DAPI. Los perfiles de potencial de accion y las relaciones voltaje-corriente fueron tomados mediante electrofisiologfa de parche-pinza (Hodgson et al., 2004, Am. J. Physiol., 287:H471-H479). La dinamica del calcio fue seguida, en celulas cargadas con Fluo 4-AM, utilizando barrido en lmea confocal con laser (Perez-Terzic et al., 2003, Circ. Res., 92:444-452; Hodgson et al., 2004, Am. J. Physiol., 287:H471-H479).

Genomica. Los perfiles de expresion genetica comparativos de celulas madre de embriones versus las cardiopoyeticas o cardiomiocitos, asf como el endodermo no cebado versus el cebado con TNFa fueron obtenidos por hibridacion con ARNc marcado a la disposicion de genoma de raton 430 2.0 utilizando protocolos estandares (Affymetrix). Los datos fueron obtenidos con un GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix), y analizados con el software GeneSpring (Silicon Genetics). Los conjuntos de poblacion de datos fueron normalizados al fenotipo no diferenciado o no cebado, y la calidad se filtro para eliminar ruido de fondo antes de la aglomeracion jerarquica.

Proteomica. Las celulas endodermicas fueron cultivadas con GMEM libre de suero. El medio acondicionado derivado fue centrifugado, filtrado, cuantificado (ensayo de Bradford), concentrado (corte Amicon Ultra 5 kDa), y recuantificado para normalizacion volumetrica. El equivalente en protema de 5 ml de medio acondicionado fue resuspendido en regulador de enfoque isoelectrico (IEF) que contema urea (7 M), tiourea (2 M), CHAPS (2% p/v) y DeStreak (15 mg/ml, Amersham). Las protemas fueron resueltas en la primera dimension utilizando bandas IEF de gradiente de pH inmovilizadas (BioRad) a pH 3-10, 4-7 y 6-11, y en la segunda dimension mediante SDS-PAGE al 7.5% y 15%. Las protemas, visualizadas por tincion con plata, fueron aisladas, limpiadas de la tincion y digeridas con tripsina (Arrell et al., 2001, Circ. Res., 89:480-487) con peptidos extrafdos sometidos a espectrometna de masas en tandem con cromatograffa lfquida-ionizacion por electroaspersion (ThermoFinnigan LTQ). Las protemas fueron identificadas utilizando los algoritmos de busqueda SEQUEST y Mascot para el minado in silico de la base de datos SwissProt database. Las protemas identificadas fueron cuantificadas posteriormente con un ensayo inmunosorbente enlazado a enzima.

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Trasplante de celulas madre. Bajo anestesia con isofluorano, una ecocardiograffa en raton con una sonda de 15- MHz (Acuson) fue utilizada para guiar la administracion en miocardio de celulas madre de embriones o cardiopoyeticas manipuladas para seguimiento in situ (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566). El rendimiento cardfaco fue monitorizado por imagenes de ultrasonido en el eje corto parsternal con una sonda en modo M 2D en el eje largo. El analisis de ondas de pulso doppler y por electrocardiograffa de 12 cables (Hodgson et al., 2004, Am. J. Physiol., 287:H471-H479), e invasivamente con microcateterizacion intraventricular (Millar). Para histopatologfa, el tejido cardfaco recolectado fue fijado durante 1 hora en paraformaldelddo al 3%, seccionado en parafina, y sometido a recuperacion de antfgenos seguida por examen confocal utilizando el anticuerpo CFP para seguimiento celular (1:500, Molecular Probes) en combinacion con a-actinina para la visualizacion de sarcomeros y tincion nuclear con DAPI. La sobreexpresion restringida cardfaca transgenica de la citoquina TNFa fue lograda utilizando el promotor de cadena pesada de a-miosina enlazado al transgen TNFa (Sivasubramanian et al., 2001, Circulation, 104:826-831). Al perturbar el dominio de quinasa del receptor de TGF-p (ATGFpRII) o la sobreexpresion del inhibidor de BMP nogina se utilizo para reducir la capacidad de las celulas madre de embriones para responder a las claves cardiogenicas (Behfar et al., 2002, FaSeB J., 16:1558-1566).

Analisis estadfstico. La comparacion entre grupos fue llevada a cabo utilizando una prueba t estandar de variables con 95% de intervalos de confianza.

Ejemplo 6 - Obtencion de cardioprogenitores y su uso en la terapia con celulas madre

A pesar de su proclividad a la cardiogenesis, el riesgo del escape neoplasico de las senales cardiogenicas ha hecho que la terapia con celulas madre de embriones (ES) sea controvertida, necesitando el descubrimiento de una alternativa segura (Chien et al., 2004, Science, 306:239-240; Menasche, 2004, Nat. Biotechnol., 22:1237-1238; Foley & Mercola, 2004, Trends Cardiovasc. Med., 14:121-125; Kehat et al., 2004, Nat. Biotechnol., 22:1282-1289; Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566). Dentro de la continuacion de la diferenciacion celular de embriones, la sobrerregulacion de factores de transcripcion cardfacos (por ejemplo, Nkx2.5, MEF2C y GATA4) (Srivastava & Olson, 2000, Nature, 407:221-226) precedio a la expresion de genes sarcomericos (por ejemplo, pMHC) distinguiendo el proceso de la predeterminacion cardfaca en el cuerpo embrioide temprano (Figura 11 A). La diseccion del cuerpo embrioide durante esta ventana cardiopoyetica descubrio una poblacion de celulas precursoras que demostro la importacion nuclear de factores de transcripcion que grnan la diferenciacion cardfaca por aislamiento a partir de su origen mesodermico derivado de celulas madre de embriones (Figuras 11B-C). Las celulas madre cardiopoyeticas capturadas estaban en ruta a la maduracion, experimentando miofibrilogenesis para formar cardiomiocitos con contraccion (CM; Figura 11D). La diseccion ultraestructural con desconvolucion a nanoescala subcalifico el estado transicional de celulas madre cardiopoyeticas durante la metamorfosis cardiogenica a partir de un fenotipo de alta relacion nucleo a citosol, tfpico de las celulas madre de embriones, hacia la adquision de estructura cardfaca estriada (Figuras 11e-f). Con un perfil gen/protema distinguible de la fuente pluripotente o de la progenie de cardiomiocitos (vease, por ejemplo, Tabla 1), la huella molecular de las celulas madre cardiopoyeticas indico un compromiso definitivo con el programa cardfaco (Figuras 11G-H). La subregulacion de los marcadores pluripotentes (por ejemplo, Oct4) (Nichols et al., 1998, Cell, 95:379-391) y oncogenos (por ejemplo, BRCA1, MYC) (Shachaf et al., 2004, Nature, 431:1112-1117) junto con la activacion de rutas cardiogenicas, que preceden la expresion de la maquinaria de excitacion-contraccion, aseguraron la conversion desde un estado no diferenciado tumorigenico al acoplamiento en una lmea celular espedfica cardfaca (Figura 11 H).

Tabla 1. Marcadores presentes en celulas madre de embriones, celulas madre cardiopoyeticas, y cardiomiocitos

Gen/nombre de protema

Expresion ESC Expresion CSC Expresion CM

Oct4

+ + -

DEK

+ + + -

BRCA1

+ + + -

Ect2

+ + + -

MYC

+ + + -

Fosb

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NRAP

- + + +

MEF2A

- + + +

Furina

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TGBp1

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Receptor a de fibronectina

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Receptor 1 de dominio de discoidina

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bag2

- + + +

Protema rica en cistema

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CUGBP2

- + + +

NDRG4

- + + +

Protema 1 inhibidora CBP/p300

- + + +

Protema 1 inducible por interferon

- + + +

Tropomiosina 1, alfa

- + + +

Protema 1 activadora de Rho GTPasa

- + + +

Carboxipeptidasa D

- + + +

Profilina 2

- + + +

Transcripto 1 inducido por el factor beta 1 de transformacion de crecimiento

- + + +

Tropomiosina 1, alfa

- + + +

Receptor de la hormona de crecimiento

- + + +

Vinculina

- + + +

Adenilato ciclasa 6

- + + +

Protema A1 de enlazamiento de calcio S100

- + + +

Tropomiosina 2, beta

- + + +

Protema 1 de enlazamiento de retinol, celular

- + + +

Moesina

- + + +

Anexina A6

- - + +

Factor de crecimiento de tejido conectivo

- - + +

Smad6

- - + +

Canal de Na+

- - + +

Canal de Ca2+ tipo L

- - + +

Ca2+ ATPasa

- - + +

MLC2V

- - + +

MLC2a

- - + +

a-MHC

- - + +

a-actina

- - + +

a-actinina

- - + +

Troponina T2

- - + +

Titina

- - + +

Protema 2A integral de membrana

- + + -

Protema 4 de enlazamiento del factor de crecimiento similar a insulina

- + + -

Antigeno 1 de celula de timo, theta

- + + -

Selenoprotema P, plasma, 1

- + + -

Glicoprotema 38

- + + -

Sustrato 8 de la ruta del receptor del factor de crecimiento epidermico

- + + -

Protema 1A de choque por calor

- + + -

Protema 1 de enlazamiento de acido retinoico celular

- + + -

8 especifica de placenta

- + + -

Matriz de metaloprotemasa 2

- + + +

Glicoprotema rica en cistema acida secretada

- + + +

Manosidasa 1, alfa

- + + +

Lectina, enlazamiento de galactosa, soluble 1

- + + +

Protema A6 de enlazamiento a calcio S100 (calciclina)

- + + +

Epoxido hidrolasa 1, microsomica

- + + +

1 similar a gen de adenoma pleiomorfico

- + + +

Factor 2 de crecimiento similar a insulina

- + + +

Protema 4 similar a protema Tubby

- + + +

Protema prion

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Protema 10 de enlazamiento a FK506

- + + + +

Ciclina D2

- + + + +

Reticulocalbina 3, dominio de enlazamiento a calcio del lado EF

- + + + +

Selenoprotema M

- + + + +

Inhibidor 1A (P21) de quinasa dependiente de ciclina

- + + + +

Caldesmon 1

- + + + +

Beta 1 integrina (receptor beta de fibronectina)

- + + + +

Transcobolamina 2

- + + + +

Anexina A2

- + + + +

Inhibidor 1A (P21) de quinasa dependiente de ciclina

- + + + +

Trombospondina 1

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Monocito para macrofago asociado con diferenciacion

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Receptor AXL de tirosina quinasa

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Anexina A5

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2 similar a enlazamiento a musculo

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Anexina A1

- + + + +

Procolageno, tipo IV, alfa 1

- + + + +

Calpaina 2

- + + + +

Protema 1 de membrana epitelial

- + + + +

Proteasa, serina, 11

- + + + +

Tropomiosina 2, beta

- + + + +

Lectina, enlazamiento a galactosa, soluble 9

- + + + +

Anexina A3

- + + + +

En el embrion, la transformacion ca^aca del mesodermo requiere senalizacion endodermica (Foley & Mercola, 2004, Trends Cardiovasc. Med., 14:121-125; Srivastava & Olson, 2000, Nature, 407:221-226). La cardiopoyesis fue alojada en cuerpos embrioides por la reprogramacion del factor alfa de necrosis tumoral de citoquina (TNFa) (Locksley et al., 2001, Cell, 104:487-501), segun se demostro a traves de la expresion sobrerregulada de los factores de transcripcion, aceleracion de la cardiogenesis y contenido cardfaco incrementado (Figuras 12A-D). El maximo entre el dfa 2 y el d^a 5 de la diferenciacion de los cuerpos embrioides (Figura 12E), el efecto de TNFa sobre la cardiogenesis manifestado como una duplicacion de la concentracion de protema dentro del secretoma endodermico (Figura 12F). La aplicacion del medio condicionado derivado de la diferenciacion vigorosa guiada por el endodermo cebado con TNFa de celulas madre de embriones pluripotentes directamente en celulas madre cardiopoyeticas, eliminando la necesidad de transito a traves de un cuerpo embrioide (Figuras 12G-J). Las celulas madre cardiopoyeticas derivaron en actividad mitotica mantenida extraembrion, expansion y resiliencia clonal a estres hipoxico (5% de O2), remanentes de su fuente embrionica, si bien adquirieron inhibicion por contacto y pudieron generar reproduciblemente sarcomeros para completar el programa cardfaco (Figura 12K). De esa manera, las celulas madre cardiopoyeticas proveyeron una fuente renovable que produjo cardiomiocitos funcionales con transientes de calcio, corriente de iones y actividad potencial de accion, demostrativa del fenotipo cardfaco sin evidencia de desdiferenciacion (Figuras 12L-O).

La amplificacion por TNFa de la cardiopoyesis (Figuras 12F-J) fue debida a una redistribucion del contenido de protema secretada endodermica (Figuras 13A-D). En particular, un coctel de mas de doce protemas dentro del secretoma endodermico fue encontrado subregulado, variando desde factores involucrados en la sarcomerogenesis (profilina, cofilina) (Obinata et al., 1997, Cell Struct. Funct., 22:181-189; Mohri et al., 2000, J. Muscle Res. Cell. Motil., 21:49-57), senalizacion de calcio (calciclina) (Edgeworth et al., 1989, Nature, 342:189-192), reprogramacion del miocardio (NDPK) (Lutz et al., 2004, Methods Enzymol., 390:403-418) y formacion cardfaca (FKBP12, cistatina, ubiquitina) (Xin et al., 2002, Nature, 416:334-338; Smart et al., 2002, Gene Expr. Patterns, 2:61-67; Kwon et al., 2002, Science, 297:96-99) hasta factores de crecimiento cardiogenicos potentes incluyendo miembros de la superfamilia TGF-p y FgF (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566; Mummery et al., 2003, Circulation, 107:2733-2740), catalogados por sondeo proteomico y/o genomico (Figuras 13A-D). La cuantificacion de protemas secretadas por el endodermo confirmo el perfil generado del coctel cebado por TNFa, ejemplificado por el ensayo inmunosorbente enlazado a enzimas de TGF-p cuyos niveles fueron corroborados adicionalmente por activacion de la senalizacion intracelular de P-Smad3 (Daniels et al., 2004, J. Clin. Invest., 114:1308-1316) en celulas madre que experimentan cardiopoyesis (Figuras 13E-F). La suplementacion del medio acondicionados no cebado derivado de endodermo con TGF-p, titulado para coincidir con la sobrerregulacion inducida por TNFa, estimulo a las celulas madre cardiopoyeticas purificadas para proliferar y diferenciarse (Figuras 13G-H). La identificacion de los componentes dentro del secretoma endodermico facilito asf la manipulacion de la cardiopoyesis, facilitando la conmutacion de la pluripotencia a la transformacion cardiogenica para la produccion a macroescala de celulas madre cardiopoyeticas ex vivo.

El valor terapeutico del uso de las celulas madre cardiopoyeticas fue establecido in vivo por trasplante guiado por ecocardiograffa. Cargas de <3x 105 celulas pluripotentes por corazon llevo a la incorporacion de cardiomiocitos derivados de celulas madre de embriones en musculo cardfaco correceptor (Figuras 14a-c), pero los incrementos en

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la dosis celular precipitaron la invasion neoplasica (Figuras 14D-F) demostrando el bajo mdice terapeutico del tratamiento basado en celulas madre de embriones. En contraste, la administracion de >3x 106 celulas madre cardiopoyeticas, reclutadas in vitro a partir de una monocapa de celulas madre de embriones utilizando el medio cardiogenico identificado aqm (Figura 14G), dio como resultado el acoplamiento electricomecanico en el corazon receptor con rendimiento contractil robusto que refleja el alineamiento exitoso de las celulas trasplantadas dentro del miocardio (Figuras 14H-J). En efecto, las celulas madre cardiopoyeticas trasplantadas experimentaron de manera reproducible diferenciacion cardfaca e insercion extensiva dentro del miocardio anfitrion, sin evidencia de formacion de tumores por examen histopatologico (Figuras 14K-M). En efecto, el uso de celulas madre cardiopoyeticas sobrepaso los resultados terapeuticos maximos obtenibles con la administracion de celulas madre de embriones (Figura 14N). El impedimento de la cardiopoyesis a traves de la ablacion genetica de la capacidad de la celulas madre para reconocer los componentes del medio (por ejemplo TGFp/BMP) exagero el riesgo de tumorigenesis (Figura 14o). Por el contrario, la sobreexpresion de TNFa transgenico restringido cardfaco (TNFa-TG) aumento la capacidad cardiogenica del corazon anfitrion (Figura 14o recuadro) y redujo el riesgo de carcinogenesis por trasplante de celulas madre de embriones (Figura 14o), demostrando que el mimetismo de la cardiopoyesis puede ser logrado in situ.

La promesa de celulas madre de embriones en esta era de la medicina regenerativa ha permanecido sin satisfacer, limitada por la propension a la transformacion carcinogenica inherente a la pluripotencia. Este impase, que evita la aplicacion terapeutica, ha sido resuelto aqm por reclutamiento espedfico del linaje de un intermediario derivado de celulas madre de embriones para servir como una alternativa segura y eficaz. El paradigma de perfeccionar la plasticidad celular para anular el riesgo maligno provee asf de un medio mediante el cual se evitan los inconvenientes de la terapia con celulas madre de embriones.

Ejemplo 7 - Componentes de un medio cardiogenico

Con base en los experimentos antes descritos, se determinaron los siguientes componentes para ser derivados endodermicos: caspasa-4; ligando 1 de quimioquina; ligando 2 de quimioquina; ligando 5 de quimioquina; ligando 7 de quimioquina; ligando 11 de quimioquina; ligando 20 de quimioquina; hepatoglobina; factor 1 estimulador de colonias; lectina; colesterol 25-hidroxilasa; sintaxina 8; sintaxina 11; ceruloplasmina; componente 1 de complemento; componente 3 de complemento; factor de crecimiento derivado de plaquetas; integrina alfa 6; lipasa 1 acida lisosomica; factor inhibidor de leucemia; factor 1 de crecimiento de insulina; interleucina 6; beta-2 microglobulina**; ubiquitina; factor inhibidor de la migracion de macrofagos; acido retinoico; TGF-p1; TGF-p2; BMP1; BMP2; BMP4; BMP5; BMP6; FGF4; FGF5; FGF12; FGF13; FGF15; FGF20; VEGF C; cofilina; ciclofilina A; FKBP12; NDPK; profilina 1; cistatina C; calciclina; y ubiquitina.

Se genero un medio cardiogenico que contema la cantidad indicada de cada componente: TGF-p1 (2.5 ng/ml); TGF- p2 (2.5 ng/ml); BMP-1 (5 ng/ml); BMP-2 (5 ng/ml); BMP-5 (5 ng/ml); BMP-6 (5 ng/ml); FGF-4 (10 ng/ml); FGF-5 (10 ng/ml); FGF-12 (10 ng/ml); FgF-13 (10 ng/ml); FGF-15 (10 ng/ml); FGF-20 (10 ng/ml); factor inhibidor de leucemia (1000 U/ml); VEGF-C (15 ng/ml); e interleucina 6 (100 ng/ml).

Los siguientes componentes fueron agregados de manera exogena al derivado de endodermo descrito mas arriba. IGF-1 (50 ng/ml); IL-6 (100 ng/ml); FGF-4 (10 ng/ml); TGFp (25 ng/ml); BMP (5 ng/ml); LIF (100 U/ml); y ha-trombina (40 nM).

En resumen, el medio cardiogenico descrito aqm contiene 54 componentes; 47 componentes que son derivados de endodermos y 7 componentes que son agregados por via exogena.

Ejemplo 8 - Materiales y metodos adicionales

Cultivo de celulas madre de embriones y diferenciacion del cuerpo embrioide. Las lmeas de celulas madre embrionicas murmicas pluripotentes (por ejemplo, CGR8, D3, 129 y R29) fueron propagadas en medio GMEM con piruvato, aminoacidos no esenciales, mercaptoetanol, suero de ternera fetal al 7.5% (FCS) y factor inhibidor de la leucemia (LIF, ESGRO), tal como fue descrito (Terzic et al., 2003, Circ Res., 92:444-452; Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566). Las celulas fueron divididas cada dos dfas para mantener el estado no diferenciado o diferenciado utilizando el metodo de “gota colgante” (Terzic et al., 2003, Circ Res., 92:444-452; Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566). Las gotas de medio diferenciacion (GMEM con selenio, piruvato, aminoacidos no esenciales, mercaptoetanol, FCS al 20%, sin LIF) que conteman celulas madre de embriones, fueron colocadas durante dos dfas en una placa tapa para permitir la organizacion del cuerpo embrioide. Los cuerpos embrioides, suspendidos durante tres dfas, fueron sembrados sobre placas recubiertas con gelatina durante siete dfas. La formacion de areas de contraccion en el mesodermo fueron monitorizadas con microscopfa, estableciendose el contenido cardfaco mediante el anticuerpo de a-actinina sarcomerico cardfaco monoclonal (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566).

Disociacion y caracterizacion embrioide. Los cuerpos embrioides, en diferentes etapas de diferenciacion, fueron desprendidos de las placas con tripsina al 0.05%, y disociados utilizando 1 mg/ml de colagenasa (CLSII, Worthington) y 0.25 mg/ml de pancreatina en (en mmol/L) NaCl 117, HEPES 20, NaH2PO4 1.2, KCl 5.4, MgSO4 1 y glucosa 5 (pH 7.35) (Terzic et al., 2003, Circ Res., 92:444-452). Las suspensiones de celulas de cuerpos embrioides

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fueron caracterizadas en cuanto al contenido de progenitores mediante sondeo inmunofluorescente confocal ademas de microscopfa con v^deo. La purificacion de celulas madre cardiopoyeticas y de cardiomiocitos fue lograda a traves del uso de un gradiente de densidad Percoll de dos capas discontinuo con base en sus propiedades masa a volumen (cardiomiocitos - D=1.07/1.09; cardiopoyeticos-D=1.07/1.09 primero, luego D=1.05/1.09). La misma metodologfa puede ser aplicada para purificar celulas madre cardiopoyeticas y cardiomiocitos siguiendo la diferenciacion guiada de monocapas de celulas madre de embriones. Para monitorizar la division celular, las celulas purificadas fueron cultivadas en una camara a temperatura y gas controlados (37°C, 5% de CO2), dispuesta sobre la platina de un microscopio acoplado con camara cCd, con adquisicion seriada de imagenes de contraste de fases.

Inmunohistoqmmica e inmunofluorescencia. Las celulas madre de embriones, las celulas madre cardiopoyeticas y los cardiomiocitos derivados, cultivados sobre portaobjetos fueron enjuagados con solucion salina regulada con fosfato (PBS), fijados en paraformaldefndo al 3% (PFA) y permeabilizados con 0.1% de TritonX-100. Para prevenir la tincion no especifica, las laminas fueron incubadas con un regulador de bloqueo (Superblock™, Pierce Biotech) despues de la fijacion. El regulador de bloqueo fue retirado, y los anticuerpos fueron agregados (Nkx2.5 1:400; MEF2C 1:500; GATA4 1:300; a-actinina 1:1000; canal de Ca2+ tipo L 1:400; Cx43 1:500; Kir6.2 1:500; GFP 1:400) durante la noche a 4°C. Al dfa siguiente, los anticuerpos primarios fueron enjuagados utilizando regulador, y se aplicaron los anticuerpos secundarios conjugados con ALEXA (1:500). El anticuerpo secundario fue enjuagado utilizando regulador de lavado y el ADN con tincion con DAPI fue incubado antes del montaje. La excitacion fluorescente de los componentes celulares tenidos fue lograda mediante el uso concurrente de lmeas de laser UV (350-370 nm), Arg/Kry (488 nm), y HeNe (568, 633 nm) para microscopfa confocal basada en Meta multicolor (Zeiss). Las imagenes adquiridas fueron analizadas utilizando el software Axioplan (Zeiss). Adicionalmente, la proliferacion de celulas madre cardiopoyeticas y su pureza fue establecida mediante microscopfa automatizada de fluorescencia multicanal de alto rendimiento ArrayScan (Cellomics) utilizando los anticuerpos MEF2C y a-actinina, junto con la tincion con DAPI.

Aislamiento de ARN y perfil genomico. El ARN total fue aislado a partir de los cuerpos embrioides, asf como de celulas madre de embriones y luego fue derivado a partir de celulas madre cardiopoyeticas y de la progenie de celulas cardfacas utilizando el kit de aislamiento Micro-to-Midi (Invitrogen). El ARN total tambien fue obtenido a partir de las celulas endodermicas cebadas con TNFa y no cebadas. Las muestras de ARN fueron analizadas utilizando microarreglos Affymetrix en donde los perfiles de expresion genetica comparativos de los cuerpos embrioides, asf como las celulas madre de embriones versus las cardiopoyeticas o de cardiomiocitos, y en estudios separados endodermos no cebados versus cebados con TNFa fueron obtenidos mediante hibridizacion de ARNc al genoma de raton 430 2.0 con el arreglo utilizando protocolos estandar (Affymetrix). Los datos fueron adquiridos con un GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix), y analizados con el software GeneSpring (Silicon Genetics). Los conjuntos de poblacion de datos fueron normalizados al fenotipo no diferenciado o no cebado y filtrados por calidad para eliminar ruido de fondo antes de la aglomeracion jerarquica. Los datos fueron confirmados sometiendo el ARN total de la muestra a Q-RT-PCR en tiempo real, utilizando cebadores que especifican la identidad de cada gen (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566).

Electroforesis en gel en dos dimensiones. Para resolver el fenotipo proteomico de celulas madre cardiopoyeticas versus su fuente y progenie las protemas celulares fueron solubilizadas utilizando regulador de enfoque isoelectrico (IEF) (urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS al 2%, con concentraciones de protema determinadas por ensayo de protemas. La electroforesis en gel bidimensional (2-DE) fue llevada a cabo en la primera dimension (IEF) utilizando una celda Protean® IEF (Bio-Rad). Las muestras de protema fueron agregadas a 300 pl de regulador IEF, suplementadas con DTT (ditiotreitol) y anfolitos (Bio-Rad), y luego fueron tomadas por rehidratacion activa en Ready Strips™ inmovilizados con gradiente de pH (IPG) (bandas de gradiente lineal de 170 mm, pH 3-10 o 4-7, Bio-Rad) a 50 voltios (V) durante 10 horas. Siguio luego la IEF, utilizando una serie de etapas de rampa de voltaje rapidas durante 15 minutos cada una a 100, 500, y 1000 V, seguidas por 10000 V para 60 kiloV-h. Una variacion de este proceso utilizando rehidratacion pasiva fue utilizada para IEF de protemas basicas (pH 6-11). Antes de la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida en segunda dimension (SDS-PAGE), las bandas IPG enfocadas fueron equilibradas en un proceso de dos etapas para asegurar la solubilidad de la protema, primero por incubacion en regulador de equilibrio (Tris-HCl 50 mM, pH 8.8, urea 6 M, glicerol al 30% v/v, SDS al 2% p/v), suplementado con 10 mg/ml de DTT, seguido por incubacion en regulador de equilibrio suplementado con 25 mg/ml de yodo acetamida. Las bandas fueron enjuagadas entonces con regulador SDS-PAGE (Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8.3, SDS al 0.1% p/v), y las protemas fueron resueltas por SDS-PAGE al 12.5% utilizando un sistema Protean® II Xi (Bio-Rad). Despues de la SDS-PAGE, los geles de 2-D fueron tenidos con plata para compatibilidad con el analisis subsecuente de protema por espectrometna de masas (Shevchenko et al., 1996, Anal. Chem., 68:850-858). Utilizando el software de analisis de gel proPDQuest 2-D (Bio-Rad), los geles tenidos con plata fueron barridos, detectandose las manchas de protema, cuantificandose, comparandose con manchas en otros geles, normalizandose y analizandose estadfsticamente para determinar la presencia y grado de cambios en los perfiles de expresion de protema en las diferentes etapas de la diferenciacion cardfaca. Las manchas de protema de interes fueron aisladas y destenidas (Gharahdaghi et al., 1999, Electrophoresis, 20:601-605) para asegurar la remocion de plata, luego se digirieron con tripsina, se extrajeron, se secaron bajo vacm y se almacenaron a -20°C para el analisis espectrometrico de masas.

Espectrometna de masas en tandem. Los peptidos tnpticos aislados a partir de manchas en gel de 2-D individuales fueron reconstituidos y resueltos por cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC) sobre una columna de fase

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reversa (RP) C18. Los peptidos fueron eludidos de la columna de RP-HPLC con un gradiente creciente de acetonitrilo, y electroasperjados en un espectrometro de masas de trampa de iones Finnigan LCQ Deca (Thermo Finnigan). Los espectros de los peptidos eludidos fueron adquiridos en una forma dependiente de datos adquiriendo primero un barrido de MS completo a partir de m/z (relacion masa/carga) 150 a 2000 seguido por barridos MS/MS hasta m/z 2000 para determinar la secuencia de aminoacidos despues de la disociacion inducida por colision de los peptidos que proveen los iones mas intensos del barrido de MS completo previo. Los espectros MS/MS fueron comparados contra las bases de datos no redundantes SwissProt o NCBI utilizando los algoritmos de busqueda SEQUEST y Mascot para buscar tanto los estados de carga 2+ y 3+ de los peptidos fragmentados. Los resultados de cada algoritmo fueron referenciados de manera cruzada, proveyendo un analisis mas robusto de lo que lo hana el algoritmo solo (Sadygov et al., 2004, Nature Meth., 1:195-202).

Inmunoprecipitacion Western. La expresion de protemas individuales fue sondeada despues de la recoleccion celular utilizando 100 pl de regulador RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Triton X-10 al 1%, desoxicolato de sodio al 0.5%, SDS al 0.1%, pH 8.0) que contema inhibidores de proteasa. Las muestras fueron ensayadas en cuanto a la concentracion de protemas y se creo una solucion de reserva de trabajo que contema 4 mg/ml diluyendo la muestra en un regulador Laemmli 2x. Las muestras fueron calentadas a 95°C y se cargaron 4060 pg de protema total sobre un gel de SDS-PAGE al 10% y se sometio a electroforesis. Las protemas fueron transferidas sobre membranas de nitrocelulosa utilizando condiciones de transferencia semiseca o humeda. Despues de la transferencia, las membranas fueron incubadas con 10 ml de regulador de bloqueo (1x TBS, Tween- 20 al 0.1%, leche en polvo desnatada al 5% (p/v), pH 7.5) a temperatura ambiente y luego se incubaron con un anticuerpo primario (1:1,000) diluido en solucion primaria (1x TBS, Tween-20 a 0.1%, leche en polvo desnatada al 1% (p/v), pH 7.5). El anticuerpo secundario (1:10,000) constituido en la solucion primaria fue agregado al dfa siguiente despues de enjuagar el primario con regulador de lavado (1x TBS, Tween-20 al 0.1%, pH 7.5). Las inmunoprecipitaciones Western fueron desarrolladas utilizando el kit de quimioluminiscencia Pierce y visualizadas utilizando un UVP Bioimager.

Parche-pinza. La actividad electrica de la membrana fue determinada por el registro mediante parche-pinza en la configuracion de celda total utilizando el modo corriente- o voltaje-pinza (Axopatch 1C, Axon Instruments). Los perfiles potenciales de accion y la relacion voltaje-corriente fueron tomados y analizados con el software Bioquest de las celulas en diferentes etapas de diferenciacion y maduracion cardfaca, superfusionadas con solucion Tyrode (en mM: NaCl 137, KCl 5.4, CaCl2 2, MgCh 1, HEPES 10, glucosa 10; pH 7.4 con NaOH) utilizando pipetas de parche (5-10 MQ) que contema (en mM) KCl 140, MgCh 1, HEPES 10, EGTA 5, y suplementado con ATP 5 mM (pH 7.2 ajustado con KOH). Las mediciones electrofisiologicas fueron llevadas a cabo a 31±1°C utilizando un controlador de temperatura (HCC-100A, Dagan Corp.) equipado con un termopad Peltier (1,10).

Imagenes de calcio. Las imagenes confocales bidimensionales (Zeiss LSM 510 Axiovert) de celulas madre que experimentaban transformacion y maduracion cardfaca, y cargadas con la sonda Ca2+ fluorescente Fluo3-AM (Molecular Probes), fueron adquiridas mediante microscopfa confocal con laser con la lmea 488 nm de un laser argon/cripton. Las imagenes fueron sometidas a desconvolucion y analizadas utilizando el software Metamorph (Visitron Universal Imaging) (Terzic et al., 2003, Circ Res., 92:444-452; Hodgson et al., 2004, Am. J. Physiol., 287:H471-H479).

Microscopfa electronica de trasmision/barrido con emision de campo y de fuerza atomica. Celulas en diferentes etapas de diferenciacion cardfaca fueron fijadas en PBS con glutaraldehfdo al 1% y formaldehido al 4% (pH 7.2). Para la microscopfa electronica trasmitida (TEM) las celulas fueron procesadas en OsO4 al 1% regulado con fosfato, tenidas con acetato de uranilo al 2%, deshidratadas en etanol y oxido de propileno, y embebidas en resina epoxica. Se colocaron secciones delgadas (90-nm) en rejillas de cobre, se tineron con citrato de plomo, y se tomaron micrograffas con un microscopio electronico JEOL (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566). Para la microscopfa electronica de barrido con emision de campo (FESEM), la membrana de plasma fue depurada utilizando una solucion hipotonica y Triton X-100 al 1%. Las celulas depuradas de la membrana o los cuerpos embrioides completos fueron fijados con glutaraldehfdo al 1% y formaldehido al 4% en PBS. Los espedmenes fueron enjuagados en PBS con osmio al 1%, deshidratados con etanol y secados en un secador de punto cntico (Ted Pella). Recubiertas con platino, las muestras fueron examinadas sobre un microscopio de barrido Hitachi. La microscopfa de fuerza atomica en modo de contacto (AFM) fue llevada a cabo con puntas de nitruro de silicio NP-S (constante de depuracion: 0.58 N/m) utilizando un controlador Nanoscope III (Digital Instruments) (Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566). Las celulas depuradas de membrana de plasma fueron fijadas in situ y enjuagadas con agua nanopura y secadas con aire. Se utilizo un escaner tipo E, con frecuencias de barrido lineales (5-15 Hz) para construir imagenes de AFM de 512x512 pfxeles. Los datos fueron analizados con el software Nanoscope IIIa, y las imagenes tridimensionales se generaron a partir de la informacion de altura topografica.

Seguimiento de celulas in vivo. Los clones de celulas madre de embriones fueron manipulados para expresar bien sea la protema fluorescente verde (GFP), la protema fluorescente cian potenciada (ECFP) o la lacZ citosolica (o nuclear) bajo el control del promotor de a-actina o a-miosina espedfico cardfaco corriente arriba del gen reportador (Clontech). Para seguir el destino de las celulas, los genes reportadores fueron subclonados corriente abajo del promotor 5'LTR del virus de las celulas madre murmicas modificadas (MSCV) o el promotor de la fosfoglicerato quinasa murmica (PGK), para una expresion estable y robusta postrasplante. Los constructos fueron linealizados, e introducidos en celulas madre de embriones por transfeccion con lipofectamina (Invitrogen) (Terzic et al., 2003, Circ

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Res., 92:444-452; Behfar et al., 2002, FASEB J., 16:1558-1566). Alternativamente, el gen reportado fue empacado en un sistema retroviral MMLV para una incorporacion de alto rendimiento en las celulas madre de embriones.

Modelo de infarto del miocardio. El infarto fue generado por ligazon de la arteria coronaria izquierda (LCA) despues de intubacion endotraqueal, ventilacion y toracotoirna en ratones, C57BL/6. La oclusion coronaria fue confirmada por inspeccion aguda del cambio de color de la pared del ventnculo izquierdo, y elevacion ST en el electrocardiograma antes del cierre del torax. Los ratones operados en simulacion sufrieron el mismo procedimiento quirurgico sin ligazon de LCA. Esta experiencia revela una mortalidad <10% relacionada con la cirugfa. Los ratones infartados recibieron diversos regfmenes de celulas madre, y fueron seguidos durante 1 a 12 meses. En un conjunto separado de experimentos, ratones deficientes en canales de Katp, generados por perturbacion direccionada del gen Kir6.2 y retrocruzados durante cinco generaciones con un fondo C57BL/6, seran comparados con ratones de control coincidentes en edad y sexo (Seino & Miki, 2003, Prog. Biophys. Mol. Biol., 81:133-176). Todos los ratones reciben alimentacion estandar, con un ciclo de 12 horas dfa/noche y fueron observados diariamente hasta la terminacion de los estudios.

Funcion cardfaca. La fraccion de eyeccion ventricular izquierda y el acortamiento fraccional fueron cuantificados por ecocardiograffa en el animal despierto (Acuson c256) (Kane et al., 2004, Diabetes, 53:S169-175). Los registros de presion ventricular izquierda in vivo se miden de manera invasiva mediante un cateter de micropresion 1.4-F (SPR- 671, Millar Instruments) despues de la incanulacion arterial carotida y avance a traves de la valvula aortica.

Remodelacion ca^aca. Las dimensiones de la camara ventricular izquierda y el espesor de la pared fueron cuantificadas in vivo por ecocardiograffa transtoracica en ratones despiertos con un transductor lineal a 15-MHz (Acuson c256) (Kane et al., 2004, Diabetes, 53:S169-175). El peso total del corazon, y el ventnculo izquierdo incluyendo el septum (LV) fueron pesados ex vivo y normalizados al peso corporal. El LV fue entonces: i) fijado en formalina al 10%, embebido en parafina, y tenido con hematoxilina/eosina y tricromo de Masson para microscopfa de luz. El area transversal de los miocitos, la fibrosis intersticial y perivascular fueron cuantificadas utilizando el software MetaMorph; ii) la ultraestructura de los miocitos fue examinada por microscopfa electronica de transmision/barrido; iii) los miocitos fueron tenidos para marcacion terminal en muesca de dUTP mediada por desoxinucleotidil transferasa (TUNEL) y caspasa 3, y experimentaron una prueba de escalamiento de ADN para apoptosis; iv) el contenido de colageno en el miocardio fue medido por el ensayo de hidroxiprolina.

Electrocardiograffa. Los electrocardiogramas fueron registrados telemetricamente en ratones conscientes sin ataduras a partir de trasmisores implantados quirurgicamente (Data Sciences International) (Terzic et al., 2003, Circ Res., 92:444-452; 10). Ademas, los electrocardiogramas de superficie con 12 cables fueron registrados en ratones anestesiados ligeramente con isofluorano.

Analisis estadfstico. La comparacion de los parametros entre grupos distribuidos normalmente fue llevada a cabo utilizando la prueba t de Studen o el analisis de varianza. La prueba de Kruskal-Wallis fue utilizada para comparar los datos no parametricos. El procedimiento del rango multiple de Duncan fue utilizado para ajustar comparaciones multiples. El analisis de Kaplan-Meier con la prueba de calificacion logantmica fue empleado para el analisis de supervivencia. Una diferencia en p<0.05 se considera significativa.

Otras realizaciones

Debe entenderse que aunque la invencion se ha descrito junto con su descripcion detallada, la descripcion anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invencion, que esta definida por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones estan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (3)

1. Reivindicaciones

   1. Un medio cardiogenico que comprende un medio de cultivo condicionado, en donde el medio de cultivo condicionado se obtiene

   cultivando celulas endodermicas ventrales en medio con el fin de generar el medio de cultivo condicionado,

   5 caracterizado porque las celulas endodermicas ventrales son de un embrion no humano que ha sido tratado con TNF-a.
2. 2. El medio cardiogenico de la reivindicacion 1, en donde el medio comprende ademas uno o mas componentes que se seleccionan del grupo que consiste en IGF-1, IL-6, FGF-4, TGF-p, BMP, LIF y ha-trombina.
3. 3. El medio cardiogenico de la reivindicacion 2, en donde el medio comprende los siguientes componentes 10 adicionales IGF-1 (50 ng/ml), IL-6 (100 ng/ml), FGF-4 (10 ng/ml), TGF-p, (25 ng/ml) BMP (5 ng/ml), LIF (100 U/ml), y

   ha-trombina (40 nM).