ES2927176T3

ES2927176T3 - FSTL1 para su uso en la reparación de tejido cardiaco

Info

Publication number: ES2927176T3
Application number: ES16777438T
Authority: ES
Inventors: Pilar Ruiz-Lozano; Mark Mercola; Ke Wei
Original assignee: Regencor Inc; Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Current assignee: Regencor Inc; Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2022-11-03
Anticipated expiration: 2036-04-08
Also published as: DK3280429T3; EP4088733A1; CN108601810A; US20200345851A1; CN108601810B; US10682416B2; EP3280429A4; WO2016164840A1; AU2023214306A1; AU2016246070A1; AU2020204541A1; JP7190711B2; US20180092980A1; CA2982179A1; JP2023018119A; JP2021046441A; CN115417921A; EP3280429A1; JP2018512456A; JP6839393B2

Abstract

En el presente documento se proporcionan, entre otras cosas, composiciones y kits que comprenden factores paracrinos derivados del epicardio (tales como folli statin-like 1 hipoglucosilado (FSTL1)) para tratar y reparar el daño al tejido cardíaco causado por enfermedad cardiovascular, infarto de miocardio (IM), otros eventos isquémicos, o deficiencia de crecimiento cardiaco, así como métodos para usar los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

FSTL1 para su uso en la reparación de tejido cardiaco

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/145.480, presentada el 9 de abril de 2015 y la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/196.766, presentada el 24 de julio de 2015.

Campo de la invención

Esta invención se refiere, entre otros, a composiciones que comprenden factores paracrinos derivados del epicardio, así como al uso de las mismas para tratar o prevenir el daño al tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) tras acontecimientos isquémicos tales como infarto de miocardio.

Antecedentes

El infarto agudo de miocardio (IAM) es una de las principales causas de muerte en el mundo occidental y muchos factores de riesgo, tanto ambientales como genéticos, contribuyen a su patogenia. El corazón carece generalmente de una capacidad regenerativa endógena suficiente para la reparación después de una lesión. La remodelación del ventrículo izquierdo (VI) resultante después de un infarto de miocardio (IM) u otros acontecimientos isquémicos conduce a la dilatación del VI y, en última instancia, a la insuficiencia cardiaca (Holmes et al., 2005, Annu Rev Biomed Eng.; 7:223-53). Inmediatamente después de la oclusión coronaria, los miocitos isquémicos aguas abajo de la oclusión se vuelven necróticos y/o sufren apoptosis. Los neutrófilos se infiltran en el tejido inmediatamente, mientras que los leucocitos, predominantemente macrófagos, llegan poco después de eso y participan en la digestión de los restos celulares necróticos. Los neutrófilos en el tejido isquémico pueden ser tóxicos para los miocitos circundantes, porque liberan especies reactivas del oxígeno y enzimas proteolíticas que dañan adicionalmente a los miocitos circundantes (Nah y Rhee, Korean Circ J.; octubre; 39(10):393-82009). Una vez que se produce el daño, se forma una cicatriz hipocelular que conduce a una disfunción contráctil y, finalmente, a una insuficiencia cardiaca.

Para reducir la carga epidemiológica y fiscal asociada con los acontecimientos isquémicos que afectan el miocardio, es imperativo que se desarrollen nuevas composiciones y estrategias para preservar la supervivencia de los miocardiocitos o estimular el crecimiento de los miocardiocitos tras una lesión provocada por acontecimientos isquémicos tales como el infarto de miocardio. Existe la necesidad de terapias que puedan abordar y/o tratar el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) tras una lesión. La invención divulgada en el presente documento aborda estas necesidades y también proporciona beneficios adicionales.

Sumario

En el presente documento se proporcionan, entre otros, composiciones y kits que comprenden factores paracrinos derivados del epicardio (por ejemplo, proteína similar a la folistatina 1 (FSTL1) hipoglicosilada) para tratar y reparar el daño al tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) provocada por una enfermedad cardiovascular, un infarto de miocardio (IM) u otros acontecimientos isquémicos, así como métodos para usar los mismos.

Por consiguiente, en algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan métodos para reparar el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) tras una lesión en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio. En la presente invención, el factor paracrino derivado del epicardio es un polipéptido de proteína similar a la folistatina 1 (FSTL1) hipoglicosilada tal como se reivindica. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, la lesión es una lesión cardiaca (por ejemplo, miocárdica) por isquemia-reperfusión, se debe a una cardiopatía isquémica, y/o se debe a un corazón hipoplásico. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, la lesión es un infarto de miocardio y/o el corazón contiene tejido cicatricial. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, reparar el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) comprende aumentar el número de miocardiocitos en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico). En algunas realizaciones, el número de miocardiocitos se aumenta en al menos dos veces en comparación con el número de miocardiocitos en el tejido cicatricial lesionado que no se pone en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, reparar el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) comprende una mejora del acortamiento fraccionario en porcentaje de tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en comparación con la cantidad de acortamiento fraccionario en porcentaje en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no se pone en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, reparar el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) comprende mejorar el movimiento de las paredes, en comparación con el mismo sujeto antes del tratamiento. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, reparar el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) comprende mejorar el área perfundida con sangre, en comparación con el mismo sujeto antes del tratamiento. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, reparar el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) comprende disminuir los episodios cardiacos (por ejemplo, miorcárdicos) y hospitalizaciones, en comparación con sujetos similares sin tratamiento. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, reparar el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) comprende un aumento en la cantidad de citocinesis de miocardiocitos en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en comparación con la cantidad de citocinesis de miocardiocitos en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no se pone en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. En algunas realizaciones, un aumento en la cantidad de citocinesis de miocardiocitos se determina mediante la expresión de Aurora cinasa B. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, reparar el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) comprende una disminución de la apoptosis de miocardiocitos. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, dicho método da como resultado un aumento de los niveles de transcritos que codifican para proteínas contráctiles específicas del músculo cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en miocardiocitos. En algunas realizaciones, dicho método da como resultado un aumento de 2 veces en los niveles de transcritos que codifican para proteínas contráctiles específicas del músculo cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en miocardiocitos. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, las proteínas contráctiles específicas del músculo cardiaco (por ejemplo, miocárdico) se seleccionan del grupo que consiste en myh6, mlc2v y mlc2a. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, dicho método da como resultado un aumento de las células actinina+ con Ca2+ contráctil rítmico en miocardiocitos. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) se pone en contacto con dicho factor paracrino derivado del epicardio inmediatamente tras la lesión. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, dicho método aumenta la supervivencia del sujeto tras la lesión. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, dicho método atenúa la fibrosis en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) tras la lesión. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, dicho método da como resultado un aumento de la vascularización de la región lesionada del tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico). En algunas realizaciones, dicho aumento de la vascularización se determina mediante la expresión del factor de von Willebrand (vWF) o la actina del músculo liso en células de vasos sanguíneos. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, dicho método induce la entrada al ciclo celular de miocardiocitos. En algunas realizaciones, dicha entrada al ciclo celular de miocardiocitos se evalúa mediante la expresión de fosfo-histona H3. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, dicho método da como resultado un aumento de al menos 2 veces en la entrada al ciclo celular de miocardiocitos en comparación con la cantidad de entrada al ciclo celular de miocardiocitos en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no se pone en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. En algunas realizaciones, dicho polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se sintetiza en una célula procariota. En algunas realizaciones, dicha célula procariota es una célula bacteriana. En algunas realizaciones, dicho polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se sintetiza en una célula eucariota que se trata con un inhibidor de glicosilación. En algunas realizaciones, dicho inhibidor de glicosilación es tunicamicina. En algunas realizaciones, el polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se genera sustituyendo aminoácidos glicosilados con aminoácidos glicosilados incapaces de glicosilarse. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, dicho polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada no protege a los miocardiocitos de la apoptosis tras una lesión. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, el polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se inyecta directamente en el tejido miocárdico lesionado. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, el polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se administra por vía sistémica. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, el polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se administra por vía endocárdica. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, el polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se incorpora o siembra en un parche de colágeno tridimensional. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, el polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se incorpora o siembra en un hidrogel. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) se pone en contacto desde uno o más de un sitio epicárdico, un sitio endocárdico y/o a través de inyección directa en el miocardio.

En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido de proteína similar a la folistatina 1 (FSTL1) hipoglicosilada y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, dicho polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se sintetiza en una célula procariota. En algunas realizaciones, dicha célula procariota es una célula bacteriana. En algunas realizaciones, dicho polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se sintetiza en una célula eucariota que se trata con un inhibidor de glicosilación. En algunas realizaciones, dicho inhibidor de glicosilación es tunicamicina. En algunas realizaciones, dicho polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se obtiene mediante edición genómica. En algunas realizaciones, dicho polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se obtiene mediante inserción de ARN modificados. En algunas realizaciones, dicho polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se obtiene mediante tratamiento con fármacos de sujetos (por ejemplo, de manera que un tratamiento inhiba la glicosilación del polipéptido de FSTL1 endógeno). En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, la composición se formula para la inyección directamente en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) lesionado. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, la composición se formula para la administración sistémica. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, el polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se incorpora o siembra en un parche de colágeno tridimensional (3D). En algunas realizaciones, el ^{parche de colágeno 3D tiene un módulo de elasticidad de 12}+ ^{4 kPa.}

En aspectos adicionales, en el presente documento se proporcionan kits que comprenden (i) un polipéptido de proteína similar a la folistatina 1 (FSTL1) hipoglicosilada tal como se reivindica; y (ii) uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y (iii) un parche de colágeno tridimensional (3D). En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, el polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada se incorpora o siembra en un parche de colágeno tridimensional (3D). En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas ^{en el presente documento, el parche de colágeno 3D tiene un módulo de elasticidad de 12}+ ^{4 kPa. En algunas}realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, el kit comprende además (iv) medios de adhesión para adherir el parche de colágeno 3D al epicardio o al miocardio de un corazón lesionado. En algunas realizaciones, dichos medios de adhesión son suturas.

En aún otros aspectos, en el presente documento se proporcionan métodos para reparar el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) tras una lesión en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un parche de colágeno tridimensional (3D) sembrado o infusionado con un polipéptido de proteína similar a la folistatina 1 (FSTL1) hipoglicosilada recombinante tal como se reivindica. En algunas realizaciones, la lesión es una lesión por isquemia-reperfusión. En algunas realizaciones, la lesión es un infarto de miocardio. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, el parche de colágeno 3D se sutura al tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico).

En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un parche de colágeno tridimensional (3D) infusionado o sembrado con un polipéptido de proteína similar a la folistatina 1 (FSTL1) hipoglicosilada recombinante tal como se reivindica. En algunas realizaciones, dicho polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada recombinante se sintetiza en una célula procariota. En algunas realizaciones, dicha célula procariota es una célula bacteriana. En algunas realizaciones, dicho polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada recombinante se sintetiza en una célula eucariota que se trata con un inhibidor de glicosilación. En algunas realizaciones, dicho inhibidor de glicosilación es tunicamicina. En algunas realizaciones de cualquiera de las realizaciones divulgadas en el presente documento, el parche de colágeno 3D tiene ^{un módulo de elasticidad de 12}+ ^{4 kPa.}

Cada uno de los aspectos y realizaciones descritos en el presente documento pueden usarse juntos, a menos que se excluyan explícita o claramente del contexto de la realización o aspecto.

En toda esta memoria descriptiva, se hace referencia a diversas patentes, solicitudes de patentes y otros tipos de publicaciones (por ejemplo, artículos de revistas, entradas de bases de datos electrónicas, etc.).

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa la actividad cardiógena en el secretoma epicárdico. a-d) Efecto cardiógeno del cultivo conjunto de miocardiocitos derivados de ESC (mCMESC) con una línea celular del epicardio (EMC). a,b) mCMESC sólo (a) y mCMESC cultivados conjuntamente con EMC durante 4 días (b). Los miocardiocitos se visualizan mediante ^{inmunofluorescencia con}a ^{-actinina (verde) y las EMC mediante fluorescencia con H2B-mCherry (rojo). c)}Cuantificación de los números de miocardiocitos (como en a y b) expresado como cambio en veces (n=3). d) Respuesta cardiógena de mCMESC en relación con el número de EMC añadido al cultivo conjunto (+: 1 X 105 EMC por pocillo, +: 5 X 105 EMC por pocillo), cuantificado usando los marcadores de miocitos Myh6, Myh7, Mlc2a y Mlc2v (n=3) normalizado a la expresión del gen Gapdh. * Diferencia estadísticamente significativa en comparación con el control (p<0,05), ■: p<0,05 en comparación con las condiciones “+”. e-i) Efecto de los medios acondicionados con ^{EMC del epicardio sobre la cardiogénesis. e,f) Tinción con}a ^{-actinina (verde) de los mCMESC después de 8 días de}tratamiento con control (e) o medios acondicionados con EMC (f). g) Cuantificación del número de miocardiocitos. h) Cuantificación de marcadores específicos del músculo cardiaco en los mCMESC, normalizado a la expresión de Gapdh. i) Cuantificación del número de miocardiocitos con transitorio de calcio rítmico medio automáticamente usando un citómetro de obtención de imágenes cinéticas (Vala Sciences). Cuantificación en g-i representada como cambio en veces. n=3 en todos los experimentos. * Diferencia estadísticamente significativa en comparación con el control (p<0,05). j-m) Medios acondicionados de células derivadas de epicardio (EPDC) de adultos promueve la citocinesis en miocardiocitos embrionarios. j) Aislamiento de miocardiocitos embrionarios a partir de corazones positivos para E12.5 GFP (Tnnt2-Cre;Rosa26mJmG/+). k) Los medios acondicionados con EPDC promueven la proliferación de miocardiocitos, y hervir los medios acondicionados (hervidos) suprimió los efectos que promueven el crecimiento. l m) El análisis de citocinesis mediante inmunotinción de Aurora B y marcador cardiaco Tnnt2 mostró un aumento de la citocinesis de miocardiocitos después del tratamiento con medios acondicionados con EPDC de adulto (grupo con vehículo: 38 células positivas de 19668; grupo con medio secundario: 74/22143); *P < 0,05; n = 5.

La figura 2 representa parches de tipo epicardio embrionario mejora la función cardiaca después de ligadura permanente de LAD. a) Ilustración esquemática de generación de parches de colágeno (procedimiento por compresión del plástico, reconstruido a partir de la referencia 30). b) Evaluación de las propiedades mecánicas de un parche modificado por ingeniería, medidas mediante microscopía de fuerza atómica. Histograma de la distribución de la microrrigidez medida del parche se muestra en rojo. Estos valores se representan gráficamente en relación con el intervalo de elasticidad informado para biomateriales de andamiaje habituales31. El área gris representa lo previamente descrito32, el intervalo óptimo de elasticidad para maximizar la contractilidad de los miocitos. c, d) Implantación de parches miméticos al epicardio. Después de la ligadura permanente de LAD para inducir el infarto de miocardio (c), se suturó el parche epicárdico en dos puntos sobre la superficie del miocardio isquémico (d). El recuadro en el en panel demuestra un parche preparado sumergido en los medios de cultivo antes de la implantación. e-g) Efectos fisiológicos de los parches cargados con medios acondicionados con células del epicardio después del infarto de miocardio (IM). Todas las muestras se recogieron en la semana 2 después de la implantación del parche. e) Sumario del análisis de ecocardiografía 2 semanas después del infarto, que incluye: simulación (control simulado), ratones infartados sin tratamiento (IM sólo), IM tratado con parche sólo (IM+parche), y animales infartados tratados con parche cargado con medios acondicionados con células del epicardio (IM+parche+CM). Todos los datos se normalizan a valores de nivel inicial individuales previos a la cirugía. f) Valores absolutos de acortamiento fraccionario (% de FS) de e. g): Análisis histológico macroscópico de corazones teñidos con tinción tricrómica de Masson; las muestras son tal como se indican. Se usó un número mínimo (n) de 8 ratones por grupo experimental. *: p<0,05 en comparación con el control simulado, •: p<0,05 en comparación con IM sólo, y ■: p<0,05 en comparación IM+parche.

La figura 3 representa que FSTL1 es un factor cardiógeno epicárdico con expresión dinámica después de la lesión. a) Espectro de EM/EM de R.GLCVDALIELSDENADWK.L, identificado como FSTL1. Probabilidad peptídica=1,0, Xcorr=6,276, delta Cn=0,471. b-f) Efecto de FSTL1 recombinante sobre miocardiocitos derivados de células madre embrionarias de ratón (mCMESC) después de 8 días de tratamiento con medios de control solos (control) o medios que contienen FSTL1 humana (FSTL1, 10 ng/ml). Se cambiaron los medios en todos los experimentos y las condiciones ^{cada 2 días. b, c) Los miocardiocitos se identifican mediante inmunotinción con}a ^{-actinina (verde). d) Cuantificación}del número de miocardiocitos (n=8) en b, c expresado como cambio en veces. e) Expresión de marcadores específicos del músculo cardiaco en b, c, normalizados a la expresión de Gapdh (n=3), como cambio en veces. f) Cuantificación del número de miocardiocitos (cambio en veces en relación con el control) con transitorio de calcio rítmico con o sin tratamiento con FSTL1 usando un análisis de citómetro de obtención de imágenes cinéticas (KIC) (n=6). g) Medición del tamaño celular individual de los miocardiocitos (en píxeles) después de 2 días de cultivo en las concentraciones indicadas de FSTL1 (n=5). *: diferencia estadísticamente significativa con respecto al control (p<0,05). h) Expresión epicárdica de FSTL1 después de la gestación intermedia. La visualización directa de proteínas usando un anticuerpo contra FSTL1 (rojo) demuestra que FSTL1 se expresa en el epicardio de ratón en los días embrionarios E12.5, E15.5 y E17.5. También se detecta alguna expresión intersticial. Las imágenes de E12.5 muestran la localización conjunta de FSTL1 con el factor de transcripción epicárdico del tumor de Wilm 1 (Wt1, tinción nuclear verde, puntas de flecha ^{blancas). Las imágenes de E15.5 y E17.5 se tiñen conjuntamente con el marcador de miocitos}a ^{-actinina (verde) y no}presenta superposición de FSTL1 (puntas de flecha blancas) y el marcador de miocitos (punta de flecha amarilla). i-l) Expresión dinámica de FSTL1 en el epicardio lesionado de adultos. i) Paneles superiores: evaluación histológica (tinción tricrómica de Masson) del tejido fibrótico inducido en tiempos secuenciales después del infarto de miocardio (IM). Paneles inferiores: inmunohistoquímica de FSTL1 (marrón) en tiempos secuenciales después del IM. Los recuadros demuestran la expresión de FSTL1 en el epicardio de un corazón operado de manera simulada, y el agotamiento de FSTL1 en el epicardio de los corazones lesionados. FSTL1 también es indetectable en el tejido fibrótico, mientras que se regula por incremento en el miocardio después del IM (obsérvese la inmunotinción marrón de FSTL1 en el miocardio después del IM). j-l) Imágenes inmunofluorescentes de alta resolución: localización conjunta de FSTL1 (rojo) con el marcador epicárdico Wt1 (verde) en el corazón de adulto no lesionado (simulado) (j). Localización epicárdica selectiva de FSTL1 (rojo) en el corazón de adulto simulado (k). FSTL1 está ausente en las células del epicardio y sus derivados después del IM (l). Marcado de linaje epicárdico (verde) después de la administración oral de tamoxifeno en ratones Wt1-CreER;Rosa26RFP/+ (administrado 6 veces durante la duración de 3 semanas y se detuvo 1 semana antes del IM). Se recogieron los corazones a las 2 semanas después del IM. La inmunotinción de RFP para las células del linaje de Wt1 (gris), FSTL1 (rojo) y Tnni3 (verde) muestra que FSTL1 está ausente en las células del epicardio y sus derivados (gris), pero es abundante en el miocardio (verde) después del IM.

La figura 4 representa que FSTL1 da lugar al efecto reparador in vivo de medios acondicionados con células del epicardio en el parche epicárdico modificado por ingeniería. a-c) Análisis fisiológico. a) Se analizó la evolución temporal de supervivencia de cada condición usando el método de Kaplan-Meier. b) Cinética del acortamiento fraccionario [FS(%)] tal como se mide mediante ecocardiografía durante los 3 primeros meses de los tratamientos indicados. Datos proporcionados como valores absolutos de FS: simulación (control simulado), ratones infartados sin tratamiento (IM sólo), IM tratada con parche sólo (IM+parche), y animales infartados tratados con parche cargado con FSTL1 (IM+parche+FSTL1). c) % de FS a las 2 y 4 semanas después del IM en ratones FSTL1-TG comparando IM+parche y IM+parche+FSTL1 *: p<0,05 en comparación con el control simulado, •: p<0,05 en comparación con IM sólo, y ■: p<0,05 en comparación con IM+parche. d-e) Análisis morfométrico. d) Tinción tricrómica de Masson representativa de corazones 4 semanas después del IM y cuantificación del área fibrótica como porcentaje de la pared del VI total (n>4). e) Evaluación mediante ecocardiografía de la morfología del ventrículo izquierdo. Las abreviaturas indican: LVIDd (diámetro interno del ventrículo izquierdo al final de la diástole); LVIDs (diámetro interno del ventrículo izquierdo al final de la sístole); LVPWd (dimensión de la pared posterior del ventrículo izquierdo al final de la diástole); LVPWs (grosor de la pared posterior del ventrículo izquierdo en la sístole). *: p<0,05 en comparación con la simulación, *: p<0,05 en comparación con IM sólo, y ■: p<0,05 en comparación con IM+parche. f-i) Análisis de la vasculatura en la semana 4 después del IM. f) Inmunotinción para un marcador endotelial (vWF). g) Área de vasos cuantificada midiendo el área media de la luz de vasos individuales en relación con el área total de las secciones histológicas. h) Inmunotinción para ^{un marcador del músculo liso (}a ^{SMA). i) Cuantificación del número de vasos por unidad de área. *: p<0,05 en}comparación con el control simulado, •: p<0,05 en comparación con IM sólo, y ■: p<0,05 en comparación con IM+parche. j) Visualización de la zona del borde del parche en la semana 4 después del IM. La tinción tricrómica del infarto y la zona del borde de los tratamientos indicados demuestra la integración del parche con el tejido del huésped y la celularización masiva del parche por las células cardiacas nativas. Obsérvese el abundante músculo (rojo) dentro del parche y en la zona del borde de los animales tratados con parche+FSTL1 (tres paneles derechos, puntas de flecha verdes).

La figura 5 representa que la expresión epicárdica reparada de FSTL1 promueve la proliferación de miocardiocitos. Todos los experimentos se realizaron tras la ligadura permanente de LAD. Las muestras se analizaron en la semana 4 de tratamiento a menos que se indique lo contrario. a-h) Inmunotinción. Inmunotinción del marcador de ^{miocardiocitos}a ^{-actinina (rojo) en el área del infarto (b-d) y tinción de inmunofluorescencia conjunta del marcador de duplicación de ADN fosfo-histona 3 Ser10 (pH3, verde) y}a ^{-actinina (rojo) en la zona del borde (f-h), en los 4 grupos}de tratamiento analizados 4 semanas después del IM, en comparación con animales operados de manera simulada (a,e). Los recuadros en (a-d) muestran imágenes de menor aumento con líneas discontinuas demarca el borde entre ^{el parche y los tejidos del huésped. Las puntas de flecha en (g, h) indican miocardiocitos}a ^-actinina+ ^{con núcleos pH3}+^.i-o) Cuantificación de la proliferación de miocardiocitos. i) Ilustración de secciones transversales usadas para análisis ^{de cuantificación, cada sección cubría el infarto, el parche y estaba separada por 25 |}i ^{m, entre 1-2 mm desde la punta. j) Imagen de alto aumento de pH3 (verde) y}a ^{-actinina (rojo) con renderizado 3D que muestra la localización conjunta del núcleo de los miocardiocitos con tinción con pH3. k) Cuantificación de incidencia de pH3}+^{, células doblemente positivas para}a ^-actinina+ ^{en los 4 grupos experimentales. Datos recogidos de 5-7 corazones en cada grupo con 3 secciones transversales diferentes contados para células pH3}+^,a ^-actinina+ ^{totales en cada corazón. l-m) Determinación de la citocinesis. l) Inmunofluorescencia conjunta de miocardiocitos (}a ^{-actinina, verde) y el marcador}de citocinesis Aurora cinasa B (rojo) en la cohorte parche+FSTL1, con renderizado 3D que muestra el surco de ^{segmentación Aurora cinasa B}+ ^{entre miocardiocitos}a ^-actinina+ ^{en el eje Z. m) Cuantificación de la incidencia de células Aurora B+/}a ^-actinina+ ^{en los 4 grupos experimentales. Datos recogidos a partir de 5-7 corazones en cada grupo con 3 secciones transversales diferentes contados para células Aurora B+/}a ^-actinina+ ^{totales en cada corazón.}n-o) Determinación de la proliferación usando marcadores de núcleos de miocardiocitos n) Inmunofluorescencia conjunta de marcadores de núcleos de miocardiocitos PCM1 (rojos) y pH3 (verde) en la cohorte parche+FSTL1, con renderizado 3D que muestra la localización conjunta de los núcleos de miocardiocitos con tinción con pH3. o) ^{Cuantificación de la incidencia de células PCM1}+;^pH3+ ^{en los 4 grupos experimentales. Datos recogidos de 5-7 corazones en cada grupo con 3 secciones transversales diferentes contados para las células PCM1}+^/pH3+ ^{totales en}cada corazón. *: estadísticamente diferente de la simulación, P<0,05.**: estadísticamente diferente de los otros grupos, P<0,05. p-v) Trazado de linaje de miocitos recién generados. El tratamiento con 4-OH-tamoxifeno (OH-Tam) de ratones aMHC-mERCremER;Rosa26Z/EG/+ (MCM+/ZEG+) indujo la expresión de eGFP en miocardiocitos preexistentes (diagramados en p). Se aplicaron parches de colágeno cargados con FSTL1 simultáneamente a la ligadura coronaria (IM). Se disecaron los corazones, se fijaron y se tiñeron 4 semanas después del IM. q) Área del VI en corazones ^{operados de manera simulada que muestran un marcaje eficiente de los miocardiocitos (}a ^{-actinina blanco; eGFP}verde). r-t) Área del VI en corazones infartados que muestran miocardiocitos eGFP+ (preexistentes, verde) a las 4 semanas después de la cirugía en el área intacta (r), en el área del/de los infarto(s), y en la zona del borde (t, u). Las puntas de flecha blancas indican no miocardiocitos pH3+. Las puntas de flecha amarillas indican células doblemente ^{positivas pH3}+^{, eGFP}+^{, lo que indica miocardiocitos preexistentes a la mitad del ciclo celular. Se observan agrupamientos de células doblemente positivas pH3}+^{, eGFP}+ ^{en la zona del borde y el área del infarto.}

La figura 6 representa la actividad proliferativa de FSTL1 en miocardiocitos tempranos dependiendo de las modificaciones de FSTL1 postraduccionales selectivas de células. a-f) FSTL1 promueve la proliferación de ^{miocardiocitos inmaduros derivados de mESC. a, d) Se estimularon mCM}ESC ^{con la concentración indicada de FSTL1 durante 24 horas con EdU 10 |}i ^{g/ml, y se tiñeron para}a ^{-actinina (rojo) y EdU (verde). Se cuantificaron los porcentajes de miocardiocitos EdU+,}a ^-actinina+ ^{de todos los miocardiocitos}a ^-actinina+ ^{(d). b, e) Se estimularon mCM}ESC ^{con FSTL1 10 ng/ml durante 48 horas y se tiñeron para}a ^{-actinina (rojo) y fosfo-histona 3 (verde). Se cuantificaron los porcentajes de miocardiocitos pH3}+^,a ^-actinina+ ^{de todos los miocardiocitos}a ^-actinina+ ^{(e). c, f) Se estimularon mCM}ESC ^{con la concentración indicada de FSTL1 durante 48 horas, y se tiñeron para}a ^{-actinina (rojo) y marcador de citocinesis Aurora B (verde). Se cuantificaron los porcentajes de miocardiocitos Aurora B+,}a ^-actinina+ ^{de todos los miocardiocitos}a ^-actinina+ ^{(f). g, h) Se glicosilaron FSTL1 expresados en células de mamífero g) Inmunotransferencia}de tipo Western contra FSTL1 de medios acondicionados de la expresión de células HEK293 /-FSTL1 y la glicosilación de proteínas de bloqueo /- tunicamicina (Tuni.), que muestra que se glicosila FSTL1. h) Inmunotransferencia de tipo Western contra FSTL1 de FSTL1 humana recombinante expresada en células de mamíferos o en bacterias, que muestra diferencias en la glicosilación (flecha roja: forma glicosilada; flecha negra: ^{forma no glicosilada). i) Se estimulan mCM}ESC ^{con H2O2 10 nM, y bacterias 10 ng/ml y FSTL1 producida por mamíferos durante 24 horas, y tinción para}a ^{-actinina y TUNEL para determinar la muerte celular. Se cuantificaron los porcentajes de miocardiocitos TUNEL}+, a ^-actinina+ ^{de todos los miocardiocitos}a ^-actinina+ ^{(i), que muestra que la FSTL1 producida}por mamíferos es capaz de atenuar la apoptosis inducida por H²O², mientras que la FSTL1 producida por bacterias no puede, mientras que ambas proteínas no tienen ningún efecto sobre la apoptosis sin estimulación con H²O². j, k) Cuantificación de EdU incorporado y Aurora B (el mismo ensayo que en a, c, d, f) que compara la FSTL1 producida por bacterias y mamíferos, que muestra que la FSTL1 producida por bacterias promueve la proliferación de mCMESC, mientras que la FSTL1 producida por mamíferos no puede. l) FSTL1 se glicosila de manera diferencial en los miocardiocitos y las células del epicardio. Inmunotransferencia de tipo Western contra FSTL1 de medios acondicionados de NRVC infectados con adeno-FSTLl y medios acondicionados de EMC, tratados con o sin tunicamicina, que muestra una proteína no glicosilada con el mismo tamaño que la FSTL1 glicosilada con diferentes tamaños, lo que sugiere que los miocardiocitos y las células del epicardio modifican FSTL1 de manera diferencial. m, n) Ensayo de incorporación de EdU comparando el efecto de los medios acondicionados de NRVC infectados con adeno-FSTLl y los medios acondicionados de EMC. Normalizados a la misma cantidad de concentración de FSTL1 usando inmunotransferencia de tipo Western, los medios acondicionados con EMC indujeron la proliferación de mCMESC en un grado similar a la FSTL1 producida por bacterias, mientras que los medios acondicionados de NRVC infectados con adeno-FSTLl no pudieron, lo que sugiere que el estado de glicosilación determina la función de FSTL1. n=5 para todos los experimentos. *: estadísticamente diferente del control, P<0,05. o) Acciones de FSTL1 durante la lesión cardiaca, modelo de trabajo. En cardiopatía isquémica FSTL1 se expresa mucho en el miocardio. La FSTL1 secretada en el miocardio está muy glicosilada (glicoFSTL1) y protege de la apoptosis, y no presenta actividad proliferativa. La FSTL1 no se expresa en el epicardio del corazón lesionado. La forma hipoglicosilada, o bien secretada por el epicardio intacto o administrada en el parche epicárdico, activa la proliferación en las células precursoras de miocardiocitos capaces de realizar replicación, ubicadas en el espacio subepicárdico.

La figura 7 representa que la administración epicárdica de FSTL1 activa la regeneración cardiaca en el modelo preclínico de una lesión cardiaca isquémica. a-d) Efecto fisiológico de la administración de parches de FSTL1 en el epicardio en el modelo experimental porcino de isquemia-reperfusión (I/R). IRM medidas en la fracción de eyección (EF) en el nivel inicial ~50% que disminuyeron después de una semana hasta ~30% (a-b). Los cerdos tratados con parche+FSTL1 una semana después de la I/R recuperaron la contractilidad en 2 semanas de tratamiento, con EF de ~40%. EF permaneció estable las siguientes 2 semanas, el tiempo más largo analizado (a,b). Esto estaba en contraste con el deterioro en equilibrio de la función cardiaca en animales no tratados (I/R sin tratamiento) o en el animal tratado con parche solo (I/R parche) (b). c-d): cerdos tratados con parche+FSTL1 (c) demostraron el tamaño (área) de cicatriz más pequeño en todos los grupos de estudio incluyendo animal con I/R parche (d). Las flechas y líneas verdes destacan el perímetro de la cicatriz. e-o) Evaluación de la integración del parche con el tejido cardiaco del huésped, angiogénesis y celularización y regeneración en la semana 4 después de la implantación. e) La tinción tricrómica de Masson del corazón del cerdo demostró la unión del parche+FSTL1 al tejido isquémico y fibrosis limitada. f-h) Inmunotinción de marcador del músculo liso (aSMA, rojo) y EdU (verde) que muestra los músculos lisos arteriales recién formados. Los corazones de cerdo tratados con parche+FSTL1 mostraron evidencias de la nueva formación de ADN en las células de músculo liso vascular en ambas del área isquémica (f, g) y en la zona del borde con el parche cargado con FSTL1 (h). La flecha y la línea blanca en el panel h demarca el borde aproximado del parche con el tejido del huésped. i-m) Análisis de incorporación de EdU de miocardiocitos que residen en el infarto y la zona del borde en los corazones de cerdo tratados con parche+FSTL1, lo que mostró miocardiocitos estriados (a-actinina+, rojo) algunos de los cuales (flechas en i) también se tiñeron de manera positiva para la síntesis de ADN (EdU, verde, ejemplos con alto aumento en j-m). n) Inmunofluorescencia conjunta de miocardiocitos (a-actinina, verde) y el marcador de citocinesis Aurora cinasa B (rojo) en el corazón con parche+FSTL1, con renderizado 3D que muestra un cuerpo intermedio de Aurora cinasa B+ entre los miocardiocitos a-actinina+ en el eje Z.

La figura 8 representa la caracterización de las células mCMESC usadas en este estudio. a) Cronograma esquemático de la preparación y el tratamiento de células. b-d) Inmunotinción de a-actinina de mCMESC, que muestra que la mayoría de las células son a-actinina+ (b), y la a-actinina carece de estructuras de estriación (c). d) Inmunotinción de a-actina del músculo liso (aSMA) de mCMESC, que muestra que la mayoría de las células son aSMA+, a diferencia de los miocardiocitos maduros sin expresión de SMA42. e-f) Detección automática de la incorporación de EdU en mCMESC. Imagen capturada de mCMESC tratados con EdU 10 |ig/ml durante 24 horas, teñidos con EdU, a-actinina y DAPI usando InCell 1000 de General Electric) (e). Superposición de máscaras de canales de EdU, a-actinina y DAPI con software de detección automático (f). g) Perfil de incorporación de EdU de los mCMESC a lo largo del tiempo. Las mCMESC se tratan con EdU 10 |ig/ml durante 24 horas en el tiempo 0 horas, 24 horas, 48 horas y 144 horas. El porcentaje de miocardiocitos EdU+/a-actinina+ de todos los miocardiocitos a-actinina+ se calcula para cada periodo de tiempo. Obsérvese la disminución de la tasa de incorporación de EdU a lo largo del tiempo. h,i) Imágenes con calcio Fluo 4 de mCMESC, con imagen de fondo de nivel inicial (h) e imagen de pico (i). j) Comparación de transitorios de calcio representativos de mCMESC (rojo) y miocardiocitos ventriculares de rata neonatales (NRVC, azul). Obsérvese la amplitud reducida, la menor tasa de latidos ascendentes y descendentes y la duración prolongada del transitorio de calcio en mCMESC en comparación con NRVC, lo que sugiere el manejo de calcio inmaduro en mCMESC. En todos los experimentos, se añadió FSTL1 un día después del sembrado en placa de los mCMESC (tiempo 0-24 en esta figura).

La figura 9 representa un análisis de microscopía de fuerza atómica (AFM) del parche epicárdico modificado por ingeniería. La punta plana a medida usada en la microscopía de fuerza atómica del parche (a), se fabricó usando deposición por haz de electrones, y se utilizó para probar la rigidez de los geles en el área de barrido de 90 |im * 90 |im (b, c).

La figura 10 representa la sobreexpresión miocárdica de ratones con FSTL1 (FSTL1-TG) después de la ligadura permanente de LAD. a-d) Cinética de expresión de la proteína FSTL1 después del infarto de miocardio. Los ratones FSTL1-TG (fondo genético C57/B16) y ratones de tipo natural (WT) compañeros de camada se sometieron a ligadura de LAD. Se recogieron tejido cardiaco y suero en el nivel inicial, día 1, día 3, día 7 y día 28 después de la cirugía. Se analizaron los niveles de proteína FSTL1 en el área isquémica (IA) y el área remota (RM) del corazón mediante inmunotransferencia de tipo Western (a). Se informa la expresión de FSTL1 expresada en relación con los niveles de tubulina (b). Se analizaron los niveles en suero de FSTL1 mediante inmunotransferencia de tipo Western (c). También se muestra la tinción con Ponceau-S para indicar la igual carga en suero. La cuantificación del nivel en suero de FSTL1 se muestra en (d). n>3 en todos los grupos. *: P<0,05 en comparación con el nivel inicial de WT, #: P<0,05 en comparación con el nivel inicial de FSTL1-TG. Se usó ANOVA para determinar la significación estadística (P<0,05). e-j) Respuesta morfométrica y funcional de ratones FSTL1-TG a la ligadura permanente de LAD a largo plaza. Tinción tricrómica de Masson representativa de WT (e) y FSTL1-TG (f) 4 semanas después del IM. Cuantificación del contenido de tejido fibrótico en la semana 4 después del IM (g). Medición ecocardiográfica de la dimensión interna del ventrículo izquierdo en la sístole (LVIDs) (h), y diámetro interno del ventrículo izquierdo en diástole (LIVDd) (i) en las semanas 2, 4 después del IM. Determinación ecocardiográfica del acortamiento fraccionario (% de FS) en los genotipos ^{indicados en las 2 y 4 semanas después del IM (j). (k-n) Doble tinción inmunofluorescente de}a ^{-actinina (miocardiocitos) y pH3 (mitosis) (k) y}a ^{-actinina (miocardiocitos) y factor de von Willebrand (células endoteliales}vasculares) (m) en los ratones FSTL1-TG y WT, cuantificada en (l, n). n=5, *, significativamente diferente (P<0,05) respecto a WT.

La figura 11 muestra que FSTL1 está ausente en el epicardio y se expresa en el miocardio después del infarto de miocardio. a-c) Detección de FSTL1 después del IM en ratones Wtl-CreER;Rosa26RFP/+ marcados en linaje. Marcaje de linaje epicárdico (verde) tras la administración oral de tamoxifeno en ratones Wtl-CreER;Rosa26RFP/+ (administrado 6 veces durante la duración de 3 semanas y detenido 1 semana antes del IM). Se recogieron los corazones a las 2 semanas después del IM. La inmunotinción de RFP para células del linaje de Wt1 (verde), FSTL1 (rojo) y Tnni3 (blanco) muestra que FSTL1 está ausente en las células del epicardio y sus derivados (verde), pero es abundante en el miocardio (gris) después del IM (imágenes de alto aumento de a, b se muestran en c).

La figura 12 representa la retención de FSTL1 en el parche in vitro e in vivo. a,b) Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas usado para medir la cantidad de FSTL1 retenida dentro de andamiajes de colágeno expuestos a PBS in vitro durante diferentes intervalos de tiempo (0-21 días) (a). La tabla enumera la concentración inicial y final de FSTL1, así como los valores de liberación dentro de las primeras 24 horas (b). c-f) Retención de FSTL1 en el parche in vivo. Imágenes representativas de la inmunotinción de FSTL1 en los grupos de tratamiento de animales indicados, semana 4 después de la cirugía. Obsérvese que, mientras que FSTL1 se expresa en el epicardio no lesionado (flecha en el recuadro en c), su expresión se volvió indetectable dentro del área del infarto después del IM (d). De manera similar, no se detectó FSTL1 en los animales con IM+parche (e), mientras que todavía persistió (tinción roja) en el área del parche del grupo IM+parche+FSTL1 (f).

La figura 13 representa la fibrosis atenuada por parche+FSTL1 después del IM. Tinción tricrómica de Masson representativa en secciones transversales en serie de corazones en 4 condiciones (simulación, IM sólo, IM+parche e IM+parche+FSTL1) 4 semanas después del IM. Obsérvese la fibrosis grave en la condición de IM sólo, y la fibrosis reducida en la condición de IM+parche, y la reducción adicional en la condición de IM+parche+FSTL1, cuantificada en la figura 4d.

La figura 14 representa la obtención de imágenes por IRM tras el tratamiento. Imágenes de IRM representativas de los grupos de tratamiento IM sólo, IM+parche e IM+parche+FSTL1 en ratón que muestran las imágenes de 3D-FSPGR (ecocardiografía de gradiente estropeado rápido) y las imágenes de realce tardío utilizando agentes de contraste de gadolinio, lo que confirma una reducción en el área del infarto (demarcada en verde) y contractilidad conservada.

La figura 15 representa el análisis de la función de parche+FSTL1 en el modelo de ratón de isquemia/reperfusión (I/R) con injerto de parche tardío. a-c) Evaluación de la función cardiaca para simulación, I/R e I/R tratados con preinjerto de parche+FSTL1, en telediastólico y telesistólico, (a, 1 semana después de la lesión), 2 semanas después de la implantación del parche (b), y 4 semanas después del injerto (c). Se normalizaron los valores dividiendo a los valores de nivel inicial previos a la cirugía para cada animal individual. d) Valores absolutos de acortamiento fraccionario (FS, %) en diferentes tiempos previos y posteriores a la I/R tal como se evaluó mediante la ecocardiografía de ratones de a-c. Las abreviaturas son las mismas que en la figura 4. *: p<0,05 en comparación con la simulación y •: p<0,05 en comparación con I/R. e) Tinción de inmunofluorescencia conjunta del marcador de duplicación de ADN fosfo-histona3 ^{Ser10 (pH3, verde) y}a ^{-actinina (rojo) en la zona del borde del corazón tratado con parche+FSTL1 4 semanas después del IM. f) Cuantificación de la incidencia de células doblemente positivas de pH3+,}a ^{-actinina+ en los 3 grupos}experimentales. Datos recogidos de 3 corazones en cada grupo con 3 secciones transversales diferentes contados ^{para las células pH3+,}a ^{-actinina+ totales en cada corazón. *: estadísticamente diferente de todos los otros grupos,}P<0,05.

La figura 16 representa una imagen representativa de todos los miocardiocitos pH3+ detectados en una sección de corazón tratado con parche+FSTL1. Tinción tricrómica de Masson de un corazón 4 semanas después del IM tratado ^{con parche+FSTL1 (a). El portaobjetos adyacente se tiñó para}a ^{-actinina en (b), lo que corresponde al área del}recuadro negro con infarto y el parche en (a). La línea punteada en (b) indica el límite entre el corazón y el parche. El ^{portaobjetos adyacente se tiñó para}a ^{-actinina y pH3, y todos los miocardiocitos doblemente positivos}a ^-actinina+,pH3+ hallados se muestran en (c) (punta de flecha blanca), con cada imagen correspondiendo al área en el recuadros blancos numerados en (b).

La figura 17 representa el efecto de la implantación de parche+FSTL1 sobre la apoptosis y la inflamación. a) Tinción con TTC representativa del día 2 después del tratamiento con IM/parche de todos los cuatro grupos (simulación, IM, IM+parche, IM+parche+FSTL1). b) Cuantificación del área en riesgo comparando todos los 4 grupos. Datos recogidos de 4 corazones en cada grupo, con 4 secciones transversales, con un grosor de aproximadamente 2 mm cada una, que abarca cada corazón. *: estadísticamente diferente de la simulación, P<0,05. c, d) Imagen representativa de ^{ensayos con TUNEL (TUNEL, verde,}a ^{-actinina, rojo) comparando los corazones 2 días después del IM con parche solo y parche+FSTL1. e) Cuantificación de TUNEL+,}a ^{-actinina+ en el área infartada, como porcentaje del número total}de miocardiocitos. No se observó ninguna diferencia entre las condiciones de IM+parche e IM+parche+FSTL1. Datos recogidos de 3 corazones en cada grupo con 3 secciones transversales diferente (igual que en la figura 5 i). Se tomaron ^{diez imágenes de 0,09 mm2 del área infartada de cada sección y se contaron para determinar las células TUNEL+,}a ^{-actinina+ y}a ^{-actinina+totales. a-e) Se realizaron tinción con TUNEL para determinar la muerte celular y tinción con}a -actinina para determinar los miocardiocitos en los corazones tratados con parche sólo y parche+FSTL1 en el día 4 y ^{día 8 después del IM (a-d). Se detectan células TUNEL+,}a ^{-actinina+ mínimas mientras que existe una cantidad significativa de células TUNEL+,}a ^{-actinina. La cuantificación de todos los núcleos de TUNEL+ no mostró diferencias}significativas entre los corazones tratado con parche y parche+FSTL1 en ambos puntos de tiempo (e). f-j) Se realizaron ^{inmunotinción de F4/80 para determinar los macrófagos y de}a ^{-actinina para determinar los miocardiocitos en los mismos corazones que en los paneles}a ^{-d (f-i). La cuantificación de células F4/80+ no mostró diferencias significativas}entre los corazones tratados con parche y parche+FSTL1 en ambos puntos de tiempo (j).

La figura 18 muestra que FSTL1 no induce proliferación en miocardiocitos de adulto y neonatales, o de células progenitoras cardiacas. a-f) Miocardiocitos de adulto derivados de aislamiento primario de ratón. a) Visualización de miocardiocitos GFP+ aislados de ratones MCM+/ZEG+ tratados con 4-OH-tamoxifeno (OH-Tam) en parches de colágeno 3D. b-d) Expresión génica en los miocardiocitos de adulto tratados con FSTL1, incluyendo los marcadores de proliferación (b), específicos del músculo cardiaco (c) y de hipertrofia (d). No se observa ningún cambio en la expresión de genes específicos del músculo cardiaco, ni ningún aumento en los marcadores del ciclo celular (consecuente con la inmunotinción con Ki67 indetectable) y marcadores de hipertrofia disminuidos. Se incorporaron los miocardiocitos dentro del parche 3D, se trataron con FSTL1 (10 ng/ml) durante 7 días con cambio de medio cada 2 días. e,f) Ensayo de FUCCI miocardiocitos de adulto cultivados en 3D, realizado 1 semana después del cultivo 3D. e) Se realizó tratamiento con FSTL1 durante 7 días con cambio de medio cada 2 días. f) Control cultivado en 3D de miocardiocitos de adulto en ausencia de FSTL1. No se observa ningún signo detectable de miocardiocitos en las fases S/G2/M (GFP+) en ninguna de las condiciones. Las flechas moradas apuntan a los núcleos coloreados en morado que resultan de la localización conjunta del marcado con Hoechst (azul) y de FUCCI de fase G1 (rojo). (g-j) Miocardiocitos ventriculares de rata neonatal (NRVC) primarios. g,h) NRVC recién aislados estimulados con FSTL1 durante 48 horas ^{con EdU 10 |}i ^{g/ml, y teñidos para}a ^{-actinina (rojo) y EdU (verde). Se cuantifican los porcentajes de miocardiocitos EdU+/}a ^{-actinina+ de todos los miocardiocitos}a ^{-actinina+ (h). i, j) NRVC estimulados con FSTL1 durante 48 horas, y teñidos para}a ^{-actinina (rojo) y pH3 (verde). Se cuantifican los porcentajes de miocardiocitos pH3+/}a ^{-actinina+ de todos los miocardiocitos}a ^{-actinina+ (j). No se halla ningún aumento de la proliferación tras el tratamiento con FSTL1.}(n=4) *: estadísticamente diferente del control, P<0,05. k-m) Se sincronizaron por inanición células progenitoras Sca1+19 durante 48 horas y se estimularon con FSTL1 o medio de crecimiento de control durante 72 horas en presencia de EdU. Se obtuvieron 3 clones mediante crecimiento clonal de la fracción Lin-Sca1+SP. Se obtuvo una reserva de Sca1 a partir de lin-Sca1+ sin crecimiento clonal. k) Tinción con EdU y DAPI de células Sca1+ después de 72 horas de tratamiento. l) Porcentaje de células EdU+ Sca1+ después de 72 horas de tratamiento. Concentración de FSTL1: 0, 1, 10, 100 ng/ml. Abreviaturas: SS, inanición en suero; CGM, medio de crecimiento de control, m) Número de células Sca1+ después de 72 horas de tratamiento con FSTL1 (n=5). No se halla un cambio significativo tras el tratamiento con FSTL1.

La figura 19 representa la detección de FSTL1 en medios acondicionados con NRVC y EMC. Inmunotransferencia de tipo Western contra FSTL1 de medios acondicionados de NRVC y medios acondicionados de EMC, tratados con o sin tunicamicina, que muestra la secreción de FSTL1 glicosilada en EMC, pero no en NRVC.

La figura 20 representa detecciones de fosfo-Akt y PCNA en los mCMESC después del tratamiento con FSTL1. Inmunotransferencia de tipo Western contra fosfo-Akt (Ser473 y Thr308, ambos indicados en la respuesta de supervivencia en miocardiocitos) y PCNA (marcador de proliferación) después de 1 hora y 24 horas de tratamiento con FSTL1 a 10 ng/ml y 50 ng/ml, que no muestra ningún cambio en fosfo-Akt ni en PCNA tras el tratamiento con FSTL1.

Descripción detallada

La invención divulgada en el presente documento se basa, en parte, en la observación de los inventores de que los medios acondicionados obtenidos a partir de cultivos de células similares al epicardio potencian la cardiomiogénesis in vitro y en el corazón lesionado de adultos. El epicardio del corazón es una capa epitelial externa que contribuye al crecimiento miocárdico durante el desarrollo proporcionando células progenitoras12, así como mitógenos, incluyendo FGF, IGF2 y PDGF3-5 Estudios recientes sugieren que el epicardio también podría conservar la función del miocardio de adulto tras una lesión, posiblemente como fuente de progenitores miógenos67. Sin embargo, hasta ahora, no se ha demostrado que ningún factor paracrino derivado del epicardio ayude a la regeneración miocárdica en mamíferos tras una lesión, aunque la identificación de tales factores, así como su mecanismo de acción proporcionaría una visión de este proceso poco conocido e intrínsecamente ineficaz8.

Tal como se detalla adicionalmente a continuación, después de someter los medios acondicionados a espectrometrías de masas seguido por análisis posteriores, se identificó la proteína similar a la folistatina (FSTL1) como un componente de la actividad cardiomiogénica observada. FSTL1 se observó que se expresaba en el epicardio de adultos, pero disminuyó de manera notable tras el infarto de miocardio (IM) donde luego se reemplazó por la expresión miocárdica. Tal como se ejemplifica a continuación en un ejemplo no limitativo, mientras que la sobreexpresión miocárdica o transgénica endógena en el miocardio no tuvo ningún efecto regenerativo, la aplicación de FSTL1 a la superficie del epicardio del corazón mediante un parche de colágeno comprimido dio lugar a la actividad de medios acondicionados de epicardio. En algunas realizaciones, el tratamiento epicárdico con FSTL1 modificada por ingeniería disminuyó la ^{remodelación patológica, reparó la vascularización e indujo la entrada al ciclo celular de células}a ^{MHC+ preexistentes}después del IM, mejorando, por consiguiente, la función cardiaca. Tal como se muestra adicionalmente en los ejemplos no limitativos descritos a continuación, los estudios in vitro indicaron que FSTL1 estimuló la proliferación de miocitos inmaduros en lugar de células progenitoras. En algunas realizaciones, las propiedades pro-proliferativas de FSTL1 se correlacionan con modificaciones postranscripcionales específicas de tejido de la proteína, tal como su estado de glicosilación. En otras realizaciones de la presente invención, la administración de FSTL1 hipoglicosilada no activa la actividad de señalización de Akt-1. En un ejemplo no limitativo adicional descrito a continuación, la administración de un parche epicárdico de FSTL1 también fue eficaz en un modelo preclínico porcino de infarto de miocardio, destacando la conservación evolutiva de este mecanismo regenerativo en mamíferos. Como tal, sin querer limitarse a la teoría, la administración epicárdica modificada por ingeniería de FSTL1 tiene el potencial de ser una opción atractiva para lograr la regeneración terapéutica de miocardiocitos tras una lesión isquémica.

I. Definiciones

La expresión “tejido cardiaco”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier tejido del corazón. El tejido cardiaco incluye tejido miocárdico, tejido del epicardio y tejido del endocardio. El tejido cardiaco comprende cualquiera de los tipos de células halladas dentro del corazón.

La expresión “factor paracrino derivado del epicardio”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier proteína, polipéptido o fragmento de los mismos producido por las células de la capa epitelial externa del corazón capaz de provocar uno o más de una respuesta fisiológica, protectora, proliferativa y/o reparadora en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) tras una lesión debida a enfermedad cardiovascular, infarto de miocardio u otro episodio isquémico. En una realización, un factor paracrino derivado del epicardio es un componente de medios acondicionados obtenidos de cultivos de células del epicardio.

El término “hipoglicosilada”, se refiere a una proteína que se modifica de una manera postraduccional modificada con un número mínimo de restos de hidratos de carbono o que carece completamente de restos de hidratos de carbono. Hipoglicosilada puede referirse a una proteína que carece completamente de cualquier modificación de hidratos de carbono sea la que fuere (por ejemplo, glicanos con unión a N, glicanos con unión a O o fosfoglicanos). En otra realización, este término se refiere a una proteína con una modificación disminuida de hidratos de carbono (tal como cualquiera de aproximadamente al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100%) en relación con la cantidad de glicosilación que se produce in vivo en condiciones fisiológicas normales en células de mamíferos. Este término también puede referirse a una proteína con una modificación disminuida de hidratos de carbono (tal como cualquiera de aproximadamente como máximo el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100%) en relación con la cantidad de glicosilación que se produce in vivo en condiciones fisiológicas normales en células de mamíferos. Este término también puede referirse a una proteína con una modificación disminuida de hidratos de carbono (tal como cualquiera de aproximadamente al menos el 1-100%, el 5-95%, el 10-90%, el 20-80%, el 30-70%, el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90%, el 90-100% de la modificación disminuida de hidratos de carbono) en relación con la cantidad de glicosilación que se produce in vivo en condiciones fisiológicas normales en células de mamíferos. Este término también puede referirse a una proteína con una modificación disminuida de hidratos de carbono (tal como cualquiera de aproximadamente como máximo el 1-100%, el 5-95%, el 10-90%, el 20-80%, el 30-70%, el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90%, el 90-100% de la modificación disminuida de hidratos de carbono) en relación con la cantidad de glicosilación que se produce in vivo en condiciones fisiológicas normales en células de mamíferos. Las proteínas hipoglicosiladas pueden modificarse por ingeniería de manera que todos los residuos de aminoácido capaces de glicosilarse (tal como residuos de aminoácido capaces de tener unión a N, unión a O o fosfoglicanos) se sustituyan por residuos de aminoácido que no son capaces de glicosilarse.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “reparar el tejido cardiaco tras una lesión” o “reparación del tejido cardiaco tras una lesión” se refiere a cualquier tipo de acción o tratamiento que disminuya, minimice o incluso mantenga el nivel de lesión debido a una enfermedad cardiovascular, infarto de miocardio u otro episodio isquémico. Por consiguiente, reparar una lesión indica que el estado del sujeto no empeora y puede mejorar con respecto a la lesión en cuestión en comparación con el nivel de lesión en ausencia del tratamiento o acción descritos en el presente documento para reducir la lesión.

Tal como se usa en el presente documento, “enfermedad cardiovascular” o “cardiopatía” es un término usado para describir una variedad de enfermedades o episodios que afectan al corazón y/o la vasculatura. Los tipos de cardiopatía incluyen, pero no se limitan a, cardiopatía coronaria, miocardiopatía, cardiopatía isquémica, insuficiencia cardiaca, cardiopatía inflamatoria, cardiopatía valvular y aneurisma. La cardiopatía puede evaluarse usando parámetros clínicos y/o valoraciones conocidas por los expertos en la técnica de diagnóstico y/o tratamiento de la misma, por ejemplo, exploraciones físicas, detección de signos y síntomas de enfermedad cardiovascular, electrocardiograma, ecocardiografía, radiografía de tórax, análisis de sangre para detectar biomarcadores cardiacos, etc. Los biomarcadores usados normalmente en el entorno clínico incluyen, pero no se limitan a, troponinas cardiacas (C, T e I), CK y CK-MB y mioglobina.

Tal como se usa en el presente documento, “ infarto de miocardio” o “ IM” se refiere al desarrollo de necrosis miocárdica, que puede ser provocada por la interrupción del riego sanguíneo al corazón que da como resultado un desequilibrio crítico entre el suministro y la demanda de oxígeno del miocardio. Esto puede deberse a la rotura de la placa con formación de trombos en un vaso coronario que conduce a una reducción aguda del riego sanguíneo a una parte del miocardio; es decir, una oclusión o bloqueo de una arteria coronaria después de la rotura de una placa aterosclerótica susceptible. Si no se trata durante un periodo de tiempo suficiente, la isquemia resultante o la restricción en el riego sanguíneo y la escasez de oxígeno pueden provocar daños o la muerte, es decir, un infarto del corazón. En general, este daño es en gran parte irreversible, y las terapias clínicas hasta el momento apuntan principalmente a retrasar la progresión de la insuficiencia cardiaca para prolongar la supervivencia. El infarto de miocardio puede evaluarse usando parámetros clínicos y/o valoraciones conocidas por los expertos en la técnica de diagnóstico y/o tratamiento del mismo, por ejemplo, exploraciones físicas, detección de signos y síntomas de infarto de miocardio, electrocardiograma, ecocardiografía, radiografía de tórax, análisis de sangre para detectar biomarcadores cardiacos que incluyen troponinas, CK y CK-MB, etc.

Tal como se usa en el presente documento, “reperfusión” se refiere a la restauración del flujo o riego sanguíneo al corazón o tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que se ha vuelto isquémico o hipóxico. Las modalidades de reperfusión incluyen, pero no se limitan a, disolución química del trombo que ocluye, es decir, la trombólisis, la administración de vasodilatadores, angioplastia, intervención coronaria percutánea (PCI), cateterismo y cirugía de injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG).

Un “sujeto” o “ individuo” puede ser un vertebrado, un mamífero o un humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales para fines deportivos, mascotas, primates, ratones y ratas. En un aspecto, un sujeto es un humano.

A menos que se defina lo contrario en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención.

Tal como se usa en el presente documento, los términos en singular “un/uno”, “una” y “el/la” incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

II. Composiciones de la invención

En el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas tal como se reivindica que contienen un factor paracrino derivado del epicardio (FSTL1) y uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.

El factor paracrino derivado del epicardio es una proteína similar a la folistatina 1 (FSTL1; también conocida como proteína relacionada con la folistatina 1). FSTL1 es una proteína que, en humanos, está codificada por el gen FSTL1. Este gen codifica para una proteína con similitud con folistatina, que es una proteína de unión a activina. FSTL1 contiene un módulo de FS (una secuencia similar a la folistatina que contiene 10 residuos de cisteína conservados), un dominio inhibidor de serina proteasa de tipo Kazal, 2 dominios de mano EF y un dominio de tipo C del factor de von Willebrand (“gen de Entrez: “proteína similar a la folistatina 1 FSTL1) En otras realizaciones, FSTL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 (secuencia de referencia de NCBI: NP_009016.1): MWKRWLALALALVAVAWVRAEEELRSKSKICANVFCGAGRECAVTEKGEPTCLCI

EQCKPHKRPVCGSNGKTYLNHCELHRDACLTGSKIQVDYDGHCKEKKSVSPSASPV

VC YQ SNRDELRRRIIQ WLEAEIIPD GWF SKGSN Y SEILDK YFKNEDN GD SRLD S SEFL

KFVEQNETAINITTYPDQENNKLLRGLCVDALIELSDENADWKLSFQEFLKCLNPSFN

PPEKKCALEDETYADGAETEVDCNRCVCACGNWVCTAMTCDGKNQKGAQTQTEE

EMTRYVQELQKHQETAEKTKRVSTKEI (SEQ ID N0:1)

La presente divulgación proporciona ácidos nucleicos que codifican para FSTL1. En diversas realizaciones, el ácido nucleico es un ácido nucleico recombinante. En algunas realizaciones, FSTL1 es codificada por el ácido nucleico de SEQ ID NO:2 (secuencia de referencia de NCBI: NM_007085.4):

1 aggagaatgg ggaggagctg ggggggcagg caggcgggga aggagaggtc ttaaggggcg

61 gcgaggggag gtcgcatttc ctccgaggct ggcgatcggc ggagctccca cctccgctta

121 cagctcgctg ccgccgtcct gccccgcgcc cccaggagac ctggaccaga ccacgatgtg

181 gaaacgctgg ctcgcgctcg cgctcgcgct ggtggcggtc gcctgggtcc gcgccgagga

241 agagetaagg agcaaatcca agatctgtgc caatgtgttt tgtggagccg gccgggaatg

301 tgcagtcaca gagaaagggg aacccacctg tetetgeatt gageaatgea aacctcacaa

361 gaggcctgtg tgtggcagta atggcaagac ctacctcaac cactgtgaac tgeategaga

421 tgcctgcctc actggatcca aaatccaggt tgattacgat ggacactgca aagagaagaa

481 atccgtaagt ccatctgcca gcccagttgt ttgctatcag tccaaccgtg atgagctccg

541 acgtcgcatc atccagtggc tggaagctga gatcattcca gatggctggt tctctaaagg

601 cagcaactac agtgaaatcc tagacaagta ttttaagaac tttgataatg gtgattctcg

661 cctggactcc agtgaattcc tgaagtttgt ggaacagaat gaaactgcca tcaatattac

721 aacgtatcca gaccaggaga acaacaagtt gcttagggga ctctgtgttg atgctctcat

781 tgaactgtct gatgaaaatg ctgattggaa actcagcttc caagagtttc tcaagtgcct

841 caacccatct ttcaaccctc ctgagaagaa gtgtgccctg gaggatgaaa cgtatgcaga

901 tggagctgag accgaggtgg actgtaaccg ctgtgtctgt gcctgtggaa attgggtctg

961 tacagccatg acctgtgacg gaaagaatca gaagggggcc cagacccaga cagaggagga

1021 gatgaccaga tatgtccagg agctccaaaa gcatcaggaa acagctgaaa agaccaagag

1081 agtgagcacc aaagagatct aatgaggagg cacagaccag tgtctggatc ccagcatctt

1141 ctccacttca gcgctgagtt cagtatacac aagtgtctgc tacagtcgcc aaatcaccag

1201 tatttgctta tatagcaatg agttttattt tgtttatttg ttttgcaata aaggatatga

1261 aggtggctgg ctaggaaggg aagggccaca geetteattt ctaggagtgc tttaagagaa

1321 actgtaaatg gtgctctggg gctggaggct agtaaggaaa ctgcatcacg attgaaagag

1381 gaacagaccc aaatctgaac ctcttttgag tttactgcat ctgtcagcag gctgcaggga

1441 gtgcacacga tgccagagag aacttagcag ggtgtccccg gaggagaggt ttgggaagct

1501 ccacggagag gaacgctctc tgcttccagc ctctttccat tgccgtcagc atgacagacc

1561 tccagcatcc acgcatctct tggtcccaat aactgcctct agatacatag ccatactgct

1621 agttaaccca gtgtccctca gacttggatg gagtttctgg gagggtacac ccaaatgatg

1681 cagatacttg tatactttga gccccttagc gacctaacca aattttaaaa atacttttta

1741 ccaaaggtgc tatttctctg taaaacactt ttttttggca agttgacttt attcttcaat

1801 tattatcatt atattattgt tttttaatat tttattttct tgactaggta ttaagctttt

1861 gtaattattt ttcagtagtc ccaccacttc ataggtggaa ggagtttggg gttcttcctg

1921 gtgcaggggc tgaaataacc cagatgcccc caccctgcca catactagat gcagcccata

1981 gttggccccc ctagcttcca gcagtccact atctgccaga ggagcaaggg tgccttagac

2041 cgaagccagg ggaagaagca tcttcataaa aaactttcaa gatccaaaca ttaatttgtt

2101 tttatttatt ctgagaagtt gaggcaaatc agtattccca aggatggcga caagggcagc

2161 caagcagggc ttaggatatc ccagcctacc aatatgctca ttcgactaac taggagggtg

2221 agttggccct gtctcttctt ttttctggac ctcagtttcc tcagtgagct ggtaagaatg

2281 cactaacctt ttgatttgat aagttataaa ttctgtggtt ctgatcattg gtccagaggg

2341 gagataggtt cctgtgattt ttccttcttc tctatagaat aaatgaaatc ttgttactag

2401 aacaagaaat gtcagatggc caaaaacaag atgaccagat ttgatctcag cctgatgacc

2461 ctacaggtcg tgctatgata tggagtcctc atgggtaaag caggaagaga gtgggaaaga

2521 gaaccacccc actctgtctt catatttgca tttcatgttt aacctccggc tggaaataga

2581 aagcattccc ttagagatga ggataaaaga aagtttcaga ttcaacaggg ggaagaaaat

2641 ggagatttaa tcctaaaact gtgacttggg gaggtcagtc atttacagtt agtcctgtgt

2701 ctttcgactt ctgtgattat taaccccact cactaccctg tttcagatgc atttggaata

2761 ccaaagatta aatccttgac ataagatctc atttgcagaa agcagattaa agaccatcag

2821 aaggaaatta tttaggttgt aatgcacagg caactgtgag aaactgttgt gccaaaaata

2881 gaattccttc tagtttttct tgttctcatt tgaaaggaga aaattccact ttgtttagca

2941 tttcaagctt ttatgtatcc atcccatcta aaaactcttc aaactccact tgttcagtct

3001 gaaatgcagc tccctgtcca agtgccttgg agaactcaca gcagcacgcc ttaatcaaag

3061 gttttaccag cccttggaca ctatgggagg agggcaagag tacaccaatt tgttaaaagc

3121 aagaaaccac agtgtctctt cactagtcat ttagaacatg gttatcatcc aagactactc

3181 taccctgcaa cattgaactc ccaagagcaa atccacattc ctcttgagtt ctgcagcttc

3241 tgtgtaaata gggcagctgt cgtctatgcc gtagaatcac atgatctgag gaccattcat

3301 ggaagctgct aaatagccta gtctggggag tcttccataa agttttgcat ggagcaaaca

3361 aacaggatta aactaggttt ggttccttca gccctctaaa agcatagggc ttagcctgca

3421 ggcttccttg ggctttctct gtgtgtgtag ttttgtaaac actatagcat ctgttaagat

3481 ccagtgtcca tggaaacatt cccacatgcc gtgactctgg actatatcag tttttggaaa

3541 gcagggttcc tctgcctgct aacaagccca cgtggaccag tctgaatgtc tttcctttac

3601 acctatgttt ttaagtagtc aaacttcaag aaacaatcta aacaagtttc tgttgcatat

3661 gtgtttgtga acttgtattt gtatttagta ggcttctata ttgcatttaa cttgtttttg

3721 taactcctga ttcttccttt tcggatacta ttgatgaata aagaaattaa agtgatggtt

3781 ttggttt cctttccccc aattaaggcc aaataaagtc gtgagaacat tacccattta

Puede incorporase un ácido nucleico de FSTL1 en un vector, tal como un vector de expresión, usando técnicas convencionales conocidas por un experto en la técnica. Los métodos usados para ligar el constructo de ADN que comprende un ácido nucleico de interés tal como FSTL1, un promotor, un terminador y otras secuencias y para insertarlos en un vector adecuado se conocen bien en la técnica. De manera adicional, los vectores pueden construirse usando técnicas de recombinación conocidas (por ejemplo, la tecnología Gateway de Invitrogen Life Technologies).

En algunas realizaciones, puede ser deseable sobreexpresar ácidos nucleicos de FSTL1 a niveles mucho mayores que los hallados actualmente en células que se producen de manera natural. Este resultado puede lograrse mediante la clonación selectiva de los ácidos nucleicos que codifican para aquellos polipéptidos en plásmidos multicopia o que colocan aquellos ácidos nucleicos bajo un promotor fuertemente inducible o constitutivo. Los métodos para sobreexpresar los polipéptidos deseados son habituales y bien conocidos en la técnica de la biología molecular y pueden hallarse ejemplos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor, 2001.

Puede usarse una variedad de células huésped para elaborar una célula huésped recombinante que puede expresar FSTL1. La célula huésped puede ser una célula que produce de manera natural FSTL1 o una célula que no produce de manera natural FSTL1. Por ejemplo, pueden usarse células de mamíferos, tales como, pero sin limitarse a, células de ovario de hámster chino (CHO) o cultivos de células derivadas del epicardio para producir FSTL1. Sin embargo, en otras realizaciones, se usan las células derivadas de organismos que no glicosilan las proteínas tras la traducción (es decir, células que no modifica de manera postraduccional proteínas con uno o más restos de hidratos de carbono) para producir Fstl recombinante.

Los ejemplos no limitativos de células que no glicosilan proteínas tras la traducción incluyen células bacterianas de vasos sanguíneos. Como tal, en una realización, la célula huésped es una célula bacteriana. En otra realización, la célula bacteriana es una célula bacteriana Gram positiva o una célula bacteriana Gram negativa. En otra realización, la célula bacteriana se selecciona del grupo que consiste en células de E. coli, L. acidophilus, P. citrea, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis, S. albus, S. lividans, S. coelicolor, S. griseus, Pseudomonas sp., P. alcaligenes, Clostridium sp., Corynebacterium sp. y C. glutamicum.

Los ácidos nucleicos que codifican para FSTL1 o los vectores que los contienen pueden insertarse en una célula huésped (por ejemplo, una célula bacteriana) usando técnicas convencionales para la expresión del polipéptido de FSTL1 codificado. La introducción de un constructo de ADN o vector en una célula huésped puede realizarse usando técnicas tales como transformación, electroporación, microinyección nuclear, transducción, transfección (por ejemplo, lipofección mediada o transfección mediada por DEAE-dextrina o transfección usando un virus de fago recombinante), incubación con precipitado fosfato de calcio-ADN, bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos con ADN y fusión de protoplastos. Las técnicas de transformación generales se conocen bien en la técnica (véanse, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) Capítulo 9, 1987; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor, 2001; y Campbell et al., Curr Genet, 16:53-56, 1989, a los que se hace referencia en el presente documento como referencia en su totalidad, particularmente con respecto a los métodos de transformación). Los ácidos nucleicos introducidos pueden integrarse en el ADN cromosómico de la célula huésped o mantenerse como secuencias de replicación extracromosómicas. En aún otra realización, puede producirse un polipéptido de FSTL1 en una célula huésped a través del suministro de ARNm modificados químicamente que codifican para el polipéptido deficiente en glicosilación de Fstl1 mutado. (véase, Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Zangi L, et al. Nat Biotechnol. Octubre de 2013;31(10):898-907). Los ARN modificados químicamente, también denominados en el presente documento ARNmod, pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de fosfato en las uniones internucleótidos de fosforotioato, modificaciones del grupo 2'-hidroxilo de la ribosa u otras modificaciones a la estructura principal del fosfato o restos de azúcares del ARNm.

En algunas realizaciones, FSTL1 es una FSTL1 hipoglicosilada. La FSTL1 hipoglicosilada puede obtenerse produciendo FSTL1 recombinante en células huésped que no modifican postraduccionalmente de manera natural proteínas con restos de hidratos de carbono (tal como bacterias, por ejemplo, E. coli) o que se han modificado por ingeniería de tal manera que no son capaces de modificar de manera postraduccional proteínas con restos de hidratos de carbono. Alternativamente, la FSTL1 hipoglicosilada puede producirse en un mamífero u otras células eucariotas de vasos sanguíneos que normalmente modifican de manera postraduccional proteínas con restos de hidratos de carbono, pero que se han tratado con uno o más inhibidores de glicosilación. Los inhibidores de glicosilación adecuados incluyen, sin limitación, tunicamicina (que bloquea toda la N-glicosilación de las proteínas), estreptovirudina, micospocidina, anfomicina, tsushimicina, antibiótico 24010, antibiótico MM 19290, bacitracina, corinetoxina, showdomicina, duramicina, 1-desoximanonojirimicina, desoxinojirimicina, N-metil-1-desoximanojirimicina, brefeldin A, un análogo de glucosa, un análogo de manosa, 2-desoxi-D-glucosa, 2-desoxiglucosa, D-(+)-manosa, D-(+)-galactosa, 2-desoxi-2-fluoro-D-glucosa, 1,4-didesoxi-1,4-imino-D-manitol (DIM), fluoroglucosa, fluoromanosa, UDP-2-desoxiglucosa, GDP-2-desoxiglucosa, un inhibidor de hidroximetilglutaril-CoA reductasa, 25-hidroxicolesterol, hidroxicolesterol, swainsonina, cicloheximida, puromicina, actinomicina D, monensina, fenilhidrazona de m-clorocarbonil-cianuro (CCCP), compactina, doliquil-fosforil-2-desoxiglucosa, N-acetil-D-glucosamina, higoxantina, timidina, colesterol, glucosamina, manosamina, castanospermina, glutamina, bromoconduritol, epóxido de conduritol, un derivado de conduritol, aglicosilmetil-p-nitrofeniltriazeno, p-hidroxinorvalina, treo-p-fluoroasparagina, 8-lactona del ácido D-(+)-glucónico, di(2-etilhexil)fosfato, tributilfosfato dodecilfosfato, éster 2-dimetilaminetílico del ácido (difenilmetil)-fosfórico, yoduro de [2-(difenilfosfiniloxi)etil]trimetilamonio, yodoacetato, 2-desoxi-D-glucosa y fluoroacetato.

Alternativamente, en otras realizaciones, la FSTL1 recombinante se modifica por ingeniería de tal manera que no es capaz de glicosilarse cuando se produce usando una célula huésped eucariota u otra que pueda glicosilarse. En la mayoría de los contextos biológicos, la glicosilación es o bien con unión a N o bien con unión a O. El proceso de glicosilación con unión a N se produce en eucariotas y ampliamente en arqueas, pero muy raramente en eubacterias. En la glicosilación con unión a N, los glicanos (es decir, restos que contienen hidratos de carbono) se unen al átomo de nitrógeno de una cadena lateral de aminoácido asparagina o arginina. Los glicanos con unión a N se unen casi siempre al átomo de nitrógeno de una cadena lateral de asparagina (Asn) que está presente como parte de la secuencia de consenso de Asn-X-Ser/Thr, en la que X es cualquier aminoácido excepto prolina (Pro), serina (Ser) y treonina (Thr). La glicosilación con unión a O es una forma de glicosilación que se produce en el aparato de Golgi en eucariotas. En la glicosilación con unión a O, los glicanos se unen al oxígeno del hidroxilo de las cadenas laterales de los aminoácidos serina, treonina, tirosina, hidroxilisina o hidroxiprolina.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la FSTL1 recombinante se modifica por ingeniería de tal manera que es incapaz de glicosilarse con unión a N. En este caso, algunos o todos los aminoácidos arginina o asparagina capaces de glicosilarse en la secuencia de polipéptido pueden sustituirse por un aminoácido incapaz de glicosilarse (por ejemplo, glutamina). En otras realizaciones, FSTL1 recombinante se modifica por ingeniería de tal manera que es incapaz de glicosilarse con unión a O. En este caso, todos los residuos de serina, treonina, tirosina, hidroxilisina o hidroxiprolina capaces de glicosilarse en la secuencia de polipéptido pueden sustituirse por un aminoácido incapaz de glicosilarse (por ejemplo, alanina). En aún realizaciones adicionales, FSTL1 recombinante se modifica por ingeniería de tal manera que es incapaz de glicosilarse con unión a O glicosilarse con unión a N sustituyendo todos los aminoácidos capaces de glicosilarse por aminoácidos incapaces de glicosilarse. Puede producirse FSTL1 incapaz de glicosilarse modificada por ingeniería en células huésped a través de la transfección de un plásmido, un vector viral que porta un gen que codifica para una FSTL1 incapaz de glicosilarse o ARNm sintetizado químicamente o miméticos de ARNm. Alternativamente, un gen que codifica para un FSTL1 incapaz de glicosilarse puede integrarse en un cromosoma de la célula huésped bajo el control de un promotor inducible o que se expresa de manera constitutiva. En aún otra realización, puede producirse un polipéptido de FSTL1 incapaz de glicosilarse en una célula huésped a través del suministro de ARNm modificados que codifican para un polipéptido de FSTL1 incapaz de glicosilarse.

La presente invención descrita contempla FSTL1 tal como se reivindica incorporada en una composición farmacéutica (por ejemplo, una composición farmacéutica estéril) que contiene uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Tal como se usa en el presente documento, un “portador farmacéuticamente aceptable” o un “excipiente farmacéuticamente aceptable” según la presente invención es un componente tal como un portador, diluyente o excipiente de una composición que es compatible con los otros componentes de la composición de manera que pueden combinarse con los agentes y/o las composiciones de la presente invención sin eliminar la actividad biológica de los agentes o las composiciones (por ejemplo, FSTL1, tal como FSTL1 hipoglicosilada), y es adecuado para su uso en sujetos tal como se proporciona en el presente documento sin efectos secundarios adversos indebidos (tal como toxicidad, irritación, respuesta alérgica y muerte). Los efectos secundarios son “ indebidos” cuando su riesgo prevalece sobre el beneficio proporcionado por la composición farmacéutica. Los ejemplos no limitativos de componentes farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, cualquiera de los portadores farmacéuticos convencionales tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, agua estéril, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, lecitina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, emulsiones tales como emulsiones aceite/agua o emulsiones agua/aceite, microemulsiones, nanoportadores y diversos tipos de agentes humectantes. También pueden incluirse aditivos tales como agua, alcoholes, aceites, glicoles, conservantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes, agentes de suspensión, y similares en la composición junto con el portador, diluyente o excipiente. En una realización, un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para su uso en las composiciones divulgas en el presente documento es estéril, libre de patógenos y/o segura de otra manera para la administración a un sujeto sin riesgo de infección asociada y otros efectos secundarios adversos indebidos.

Cualquiera de las composiciones farmacéuticas que contienen FSTL1 (tal como que contienen FSTL1 hipoglicosilada) divulgadas en el presente documento pueden formularse para la administración usando cualquier número de métodos de administración disponibles en la técnica. La administración puede ser mediante una variedad de vías incluyendo parche, catéter, endoprótesis vascular, oral, rectal, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intranasal, y similares. En algunas realizaciones, los métodos de administración anteriores pueden usarse para administrar suspensiones que comprenden FSTL1 (por ejemplo, FSTL1 hipoglicosilada mezclado con partículas de Gelfoam). Estas composiciones son eficaces tanto como composiciones inyectables como orales. Tales composiciones se preparan de una manera bien conocida en la técnica farmacéutica y comprenden al menos un compuesto activo. Cuando se emplean como composiciones orales, las composiciones de polipéptido se protegen de la digestión con ácidos en el estómago mediante un protector farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, cualquiera de las composiciones farmacéuticas que contienen FSTL1 (tal como que contienen FSTL1 hipoglicosilada) divulgadas en el presente documento pueden incorporarse en un parche modificado por ingeniería para la administración directamente al epicardio o al tejido dañado del miocardio. En una realización, se usa un gel de colágeno comprimido para producir un parche de colágeno tridimensional (3D) para administrar la FSTL1 hipoglicosilada directamente al epicardio. En algunas realizaciones, pueden comprimirse geles de colágeno altamente hidratados para eliminar el agua en exceso y producir un biomaterial denso con propiedades biológicas y mecánicas mejoradas.

Tal como se describe en el ejemplo 2 a continuación, se sometieron geles de colágeno altamente hidratados a compresión no confinada a través de la aplicación de un esfuerzo de compresión estático de -1.400 Pa durante 5 minutos dando como resultado una reducción del volumen de ~98-99%. El módulo de elasticidad del colágeno comprimido se aproxima al del epicardio embrionario que es óptimo para la contractilidad de los miocardiocitos inmaduros. La elasticidad de los parches de colágeno comprimido puede evaluarse mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) en modo de nanomuesca, usando un desencadenador de fuerza que da como resultado una deformación local mínima de menos de aproximadamente el 10% (tal como menos de cualquiera de aproximadamente el 9%, el 8%, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2%, el 1% o el 0,5%, incluidos todos los valores que se sitúan entre estos porcentajes) y que tienen una muesca de ~100 nm para minimizar el efecto de artefactos relacionados con el sustrato. Los parches de colágeno 3D pueden sembrarse con FSTL1 producida de manera recombinante (tal como FSTL1 hipoglicosilada) seguido por administración directa al epicardio o a un área dañada o lesionada del miocardio mediante, por ejemplo, sutura. En algunas realizaciones, los parches de colágeno 3D tienen un módulo de elasticidad comparable al informado para el epicardio embrionario (E-12+4 kPa, tal como cualquiera de aproximadamente 8 kDa, 9 kDa, 10 kDa, 11 kDa, 12 kDa, 13 kDa, 14 kDa, 15 kDa o 16 kDa). En otras realizaciones, los parches de colágeno 3D tiene un módulo de elasticidad que es menor que el del epicardio maduro (E > 30-40 kPa). En otras realizaciones, los parches de colágeno 3D tienen un módulo de elasticidad que es menor que el del tejido cardiaco fibrótico (E > 100 kPa), pero mayor que el de la mayoría de biomateriales de andamiaje usados actualmente (E < 1 kPa). En otra realización, los parches de colágeno 3D tienen un módulo de elasticidad de aproximadamente cualquiera de 1 kPa, 2 kPa, 3 kPa, 4 kPa, 5 kPa, 6 kPa, 7 kPa, 8 kPa, 9 kPa, 10 kPa, 11 kPa, 12 kPa, 13 kPa, 14 kPa, 15 kPa, 16 kPa, 17 kPa, 18 kPa, 19 kPa, 20 kPa, 21 kPa, 22 kPa, 23 kPa, 24 kPa, 25 kPa, 26 kPa, 27 kPa, 28 kPa o 29 kPa.

Puede hallarse información adicional relacionado con la construcción y el uso de parches a base de colágeno 3D para la administración de sustancias directamente al corazón en Serpooshan, V. et al., Acta Biomater, 2010; 6, 3978-3987; Serpooshan, V. et al., J Biomed Mater Res A, 2011; 96, 609-620; y Abou Neel et al., Soft Matter, 2006; 2, 986-992.

Otra opción para la administración de un polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada al tejido cardiaco es un componente de un hidrogel autopolimerizante administrado mediante tecnología de catéter. Puede hallarse información adicional relacionada con este tipo de administración Koudstaal et al., J. of Cardiovasc. Trans. Res. (2014) 7:232-241. También puede emplearse administración mediante catéter para suspensiones que comprenden FSTL1 (por ejemplo, FSTL1 hipoglicosilada mezclada con partículas de Gelfoam).

III. Métodos

Los polipéptidos, composiciones farmacéuticas, kits y parches de colágeno 3D reivindicados son útiles en los métodos para reparar tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) tras una lesión en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio. El factor paracrino derivado del epicardio es un polipéptido de proteína similar a la folistatina 1 (FSTL1) tal como se reivindica. En otras realizaciones de la presente invención, la administración de FSTL1 no activa la actividad de señalización de Akt-1 (véase la figura 20). En otras realizaciones de la presente invención, la administración de FSTL1 no da como resultado una disminución de la apoptosis de miocardiocitos (véase la figura 6).

La lesión al tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) puede asociarse con un número cualquiera de enfermedades o estados conocidas por afectar al corazón o al aparato circulatorio e incluyen, sin limitación, cardiopatía coronaria, miocardiopatía, cardiopatía isquémica, insuficiencia cardiaca, cardiopatía inflamatoria, cardiopatía valvular y aneurisma. En una realización, la lesión es provocada por un infarto de miocardio (IM; tal como infarto agudo de miocardio (IAM)). En otra realización, la lesión es provocada por un episodio isquémico seguido por reperfusión.

La reparación del tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) lesionado puede comprender aumentar el número de miocardiocitos que pueden medirse indirectamente en el sujeto vivo mediante diversos métodos de obtención de imágenes (como IRM de realce tardío, DE-IRM) tal como disminuye en el tamaño del infarto de miocardio. Véase, por ejemplo: (Hendel RC et al, JACC 48(7);1475-97) y (Sardella G et al, JACC 2009; 53(4):309-15). En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente el 2%, el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 90%, el 100%, o aproximadamente el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90%, el 90-100% de recuperación del músculo perdido y reducción del tamaño del infarto. En otras realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente al menos el 2%, el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 90%, el 100%, o aproximadamente el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90%, el 90-100% de recuperación del músculo perdido y reducción del tamaño del infarto. En otras realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente como máximo el 2%, el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 90%, el 100%, o aproximadamente el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90%, el 90-100% de recuperación del músculo perdido y reducción del tamaño del infarto.

En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos divulgados en el presente documento, la FSTL1 se infusiona, se siembra o se incorpora en un parche a base de colágeno 3D (tal como cualquiera de los descritos en el presente documento). Luego el parche a base de colágeno puede ponerse en contacto directamente con el epicardio o un área lesionada del miocardio (tal como un área del miocardio expuesta a un episodio isquémico, tal como infarto de miocardio). El parche de colágeno 3D puede aplicarse al epicardio o miocardio a través de sutura o mediante cualquier otro medio conocido en la técnica para poner en contacto el parche con el tejido lesionado.

En aún otras realizaciones, la FSTL1 es un componente de un hidrogel que se administra al epicardio, al endocardio, o a un área lesionada del miocardio (mediante, por ejemplo, tecnología de catéter; Koudstaal et al., J. of Cardiovasc. Trans. Res. (2014) 7:232-241.

En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos divulgados en el presente documento, se logra un aumento de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o más veces en el número de miocardiocitos en comparación con el número de miocardiocitos en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no está en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. La evaluación de la replicación de miocardiocitos es rutinaria en la técnica y puede determinarse, por ejemplo, determinando el número de células ^{positivas para}a ^{-actinina en una muestra de tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) de un sujeto. En algunas otras}realizaciones, el efecto sobre el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) podría lograrse con la colocación de FSTL1 hipoglicosilada en la proximidad del espacio endocárdico (es decir, el endocardio), por ejemplo, mediante la administración a través de tecnología de catéter. En algunas realizaciones un catéter adecuado puede ser un catéter NOGA (Johnson & Johnson).

En algunas realizaciones, el efecto sobre el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) puede lograrse con la colocación de FSTL1 hipoglicosilada por vía endocárdica en el corazón mediante sistemas de administración mediante catéter percutáneas, por ejemplo, como los sistemas disponibles desarrollados por BioCardia (www.biocardia.com).

En algunas realizaciones, el efecto sobre el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) puede lograrse con la colocación de FSTL1 hipoglicosilada por vía epicárdica en el corazón usando dispositivos de catéter similares a los usados en otras aplicaciones (por ejemplo, Epicardial Catheter System™, St. Jude Medical).

En algunas realizaciones, el efecto sobre el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) puede lograrse con la colocación de FSTL1 hipoglicosilada cuando se impregna en endoprótesis farmacoactivas (por ejemplo, las disponibles de Abbott Laboratories o Biosensors International, entre otros).

En algunas realizaciones, el efecto sobre el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) puede lograrse con la colocación de FSTL1 hipoglicosilada por vía sistémica, usando una formulación aprobada.

En algunas realizaciones, el efecto sobre el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) puede lograrse con la colocación de FSTL1 hipoglicosilada mediante el uso de un compuesto o fármacos que inhiban la glicosilación de la proteína FSTL1 glicosilada endógena, que está fácilmente disponible y es conocida por un experto en la técnica.

En algunas realizaciones, el efecto sobre el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) puede lograrse con la colocación de FSTL1 hipoglicosilada mediante la introducción de ARNmod que codifican para sitios de N-glicosilación de mutagénesis dirigida específicos en la secuencia de ARNm de FSTL1.

En algunas realizaciones, el efecto sobre el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) puede lograrse con la colocación de FSTL1 hipoglicosilada mediante la edición de genoma usando tecnología CRISPR/Cas9 o similar, (véase, por ejemplo, Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Hao Yin, et al. Nature Biotechnology 32, 551-553 (2014) doi:10,1038/nbt.2884).

En algunas otras realizaciones, el efecto sobre el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) puede lograrse con la administración de un mimético de molécula pequeña de FSTL1 hipoglicosilada

En otras realizaciones, la reparación del tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) lesionado incluye una mejora en el acortamiento fraccionario en porcentaje de tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en comparación con la cantidad de acortamiento fraccionario en porcentaje en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no está en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% o mayor de mejora en el acortamiento fraccionario en porcentaje de tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en comparación con el mismos sujeto antes del tratamiento, incluidos todos los valores que están entre estos porcentajes. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente como máximo el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% de mejora en el acortamiento fraccionario en porcentaje de tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en comparación con el mismo sujeto antes del tratamiento, incluidos todos los valores que están entre estos porcentajes. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente al menos el 1-100%, el 5-95%, el 10-90%, el 20-80%, el 30-70%, el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90%, el 90-100% de mejora en el acortamiento fraccionario en porcentaje de tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en comparación con el mismo sujeto antes del tratamiento, incluidos todos los valores que están entre estos porcentajes. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente como máximo el 1-100%, el 5-95%, el 10-90%, el 20-80%, el 30-70%, el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90%, el 90-100% de mejora en el acortamiento fraccionario en porcentaje de tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en comparación con el mismo sujeto antes del tratamiento, incluidos todos los valores que están entre estos porcentajes. La reparación del tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) lesionado can también comprende un aumento en la cantidad de citocinesis de miocardiocitos en comparación la cantidad de citocinesis de miocardiocitos en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no está en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% o mayor de mejora de la cantidad de citocinesis de miocardiocitos. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente como máximo el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% o mayor de mejora de la cantidad de citocinesis de miocardiocitos. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente al menos el 1-100%, el 5-95%, el 10-90%, el 20-80%, el 30-70%, el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90% o el 90-100% de mejora de la cantidad de citocinesis de miocardiocitos. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente como máximo el 1-100%, el 5-95%, el 10-90%, el 20-80%, el 30-70%, el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90% o el 90-100% de mejora de la cantidad de citocinesis de miocardiocitos. La evaluación de la citocinesis de miocardiocitos es rutinaria en la técnica y puede medirse determinando, por ejemplo, el nivel de expresión de Aurora cinasa B en una muestra de tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) de un sujeto. Los métodos permiten realizar estos estudios sólo postmortem o después de una biopsia o después de un trasplante.

En algunas realizaciones, la reparación del tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) lesionado puede comprender la disminución de la apoptosis de miocardiocitos en comparación con la cantidad apoptosis de miocardiocitos en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no está en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 100% o mayor de reducción en la apoptosis de miocardiocitos en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico), incluidos todos los valores que están entre estos porcentajes. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente como máximo el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% de reducción en la apoptosis de miocardiocitos en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico), incluidos todos los valores que están entre estos porcentajes. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente al menos el 1-100%, el 5-95%, el 10-90%, el 20-80%, el 30-70%, el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90%, el 90-100% o mayor de reducción en la apoptosis de miocardiocitos en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico), incluidos todos los valores que están entre estos porcentajes. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente como máximo el 1-100%, el 5-95%, el 10-90%, el 20-80%, el 30-70%, el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90% o el 90-100% de reducción en la apoptosis de miocardiocitos en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico), incluidos todos los valores que están entre estos porcentajes. La evaluación de la apoptosis de miocardiocitos es rutinario (postmortem o ex-vivo, después de la separación del corazón) en la técnica y puede medirse, por ejemplo, mediante tinción con TUNEL de una muestra de tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) de un sujeto.

La reparación del tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) lesionado también puede comprender niveles aumentados de uno o más transcritos que codifican para proteínas contráctiles específicas del músculo cardiaco en miocardiocitos en comparación con el nivel transcripcional de estas proteínas contráctiles en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no está en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente como máximo el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 100% o mayor de un nivel aumento de uno o más transcritos que codifican para proteínas contráctiles específicas del músculo cardiaco. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% de nivel aumentado de uno o más transcritos que codifican para proteínas contráctiles específicas del músculo cardiaco. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente al menos el 1-100%, el 5-95%, el 10-90%, el 20-80%, el 30-70%, el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90% o el 90-100% de nivel aumentado de uno o más transcritos que codifican para proteínas contráctiles específicas del músculo cardiaco. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente como máximo el 1-100%, el 5-95%, el 10-90%, el 20-80%, el 30-70%, el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90% o el 90-100% de nivel aumentado de uno o más transcritos que codifican para proteínas contráctiles específicas del músculo cardiaco. En algunas realizaciones, las proteínas contráctiles específicas del músculo cardiaco se seleccionan del grupo que consiste en myh6, mlc2v, y mlc2a. La evaluación de transcrito de proteína contráctil específico del músculo cardiaco es rutinaria en la técnica y puede medirse mediante, por ejemplo, transferencia de tipo Northern, inmunotransferencia de tipo Western, PCR con transcriptasa inversa (RT) PCR, análisis de FACS, inmunohistoquímica o hibridación in situ.

La reparación del tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) lesionado puede comprender un aumento de células actinina+ con Ca2+ contráctil rítmico en miocardiocitos. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de un aumento de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más veces en la cantidad de células actinina+ con Ca2+ contráctil rítmico en miocardiocitos en comparación con el número de células actinina+ con Ca2+ contráctil rítmico en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no está en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. La evaluación de células actinina+ con Ca2+ contráctil rítmico en miocardiocitos es rutinaria en la técnica (véase el ejemplo 1, a continuación en el presente documento).

El tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) lesionado puede ponerse en contacto con cualquiera de las composiciones de factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) (tal como composiciones farmacéuticas) divulgadas en el presente documento antes, durante o después de la lesión al tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico). En algunas realizaciones, el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) se pone en contacto con la composición de factor paracrino derivado del epicardio en un sujeto considerado en riesgo de una enfermedad cardiovascular, IM u otro episodio isquémico miocárdico para mitigar o prevenir una lesión al miocardio por el episodio. En otras realizaciones, el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) se pone en contacto con la composición de factor paracrino derivado del epicardio inmediatamente tras la aparición de un episodio isquémico provocado por una enfermedad cardiovascular o un IM, tal como aproximadamente 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 11 minutos, 12 minutos, 13 minutos, 14 minutos, 15 minutos, 16 minutos, 17 minutos, 18 minutos, 19 minutos, 20 minutos, 21 minutos, 22 minutos, 23 minutos, 24 minutos, 25 minutos, 26 minutos, 27 minutos, 28 minutos, 29 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 1,5 horas, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas, 3.5 horas, 4 horas, 4,5 horas, 5 horas 5,5 horas, 6 horas, 6,5 horas, 7 horas, 7,5 horas, 8 horas, 8,5 horas, 9 horas, 9.5 horas, 10 horas, 10,5 horas, 11 horas, 11,5 horas o 12 horas o más (incluidos todos los periodos de tiempo que están entre estos valores). En algunas realizaciones, la composición se administra menos de 1 minuto después de la lesión cardiaca. Alternativamente, en otras realizaciones, el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) se pone en contacto con la composición de factor paracrino derivado del epicardio posteriormente a la lesión, tal como al menos 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas o 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, tres semanas, un mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, o uno o más años (incluidos todos los periodos de tiempo que están entre estos valores) tras la aparición de un episodio isquémico provocado por una enfermedad cardiovascular o un IM.

Cualquiera de los métodos de tratamiento de lesiones al tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) divulgados en el presente documento pueden dar como resultado un aumento de la supervivencia en un sujeto tras una lesión. Tal como se usa en el presente documento, un aumento de la supervivencia incluye, por ejemplo, al menos aproximadamente el 5% (por ejemplo, al menos aproximadamente el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 40%, el 45%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 100%, el 110%, el 120%, el 130%, el 140%, el 150% o más del 200% o mayor) de aumento en la supervivencia de un sujeto en comparación con la supervivencia relativa en sujetos que no se han sometido a los métodos descritos en el presente documento. Puede medirse el tiempo de supervivencia, por ejemplo, en días, semanas, meses o años. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) lesionado con un factor paracrino derivado del epicardio según cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede prolongar la supervivencia del sujeto en al menos seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, 10 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses, 36 meses, o más.

En algunas realizaciones, la reparación del tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) lesionado puede comprender disminuir o atenuar la fibrosis en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en comparación con la cantidad de fibrosis en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no está en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 100%, o mayor de reducción en la fibrosis en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico), incluidos todos los valores que están entre estos porcentajes. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado de aproximadamente como máximo el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% de reducción en la fibrosis en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico), incluidos todos los valores que están entre estos porcentajes. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente al menos el 1-100%, el 5-95%, el 10-90%, el 20-80%, el 30-70%, el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90% o el 90-100% de reducción en la fibrosis en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico), incluidos todos los valores que están entre estos porcentajes. La evaluación de la fibrosis de miocardiocitos es rutinaria en la técnica y puede medirse mediante DE-IRM, o mediante examen histológico de tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) (postmortem o mediante biopsia). En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente como máximo el 1-100%, el 5-95%, el 10-90%, el 20-80%, el 30-70%, el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90% o el 90-100% de reducción en la fibrosis en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico), incluidos todos los valores que están entre estos porcentajes. La evaluación de la fibrosis de miocardiocitos es rutinaria en la técnica y puede medirse mediante DE-IRM, o mediante examen histológico del tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) (postmortem o mediante biopsia).

La reparación del tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) lesionado puede comprender de manera adicional un aumento de la vascularización de la región lesionada del tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico). En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 100%, o mayor de recuperación o aumento de perfusión por la sangre en la cantidad de vascularización en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en comparación con la cantidad relativa de vascularización en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no está en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente como máximo el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 100% de recuperación o aumento de perfusión por la sangre en la cantidad de vascularización en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en comparación con la cantidad relativa de vascularización en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no está en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente al menos el 1-100%, el 5-95%, el 10-90%, el 20-80%, el 30-70%, el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90% o el 90-100% de recuperación o aumento de perfusión por la sangre en la cantidad de vascularización en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en comparación con la cantidad relativa de vascularización en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no está en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de aproximadamente como máximo el 1-100%, el 5-95%, el 10-90%, el 20-80%, el 30-70%, el 5-10%, el 10-20%, el 20-30%, el 30-40%, el 40-50%, el 50-60%, el 60-70%, el 70-80%, el 80-90% o el 90-100% de recuperación o aumento de perfusión por la sangre en la cantidad de vascularización en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en comparación con la cantidad relativa de vascularización en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no está en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. La evaluación de la vascularización en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) es rutinaria en la técnica y puede evaluarse midiendo la expresión de proteínas tales como factor de von Willebrand (vWF) o actina del músculo liso en células de vasos sanguíneos (véase el ejemplo 4, a continuación en el presente documento).

En realizaciones adicionales, la reparación del tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) lesionado abarca un aumento de la entrada al ciclo celular de miocardiocitos. En algunas realizaciones, poner en contacto el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) con un factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) da como resultado cualquiera de al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o más veces de aumento en la cantidad de entrada al ciclo celular de miocardiocitos en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) en comparación con la cantidad de entrada al ciclo celular de miocardiocitos en tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) que no está en contacto con un factor paracrino derivado del epicardio tras una lesión. La evaluación de la entrada al ciclo celular de miocardiocitos en el tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) es rutinaria en la técnica y puede evaluarse midiendo la expresión de, por ejemplo, fosfo-histona H3 (véase el ejemplo 5, a continuación en el presente documento).

En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos divulgados en el presente documento, el factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) se infusiona, siembra o incorpora en un parche a base de colágeno 3D (tal como cualquiera de los descritos en el presente documento). Luego puede ponerse en contacto el parche a base de colágeno directamente con el epicardio o un área lesionada de miocardio (tal como un área del miocardio expuesto a un episodio isquémico, tal como infarto de miocardio). El parche de colágeno 3D puede aplicarse al epicardio o al miocardio a través de sutura o mediante cualquier otro medio conocido en la técnica para poner en contacto el parche con el tejido lesionado.

En aún otras realizaciones, el factor paracrino derivado del epicardio (tal como FSTL1 hipoglicosilada) es un componente de un hidrogel que se administra al epicardio, al endocardio o a un área lesionada de miocardio (mediante, por ejemplo, tecnología de catéter; Koudstaal et al., J. of Cardiovasc. Trans. Res. (2014) 7:232-241).

IV. Kits

También se proporcionan en el presente documento kits que comprenden (i) un factor paracrino derivado del epicardio (tal como un polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada); y (ii) uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Uno o ambos de estos componentes del kit pueden elaborarse para que sean estériles de manera que puedan administrarse a un individuo que lo necesita (por ejemplo, un individuo con lesión cardiaca, tal como IM). Los kits pueden contener opcionalmente un parche de colágeno 3D (tal como cualquiera de los divulgados en el presente documento) que pueden sembrarse o infusionarse con el factor paracrino derivado del epicardio antes de la administración a un sujeto. Alternativamente, un parche de colágeno 3D sembrado previamente o infusionado previamente puede incluirse en el kit junto con instrucciones escritas que se refieren a su uso y aplicación al tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) lesionado o al epicardio de un sujeto que lo necesita. El kit puede comprender además medios para adherir el parche de colágeno 3D al epicardio o al tejido cardiaco (por ejemplo, miocárdico) lesionado tal como, sin limitación, material de sutura.

Cualquiera de los kits divulgados en el presente documento también puede incluir un hidrogel (tal como un hidrogel autopolimerizante) como portador para un factor paracrino derivado del epicardio (tal como un polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada). En una realización, los kits también incluyen uno o más catéteres para la administración del hidrogel (tal como un hidrogel infusionado con un polipéptido de FSTL1 hipoglicosilada) al endocardio, epicardio y/o una o más áreas dañadas del miocardio.

El kit también puede incluir instrucciones escritas para usar el kit, tal como instrucciones para infusionar un factor paracrino derivado del epicardio en un parche de colágeno 3D, suturar el parche al miocardio o epicardio, infusionar un factor paracrino derivado del epicardio en un hidrogel (tal como un hidrogel autopolimerizante), así como la administración del hidrogel al epicardio o una o más áreas dañadas del miocardio a través de tecnología de catéter.

Se pretende que cada limitación numérica máxima dada en toda esta memoria descriptiva incluya cada limitación numérica inferior, como si tales limitaciones numéricas inferiores estuvieran expresamente escritas en el presente documento. Cada limitación numérica mínima dada en toda esta memoria descriptiva incluirá cada limitación numérica mayor, como si tales limitaciones numéricas mayores estuvieran expresamente escritas en el presente documento. Cada intervalo numérico dado en toda esta memoria descriptiva incluirá cada intervalo numérico más estrecho que se encuentre dentro de un intervalo numérico más amplio, como si tales intervalos numéricos más estrechos estuvieran todos expresamente escritos en el presente documento.

La invención puede entenderse adicionalmente hacienda referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1: La señalización paracrina epicárdica activa la amplificación de miocardiocitos

El epicardio del corazón es una capa epitelial externa que contribuye al crecimiento miocárdico durante el desarrollo proporcionando células progenitoras12, así como mitógenos, incluyendo FGF, IGF2 y PDGF3-5. Estudios recientes sugieren que el epicardio también podría conservar la función del miocardio adulto tras una lesión, posiblemente como fuente de progenitores miógenos67. Sin embargo, no se ha demostrado que los factores paracrinos derivados del epicardio apoyen la regeneración miocárdica en los mamíferos, aunque su identidad y mecanismo de acción proporcionarían información sobre este proceso poco conocido e intrínsecamente ineficiente8. Este ejemplo describe la identificación de un factor paracrino derivado del epicardio de este tipo.

Materiales y métodos

Se obtuvieron células progenitoras Sca1+, progenitores de miocardiocitos Myh6~ del laboratorio de Schneider tal como se describe19.

Se mantuvieron células mesoteliales del epicardio (EMC) en DMEM con FBS al 10% y antibióticos/antimicóticos tal como se describe33. Las EMC se transducen de manera estable con lentivirus H2B-mCherry para determinar el marcaje de núcleos.

Miocardiocitos derivados de células madre embrionarias de ratón (mCMESC): Se generó una línea estable de ESC de ratón para determinar la selección de resistencia a fármacos de miocardiocitos (Myh6-Puror;Rex-Blastr) mediante transducción lentiviral y selección con blasticidina, de manera similar a la línea humana informada previamente34.

Se obtuvieron mCMESC mediante diferenciación de mESC Myh6-Puror;Rex-Blastr en un medio de diferenciación que contenía: medio de Iscove modificado por Dulbecco (IMDM) complementado con FBS al 10%, glutamina 2 mM, monotioglicerol 4,5*10"4 M, ácido ascórbico 0,5 mM, transferrina 200 |ig/ml (Roche), medio de hibridomas libre de proteínas al 5% (PFHM-II, Invitrogen) y antibióticos/antimicóticos como cuerpos embrionarios (EB) hasta el día 4 y se sembraron en una placa de cultivo celular adherente hasta el día 9, un día después de la aparición de pulsación espontánea. Para purificar los miocardiocitos Myh6+, se añadió puromicina en el día de diferenciación 9 durante 24 horas. Posteriormente se tripsinizaron las células y se sembraron como miocardiocitos en monocapa. Los tratamientos con medios acondicionados y FSTL1 se realizaron normalmente 24 horas después del sembrado en monocapa. La duración de los tratamientos se indicada en las leyendas de cada figura.

Miocardiocitos embrionarios. Se usó clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para purificar miocardiocitos de corazones Tnt-Cre;Rosa26mTmG/+ de embriones e12.5. Se disociaron los corazones mediante digestión con colagenasa IV y células GFP+ para la purificación mediante FACS. Se cultivaron las células GFP+ y se confirmó que eran miocardiocitos por su expresión de los marcadores específicos de miocardiocitos alfa actinina (ACTN2) y troponina cardiaca T (TNNT2). Se golpearon rítmicamente cuando se cultivaron in vitro.

Medios acondicionados con células mesoteliales del epicardio (EMC) de rata. Se cultivaron células EMC 33 en FBS al 10% DMEM con pen./estrep. hasta confluencia (~1 * 106/cm2), luego se lavaron con PBS 3 veces y se cambió el medio a DMEM libre de suero con pen./estrep. sin rojo de fenol y se cultivaron durante 2 días adicionales antes de recogerse los medios como medios acondicionados (se añadieron 20 ml de medios para acondicionar y se recogieron 18 ml después de 2 días). Se filtraron los medios recogidos a través de una membrana con poros de 0,22 |im (Millipore). Se prepararon medios acondicionados de control de la misma manera, pero sin células EMC.

Se generaron medios acondicionados con EPDC de ratón adulto en el laboratorio de Zhou9. En resumen, se les inyectó a ratones adultos de ocho semanas con corazones Wt1CreERT2/+;Rosa26mTmG/+ por vía oral 4 mg de tamoxifeno mediante sonda gasonástrica, se administraron de cuatro a cinco inyecciones orales durante un periodo de dos semanas. Luego se indujo un infarto de miocardio mediate ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda en ratones adultos (11 semanas). Una semana después de la lesión, se recogieron los corazones WtPreERJ2/+;Rosa26mJmG/+, que luego se digirieron con colagenasa IV para dar células individuales. La disolución de digestión se elaboró añadiendo 4 ml de colagenasa IV al 1% y 1 ml de tripsina al 2,5% en un 44,5 ml de solución salina equilibrada de Hank, y se complementó con 0,5 ml de suero de pollo y 0,5 ml de suero de caballo. Se resuspendieron las células en solución salina equilibrada de Hank, se añadieron 4 ml de disolución de digestión a cada tubo y se agitó suavemente en un agitador a 37°C durante 6 minutos. Después de retirar el sobrenadante que contenía las células disociadas, se añadieron otros 4 ml de disolución de digestión para repetir la digestión 6 veces. Después de la digestión final, se filtraron las células a través de un filtro de 70 |im y se sedimentaron las células centrifugando a 200g durante 5 minutos a 4°C. Luego se resuspendieron las células mediante solución salina equilibrada de Hank para el aislamiento mediante FACS. Se usaron las células disociadas de los corazones GFP como control para el ajuste de la ventana de adquisición en FACS. Se aislaron células GFP+ (células derivadas del epicardio, EPDC) de corazones GFP+ W P eERT2/+; Rosa26mTmG/+ mediante FACS y se confirmó que estas poblaciones purificadas de GFP+ eran células GFP+ bajo un microscopio de fluorescencia. Se restableció la expresión de FSTL1 (determinada mediante PCR) en las EDPC GFP+ cultivadas. Luego se añadieron medios acondicionados completos de las EPDC al ensayo de miocitos. Las diluciones son tal como se indican en la leyenda de las figuras.

Se midió la proliferación de miocardiocitos tratados con medio secundario mediante el ensayo con MTT usando una disolución Celltiter 96 Aqueous One (Promega) tal como se describió previamente9. Después de añadir el reactivo Celltiter 96 Aqueous One en el medio de cultivo celular, se incubó la placa a 37°C durante 3-4 horas, y luego se registró la absorbancia a 490 nm usando un lector de placas de 96 pocillos. La absorbancia a 490 nm está estrechamente correlacionada con el número de células. La lectura de MTT en el eje x, ensayo con MTT marcado (A490), refleja así el número de células relativo de cada pocillo entre los grupos de tratamiento.

Obtención de imágenes de calcio: Se registraron transitorios de calcio contráctil usando un citómetro de obtención de imágenes cinéticas (KIC, Vala Sciences) usando un indicador de calcio Fluo4 NW (Life Science). Los datos se procesaron usando el software Cyteseer que contiene el paquete de análisis de KIC (Vala Sciences) tal como se describió38.

Extracción de ARN y Q-RT-PCR: Se extrajo ARN total con TRIzol (Invitrogen) y se transcribió de manera inversa a ADNc con el kit de transcripción inversa QuantiTect (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Se sometieron muestras de ADNc sintetizadas a partir de 100 ng de ARN total a RT-QPCR con el kit LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche) realizado con el sistema de PCR en tiempo real LightCycler 480 (Roche). A continuación se enumeran las secuencias de cebador usadas en este ejemplo, así como en los otros ejemplos divulgados en el presente documento:

Gen C ebador d irecto C ebador inverso

Gapcd aaiggatacggctacagc gígcagcgaaGtiaitg Myhñytiñ csigceaatgaepscG cdaeadcdgiactgcc

MyttJ gccaaaacaceaaceígíceaaglic clgdggagaggttaikdcg Mic2v aggtccaattaactJcaccgt gtcagcatctcccggacala MfcSa acegicttccteaeact cttgidgcdgggiea

m ? ccditgcígíccccgaaga ggctidcalclgitgdicd

Myc ccdatttcalctgcgacgag gagaaggacgtagcgaccg Ccnúi adigaagtaagatacggagg gcgiatcdgacaccaaíete

C úknla cgdgidigcaetdggi cgttileggeeetgagatgit CúkniQ tcaaacctgagaglglctaacg ccgggccgaagagat^dg

C4ím 2t> c ccigccacectlaccaga gcagaiaectcgeaaígteac Gmn2a acaícaagaeaícgtgcgatatt ecagcggtacaeaaagacca icagcaggaaeiltgltacc aataígagcdgaaalgggc

Npm tgacacaccacaagggclta gggggtaggattpcagpt gaggtcacícctatecíetgg geeatticciccgacttttde

vegfa aatgcífdccgcfetgaa gaícaigcggatcaaac.dc

Resultados

Para buscar señales epicárdicas que promuevan la cardiogénesis, se cultivó conjuntamente la línea de células mesoteliales del epicardio (EMC) con miocardiocitos derivados de células madre embrionarias de ratón (denominados mCMESC) Myh6+. Se prepararon mCMESC a partir de selección con puromicina de ESC de ratón Myh6-Puror diferenciadas (figura 8 y Materiales y métodos para detalles y fenotipo celular). El cultivo conjunto con EMC aumentó ^{de manera coherente el número de miocitos}a ^{-actinina+ (figura 1a-c) y la expresión de los marcadores de}miocardiocitos incluyendo Myh6, Myh7, Mlc2a y Mlc2v (figura 1d). Los medios acondicionados con EMC no diluidos ^{dieron lugar al efecto del cultivo conjunto aumentando el número de miocitos (2,4 veces las células}a ^-actinina+detectadas, figura 1e-g) y la expresión de Myh6 (1,8 veces), Mlc2v (1,9 veces) y Mlc2a (1,3 veces) (figura 1h). Además, ^{los medios acondicionados EMC aumentaron el número de células}a ^{-actinina+ que presentaban transitorios de Ca2+}contráctil rítmico (8,6 veces) en relación con los medios convencionales (figura 1i). Por tanto, el/los factor(es) secretado(s) de cultivos de tipo epicárdico aumentaron el número de células contráctiles en los cultivos de miocardiocitos derivados de ESC. Los cultivos conjuntos no promovieron la cardiogénesis de ESC (Myh6-) no diferenciadas (no mostrado).

Para evaluar si el epicardio de adultos también contiene una actividad de este tipo, se prepararon medios acondicionados de células derivadas del epicardio (EPDC) que se habían aislado mediante FACS a partir de ratones9 de 3-4 meses WT1CreERT2/+;Rosa26mTmG/+ (figura 1j y Materiales y métodos). Cuando se añaden a miocardiocitos embrionarios E12.5 (también aislados previamente mediante FACS basándose en fluorescencia eGFP de ratones TNT-Cre;Rosa26mTmG/+), medios acondicionados con EPCD de adulto mejoraron significativamente la proliferación de miocardiocitos en medios libres de suero (p<0,05, figura 1k). La ebullición de los medios con EPDc antes de la incubación anuló el efecto, lo que es coherente con que la actividad esencial es proteica. Los medios acondicionados con EPDC doblaron casi la incidencia de Aurora cinasa B en el surco de segmentación que conecta las células Tnnt2+ adyacentes (del 0,19 al 0,33%, P < 0,05, figura 1l,m), lo que indica una actividad en el epicardio de adultos que promueve la citocinesis de miocardiocitos embrionarios.

Ejemplo 2: Un epicardio modificado por ingeniería atenúa la remodelación y mejora la función cardiaca

Este ejemplo describe el efecto de factores secretados por el epicardio en el corazón de adultos.

Materiales y métodos

Se aislaron miocitos ventriculares de adulto de ratones FVB de 3 meses tal como se publicó anteriormente35. En resumen, se anestesiaron los ratones con pentobarbital sódico (100 mg/kg i.p.). Se extrajo el corazón y se perfundió retrógradamente a 37°C con solución libre de Ca2+ (en mM, NaCl 120, KCl 14,7, KH2PO40,6, Na2HPO40,6, MgSO4-7H2O 1,2, NaHCO3 4,6, Na-HEPES 10, taurina 30, BDM 10, glucosa 5,5) seguido de digestión enzimática con colagenasa. Se cortaron los ventrículos en trozos pequeños y se digirieron adicionalmente. Se añadió tampón de parada (disolución libre de Ca2+ CaCh 12,5 |iM suero de ternero bovino al 10%) y se centrifugó la suspensión celular a 40g durante 3 min. Se resuspendieron los miocitos en tampón de parada en concentraciones crecientes de CaCl2 hasta que se alcanzó 1 mM. A continuación, se resuspendieron las células en MEM suero de ternero bovino al 5% BDM 10 mM L-glutamina 2 mM y se añadieron a la disolución de colágeno, prepolimerización (250.000 células por ml o por parche). Después de la gelificación del colágeno y la compresión plástica, se cultivaron los parches celulares en los medios mencionados anteriormente (en placas) durante la noche y luego se transfirieron a medios de cultivo: MEM albúmina sérica bovina 1 mg/ml blebbistatina 25 |iM L-glutamina 2 mM, en presencia o ausencia de FSTL1 recombinante (AVISCERA BIOSCIENCE, 10 ng/ml). En el día 7, se realizó un ensayo con indicador de ciclo celular basado en ubiquitinación fluorescente (FUCCI, Premo™ FUCCI Cell Cycle Sensor, Life Technologies, US) en las muestras de cultivo 3D tal como se describió anteriormente36. En este ensayo, las células G1 y S/G2/M emiten fluorescencia roja y verde, respectivamente. El volumen de Premo™ geminina-GFP y Premo™ Cdt1-RFP se calcularon usando la siguiente ecuación:

número de células .xFFC Volumen de reactivo Premo™ geminina GFP o Premo™ Cdt1 RFP (ml) = n r i i i

donde el número de células es el número total estimado de células en el momento del marcaje celular (igual a la densidad de siembra de CM, PPC (partículas por célula) es el número de partículas virales por célula (=40 en este ensayo), y 1 * 108 es el número de partículas virales por ml del reactivo. Los volúmenes de reactivos calculados anteriormente se añadieron directamente a los parches celulares en medio celular completo, se mezclaron suavemente y se incubaron durante la noche en la incubadora de cultivo (>16 horas). Se obtuvieron imágenes de muestras de parche usando un microscopio de fluorescencia convencional, utilizando conjuntos de filtros GFP y RFP.

Gel de colágeno comprimido para su uso como parche epicárdico modificado por ingeniería: Se produjeron geles de colágeno altamente hidratados, usados como parche cardiaco en este estudio, añadiendo 1,1 ml de IX DMEM (Sigma, MO, EE. UU.) a 0,9 ml de disolución estéril de colágeno tipo I de cola de rata en ácido acético (3,84 mg/ml, Millipore, MA, EE. UU.). Se mezcló bien la mezcla de 2 ml de colágeno-DMEM resultante y se neutralizó con NaOH 0,1 M (~50 |jl). Todo el proceso se realizó en hielo para evitar la gelificación prematura del colágeno. En el caso de parches que contenían factores epicárdicos, los medios de cultivo con EMC se recogieron como anteriormente y se mezclaron 0,6 ml de estos con 0,5 ml de DMEM. Luego se distribuyó la disolución de colágeno (0,9 ml) en los pocillos de placas de 24 pocillos (15,6 mm de diámetro) y se colocó en una incubadora de cultivo tisular durante 30 min a 37°C para la polimerización. La compresión plástica se realizó tal como se describió anteriormente3940 para eliminar el exceso de agua y producir un biomaterial denso con propiedades biológicas y mecánicas mejoradas. En resumen, como molde, los geles de colágeno altamente hidratados (en un volumen de ~ 0.9 ml) se sometieron a una compresión ilimitada a través de la aplicación de un esfuerzo de compresión estático de ~ 1.400 Pa durante 5 minutos (véanse3941 para más detalles), lo que da como resultado una reducción de volumen de ~98-99%. El módulo de elasticidad del colágeno comprimido, destinado a aproximarse al del epicardio embrionario que es óptimo para la contractilidad de los miocardiocitos inmaduros32), se evaluó mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) en modo de nanomuesca, usando un desencadenador de fuerza que dio como resultado una deformación local mínima de menos del 10% (muesca de ~100 nm) para minimizar el efecto de los artefactos relacionados con el sustrato. Se fabricó una punta de AFM plana a medida mediante fresado de haz de iones enfocados y se utilizó para sondear la rigidez de los geles barriendo las áreas de 90 |im * 90 |im (figura 9 a-c).

Oclusión de LAD permanente (IM): Se adquirieron ratones C57BL/6J macho de 10-12 semanas de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EE. UU.). Los procedimientos que implicaban el uso de animales y las cirugías fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Stanford (IACUC). El cuidado de los animales y las intervenciones se proporcionaron según la Ley de Bienestar de los Animales de Laboratorio. Se anestesió a los ratones con una cámara de inhalación de isoflurano, se intubaron por vía endotraqueal con un angiocatéter de calibre 22 (Becton, Dickinson Inc., Sandy, Utah) y se conectaron a un ventilador de control de volumen para animales pequeños (Harvard Apparatus, Holliston, M^a). Se realizó una toracotomía izquierda a través del cuarto espacio intercostal y se retrajeron los pulmones para exponer el corazón. Después de abrir el pericardio, se colocó una sutura 7-0 para ocluir la arteria descendente anterior izquierda (LAD) ~ 2 mm por debajo del borde de la aurícula izquierda. La ligadura se consideró exitosa cuando la pared del VI se volvió pálida. En el caso de los grupos experimentales tratados con parche, inmediatamente después de la ligadura, se suturó el parche de colágeno preparado (en dos puntos) sobre la superficie del miocardio isquémico. Los animales se mantuvieron en una almohadilla térmica hasta que se recuperaron. Otro grupo de ratones se sometió a una ligadura simulada; tuvieron un procedimiento quirúrgico similar sin ligadura de LAD. Se usó un número mínimo de n=8 en cada grupo de estudio.

Tinción con TTC: El día 2 tras el tratamiento con IM/parche, se recogieron los corazones de ratón de los cuatro grupos y se seccionaron perpendicularmente al eje largo en cuatro secciones (aproximadamente 2 mm de grosor). Se colocaron las secciones en los pocillos de una placa de cultivo celular de 12 pocillos y se incubaron con una disolución de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio al 1% (TTC, Sigma-Aldrich) durante 15 minutos a 37°C. Posteriormente, se lavaron las secciones con PBS y se visualizaron usando un microscopio estereoscópico y se fotografiaron con una cámara digital.

Ecocardiografía: Se evaluó la función cardiaca in vivo mediante ecocardiografía dos y cuatro semanas después de la ligadura de la LAD. Se realizó el análisis bidimensional (2D) en ratones usando una plataforma de ecografía GE Vivid 7 (GE Health Care, Milwaukee, WI) equipada con un transductor de 13 MHz. Se sedó a los ratones con isoflurano (100 mg/kg, inhalación) y se afeitó el tórax. Se colocó a los ratones en una plataforma calentada en una posición de decúbito supino o lateral izquierdo para facilitar la ecocardiografía. Se registraron los clips 2D y las imágenes en modo M en una vista de eje corto desde el ventrículo izquierdo medio en las puntas de los músculos papilares. Se midieron el diámetro interno del VI (LVID) y el grosor de la pared posterior (LVPW) tanto en telediastólico como en telesistólico. Se calcularon el acortamiento fraccionario (FS, %) y la fracción de eyección (EF, %, a través de la extrapolación de datos 2D) a partir de las dimensiones del VI en la vista de eje corto 2d . Se usó un número mínimo (n) de 8 ratones por grupo experimental para las evaluaciones de ecocardiografía. Se realizaron las mediciones mediante dos grupos independientes con enmascaramiento.

Resultados

A continuación, se evaluó el efecto de los factores secretados por el epicardio en el corazón de adultos mediante la administración de medios acondicionados usando parches epicárdicos de colágeno 3D. Los parches de colágeno 3D (figura 2a) se diseñaron para tener un módulo de elasticidad comparable al informado para el epicardio embrionario (E-12+4 kPa)10, que es inferior al del epicardio maduro (E>30-40 kPa) y tejido cardiaco fibrótico (E>100 kPa), pero mayor que el de la mayoría de los biomateriales de andamiaje usados actualmente (E<1 kPa) (figura 2b y figura 9). Se sembraron los parches modificados por ingenierías con medios acondicionados con EMC y se suturaron en el epicardio de corazones murinos adultos infartados (figura 2c,d). Se realizó la implantación del parche inmediatamente después de la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) (infarto de miocardio [IM]). Dos semanas más tarde, los corazones tratados con parche de medios epicárdicos (cohorte IM+parche+CM) y parche vacío (IM+parche, sin medios acondicionados) mostraron parámetros morfométricos significativamente mejores, incluido el diámetro interno del ventrículo izquierdo al final de la diástole y en la sístole (LVIDd y LVIDs, respectivamente), y la dimensión de la pared posterior del ventrículo izquierdo al final de la diástole y la sístole (LVPWd y LVPWs, respectivamente) en relación con los animales con IM sólo (figura 2e y tabla 1), coherente con un modelo en el que el parche de colágeno proporciona soporte mecánico que inhibe la remodelación patológica10. En particular, el tratamiento IM+parche+CM proporcionó un beneficio adicional en relación con todas las demás condiciones, con parámetros significativamente mejores de contractilidad ventricular (figura 2e, f y tabla 1), indicando así una actividad secretada por el epicardio implicada en la conservación de la función.

Ejemplo 3: FSTL1 es un factor epicárdico capaz de inducir la proliferación de miocardiocitos

Esto ejemplo proporciona datos que sugieren que FSTL1 desempeña un papel una interferencia epicárdica-miocárdica para promover la cardiomiogénesis.

Materiales y métodos

Análisis de CL-EM/EM de medios acondicionados: En primer lugar, se añadió tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) a 1 ml de medio secundario a 10 mM y se redujo la muestra de proteína a 37°C durante 30 min. Luego se añadió yodoacetamida a 20 mM y se alquiló la disolución a 37°C durante 40 min en la oscuridad. Luego se añadió a la disolución tripsina de calidad espectrometría de masas (Promega) en una razón de 1:100. Después de la digestión durante la noche a 37°C, luego se desalinizó la muestra con un cartucho SepPack, se secó con un dispositivo SpeedVac y se resuspendió en 100 |il de ácido fórmico al 5%. Se analizaron los péptidos resultantes en línea mediante un sistema CL-EM/EM, que consistía en un HPLC Michrom, una columna Michrom Magic C18 de 15 cm, una fuente de EM ADVANCED Michrom de bajo flujo y un dispositivo LTQ-Orbitrap XL (Thermo Scientific, Waltham, MA). Se usó un gradiente de 120 min del 0-30% de B (0,1% de ácido fórmico, 100% de acetonitrilo) para separar los péptidos, y el tiempo total de CL fue de 141 min. Se configuró el dispositivo LTQ-Orbitrap XL para el barrido de los precursores en el dispositivo Orbitrap a una resolución de 60.000, seguido de EM/EM dependiente de los datos de los 4 precursores principales. Luego, los datos de CL-EM/EM sin procesar se enviaron a Sorcerer Enterprise (Sage-N Research Inc.) para la identificación de proteínas en comparación con la base de datos de proteínas de rata IPI, que contiene secuencias de péptidos semitrípticas con la posibilidad de hasta 2 escisiones perdidas y tolerancia de masa precursora. de 50,0 ppm. Se añadió una masa molecular de 57 Da a todas las cisteínas para dar cuenta de la carboxiamidometilación. La búsqueda diferencial incluye 16 Da para la oxidación de metionina. Los resultados de la búsqueda se visualizaron, clasificaron, filtraron y analizaron estadísticamente usando PeptideProphet y ProteinProphet (ISB). La puntuación mínima de probabilidad de Transproteomic Pipeline (TPP) para proteínas y péptidos se estableció en 0,95, respectivamente, para asegurar una tasa de error de TPP inferior a 0,01.

Se adquirió FSTL1 recombinante de AVISCERA BIOSCIENCE (00347-02-100, producida en E. Coli) y R&D system (1694-FN-050, producida en una línea de células de mieloma de ratón, derivada de NS0).

Histología e inmunohistoquímica: El análisis histológico para este y otros ejemplos se realizó según los protocolos convencionales para inclusión en parafina. Para la inmunohistoquímica, los embriones incrustados se seccionaron con ^{un grosor de 7 |}i ^{m, a menos que se indique lo contrario. Los anticuerpos usados en este ejemplo y en los otros ejemplos divulgados en el presente documento fueron los siguientes:}a ^{-actinina 1:200 (Sigma, A7811),}a ^{-actina de}músculo liso 1:300 (Sigma A2547) fosfo-histona3 1:100 (conejo Millipore 06 -570), fosfo-histona3 1:300 (ratón Abcam ab14955), WT1 1:100 (Abcam, ab15249), Aurora B 1:250 Millipore 04-1036 (lote 221196), PCM1 1:200 (Sigma-Aldrich HPA023370), FSTL1 1:200 (R&D MAB17381). Se usaron al menos 5 secciones por tinción para determinar la histología y 3 para estudios de inmunohistoquímica, respectivamente. Un criterio de inclusión para el injerto del parche fue que el parche cubriera > 70% del infarto (controlado por histología). Los ensayos con TUNEL se realizaron en secciones congeladas según las instrucciones (Roche 11684795910).

Resultados

Para identificar la(s) proteína(s) secretada(s) epicárdica(s) bioactiva(s), se analizaron medios acondicionados con EMC mediante espectrometría de masas. La comparación de espectros con la base de datos de ratas IPI identificó 1596 lecturas de péptidos correspondientes a 311 proteínas únicas, de las que 95 lecturas se debieron a 16 proteínas secretadas discretas. Se seleccionaron diez proteínas con los recuentos espectrales más altos para analizarlas en el ensayo de mCMESC. De estos, la actividad cardiógena se observó sólo con proteína similar a la folistatina (también conocido como FSTL1, FRP o TSC36) (figura 3a), que es una glicoproteína secretada de la familia BM-40/SPARC/osteonectina que comparte un solo dominio rico en cisteína con la folistatina. A diferencia de la folistatina, FSTL1 no bloquea la activina y sus funciones bioquímicas y biológicas están mal caracterizadas11. La administración de FSTL1 en el corazón da como resultado efectos antiapoptóticos a corto plazo1213, pero no se ha atribuido ninguna función de reparación miocárdica a FSTL1; de hecho, los niveles de FSTL1 aumentan en el torrente circulatorio después de un IM agudo y, por este motivo, se ha considerado un biomarcador para el síndrome coronario agudo14.

El tratamiento de mCMESC durante 8 días con FSTL1 humana recombinante sintetizada en bacterias (10 ng/ml) aumentó el número de miocardiocitos en 3 veces (figura 3b-d), así como aumentó los niveles de transcritos que codifican para proteínas contráctiles específicas del músculo cardiaco en 2 veces (myh6, mlc2v y mlc2a, figura 3e) y ^{el número de células}a ^{-actinina+ con transitorios de Ca2+ contráctil rítmico en 7 veces (figura 3f) sin inducir hipertrofia.}De hecho, FSTL1 disminuyó el tamaño de las células de los miocitos de una manera dependiente de la dosis (figura 3g). Juntos, estos datos sugieren que FSTL1 desempeña un papel en la interferencia epicárdica-miocárdica para promover la cardiomiogénesis.

La visualización directa mediante inmunotinción reveló que FSTL1 está restringida al epicardio ya en la gestación intermedia (figura 3h), aunque está presente antes en el miocardio del tubo cardiaco primitivo15. La expresión epicárdica no se había observado previamente, aunque persiste a lo largo de la edad adulta (figura 3i-k). Notablemente, la localización de FSTL1 cambia drásticamente después de una lesión isquémica, de modo que se vuelve abundante en el miocardio (figura 3 i-l) y está llamativamente ausente en el epicardio y el área infartada (figura 3i, l y figura 10).

Ejemplo 4: La administración localizada de FSTL1 mejora la función cardiaca después del IM

Estudios anteriores han demostrado que la sobreexpresión transitoria de FSTL1 en miocardiocitos, o la infusión sistémica directa de FSTL1 recombinante humana, es antiapoptótica tras una isquemia/reperfusión aguda1213. Sin embargo, en este ejemplo se examina si confiere algún beneficio a largo plazo.

Materiales y métodos

Obtención de imágenes mediante resonancia magnética de realce tardío (DEMRI) in vivo: Para prepararse para el barrido, la inducción de la anestesia se logró con el 2% y se mantuvo con el 1,25-1,5% de isoflurano con monitorización de la frecuencia respiratoria. Se insertaron derivaciones de ECG por vía subcutánea para monitorizar la frecuencia cardiaca mientras la temperatura corporal se mantenía a 37°C. Usando el escáner clínico 3T GE Signa Excite con una hélice de ratón dedicada (Rapid MR International, Alemania), se registraron los parámetros funcionales en las semanas 1 y 4 después del tratamiento. Se realizaron las siguientes secuencias para las adquisiciones de IRM: (1) se realizó DEMRI después de la inyección i.p. de 0,2 mmol/kg de gadopentetato de dimeglumina (Magnevist, Berlex Laboratories) usando secuencias de fGRE-IR sincronizadas con FOV de 3,4 cm, grosor de corte de 0,9 mm, matriz de 128x128, TE 5 ms, TI 150-240 ms y FA 60°; y (2) se realizaron IRM cardiaca de volúmenes usando fSPGR con FOV de 7 cm, grosor de corte 0,9 mm, matriz de 256x256, TE 5,5ms y FA 30. Se usaron imágenes simples frontales y axiales para posicionar un plano de obtención de imágenes bidimensional a lo largo del eje corto de la cavidad del ventrículo izquierdo (VI). Se usó un número mínimo (n) de 2 ratones por grupo experimental para este estudio cualitativo.

Recuento de vasos: Los parámetros de densidad de los vasos sanguíneos se midieron a partir de secciones histológicas de muestras de corazón teñidas para el factor de von Willebrand (vWF) como marcador de células endoteliales en la pared del vaso. Se analizaron hasta 60 secciones para cada grupo de tratamiento (4 ratones en cada grupo). Se realizó el análisis con ImageJ para calcular: 1) el área luminal total de los vasos sanguíneos y 2) el número de vasos que se tiñeron positivamente para el vWF. En cada caso, se obtuvo un histograma de los parámetros del vaso como una fracción del área de superficie total analizada y se representaron gráficamente los valores intermedios para cada grupo de tratamiento. La significación estadística (p<0,05) de las diferencias del grupo simulado se determinó mediante ANOVA unilateral.

Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas: Para evaluar la retención de FSTL1 dentro del sistema de parches modificados por ingeniería in vitro, se sumergieron andamiajes de colágeno cargados con FSTL1 (5 |ig/ml) en PBS y se agitaron durante diversos tiempos (0, 12 horas, 1 día y 21 días) a 37°C y se determinó la concentración de FSTL1 usando el kit de ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (USCN Life Science, Inc., Houston, EE. UU.). El límite de detección para esta técnica fue de 0,50 ng/ml. Se pretrataron los andamiajes con 1 mg/ml de colagenasa tipo I (Sigma Aldrich, MO, EE. UU.) y 5 mg/ml de hialuronidasa (Sigma Aldrich, MO, EE. UU.) disueltos en solución salina tamponada con fosfato durante 5 minutos, seguido de centrifugación a 5.000 * g durante 20 minutos. Se añadieron alícuotas de 100 |il de las muestras recogidas a las placas de 96 pocillos y se incubaron durante 2 horas a 37°C. Luego, se añadieron 100 |il del reactivo de detección A preparado a los pocillos seguido de 1 hora de incubación a la misma temperatura. Después de aspirar y lavar 3 veces, se añadieron 100 |il del reactivo de detección B preparado a los pocillos y se incubaron durante 30 minutos a 37°C. Después de aspirar y lavar 5 veces, se añadieron 90 |il de disolución de sustrato a los pocillos seguido de incubación durante 25 minutos a 37°C. Se añadieron 50 |il de disolución de parada a los pocillos y se leyó la absorbancia de cada pocillo a 450 nm, inmediatamente. La concentración de FSTL1 se definió usando la curva de calibración de las disoluciones de patrón. La prueba se realizó 4 veces.

Isquemia-reperfusión (I/R): Se anestesiaron e intubaron ratones macho C57/BL6, de 10 a 11 semanas, tal como se describió anteriormente. Luego se realizó una toracotomía lateral izquierda. Se retiró suavemente el pericardio y se usó una sutura de nailon 8-0 (Ethicon, Inc. Johnson & Johnson Co., EE. UU.) para ligar la arteria coronaria descendente anterior izquierda contra un tubo PE10, que se retiró después de 30 minutos de oclusión. La realización satisfactoria de la oclusión de la arteria coronaria se verificó mediante inspección visual (observando el desarrollo de un color pálido en el miocardio distal tras la ligadura). Luego se cerró el tórax con suturas 7-0 alrededor de las costillas adyacentes y se cerró la piel con suturas 6-0. Se administró buprenorfina por vía subcutánea durante un mínimo de 1 día en dosis dos veces al día. Para el grupo de animales tratados con parche, se realizó una segunda toracotomía una semana después de la incidencia de i/r y el parche de colágeno preparado se suturó (en dos puntos) sobre la superficie del miocardio isquémico. Los controles operados de manera simulada consistieron en ratones de la misma edad que se sometieron a procedimientos quirúrgicos idénticos (dos toracotomías) con la excepción de la ligadura de LAD. En el estudio de isquemia-reperfusión, se evaluó la función cardiaca in vivo antes del nivel inicial de la cirugía), 1 semana después de la incidencia de I/R, y dos y cuatro semanas después de la implantación.

Ratones FSTL1-TG usados en experimentos con IM son ratones de fondo genético, hembra y macho C57BL6 de 12 15 semanas. Y el protocolo de estudio fue aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Boston.

Resultados

Se evaluó la función cardiaca en ratones transgénicos, que expresan FSTL1 bajo el control del promotor MCK restringido al músculo estriado (FSTL1-TG16, figura 11a, b). Los ratones FSTL1-TG mostraron una mejora pequeña pero significativa en la contractilidad después de la ligadura permanente de LAD, sin embargo, no mostraron una mejora a largo plazo de los parámetros morfométricos o el tamaño de la cicatriz, a pesar de la abundante sobreexpresión de FSTL1 (figura 11a-j). Por tanto, la sobreexpresión miocárdica de FSTL1 es insuficiente para dar lugar al efecto cardioprotector de los medios acondicionados de epicardio administrados a la superficie del epicardio. A continuación se evaluó el efecto de la administración epicárdica de hFSTL1 sobre la función cardiaca. Se prepararon parches de colágeno como antes, pero esta vez se cargaron con 10 |ig de hFSTL1/parche recombinante sintetizado a partir de bacterias antes de la polimerización y aplicación sobre la superficie del epicardio de los corazones infartados (véase Material y métodos para más detalles). Los parches retuvieron hFSTL1 inmunodetectable hasta 21 días in vitro y 28 días in vivo, los tiempos más largos sometidos a prueba (figura 12). Se aplicaron parches de hFSTL1 recién preparados (parche+FSTL1) sobre la superficie del epicardio de los corazones inmediatamente después del IM. Parche+FSTL1 dio como resultado una supervivencia significativamente mejorada de los animales en comparación con animales con IM sólo y parche sólo (figura 4a).

Las mediciones ecocardiográficas de evolución temporal de la contractilidad (% de acortamiento fraccionario, % de FS) demostraron que el parche+FSTL1 provocó una recuperación constante de la función cardiaca entre 2 semanas y 3 meses después del IM, cuando el % de FS se acercó al de los animales operados de manera simulada (figura 4b y tabla 1). Por el contrario, los animales sin tratamiento mostraron una disminución severa en el % de FS después de 4 semanas sin una mejora posterior. El tratamiento con parche solo atenuó la disminución de la función cardiaca en relación con ningún tratamiento posterior, pero a diferencia de FSTL1, no hubo una mejora posterior en la función cardiaca (figura 4b y tabla 1).

Tabla 1. Valores de ecocardiografía en bruto (promedio ± EEM) obtenidos los días 0 (nivel inicial), 14 y 28 después del tratamiento en un modelo de ratón de ligadura de LAD permanente. El parche se implantó simultáneamente con la lesión

Simulación ^3.8&Í 2.44 í 13 144 26.40 3F.7S Nivel inicial, n 10 ^§0 _{S 04}

, diferencia estadísticamente significativa (P<0,05) en comparación con la simulación . diferencia estadísticamente significativa (P<0.05) en comparación con IM sólo diferencia estadísticamente significativa (P<0,05) en comparación con IM+parche ' diferencia estadísticamente significativa (P<0,05) en comparación con IM+parche+CM Se sometió a prueba posteriormente si es necesaria la administración epicárdica de FSTL1 para inducir los efectos beneficiosos, dado que FSTL1 está regulada por incremento en el miocardio después de un IM16. Esto se realizó implantando parche sólo o parche+FSTL1 en ratones FSTL1-TG con infarto de miocardio16. Los parámetros de contractilidad aumentaron drástica y específicamente en los animales transgénicos sembrados con parche+FSTL1, con cambios perceptibles en la semana 2 de tratamiento y alcanzando una mejora de hasta el 50% en la semana 4 (figura 4c), en comparación con el tratamiento con parche sólo. Por tanto, la administración epicárdica de FSTL1 recombinante es eficaz incluso en el contexto de la sobreexpresión miocárdica transgénica de FSTL1, y señala además los beneficios específicos de la administración epicárdica de FSTL1, más allá del parche solo o la sobreexpresión miocárdica de FSTL1.

La función cardiaca mejorada y la supervivencia estuvieron acompañadas de una fibrosis significativamente atenuada después de la implantación del parche+FSTL1 (figura 4d, figura 13). El adelgazamiento del VI fue similar en las cohortes de parche+FSTL1 y parches sólo, y ambos tratamientos redujeron significativamente el adelgazamiento del VI en relación con la condición de IM sólo (figura 4d, e y tabla 1). En un grupo experimental independiente, el análisis de obtención de imágenes por resonancia magnética con realce tardío (DEMRI) 4 semanas después de la lesión confirmó que el tratamiento con IM+parche+FSTL1 redujo el tamaño de la cicatriz (figura 14).

También se investigó si el parche+FSTL1 tendría un efecto beneficioso similar si se aplicara después de que la función cardiaca hubiera disminuido. Para este propósito se usó un modelo de isquemia-reperfusión (I/R) y se implantaron parches una semana después de la lesión. Todos los animales mostraron contractilidad reducida (del 37% de FS antes de la lesión al 22% una semana después de la I/R antes de la colocación del parche). La función cardiaca de los animales no tratados disminuyó progresivamente (el 22%, el 20% y el 16% de FS a las 1, 3 y 5 semanas después de la I/R). Por el contrario, la cohorte parche+FSTL1 se recuperó al 34% tres semanas después de la I/R y se estabilizó, lo que corresponde a una recuperación completa de FS (figura 15 y tabla 2). Similar al modelo de ligadura permanente (figura 4), la recuperación funcional se acompañó de la restauración de los parámetros morfométricos (figura 15 y tabla 2). Estos datos indican que la FSTL1 administrada al epicardio conduce a la reversión del daño después de una lesión isquémica.

Tabla 2. Valores de ecocardiografía en bruto (promedio ± EEM) a largo plazo (meses 2 y 3) después del tratamiento, en un modelo de ratón de ligadura de LAD permanente. El parche se implantó de manera simultánea con la lesión.

Simulación 4.25 * 2.55 ± 1,20 ^*M I i 72,00 * 35.75 i Mes 2, n=4 0,05 0.03 0.03 0.07 0.41 0.25

Simulación 4.41 * 3.011 1 ,12 * 1 34* 57,00 * 3233 * Mes 3, n=4 0.13 013 0.02 0.01 i 14 1.25

IM

Mes :::::::::::::::::::::::::::::::::

IM+p 4.94 * S « * 0,00 * U S * 53,50* 23.53 * Mes 0,23 0 ^. 22 ^* OJO 0^.02^*2.03** 1.57** ^:5rI ⁿ M ^i& + ^m 445 1.17

Mes

n S4

,N

:::

* 'diferencia estadísticamente significativa (P<0,05) en comparación con la simulación

*: diferencia estadísticamente significativa (P<0,05) en comparación con IM sólo

* diferencia estadísticamente significativa (P<0,05) en comparación con IM+parche

* diferencia estadísticamente significativa (P<0,05) en comparación con IM+parche+CM

FSTL1 en el parche aumentó la vascularización tanto del parche de colágeno como del miocardio subyacente en el borde de la región infartada según lo evaluado por el factor de von Willebrand (vWF) y la inmunotinción de actina del ^{músculo liso (}a ^{SMA) (figura 4f-i). Aproximadamente el 1,5% del área del parche y el miocardio subyacente estaban}ocupados por vasos en el grupo IM+parche+FSTL1, en comparación con un 0,9% en el IM+parche, el 0,4% del área en los grupos IM sólo (figura 4g). Este valor indica la reparación de casi la mitad de la vasculatura observada en la región comparable de la pared distal del VI de animales operados de manera simulada (área del 3,1%). El número de vasos (de cualquier tamaño) por área de superficie unitaria de las secciones histológicas también aumentó en el grupo IM+parche+FSTL1 (82 vasos/mm2) en relación con los grupos de tratamiento IM+parche (35 vasos/mm2) e IM sólo (15 vasos/mm2) (figura 4i). Por el contrario, los animales operados de manera simulada presentaron 136 vasos/mm2, lo que nuevamente indica que parche+FSTL1 restauró la vascularización a niveles de aproximadamente la mitad de los de los ratones sin infarto. Además, las células del músculo liso rodearon numerosos vasos, particularmente en el grupo IM+parche+FSTL1 (figura 4h). La tinción tricrómica de Masson mostró un injerto contiguo del parche+FSTL1 en el miocardio del huésped y demostró la migración de las células huésped al parche, incluyendo la evidencia de células estriadas 4 semanas después del IM y la colocación del parche (flechas verdes, las dos últimas columnas en la figura 4j).

Ejemplo 5: La FSTL1 induce la entrada al ciclo celular de miocardiocitos in vivo

Este ejemplo muestra que la FSTL1 administrada al epicardio podría tener una función diferente que la FSTL1 producida en el miocardio.

Materiales y métodos

Los métodos usados en el ejemplo 5 son tal como se describen en el presente documento.

Resultados

^{La cohorte parche+FSTLI mostró evidencia de miocitos estriados}a ^-actinina+ ^{dentro del parche (figura 5a-d). Rara vez}se observaron células estriadas en el parche en ausencia de FSTL1. Es importante destacar que FSTL1 provocó un ^{aumento de 6,2 veces en la incidencia de miocardiocitos}a ^-actinina+ ^{que también fueron positivos para fosfo-histona}H3 (Ser10) (pH3) en relación con los observados en los animales con IM sólo (desde 2,5 por sección transversal (figura 5 i) en el IM sólo hasta 15,6 por sección en el grupo de tratamiento IM+parche+FSTL1, p<0,05; figura 5e-k y figura 16), lo que sugiere que FSTL1 promueve la entrada en la fase S y la replicación del ADN. La localización en la mitad del cuerpo, que es el puente transitorio que conecta las células en división, se confirmó mediante la detección de la ^{inmunorreactividad de la Aurora cinasa B entre las células teñidas con}a ^{-actinina y la no superposición con la tinción}nuclear con DAPI en reconstrucciones tridimensionales de secciones ópticas confocales (figura 5l), y una incidencia significativamente aumentada de miocardiocitos con Aurora cinasa B localizada en la mitad del cuerpo en corazones ^{con IM+parche+FSTL1 en relación con otras condiciones (figura 5 m), lo que sugiere que la células}a ^-actinina+ ^{son inducidas a experimentar citocinesis. Mediante el uso de PCM1 como marcador de núcleos de miocardiocitos}17^{, se}observó un aumento significativo de la incidencia de núcleos PCM1+ positivos para pH3 (figura 5n, o). También se observa un aumento de la proliferación de miocardiocitos 4 semanas después del injerto en corazones tratados con parche+FSTL1 después de una lesión por I/R (figura 15). No hubo ningún efecto de FSTL1 sobre la apoptosis de los miocardiocitos o el área de riesgo inmediatamente después del IM, o la apoptosis y la inflamación en los días 4 y 8 después del IM (figura 17), aunque se ha demostrado que FSTL1 previene la apoptosis y podría modular la inflamación ^{de manera aguda tras la lesión isquémica}121316^.

^{Por el contrario, con la administración de parche+FSTL1, el número de miocardiocitos pH3}+ ^{en la zona del borde}miocardio no aumentaron en los ratones FSTL1-TG en comparación con los controles de tipo natural (figura 10k,l), a ^{pesar del aumento de la vascularización (figura 10m,n y}16^{), lo que indica que la FSTL1 administrada al epicardio}podría tener una función diferente a la de la FSTL1 producida en el miocardio.

Ejemplo 6: Origen de la proliferación de miocardiocitos capaces de responder a FSTL1

Este ejemplo muestra que el estado de glicosilación de FSTL1 está unido a cambios en su estado funcional.

Materiales y métodos

Se aislaron miocardiocitos ventriculares de rata neonatal (NRVC) con el kit de aislamiento de miocardiocitos de rata neonatal (Cellutron) y se cultivaron a 37°C con el 5% de CO². En resumen, se diseccionaron ventrículos de ratas Hsd:SD (Sprague Dawley) de 1-2 días, luego se digirieron cinco veces durante 15 minutos cada una con el cóctel de enzimas a 37°C. Se agruparon las células, se sembraron previamente durante 90 minutos en una placa de cultivo celular sin recubrir para eliminar los fibroblastos y se sembraron en placas de plástico de cultivo celular recubiertas con gelatina al 1% en medios ricos en suero (DME/F12 [1:1], BSA al 0,2% , piruvato de sodio 3 mM, ácido ascórbico 0,1 mM, transferrina 4 mg/litro, L-glutamina 2 mM y ciprofloxacina 5 mg/litro complementados con suero de caballo al ^{10% y suero bovino fetal (FBS) al 5%) a 3 * 10}5 ^células/cm2^{. Después de 24 horas, se cambió el medio a medio bajo}en suero (el mismo pero con FCS al 0,25%) y se cultivaron las células hasta su uso.

^{Ensayo automatizado in vitro de proliferación celular y muerte celular: se incubaron células (mCM}ESC ^{y NRVC) con}EdU (los detalles de la dosificación y la duración de la exposición se especifican en las leyendas de las figuras) en un formato de placa 384 y se fijaron durante 2 horas en PFA al 4%, se lavaron en PBS y se tiñeron para EdU usando el kit de ensayo Click-it EdU (Life Technologies). Luego se lavaron las células en PBS, se sometieron a inmunotinción ^{con un anticuerpo contra}a ^{-actinina (Sigma, A7811) para identificar los miocardiocitos y se tiñeron con DAPI (4',6-}diamidino-2-fenilindol) para identificar los núcleos. Luego se obtuvieron imágenes de las placas usando el sistema InCell 1000 (GE Healthcare) y se analizaron automáticamente en el software Developer Toolbox (GE Healthcare) tal ^{como se describe}37^{. Se generaron razones de núcleos EdU+/}a ^-actinina+ ^{y núcleos}a ^-actinina+ ^{para el porcentaje de EdU incorporado en los miocardiocitos en el ADN cromosómico. De manera similar, las células (mCM}ESC ^{y NRVC) en}formato de placa 384 se fijaron durante 2 horas en PFA al 4%, se lavaron en PBS y se sometieron a inmunotinción con anticuerpo contra pH3 (Millipore 06-570) para determinar los núcleos en mitosis, o Aurora B (Millipore 04-1036) ^{para determinar la citocinesis o TUNEL (Roche) para determinar la muerte celular, y anticuerpo contra}a ^-actinina(Sigma, A7811) para determinar los miocardiocitos y DAPI para determinar los núcleos. Se realizaron los mismos análisis y obtención de imágenes que en los ensayos con EdU. Se calcularon los porcentajes de núcleos doblemente ^{positivos pH3}+^,a ^-actinina+^{, células doblemente positivas Aurora B}+^,a ^-actinina+ ^{y núcleos doblemente positivos TUNEL}+^,a ^-actinina+ ^{en relación con el número total de núcleos de células}a ^{-actinina+ para determinar los porcentajes}de miocardiocitos que experimentan mitosis, citocinesis y apoptosis, respectivamente.

Sobreexpresión de FSTL1 e inmunotransferencia de tipo Western: Se transfectaron de manera transitoria células Hek293 con plásmido de FSTL1 humana (GE Dharmacon, ID: ccsbBroad304_02639 pLX304-Blast-V5-FSTL1) usando Lipofectamine 2000 (la transfección simulada se realizó con Lipofectamine y sin plásmido). 48 h después de la transfección, se reemplazó el medio que contenía suero por DMEM sin suero y se incubó con las células durante 24 h. Se usó tunicamicina a 2 ug/ml. Se recogieron medios acondicionados de muestras de tunicamicina durante 16 h (las células se veían sanas). Se centrifugaron los medios acondicionados a 400 g durante 7 min y luego se concentraron aproximadamente 20 veces usando columnas de corte Microcon-10 kDa (Millipore). Se combinaron las muestras en una razón de 1 a 1 con tampón de muestra 2x SDS que contenía inhibidor de proteasa, DTT y EDTA 5 mM, se hirvieron durante 10 minutos a 95°C y se ejecutaron en un gel Mini-Protean TGX de acrilamida al 4-15%, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con anticuerpo primario anti-V5 MAB 15253 (Pierce) dilución 1:1.000 y anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado a 800 nm a una dilución de 1:10.000 (Odyssey). Se infectaron miocardiocitos ventriculares de ratas neonatales con adenovirus que expresaban FSTL1 de ratón sin marcar a una MOI de 50. 24 h después de la infección, se reemplazó el medio de cultivo por medio sin suero. Se acondicionó el medio DMEM/F12 pen./estrep. libre de suero con las células NRVC y EMC infectadas durante 24 horas. Se usó tunicamicina a 1 ug/ml y se acondicionó el medio durante 16 horas. Se centrifugó el medio acondicionado a 400g durante 7 minutos y luego se concentró usando columnas de corte Microcon-10 kDa (Millipore). Se combinaron las muestras en una razón de 1 a 1 con tampón de muestra 2x SDS que contenía inhibidor de proteasa, DTT y EDTA 5 mM, se hirvieron durante 10 minutos a 95°C y se ejecutaron en gel Any KD Mini-Protean t Gx , se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se incubaron con una dilución 1:500 de anticuerpo primario anti-FSTL1 MAB1694 (R&D) y anticuerpo secundario anti-IgG de rata conjugado a 800 nm a una dilución 1:10.000 (Odyssey). Se realizaron el bloqueo y la incubación de anticuerpos en bloqueador Odyssey. La inmunotransferencia de tipo Western para FSTL1 recombinante (100 ng cada vez) se realizó de la misma manera.

Marcaje del linaje de miocardiocitos: El marcaje del linaje de miocardiocitos se logró inyectando 4-OH tamoxifeno por vía intraperitoneal en ratones18 Myh6mERcremER:Rosa26Z/EG de ocho semanas de fondo genético C57BL6 a una dosis de 20 mg por kg por día durante 2 semanas, y se detuvo 1 semana antes de la recolección de miocardiocitos (figura 5p), o la operación del IM y el injerto del parche. 4 semanas después del IM, se reunieron los animales para inmunotinción (figura 5q-u).

Resultados

In vivo, los miocardiocitos inducidos por FSTL1 para entrar en el ciclo celular podrían surgir de miocitos preexistentes (células Myh6+) o de novo de una población progenitora. Para distinguir entre estas posibilidades, los miocardiocitos ^Myh6+ ^{preexistentes se marcaron hereditariamente usando Cre inducible por tamoxifeno bajo el control del promotor}18 de Myh6 específicos de miocardiocitos y su destino siguió después del IM e injerto de parche+FSTL1 (figura 5p). El 4-OH tamoxifeno inyectado en ratones Myh6mERCremER: Rosa26Z/EG marcó de manera eficaz los miocardiocitos preexistentes con eGFP antes del IM (figura 5q). Cuatro semanas después del injerto del parche, eran claramente ^{visibles células eGFP}+^{, pH3}+ ^{en el área del infarto y la zona del borde (figura 5r-u), lo que indica que el parche+FSTL1}actúa sobre las células que expresaron Myh antes de la ligadura de LAD y el injerto del parche.

^{¿Cuál es la fuente de la ciclación de células}a ^-actinina+^{? Los miocardiocitos de adulto son generalmente refractarios}a la entrada del ciclo celular, y FSTL1 no promovió la replicación del ADN o la división celular de los miocardiocitos ventriculares murinos de adultos o neonatales in vitro (figura 18a-j). De manera similar, FSTL1 no estimuló la ^{proliferación o diferenciación de células progenitoras cardiomiogénicas primarias expandidas clonalmente (Lin}-^{, Sca1}+^{, SP}+^{) del corazón murino de adulto que puede formar miocardiocitos tras la reimplantación en el corazón}19 ^{de adulto (figura 18k-m). Por el contrario, las células mCM}ESC ^{respondieron a FSTL1 de manera dependiente de la dosis mediante un aumento de la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) en mCM}ESC a ^-actinina+ ^{(figura 6a,d), un aumento del número de células pH3}+^,a ^-actinina+ ^{(figura 6b,e) y la Aurora cinasa B localizada en el surco de}segmentación/cuerpo medio (figura 6c,f). Estos resultados, combinados con los resultados de trazado de linaje que ^{muestran células Myh6}+ ^{que proliferan in vivo después del tratamiento con parche+FSTL1 (figura 5 p-u), sugieren la existencia de células Myh6}+^/a ^-actinina+^{, ubicadas proximales al epicardio, que son competentes en proliferación en la}respuesta a FSTL1 epicárdica.

Sin embargo, siguió resultando paradójico que ni la inducción miocárdica endógena de la expresión de FSTL1, ni la sobreexpresión transgénica directa de FSTL1 pudieran activar la regeneración (figura 4, figura 10). Por tanto, se sometió a prueba si las modificaciones específicas de células de FSTL1 podrían estar implicadas, lo que es particularmente importante ya que todos los experimentos anteriores se realizaron usando FSTL1 humana sintetizada en de bacterias (figuras 4, 5, 6a-f). FSTL1 está muy glicosilada en las células de mamíferos (figura 6g), mientras que la FSTL1 recombinante producida en bacterias no lo está (figura 6h). Por tanto, se sometió a prueba la función de la FSTL1 recombinante producida en células bacterianas (no marcadas) y de mamíferos (glicosiladas) en los ensayos ^{de apoptosis y proliferación en células mCM}ESC^{. La FSTL1 humana expresada en mamíferos protege a los mCM}ESC de la apoptosis inducida por H²O²mientras que la FSTL1 expresada en bacterias, no (figura 6 i). En cambio, la FSTL1 ^{humana expresada en bacterias promueve la proliferación de los mCM}ESC^{, mientras que la FSTL1 humana expresada}en mamíferos, no (figura 6 j, k), por tanto, estas diferencias funcionales claves se correlacionan con el estado glicosilación de FSTL1. También se comparó si la FSTL1 sobreexpresada en miocardiocitos ventriculares de rata neonatal (NRVC) -NRVC no produce una cantidad detectable de FSTL1 endógena (figura 19) - con la FSTL1 en endógena expresada en EMC-células del epicardio. El análisis de inmunotransferencia de tipo Western indicó diferencias de tamaño significativo entre las formas miocárdicas y epicárdicas de FSTL1, diferencias que “desaparecen” con tratamiento con tunicamicina (inhibidor de glicosilación) (figura 6 i), lo que sugiere que la FSTL1 se modifica de manera postranscripcional (glicosilada) de una manera específica de células. Posteriormente, estas formas de Fstl producidas en células del miocardio y del epicardio se sometieron a prueba de manera funcional en el ensayo de proliferación en mCMESC Los medios acondicionados miocárdicos de NRVC infectados con un adenovirus de FSTL1 no marcado no mostraron ningún efecto sobre la proliferación de los mCMESC Por el contrario, los medios acondicionados con EMC promovieron significativamente la proliferación de los mCMESC de una manera dependiente de la FSTL1 hipoglicosilada (figura 6 m, n) hasta un grado comparable al de la hFSTL1 sintetizada en bacterias, lo que demuestra que las modificaciones postranscripcionales específicas de células se relacionan con cambios en el estado funcional de FSTL1.

Ejemplo 7: La administración epicárdica de FSTL1 activa la regeneración cardiaca en un modelo porcino preclínico.

Este ejemplo muestra que el efecto reparador de la administración de parche+FSTL1 en el epicardio parece estar conservado de manera evolutiva.

Materiales y métodos

Aplicación del parche en un modelo porcino de isquemia-reperfusión: El estudio con cerdos se realizó mediante el inflado de un catéter de dilatación de angioplastia coronaria percutánea para ocluir la LAD en cerdos Yorkshire (45 días). El tiempo de oclusión de 90 minutos fue seguido por una reperfusión completa para imitar el modelo clínico de enfermedad del IM. Una semana después del IM, se realizó una toracotomía izquierda y se suturó el parche sobre el infarto. Los grupos de animales incluyeron: controles simulados, I/R sin tratamiento (n=3), I/R tratada con parche sólo (I/R+parche, n=1) e I/R tratada con parche cargado con FSTL1 (I /R+parche+FSTL1, n=2). Administración de EdU: se infusionaron 250 mg/semana de EdU en la circulación durante el transcurso del estudio de 4 semanas (semana 1 a semana 5 posterior a la I/R), usando minibombas osmóticas.

Análisis estadístico: El número de muestras (n) usadas en este y todos los demás ejemplos se registra en el texto y se muestra en las figuras. Todos los experimentos in vitro se han realizado al menos dos veces independientemente. Los experimentos de expresión génica se han realizado 3 veces independientemente y los ensayos de proliferación con EdU y la medición del tamaño celular se han realizado más de 10 veces independientemente. El tamaño de muestra no estaba predeterminado, con un análisis retrospectivo de resultados significativamente diferentes en la mayoría de los estudios in vitro que usan Gpower 3.1 producen potencia > 0,8. Se estimaron los tamaños de muestra para los estudios con animales. Los animales que no sobrevivieron hasta 4 semanas después de la cirugía se excluyeron de los estudios funcionales e histológicos. No se aplicó la aleatorización. Se practicó el enmascaramiento de la asignación de grupos entre la cirugía de animales y el análisis de resultados de los experimentos de infarto de miocardio en ratones. Los valores presentados se expresan como medias EEM. La justificación para usar medias EEM en lugar de DE es que el EEM cuantifica la incertidumbre en una estimación de la media, mientras que la DE indica la dispersión de los datos de la media. Dicho de otro modo, el EEM proporciona una estimación del valor medio informado, mientras que la DE proporciona una idea de la variabilidad de las observaciones individuales. Se usaron ANOVA unidireccional y la prueba t de Student para someter a prueba la significación estadística (P < 0,05). La curva de supervivencia se generó usando PRISM (GraphPad) y se usó la prueba de rangos logarítmicos (Mantel-Cox) para someter a prueba las diferencias significativas entre la supervivencia de los ratones en diferentes condiciones.

Resultados

La administración epicárdica modificada por ingeniería de FSTL1 se evaluó en el modelo porcino de lesión miocárdica por isquemia-reperfusión. Antes del infarto, la fracción de eyección (EF) era ~50% tal como se determina mediante imágenes de resonancia magnética (IRM). Una semana después de la I/R, el % de EF disminuyó a ~30%, después de lo cual se aplicó parche+FSTL1 en el epicardio del tejido lesionado. Los cerdos tratados con parche+FSTL1 recuperaron la contractilidad a la semana 2 de tratamiento (semana 3 del experimento), logrando una EF de aproximadamente el 40%, y se mantuvieron estables durante 2 semanas, el tiempo más largo analizado (figura 7a, b). Esto contrastaba con la disminución constante de la función cardiaca en los animales no tratados y en el animal tratado con el parche solo (figura 7b).

Los cerdos tratados con parche+FSTL1 demostraron el contenido más bajo en la formación de tejido fibrótico (tamaño de la cicatriz) de todos los tratamientos, incluyendo el animal con el parche sólo (véanse las imágenes de IRM representativas (figura 7c, d). Los tejidos porcinos, analizados en la semana 4 después del injerto del parche (semana 5 del experimento), mostraron integración del parche en el tejido huésped y fibrosis limitada (figura 7e) y el marcaje con EdU de las células del músculo liso vascular (figura 7f-h) y miocardiocitos (figura 7i-m) en la zona del borde del área isquémica. También se detectaron miocardiocitos con Aurora cinasa B localizada en la mitad del cuerpo (indicativa de citocinesis) en la zona del borde del corazón tratado con parche+FSTL1 (figura 7n). Por tanto, el efecto restaurador de parche+FSTL1 en el epicardio parece estar conservado de manera evolutiva.

Ejemplo 8: La administración de FSTL1 hipoglicosilada no activa la actividad de señalización de Akt-1

Este ejemplo muestra que el tratamiento con FSTL1 de mCMESC no dio como resultado la activación de Akt-1.

El tratamiento de mCMESC con FSTL1, así como la inmunotransferencia de tipo Western para fosfo-Akt se realizaron tal como se describió anteriormente.

Los resultados se muestran en la figura 20 que representa las detecciones de fosfo-Akt y PCNA en los mCMESC después del tratamiento con FSTL1. La inmunotransferencia de tipo Western contra fosfo-Akt (Ser473 y Thr308, ambas implicadas en la respuesta de supervivencia en los miocardiocitos) y PCNA (marcador de proliferación) después de 1 hora y 24 horas de tratamiento con FSTL1 a 10 ng/ml y 50 ng/ml, no dio como resultado ningún cambio significativo ni en fosfo-Akt ni en PCNA tras el tratamiento con FSTL1.

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Claims

REIVINDICACIONES

i . Polipéptido de proteína similar a la folistatina 1 (FSTL1) para su uso en un método para reparartejido cardiaco tras una lesión en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método poner en contacto el tejido cardiaco con el polipéptido de FSTL1,

en el que el polipéptido de FSTL1 carece completamente de cualquier modificación de hidratos de carbono.
2. Parche de colágeno tridimensional (3D) sembrado o infusionado con un polipéptido de FSTL1 recombinante para su uso en un método para reparar tejido cardiaco tras una lesión en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método poner en contacto el tejido cardiaco o epicardio con el parche de colágeno 3D, en el que el polipéptido de FSTL1 carece completamente de cualquier modificación de hidratos de carbono.
3. Polipéptido de FSTL1 para su uso según la reivindicación 1, en el que

(A) la lesión es una lesión cardiaca por isquemia-reperfusión, se debe a una cardiopatía isquémica, y/o se debe a un corazón hipoplásico,

o

(B) la lesión es un infarto de miocardio y/o el corazón contiene tejido cicatricial.
4. Polipéptido de FSTL1 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3, en el que

(A) reparar el tejido cardiaco comprende aumentar el número de miocardiocitos en el tejido cardiaco, en el que opcionalmente el número de miocardiocitos se aumenta al menos tres veces en comparación con el número de miocardiocitos en el tejido cardiaco que no está en contacto con el polipéptido de FSTL1 tras una lesión,

o

(B) reparar el tejido cardiaco comprende una recuperación aumentada de tejido cardiaco dañado, incluyendo miocardiocitos y/o vasculatura cardiaca, en el que opcionalmente el número de miocardiocitos se aumenta al menos tres veces en comparación con el número de miocardiocitos en el tejido cardiaco que no está en contacto con el polipéptido de FSTL1 tras una lesión.
5. Polipéptido de FSTL1 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-4, en el que

(A) reparar el tejido cardiaco comprende una mejora del acortamiento fraccionario en porcentaje del tejido cardiaco en comparación con la cantidad de acortamiento fraccionario en porcentaje en el tejido cardiaco que no está en contacto con el polipéptido de FSTL1 tras una lesión,

o

(B) reparar el tejido cardiaco comprende una reducción en el área de la cicatriz (fibrosis) de al menos un 2% en comparación con la cantidad de fibrosis en el mismo corazón antes del tratamiento mediante contacto, administración o edición genómica del polipéptido de FSTL1 tras una lesión,

o

(C) reparar el tejido cardiaco comprende un aumento en el área vascular perfundida de al menos un 2% en comparación con la cantidad de área perfundida en el mismo corazón antes del tratamiento mediante contacto, administración o edición genómica del polipéptido de FSTL1 tras una lesión,

o

(D) reparar el tejido cardiaco comprende un aumento en la cantidad de citocinesis de miocardiocitos en el tejido cardiaco en comparación con la cantidad de citocinesis de miocardiocitos en el tejido cardiaco que no se ha puesto en contacto con el polipéptido de FSTL1 tras una lesión, en el que opcionalmente un aumento en la cantidad de citocinesis de miocardiocitos se determina mediante la expresión de Aurora cinasa B.
6. Polipéptido de FSTL1 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-5, en el que

(A) reparar el tejido cardiaco comprende una proliferación de miocardiocitos,

y/o

(B) dicho método da como resultado un aumento de los niveles de transcritos que codifican para proteínas contráctiles específicas del músculo cardiaco en miocardiocitos, en el que opcionalmente

(i) dicho método da como resultado un aumento de 2 veces en los niveles de transcritos que codifican para proteínas contráctiles específicas del músculo cardiaco en miocardiocitos,

y/o

(ii) las proteínas contráctiles específicas del músculo cardiaco se seleccionan del grupo que consiste en myh6, mlc2v y mlc2a.
7 Polipéptido de FSTL1 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-5, en el que

(A) dicho método da como resultado un aumento de las células actinina+ con Ca2+ contráctil rítmico en miocardiocitos,

o

(B) el tejido cardiaco se pone en contacto con el polipéptido de FSTL1 inmediatamente tras la lesión, o

(C) el tejido cardiaco se pone en contacto con el polipéptido de FSTL1 en cualquier momento después de la lesión,

o

(D) dicho método disminuye los episodios cardiacos y las hospitalizaciones,

o

(E) dicho método atenúa la fibrosis en el tejido cardiaco tras la lesión.
8 Polipéptido de FSTL1 para su uso según la reivindicación 3, en el que dicho método da como resultado un aumento de la vascularización de la región lesionada del tejido cardiaco, en el que opcionalmente dicho aumento de la vascularización se determina mediante la expresión del factor de von Willebrand (vWF) o actina del músculo liso en células de vasos sanguíneos.
9 Polipéptido de FSTL1 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-8, en el que dicho método induce la entrada al ciclo celular de miocardiocitos,

en el que opcionalmente

(A) dicha entrada al ciclo celular de miocardiocitos se evalúa mediante la expresión de fosfo-histona H3, y/o

(B) dicho método da como resultado un aumento de al menos 2 veces en la entrada al ciclo celular de miocardiocitos en comparación con la cantidad de entrada al ciclo celular de miocardiocitos en el tejido cardiaco que no se ha puesto en contacto con el polipéptido de FSTL1 tras una lesión.
10. Polipéptido de FSTL1 para su uso según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de FSTL1 se sintetiza en una célula procariota.
11. Polipéptido de FSTL1 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-10, en el que (A) el polipéptido de FSTL1 se administra mediante un parche de colágeno en el tejido miocárdico lesionado, o

(B) el polipéptido de FSTL1 se inyecta directamente en el tejido miocárdico lesionado,

o

(C) el polipéptido de FSTL1 se administra por vía sistémica,

o

(D) el polipéptido de FSTL1 se administra por vía endocárdica, en el que opcionalmente la administración endocárdica es a través de un catéter,

o

(E) el polipéptido de FSTL1 se administra por vía epicárdica a través de un catéter,

o

(F) el polipéptido de FSTL1 se administra a través de un catéter usando una endoprótesis farmacoactiva, o

(G) el tejido cardiaco se pone en contacto desde uno o más de un sitio epicárdico, un sitio endocárdico y/o a través de inyección directa en el miocardio.
12. Composición farmacéutica estéril que comprende un polipéptido de FSTL1, un parche de colágeno 3D y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables,

en la que el polipéptido de FSTL1 carece completamente de cualquier modificación de hidratos de carbono, en la que opcionalmente el parche de colágeno 3D tiene un módulo de elasticidad de 12 4 kPa.
13. Composición farmacéutica estéril según la reivindicación 12,

(i) que comprende además un inhibidor de la glicosilación de FSTL1, en la que opcionalmente dicho inhibidor de glicosilación de FSTL1 comprende tunicamicina,

o

(ii) en la que dicho polipéptido de FSTL1 se sintetiza en una célula procariota, en la que opcionalmente dicha célula procariota es una célula bacteriana.
14. Composición farmacéutica estéril según la reivindicación 12, en la que el polipéptido de FSTL1 se sintetiza en una célula que comprende ARN modificados (ARNmod), o en la que el polipéptido de FSTL1 se expresa mediante edición genómica.
15. Kit que comprende (i) un polipéptido de FSTL1, en el que el polipéptido de FSTL1 carece completamente de cualquier modificación de hidratos de carbono, y (ii) uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, que comprende además (iii) un parche de colágeno 3D,

en el que opcionalmente el parche de colágeno 3D tiene un módulo de elasticidad de 12 4 kPa.
16. Kit según la reivindicación 15, que comprende además (iv) medios de adhesión para adherir el parche de colágeno 3D al epicardio o al miocardio de un corazón lesionado, en el que opcionalmente dichos medios de adhesión son suturas.
17. Parche de colágeno 3D para su uso según la reivindicación 2, en el que

(A) la lesión es una lesión por isquemia-reperfusión o un infarto de miocardio,

y/o

(B) el parche de colágeno 3D se sutura al tejido cardiaco o epicardio.
18. Parche de colágeno 3D infusionado o sembrado con un polipéptido de FSTL1 recombinante, en el que el polipéptido de FSTL1 carece completamente de cualquier modificación de hidratos de carbono, y en el que opcionalmente

(A)

(i) dicho polipéptido de FSTL1 recombinante se sintetiza en una célula procariota, en el que además opcionalmente dicha célula procariota es una célula bacteriana,

o

(ii) dicho polipéptido de FSTL1 recombinante se sintetiza en una célula eucariota que se trata con un inhibidor de glicosilación, en el que además opcionalmente dicho inhibidor de glicosilación es tunicamicina, y/o

(B) el parche de colágeno 3D tiene un módulo de elasticidad de 12 4 kPa.