JPWO2007034753A1 - コンドロモジュリン−ｉを有効成分とする血管新生関連疾患治療剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、心臓弁膜等における抗血管新生因子の働きを解析し、血管新生に起因する疾患の発症のメカニズムを明らかにすることを目的とする。より具体的には、心臓弁膜症等の血管新生に起因する疾患のための治療薬の提供、並びに、該治療薬を効率的にスクリーニングする方法の提供を課題とする。本発明者らによって、コンドロモジュリン-Iは、心臓弁膜に顕著に発現しており、心臓弁膜症に至る血管新生、肥厚および石灰化を予防することによって、弁膜の正常な機能を維持するために重要な役割を果たしていることが見出された。コンドロモジュリン-Iタンパク質、または該タンパク質の発現もしくは機能を活性化させる物質は、血管新生に起因する疾患に対して治療効果を有することが期待される。

Description

本発明は、コンドロモジュリン-Iを有効成分とする血管新生関連疾患治療剤、および、コンドロモジュリン-Iの発現を指標とする血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング方法に関する。

血管新生と抗血管新生因子のバランスは、組織および臓器の正常な発達および恒常性にとって重要である。心臓は、血管に富む臓器であり、多くの血管新生因子を産生するが、心臓弁膜は無血管であり、酸素は血流からの拡散によって供給されている（非特許文献１参照）。アテローム性動脈硬化症、リウマチ性心臓弁膜症、または感染性心内膜炎のような病的な状態では、心臓弁膜は血管新生因子を発現して、血管新生が起こる（非特許文献２および３参照）。心臓弁膜における無血管性の維持に対する抗血管新生因子（血管新生阻害因子）の関与については不明である。

軟骨は、心臓弁膜組織と類似の特徴を有する代表的な無血管組織である。軟骨を含む軟骨細胞と同様に、弁間質細胞（VICs）として知られる心臓弁膜組織の間葉細胞は、不完全な基底層にまばらに分布して、内皮細胞層の下の細胞外マトリックスのコラーゲン線維、エラスチン微小線維、およびプロテオグリカンと直接、広範に接する（非特許文献４〜６参照）。BMP2（非特許文献７参照）、およびTGFβ2（非特許文献８参照）のような増殖因子だけでなく、Sox9（非特許文献９参照）、NATc（非特許文献１０参照）、Runx2（Cbfa1としても知られる）（非特許文献１１参照）、MSX2（非特許文献１２参照）のような軟骨内骨化の際の軟骨形成にとって必須の転写因子も同様に、心臓弁膜において発現している。Sox9はSox5およびSox6と共に、非軟骨形成細胞においても（非特許文献１３参照）、コンドロモジュリン-I（Chm-I）を含む軟骨に特異的な遺伝子の発現を誘導することができ、これらは心臓弁膜の発達にとっても必須であることが報告されている（非特許文献７参照）。

しかしながら、心臓弁膜における抗血管新生因子の作用については不明な点が多く、心臓弁膜症等の血管新生に起因する疾患についての発症メカニズムは明らかとなっていない。
なお、本願発明の関連文献として以下の特許文献もしくは非特許文献が報告されている。

特許第3585180号 特開平9-299088号 特開2004-123722号 特開平5-178896号 Hammon, J.W., Jr., O'Sullivan, M.J., Oury, J. & Fosburg, R.G. Allograft cardiac valves. A view through the scanning electron microscope. J Thorac Cardiovasc Surg 68, 352-60 (1974). Soini, Y., Salo, T. & Satta, J. Angiogenesis is involved in the pathogenesis of nonrheumatic aortic valve stenosis. Hum Pathol 34, 756-63 (2003). Yamauchi, R. et al. Upregulation of SR-PSOX/CXCL16 and recruitment of CD8+ T cells in cardiac valves during inflammatory valvular heart disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 282-7 (2004). Filip, D.A., Radu, A. & Simionescu, M. Interstitial cells of the heart valves possess characteristics similar to smooth muscle cells. Circ Res 59, 310-20 (1986). Lester W, R.A., Granton B, et al. Porcine mitral valve interstitial cells in culture. Lab Invest, 710-719 (1988). Gotlieb, A.I., Rosenthal, A. & Kazemian, P. Fibroblast growth factor 2 regulation of mitral valve interstitial cell repair in vitro. J Thorac Cardiovasc Surg 124, 591-7 (2002). Sugi, Y., Yamamura, H., Okagawa, H. & Markwald, R.R. Bone morphogenetic protein-2 can mediate myocardial regulation of atrioventricular cushion mesenchymal cell formation in mice. Dev Biol 269, 505-18 (2004). Camenisch, T.D. et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Dev Biol 248, 170-81 (2002). Akiyama, H. et al. Essential role of Sox9 in the pathway that controls formation of cardiac valves and septa. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 6502-7 (2004). Ranger, A.M. et al. The transcription factor NF-ATc is essential for cardiac valve formation. Nature 392, 186-90 (1998). Rajamannan, N.M. et al. Human aortic valve calcification is associated with an osteoblast phenotype. Circulation 107, 2181-4 (2003). Chan-Thomas, P.S., Thompson, R.P., Robert, B., Yacoub, M.H. & Barton, P.J. Expression of homeobox genes Msx-1 (Hox-7) and Msx-2 (Hox-8) during cardiac development in the chick. Dev Dyn 197, 203-16 (1993). Ikeda, T. et al. The combination of SOX5, SOX6, and SOX9 (the SOX trio) provides signals sufficient for induction of permanent cartilage. Arthritis Rheum 50, 3561-73 (2004). Hiraki, Y. et al. Molecular cloning of a new class of cartilage-specific matrix, chondromodulin-I, which stimulates growth of cultured chondrocytes. Biochem Biophys Res Commun 175, 971-977 (1991). Funaki, H. et al. Expression and localization of angiogenic inhibitory factor, chondromodulin-I, in adult rat eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 42, 1193-200 (2001). Azizan, A., Holaday, N. & Neame, P.J. Post-translational processing of bovine chondromodulin-I. J Biol Chem 276, 23632-8 (2001). Hiraki, Y. et al. Identification of chondromodulin I as a novel endothelial cell growth inhibitor. Purification and its localization in the avascular zone of epiphyseal cartilage. J Biol Chem 272, 32419-26 (1997).

本発明は、心臓弁膜等における抗血管新生因子の働きを解析し、血管新生に起因する疾患の発症のメカニズムを明らかにすることを目的とする。より具体的には、心臓弁膜症等の血管新生に起因する疾患のための治療薬の提供、並びに、該治療薬を効率的にスクリーニングする方法の提供を課題とする。さらに本発明は、弁組織中への血管新生を抑制する機能を有する人工心臓弁の提供を課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を行った。心臓弁膜はよく知られた無血管組織であるが、いくつかの心臓弁膜症（Valvular Heart Diseases; VHD）ではその無血管性が失われている。本発明者らは、弁膜の無血管性の分子メカニズムを解明すべく、心臓弁膜あるいは網膜等におけるコンドロモジュリン-I(ChM-I)の発現解析を行った。さらに、無血管性に関与するものと考えられるChM-Iについて、その遺伝子を標的とした遺伝子ノックアウト技術を用いてVHDの誘発について検討を行った。

コンドロモジュリン-I（ChM-I）は、眼および軟骨の無血管組織に主に存在するアミノ酸残基335個のII型膜貫通前駆体からのアミノ酸残基121個の糖タンパク質である（非特許文献１４および１５参照）。翻訳後、ChM-I前駆体は、RERR-ELVR部位でフリンプロテアーゼによって切断され（非特許文献１６参照）、分泌されたChM-Iは、軟骨マトリックスの領域間空間に蓄積することが知られている（非特許文献１７参照）。

また、軟骨から単離された抗血管新生因子であるコンドロモジュリン-Iは、E9.5で左心室、流出路、および弁原基において検出されたが、後期胚および成体段階では心臓弁膜にのみ検出された。コンドロモジュリン-Iは、マウスおよびヒトの正常な心臓弁膜においては、顕著な発現が観察されたが、ApoE-/-マウス、ならびに感染性心内膜炎、リウマチ性心疾患、およびアテローム性動脈硬化症を含むヒトVHDではいずれも顕著に減少した。

また、VEGF-Aの発現、血管新生、および石灰化は、コンドロモジュリン-Iがダウンレギュレートされている場所で特に認められた。培養弁間質細胞から得られた培養上清は、内皮細胞の管形成および動員を強く阻害したが、これはコンドロモジュリン-IのsiRNAによって部分的に阻害された。さらに、コンドロモジュリン-Iの遺伝子を標的とすることによって、心臓弁膜においてVEGF-A発現の増強、血管新生および弁膜の肥厚の変化が起こり、心エコー法によって決定したところ、これによって大動脈弁の肥厚および血流の乱れが引き起こされることが分かった。

上述の如く本発明者らは、コンドロモジュリン-Iが、VHDに至る血管新生、肥厚および石灰化を予防することによって、弁膜の正常な機能を維持するために重要な役割を果たしているという証拠を初めて示すことに成功した。

即ち、コンドロモジュリン-Iの発現もしくは機能が阻害されることにより、心臓弁膜等に異常が生じ、その結果、心臓弁膜等の血管新生に関連する疾患が引き起こされるものと考えられる。従って、コンドロモジュリン-Iタンパク質自体、あるいは、該タンパク質の発現もしくは機能を活性化させる物質は、心臓弁膜症等の血管新生関連疾患に対して、有効な治療効果を奏することが期待される。

また、本発明者らによって、心臓弁膜症等の血管新生関連疾患の患者において、心臓弁膜におけるコンドロモジュリン-Iの発現減少が見出された。即ち、コンドロモジュリン-Iの発現量もしくは活性を指標とすることにより、血管新生関連疾患の治療薬（候補化合物）のスクリーニングを行うことが可能である。

また、本発明によって得られた種々の知見は、心臓弁膜における無血管の維持、および血管新生に起因する疾患の発症のメカニズムに対して、新しい洞察を提供するものである。これらのメカニズムを理解することは、心臓弁膜症等に関する新しい治療手段を開発する上で非常に重要となるものであり、本発明は、学術的な観点からも大きく寄与するものである。

さらに、これまでブタ生体弁や生体内溶解型高分子化合物（ポリ乳酸等）に骨髄細胞等を添加して作成されたハイブリッド型の人工心臓弁は、弁間質組織中に新生血管が浸潤し、これに伴った炎症細胞の浸潤や、MMP（マトリックスメタロプロテアーゼ）の活性化による破壊が生じ、長期間の機能維持は不可能であった。しかし本発明によって提供される人工心臓弁は、弁組織中への血管新生が抑制されることから、従来の人工心臓弁と比較して長期間の機能維持に寄与するものと考えられる。

即ち本発明は、心臓弁膜症等の血管新生に起因する疾患のための治療薬、並びに、該治療薬を効率的にスクリーニングする方法に関し、より具体的には、
〔１〕 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、血管新生抑制剤、
（ａ）コンドロモジュリン-Iタンパク質
（ｂ）コンドロモジュリン-Iタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、コンドロモジュリン-Iタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするDNA
〔２〕 心臓弁膜において血管新生抑制作用を有することを特徴とする、〔１〕に記載の血管新生抑制剤、
〔３〕 網膜において血管新生抑制作用を有することを特徴とする、〔１〕に記載の血管新生抑制剤、
〔４〕 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、血管新生関連疾患治療剤、
（ａ）コンドロモジュリン-Iタンパク質
（ｂ）コンドロモジュリン-Iタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、コンドロモジュリン-Iタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするDNA
〔５〕 コンドロモジュリン-Iタンパク質の発現活性化物質もしくは機能活性化物質を有効成分として含有する、血管新生関連疾患治療剤、
〔６〕 血管新生関連疾患が、心臓弁膜の血管新生に起因する疾患である、〔４〕または〔５〕に記載の血管新生関連疾患治療剤、
〔７〕 血管新生関連疾患が、網膜の血管新生に起因する疾患である、〔４〕または〔５〕に記載の血管新生関連疾患治療剤、
〔８〕 血管新生関連疾患が、心臓弁膜症、感染性心内膜炎、リウマチ性心疾患、アテローム性動脈硬化症、および網膜症からなる群より選択される疾患である、〔４〕または〔５〕に記載の血管新生関連疾患治療剤、
〔９〕 コンドロモジュリン-Iタンパク質が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の薬剤、
〔１０〕 コンドロモジュリン-I遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする、遺伝子ノックアウト非ヒト動物、
〔１１〕 心臓の弁に異常を有することを特徴とする、〔１０〕に記載の遺伝子ノックアウト非ヒト動物、
〔１２〕 血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング用である、〔１０〕または〔１１〕に記載の遺伝子ノックアウト非ヒト動物、
〔１３〕 コンドロモジュリン-Iタンパク質の発現もしくは機能を活性化させる化合物を選択することを特徴とする、血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング方法、
〔１４〕 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング方法、
（ａ）コンドロモジュリン-Iタンパク質を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるコンドロモジュリン-Iタンパク質の発現量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を上昇させる化合物を選択する工程
〔１５〕 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング方法、
（ａ）コンドロモジュリン-I遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
〔１６〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング方法、
（ａ）コンドロモジュリン-Iタンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活性を上昇させる化合物を選択する工程
〔１７〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング方法、
（ａ）〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載の遺伝子ノックアウト非ヒト動物に被検化合物を投与する工程
（ｂ）前記遺伝子ノックアウト非ヒト動物におけるコンドロモジュリン-Iタンパク質の発現量もしくは活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与しない場合と比較して、コンドロモジュリン-Iタンパク質の発現量もしくは活性を上昇させる化合物を選択する工程
〔１８〕 前記非ヒト動物の心臓弁膜または眼内における前記タンパク質の発現量もしくは活性を測定することを特徴とする、〔１７〕に記載のスクリーニング方法、
〔１９〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング方法、
（ａ）〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載の遺伝子ノックアウト非ヒト動物に被検化合物を投与する工程
（ｂ）前記遺伝子ノックアウト非ヒト動物における心臓弁膜もしくは網膜を観察する工程
（ｃ）被検化合物を投与しない場合と比較して、心臓弁膜もしくは網膜を正常化させる化合物を選択する工程
〔２０〕 血管新生関連疾患が、心臓弁膜症、感染性心内膜炎、リウマチ性心疾患、アテローム性動脈硬化症、または網膜症である、〔１３〕〜〔１９〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、
〔２１〕 以下の（ａ）および（ｂ）を主要な構成成分とすることを特徴とする、人工心臓弁、
（ａ）コンドロモジュリン-I遺伝子を発現する細胞
（ｂ）脱細胞弁あるいは生体内溶解型高分子化合物
〔２２〕 以下の工程（ａ）〜（ｃ）によって製造される、人工心臓弁、
（ａ）コンドロモジュリン-I遺伝子を発現する細胞を培養および増殖させる工程
（ｂ）前記（ａ）の細胞を、脱細胞弁あるいは生体内溶解型高分子化合物の表面に播種する工程
（ｃ）コンドロモジュリン-I遺伝子を発現する細胞が、前記（ｂ）の脱細胞弁あるいは生体内溶解型高分子化合物の有する間隙を満たすまで培養する工程
を提供するものである。

また本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかと、薬学的に許容される担体または媒体とを混合する工程を含む、血管新生抑制剤または血管新生関連疾患治療剤の製造方法に関する。
（ａ）コンドロモジュリン-Iタンパク質（例えば配列番号：２に記載のアミノ酸配列によって示されるヒトコンドロモジュリン-Iタンパク質など）
（ｂ）コンドロモジュリン-Iタンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号：２に記載のヒトコンドロモジュリン-Iタンパク質のアミノ酸配列など）において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、コンドロモジュリン-Iタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするDNA
さらに本発明は、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを個体へ投与する工程を含む、血管新生関連疾患を予防もしくは治療する方法に関する。また本発明は、〔２１〕または〔２２〕に記載の人工心臓弁を用いる工程を含む、血管新生関連疾患を治療する方法に関する。
あるいは本発明は、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの物質の血管新生抑制剤または血管新生関連疾患治療剤の製造における使用を提供するものである。

齧歯類およびヒト心臓におけるChM-Iの時間的および空間的発現を示す写真および図である。（a）様々なラット組織からの総RNAを用いたchm-IのRT-PCRの結果を示す写真である。軟骨、眼、および心臓において陽性シグナル（310 bp）を示した。（b）ラット心臓におけるchm-Iの空間的発現を示す写真である。心臓弁膜に陽性シグナルを認めたが、心房または心室には認められなかった。成体ラット眼を陽性対照として用いた。（c）ラット心臓におけるchm-Iの時間的発現を示す写真である。RT PCRを胚および成体心臓において行った。E9.5期以降の胚心臓において陽性シグナルを認めた。成体ラット眼および肝臓を陽性および陰性対照として用いた。（d）chm-Iの定量的PCRを成体ラット心臓において行った結果を示すグラフである。Chm-Iは心臓弁膜において心房の場合より30.3倍高いレベルで、心室の場合より72.1倍高いレベルで発現された。* P＜0.01。（e,f）抗ChM-I抗体を用いたラット（e）およびヒト（f）心臓に関するウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。軟骨および肝臓を陽性および陰性対照として用いた。 発達途中および成体マウス心臓におけるChM-Iタンパク質の免疫組織化学および免疫蛍光染色の結果を示す写真である。（a〜d）ChM-Iは、成体における四つ全ての弁において発現された。陽性シグナルを茶色で示す。a,b）短軸方向の視野。c,d）長軸方向の視野。AV、大動脈弁；LV、左心室；MV、僧帽弁；PV、肺動脈弁；PA、肺動脈；IVS、心室中隔。（e〜p）ChM-IおよびVEGF-Aの免疫蛍光染色を、成体（e〜i）および発達段階（m〜p）のマウス心臓における連続切片において示す。A、心房；LA、左心房；TV、三尖弁；RV、右心室；VIC、心室間質細胞；EC、内皮細胞；AVC、房室隆起；OFT、流出路。バーは、1 mm（eおよびp）、200μm（a、b、d、f、およびh〜n）、100μm（cおよびo）、および20μm（g）を表す。 加齢ApoE^-/-マウス心臓の硬化病変におけるChM-IおよびVEGF-Aの免疫組織化学、免疫蛍光染色、およびインサイチューハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。（a）ApoE^-/-マウス心臓の僧帽弁（MV）の硬化病変（矢印の先）におけるChM-IおよびVEGF-Aの免疫組織化学。四角で囲った部分をb）において拡大する。c）b）の連続切片を、VEGF-A抗体を用いて免疫染色した。（d,e）ApoE^-/-および年齢をマッチさせたApoE^+/+マウス大動脈弁（AV）におけるChM-Iのインサイチューハイブリダイゼーション。（f〜m）ApoE^-/-（f〜i）および年齢をマッチさせたApoE^+/+マウス（j〜m）におけるChM-IおよびVEGF-Aの免疫蛍光染色。VEGF-Aは、ChM-IがApoE^-/-マウスにおいてダウンレギュレートされている硬化弁膜領域において顕著にアップレギュレートされたことに注意されたい。バーは100μm（a〜c）および20μm（d〜m）を表す。 ヒト剖検および外科試料からの心臓弁膜の組織学および免疫組織化学の結果を示す写真である。（a〜f）心臓弁膜症を有しない（No-VHD）剖検からの試料。HE、ヘマトキシリンエオジン染色；Azan、アザン染色。ChM-Iは強く発現されたが、VEGF-Aは発現されなかったことに注意されたい。（g〜r）様々な心臓弁膜症の外科試料に関する免疫組織化学の代表的な顕微鏡写真。感染性心内膜炎（IE、g〜j）、リウマチ性心疾患（RHD、k〜n）、およびアテローム性動脈硬化症心臓弁膜症（o〜r）において、顕著な血管新生を認めた。ChM-Iは、VEGF-Aが強く発現されて、新しい血管形成が認められた大きい領域において顕著に減少した。AV、大動脈弁；MV、僧帽弁。バーは200μmを表す。 弁間質細胞（VICs）におけるChM-Iの発現とヒト冠動脈内皮細胞（HCAECs）におけるインビトロでの管形成、遊走、およびアポトーシスに及ぼすその効果を示す写真および図である。（a）外植体培養の3日後でのラットVICsの単層培養の位相差顕微鏡写真。（b）外植体培養7日後。VICsは、丸石様（Cb）または紡錘様（Sp）外観の細胞を示した。（c）VICsは、外植体培養14日後にコンフルエント密度で線維芽細胞様外観を示した。（d）図5bに示すVICsは、アセチル-LDL-Dil染色に関して陰性であった。HCAECsは陽性対照として示す（挿入図）。（e,f）VICs（c）およびNIH3T3細胞（f）におけるChM-Iの免疫蛍光染色。双方の細胞の核をToto-3によって染色した。ChM-Iは、細胞質における顆粒状のパターンとして染色された。（g〜k）VICs条件培地は、インビトロでマトリゲル上での内皮細胞管形成を阻害した。（g）マトリゲル上でのHCAECsの管形成の代表的な写真。CM、条件培地。（h）NIH3T3-CMは、HCAECsの管腔形成に影響を及ぼさなかった。（i）VICs-CMは、6時間でHCAECsの管腔形成を有意に抑制した。（j）VICsを、chm-Iに対して特異的なsiRNAによって3日間処置した。siRNA処置VICs-CMは、HCAECs上での管腔形成の抑制能を部分的に喪失した。（k）Scion画像ソフトウェアを用いて（g）〜（j）の定量的に分析したデータを示す。細胞の管の長さを3回の実験から0.25 mm²の異なる領域5個において測定して、長さを方法において記述したようにmm/mm²として表記した。（l〜p）VICsは、インビトロでHCAECsの化学遊走性を阻害した。VICsと同時培養した上室に適用したHCAECsは、ボイデンチャンバーの下室（m）に落下する。インキュベーション（3時間、37℃）後、HCAECsは、如何なる細胞も含まない場合（l）、またはNIH3T3細胞と同時培養した場合（n）と比較して、メンブレンの下面への遊走が阻害された。（o）chm-Iに対して特異的なsiRNAは、VICs-CMによるHCAECsの化学遊走の抑制を減少した。（p）各実験に関して、結果を3実験からの無作為に選択した高倍率視野5個において計数した細胞数として表記した。遊走細胞数をチャートに示す。（q〜u）VICs-CMによるアポトーシスの誘導。NIH3T3-CM（q,r）またはVICs-CM（s,t）と共に培養したHCAECsを、アネキシンV-FITC結合体によって処置した。本発明者らは、HCAECsをVICs-CMと共に6時間培養した場合に、アネキシンV陽性蛍光細胞を検出した。（u）3実験からの無作為に選択した視野5個からのアネキシンV-FITC陽性細胞数によるアポトーシス細胞の定量。バーは、50μm（e,f）、100μm（a〜d、l〜o、およびq〜t）、および200μm（g〜j）を表す。*：P＜0.05、**：P＜0.01。 加齢chm-I^-/-マウスの心臓弁膜における異常な血管新生、炎症細胞浸潤、および無機質化を示す写真および図である。（a）加齢chm-I^-/-マウスのHE染色によって、低倍率で、肥厚した弁が示された。（b）chm-I^-/-マウスは、ChM-I免疫染色に関して陰性であることを確認した。（c）VEGF-A染色をchm-I^-/-マウスの弁膜に対して行ったところ、強い陽性シグナルを大動脈弁に認めた。（d）加齢chm-I^-/-マウスにおいて（e）の連続切片においてHE染色および陽性vWF染色によって、毛細管様構造が高倍率で明らかとなった。もう一つの連続切片は、MAC-1免疫蛍光（l）に関する陽性染色を示した。chm-I^-/-マウスと比較すると、対照としての年齢をマッチさせたchm-I^+/+マウスはChM-I（h）に関して陽性であり、VEGF-A陽性細胞（i）、毛細管様構造（j）、vWF（k）、およびMAC-1（l）に関して陰性であった。（m,n）大動脈弁の三つの小葉におけるTOTO-3陽性細胞およびvWF陽性細胞を、少なくとも唯一の弁が目に見える免疫蛍光に関して染色した20μm切片毎に計数した。チャートをchm-I^-/-（n＝7）およびchm-I^+/+（n＝5）について作製した。バーは50μm（a、f、g、およびl）、および20μm（その他）を表す。*：P＜0.01。 chm-I^-/-マウス心臓の心エコー法の結果を示す写真である。（a）二次元（2D）モード心エコー法は、大動脈弁において異常に明るいエコー源性の塊を明らかにしたが、これはchm-I^+/+マウス心臓（c）においては検出されなかった。（b）ドップラーカラー試験により、chm-I^+/+マウス心臓の大動脈弁領域においても検出されなかったモザイク状の乱流が示された。（d）挿入図は、それぞれの長軸の図のAVレベル短軸図を示す。AV、大動脈弁；RV、右心室；LV、左心室；LA左心室；LA、左心房；Ao、大動脈；IVS、心室中隔；PW、後壁。 マウス心臓におけるchm-Iのインサイチューハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。（a,c）chm-I mRNAの存在を、成体マウス心臓の弁4個において確認した。（d,e）E10.5マウス胚心臓のホールマウントインサイチューハイブリダイゼーション（WISH法）は、流出路および左心室において陽性シグナル、ならびに右心室および心房の外彎曲において弱いシグナルを示した（fおよびg）。E12.5では同じシグナル伝達パターンを認めた。これらの胚の段階で、心臓は、立体顕微鏡下でchm-I特異的プローブに関して陽性であることが確認された最も強い臓器であった（f）。他の組織を摘出して、心臓を単離した（g）。（h〜k）発達途中、chm-I mRNAの発現は、心臓弁膜の原基および心外膜に局在するようになった。（j,k）胚形成の後期では、LVの心筋細胞においてシグナルを認めることができず、房室管隆起および流出路におけるアポトーシスに起因する薄い弁膜は、chm-I mRNAに関する茶色の陽性シグナルを示した。TV、三尖弁；MV、僧帽弁；PV、肺動脈弁；AV大動脈弁；RV右心室；LV、左心室；A、心房；OFT、流出路；AVC、房室隆起 中期および後期胚マウス心臓におけるchm-Iの免疫蛍光染色の結果を示す写真および図である。（a〜c）E16.5マウス胚心臓を抗ChM-Iおよび抗VEGF-Aによって免疫染色した。心臓弁膜の原基は、ChM-Iに関して陽性シグナルを示した。AVおよびPVの領域を（b）および（c）において拡大した。VEGF-Aの発現は、ChM-I発現とは対照的に心筋細胞および内皮細胞において認められた。（d,e）出生直前のE18.5マウス胚心臓。心臓弁膜はほぼ形成され、ChM-I陽性であり、VEGF-A陰性である。（f）E11.5、E14.5、およびE18.5胚の心臓抽出物において、QT-PCRをchm-Iに関して実施した。初期発達段階の胚の左心室において認識されたchm-Iの発現は、発達の中期までに急速に減少した。バーは200μm（a、d、およびe）、50μm（bおよびc）を示す。 ヒトコンドロモジュリン-I遺伝子の塩基配列、およびヒトコンドロモジュリン-Iタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は、cDNAにおける塩基配列から決定されたヒトコンドロモジュリン-I前駆体タンパク質のもので、そのC-末端部分120アミノ酸残基の部分（下線）が（成熟型）ヒトコンドロモジュリン-Iタンパク質のアミノ酸配列である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らによって、コンドロモジュリン-Iの発現もしくは機能が阻害されることにより、心臓弁膜等に異常が生じ、その結果、心臓弁膜等の血管新生に関連する疾患が引き起こされることが示された。従って、コンドロモジュリン-Iタンパク質自体、あるいは、該タンパク質の発現もしくは機能を活性化させる物質は、心臓弁膜症等の血管新生関連疾患に対して、有効な治療効果を奏することが期待される。

本発明者はまず、コンドロモジュリン-Iタンパク質を有効成分として含有する、血管新生関連疾患治療剤を提供する。

本発明のコンドロモジュリン-I(ChM-I)タンパク質は、ヒトのコンドロモジュリン-Iタンパク質であることが好ましいが、その由来する生物種は特に制限されず、ヒト以外の生物におけるコンドロモジュリン-Iと同等なタンパク質（ヒトコンドロモジュリン-Iのホモログ・オルソログ等）も本発明における「コンドロモジュリン-Iタンパク質」に含まれる。例えば、心臓、血管等の組織を有し、かつ、ヒトのコンドロモジュリン-Iと同等なタンパク質を有する生物であれば、本発明を実施することは可能である。

例えば、ヒトコンドロモジュリン-Iタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に、該アミノ酸配列をコードするDNA（コンドロモジュリン-I遺伝子）の塩基配列を配列番号：１に示す。

また、コンドロモジュリン-Iに相当するタンパク質を有するヒト（アクセッション番号AB006000）以外の生物としては、例えば、マウス（アクセッション番号U43509）、ラット、ウサギ、ウシ（アクセッション番号M65081）、ニワトリ（アクセッション番号AF027380.1）、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル（アクセッション番号BC043890）、メダカ等が挙げられる。

上記以外のタンパク質であっても、例えば本願配列表に記載された配列と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有し、かつ、コンドロモジュリン-Iが有する機能（例えば、血管新生阻害活性等）を持つタンパク質は、本発明のコンドロモジュリン-Iに含まれる。上記タンパク質とは、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、通常変化するアミノ酸数が30アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、最も好ましくは3アミノ酸以内である。

本発明における「コンドロモジュリン-I遺伝子」には、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物における内在性の遺伝子（例えば、ヒトのコンドロモジュリン-I遺伝子のホモログ等）が含まれる。

また、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物の内在性のDNAは、一般的に、配列番号：１に記載のDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上(例えば、95％以上、さらには96％、97％、98％または99％以上)の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。また、該DNAは、生体内から単離した場合、配列番号：１に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」の条件を挙げることができる。当業者においては、他の生物におけるコンドロモジュリン-I遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、コンドロモジュリン-I遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお、本明細書においては、ヒト以外の生物におけるコンドロモジュリン-Iタンパク質（遺伝子）に相当するタンパク質（遺伝子）、あるいは、上述のコンドロモジュリン-Iと機能的に同等なタンパク質（遺伝子）を、単に「コンドロモジュリン-Iタンパク質（遺伝子）」もしくは「ChM-I」と記載する場合がある。

本発明の「コンドロモジュリン-Iタンパク質」は、天然のタンパク質のほか、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えばコンドロモジュリン-Iタンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し、コンドロモジュリン-Iタンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、コンドロモジュリン-Iタンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。本発明の「コンドロモジュリン-Iタンパク質」は、例えば、後述のスクリーニング方法において、例えば対照タンパク質として好適に用いられる。

本発明において「発現」とは遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」及びタンパク質の「分解抑制」によるものが含まれる。「コンドロモジュリン-Iタンパク質の発現」とは、コンドロモジュリン-Iタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳が生じること、またはこれらの転写・翻訳によりコンドロモジュリン-Iタンパク質が生成されることを意味する。また、「コンドロモジュリン-Iタンパク質の機能」とは、例えば、血管新生を抑制する機能、肋軟骨細胞培養系のDNA合成促進機能（Y. Hiraki, et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun., 175:971-977.）、肋軟骨細胞培養系のプロテオグリカン合成促進機能（H. Inoue, et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun., 241:395-400., Y. Hiraki, et al. (1997) J. Biol. Chem., 272:32419-32426.）、肋軟骨細胞培養系のコロニー形成促進機能（H. Inoue, et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun., 241:395-400.）、動脈血管内皮細胞培養系のDNA合成ならびに細胞増殖阻害機能（Y. Hiraki, et al. (1997) J. Biol. Chem., 272:32419-32426.）、動脈血管内皮細胞培養系の管腔形成阻害機能（Y. Hiraki, et al. (1997) J. Biol. Chem., 272:32419-32426., Y. Hiraki, et al. (1999) Eur. J. Biochem., 260:869-878.）、鶏胚尿漿膜血管新生の阻害機能（Y. Hiraki, et al. (1999) Eur. J. Biochem., 260:869-878.）、移植ヒト腫瘍に対する腫瘍増生ならびに腫瘍血管増生の抑制機能（T. Hayami, et al. (1999) FEBS Lett., 458:436-440., Y. Oshima, et al. (2004) J. Cell Sci., 117:2731-2744.）、培養ヒト網膜血管内皮細胞のDNA合成ならびに管腔形成抑制機能（H. Funaki, et al. (2001) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 42:1193-1200., Y. Oshima, et al. (2003) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 44:1814-1823.）、培養ヒト臍帯静脈内皮細胞のDNA合成、細胞遊走、管腔形成に対する阻害機能（Y. Oshima, et al. (2003) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 44:1814-1823., Y. Oshima, et al. (2004) J. Cell Sci., 117:2731-2744.）、関節リウマチに対する抑制活性：T細胞免疫応答と培養滑膜細胞の増殖に対する阻害機能（K. Setoguchi, et al. (2004) Arthritis Rheumatism, 50:828-839.）等を挙げることができる。
上述の各種機能は、当業者においては、一般的な技術を用いて、適宜、評価（測定）することが可能である。具体的には、上述の各種機能に関して記載された文献等を参照して実施することができる。

例えば、コンドロモジュリン-Iタンパク質の有する血管新生抑制活性は、特に制限されるものではないが、(1)血管内皮細胞の遊走活性、(2)血管内皮細胞のアポトーシス誘導の評価、(3)血管内皮細胞の血管形態形成反応（tube formation）等、を適宜評価することによって測定することができる。

本発明は、ヒトコンドロモジュリン-Iタンパク質、または、該タンパク質の変異体（改変体、他の生物のホモログ等）であって、コンドロモジュリン-Iと機能的に同等なタンパク質を有効成分とする、血管新生関連疾患治療剤を提供する。

即ち本発明の好ましい態様としては、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかの物質を有効成分として含有する、血管新生関連疾患治療剤に関する。
（ａ）コンドロモジュリン-Iタンパク質
（ｂ）コンドロモジュリン-Iタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、コンドロモジュリン-Iタンパク質と機能的に同等なタンパク質

本発明の薬剤の成分である「コンドロモジュリン-Iタンパク質」は、天然のタンパク質の他、遺伝子組換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えばコンドロモジュリン-Iタンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し、コンドロモジュリン-Iタンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、コンドロモジュリン-Iタンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。

また、本発明の薬剤の成分であるコンドロモジュリン-Iタンパク質をコードするDNAもまた、本発明に含まれる。本発明のコンドロモジュリン-Iタンパク質をコードするDNAは、染色体DNAであっても、cDNAであってもよい。コンドロモジュリン-Iタンパク質をコードする染色体DNAは、例えば、細胞等から染色体DNAのライブラリーを調製し、コンドロモジュリン-Iタンパク質をコードするDNAにハイブリダイズするプローブを用いた、該ライブラリーのスクリーニングにより取得することができる。またコンドロモジュリン-I タンパク質をコードするcDNAは、コンドロモジュリン-Iタンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）からRNA試料を抽出し、コンドロモジュリン-Iタンパク質をコードするDNAにハイブリダイズするプライマーを用いたRT-PCR法等の遺伝子増幅技術により取得することができる。

本発明のコンドロモジュリン-Iタンパク質または該タンパク質をコードするDNAは、コンドロモジュリン-Iタンパク質と機能的に同等であれば、その塩基配列やアミノ配列が改変された変異体であってもよい。このような変異体は、天然のものでも人工のものでもよい。人工的に変異体を調製するための方法は当業者に公知である。例えば、Kunkel法（Kunkel, T. A. et al., Methods Enzymol. 154, 367-382 (1987)）、ダブルプライマー法（Zoller, M. J. and Smith, M., Methods Enzymol. 154, 329-350 (1987)）、カセット変異法（Wells, et al., Gene 34, 315-23 (1985)）、メガプライマー法（Sarkar, G. and Sommer, S. S., Biotechniques 8, 404-407 (1990)）などが知られている。

本発明の薬剤は、上述の（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするDNA、または該タンパク質を発現するベクターを成分とするものであってもよい。即ち本発明は、以下の（ｃ）を有効成分とする、血管新生関連疾患治療剤に関する。
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするDNA、もしくは該DNAを発現し得るベクター

上記DNAは、効率的な発現のために機能的にプロモーターと結合していることが好ましい。本発明に用いられるプロモーターとしては、本来のコンドロモジュリン-I遺伝子プロモーターを利用することができるが、これ以外にも、公知の種々のプロモーター、例えばCMVプロモーター等を用いることができる。また、当業者であれば、公知の種々の発現ベクターを用いて、容易に本発明のタンパク質を発現するベクターを作製することができる。

本発明の上記ベクターは、遺伝子治療用に使用することも可能である。遺伝子治療とは、機能を有するタンパク質をコードするDNAを含むベクターを患者に投与し、治療または予防することをいう。遺伝子治療に使用することができるベクターには、例えば、アデノウイルスベクター（例えばpAdex1cw）やレトロウイルスベクター（例えばpZIPneo）等が挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のタンパク質をコードするDNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことができる。生体内への投与はex vivo法でもよいが、in vivo法が好ましい。

また、本発明のコンドロモジュリン-Iタンパク質の発現もしくは機能を活性化することによって、血管新生が抑制され、結果として血管新生に関連する疾患に対する治療効果が期待される。
従って本発明は、コンドロモジュリン-Iタンパク質の発現活性化物質または機能活性化物質を有効成分として含む、血管新生関連疾患治療剤を提供する。

本発明において「血管新生関連疾患」とは、血管新生に起因する疾患を指すが、特に、心臓弁膜あるいは網膜における血管新生に起因する疾患であることが好ましい。本発明の血管新生関連疾患としては、例えば、心臓弁膜症、感染性心内膜炎、リウマチ性心疾患、アテローム性動脈硬化症、網膜症、角膜表面への周囲からの血管新生、癌の血管新生、または慢性間接リウマチ等の関節炎等を例示することができる。

本発明における「タンパク質の発現活性化物質」は、タンパク質の発現を有意に活性化（上昇）させる物質である。本発明の上記「発現活性化」には、該タンパク質をコードする遺伝子の転写活性化、および／または該遺伝子の転写産物からの翻訳活性化が含まれる。

本発明のコンドロモジュリン-Iタンパク質の発現活性化物質としては、例えば、コンドロモジュリン-I遺伝子の転写調節領域（例えば、プロモーター領域）に結合して、該遺伝子の転写を促進する物質（転写活性化因子等）を挙げることができる。

また、本発明においてコンドロモジュリン-Iタンパク質の発現活性の測定は、当業者においては周知の方法、例えば、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法等により、容易に実施することができる。

またコンドロモジュリン-Iタンパク質の機能活性化物質とは、コンドロモジュリン-Iタンパク質の機能を有意に活性化させる物質である。本発明者らによって、コンドロモジュリン-Iタンパク質は、例えば、心臓弁膜における血管新生を抑制する機能を有することが示された。従って、本発明の機能活性化物質としては、例えば、コンドロモジュリン-Iタンパク質の心臓弁膜における血管新生抑制作用を増強させる物質を挙げることができる。

また、コンドロモジュリン-Iタンパク質、または該タンパク質の発現もしくは機能を活性化させる物質は、血管新生（例えば、心臓弁膜における血管新生）を抑制させる作用を有する。従って本発明は、上述の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、血管新生抑制剤（阻害剤）を提供する。

本発明の上記血管新生抑制剤は、好ましくは、心臓弁膜、網膜、角膜、関節軟骨、または腫瘍組織において血管新生抑制作用を有することを特徴とする。

また、本発明の「治療剤」は、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することもできる。

なお、本発明における「治療」には、疾患の発生を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。また、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合、症状が改善する場合等も、本発明の「治療」の意味に含まれる。

本発明の薬剤（血管新生抑制剤、血管新生関連疾患治療剤等）は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。

例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。

本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。

また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。

また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、エチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。

本発明の薬剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の薬剤を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。

また、本発明の薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。即ち、本発明の薬剤を保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。心臓弁膜、網膜等に局所的に投与することもできる。

本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む動物に対して、必要量（有効量）が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。

さらに本発明は、本発明のコンドロモジュリン-I遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする、コンドロモジュリン-I遺伝子ノックアウト非ヒト動物（本明細書においては、「ノックアウト非ヒト動物」、あるいは、単に「動物」と記載する場合あり）を提供する。

本発明の遺伝子ノックアウト非ヒト動物は、例えば、血管新生関連疾患治療のための薬剤のスクリーニングに用いることが可能である。また、該疾患のメカニズム解明の研究のための病態モデル動物として、非常に有用である。
本発明におけるノックアウト動物には、アンチセンスRNAもしくはsiRNAの作用により遺伝子の発現が抑制された所謂「ノックダウン動物」も含まれる。

本発明において「コンドロモジュリン-I遺伝子の発現が人為的に抑制されている」には、例えば、（１）コンドロモジュリン-I遺伝子の遺伝子対の一方または双方に、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換等の遺伝子変異を有することにより該遺伝子の発現が抑制されている状態、（２）コンドロモジュリン-I遺伝子の発現抑制効果を有する核酸（例えば、アンチセンスRNAまたはsiRNA等）の作用により遺伝子発現が抑制されている状態、等を挙げることができる。

本発明における「抑制」には、コンドロモジュリン-I遺伝子の発現が完全に抑制されている場合、および、本発明の動物におけるコンドロモジュリン-Iの発現量が野生型動物におけるコンドロモジュリン-I遺伝子の発現量と比較して有意に低下している場合、が含まれる。

上記（１）には、コンドロモジュリン-I遺伝子の遺伝子対の一方の遺伝子の発現のみが抑制されている場合（ヘテロノックアウト動物）も含まれるが、遺伝子対の双方のコンドロモジュリン-I遺伝子の発現が抑制されていることが好ましい（ホモノックアウト動物）。

本発明における遺伝子変異の存在する部位は、該遺伝子の発現が抑制されるような部位であれば特に制限されず、例えばエクソン部位、プロモーター部位等を挙げることができる。

本発明の遺伝子ノックアウト動物は、当業者においては一般的に公知の遺伝子工学技術により作製することができる。例えば、以下のようにして遺伝子ノックアウトマウスを作製することができる。まず、マウスから本発明のコンドロモジュリン-I遺伝子のエクソン部分を含むDNAを単離し、このDNA断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを構築する。このターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法などによりマウスのES細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組み換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためには、ターゲッティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子などを結合させておくことも可能である。これにより、非相同組み換えを起こした細胞株を排除することができる。また、PCRおよびサザンブロットにより相同組み換え体の検定を行い、本発明の遺伝子の遺伝子対の一方が不活性化された細胞株を効率よく得ることもできる。

相同組み換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組み換え箇所以外にも、遺伝子挿入による未知の遺伝子破壊の恐れがあることから、複数のクローンを用いてキメラ作製を行うことが好ましい。得られたES細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションし、キメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、本発明のコンドロモジュリン-I遺伝子の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配させることで、本発明の遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したマウスを取得することができる。マウス以外のES細胞が樹立された動物においても、同様の手法により、遺伝子改変を行うことができる。

本発明の上記ノックアウト動物は、好ましくは、コンドロモジュリン-I遺伝子の発現抑制効果を有する核酸（アンチセンスRNA、siRNA、shRNA等）を非ヒト動物へ導入することによってコンドロモジュリン-I遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、ノックアウト（ノックダウン）動物である。

上記ノックダウン動物は、本発明の核酸（アンチセンスRNA、siRNA、shRNA等）を発現し得る構造のベクターを、非ヒト動物へ導入することによっても作製することができる。

本発明のノックアウト動物の種類は、非ヒト動物であれば特に制限されないが、通常、高等動物であり、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは霊長類である。より具体的には、本発明の動物として、好ましくはマウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類（ネズミ目）、またはサルであり、より好ましくは、マウスである。

本発明の遺伝子ノックアウト（ノックダウン）非ヒト動物の好ましい態様としては、心臓の弁に異常を呈することを特徴とする動物である。この「異常」とは、具体的には、心臓弁膜の肥厚、石灰化、可動性低下、弁膜組織中への血管侵入あるいは血管内皮細胞やマクロファージの侵入、大動脈血流の乱流現象、大動脈−左心室の圧較差等を指す。

また、本発明の上記非ヒト動物は、例えば、本発明の薬剤のスクリーニング方法に利用することができる。即ち、本発明者らによって上記非ヒト動物が、例えば、血管新生関連疾患治療剤のスクリーニングに好適に利用可能であること（新規用途）が見出された。従って本発明の非ヒト動物の好ましい態様としては、後述のスクリーニング方法用動物である。

また本発明は、コンドロモジュリン-I遺伝子の発現量を指標とする、本発明の薬剤（血管新生抑制剤もしくは血管新生関連疾患治療剤）のスクリーニング方法を提供する。
コンドロモジュリン-I遺伝子の発現量を上昇（亢進）させる物質は、本発明の薬剤となることが期待される。本発明のスクリーニング方法によって、血管新生抑制剤もしくは血管新生関連疾患治療剤のための候補化合物を効率的に取得することができる。

本発明の方法の好ましい態様は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、本発明の薬剤（血管新生抑制剤もしくは血管新生関連疾患治療剤）のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロモジュリン-Iタンパク質を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞におけるコンドロモジュリン-Iタンパク質の発現量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を上昇させる化合物を選択する工程

本発明の上記方法においては、まず、コンドロモジュリン-Iタンパク質（遺伝子）を発現する細胞に被検化合物を接触させる。

本方法に用いる「細胞」は、特に制限されないが、好ましくはヒト由来の細胞である。「コンドロモジュリン-Iタンパク質を発現する細胞」としては、内在性のコンドロモジュリン-Iタンパク質を発現している細胞、または外来性のコンドロモジュリン-I遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のコンドロモジュリン-I遺伝子が発現した細胞は、通常、コンドロモジュリン-I遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。

本発明のスクリーニング方法に供する被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。

また、これらの被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。

コンドロモジュリン-Iタンパク質（遺伝子）を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、コンドロモジュリン-Iタンパク質を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。

本方法においては次いで、該コンドロモジュリン-Iタンパク質の発現量を測定する。ここで「タンパク質の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。発現量の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。

例えば、コンドロモジュリン-Iタンパク質を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、DNAアレイ法等を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また、コンドロモジュリン-Iタンパク質を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、コンドロモジュリン-Iタンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うこともできる。さらに、コンドロモジュリン-Iタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施し、該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。コンドロモジュリン-Iタンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の双方を利用することができる。

コンドロモジュリン-Iタンパク質に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然のコンドロモジュリン-Iタンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナント（組み換え）コンドロモジュリン-Iタンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、コンドロモジュリン-Iタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えばコンドロモジュリン-Iタンパク質もしくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、コンドロモジュリン-Iタンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、コンドロモジュリン-Iタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。

本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（被検化合物の非存在下において測定した場合）と比較して、コンドロモジュリン-Iタンパク質の発現量を上昇させる化合物を選択する。また、対照と比較することにより上記（ｃ）の選択を行うことも可能である。

本方法により単離される化合物は、血管新生（例えば、心臓弁膜もしくは網膜等における血管新生）を抑制する作用を有し、血管新生に関連する疾患の治療剤となることが期待される。

また本発明のスクリーニング方法の他の態様は、コンドロモジュリン-Iタンパク質の活性（機能）を指標とする方法である。上記方法は、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、本発明の薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロモジュリン-Iタンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活性を上昇させる化合物を選択する工程

本方法においてはまず、コンドロモジュリン-Iタンパク質または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と被検化合物を接触させる。

次いで、コンドロモジュリン-Iタンパク質の活性を測定する。コンドロモジュリン-Iタンパク質の活性としては、例えば、上述の各種活性（機能）を挙げることができる。該活性の測定は当業者においては公知の手法を用いて、あるいは、本明細書において引用された各種文献を参照して、適宜評価することができる。

さらに被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該タンパク質の活性を上昇（亢進）させる化合物を選択する。

本発明のスクリーニング方法の他の態様は、本発明のコンドロモジュリン-Iタンパク質（遺伝子）の発現レベルを上昇させる化合物をレポーター遺伝子の発現を指標として選択する方法である。

本発明の上記方法の好ましい態様は以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、本発明の薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロモジュリン-I遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程

本方法においてはまず、コンドロモジュリン-I遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、コンドロモジュリン-I遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、コンドロモジュリン-I遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、コンドロモジュリン-I遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。コンドロモジュリン-I遺伝子のcDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するコンドロモジュリン-I遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。

本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびGFP遺伝子等が挙げられる。「コンドロモジュリン-I遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「コンドロモジュリン-I遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのDNA構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。

「コンドロモジュリン-I遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、コンドロモジュリン-I遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを添加したものを挙げることができる。

本方法における「接触」は、「コンドロモジュリン-I遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。

本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。

本方法においては、次いで測定したレポーター遺伝子の発現レベルを被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較して、上昇（亢進）させる化合物を選択する。

また本発明は、本発明の上記動物を利用した本発明の薬剤（血管新生関連疾患治療剤もしくは血管新生抑制剤等）のスクリーニング方法に関する。

本発明の方法は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、本発明の薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）本発明の遺伝子ノックアウト非ヒト動物に被検化合物を投与する工程
（ｂ）前記遺伝子ノックアウト非ヒト動物におけるコンドロモジュリン-Iタンパク質の発現量もしくは活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与しない場合と比較して、コンドロモジュリン-Iタンパク質の発現量もしくは活性を上昇させる化合物を選択する工程

まず、上記した遺伝子ノックアウト非ヒト動物に被検化合物を投与する。被検化合物の投与は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型等が挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局所的（例えば、心臓弁膜、網膜等）に投与することができる。

被検化合物がDNAである場合、生体内に投与する場合には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターを利用することができる。投与方法としては、in vivo法およびex vivo法を例示することができる。

本方法においては次いで、該遺伝子ノックアウト動物におけるコンドロモジュリン-Iタンパク質の発現量もしくは活性を測定する。より具体的には、該動物の組織、器官、細胞等（好ましくは、心臓弁膜、眼内、網膜等）について、コンドロモジュリン-Iタンパク質の発現量もしくは活性の測定を行う。発現量もしくは活性の測定は上述の方法によって行うことができる。

本方法においては、次いで、被検化合物を投与しない場合（対照）と比較して、コンドロモジュリン-Iタンパク質の発現量もしくは活性を上昇させる化合物を選択する。

また、本発明の遺伝子ノックアウト動物を利用し、該動物における心臓弁膜もしくは網膜の形態変化を指標とすることにより、本発明のスクリーニングを行うことも可能である。

本発明の好ましい態様においては、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、本発明の薬剤のスクリーニング方法である。
（ａ）本発明の遺伝子ノックアウト非ヒト動物に被検化合物を投与する工程
（ｂ）前記遺伝子ノックアウト非ヒト動物における心臓弁膜もしくは網膜を観察する工程
（ｃ）被検化合物を投与しない場合（対照）と比較して、心臓弁膜もしくは網膜を正常化させる化合物を選択する工程

本方法においては次いで、コンドロモジュリン-I遺伝子をノックアウトした非ヒト動物の呈する表現型に依存する形態上の変化を観察する。即ち、該ノックアウト動物における異常な心臓弁膜もしくは網膜を、正常化させる物質を選択することにより、本発明の薬剤の候補化合物を取得することができる。例えば、前記ノックアウト非ヒト動物における心臓弁膜内の肥厚、石灰化等を正常化させる化合物を選択する。

また本発明は、本発明のスクリーニング方法を実施するために用いられる、各種薬剤・試薬等を含むキットを提供する。
本発明のキットは、例えば本発明の上述の各種試薬の中から、実施するスクリーニング方法にあわせて適宜選択することができる。例えば本発明のキットは、コンドロモジュリン-Iタンパク質の検出の際に利用可能な、コンドロモジュリン-I遺伝子に対するプローブもしくは該遺伝子の任意の領域を増幅するためのプライマー等のオリゴヌクレオチド、または、コンドロモジュリン-Iタンパク質を認識する抗体（抗コンドロモジュリン-Iタンパク質抗体）等を構成要素として含む。

上記オリゴヌクレオチドは、例えば、本発明のコンドロモジュリン-I遺伝子のDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、コンドロモジュリン-I遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。

本発明においてハイブリダイゼーションの条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer (Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を3回行い、最後に1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分間の洗浄を2回行うことができる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、条件を設定することができる。

該オリゴヌクレオチドは、上記本発明のスクリーニング用キットにおけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、本発明のコンドロモジュリン-I遺伝子のDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。

本発明のキットには、さらに、本発明の方法において使用される各種試薬、容器等を含めることができる。例えば、各種反応試薬、細胞、培養液、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示書等を適宜含めることができる。

また本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）を主要な構成成分とすることを特徴とする、人工心臓弁を提供する。
（ａ）コンドロモジュリン-I遺伝子を発現する細胞
（ｂ）脱細胞弁あるいは生体内溶解型高分子化合物
本発明の人工心臓弁は、上記（ａ）および（ｂ）を主要な構成成分とする、ハイブリッド型の人工心臓弁であって、例えば「ハイブリッド型再生弁」と記載する場合もある。

また本発明は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）によって製造される、人工心臓弁を提供する。
（ａ）コンドロモジュリン-I遺伝子を発現する細胞を培養および増殖させる工程
（ｂ）前記（ａ）の細胞を、脱細胞弁あるいは生体内溶解型高分子化合物の表面に播種する工程
（ｃ）コンドロモジュリン-I遺伝子を発現する細胞が、前記（ｂ）の脱細胞弁あるいは生体内溶解型高分子化合物の有する間隙を満たすまで培養する工程

本製造工程においては、まずコンドロモジュリン-I遺伝子を発現する細胞を培養する。コンドロモジュリン-I遺伝子を発現している細胞を得るためには、例えば被検者または被検者以外の（心臓）弁組織の一部（例えば心臓弁輪組織または三尖弁等）をバイオプシー等で切除した上で、表面の内皮細胞を除去することにより得ることができる。得られた細胞をエクスプラント培養し、充分量になるまで増殖させる。エクスプラント培養条件は、当業者に一般に知られている培養条件、例えば、論文（Lester W, Rosenthal A, Granton B, Gotlieb AI. Porcine mitral valve interstitial cells in culture. Lab. Invest. 59, 710-719, (1988)）の細胞培養の項目に記載の培養条件を利用することができる。

次いで、該細胞を、脱生体弁あるいは生体内溶解型高分子化合物の表面に播種する。脱生体弁あるいは生体内溶解型高分子化合物は、間隙を有するもの、即ち多孔性のものを用いることが好ましい。

次いで表面に播種した細胞が、脱生体弁あるいは生体内溶解型高分子化合物の有する間隙（孔）に浸潤し間隙を満たすまで培養を行う。培養条件は例えば既に論文（Lester W, Rosenthal A, Granton B, Gotlieb AI. Porcine mitral valve interstitial cells in culture. Lab. Invest. 59, 710-719, (1988)）に記載してある条件を利用することができる。

該細胞が上記間隙（孔）を充分に満たしたところで、該細胞を有する脱生体弁あるいは生体内溶解型高分子化合物を無血清培養液に転換する。

なおこのようにして製造された本発明の人工心臓弁は、さらに生理食塩水にて洗浄し血清成分を除去した後に、破壊の進んだ弁置換が必要な患者の弁と置換手術を行うこともできる。

本発明における、上記「コンドロモジュリン-I遺伝子を発現する細胞」とは、好ましくは被検者由来あるいは被検者以外由来の弁間質細胞である。即ち自己弁間質細胞あるいは他家（第三者）の弁間質細胞を用いることができる。

本発明における、上記「脱細胞弁」とは、脱細胞化を行った（細胞成分を除去した）生体弁を指す。脱細胞化は、当業者に公知の手法をもって実施することが可能である。また上記のように、本発明の脱細胞弁は、多孔性のものが好ましい。

また本発明における「生体弁」とは、例えばブタの生体弁を利用することができる。

また本発明における「生体内溶解型高分子化合物」として例えば、ポリ乳酸等が挙げられる。また上記のように本発明の生体内溶解型高分子化合物は、多孔性のものが好ましい。

また本発明者らは、弁の間質細胞が血管新生抑制因子であるコンドロモジュリン-Iを分泌することにより、新生血管が弁間質組織中に浸潤せず、これに伴った炎症細胞の浸潤やMMPの活性化による破壊から弁組織を保護していることを明らかにした。これまでブタ生体弁や生体内溶解型高分子化合物（ポリ乳酸等）に骨髄細胞等を添加したハイブリッド型再生弁では弁組織中に血管侵入や、炎症細胞の浸潤に伴い、長期間の機能維持は不可能であった。そこで本発明者らは自己弁間質細胞あるいは他家（第三者）の弁間質細胞をブタ生体弁（脱細胞弁）や生体内溶解型高分子化合物（ポリ乳酸等）に播種し、本来の弁組織の構造類似の組織を保持したハイブリッド型再生弁の作成を試み、これを臨床応用しようというものである。
即ち本発明は、弁組織における血管新生を抑制する機能を有することを特徴とする人工心臓弁を提供する。

また本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかと、薬学的に許容される担体または媒体とを混合する（組み合わせる）工程を含む、血管新生抑制剤または血管新生関連疾患治療剤の製造方法に関する。
（ａ）コンドロモジュリン-Iタンパク質（例えば配列番号：２に記載のアミノ酸配列によって示されるヒトコンドロモジュリン-Iタンパク質など）
（ｂ）コンドロモジュリン-Iタンパク質のアミノ酸配列（例えば配列番号：２に記載のヒトコンドロモジュリン-Iタンパク質のアミノ酸配列など）において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、コンドロモジュリン-Iタンパク質と機能的に同等なタンパク質
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするDNA

「薬学的に許容される担体または媒体」とは、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかと共に投与することが可能であり、血管新生を抑制する作用を有意に阻害しない材料である。このような担体または媒体としては、例えば脱イオン水、滅菌水、塩化ナトリウム溶液、デキストロース溶液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸含有リンゲル溶液、培養液、血清、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）などが挙げられ、これらと前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを適宜組み合わせて製剤化することが考えられる。また、必要に応じて遠心などにより濃縮され、生理食塩水などの生理的溶液中に再懸濁されてよい。また、リポソームの膜安定化剤（例えばコレステロール等のステロール類）を含んでいてもよい。また、抗酸化剤（例えばトコフェロールまたはビタミンEなど）を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加することができる。本発明の組成物は、水溶液、カプセル、懸濁液、シロップなどの形態であり得る。

さらに本発明は、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを個体（例えば患者等）へ投与する工程を含む、血管新生関連疾患を予防もしくは治療する方法に関する。本発明の予防もしくは治療する方法における個体とは、好ましくはヒトであるが、特に制限されず非ヒト動物であってもよい。本発明の前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができるが、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、または皮下等に行われうる。投与は局所あるいは全身であってよい。ヒト以外の動物について投与する場合、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）でヒトの投与量を換算した量を投与することができる。

また本発明は、上記本発明の人工心臓弁を用いる工程を含む、血管新生関連疾患を治療する方法に関する。

あるいは本発明は、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの物質の血管新生抑制剤または血管新生関連疾患治療剤の製造における使用を提供するものである。

なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により制限されるものではない。
〔実施例１〕 ヒト試料の調製
大動脈弁18例および僧帽弁11例（男性29人から；平均年齢60.3±17.7歳）を弁狭窄または逆流のために弁置換手術を受けた患者から採取した。試料を摘出後直ちにホルムアルデヒドにおいて固定して、パラフィンに包埋した。対照に関して、顕微鏡的および肉眼的に正常で石灰化していない滑らかで柔軟な大動脈弁および僧帽弁3個を剖検患者（平均年齢、44.3±9.7歳）3人から得た。

〔実施例２〕 マウス及びラットの調製
野生型ICR系マウスおよびウィスター系ラットを日本クレア（東京、日本）から購入した。ApoE^-/-マウス（Plump, A.S. et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell 71, 343-53 (1992)）は、ジャクソン研究所から購入して、十分に老齢となるまで（n＝5、90.5±3.7週齢）通常食を与えた。Chm-I^-/-系統は、既知の方法で作製し（Nakamichi, Y et al. Chondromodulin I is a bone remodeling factor. Mol Cell Biol 23,636-44 (2003)）、90.2±7.4週齢（n＝7）となるまで維持した。

〔実施例３〕 成体ラット大動脈弁間質細胞（VICs）の単離
心臓を、麻酔した5週齢のウィスター系ラットから摘出した。大動脈弁の小葉を迅速に採取して、実体顕微鏡下で細切して、既知の方法で（Lester W, R.A., Granton B, et al. Porcine mitral valve interstitial cells in culture. Lab Invest, 710-719 (1988)）エクスプラント培養のために用いた。5×5 mmの小片を組織から切断して、12ウェルコラーゲンコーティング皿（イワキ、東京、日本）に載せて、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むM199（シグマ-アルドリッチ、東京、日本）において増殖させた。条件培地（CM）を培地交換の3日後のコンフルエント弁間質細胞から得て、さらなる分析に用いた。

〔実施例４〕 細胞培養の調製
NIH3T3細胞は既知の方法で（Hisaka, Y et al. Powerful and controllable angiogenesis by using gene-modified cells expressing human hepatocyte growth factor and thymidine kinase. J Am Coll Cardiol 43, 1915-22 (2004)）維持した。ヒト冠動脈血管内皮細胞（HCAECs）をタカラバイオテクノロジー（東京、日本）から購入して、既知の方法で（Hamilton, K.L., Mbai, F.N., Gupta, S. & Knowlton, A.A. Estrogen, heat shock proteins, and NFkappaB in human vascular endothelium. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 1628-33 (2004)）維持して、継代回数3〜5回の細胞を本試験において用いた。

〔実施例５〕 逆転写PCR（RT-PCR）による解析
トリゾル試薬（ギブコ-BRL（Gibco-BRL））を用いて総RNAを単離し、DNアーゼI（ロシュ（Roche））によって処置した。RT-PCRは、以下のプライマーを用いて既知の方法で（Enomoto, H. et al. Vascular endothelial growth factor isoforms and their receptors are expressed in human osteoarthritic cartilage. Am J Pathol 162, 171-81 (2003)）実施した。
マウスchm-I（ジェンバンク（Genbank）（商標）アクセッション番号NM_010701号）：（フォワード）5'-CTTAAGCCCATGTATCCAAA-3'／配列番号：３、（リバース）3'-CCAGTGGTTCACAGATCTTC-5'／配列番号：４；gapdh（フォワード）5'-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3'／配列番号：５、（リバース）3'-CATGGACTGTGGTCATGAG-5'／配列番号：６。

chm-Iに関するRT-PCRを様々な臓器において行った。軟骨および眼は陽性対照として用いた。chm-Iは、心臓以外の臓器では検出されなかった（図１a）。Chm-I発現は心臓弁膜において強かったが、心房および心室には存在しなかった（図１b）。ラットの胚形成の際、chm-Iの発現はE9.5で心臓に初めて出現して、成体まで持続した（図１c）。

〔実施例６〕 リアルタイム定量的RT-PCR（QT-PCR）による解析
ラット心臓におけるラットchm-I mRNAの相対量を、既知の方法により（Aoyama, T. et al. Expression of the chondromodulin-I gene in chondrosarcomas. Cancer Lett 204, 61-8 (2004)）、ABI PRISM 7700配列検出システム（PEアプライドバイオシステムズ（PE Applied Biosystems））によるタックマンリアルタイムPCRによって評価した。chm-I cDNA（ジェンバンク（商標）アクセッション番号NM_030854）の+411（エキソン4）から+485（エキソン5）までの75 bpの断片を、特異的プライマー（センス、5'-GAAGGCTCGTATTCCTGAGGTG-3'／配列番号：７；アンチセンス5'-TGGCATGATCTTGCCTTCCAGT-3'／配列番号：８）を用いて増幅して、タックマンプローブ（5'-FAM-CGTGACCAAACAGAGCATCTCCTCCA-3'-TAMRA／配列番号：９）によって標識した。GAPDH mRNAを内部対照として用いて、全ての反応を1試料あたり3回ずつ行った。各試料におけるchm-I/ GAPDHの比を計算して、chm-I遺伝子の発現レベルを標準物質としてラットの全眼におけるchm-I/ GAPDH比（1.0）を用いて相対値として決定した。同じ分析を3回行って、値をGAPDHレベルに対して標準化したラット全眼のmRNAレベルと比較した％mRNAレベルとして表記する。

定量的PCRにより、chm-I発現が、心房または心室と比較して心臓弁膜では800倍高かったことが判明した（図１d）。

〔実施例７〕 ウェスタンブロッティングによる解析
ウィスター系ラットおよび剖検ヒト組織（心房、心室、心臓弁膜および軟骨）を溶解緩衝液[20 mMトリス（pH 7.4）、1 mM EDTA、1 mM EGTA、complete mini（登録商標）（ロシュ、ドイツ）錠／緩衝液10 ml]においてホモジナイズした。ウェスタンブロット分析は、既知の方法で実施した（Funaki, H. et al. Expression and localization of angiogenic inhibitory factor, chondromodulin-I, in adult rat eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 42, 1193-200 (2001)）。ChM-Iタンパク質を可視化するために、各試料のローディング量を変化させた。メンブレンをウサギ抗ChM-Iポリクローナル抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）-結合抗ウサギIgG抗体（アマシャムファルマシアバイオテック、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）と共にインキュベートして、供給元の説明書に従ってシグナルをSuperSignal West Pico（PIERCE）によって可視化した。

ウェスタンブロット分析から、ラットおよびヒト心臓弁膜にChM-Iが存在することが示された（図１ef）。心臓弁膜において認められる25 kDa ChM-Iタンパク質は、軟骨抽出物においても同様に検出される成熟グリコシル化型であると推定された。心房および心室抽出物はChM-Iが存在するシグナルを示さなかった。

〔実施例８〕 インサイチューハイブリダイゼーションと免疫組織化学による解析
（インサイチューハイブリダイゼーション）
パラフィン抱埋切片をプロテナーゼKによって処理して、既知の方法でインサイチューハイブリダイゼーションを行った（Enomoto, H. et al. Vascular endothelial growth factor isoforms and their receptors are expressed in human osteoarthritic cartilage. Am J Pathol 162, 171-81 (2003)）。鋳型DNAは、pCR II-TOPOベクターにクローニングされたマウスchm-Iをコードする879-bp cDNAであった。0.003％過酸化水素を含む50 mmol/Lトリス-塩酸pH 7.6における0.2 mg/ml 3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸の溶液によって発色させて、切片をヘマトキシリンによって対比染色して、顕微鏡下で観察した。

また、9.0、9.5、10.0、および12.5日のマウス胚（E）を採取して、既知の方法で（Dietz, U.H., Ziegelmeier, G., Bittner, K., Bruckner, P. & Balling, R. Spatio-temporal distribution of chondromodulin-I mRNA in the chicken embryo: expression during cartilage development and formation of the heart and eye. Dev Dyn 216, 233-43 (1999)）DIG標識RNAプローブを用いて、ホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションを行った。

（免疫組織化学および免疫蛍光染色）
妊娠または非妊娠成体マウス心臓をPBSによって心尖から還流して、4％パラホルムアルデヒド（PFA）/PBSによって固定し、これを既知の方法で（Funaki, H. et al. Expression and localization of angiogenic inhibitory factor, chondromodulin-I, in adult rat eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 42, 1193-200 (2001)）免疫染色のために用いた。すなわち、妊娠または非妊娠成体マウス心臓を解剖して4％PFAにおいて4℃で一晩液浸固定した後、パラフィンに抱埋した。一次抗体を適用する前に、切片をキシレンにおいてパラフィン除去して、pH 6.0の10 mmolクエン酸一水和物（DAKO、グロストルップ、デンマーク）中でマイクロ波オーブンにおいて3分間加熱した。それらをPBSにおいてすすいだ後、切片を5％正常ウサギ血清、アフィニティ精製ウサギ抗ポリクローナル抗マウスChM-I、ウサギポリクローナル抗VEGF-A（200倍希釈；sc-507；サンタクルズバイオテクノロジー（Santa Cruz Biotecunology）、カリフォルニア州）、抗フォンウィルブランド因子（200倍希釈；vWF；RB-281-A0；ラブビジョンコーポレーション（Lab vision Corporation）、ウェスティングハウスドライブフレモント、カリフォルニア州）、または抗MAC-1（200倍希釈；557394；BDファーミンゲンインク（BD PharMingen, Inc.）、サンジエゴ、カリフォルニア州）と共に4℃で一晩インキュベートした。免疫組織化学反応を観察するために、色素産生基質として0.05 Mトリス緩衝生理食塩液（pH 7.6）中に0.01％H₂O₂を含む0.05％3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸（シグマ-アルドリッチ（Sigma-Aldrich）、東京、日本）を適用することによって、シグナルを検出した。切片をヘマトキシリンによって対比染色して、段階的エタノールにおいて脱水し、Permount（フィッシャーサイエンティフィック（Fisher Scientific）、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）に封入した（Hiraki, Y et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. Eur J Biochem 260, 869-78 (1999)）。

免疫蛍光試験に関して、切片をアレクサ488または594（モレキュラープローブス（Molecular Probes）、ユージーン、オレゴン州）に結合させた二次抗体と共にインキュベートした。核をTOTO-3（モレキュラープローブス、ユージーン、オレゴン州）によって染色した。スライドガラスを共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM 510 META；カールツァイス（Carl Zeiss）、イェーナ、ドイツ）下で観察した。光学切片を1024×1024ピクセルの解像度で得て、LSMソフトウェア（カールツァイス、イェーナ、ドイツ）を用いて分析した。本発明者らは、各免疫染色実験の陰性対照として一次抗体のために非免疫ウサギ血清を用いて行った。

インサイチューハイブリダイゼーション（図８）および免疫組織化学（図２、図９）によって、成体マウス心臓における四つ全ての心臓弁膜にChM-Iが存在することが判明した。連続切片により、ChM-Iの発現は、VEGF-A発現とは相反的に検出されうることが判明した。ChM-Iタンパク質は、弁間質細胞（VICs）および細胞外マトリックス全体に検出されたが、心臓弁膜の外側の内皮細胞層には検出されなかった。

発達の際に、房室管隆起（AVC）および流出路（OFT）からの心臓弁膜前駆細胞は、E9.5に始まるchm-I転写物およびChM-Iタンパク質を発現する。この発現の開始は、RT-PCRの結果と一致する。10.0期の胚において、ChM-Iは、左心室（LV）の肉柱形成心筋細胞を覆う心ゼリー、右心室（RV）の外彎曲および心流出路において発現される。心室におけるChM-I発現は、発達が進行すると徐々に減少して、胚形成の中期までにchm-I転写物およびタンパク質は消失した。ChM-IおよびVEGF-Aの位置が異なることは、発達の全ての段階で明白であった。VEGF-Aの発現は、心筋細胞および心室腔に面する内皮細胞に限定されたが、ChM-I発現は、弁膜小葉の原基に限定された。

〔実施例９〕 加齢ApoE^-/-マウスにおける弁膜硬化症でのChM-IとVEGF-Aの発現の解析
抗血管新生ChM-Iおよび血管新生VEGF-Aの発現を、心臓弁膜に異常な脂質沈着と石灰化とを有するアテローム性動脈硬化症のモデルである加齢ApoE^-/-マウス（90.5±3.7週齢）の心臓弁膜において調べた。ChM-Iの発現は、新たに浸潤したVEGF-A陽性細胞を有する（図３glkm）大動脈弁および僧帽弁の双方において石灰化領域には存在しなかった（図３abfh）。年齢をマッチさせた野生型マウス（88.5±4.4週齢）は、予想される生理的ChM-I陽性およびVEGF-A陰性発現パターンを示し、硬化または石灰化を示さなかった。chm-Iに関するインサイチューハイブリダイゼーションでは、ApoE^-/-マウスにおける硬変大動脈弁の小葉にシグナルを認めなかった（図３d）が、年齢をマッチさせた野生型マウスは陽性シグナルを示した（図３e）。

〔実施例１０〕 ヒト心臓弁膜の病的な血管新生における、ChM-IとVEGF-Aの発現の解析
剖検または外科標本の免疫染色を、ヘマトキシリン-エオジン（HE）染色およびアザン染色と共に用いて、心臓弁膜症（VHD）患者の心臓弁膜におけるChM-IおよびVEGF-Aの発現プロフィールを決定した（図４）。VHDを有しない患者の心臓弁膜には血管は存在しなかった。正常な弁膜において、ChM-Iは、線維層、海綿層、心室層に検出されて、内皮層には存在しなかったが、VEGF-Aは、全ての細胞層に存在しなかった。比較すると、感染性心内膜炎（IE）、リウマチ性心疾患（RHD）、およびアテローム性動脈硬化症患者の心臓弁膜には、多数の血管が認められた。ApoE^-/-マウスからの知見と一致して、ChM-Iは、VEGF-Aを強く発現した新しい血管形成領域において顕著にダウンレギュレートされた。この発現プロフィールは、大動脈弁輪拡張症患者、僧帽弁腱策破裂患者の心臓弁膜では認められなかった（表１）。

これらの知見は、疾患を有する心臓弁膜における血管新生の発生および硬変変化が、ChM-Iの発現に直接関連することを明らかに示している。

〔実施例１１〕 弁間質細胞由来ChM-Iの、インビボでヒト冠動脈内皮細胞の管腔形成および遊走の抑制及びアポトーシス誘導の解析
（アセチル-LDL処置）
ChM-Iが弁間質細胞によって産生されるか否か、およびVIC-由来ChM-Iがインビトロでヒト冠動脈内皮細胞（HCAECs）の増殖および管腔形態形成に影響を及ぼしうるか否かを調べた。
ラット初代培養心臓弁膜および弁間質細胞の外植片培養物を作製した。弁間質細胞またはヒト冠動脈血管内皮細胞を、DiI（モレキュラープローブス、ユージーン）によって標識した10μg/mlアセチル化アポタンパク質（Ac-LDL）によって37℃で1時間処置した。ニコンDiaphot顕微鏡（励起554 nm、放射571 nm）の下で蛍光細胞を観察した。

結果を図５a〜fに示す。外植片細胞は、3日後の弁間質細胞の特徴である丸石および紡錘型の細胞の不均一な集団であった（Zacks, S. et al. Characterization of Cobblestone mitral valve interstitial cells. Arch Pathol Lab Med 115, 774-9 (1991)）。7日後、双方の細胞タイプはより線維芽細胞様となり、より伸長した形となり、既知のとおりにコンフルエンス後に直交する過増殖パターンを形成する（Lester W, R.A., Granton B, et al. Porcine mitral valve interstitial cells in culture. Lab Invest, 710-719 (1988)）。細胞は、アセチルLDL-DiI結合体に関して陰性であることが判明し、外表面に内皮細胞層を有する弁間質細胞からなる心臓弁膜と一致した。免疫染色により、弁間質細胞の細胞質においてChM-Iが発現されていること、および陰性対照NIH3T3細胞にはChM-Iが存在しないことが示された。

（管腔形成アッセイ）
24ウェル培養プレート（コスター（Costar）、コーニング（Corning）、ニューヨーク）を増殖因子を添加したマトリゲル（0.4 ml；ベクトンディッキンソンラブウェア（Becton Dickinson Labware）、ベッドフォード、マサチューセッツ州）によってコーティングして、37℃で30分間インキュベートした。4時間飢餓状態のヒト冠動脈血管内皮細胞をトリプシン-EDTAによって処理して、培養培地に20分間浮遊させた。細胞を、弁間質細胞またはNIH3T3細胞のCMの存在下または非存在下において、重合化マトリゲルにおいて10000個／ウェルの密度で播種して、既に記述されているように（Oshima, Y et al. Expression and localization of tenomodulin, a transmembrane type chondromodulin-I-related angiogenesis inhibitor, in mouse eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci 44, 1814-23 (2003)）管腔形成アッセイを行った。37℃で6時間インキュベートした後、位相差光学顕微鏡（カールツァイス）において写真を撮影した。ヒト冠動脈血管内皮細胞の毛細管様形態形成を定量的に評価するために、画像処理および分析ソフトウェア（シオン画像コンピュータープログラム、メリーランド州ベセスダの米国国立衛生研究所の公式ドメインにおいて入手可能）を用いて、視野あたりの管様構造の全長を測定した。各実験を5回行った。

その結果、ヒト冠動脈血管内皮細胞は、既に報告されているように（Oshima, Y et al. Expression and localization of tenomodulin, a transmembrane type chondromodulin-I-related angiogenesis inhibitor, in mouse eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci 44, 1814-23 (2003)）、6時間後にマトリゲル上で毛細管様の管構造を形成した（図５g）。毛細管様の構造は、弁間質細胞条件培地（CM）（図５i）によってヒト冠動脈血管内皮細胞を処置した後では、対照細胞（図５g）またはCM処置NIH3T3細胞（図５h）と比較して顕著ではなくなった。

（RNA干渉）
ラットchm-I（chm-I-siRNA、5'-AACCUCCUGGCAGUAGAUGUA-3'／配列番号：１０）またはGL3ルシフェラーゼ（GL3-luc-siRNA、5'-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3'／配列番号：１１）に対する小さい干渉RNA（siRNA）二本鎖を、オリゴフェクタミン（インビトロジェン（Invitrogen））を用いて90％コンフルエンスまで増殖させた弁間質細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、細胞からの条件培地を実験に用いた。

弁間質細胞をchm-I特異的なsiRNAによって処置すると、chm-I転写物のレベルは有意に減少した（データ示さず）。siRNA処置弁間質細胞からのCMと共に培養したヒト冠動脈血管内皮細胞は、毛細管様構造の形成能を再度獲得した（図５j）。毛細管様構造の全長は、scion画像コンピュータープログラムを用いて評価した（図５k）。

（遊走アッセイ）
浸潤アッセイは、既知の方法で（Porter, K.E. et al. Simvastatin inhibits human saphenous vein neointima formation via inhibition of smooth muscle cell proliferation and migration. J Vasc Surg 36, 150-7 (2002)）、24ウェルプレートに孔径8μmのフィルター挿入物を有する改変ボイデンチャンバー（ベクトンディッキンソンラブウェア、フランクリンレークス、ニュージャージー州）において行った。すなわち、rhVEGF-AをEBM2に20 ng/mlで溶解して、ボイデン装置の下室に入れた。NIH3T3または弁間質細胞（1×10⁵個/ウェル）を下室に加えて48時間後にヒト冠動脈血管内皮細胞（5×10⁴個/ウェル）を上室に播種した。16時間インキュベートした後、フィルターの上面に結合したまま残っている細胞を綿棒の先端で採取して、フィルターの下面に存在する細胞を光学顕微鏡を用いて計数した。アッセイを5回行い、結果を平均した。

その結果、改変ボイデンチャンバーを用いることによって、ChM-Iがヒト冠動脈血管内皮細胞の遊走能も阻害することが明らかとなった。弁間質細胞と同時培養したヒト冠動脈血管内皮細胞は、NIH3T3細胞と比較して膜の下面への移動能を喪失した（図５lm）。弁間質細胞をchm-Iに特異的なsiRNAによって処置すると、ヒト冠動脈血管内皮細胞の遊走能は部分的に回復した（図５o）。これらの結果は、ChM-Iが心臓弁膜における化学遊走物質阻害剤として重要な役割を有することを示唆している。

（アネキシンV-FITC／ヨウ化プロピジウムアッセイ）
弁間質細胞培養上清で処置後のヒト冠動脈血管内皮細胞の形態変化は、一部アポトーシスが関与していることを示唆している。ChM-Iがアポトーシスを誘導する可能性を調べるために、アネキシンV／ヨウ化プロピジウムアッセイ（バイオビジョンインク、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を用いてヒト冠動脈血管内皮細胞におけるアポトーシスに及ぼす弁間質細胞からのCMの影響を決定した。処置後、細胞をアネキシンV-FITCによって標識して、無作為に選択した視野6個を、ニコンDiaphot顕微鏡（励起488 nm、放射530 nm）を用いて蛍光細胞に関して計数した。

結果、アネキシンV-FITCに関する染色が陽性であれば、アポトーシスの誘導を示し（図５rt）、蛍光細胞はヨウ化プロピジウム陽性（初期アポトーシス標識パターン）および陰性（後期アポトーシス標識パターン）の双方であった。NIH3T3細胞からのCMによって処置したヒト冠動脈血管内皮細胞は、アネキシンV-FITC陰性であった（図５qr）。アネキシンV-FITC陽性蛍光細胞を高倍率で計数した（図５u）。これらの知見は、VICs-由来ChM-Iが内皮の浸潤および血管の形成から心臓弁膜を保護することを示唆している。

（統計分析）
値は平均値±SEMで表す。二つの平均値を比較する場合、統計学的有意性は、対応のないスチューデントt-検定を用いて評価した。三つより多い群のあいだの多数の比較は、ANOVAを用いて行った。p＜0.05の値は有意であると見なされた。

〔実施例１２〕 chm-I遺伝子の破壊による心臓弁膜におけるVEGF-A発現、血管新生、肥厚、および石灰化の誘導
インビボでのChM-Iの機能を解明するために、chm-I^-/-マウスの心臓弁膜を調べた。8週齢では、chm-I^-/-と野生型マウスとのあいだに組織学的な差を認めなかった。老齢になると（90.2±7.4週齢）、chm-I^+/+マウスの心臓弁膜は、年齢をマッチさせた野生型マウスの場合より有意に肥厚し、弁間質細胞の密度はよりまばらであった（図６）。chm-I^-/-マウスの心臓弁膜は、病的状態（ChM-I陰性およびVEGF-A陽性）に一致するChM-IおよびVEGF-A発現パターンを示し、新規の毛細管様構造が存在した。毛細管様構造を形成する細胞は、それらが抗vWF抗体陽性であったことから内皮細胞であった。chm-I^-/-マウスの心臓弁膜におけるカルシウム沈着は、フォンコッサ染色（データ示さず）によって検出し、炎症細胞の存在は、MAC-1陽性染色によって確認した。新しい血管形成および炎症細胞の浸潤は、加齢chm-I^-/-マウスの心臓弁膜における硬化プロセスを示している。年齢をマッチさせた野生型マウスはこれらの特徴を示さなかった。HE染色ならびにVEGF-Aおよびv-WFに関する免疫染色から、年齢をマッチさせたchm-I^+/+マウスの心臓弁膜では血管が非常に少ないことが示された。大動脈弁の三つの小葉における毛細管構造を、HE染色後20μm毎の切片に関して計数した。chm-I^-/-マウス（n＝7）における毛細管の数は、chm-I^+/+マウス（n＝7）より16.7倍多かった。

〔実施例１３〕 心エコー法によって検出されたchm-I^-/-マウスにおける初期相大動脈狭窄の発生
経胸部心エコー法を、10-MHz直線アレイ変換器を備えたSonos 1000心エコー装置（ヒューレットパッカード（Hewlett-Packard））によって実施した。心臓は、大動脈弁レベルでの長軸および短軸方向の視野において二次元（2D）およびカラードップラーモードで撮像した。

心エコー法により、わずかな音響陰影と共に振幅する明るいエコー源性大動脈弁が明らかとなり、心臓弁膜内の肥厚または石灰化を示唆した（図７）。カラードップラー試験は、AVに対して遠位のモザイク状の乱れた噴流を示した。chm-I^+/+マウスの心臓には、エコー源性の物体または乱れた噴流を認めなかった。chm-I^+/+およびchm-I^-/-マウスのあいだでは、左心室の直径、左心室壁の厚み、僧帽弁（MV）の明度、またはMV領域の乱流に有意差を認めなかった。

心疾患の臨床での重要性およびこの分野における集中的な病理分析にも関わらず、心臓弁膜の変性の基礎となるメカニズムに関してはこれまでのところほとんど分かっていなかった。本発明者らは、心臓弁膜における無血管性の維持により心臓弁膜症を防ぐ働きを有する抗血管新生因子のChM-Iについて、その作用機序を証明することに成功した。

具体的には、本発明者らによって以下の知見が示された。
（i）ChM-Iは、E9.5での房室間隆起および心臓流出路、E10.0での心室筋、および後期胚形成から成体までの心臓弁膜において、組織特異的に発現する；
（ii）ApoE^-/-マウス、ならびに感染性心膜炎、リウマチ性心臓弁膜症、およびアテローム性動脈硬化症患者では、ChM-I発現は顕著に減少したが、VEGF-A発現は増強する；
（iii）VICsによって分泌されたChM-Iは、インビトロでのヒト冠動脈血管内皮細胞による血管新生の抑制に重要な役割を有する；
（iv）心臓弁膜症を示す毛細管様構造および炎症細胞の数は、加齢chm-I^-/-マウスで増強する；
（v）加齢chm-I^-/-マウスの経胸部領域の心エコー分析によって、大動脈弁の肥厚および石灰化ならびに大動脈弁からの乱流が示され、大動脈弁狭窄における初期変化が示唆される、等。

ChM-Iは、ヒト（Hiraki, Y. et al. Eur J Biochem 260, 869-78 1999）、ウサギ（Shukunami, C. & Hiraki, Y. Biochem Biophys Res Commun 249, 885-90 1998.）、マウス（Shukunami, C. et al. Int J Dev Biol 43, 39-49 1999）、ニワトリ（Shukunami, C. et al. FEBS Lett 456, 165-70 1999. Dietz, U.H. et al. Dev. Dyn. 216, 233-43 1999）、ウシ（Hiraki, Y. et al. Biochem Biophys Res Commun 175, 971-977 1991）、およびゼブラフィッシュ（Sachdev, S.W. et al. Mech Dev 105, 157-62 2001）を含む様々な種の軟骨、眼、および胸腺にて発現している。本願によって、正常および病的状態の心臓弁膜におけるChM-Iの発現について調べ、それによって正常な心臓弁膜では一生を通してChM-I発現が持続するが、疾患を有する心臓弁膜では発現が持続しないことが判明した。この知見は、ChM-Iが心臓弁膜機能の維持に重要な役割を有することを強く示唆するものである。

Faribaは、コラーゲンXVIII型の内部断片に由来する抗血管新生因子であるエンドスタチンの発現が、病的状態では大動脈弁において増強されるが正常な状態では増強されないことを報告した（Chalajour, F. et al. Exp. Cell Res. 298, 455-64 2004）。本願は、血管新生を抑制する生理的条件で心臓弁膜において発現された抗血管新生因子に関する最初の報告である。心臓弁膜は、動的な小室ポンプにおける流動調節組織であることから、それらは機械的ストレスおよび弁膜の外層に存在する内皮細胞層の損傷を受ける。

本発明者らによって、ChM-Iが機械的損傷に起因する炎症および脈管形成から心臓弁膜を保護する因子として同定されたことは、非常に有益なことである。ChM-Iが心臓弁膜症に対する保護因子として機能するという仮説を確認するために、本発明者らは、疾患状態、インビトロモデル、およびインビボ心臓弁膜症モデルとしてのchm-I^-/-マウスの心臓弁膜におけるChM-I発現プロフィールの分析を行った。本発明者らは、ChM-I発現が疾患弁膜では劇的にダウンレギュレートしたが、これと対照的にVEGF-Aは顕著にアップレギュレートすることを示した。ChM-IおよびVEGF-Aに関するこの発現パターンは、いくつかのメカニズムによって説明することができる。

第一に、上流のシグナルは血管新生および抗血管新生因子のあいだの遺伝子スイッチを制御する可能性がある。このメカニズムを支持して、Takedaは、cbfa1^-/-マウスについて、軟骨における軟骨内骨化を媒介する重要な転写因子であるCbfa1が、軟骨細胞における血管新生刺激（VEGF-Aのアップレギュレーション）と血管新生の抑制（ChM-Iのダウンレギュレーション）のあいだで協調して発現変化が誘導されることを示した（Takeda, S. et al. Genes Dev. 15, 467-81 2001）。Cbfa1発現は、Rajamannanによって、アテローム性動脈硬化症の大動脈弁においてアップレギュレートされることが示された（Akiyama, H. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 6502-7 2004）。疾患を有する弁でアップレギュレートしたCbfa1が、ChM-IおよびVEGF-Aの発現を誘導する可能性はある。

第二に、リウマチ熱または感染性心内膜炎における心臓弁膜の急性炎症、高血圧症における二尖大動脈弁のような弁膜に対する過度の機械的ストレス、およびアテローム性動脈硬化症において認められる慢性炎症は、弁間質細胞の喪失を誘導する可能性がある。弁間質細胞の減少によって、疾患を有する弁膜によって産生されるChM-Iレベルが減少する可能性があり、次いで、VEGF-A発現細胞の浸潤を引き起こす可能性がある。同様に、上記の二つのメカニズムの組み合わせは、ChM-IのダウンレギュレーションおよびVEGF-A発現のアップレギュレーションを説明できる可能性がある。

心臓弁膜のウェスタンブロット分析によって25 kDaタンパク質が同定され、ChM-Iの成熟したグリコシル化分泌型が軟骨において認められた。インビトロ免疫染色実験は、心臓弁膜によって発現されたChM-Iが弁間質細胞においてマトリックスタンパク質に結合したタンパク質の成熟分泌型であることを強く示唆する。

弁間質細胞の培養上清は、インビトロでヒト冠動脈血管内皮細胞の遊走および管腔形態形成を抑制して、これらの細胞のアポトーシスを誘発した。弁間質細胞の培養上清の抗血管新生活性がChm-I特異的siRNAによって抑制されることは、ChM-Iが心臓弁膜における重要な抗血管新生因子であることを示唆している。この抗血管新生活性の不完全な抑制は、弁間質細胞が、眼において同定された因子と類似の他の抗血管新生因子を分泌している可能性を示唆している。眼では、ChM-Iの他にも、抗血管新生因子であるエンドスタチンおよびPEDF（色素上皮由来因子）が発現されている（Dawson, D.W. et al. Science 285, 245-8 1999）。

血管新生および炎症細胞の浸潤が、加齢chm-I^-/-マウスの心臓弁膜で認められた。心エコー法を用いることによって、これらのマウスに石灰化および肥厚した大動脈弁が存在することが証明された。大動脈弁に対して遠位のモザイク状の乱れた乱流が検出されたことと共に、これらの知見は、chm-I^-/-マウスが大動脈弁狭窄に関連した初期変化を示すという証拠を提供する。マクロファージの浸潤、VEGF-A陽性細胞および石灰化を含むアテローム性動脈硬化症に関連した活性の病的変化は、抗血管新生因子の保護作用が存在しない場合の通常の機械的ストレスに起因する心臓弁膜の変化を示している。

Nakamichiは、chm-I^-/-マウスが12週齢で骨塩密度の有意な増強を有することを発見し、また、本発明によって、加齢chm-I^-/-マウスにおける大動脈弁の顕著な血管新生が確認された。Dochevaは、最近、chm-Iとその相同体であるテノモジュリンの双方を欠損するマウスが、酸素誘導網膜症後の血管新生に変化を示さなかったことを報告した（Docheva, D. et al. Mol Cell Biol 25, 699-705 2005）。心臓弁膜と網膜とのこの違いは、心臓弁膜には存在しない網膜における抗血管新生因子の存在によって説明される可能性がある。若い成体ノックアウトマウスの心臓弁膜において認められた無血管性は、加齢chm-I^-/-マウスにおける血管新生が、心臓において損傷した血管が発達した結果ではなくて、年齢および炎症によって誘導された弁膜における退縮性変化によることを示唆している。

これまでの研究から、（i）血管新生因子の発現および脈管新生が心臓弁膜症（VHD）において起こること（Soini, Y. et al. Hum Pathol 34, 756-63 2003, Chalajour, F. et al. Exp Cell Res 298, 455-64 2004, Shworak, N.W. Curr Opin Cardiol 19, 140-6 2004, Mohler, E.R., 3rd et al. Circulation 103, 1522-8 2001, Mazzone, A. et al. J Am Coll Cardiol 43, 1670-6 2004）、（ii）アテローム斑の進行が血管新生に関連すること（O'Brien, K.D. et al. Circulation 93, 672-82 1996,Moulton, K.S. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 4736-41 2003）、（iii）変性心臓弁膜症の初期病変が、アテローム性動脈硬化症と何らかの類似性を有する活動型炎症プロセスであること（Mohler, E.R., 3rd et al. Circulation 103, 1522-8 2001, Otto, C.M. et al. Circulation 90, 844-53 1994, O'Brien, K.D. et al. Circulation 92, 2163-8 1995, Agmon, Y. et al. J Am Coll Cardiol 38, 827-34 2001, O'Brien, K.D. et al. Circulation 106, 2224-30 2002,Pohle, K. et al. Mayo Clin Proc 79, 1242-6 2004）、および（iv）心臓弁膜症における内皮細胞が血管新生能の有意な増加を示すこと（Chalajour, F. et al. Exp Cell Res 298, 455-64 2004）が示された。これらの知見は、心臓弁膜症における心臓弁膜の血管新生によって、硬変原性の変化が進行することを示唆している。

併せて考慮すると、本願によって得られた知見は、抗血管新生因子が、血管新生および異栄養変化の発生から心臓弁膜を保護するという機序を強くサポートするものと言える。

さらに本発明者らによって提供される人工心臓弁は、弁組織中への血管新生が抑制され、長期間の機能維持に寄与するものと考えられる。

Claims (22)

1. 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、血管新生抑制剤。
   （ａ）コンドロモジュリン-Iタンパク質
   （ｂ）コンドロモジュリン-Iタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、コンドロモジュリン-Iタンパク質と機能的に同等なタンパク質
   （ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするDNA
2. 心臓弁膜において血管新生抑制作用を有することを特徴とする、請求項１に記載の血管新生抑制剤。
3. 網膜において血管新生抑制作用を有することを特徴とする、請求項１に記載の血管新生抑制剤。
4. 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、血管新生関連疾患治療剤。
   （ａ）コンドロモジュリン-Iタンパク質
   （ｂ）コンドロモジュリン-Iタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含む、コンドロモジュリン-Iタンパク質と機能的に同等なタンパク質
   （ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のタンパク質をコードするDNA
5. コンドロモジュリン-Iタンパク質の発現活性化物質もしくは機能活性化物質を有効成分として含有する、血管新生関連疾患治療剤。
6. 血管新生関連疾患が、心臓弁膜の血管新生に起因する疾患である、請求項４または５に記載の血管新生関連疾患治療剤。
7. 血管新生関連疾患が、網膜の血管新生に起因する疾患である、請求項４または５に記載の血管新生関連疾患治療剤。
8. 血管新生関連疾患が、心臓弁膜症、感染性心内膜炎、リウマチ性心疾患、アテローム性動脈硬化症、および網膜症からなる群より選択される疾患である、請求項４または５に記載の血管新生関連疾患治療剤。
9. コンドロモジュリン-Iタンパク質が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１〜８のいずれかに記載の薬剤。
10. コンドロモジュリン-I遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする、遺伝子ノックアウト非ヒト動物。
11. 心臓の弁に異常を有することを特徴とする、請求項１０に記載の遺伝子ノックアウト非ヒト動物。
12. 血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング用である、請求項１０または１１に記載の遺伝子ノックアウト非ヒト動物。
13. コンドロモジュリン-Iタンパク質の発現もしくは機能を活性化させる化合物を選択することを特徴とする、血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング方法。
14. 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング方法。
    （ａ）コンドロモジュリン-Iタンパク質を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
    （ｂ）前記細胞におけるコンドロモジュリン-Iタンパク質の発現量を測定する工程
    （ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を上昇させる化合物を選択する工程
15. 以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング方法。
    （ａ）コンドロモジュリン-I遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
    （ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
    （ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
16. 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング方法。
    （ａ）コンドロモジュリン-Iタンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
    （ｂ）前記タンパク質の活性を測定する工程
    （ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活性を上昇させる化合物を選択する工程
17. 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング方法。
    （ａ）請求項１０〜１２のいずれかに記載の遺伝子ノックアウト非ヒト動物に被検化合物を投与する工程
    （ｂ）前記遺伝子ノックアウト非ヒト動物におけるコンドロモジュリン-Iタンパク質の発現量もしくは活性を測定する工程
    （ｃ）被検化合物を投与しない場合と比較して、コンドロモジュリン-Iタンパク質の発現量もしくは活性を上昇させる化合物を選択する工程
18. 前記非ヒト動物の心臓弁膜または眼内における前記タンパク質の発現量もしくは活性を測定することを特徴とする、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
19. 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、血管新生関連疾患治療剤のスクリーニング方法。
    （ａ）請求項１０〜１２のいずれかに記載の遺伝子ノックアウト非ヒト動物に被検化合物を投与する工程
    （ｂ）前記遺伝子ノックアウト非ヒト動物における心臓弁膜もしくは網膜を観察する工程
    （ｃ）被検化合物を投与しない場合と比較して、心臓弁膜もしくは網膜を正常化させる化合物を選択する工程
20. 血管新生関連疾患が、心臓弁膜症、感染性心内膜炎、リウマチ性心疾患、アテローム性動脈硬化症、または網膜症である、請求項１３〜１９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
21. 以下の（ａ）および（ｂ）を主要な構成成分とすることを特徴とする、人工心臓弁。
    （ａ）コンドロモジュリン-I遺伝子を発現する細胞
    （ｂ）脱細胞弁あるいは生体内溶解型高分子化合物
22. 以下の工程（ａ）〜（ｃ）によって製造される、人工心臓弁。
    （ａ）コンドロモジュリン-I遺伝子を発現する細胞を培養および増殖させる工程
    （ｂ）前記（ａ）の細胞を、脱細胞弁あるいは生体内溶解型高分子化合物の表面に播種する工程
    （ｃ）コンドロモジュリン-I遺伝子を発現する細胞が、前記（ｂ）の脱細胞弁あるいは生体内溶解型高分子化合物の有する間隙を満たすまで培養する工程

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