JP2004534742A

JP2004534742A - Ｕｎｃ−５１様キナーゼ、ｒｏｍａ１、または２ｔｍタンパク質による細胞小器官代謝の修飾

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Publication number: JP2004534742A
Application number: JP2002578480A
Authority: JP
Inventors: シュトイヤーナーゲルアルント; ブレンナーギュンター; チオゼックトーマス
Original assignee: Develogen AG
Current assignee: Develogen AG
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2002-03-27
Publication date: 2004-11-18
Also published as: EP1373518A2; US20060248601A1; WO2002079478A3; WO2002079478A2

Abstract

本発明は、脱共役タンパク質（ＵＣＰｓ）の活性に影響を及ぼし、その結果、改変ミトコンドリア活性につながり、細胞小器官、望ましくはミトコンドリアの膜安定性および（または）機能に寄与するポリペプチド（Ｕｎｃ-５１キナーゼ、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭタンパク質）を開示する。本発明は、疾患および障害の診断、試験、予防、および治療における、これらのポリペプチドの使用法に関連するものであり、その疾患および障害の例としては、限定するものではないが、代謝疾患、例えば、肥満症、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群（悪質液）、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）、ＲＯＳ産出に関連した障害などなどがあげられる。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、本明細書中でＵｎｃ−５１様キナーゼ、ミトコンドリア活性の制御因子（ＲＯＭＡ１）、およびミトコンドリアの２ＴＭタンパク質と呼ばれる、タンパク質の核酸およびアミノ酸配列に関連するものである。さらに、本発明は、脱共役タンパク質（ＵＣＰｓ）の活性に影響を及ぼし、その結果、改変ミトコンドリア活性につながるＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭタンパク質における突然変異体に関連するものである。本発明はまた、疾患および障害の診断、試験、予防、および治療におけるこれらの配列の使用法にも関連するものであり、その疾患および障害の例としては、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群（悪質液）、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）、ミトコンドリア障害、ＲＯＳ産出などがあげられる。
【０００２】
ミトコンドリアは動物細胞のエネルギー供給元である。炭水化物、脂肪などのような代謝栄養素から入手可能なほとんどのエネルギーは、ミトコンドリア内膜にプロトン勾配を生成するために用いられる。このプロトン勾配は、ＡＴＰ、細胞主要な燃料物質を産出する酵素ＡＴＰ合成酵素を推進する（Mitchell P、Science 206、1979、1148-1159）。茶色脂肪組織のミトコンドリア（ＢＡＴ）には、プロトンをミトコンドリア内膜を通してトンネルするタンパク質（脱共役タンパク質１、ＵＣＰ１）が存在する（レビュー：Klingenberg らの1999, Biochim. Biophys. Acta, 1415（2）：271-96）。プロトン勾配に保管されたエネルギーは、その結果、熱として開放され、ＡＴＰ合成には使用されない。
【０００３】
動物のエネルギー摂取が消費を超える場合、余剰エネルギーは脂肪組織に脂肪として保管される。脱共役タンパク質の活性化によってミトコンドリア内膜を通して漏出するプロトンの生成は、熱量効率を減少させるので、動物健康に有害な過剰体脂肪（肥満）の蓄積を回避する。ヒトの場合、但し、茶色脂肪組織は成人にはほとんど非存在である。以上の点から、ＵＣＰ１は、ヒト肥満症の形成または予防において主要な因子であると考慮されなかった。最近、ヒト組織（例えば白色脂肪組織、筋肉など）に広範に発現する類似の配列（ＵＣＰ２-ＵＣＰ５）を持つ追加タンパク質の発見は、このＵＣＰファミリーのメンバーを医薬品研究の標的として重要なものとした（レビュー： Adams Nutr 2000、130（4）：711-4）。興味深いことには、Ricquier、2000、Biochem J. 345、161-179 においてレビューされたように、特に植物ＵＣＰｓＳｔＵＣＰ（ジャガイモから）およびＡｔＵＣＰ（シロイヌナズナ）のような相同体がさらに同定されている。これらのタンパク質の生体内機能は未知であるが、ＵＣＰ活性に影響を及ぼす可能性は、肥満症および関連疾患の治療または予防に対する療法として考慮できるものであろう。
【０００４】
ミトコンドリアはエネルギー変換において非常に特殊な機能を有し、当該機能はその形態構造、すなわち特有の細胞膜に反映されている。この細胞膜は電子伝達プロセスに対する枠組みを提供するばかりでなく、高度に特殊な酵素が限局されている各細胞小器官において大きな細胞内区画を作成する。以上の点から、ミトコンドリアのエネルギー代謝とこれらの細胞小器官の生化学的／生物物理学的な性質との間には強力な関連性が存在する。
【０００５】
本発明の根底にある技術的問題は、ミトコンドリアの生物学的／生化学的活性を調節するための手段／方法を提供することであり、それによって、ＡＴＰレベル、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比、および（または）スーパーオキシド産出を調節するため、エネルギー消費、体温度、熱産生、過剰な基質の供給または、欠乏した基質の供給に対する細胞代謝に影響する原核細胞の代謝条件を調節することである。この技術的問題に対する解決は、請求項において特徴づけられた実施例を提供することによって達成する。
【０００６】
補足実施例に示したように、本発明は、ｄＵＣＰｙ活性によって誘発された眼欠陥を抑制または促進する遺伝子を開示する。これらの遺伝子は、Ｕｎｃ−５１（エンハンサー）、ＲＯＭＡ１（ミトコンドリア活性の制御因子）（抑制因子）およびミトコンドリアの２ＴＭタンパク質（抑制因子）のショウジョウバエ相同体である。Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１における突然変異体、および（または）原核生物における２ＴＭは、脱共役タンパク質（ＵＣＰｓ）の活性に影響を及ぼし、その結果、改変ミトコンドリア活性につながることが構想される。
【０００７】
Ｕｎｃ−５１は当初、軸索伸長およびガイダンスに必要な遺伝子として線虫において発見された（Ogura らの1994, Genes Dev 8：2389-2499； Ogura らの1997, Genes Dev 11： 1801-1811）。Ｕｎｃ５１のマウス相同体（Ｕｎｃ−５１キナーゼ１に対してＵｌｋ-１と称する）は、線虫Ｕｎｃ−５１遺伝子に対する配列相同性に基づいて同定されている（Yan らの1998、Biochem Biophys Res Commun 246： 222-227）。後には、第二のマウスＵＮＣ-５１様キナーゼが発見され、Ｕｌｋ-２と称された（Yan らの1999、Oncogene 18：5850-5859）。ヒトＵｌｋ-１も同様に配列相同性に基づいてクローニングされた（Kuroyanagi らの1998、Genomics 51：76-85）。ヒト遺伝子が偏在的に発現されるのに対して、線虫遺伝子は神経細胞において特異的に発現される。ヒトＵｌｋ-２遺伝子は文献で報告されていない。但し、その存在はジーンバンクのデータベースエントリから演繹することができる。配列特徴は、Ｕｎｃ−５１様遺伝子が、真核生物間に構造的に保存されるタンパク質キナーゼのサブファミリ（亜科）を形成することを示唆する（Yan らの1998、Biochem Biophys Res Commun 246： 222-227）。線虫遺伝子以外には、高等真核生物におけるＵｎｃ−５１様遺伝子の機能は知られていない。
【０００８】
プロヒビティン（prohibitins）は、アポトーシス、ミトコンドリア呼吸鎖、呼吸酵素、および老化（agin）の集合を含んだ、細胞プロセッシングで役割を果たす細胞周期調節、偏在的に豊富であり進化的かつ積極的に保存されるタンパク質である（Coates らのExp Cell Res. 2001, 265：262-73）。ショウジョウバエＲＯＭＡ１のマウス相同体ＢＡＰ３７（同義語はＰｈｂ２ｐ、プロヒビティン２）は、ＩｇＭ抗原受容体の相互作用子として同定されており（Terashima らのEMBO J. 1994 Aug 15；13（16）：3782-92）；ヒトＢＡＰ-３７（同義語ＲＥＡ）は、エストロゲン受容体相互作用子として同定されている（Montano らの1999. Proc Natl Acad SciU S A. 96（12）：6947-52）。ＢＡＰ３７（プロヒビティン１；ＲＥＡ）およびプロヒビティン（プロヒビティン１）は、互いに相互作用して、ミトコンドリア内膜において複合体を形成する（Coates らの1997、Curr. BioI.；7（8）：607-10 を参照）。酵母菌相同体Ｐｈｂ１ｐおよびＰｈｂ２ｐは、ミトコンドリア内膜においてミトコンドリアの翻訳産生物を安定化するシャペロンとしての役割を果たす（Nijtmans らの2000、EMBO J.；19（11）：2444-51）。
【０００９】
ショウジョウバエの２ＴＭ遺伝子は、脊椎動物において相同体を保存している（図7を参照）。本発明に示したように、ショウジョウバエ、マウス、およびヒトの２ＴＭ遺伝子の配列分析は、２ＴＭ遺伝子によってコードされたタンパク質が２つの膜貫通ドメインを有することを予測する（図８を参照）。
【００１０】
たとえいくつかの、レプチン、ＶＣＰＩ、ＶＣＰＬ、またはペルオキシソーム増殖活性の受容体ガンマ活性化補助因子のような、体重／重量を調節する恒常性システムに影響を及ぼすはずの候補遺伝子が記述されているとしても、肥満調節または重／重量調節に影響を及ぼす、特有の分子機構および（または）分子は、知られていない。
【００１１】
以上の点から、本発明の根底にある技術的問題は、体重調節および（または）エネルギー恒常性回路に影響を及ぼす（病理学的な）代謝条件の調節のための手段と方法を提供することであった。当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴づけられた実施例を提供することによって達成することができる。
【００１２】
従って、本発明は、体重調節における新規機能をともなう遺伝子、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症に関連するものである。本発明は、体重、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症、およびそれに関連した障害、例えば摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、癌、例えば生殖器官の癌、睡眠時無呼吸、ＲＯＳ産出に関与する障害、ミトコンドリア障害、および神経変性疾患のような障害の調節に関与する特定の遺伝子を開示する。
【００１３】
とりわけ、本発明ではヒトＵｎｃ５１キナーゼ、ＲＯＭＡ１、および（または）ミトコンドリアの２ＴＭ遺伝子が上述した条件に関与するものとして記載されている。これまでは、Ｕｎｃ５１キナーゼ、ＲＯＭＡ１、および（または）ミトコンドリアの２ＴＭおよび相同性ヒトタンパク質がエネルギー恒常性および体重調節および関連障害の調節に関与することは記載されておらず、従って上記のような代謝疾患およびその他の疾患における機能は記述されていない。本発明において、Ｕｎｃ５１キナーゼ、ＲＯＭＡ１、および（または）ミトコンドリアの２ＴＭの正しい遺伝子投与量がエネルギー恒常性の維持にとって必須であることを実証する。遺伝子学的スクリーニングを用いて、Ｕｎｃ５１キナーゼ、ＲＯＭＡ１、および（または）ミトコンドリアの２ＴＭ相同性遺伝子の突然変異が肥満症の原因となることを同定した。
【００１４】
さらに、本発明は、細胞小器官、具体的にはミトコンドリアにおける膜安定性および（または）機能に寄与するＵｎｃ５１様キナーゼタンパク質、ＲＯＭＡ１タンパク質、および（または）ミトコンドリアの２ＴＭタンパク質と呼ばれるタンパク質に関連するものである。本発明はまた、脱共役タンパク質（ＵＣＰｓ）の活性に影響を及ぼし、その結果、改変ミトコンドリア活性につながるＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭにおける突然変異体に関連するものである。本発明はまた、疾患および障害の診断、試験、予防、および治療における、これらのポリペプチドの使用法に関連するものであり、その疾患および障害の例としては、限定するものではないが、代謝疾患、例えば、肥満症、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群（悪質液）、ミトコンドリアの障害、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）、ＲＯＳ産出障害、神経変性疾病などがあげられる。
【００１５】
本発明は、細胞小器官、具体的にはミトコンドリアにおける細胞小器官の膜安定性および（または）機能に寄与するポリペプチドをコードする核酸分子に関連するものであり、当該核酸分子が下記の場合とする。（ａ）本明細書に定義の条件下で、本明細書に開示したアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補鎖にハイブリタイズする場合；（ｂ）本明細書に定義の条件下で、本明細書に開示した核酸分子の相補鎖にハイブリタイズする場合；（ｃ）（ａ）の核酸分子に対して縮重する場合；（ｄ）少なくとも８５％、望ましくは少なくとも９０％、より望ましくは少なくとも９５％、より望ましくは少なくとも９８％および最大で９９，６％が本明細書中で開示したアミノ酸配列に同一であり、細胞小器官の膜安定性および（または）の機能に寄与するポリヌクレオチドを表すポリペプチドをコードする場合；（ｅ）突然変異のために（ａ）〜（ｅ）の核酸分子と異なり、ここにおいて当該突然変異がコードされたポリペプチドにおいて改変、除去、複製または早期停止の原因となる場合；または（ｆ）本明細書中で描写した配列を有する場合。さらに、本発明は当該核酸分子から成るベクターを提供するほかに、当該ベクターで形質転換された宿主も提供する。本発明はまた、当該核酸分子によってコードされたポリペプチドおよび抗体、断片またはその誘導体、またはアプタマー、または核酸分子を特異的に認識する他の受容体、または本発明のポリペプチドに関連するものである。本発明には、核酸分子、ベクター、宿主、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、断片またはその誘導体、またはアプタマー、またはその他の受容体、または本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物も記載されている。望ましくはこれらの組成物は、診断用または医薬組成物である。さらに本発明は、動物または植物における細胞代謝に関与するポリペプチドまたは物質、または恒常性を修飾する能力を持つポリペプチドまたは物質、および哺乳動物の体重調節に関与するポリペプチドを同定する方法を提供する。本発明はまた、本発明の核酸分子またはポリペプチドの発現に影響を及ぼす化合物を同定する方法に関連するものである。加えて、本発明の１つ以上の化合物の発現の影響を評価する方法を開示した。最終的に本発明は、本発明による（ポリ）ペプチドの阻害剤および（または）刺激剤から成る組成物を提供し、それは本発明による化合物から成るキットを提供する。
【００１６】
本発明は、細胞小器官、望ましくはミトコンドリアの膜安定性および（または）機能に寄与するタンパク質（Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭと呼ばれる）の同定に基づいている。発明者らは、Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭにおける突然変異体が脱共役タンパク質（ＵＣＰｓ）の活性に影響を及ぼし、その結果、改変ミトコンドリア活性につながることを発見した。それ故に、これらの配列は、例えば、限定するものではないが、肥満症のような代謝疾患、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群（悪質液）、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）、ミトコンドリア障害、高コレステロール血症、異脂肪血症、冠動脈心疾患、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸、ＲＯＳ産出に関連した障害などの疾患および障害の診断、試験、予防、および治療において使用することが可能である。
【００１７】
従って、本発明は、細胞小器官、例えばミトコンドリアの膜安定性および（または）機能に寄与するポリペプチドをコードする核酸分子に関連するものであり、ここでの当該核酸分子は下記の場合とする。
（ａ）６５℃または６６℃にて０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶液において、本発明に記載されたタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補鎖にハイブリタイズする場合；
（ｂ）（ａ）の核酸分子に対して縮重する場合；
（ｃ）少なくとも３５％、望ましくは少なくとも５０％、より望ましくは少なくとも６０％、より望ましくは少なくとも７０％、より望ましくは少なくとも８０％、より望ましくは少なくとも９０％、最も望ましくは少なくとも９５％および最も望ましくは少なくとも９９％が本発明のタンパク質のアミノ酸配列と同一のポリペプチドをコードする場合；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の核酸分子と異なり、当該突然変異体がコードされたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止の原因となるような突然変異による核酸分子。
【００１８】
補足実施例に記録したように、本発明は細胞小器官の膜安定性および（または）機能に直接的または間接的に関与する遺伝子および遺伝子産物、具体的にはミトコンドリアを提供する。
【００１９】
本明細書に使用する用語「膜安定性」には、全体の安定性のみならず、細胞小器官の細胞膜上の局所安定性、例えば、特に内膜の内側および外側の安定性も含まれる。用語「膜安定性」は以上の点から、タンパク質・タンパク質相互作用によって提供されるほかに、所定の膜成分につながるタンパク質−脂質相互作用によっても提供される細胞膜の構造上機能に関連する。
【００２０】
上記で使用した「細胞小器官の膜機能に寄与する」という表現は、特に、輸送機能（イオン、代謝産物、ビタミンなどの能動および受動輸送など）、その他の膜タンパク質の制御因子機能（輸送体、担体など）またはその他（膜）のタンパク質（増強／抑制因子機能など）の修飾因子機能、および（または）以下に定義したその他の機能を含んだ、上記に定義したポリペプチド機能に関連するものである。
【００２１】
本明細書で使用した「細胞小器官」という表現は、ミトコンドリアのみに関連するばかりでなく、例えば、限定するものではないが、ペルオキシソームまたは植物細胞の細胞小器官（例：葉緑体）などの細胞小器官にも関連するものである。
【００２２】
本発明の文脈において使用した「ハイブリタイズする」および「ハイブリタイズ」という用語は、特に上記に定義したように、望ましくはストリンジェントな条件、例えば０．２ｘＳＳＣ０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、６５℃または６６℃などの条件に関連するものである。当該条件にはハイブリダイゼーション条件のほかに、洗浄条件もまた含まれる。但し、洗浄条件はハイブリダイゼーション条件に比べてよりストリンジェントであることが望ましい。ハイブリダイゼーション条件を設定することによって、当業者は厳密に相補的な配列、または高度または低度の相同性を有する配列が検出されるかどうかを決定することができる。条件の設定は当業者の能力範囲内で行なうものとし、例えば Sambrook、 Molecular Cloning、 A Laboratory Manual、 2nd edition （1989）、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor、 NY に記載されたプロトコルに従って決定するものとする。相同性の検出に対してあまり厳しくないハイブリダイゼーション条件、および正確には相補的でない配列は、６ｘＳＳＣ１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、６５℃または６６℃に設定することが可能である。
【００２３】
本発明の核酸分子にハイブリダイズする分子には、（ポリ）ペプチドをコードする上述の核酸分子の断片、誘導体および対立遺伝子変異体も含まれ、本発明に記載する肥満症を調節し、その原因となり、または寄与する。この点で、断片は当該（ポリ）ペプチドをコードするために十分に長い核酸分子の部分として定義する。用語「誘導体」は、これらのハイブリダイズする分子の配列が上述の核酸分子の配列と１つ以上の位置で異なること、およびこれらの配列に対して高度な相同性を示すことを意味する。当業者は、コンピュータプログラムおよびパッケージを用いて相同性値を決定することが可能である。一般にヌクレオチドまたはアミノ酸配列の同一性／相同性は、ＢＬＡＳＴＩＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＮＡＬＩＧＮ、ＰＡＬＩＧＮのような公知のコンピュータプログラム、または２つのセグメント間の相同性の最高のセグメントを見出すために特定のアルゴリズムを使用するｂｌ２ｓｅｑを使用することによって従来通りに決定することができる。
【００２４】
補足実施例に示したように、本発明の文脈におけるアミノ酸レベルでの同一率の比較分析は、望ましくはＮＣＢＩからの「ｂＩ２ｓｅｑ」プログラムを用いて取得することができ、その際に使用するパラメータは、ギャップ開始コスト：１１およびギャップ継続コスト：１とする。但し、そのプログラムは当該値に対して任意の正の整数を許容するものとする。
【００２５】
相同性とは、機能上および（または）構造上の同等性がそれぞれの核酸分子間、またはそれらがコードするタンパク質間に存在することを意味する。上述の分子に対して相同であり、これらの分子の誘導体を表す核酸分子は、一般に同一の生物学的機能を発揮する修飾を形成する分子の誘導体である。これらの変異は天然の変異であり得、例としては他の生物体に由来する配列、または自然に出現した突然変異体、または特定の変異誘発手段によって導入された突然変異体が挙げられる。さらに変異は合成的に産生された配列でもあり得る。対立遺伝子変異体は天然に発生したものであっても、合成的に産生された変異体または組換えＤＮＡ技術によって産生された変異体であってもよい。
【００２６】
本発明の核酸分子は、少なくとも８５％および最大で９９，６％が本発明のタンパク質のアミノ酸配列に同一の細胞小器官の膜安定性および（または）機能に寄与し、驚いたことに細胞小器官の膜機能および（または）安定性に関与することがわかっており、および具体的にはＵＣＰｓを修飾する能力を有することがわかっているタンパク質を表すポリペプチドをコードすることが望ましい。補足実施例も参照すること。補足実施例において実証したように、本明細書に記載のポリペプチド（およびコード化核酸分子）は、キイロショウジョウバエ遺伝子ｄＵＣＰｙの過剰発現が原因で生じたショウジョウバエにおける特定の眼の形質を修飾、例えば抑制、または促進することができた。ショウジョウバエの複眼におけるｄＵＣＰ（ヒトＵＣＰｓに対する相同性を有する）の過剰発現は、遺伝的「修飾因子スクリーニング」の「読み取り」として使用できる、明らかに可視的な眼欠陥（補足実施例および図を参照）をもたらした。
【００２７】
当該「修飾因子スクリーニング」においては、その眼中発現を修飾するために、数千の異なる遺伝子を変異誘発さしめる。変異誘発された遺伝子の１つがｄＵＣＰｙと相互に影響し、その活性を修飾する場合には、眼欠陥の促進または抑制が発生するであろう。そのようなハエは識別が容易なので、選択して相互作用する遺伝子を単離することができる。
【００２８】
補足実施例に示したように、ｄＵＣＰｙ活性によって誘発された眼欠陥を抑制または促進するいくつかの遺伝子を同定した。ショウジョウバエ遺伝子の配列を用いて、公共データベース（例えばNational Institutes of Health （NIH）のNational Center for Biotechnology Information （NCBI））で哺乳動物相同体のＢＬＡＳＴ検索を行った。
【００２９】
Ｕｎｃ−５１様遺伝子のショウジョウバエ、マウス、およびヒトとの間の配列類似性を表１に示す（タンパク質配列のアライメントは図２に示す）：
表１：本発明のＵｎｃ−５１様遺伝子およびタンパク質
表１Ａ：本発明のＵｎｃ−５１様遺伝子およびタンパク質のＧｅｎｂａｎｋ（ＮＣＢＩ）アクセッション番号
【００３０】
【表１】

【００３１】
表１Ｂ：Ｕｎｃ−５１様とタンパク質間との間の類似性および同一性
【００３２】
【表２】

【００３３】
別の修飾遺伝子はミトコンドリア活性１制御因子（ＲＯＭＡ１）と称する。ショウジョウバエ遺伝子の配列を用いて、公共データベース（National Institutes of Health （NIH）のNational Center for Biotechnology Information（NCBI））で哺乳動物相同体のＢＬＡＳＴ検索を行った。ＲＯＭＡ１のヒト相同体は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００６６３９．１（同一性＝１８９／２６１（７２％）、ポジティブ＝２３６／２６１（９０％）の下に「Ｂ細胞関連タンパク質」（ＢＡＰ）として注釈される；特許申請ＷＯ０１／３６６７４で開示されたＢＡＰ１のアクセッション番号ＡＸ１４６８９１も参照）。マウス相同体は、アクセッション番号ＮＰ＿０３１５５７．１（同一性＝１８５／２６０（７１％）、ポジティブ＝２３１／２６０（８８％））、図５を参照）の下に入手可能である。
【００３４】
別の修飾遺伝子は２ＴＭと称する。２ＴＭ遺伝子のショウジョウバエ、マウスおよびヒトとの間の配列類似性を下記の表２に示す（タンパク質配列のアライメントは図７に示す）：
表２異なる種の２ＴＭ遺伝子およびタンパク質
表２Ａ：本発明の２ＴＭ遺伝子およびタンパク質のＧｅｎｂａｎｋ（ＮＣＢＩ）アクセッション番号
キイロショウジョウバエ：ＧａｄＦｌｙアクセッション番号ＣＧ７６２０（ショウジョウバエゲノムプロジェクト、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＦ４５４８９４
マウス：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ２６１２４
ヒト（図７も参照）：
染色体１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿０５７６５９；配列識別番号６；図７Ａ）。遺伝子座からのｃＤＮＡ（アクセッション番号ＡＸ０２６５４９）はＷＯ００／４０７５２で言及されている。このドキュメントは、「癌関連遺伝子およびその産生物」に関連するものである。
【００３５】
ハイパーリンク１０番染色体タンパク質ＥｎｓＥＭＢＬヒトゲノム注釈アクセッション番号ＥＮＳＰ０００００２４２５１８遺伝子：ＥＮＳＧ０００００１２２９１４ゲノムクローン：ＡＬ３６０１７７（配列識別番号７、図７Ｂを参照）
２番染色体タンパク質ＥｎｓＥＭＢＬヒトゲノム注釈アクセッション番号ＥＮＳＰ０００００２４３７８５、遺伝子：ＥＮＳＧ０００００１２３９９８、ゲノムクローン：ＡＣ０４４８５０（を参照配列識別番号８、図７Ｃ）
１７番染色体タンパク質ＥｎｓＥＭＢＬヒトゲノム注釈アクセッション番号ＥＮＳＰ０００００２５０５９４遺伝子：ＥＮＳＧ０００００１２９６５３ゲノムクローン：ＡＣＯ１５８０２（不完全）（配列識別番号９、図７Ｄを参照）。
【００３６】
表２Ｂ：２ＴＭタンパク質のキイロショウジョウバエ（ＧａｄＦｌｙアクセッション番号ＣＧ７６２０）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ２６１２４）およびヒト配列識別番号６、配列識別番号７、配列識別番号８、配列識別番号９との間の類似性および同一性
【００３７】
【表３】

【００３８】
本明細書に記載したポリペプチド（および遺伝子）における突然変異体は、修飾および改変されたミトコンドリア活性を備え得る形質変化および（または）生理変化につながることが構想される。これは、次には、特に、改変エネルギー代謝、変異熱産生および（または）改変エネルギー恒常性につながる得る。
【００３９】
好適な実施例において、本発明の上記の核酸分子はＤＮＡである。この文脈の前後関係において、用語「核酸分子」は、コーディングおよび、適用可能な限り、非コーディング配列、例えば特に５'および３'非コーディング配列などを備えていることは当然のことながら共通認識とする。当該５'および（または）３'非コーディング領域は、転写、および随意的にはポリＡシグナルの開始を保証し、転写の終結および（または）転写物の安定化を保証する（特定の）調節配列を備え得る。追加の５'および３'非コーディング領域は、プロモーターおよび（または）転写のほかに、翻訳エンハンサーをも備え得る。さらに用語「核酸分子」は、適用する場合、イントロン変異体およびスプライス変異体を備え得る。この核酸分子は、一本鎖または二本鎖分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもあり得る。本明細書中で使用した用語ＤＮＡには、特にｃＤＮＡのほかにゲノムＤＮＡもまた包含される。さらに、本発明の核酸分子はｍＲＮＡのようなＲＮＡ分子でもあり得る。本発明に基づいた用語「核酸分子」には、核酸プローブがハイブリダイズし得る核酸誘導体も包含される。当該核酸プローブ自体は、当該核酸分子または当該誘導体に対してハイブリダイズ可能な核酸分子の誘導体であり得る。用語「核酸分子」にはさらに、アミド背骨連鎖を有するＤＮＡ類似体を含むペプチド核酸（ＰＮＡｓ）が包含される（Nielsen、Science 254 （1991）、1497-1500）。
【００４０】
このこの文脈の前後関係において、本発明の核酸分子は、当分野で公知であり市販されている、特にＡＢＩ３９４ＤＮＡ-ＲＡＮ-ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓのようなシンセサイザーを用いて化学的に合成することも可能であることが強調されなくてはならない。
【００４１】
本発明の核酸分子が細胞小器官の膜安定性および（または）機能に寄与するポリペプチドをコードし、ここでは細胞小器官において膜安定性および（または）機能に寄与する当該ポリペプチドがミトコンドリアおよび（または）ペルオキシソーム中に発現されることが望ましい。当該ポリペプチドが当該膜の維持に関与することは特に望ましい。
【００４２】
さらに、本発明の核酸分子がポリペプチドをコードし、ここでは細胞小器官において膜安定性および（または）機能に寄与する当該ポリペプチドが輸送体分子および（または）輸送体分子の制御因子であることが構想される。例えば、本発明の核酸分子によってコードされたポリペプチドが、イオン、代謝産物またはビタミンのような分子を細胞膜を横切って輸送する能力を持つ担体および（または）輸送分子を直接的または間接的に制御すること、および（または）当該ポリペプチドがそのような輸送体／担体分子であることが構想される。
【００４３】
上記に定義したように、本発明の核酸分子がポリペプチドをコードし、ここでは当該ポリペプチドが修飾ポリペプチドであることは特に望ましい。特に好適な修飾ポリペプチドは、ミトコンドリアのタンパク質の修飾因子、例えばＵＣＰファミリーメンバー修飾を備えている。
【００４４】
ＵＣＰ（脱共役タンパク質）ファミリーの当該メンバーは当分野で公知であり、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、ＵＣＰ４、ＵＣＰ５、ＳｔＵＣＰまたはＡｔＵＣＰを備えている。特に前掲のRicquier （2000）を参照。上記のミトコンドリアのタンパク質の修飾、および具体的にはＵＣＰｓのタンパク質の修飾は、当該タンパク質との直接相互作用によって、または、当該ミトコンドリアのタンパク質の機能または活性に必要な、または当該ミトコンドリアのタンパク質の活性によって生成される、イオン、代謝産物またはビタミンなどの供給／移入／搬出によって（またはこれらのプロセスの遮断によって）も生じ得る。以上の点から、当該「修飾」は輸送現象および供給現象にも関連するものである。さらに、当該「修飾」には、１つ以上のタンパク質／ポリペプチドの機能制御、望ましくはＵＣＰファミリーのメンバーの機能制御が包含される。最も好適なのは、細胞代謝、具体的にはエネルギー代謝に影響を及ぼすイベントを備えている「修飾」である。
【００４５】
本発明はまた、上記に指摘したように、本明細書に記載した核酸分子の「変異体」に関連する。この文脈の前後関係における用語「変異型」とは、これらのポリヌクレオチドのそれぞれのヌクレオチドおよびそのコードされたアミノ酸配列が、１つ以上のヌクレオチド位置において細胞小器官の膜安定性および（または）機能に寄与する上述の核酸分子および（ポリ）ペプチドの配列と異なること、および当該核酸分子に対して高度な相同性を持つことを意味する。相同性は上記の定義のとおりであることは当然のことながら共通認識とする。上記の核酸分子の配列からの逸脱は、例えばヌクレオチドの置換、除去、追加、挿入および（または）組換えの結果である。相同性は、それぞれの核酸分子またはコードされたタンパク質が機能的および（または）構造的に等価であることをさらに暗示する。上記の核酸分子に対して相同性を持つ核酸分子および当該核酸分子の誘導体である核酸分子は、例えば、同一の生物学的機能を持つ、具体的には同一または実質上同一の生物学的機能でタンパク質をコードする修飾を表す当該核酸分子の変異である。それらは、他の哺乳類または突然変異体からの配列のような天然変異であり得る。この文脈の前後関係における用語「変異体」には、特に上記に記載したように、対立遺伝子変異またはスプライス変異体がさら包含される。天然Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭタンパク質変異体またはＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ遺伝子変異体を「対立遺伝子変異体」は称され、生物体の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの交代形態の１つを参照する（Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York （1985）および最新版）。これらの対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチドおよび（または）（ポリ）ペプチドレベルのいずれかで変動する。別法として、非自然発生の変異体は、変異誘発技術または直接合成によって産生することが可能である。タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を用い変異体を生成して、本明細書に記載の特性を改良または改変することが可能である。Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭのタンパク質またはＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭの遺伝子。以上の点から、用語「対立遺伝子変異型」には、合成的に産生された変異体または遺伝子操作された変異体も包含される。本発明の核酸分子は、天然に起源するもの、合成または半合成物、または誘導体のいずれでも差し支えない。
【００４６】
上記の（ポリ）ペプチド、例えばＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭの野生型形態および変異形態および（または）その断片をコードする本発明の核酸分子には、翻訳可能な転写物、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲ法のプライマーとしての使用、または核酸の発現プロフィール作成、例えば適切に被覆されたチップ上、または診断用および（または）医薬環境における使用を含んださまざまなアプリケーションが見出されている。当業者は有用なＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）プライマーを本発明の核酸分子から演繹することができる。特に有用なプライマーは、特に補足実施例において使用したプライマーである。
【００４７】
具体的には、それらのプライマーは、Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭの遺伝子および遺伝子転写物の存在の検出において、およびＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭの相同体または構造上の類似体をコードする核酸の検出および（または）増幅において、それぞれ使用することが可能である。本明細書で開示したプローブ、材料および方法を利用すると、特にｃＤＮＡおよびゲノムライブラリの探索に対して、当業者は該当する相同体を回復できる立場となる。下記に記載のように、本発明の核酸分子は、特定の発現ベクターの一部であることが可能であり、発現およびスクリーニングのための組換え細胞、および遺伝子組換え動物における機能的研究（例えばＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭの発現に関連する疾病に対する候補薬物の有効性）に取り込むことが可能である。
【００４８】
さらに、診断において、本明細書に記載したＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ遺伝子およびＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ対立遺伝子に存在する単一ヌクレオチド遺伝子多型に関連した特定のハイブリダイゼーションプローブは、臨床試料および研究実験試料において野生型および変異体Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ対立遺伝子の同定にその用途を見出す。変異体対立遺伝子は、特に、対立遺伝子特定のオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブを、例えば高処理量臨床の診断用に生成するために使用される。治療的アプローチには、上記および下記に記載した本発明の核酸分子を用いて、本発明の細胞発現または細胞内の濃度または活性（ポリ）ペプチドの利用能を調節することが可能である。これらの核酸分子には、本発明の開示する核酸の補体を含むアンチセンス分子、すなわち一本鎖配列を包含することが可能である。
【００４９】
本発明の核酸分子は、前記の核酸分子の単独または組み合わせのいずれかを備えている、遺伝子組換え的に産生されたキメラ核酸分子であり得る。望ましくは、当該核酸分子はベクターの一部である。本発明はまた、以上の点から、本発明の核酸分子を備えているベクターに関連するものである。
【００５０】
本発明のベクターは、例えば従来の遺伝工学において使用されるプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージまたは他のベクターであることが可能であり、好適な宿主細胞中および好適な条件下での当該ベクターの選択を許容するマーカー遺伝子のような遺伝子をさらに包含することも可能である。
【００５１】
さらに本発明のベクターには、本発明の核酸配列に加えて、好適な宿主においてコーディング領域の適切な発現を許容する発現制御エレメントを備えることが可能である。そのようなアレイエレメントは当事者に公知であり、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、翻訳およびベクターへの挿入を導入する挿入部位を備えることが可能である。望ましくは、本発明の核酸分子は、動作可能なように当該発現制御配列に連鎖し、原核細胞または真核細胞における発現を許容するものである。
【００５２】
原核細胞および真核細胞の発現を保証する制御エレメントは当業者に公知のものである。上記に記載したように、制御エレメントには普通、転写の開始および、転写の終結および転写の安定化および随意的にポリＡシグナルを保証する調節配列が備えられている。追加の調節エレメントには転写のほかに、翻訳エンハンサー、および（または）自然付随のプロモーター領域または異種のプロモーター領域もまた包含することが可能である。ベクターがひとたび適切な宿主に取り込まれると、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現に好適な条件下で維持され、要求どおりに、本発明（ポリ）ペプチドまたはその断片の収集および精製が次に続き得る。
【００５３】
さらに、本発明のベクターは遺伝子伝達ベクターまたは遺伝子標的ベクターでもあり得る。治療用遺伝子の体外技術または生体内技術による細胞内への導入に基づく遺伝子療法は、最も重要な遺伝子伝達のアプリケーションの１つである。体外または生体内の遺伝子療法のための好適なベクター、方法または遺伝子送達システムは文献に記載されており、当業者に公知である；例えば、Giordano, Nature Medicine 2 （1996）, 534-539； Schaper, Circ. Res. 79 （1996）, 911-919； Anderson, Science 256 （1992）, 808-813, Isner, Lancet 348 （1996）, 370-374； Muhlhauser, Circ. Res. 77 （1995）, 1077-1086； Onodua, Blood 91 （1998）, 30-36； Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9（1998）, 2243-2251； Verma, Nature 389 （1997）, 239-242； Anderson, Nature 392 （Supp. 1998）, 25-30； Wang, Gene Therapy 4 （1997）, 393-400； Wang, Nature Medicine 2 （1996）, 714-716； WO 94／29469； WO 97／00957； US 5,580,859； US 5,589,466； US 4,394,448 またはSchaper, Current Opinion in Biotechnology 7 （1996）, 635-640, およびそれらに引用された参照を参照のこと。具体的には、当該ベクターおよび（または）遺伝子送達システムはまた、脂肪細胞における遺伝子療法アプローチ（特に、ＵＳ５，８６９，０３７または Zhou, PNAS USA96 （1999）, 2391-2395 を参照）、または視床下部における遺伝子療法アプローチ（特に、Geddes, Front Neuroendocrinol. 20 （1999）, 296-316 or Geddes, Nat. Med. 3 （1997）, 1402-1404 を参照）においても記載されている。本発明の核酸分子およびベクターは、細胞への直接導入用、またはリポソーム、ウィルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルス性ベクター）、電気穿孔法、弾道的送達法（例えば、遺伝子銃）またはその他の送達系を介した細胞への導入用にデザインすることが可能である。その上、バキュロウイルスシステムは、本発明の核酸分子に対する原核発現システムとして使用される。
【００５４】
以下に記述されているように、本発明の核酸分子および（または）本発明の上記ベクターおよび宿主は、医薬組成物として特に有用であリ得る。当該医薬組成物は、遺伝子療法アプローチにおいて使用することが可能である。この文脈の前後関係において、核酸分子および（または）本発明のベクターを用いて、本発明の細胞発現および（または）（ポリ）ペプチドの細胞内濃度またはその断片の（ポリ）ペプチドを調節、改変および（または）修飾し得ることが構想される。当該調節、改変および（または）修飾は、本明細書に記載したＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ遺伝子のＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ（ポリ）ペプチドおよび（または）遺伝子産物の上方制御または下方制御を引き起こすことが可能である。さらに、当該治療的アプローチは、活性Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ（ポリ）ペプチド／タンパク質／遺伝子産物の利用能の改変および（または）調節につながり得る。この文脈の前後関係における用語「活性」は、生物体におけるその（正常な）細胞機能を行う能力を指す。
【００５５】
遺伝子療法アプリケーションに対して、本発明の（ポリ）ペプチドをコードする核酸またはその断片は、ウイルスおよび疾病の感染および授与のため、および感染した細胞または生物体において寛解効果または治療効果のために使用されるウィルスような遺伝子送達システムにクローン化することが可能である。
【００５６】
上記に記載したように、核酸分子および（または）ベクターを用いて、Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭタンパク質／（ポリ）ペプチドの遺伝子発現または細胞内の濃度を調節／改変することが可能である。当該調節／改変は、アンチセンス・アプローチによって達成することが可能である。
【００５７】
Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ発現のアンチセンス調節には、動作可能なように遺伝子調節配列に連鎖したアンチセンス核酸を使用することが可能である。例えば、細胞を、遺伝子の転写がｍＲＮＡをコードする内在性Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭに結合可能なアンチセンス転写物を産出するように配向されたプロモーター配列を有するＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ配列から成るベクターで形質移入する。アンチセンス核酸の転写は、構成型または誘導型のいずれでも可能であり、そのベクターは安定した染色体外の維持および統合を提供することが可能である。別法として、ゲノムＤＮＡまたは本発明の（ポリ）ペプチドまたはその断片をコードするｍＲＮＡに結合する、一本鎖アンチセンス核酸を、当該（ポリ）ペプチドの発現にかなりの減少をもたらす濃度で、宿主の中または宿主から一時的に単離された標的細胞に投与し得る。さらに、本発明の（ポリ）ペプチドの発現は、アンチセンスアプローチ以外の手段によって影響、例えば抑制され得ることが構想される。以上の点から、本発明の（ポリ）ペプチドの発現の減少は、アンチセンス核酸の代わりに二本鎖ＲＮＡを適用するＲＮＡ媒介遺伝子干渉によって達成することも可能である（Sharp, Genes Dev. 13 （1999）, 139-141 を参照）。二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡｉアプローチによる遺伝子抑制は、Hunter、Curr. Biol. 10 （2000）、R137-R140 にも記載されている。
【００５８】
本発明の核酸分子は、以上の点から、本発明のＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ（ポリ）ペプチドの野生型または変異体型のいずれかをコードする核酸分子の機能を抑制することができる適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドの作成のために使用することが可能である。当該アンチセンスヌクレオチドには、望ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より望ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、さらにより望ましくは３０ヌクレオチドおよび最も望ましくは少なくとも４０ヌクレオチドが包含されている。
【００５９】
加えて、リボザイムアプローチもまた、本発明において構想されている。リボザイムは本発明の核酸分子を特異的に切断することが可能である。本発明の文脈の前後関係において、リボザイムには、特にハンマーヘッド型リボザイム、改変コア配列またはデオキシリボザイムを有するハンマーヘッド型リボザイムが包含され（例えば、Santoro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 （1997）, 4262 を参照）、天然および生体外選択および（または）合成されたリボザイムを備えていることが可能である。
【００６０】
肥満症の調節、誘発または寄与および（または）体重調節に関与する哺乳動物の（ポリ）ペプチドをコードするタンパク質／（ポリ）ペプチド（下記を参照）に対する核酸分子コーディングに相補的な本発明に記載の核酸分子は、本発明の核酸分子を特異的に切断する適切なリボザイム（例えば、ＥＰ-Ｂ１０２９１５３３、ＥＰ-Ａ１０３２１２０１、ＥＰ-Ａ２０３６０２５７を参照）の作成に使用することが可能である。適切な標的部位および対応リボザイムの選択は、Steinecke, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith, eds. Academic Press, Inc. （1995）, 449-460 に記載された実施例のように行うことができる。
【００６１】
本発明はまた、本発明のベクターまたは本発明のベクターを保有する非ヒト宿主によって形質移入または形質転換された宿主細胞、すなわち、本発明に記載の核酸分子またはそのような核酸分子を含んだベクターによって遺伝的に修飾された宿主細胞または宿主に関連するものである。用語「遺伝子操作された」とは、宿主細胞または宿主が、その天然ゲノムに加えて、細胞または宿主またはその前任／親のうちの１つに導入された本発明に記載の核酸分子またはベクターを備えていることを意味する。核酸分子またはベクターは、遺伝子的に操作された宿主細胞または宿主中に、ゲノム外の非依存性の分子として、望ましくは複製可能な分子として、または宿主細胞または宿主のゲノムに安定して統合された状態のいずれかとして存在することが可能である。
【００６２】
本発明の宿主細胞は、任意の真核細胞または原核細胞であり得る。好適な真核細胞は、一般に大腸菌または枯草菌などのクローニングに使用されるものである。さらに、原核細胞は、例えば真菌細胞または動物細胞を備えている。より好適な実施例において、本発明のベクターを用いて形質転換させた宿主細胞とは、脂肪細胞、脳細胞、苔類細胞、上皮性細胞、膵臓細胞、血球またはそれから得た細胞（株）である。
【００６３】
宿主は、望ましくは非ヒト哺乳類、最も望ましくはマウス、ラット、ヒツジ、子ウシ、イヌ、サルまたは類人猿であり、およびサンドラット（Psammomys obesus）を包含し得る。当該哺乳動物は治療法、望ましくは病理学的な体重／重量、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）、高コレステロール血症、異脂肪血症、冠動脈心疾患、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸、ＲＯＳ産出に関連した障害、ミトコンドリア障害などにつながる肥満症、脂肪過多症、摂食障害および（または）障害のための治療法の開発のためには不可欠なものであり得る。
【００６４】
さらに本発明の宿主は、本発明の（ポリ）ペプチド（またはその断片）の産出において部分的に有用であリ得る。当該（ポリ）ペプチド（またはその断片）が当該宿主から単離されることが構想される。
【００６５】
本発明の宿主はまた、下記に記載のように非ヒト遺伝子組換え動物でもあり得る。本発明は、本発明の核酸分子の変異形態から成る非ヒト遺伝子組換え動物、または本発明の核酸分子が除去および（または）不活化されている非ヒト遺伝子組換え動物をも構想する。当該削除は部分的削除であり得る。特に好適な非ヒト遺伝子組換え動物は、ショウジョウバエ、線形動物（線虫のような）、マウス、ラット、ヒツジなどである。
【００６６】
さらに、本発明は、当該（ポリ）ペプチドの合成を許容し、培養から産生された（ポリ）ペプチドを回復および（または）単離する好適な条件下で本発明の宿主細胞の培養を包含する本発明の核酸分子によってコードされた（ポリ）ペプチドを産出する方法に関連するものである。
【００６７】
加えて、本発明は、本発明の核酸分子によってコードされた（ポリ）ペプチド、または上記に記載の方法によって産生または取得可能な（ポリ）ペプチドに関連するものである。本明細書に使用した用語「（ポリ）ペプチド」は、ペプチド、完全長タンパク質またはその断片のいずれかを示す。ペプチドは、望ましくは本発明の（ポリ）ペプチドの断片である。用語「（ポリ）ペプチド」には、アミノ酸残基が共有結合のペプチド結合によって連鎖されている任意の長さのアミノ酸鎖を含むペプチドまたは（ポリ）ペプチドが包含される。望ましくは、「ペプチド」の当該アミノ酸鎖は、少なくとも１０アミノ酸、より望ましくは少なくとも２０、より望ましくは少なくとも３０、より望ましくは少なくとも４０、さらにより望ましくは少なくとも５０および、最も望ましくは少なくとも６０アミノ酸から成る。本発明の（ポリ）ペプチドが少なくとも１００、より望ましくは少なくとも２００、より望ましくは少なくとも３００、より望ましくは少なくとも４００、より望ましくは少なくとも５００、さらにより望ましくは少なくとも６００アミノ酸から成ることは一層望ましい。
【００６８】
本発明において使用され、および本発明の（ポリ）ペプチドとの関連で使用されている用語「またはその断片」には、特定のペプチド、本明細書で開示した（ポリ）ペプチドのアミノ酸伸長が包含される。当該「その断片」は機能的断片であることが望ましい。用語「機能的断片」は、少なくとも部分的に本発明の（ポリ）ペプチドの生理活性および（または）構造活性を満たす、上記で同定した本発明の（ポリ）ペプチドの部分を示す。但し、当該断片が本発明の（ポリ）ペプチドに対して介在分子および（または）抑制分子として機能することも構想される。例えば、本発明の（ポリ）ペプチドの断片が構造的および（または）生理的に本発明の（ポリ）ペプチドと相互に影響し合い、それによって当該（ポリ）ペプチドの機能を抑制することが構想される。
【００６９】
本発明の（ポリ）ペプチドは、細菌、酵母菌のような宿主細胞、または哺乳動物細胞または昆虫細胞のような他の原核細胞で発現した組換え（ポリ）ペプチドであり得る。別法として、それらはウィルス製剤（調合）から単離することが可能である。本発明における他の実施例では、合成（ポリ）ペプチドを使用することが可能である。以上の点から、そのような（ポリ）ペプチドは、天然アミノ酸残基のみを包含する本発明の核酸分子によってコードされたような（ポリ）ペプチドであり得るが、修飾を含む（ポリ）ペプチドでもあり得る。本発明の（ポリ）ペプチドは、例えば、そのような（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現の生成物、化学的修飾の生成物であり、天然源、例えば、ウィルス製剤（調合）から精製することもできる。さらに、本発明の（ポリ）ペプチドは、（ポリ）ペプチドドメインの共有結合連鎖の生成物でもあリ得る。
【００７０】
ペプチド／（ポリ）ペプチドは、生化学的技術または合成技術によって産出することも可能である。それらの方法は当分野では公知である（例えば Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 （1963）, 2149-2146； Stewart, "Solid Phase Peptide Synthesis", WH Freeman Co, San Francisco （1969）； Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin （1987）； Janson, "Protein Purification, Principles, 高Resolution Methods and Applications", VCH Publishers, New York, Weinheim, Cambridge （1989）； Wrede, "Concepts in Protein Engineering and Design", Walter de Gruyter, Berlin, New York （1994）を参照）。
【００７１】
本発明はまた、本発明の（ポリ）ペプチドまたはその断片から成る融合タンパク質にも関連するものである。以上の点から、本発明の（ポリ）ペプチドに加えて、当該融合タンパク質には、最低もう１つのドメインが含まれ、当該ドメインは共有結合または非共有結合を介して連鎖されている。その連鎖は、当分野で周知の方法に従った遺伝子融合に基づくか（前出のSambrook らのAusubel、「Current Protocols in Molecular Biology」、Green Publishing Associates. and Wiley Interscience, N.Y. （1989））または、例えばＷＯ９４／０４６８６に記載された、例えば化学的架橋結合によって行うことができる。本発明の（ポリ）ペプチドから成る融合タンパク質に存在する追加ドメインは、可動性のリンカー、有利には、（ポリ）ペプチドリンカーによって好適に連鎖されることが可能であり、ここでは当該（ポリ）ペプチドリンカーは複数および親水性の、当該追加ドメインのＣ末端と、ペプチド、（ポリ）ペプチドまたは抗体Ｎ末端との間の距離にまたがるのに充分な長さのペプチド結合されたアミノ酸を望ましくは備えている。その逆の場合もまた同様である。上記の融合タンパク質が、さらなる切断可能なリンカーまたは切断部位、例えば、タンパク質分解酵素または化学薬品によって特異的に認識および切断される切断部位を備えていることも可能である。
【００７２】
その上、当該の少なくとも１つのドメインは、所定の特異性または機能のドメインであり得る。この文脈の前後関係において、本発明の（ポリ）ペプチドが当分野で公知の従来の方法によってさらに修飾され得ることは当然のことながら共通認識とする。これは、本発明の（ポリ）ペプチドおよび他の機能的アミノ酸配列、例えば、細胞小器官の局在性シグナル、転写促進ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ホルモン結合ドメイン、タンパク質タグ（例えばＧＳＴ、ＧＦＰ、ｈ-ｍｙｃペプチド、フラグ、ＨＡペプチド、連鎖球菌）、膜貫通ドメインまたは異種タンパク質から得られる脂肪酸添付モチーフから成る融合タンパク質の構築を可能にする。
【００７３】
本発明の融合タンパク質はまた、少なくとも２つの本発明の（ポリ）ペプチドのエピトープから成るモザイク（ポリ）ペプチドでもあり、ここでは、当該モザイク（ポリ）ペプチドには、正常には未変性のＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭタンパク質のエピトープ間に介在するアミノ酸が欠乏している。特に、そのようなモザイク（ポリ）ペプチドは、本明細書に記載したアプリケーションおよび方法において有用である。その理由は、単一ペプチドまたは（ポリ）ペプチド内に、おそらく直線的に存在、またはリジンの症例においては多抗原ペプチドシステムとして存在している多数の関連エピトープを包含し得るからである。関連エピトープはスペーサー領域によって分離することができる。
【００７４】
本発明の核酸分子、（ポリ）ペプチド（そのほかに本明細書に記載したように抗体または断片またはその誘導体、アプタマーまたはその他の受容体も含む）、融合タンパク質、モザイク（ポリ）ペプチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、検出可能な程度に標識化することが可能である。生体分子標識化のための種々の技術は入手可能であり、当業者に公知されているので、本発明の範囲内に含まれるものとする。そのような技術は、例えば、Tijssen, "Practice and theory of enzyme immuno assays", Burden, RH and von Knippenburg （Eds）, Volume 15 （1985）, "Basic methods in molecular biology"； Davis LG, Dibmer MD； Battey Elsevier （1990）, Mayer らの（Eds） "lmmunochemical methods in cell and molecular biology" Academic Press, London （1987）, or in the series "Methods in Enzymology", Academic Press, Inc. のシリーズに記載されている。検出方法には、限定されるものではないが、オートラジオグラフィー蛍光顕微鏡、直接および間接酵素的な反応が包含される。
【００７５】
本発明は、さらに加えて、抗体または断片またはその誘導体または抗血清またはアプタマーまたは核酸上のエピトープ（抗原決定基）を特異的に認識する他の受容体、または本発明の（ポリ）ペプチドにも関連するものである。抗体を産出するための一般的な方法論は、公知であり、単クローン性の抗体に対して、例えばKohler and Milstein, Nature 256 （1975）, 494 and reviewed in J.G.R. Hurrel, ed., "Monoclonal Hybridoma Antibodies： Techniques and Applications", CRC Press Inc., Boco Raron, FL （1982）に記載されている。本発明に記載の用語「抗体」とは、単クローン性の抗体または多クローン性の抗体に関連するものである。多クローン性の抗体（抗血清）は、従来のプロトコルに従って取得することができる。抗体断片または誘導体は、Ｆ（ａｂ'）_２、Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片から成る；例えば、Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press 1988, Cold Spring Harbor, NY. を参照。望ましくは本発明の抗体は単クローン性の抗体である。さらに、本発明に従って、本発明の誘導体は、疑ペプチド（peptidomimetic）によって産生することができる。本発明の文脈の前後関係における用語「アプタマー」には、ＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ（ｓｓ＝一本鎖）、修飾ＲＮＡ、修飾ｓｓＤＮＡまたは、高特異性および親和性を保有する複数の標的配列を結合するＰＮＡｓのような核酸が包含される。アプタマーは当分野で公知であり、特に、Famulok、Curr. Op. Chem. Biol. 2 （1998）、320-327 に記載されている。アプタマーの調製（調合）は当分野で公知であり、結合部位を同定するために、特に組み合わせＲＮＡライブラリを利用することが可能である（Gold、Ann. Rev. Biochem. 64 （1995）、763-797）。当該の他受容体は、例えば、当該抗体などから疑ペプチド（peptidomimetic）によって得ることが可能である。その認識の特異性は、他の公知のタンパク質、分子が未結合であることを暗示する。特異性評価のために好適な宿主は、核酸分子のエピトープ（抗原決定基）または本発明の（ポリ）ペプチドのほかに、例えば当分野で公知（例えばＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着検査法形態）のタンパク質または核酸分子からの対応化合物も包含しており、同時に本発明の化合物のみに結合するが、当該対応化合物とは有意な範囲でほとんど交差反応をしない抗体などを同定する、上記に復唱した化合物の接触を暗示する。
【００７６】
本発明は、本発明の核酸分子のアンチセンスオリゴヌクレオチドにも関連するものである。当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、科学的な目的にのほかに、診断目的または治療目的においてもまた使用することが可能なためである。
【００７７】
本発明はさらにまた、本発明のポリペプチドを発現する非ヒト動物、または本発明の融合タンパク質または、本発明の核酸分子から成る本発明のベクターで形質移入した融合タンパク質を提供する。例えば、非ヒト動物が本発明のポリペプチドを過剰発現または過小発現することが構想される。さらに、本発明は、本発明の核酸分子または相同体、パラログまたはそのオルソログが消音および（または）変異されるような非ヒト動物に関連するものである。
【００７８】
上記の非ヒト動物は、望ましくはマウス、ラット、ヒツジ、ハムスター、ブタ、イヌ、サル、ウサギ、子ウシ、ウマ、線形動物、ハエおよびサカナから成るグループから選択する。本発明はまた、本発明の核酸分子またはベクターから成る遺伝子組換えマウス、ラット、ハムスター、イヌ、サル、ウサギ、ブタ、線虫、ショウジョウバエ、サカナ（例：ゼブラフィッシュまたはシビレエイ）のような遺伝子組換え非ヒト動物にも関連するものである。当該動物は、本発明の（ポリ）ペプチドの単一またはいくつかの形態をコードし、肥満症を調節、誘発またはそれに寄与、または体重調節に関与する、単一またはいくつかの同一または異なる核酸分子のコピーを有することが可能である。これらの動物は、本明細書中に記載されたような肥満症、脂肪過多症、摂食障害、消耗症および（または）体重／重量の他の障害、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）、高コレステロール血症、異脂肪血症、冠動脈心疾患、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸、ＲＯＳ産出に関連した障害などのための研究モデルとして部分的に有用である。さらに、当該遺伝子組換え非ヒト動物は、上記のＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭタンパク質の変異体形態との接続、例えば薬物の薬理学的な研究に良く適している。
【００７９】
別の実施例において、本発明は、核酸分子、ベクター、宿主、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、断片またはその誘導体またはアプタマーまたは他の受容体、または本明細書に定義されたポリペプチド、例えばＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭによって影響および（または）修飾される遺伝子および（または）遺伝子産物の機能を制御するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関連するものである。
【００８０】
当該の影響／修飾は、タンパク質とタンパク質断片との間の直接相互作用によって、および（または）当該遺伝子および（または）遺伝子産物の機能、活性および（または）発現に必要な代謝化合物、またはイオンを供給することによって発生させることが可能である。当該遺伝子および（または）遺伝子産物が、細胞小器官に発現する遺伝子および（または）遺伝子産物であることは特に望ましい。当該細胞小器官は、特にミトコンドリアまたはペルオキシソームであり得る。
【００８１】
当該遺伝子および（または）遺伝子産物が、ＵＣＰファミリーのメンバーであることは特に望ましい。ＵＣＰファミリーのメンバーは公知であり、上記に記載されている。
【００８２】
本発明はさらに、核酸分子、ベクター、宿主、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、断片またはその誘導体またはアプタマーまたは他の受容体または本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドから成る組成物を提供する。当該組成物は、特に診断組成物または医薬品組成物であり得る。
【００８３】
加えて、本発明は、細胞障害、細胞塊、器官および（または）被験者および（または）治療、細胞障害の軽減および（または）予防、細胞塊、器官および（または）被験者を検出および（または）検証するために本明細書に定義した組成物の使用法を提供する。当該障害は、代謝障害またはミトコンドリアの障害であり、ミトコンドリアの障害には、聴覚障害、網膜症、進行性の脳障害（enzelopathies）、運動失調、痙性対麻痺、代謝性アシドーシスおよびその他の障害が包含される。当該代謝障害には、肥満症、脂肪過多症、摂食障害（神経性過食症、拒食症）、悪質液（消耗症）、膵臓の機能障害（例：糖尿病、具体的には第２型の糖尿病）および（または）ＲＯＳ（活性酸素種）産出（具体的には老化および発癌における感染に対する反応）に関連する障害を包含し得る。例えば、ＵＣＰｓは膵臓の障害、例えば糖尿病に関与することが示されている。脱共役タンパク質の糖尿病における役割は、げっ歯類のストレプトゾトシン糖尿病におけるＵＣＰ３の誘発によって実証されている（特に、Hidaka、Proc Soc Exp Biol Med 224： 172-177 （2000）、Hidaka、Diabetes 48： 430-435 （1999）を参照）。さらに、膵臓ベータ-細胞におけるＵＣＰ２発現は、ベータ-細胞機能およびインシュリン分泌に影響することが示されている（Wang, Diabetes 48： 1020-1025 （1999）； Chan, Diabetes 48： 1482-1486 （1999））。
【００８４】
活性酸素種（ＲＯＳ）は、膜機能障害、ＤＮＡ損傷およびタンパク質の不活性化につながる。病理学的な影響には、癌、関節炎および神経変性の疾病が含まれる。ＲＯＳ制限代謝は、細胞損傷を予防するための主要な機構である。具体的には、肥満症は増大した酸化ストレスを誘発する（Hayes、Free Radic Res 31： 273-300 （1999）； Yang、Arch Biochem Biophys 378： 259-268 （2000））。対照的に、マクロファージにおいて増大したＲＯＳ産出は免疫の反応を改良する。同様にＵＣＰ２ノックアウトマウスは、特定の病原体による感染に対してより高い耐性を示す。以上の点から、修飾能力を有する本発明の化合物、特にＵＣＰｓは上記に同定された目的に良く適している。
【００８５】
さらなる実施例において、本発明は、本明細書で定義したとおり、ポリペプチドと相互作用可能な物質を同定するために、核酸分子、ベクター、宿主、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、断片またはその誘導体またはアプタマーまたは他の受容体、またはそのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用法に関連するものである。当該ポリペプチドと相互作用可能な当該物質は、拮抗薬または作用薬であり得る。
【００８６】
なお、さらなる実施例において、本発明は、ポリペプチドまたは、動物の細胞代謝に関与する物質または恒常性を修飾する能力のある物質を同定する下記のステップから成る方法を提供する：
（ａ）本発明のポリペプチドまたはその断片または本発明の融合タンパク質またはその断片との相互作用に関するポリペプチドまたは物質収集読み出し装置を使用して検査するステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）において正の相互作用を示したポリペプチドまたは物質を同定するステップ。
【００８７】
上記の用語「細胞代謝」には、細胞小器官の細胞膜を横切ったイオン輸送、ビタミン輸送または代謝産物輸送の調節に関与する代謝イベントを包含することが可能である。これらの輸送イベントまたはその調節は、エネルギー恒常性、貯蔵化合物の累積および（または）根治的生成／除去に影響を及ぼすことが可能である。
【００８８】
ポリペプチドまたは上記の開示方法によって同定された物質は、特にポリペプチドまたは直接的または間接的に本発明のポリペプチド、すなわちＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭタンパク質および（または）その断片と相互作用する物質（例えばリンカータンパク質経由または生理的パラメータ経由）であり得る。上記ステップ（ａ）の相互作用に関する当該検査は、当事者に公知の方法によって行うことが可能であり、その方法を本明細書に記載した。具体的には、これらの測定法は、生化学的、免疫学的なおよび（または）分子生物学的な測定法から成る。
【００８９】
読み出し装置を使用する当該相互作用測定法には、当分野で公知であり、特に２つのハイブリッドスクリーニング（特に、ＥＰ-０９６３３７６、ＷＯ９８／２５９４７、ＷＯ００／０２９１１に記載されている）、ＧＳＴプルダウンカラム、記載した通りの細胞抽出物からの共沈殿測定法、特に Kasus-Jacobi, Oncogene 19 （2000）, 2052-2059, "interaction-trap" systems、（記載した通り、特にＵＳ６，００４，７４６における）発現クローン化（例えば lamda gtll）、ファージディスプレイ（記載されたとおりの、特にＵＳ５，５４１，１０９における）、生体外結合測定法などが包含される。さらなる相互作用測定の方法および対応する読み出し装置は、特にＵＳ５，５２５，４９０、ＷＯ９９／５１７４１、ＷＯ００１１７２２１、ＷＯ００／１４２７１またはＷＯ００／０５４１０に記載されている。
【００９０】
同様に、相互作用する分子／（ポリ）ペプチドは、当分野で公知の細胞基調技術によって演繹することが可能である。これらの測定法には、特にレポーター遺伝子構成物の発現、または記載されたように、例えば、遺伝子発現に影響する薬物／小化合物の同定に対する「ノックイン」測定法が包含される。当該「ノックイン」測定法には、組織培養細胞における「ノックイン」のほかに、（遺伝子組換え）動物におけるノックイン測定法を包含することが可能である。成功した「ノックイン」の実施例は、当分野で公知である（特にTanaka、J. Neurobiol. 41 （1999）、524-539 またはMonroe、Immunity 11 （1999）、201-212 を参照）。さらに、本発明の（ポリ）ペプチド（またはその断片）の他の分子／（ポリ）ペプチド、ペプチドに対する結合、または本発明の（ポリ）ペプチド（またはその断片）自体に対する結合（二量体化、オリゴマー形成、多量体化）および、当該相互作用の、特にシンチレーション近接測定法（ＳＰＡ）または同種時間分解蛍光測定法（ＨＴＲＦＡ）による測定を包含する生化学的測定法を用いことが可能であるが、これらの測定法に限定されるものではない。当該「相互作用の検査」には、複合体形成の測定も含むことが可能である。複合体形成の測定は、当分野で公知であり、特に不均一系および均一系による測定が包含される。均一系による測定法には、結合パートナーが溶液中に残存し、凝集測定法のような測定法を包含する測定法が包含される。不均一系の測定法には、特にイムノアッセイ（免疫学的測定法）、例えばＥＬｌＳＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、ＦＩＡ、ＣＬｌＡまたはＥＣＬのような測定法が包含される。
【００９１】
相互作用および（または）本発明の（ポリ）ペプチドの結合パートナーを同定するため、または本発明の（ポリ）ペプチドのこの（特定の）細胞内結合パートナー／標的との結合を妨害する能力のある薬剤／化合物を同定するための、さらなる方法および測定法を以下に開示する。当該の追加および（または）さらなる方法および測定法は体重調節に関与し、および（または）本発明のＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ（ポリ）ペプチドと相互作用する能力を持つ（ポリ）ペプチドを同定する上記の方法においても使用することが可能である。
【００９２】
本発明の方法の任意の測定または検出のステップは、コンピュータ技術によって補助することが可能である。例えば、本発明に従った当該検出および（または）測定ステップは、イメージ分析、分光法または流動細胞計測法を含む種々の手段によって自動化することが可能である。
【００９３】
なお別の実施例において、本発明は、１つ以上の相互作用を行う（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を同定するステップをさらに包含する上記に記載した方法に関連するものである。
【００９４】
そのような核酸分子の同定は、当分野で公知であり、特に、特定プライマーおよび（または）変性プライマーの使用法を包含する。さらに、前述のSambrookまたは Glick （1994）, "Molecular Biotechnology", ASM Press, Washington に記載された組換え技術を用いることも可能である。
【００９５】
なお、さらなる実施例において、本発明は、動物の細胞代謝に関与するポリペプチドまたは物質、または恒常性を修飾する能力のあるポリペプチドまたは物質を下記のステップで同定する方法に関連するものである：
（ａ）本発明のポリペプチドとの相互作用に対してポリペプチドまたは物質の収集を検査するステップ、または上記の方法によって同定されたポリペプチドまたは物質の収集を検査するステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）において正の相互作用を示したポリペプチドを同定するステップ；および随意的に
（ｃ）同定されたポリペプチドにステップ（ａ）および（ｂ）を１回以上繰返すステップ。ここで、新規に同定されたポリペプチドは、さらに相互作用するポリペプチドを同定するために、以前に同定されたポリペプチドをベイトとして置換する。
【００９６】
上記の方法には、１つ以上の相互作用する（ポリ）ペプチドコードする核酸分子を同定するステップをさらに包含することが可能である。
【００９７】
本発明はまた、本明細書に記載した核酸分子の使用法、または本明細書に記載した細胞代謝、具体的にはエネルギー代謝の機能的カスケードに関与する遺伝子および（または）遺伝子産物の検出および（または）単離のためのポリペプチドの使用法も提供する。
【００９８】
その上、本発明は、哺乳動物における体重調節に関与するポリペプチドを同定する下記のステップから成る方法に関連するものである：
（ａ）（ポリ）ペプチドの収集を本発明のポリペプチドまたはその断片または本発明の融合タンパク質またはその断片と、当該（ポリ）ペプチドとの結合を許容する条件下で接触せしめるステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）において、本発明の当該ポリペプチドまたは本発明の融合タンパク質に結合しなかった（ポリ）ペプチドの当該収集から（ポリ）ペプチドを除去するステップ。および
（ｃ）本発明の当該ポリペプチドまたは本発明の融合タンパク質に結合する（ポリ）ペプチドを同定するステップ。
【００９９】
上記の方法は、さらなる努力を費やすことなく、当業者によって実行されることが可能である。ステップ（ａ）の当該「接触」は、本発明の（ポリ）ペプチドおよび（または）その断片と共役する（磁石）ビーズを使用して、特に溶液中で行うことが可能である。非結合（ポリ）ペプチドは、当分野で公知の方法、例えば磁力分離、重力、親和性カラムシステムおよび対応洗浄から成る方法によって容易に除去することが可能である。
【０１００】
結合（ポリ）ペプチドを同定する方法は、当分野で公知であり、特にＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析、およびウエスタンブロット法を包含する。さらに、２Ｄゲル電気泳動、ゲル内温浸、マイクロシークエンシング、Ｎ末端シークエンシング、ＭＡＬＤＩ-ＭＳ、質量分析におけるペプチドの分析、ペプチド質量フィンガープリント法、ＰＳＤ-ＭＡＬＤＩ-ＭＳおよび（または）（ミクロ）ＨＰＬＣのような技術がある。同定された分離ポリペプチドは、特にエドマン分解法、ＭＡＬＤＩ-ＭＳ法、ラダーシークエンシング法（Thiede、FEBS 357 （1995）、65）によって、さらに分析することが可能である。
【０１０１】
上記の（および他の当分野で公知の）方法を使用することによって、同定された（ポリ）ペプチドのアミノ酸配列は演繹および配列される。これらの配列されたアミノ酸の断片から変性オリゴヌクレオチドを演繹および合成することが可能であり、これらを用いて、例えばゲノムまたはｃＤＮＡライブラリをスクリーニングし、対応遺伝子／ｃＤＮＡ．を同定およびクローン化することが可能である。
【０１０２】
さらに、ファージディスプレイアプローチを本発明の方法において使用することも可能である。ファージディスプレイは、所定の分子と相互に影響するタンパク質との同定を許容する。それぞれ異なるペプチドエピトープ（抗原決定基）を表すファージのライブラリは、所定の分子に対する結合に関してテストする。結合ファージを精製して、ペプチドエピトープ（抗原決定基）をコードする挿入断片を配列することが可能である。ファージディスプレイキットは当分野で公知であり、市販品としては例えばDisplay Systems Biotech Cat. No. 300-110 があげられる。
【０１０３】
本発明は、さらに別の実施例において、本明細書に記載の方法に関連するものであり、ここでは、本発明の当該（ポリ）ペプチドを固形担体に固定する。固形担体は当分野で公知であり、特に市販のカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁力ビーズ、膠質金属粒子、ガラスおよび（または）シリコン素子およびシリコン面、ニトロセルロース条片、膜、シート、デュラサイト（duracytes）、反応トレーのウェルおよび壁、プラスチックチューブなどが包含される。本発明の当該（ポリ）ペプチドを固定化／不動化するための好適な方法は公知であり、イオン性相互作用、疎水性相互作用、共有結合相互作用などが含まれるがそれらに限定されるものではない。特定の好適な実施例において、当該固形担体はゲルろ過または親和性クロマトグラフィー材料とする。
【０１０４】
上記の本発明の方法のより好適な実施例において、当該結合（ポリ）ペプチドは、ステップ（ｃ）における当該同定に先行して開放される。当該開放は、溶出によって発効することが可能である。そのような溶出方法は当分野で公知であり、特に異なるイオン強度または異なるｐＨの溶液を用いた溶出、または薬剤／分子／ペプチドのインターカレートまたは競合を利用した溶出を包含する。
【０１０５】
さらに、より好適な実施例において、本発明は、本発明の上記に記載の方法に関連するものであり、ここでは当該方法には１つ以上の結合（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を同定するステップがさらに包含されている。
【０１０６】
上記に指摘したように、特に、変性プライマー／オリゴヌクレオチドを用いて、または発現クローニングによって、当該核酸分子を演繹し、対応遺伝子および（または）ｃＤＮＡを検出することが可能である。
【０１０７】
本発明の核酸分子の発現に影響を及ぼす化合物を同定する方法は下記のステップから成る。
（ａ）本発明の核酸分子または、化合物または化合物の収集によって、動作可能なように読み出し装置に連鎖した本発明の方法によって同定された核酸分子から成る発現ベクターを保有する宿主に接触するステップ。
（ｂ）当該接触が、当該読み出し装置によって提供されるシグナル強度に変化をもたらすがどうかを測定するステップ；および、随意的に、
（ｃ）ステップ（ｂ）におけるシグナルの変化を誘発する化合物の当該収集内で化合物を同定するステップ；
ここでは、シグナル強度の当該変化が当該核酸分子の発現の変化に相関する。
【０１０８】
さらに、本発明は、上記の定義のとおりに（ポリ）ペプチドの活性に影響を及ぼす化合物を同定する下記のステップから成る方法を提供する。
（ａ）動作可能なように読み出し装置に連鎖し、および（または）、化合物または化合物の収集によって読み出し装置に連鎖した本発明の（ポリ）ペプチドを保有する本発明の核酸分子から成る発現ベクターを保有する宿主に接触するステップ；
（ｂ）当該接触が、当該読み出し装置によって提供されるシグナル強度に変化をもたらすがどうかを測定するステップ；および、随意的に、
（ｃ）ステップ（ｂ）におけるシグナルの変化を誘発する化合物の当該収集内で化合物を同定するステップ；
ここでは、シグナルの当該変化は、当該（ポリ）ペプチドの活性の変化に相関する。
【０１０９】
本発明による方法の文脈の前後関係において、上記に使用された用語「活性」には、本発明の（ポリ）ペプチドの「機能」も包含される。当該機能には、上記に記載したように、酵素活性またはその他の機能、特にシグナル伝達経路における介入などを包含することが可能である。そのような活性および当該活性の修飾因子は、本明細書に記載したように、好都合な生体外または生体内測定法によって、またはその変異によって決定および（または）同定することが可能である。根底にある技術は、広範かつ一般的に当業者に公知されている。
【０１１０】
本発明の核酸分子に動作可能なように連鎖、または本発明の（ポリ）ペプチドに連鎖した読み出し装置には、本明細書に開示された放射性標識に基づく測定法、発光、蛍光などが包含されるがそれに限定されるものではなく、特に当該読み出し装置は、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）を包含することが可能である。上記の方法は、特に（自動化）高処理量スクリーニングにおいて有用である。本発明の文脈の前後関係において、上記の「動作可能なように本発明の核酸分子に連鎖した読み出し装置」には、異なる分子、例えば、特に他のプラスミド、ベクターなどのような核酸分子上に位置する読み出し装置も包含される。上記方法のステップ（ａ）の当該宿主は、原核宿主細胞であり得る。当該宿主細胞は、酵母菌細胞または植物細胞であり得る。当該真核生物の宿主細胞が哺乳動物の宿主細胞であることは特に望ましい。但し、当該宿主細胞は、真核細胞、例えば細菌でもあり得る。特に好適なのは、真核（宿主）細胞が上記の場合である。
【０１１１】
本発明の方法における用語「化合物」には、単一物質または同一または同一でない複数物質が含まれる。当該化合物は、例えば試料、例えば植物、動物または微生物からの抽出細胞に包含されることが可能である。本化合物（物質）は、本明細書中に記載された方法によってスクリーニングされたに化合物ライブラリ由来するペプチドまたは低分子重量の有機分子である。さらに、当該化合物は当分野で公知であリ得るが、本発明の（ポリ）ペプチドの活性に影響可能なこと、または本発明の核酸分子の発現に影響可能であることは、共に知られていない。複数個の化合物は、例えば生体外試料および培養培地に添加すること、または細胞に注入することが可能である。
【０１１２】
化合物を含む試料（化合物の収集）が、本発明の方法において同定された場合には、該当の化合物を含むと同定された本来の試料から化合物を単離すること、または本来の試料をさらに細区画すること、例えば、資料に複数の異なる化合物が含まれている場合、試料ごとに含まれている異なる物質の数を減少させるため、本来の試料の細区画をさらに細区画する作業を繰返すこと、のいずれかが可能である。その時点で、本明細書に記載した当分野で公知の方法によって、当該試料または化合物が所望の特性を示すかどうかを決定することができる。試料の複雑さに応じて、本発明に記載の方法に従って上記ステップを何回か繰り返し、望ましくは試料には限定された数または単一物質のみが包含されると識別されるまでステップを繰返す。当該試料には類似の化学的性質および（または）物理的性質を有する物質が包含されることが望ましく、当該物質が全て同一であることが最も望ましい。本発明の方法は、当業者によって、例えば従来の技術（例えば、ＥＰ-Ａ-Ｏ４０３５０６を参照）に記載されている他の細胞基調測定法に従って容易に実施およびデザインすることができる。さらに、当業者は、どの化合物および（または）細胞が本発明の方法を実施するために使用することが可能であるかを容易に認識することが可能である。例えば、上記に記載した宿主細胞または酵素は、必要に応じて、例えば前駆物質化合物を、本発明の核酸分子の発現に影響および（または）本発明の（ポリ）ペプチドの活性に影響を及ぼす活性化合物に転換する。そのような本発明方法の適応は、当業者の能力範囲で行なうものとし、必要以上の実験無しに実施できるものである。
【０１１３】
本発明に記載の方法に従って使用できる化合物には、特にペプチド、タンパク質、およびｃＤＮＡ発現ライブラリ、抗体、小有機の化合物、結合基、ＰＮＡｓなどを含んだ核酸が含まれる。当該化合物はまた、機能的誘導体または公知活性化剤または阻害剤の類似体でもある。化学的誘導体および類似体の調製（調合）のための方法は、当業者に公知であり、例えばBeilstein（前掲）に記載されている。さらに、当該誘導体および類似体の効果は、当分野で公知の方法および（または）本明細書に記載した方法に従ってテストすることができる。さらに、疑ペプチド（peptidomimetic）および（または）本発明の核酸分子または本発明の核酸分子の発現の適切な活性化剤または阻害剤、または本発明の（ポリ）ペプチド活性のコンピュータ支援設計は、例えば、本明細書に記載した方法に従って使用することができる。例えば、タンパク質およびペプチドのコンピュータ支援設計のための適切なコンピュータ装置は、従来の技術、例えば Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 （1994）, 1033-1036； Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 （1987）, 1-13； Pabo, Biochemistry 25 （1986）, 59875991 に記載されている。上記に記載のコンピュータ分析から得た結果は、本発明の方法、例えば公知の化合物、物質または分子の最適化と組み合わせて使用することができる。適切な化合物はまた、連続的な化学的修飾およびその結果として生じる化合物の検査を介して、例えば本明細書に記載の方法に従って、疑ペプチド（peptidomimetic）組み合わせライブラリの合成によって同定することもできる。疑ペプチド（peptidomimetic）組み合わせライブラリの生成および使用法に関する方法は、従来の技術、例えば Ostresh, Methods in Enzymology 267 （1996）, 220-234 and Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 （1996）, 709-715 において記載されている。さらに、Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭタンパク質またはそのＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ核酸分子の阻害剤または活性化剤の三次元および（または）結晶学的構造を、本発明の方法においてテストされる本発明の（ポリ）ペプチドの疑ペプチド（peptidomimetic）阻害剤または活性化剤の設計のために使用することができる（Rose, Biochemistry 35 （1996）, 12933-12944； Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 （1996）, 1545-1558）。
【０１１４】
なお、さらなる実施例において、本発明は、非ヒト動物における本発明の１つ以上のポリペプチドまたは１つ以上の融合タンパク質の発現の影響を評価する下記のステップから成る方法を提供する。
（ａ）当該動物において本発明の核酸分子を過剰発現するステップ；および
（ｂ）当該動物の重量が増加したか減少したか、代謝変化が誘発されたかどうか、および（または）摂食行為が修飾されかたどうかを、それぞれ判定するステップ。
【０１１５】
同様に、本発明は、非ヒト動物における本発明の１つ以上の（ポリ）ペプチドまたは１つ以上の融合タンパク質の発現の影響を評価する下記のステップから成る方法にも関連するものである。
（ａ）当該動物において本発明の核酸分子を低発現するステップ；および
（ｂ）当該動物の重量が増加または減少したか、代謝変化が誘発されたかどうか、および（または）摂食行為が修飾されかたどうかを、それぞれ判定するステップ。
【０１１６】
上記に記載の遺伝子組換え非ヒト動物は、本発明の１つ以上の（ポリ）ペプチドの発現の影響を評価する上記の方法にとって特に有用であり得る。本発明の核酸分子の上記「低発現」には、特に両対立遺伝子の全欠損、または任意の１つの対立遺伝子の除去が包含される。さらに、当該用語には、試験動物における低機能的タンパク質／（ポリ）ペプチドの発現を引き起こす突然変異の生成が包含される。
【０１１７】
上述のポリペプチドの結合標的および薬剤との相互作用を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
（ａ）下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
（ａａ）本発明のポリペプチド、またはその断片または本発明の融合タンパク質またはその断片；
（ａｂ）当該（ポリ）ペプチドまたは融合タンパク質またはその断片の結合標的および薬剤；および
（ａｃ）リファレンス親和性にて、当該（ポリ）ペプチド、融合タンパク質またはその断片が特異的に当該結合標的および薬剤に結合する条件下における候補薬剤；
（ｂ）（候補）薬剤の偏向親和性を決定するため、当該結合標的に対する当該（ポリ）ペプチド、融合タンパク質またはその断片の結合親和性を検出するステップ；および
（ｃ）（候補）薬剤の偏向親和性とリファレンス親和性間の差異を確定するステップ。
【０１１８】
上記に指摘したように、本発明の（ポリ）ペプチドの特定結合の標的および薬剤には、シグナル伝達経路および（または）特定の受容体の本発明の（ポリ）ペプチドとの接触に関与する分子を包含することが可能である。但し、本発明の（ポリ）ペプチドの当該結合標的および薬剤は、当該（ポリ）ペプチド自体であり、特に二量体化または多量体化につながることも構想される。さらなる（天然および人工）結合標的および薬剤は、当分野で公知な方法および本明細書で開示した方法によって同定することが可能である。
【０１１９】
本発明の（ポリ）ペプチドの相互作用の「リファランス親和性」およびその結合標的および薬剤は、当分野で公知の方法によって確立および（または）演繹することが可能である。当該方法には、生体外および生体内方法が包含されるがそれらに限定されるものではなく、本明細書に記載したように結合アッセイを関与することも可能である。具体的には、当該結合アッセイは、本発明の（ポリ）ペプチドの結合標的および薬剤との分子相互作用が評価されるような任意の測定法を含む。当該結合標的および薬剤には、天然（例えば細胞内の）結合標的および薬剤、例えば、Ｕｎｃ−５１基質、ＲＯＭＡ１基質および（または）２ＴＭ基質、Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１および（または）２ＴＭ（ポリ）ペプチド自体、Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１および（または）２ＴＭ（ポリ）ペプチド制御因子および（または）シグナル伝達カスケードの分子などを包含することが可能である。本発明の範囲内には、但し、例えば抗体または誘導体および（または）その断片、アプタマーのほかに、非天然の受容体分子も含むことが可能である本発明の（ポリ）ペプチドの非天然の結合パートナーも包含される。当該結合標的および薬剤には、アンタゴニストのほかに本発明の（ポリ）ペプチドのアゴニストもまた包含される。
【０１２０】
本発明の（ポリ）ペプチドの特定の親和性、活性および（または）機能は、好都合な生体外、細胞基調または生体内測定法、例えば動物における生体外結合アッセイ、細胞培養測定法（例えば遺伝子療法、遺伝子組換え）などによって決定することが可能である。結合アッセイには、本発明の（ポリ）ペプチドの分子の結合標的との相互作用が評価される任意の測定法が含まれる。結合標的は、当該本発明の（ポリ）ペプチド自体のオリゴマー形成（二量体化、多量体化）、基質または当該本発明の（ポリ）ペプチドの調節タンパク質または、本発明の（ポリ）ペプチドの活性または（細胞）局在性を直接的に調整する他の制御因子のような、天然細胞内結合標的であり得る。さらなる結合標的および薬剤には、抗体などの特定の免疫のタンパク質のような非天然結合標的、または以下に記載したようなスクリーニング測定法において同定されたようなＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ（ポリ）ペプチド特定の薬剤が包含される。
【０１２１】
特定のスクリーニング測定法は、特にＵＳ５，８５４，００３またはＵＳ５，６３９，８５８において開示されている。本発明の（ポリ）ペプチドの特定の結合薬剤には、ヘプタぺリカル受容体のファミリーの受容体のようなＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ特異性の受容体を含むことが可能である。他の天然Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ結合標的は、細胞、細胞膜および細胞抽出物および画分を開示した材料および方法、および当分野で公知の他の方法でスクリーニングすることによって容易に同定することができる。例えば、本発明の（ポリ）ペプチドの天然細胞内結合の標的は、１-ハイブリッドスクリーン、２-ハイブリッドスクリーン、および３-ハイブリッドスクリーンのような測定法を用いて同定することが可能である。加えて、生化学的精製製法、細胞抽出物からの共沈殿測定法、相互作用捕集装置、発現クローン化（例えばラムダｇｔ１１を使用する細菌、またはプラスミド発現ベクターを使用する原核細胞系において）、ファージディスプレイなどの方法を、天然Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ結合薬剤を同定するために利用することが可能である。非天然の細胞内結合薬剤は、以下に記載したように、化学的ライブラリのスクリーンにおいて取得することが可能である。
【０１２２】
本発明は、Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ調節可能な細胞機能のレベルで活発な薬剤のための、薬理学的な薬剤、化合物または主要化合物を同定する効果的な方法を提供する。一般に、これらのスクリーニング方法は、本発明の（ポリ）ペプチドの天然Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ結合標的との相互作用を調節する化合物の測定法に関与する。標識化生体外タンパク質-タンパク質結合アッセイ、免疫測定法、細胞基調測定法などを含んだ薬剤結合のためのさまざまな測定法を提供する。これらの方法は、主要化合物のための化学的ライブラリの自動化、コスト効果に優れた高処理量スクリーニングに対して修正可能であり、広範な国内および国外の医薬品およびバイオテクノロジー薬物の開発プログラム用において直ちに使用できるアプリケーションを持つ。同定された試薬は、医薬品産業において動物およびヒト試行用にその用途を見出すであろう。例えば、試薬を誘導体化し、生体外および生体内測定法で再スクリーンを行なうと、医薬品開発のために活性を最適化し、毒性を最小にすることが可能である。
【０１２３】
生体外結合におけるアッセイは、例えば、別のペプチドまたは、検出または固着用のタグなどの（ポリ）ペプチドの融合生成物の一部であり得る本発明の（ポリ）ペプチドを含んだ組成物の混合体を使用する。これらの方法において使用される本発明の（ポリ）ペプチドまたはその断片は、普通単離され、部分的に純粋または純粋な形態で加えられ、典型的には遺伝子組換え的に産生される。アッセイ混合物には、候補薬理学的な薬剤も異なる濃度で包含される。候補薬剤は、多くの化学クラスを含み、典型的には有機の化合物だが；望ましくは小有機化合物である。小有機化合物は、５０Ｄａ以上の分子量を有するが、約２，５００Ｄａ以下、望ましくは約１，０００Ｄａ以下、より望ましくは、約５００Ｄａ以下の分子量を有する。候補薬剤には、タンパク質および（または）ＤＮＡとの構造上の相互作用に必要な機能的化学基から成り、典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくは少なくとも２つの機能的化学基、より望ましくは少なくとも３つの機能的化学基が含まれる。候補薬剤には多くの場合、周期性の炭素または複素環式構造、および（または）１つ以上の前記機能基と置換された芳香族またはポリ芳香族構造が包含される。候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、プリミジン（pyrimidies）、誘導体、構造上の類似体またはその組み合わせなどを含んだ生体分子間に見出される。その薬剤が存在する場合、または薬剤が形質移入された核酸にコードされる場合には、当該核酸は典型的にＤＮＡまたはＲＮＡである。
【０１２４】
候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含んださまざまなソースから取得する。例えば、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および直接合成のための多くの手段が利用可能である。別法として、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリは入手可能であるか、または容易に産生できる。その上、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を通して、天然および合成的に産生したライブラリおよび化合物は容易に修飾できる。加えて、公知の薬理学的薬剤は、構造類似体を産出するため、有向またはランダムな化学的修飾の対象であり得る。
【０１２５】
種々の他の試薬も、この混合物に含まれ得る。これらには、生化学的エネルギー源として必要な試薬、例えばＡＴＰまたはＡＴＰ類似体、核酸、例えば核酸結合アッセイにおいて、塩類、緩衝剤、中性のタンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤などが含まれ、それらを用いて、至適なタンパク質-タンパク質および（または）タンパク質-核酸結合を促進すること、および（または）非特異性またはバックグラウンド相互作用を減少することが可能である。また、プロテアーゼ阻害剤、核酸分解酵素阻害剤、抗菌の薬剤などのような測定の効率を改良する試薬を使用することも可能である。
【０１２６】
結果として生じる混合物は、候補薬理学的薬剤の存在のため、Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭポリペプチドが特異的に細胞結合の標的、部分または類似物をリファレンス結合親和性と結合する条件下でインキュベートされる。混合体の組成物は、不可欠な結合を提供する任意の順序で加え、インキュベーションは至適な結合を促進する任意の温度で実施することが可能である。インキュベーション期間も同様に至適な結合に対して選択するが、迅速な高処理量スクリーニングを促進するために最小限に止める。一般に複数の測定法配合は、種々の濃度に対して異なる反応を得るために異なる薬剤濃度と並行して実施する。典型的に、これらの濃度の１つは、ネガティブ制御（すなわちゼロ濃度または測定法の検出限界以下の濃度）の役割を果たす。
【０１２７】
インキュベーション後、薬剤バイアス結合および（または）本発明の（ポリ）ペプチドと１つ以上の結合標的との間の親和性は任意の好都合な方法によって検出する。無細胞結合型測定法に対しては、未結合組成物から結合組成物を分離するため、分離ステップが多くの場合用いられる。分離ステップは種々の方法で達成することが可能である。都合よく、少なくとも１つの組成物を任意の固形基質上に固定化し、未結合組成物をその固形から都合よく分離することが可能である。固形基質は、さまざまな材料からさまざまな形状、例えばマイクロタイターのプレート、ミクロビーズ、尿試験紙、樹脂粒子などで作成することが可能である。基質は、洗浄およびコストの容易／緩和するために、信号雑音比を最大化し、主にバックグラウンド結合を最小化するように選択する。
【０１２８】
分離は、例えば、ビーズまたは尿試験紙を貯蔵槽から除去することによって、例えばマイクロタイタープレートウェルのような貯蔵槽を空または希釈することによって、ビーズ（例えば鉄コア付きのビーズは磁石を用いて容易に単離および洗浄することが可能である）、粒子、クロマトグラフィーのカラムまたは洗浄溶液または溶剤を有するフィルタをリンス（洗浄処理）することによって発効することが可能である。典型的に、分離ステップには、拡張リンスまたは洗浄または複数のリンスおよび洗浄が含まれる。例えば、固形基質がマイクロタイターのプレートである場合、塩類、緩衝剤、洗剤、非特異性のタンパク質などのような特定の物質との結合に関与しないインキュベーション混合体の組成物が典型的に含まれている洗浄溶液を用いて、ウェルを数回にわたって洗浄することが可能である。
【０１２９】
別法として、無細胞の結合型測定法は、分離ステップ、例えばシンチレーション近接測定法（ＳＰＡ）や同種の時間分解蛍光測定法（ＨＴＲＦＡ）を必要としない均一形態において実施することが可能である。さらに使用可能である方法には、蛍光極性化（ＦＰ）および蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）が含まれる。
【０１３０】
検出は任意の好都合な方法で発効することが可能である。１つ、２つ、および３つのハイブリッドスクリーンのような細胞基調測定法の場合、Ｕｎｃ−５１標的結合から生じた転写物は普通、直接的または間接的に検出可能な生成物をコードする（例えばガラクトシダーゼ活性、ルシフェラーゼ活性など）。無細胞の結合アッセイの場合は普通、組成物の１つは標識を包含するか、または標識に連結される。さまざまな標識、実質的には結合タンパク質の検出を提供する任意の標識を用いることが可能である。標識は、放射能、発光、光の分極化、光学または電子濃度などの直接検出、またはエピトープタグ、酵素などの間接検出を提供することが可能である。標識は、タンパク質、例えば亜リン酸の放射性同位元素から成るリン酸塩基に付属することができ、またはタンパク質構造、例えば硫黄の放射性同位元素から成るメチオニン残基に取り込むことも可能である。
【０１３１】
標識および他の測定法の組成物の性質にもよるが、種々の方法を用いて特定の標識を検出することが可能である。例えば、標識を含んだ結合複合体の固形基質またはその一部に結合した検出可能な標識は、その固形基質から分離することが可能であり、その後には検出された標識から分離することが可能である。標識は、光学または電子濃度、照射性の放出、非照射性エネルギー伝達、分極光放出などを通して直接的に検出することが可能であり、または抗体包含体などを用いて間接的に検出することも可能である。例えば、放射性標識の場合、例えば粒子カウンタを用いると、放出を直接的に検出することができ、または例えばシンチレーション反応混液およびカウンタを用いると、放出を間接的に検出することも可能である。
【０１３２】
本発明の（ポリ）ペプチドの、薬剤が欠如した標的に対する結合親和性と、薬剤が存在する標的に対する結合親和性とを比較した場合の差異は、薬剤がＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭポリペプチドの結合をＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ結合標的に対して調整することを示す。本明細書に使用される差異は、統計的に有意であり、望ましくは少なくとも５０％、より望ましくは少なくとも９０％の差異を表す。
【０１３３】
類似して、細胞基調測定法において、薬剤が存在する場合と欠如している場合のＵｎｃ−５１依存活性の差異は、薬剤がＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ細胞機能またはＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ発現を調整することを示す。そのような細胞基調アプローチには、一過性または安定発現アッセイが関与する。この方法において、細胞は、要するに本発明の一部の（ポリ）ペプチドおよびＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ反応性のプロモーターの転写制御下にあるレポーターから成るポリペプチドをコードする１つ以上の構成物によって形質移入される。細胞はまた、Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ活性化剤、例えばＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ活性を刺激する能力のある受容体などをコードする構成物によって有利に同時形質移入されることが可能である。別法として、脂肪プロモーター自体が好適なレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼに連鎖することができ、細胞基調測定法において使用されると、上方制御または下方制御を介して脂肪発現を調節する能力のある化合物に対してスクリーニングすることが可能である。
【０１３４】
本明細書に記載した方法は、特にロボット液体予製ワークステーションを使用する自動高処理量薬物スクリーニングに適している。類似のロボット自動化は、高処理量細胞プレーティングおよび種々の測定法読み出しの検出のために利用可能である。
【０１３５】
本発明の核酸分子の発現または本発明の（ポリ）ペプチドの結合パートナーとの関連性を調節する前掲の候補薬剤は、動物およびヒト試行用に貴重な試薬を医薬品産業に提供する。標的治療の指標は、標的Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ細胞機能（例えば遺伝子発現または結合パートナーとの関連）が調節の対象となる場合のみに限定されている。特に、薬物スクリーニング測定法から取得した候補薬剤および、その対象組成物、例えばＵｎｃ−５１由来の核酸または治療ポリペプチドは、肥満症、癌のような消耗症に関連した障害、感染性の疾病およびＨＩＶ感染、または過食症の治療を含む体重調節およびエネルギー恒常性に関連した疾病における治療アプリケーションを提供する。下記に記述されているように、適応症に対して、これらの組成物および薬剤は、都合良くは、生理的受容可能な担体、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水、生理食塩水、脱イオン水などで、任意の便利な方法、望ましくは非経口的によって投与することが可能である。安定剤、殺菌剤などのような、その他の添加物も含むことが可能である。典型的には、組成物は、血液または関節液のような保有生理液に加えられる。一般に、投与量は、例えば治療目的、投与経路、および患者の条件によって、経験的に決定される。典型的に、臨床家は、投与量が所要の生物学的効果を提供する量に達するまで、本発明の分子を投与する。この療法の進歩状況は、従来の測定法によって容易に監視される。
【０１３６】
本発明の方法によって同定した化合物または薬剤を精製する方法は下記から成る。
（ａ）当該化合物による疑ペプチド（peptidomimetic）のモデリング法；および
（ｂ）モデル化合物の化学的合成法。
【０１３７】
疑ペプチド（peptidomimetic）は当分野で公知であり、特に、Beeley, Trends Biotech 12 （1994）, 213-216, Wiley, Med. Res. Rev. 13 （1993）, 327-384, Hruby, Biopolymers 43 （1997）, 219-266、またはそこで引用された参照または上記に引用された参照において開示されている。
【０１３８】
疑ペプチド（peptidomimetic）の組み合わせライブラリの生成および使用の方法は、従来の技術、例えば Ostresh, Methods in Enzymology 267 （1996）, 220-234 and Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 （1996）, 709-715 に記載されている。化学的誘導体および類似体の化学的合成および（または）調製（調合）のための方法は当業者に公知であり、例えば Beilstein （前掲）および "Organic Synthesis", Wiley, New York, U.S.A.（前出を参照）に記載されている。
【０１３９】
上記の疑ペプチド（peptidomimetic）方法および（または）化学的合成、修飾または精製に関する方法は、本発明の化合物上、例えば（ポリ）ペプチド上または本発明の融合タンパク質上に直接的に用いることが可能であることが本発明において構想される。
【０１４０】
本発明は、本発明の化合物の処方、本明細書に記載した方法によって同定した化合物または薬剤、または医薬的受容が可能な担体および（または）希釈剤を用いて上記の方法によって精製した化合物から成る組成物を産出する方法に関連するものである。
【０１４１】
好適な医薬品担体、賦形剤および（または）希釈剤の実施例は、当分野で公知であり、リン酸塩緩衝生理食塩水溶液、水、乳濁液、油／水のような乳濁液、種々のタイプの湿潤剤、消毒した溶液などが含まれる。そのような担体から成る組成物は公知の従来の方法によって調剤することができる。これらの医薬組成物は、被験者に好適な投与量で投与することができる。好適な組成物の投与は、幾つかの異なる方法、例えば静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所的投与、皮内投与、鼻腔内投与または気管支内投与によって発効することが可能である。投与量の投与計画は、主治医および臨床要因によって決定される。医術分野において公知のように、任意の患者に対する投与量は、患者のサイズ、体図面積、年令、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、一般的な健康、およびその他の同時に投与される薬物を含んだ多くの要因によって決定される。タンパク性の医薬用活性物質は、１投与当たり１ｎｇ〜１０ｍｇの量を処方することが可能である。但し、特に前記の要因を考慮すると、この模範的範囲の以下または以上の場合も想定される。投与計画が継続的な注入の場合、投与範囲はそれぞれ体重１キロ当たり毎分１μｇ〜１０ｍｇ単位とする。進歩状況は定期的なアセスメントによって監視する。本発明の組成物は、局所的または全身的に投与することが可能である。本発明の組成物は、標的部位、例えば遺伝子銃送達によって内部または外部の標的部位、またはカテーテルによって動脈内の部位に直接的に送達することも可能である。非経口的な投与の製剤（調合）には、消毒水溶性または非水溶性溶液、検査液、および乳濁液が含まれる。非水溶性溶剤の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような野菜油、および注射用のオレイン酸エチルのような有機のエステルがあげられる。水溶性担体には、乳濁液または検査液、生理食塩水および緩衝培地を含んだ水、アルコール性／水溶性の溶液が含まれる。非経口的な媒介物には、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内の媒介物には、液体および栄養素補充薬、電解質補充薬（例：ブドウ糖リンゲル液上の基調）などが含まれる。防腐剤およびその他の添加物、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなども存在することが可能である。さらに本発明の医薬組成物は、医薬組成物の使用目的にもよるが、さらなる薬剤を包含することが可能である。
【０１４２】
その上、本発明は、本発明の化合物または本発明の方法によって同定した化合物または薬剤から成る組成物を産出する下記のステップから成る方法を提供する。
（ａ）下記を達成するために、本発明の化合物、または本発明の方法によって主要化合物として同定した化合物または薬剤を修飾するステップ。
（ｉ）処置の修飾部位、活性のスペクトラム、器官の特異性および（または）
（ｉｉ）改良された作用強度、および（または）
（ｉｉｉ）減少した毒性（改良された治療学指数）、および（または）
（ｉｖ）減少した副作用、および（または）
（ｖ）治療処置の修飾発病、効果期間および（または）
（ｖｉ）修飾された薬物動態学的（pharmakinetic）パラメータ（再吸収、分配、代謝および排泄）、および（または）
（ｖｉｉ）修飾物理化学的パラメータ（溶解度、吸湿性、色、味、匂い、安定性、状態）、および（または）
（ｖｉｉｉ）改良された一般的な特異性、器官／組織特異性、および（または）
（ｉｘ）最適化されたアプリケーション形態および経路
（ｉ）カルボキシル基のエステル化、または
（ｉｉ）炭素酸を用いたヒドロキシル基のエステル化、または
（ｉｉｉ）例えばリン酸塩、ピロリン酸または硫酸塩またはヘミコハク酸塩へのヒドロキシル基のエステル化、または
（ｉｖ）医薬用に受容可能な塩類の形成、または
（ｖ）医薬的受容が可能な複合体の形成、またはまたは
（ｖｉ）薬剤的に活性ポリマーの合成、または
（ｖｉｉ）親水性の成分の導入、または
（ｖｉｉｉ）アロマート（aromate）上の置換基の導入／交換または側鎖、置換基型の変化、または
（ｉｘ）等比体積または生物学的等価性の成分の導入による修飾、または
（ｘ）相同性化合物の合成、または
（ｘｉ）分枝側鎖の導入、または
（ｘｉｉ）サイクリック類似体へのアルキル置換基の変換、または
（ｘｉｉｉ）ケタール、アセタールへのヒドロキシル基の誘導体化、または
（ｘｉｖ）アミド、フェニルカルバメートへのＮ-アセチル化、または
（ｘｖ）Mannich 基剤、イミンの合成、または
（ｘｖｉ）Schiff 基剤、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チアゾリジン（thiozolidine）へのケトンまたはアルデヒドの形質転換
（ｂ）医薬用に受容可能な担体を用いる当該修飾の生成物の製剤
上記に記載したように、医薬的受容が可能な担体は当分野で公知である。また、本発明の化合物、すなわち本発明の（ポリ）ペプチドまたは融合タンパク質、本発明の核酸分子も、上記の方法において組成物を産出するために用いられることが構想される。望ましくは、当該組成物は、本明細書に記載したように医薬組成物である。
【０１４３】
以上の点から、より好適な実施例において、本発明は、本発明の化合物または本発明の方法によって同定した化合物または薬剤から成る組成物を産出する方法に関連するものであり、ここでは、当該組成物は、特に以下に記載したように、肥満症、脂肪過多症、摂食障害、過食症、消耗症および（または）体重／体質量の増加または減少につながる障害、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）、高コレステロール血症、異脂肪血症、冠動脈心疾患、骨関節炎、胆石症、生殖器官の癌、睡眠時無呼吸、ＲＯＳ産出に関連する障害、特に以下に記載した障害などを防止または治療するための医薬組成物である。
【０１４４】
本発明が、本発明の化合物または本発明の方法によって同定した化合物または薬剤から成る組成物を産出する方法に関連するものであり、ここでの当該組成物は、肥満症、脂肪過多症、摂食障害（例：神経性過食症、神経性食欲不振症）、消耗症候群（例：悪質液）、ミトコンドリアの障害、膵臓の機能障害（例：糖尿病）、インシュリン抵抗性の予防、ＲＯＳ産出に関連する障害（例：感染、癌、老化に対する反応）を防止、軽減または治療する医薬組成物であることが特に望ましい。いくつかの疾患および障害は、ミトコンドリアの代謝における変化、および（または）アポトーシスにつながるミトコンドリア関連機能の不適正な誘発または抑制によって引き起こされるか、またはそれに関連するものと考えられてきた。これらには例証として、限定するものではないが、慢性神経変性疾患、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）など；自己免疫疾患；１型および２型を含む真性糖尿病；ミトコンドリア関連疾患、これらに限定されるものではないが、ミトコンドリアの構造異常現象を伴なう先天的筋ジストロフィー、重度のｍｔＤＮＡ枯渇を伴なう致命的小児ミオパシーおよびｍｔＤＮＡの中還元を伴なう良性「遅発型」ミオパシー、ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシス、および脳卒中）およびＭＩＤＤ（ミトコンドリアの糖尿病および聴覚障害）；ＭＥＲＦＦ（ミオクローヌス癲癇赤色ぼろ線維症候群）；関節炎；ＮＡＲＰ（末梢神経障害；失調；網膜色素変性症）；ＭＮＧＩＥ（筋疾患および外部の眼筋麻痺；末梢神経障害；胃腸路；脳症）、ＬＨＯＮ（leber's；遺伝性；視覚性；末梢神経障害）、Kearns-Sayre疾病；ピアソン症候群；ＰＥＯ（進行性外部眼筋麻痺）；ウルフラム症候群ＤＩＤＭＯＡＤ（尿崩症、真性糖尿病、視神経萎縮、聴覚障害）；リー症候群；失調；精神分裂病；および増殖障害、例えば癌、腫瘍および乾癖などがあげられる。
【０１４５】
なお他の実施例において、本発明は下記の成分から成る化合物を提供する。
（ａ）本発明またはその方法によって同定または精製した本発明の（ポリ）ペプチドの阻害（抑制）薬；
（ｂ）本明細書に記載した方法または本発明の核酸分子によって同定した遺伝子の発現の阻害（抑制）薬；および（または）
（ｃ）本発明の方法によって同定した化合物。
【０１４６】
本発明の（ポリ）ペプチドの当該阻害（抑制）薬は、本発明の野生型（ポリ）ペプチドの阻害（抑制）薬、Ｕｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭタンパク質として機能する化合物であり得る。体重減少の誘発につながる可能性のある当該阻害（抑制）薬は、調節細胞（膵臓のベータ-細胞）に影響を及ぼし、それによってベータ-細胞機能の改良、またはインシュリン抵抗性の防止を行うので、ＲＯＳ濃度（老化、発癌および虚血耐性現象の増大における分子損傷の減少の原因）の低減を引き起こすＲＯＳ（反応酸素種）産出を変えることが可能である。但し、組織特定の反応および代謝状況が原因で、逆効果も発生し得る。当該阻害（抑制）薬は、本発明の（ポリ）ペプチドの変異形態と特異的に相互作用する阻害（抑制）薬でもあるため、体重の減少につながること、または現在の体重を維持することが可能である。
【０１４７】
本発明の方法によって同定した（ポリ）ペプチドの用語「阻害（抑制）薬」は、本発明の方法によって同定したように、（ポリ）ペプチドの相互作用の活性および（または）機能に影響する、阻害（抑制）薬にも関連するものであることは当然のことながら共通認識とする。当該相互作用は直接または間接のいずれでもあり得る。当該「阻害（抑制）薬」は、本明細書に定義したようにその結合標的／薬剤で、本発明の（ポリ）ペプチドの相互作用を妨害および（または）修飾することも可能である。上記は、用語「本発明の核酸分子の発現または本発明の方法によって同定した遺伝子の阻害（抑制）薬」に準用する。当該阻害（抑制）薬は、転写および（または）翻訳プロセスを妨害する可能性がある。
【０１４８】
同様に、本発明は下記の成分から成る組成物に関連する。
（ａ）本発明の（ポリ）ペプチドまたは上記に記載の方法によって同定または精製した（ポリ）ペプチドの刺激剤；
（ｂ）本発明の核酸分子の発現または本発明の方法によって同定した遺伝子の刺激剤；
（ｃ）本発明の方法によって同定した化合物；および（または）
（ｄ）本発明のベクター。
【０１４９】
本発明の用語「（ポリ）ペプチドの刺激作用」は、本発明の（ポリ）ペプチドの刺激剤（活性化剤）として機能する化合物に関連するものである。当該刺激剤／活性化剤は、重量増加の誘発につながる可能性があり、消耗症の治療に有用である。当該刺激剤／活性化剤は、免疫反応における有効性の増加につながるＲＯＳ産出を変えることも可能である。なお、組織特定の反応および代謝状況に起因して、逆効果も構想される。本明細書に記載した「刺激剤」は、特に本発明の（ポリ）ペプチドのその結合標的との相互作用の増加につながることが可能である。その用語はまた、本発明の（ポリ）ペプチドの変異形態の刺激剤／活性化剤にも関連するものである。その変異形態の当該刺激剤は、体重の増加または現体重の維持につながることが可能である。
【０１５０】
「阻害剤」のほかに、「本発明の（ポリ）ペプチドの刺激剤」もまた、当分野で公知および本明細書で開示した方法によって、演繹および（または）評価することが可能である。
【０１５１】
用語「本発明の方法によって同定または精製した（ポリ）ペプチドの刺激剤」は、本発明の方法によって同定したように（相互作用する）（ポリ）ペプチドの活性／機能に影響する刺激剤にも関連するものであり、それらは、当該（ポリ）ペプチドと、直接または間接様式のいずれかで相互に影響することが可能である。上記に定義した用語「阻害（抑制）薬」に対して既に述べたように、上記は、用語「本発明の核酸分子の発現または本発明の方法によって同定した遺伝子の刺激剤」に対しても準用する。
【０１５２】
上記の「阻害剤」および「刺激剤」は、（ポリ）ペプチドに関連するばかりでなく、本発明の（ポリ）ペプチドおよび（または）核酸分子、または本発明の方法によって同定した（ポリ）ペプチドおよび（または）遺伝子に結合、妨害、および（または）相互に影響する小分子を含むことも可能である。そのような小分子の実施例には、小ペプチド、無機質および（または）有機質または、Ｄアミノ酸を含むペプチド類似物のようなペプチド様の分子から成るが、それらに限定されるものではない。当該「阻害剤」および「刺激剤」には、抗体、誘導体および（または）その断片、アプタマーまたは特定の（オリゴ）ヌクレオチドがさらに包含される。その「阻害剤」および「刺激剤」は、本明細書で開示したように、医薬組成物および（または）診断用の組成物の一部でもあリ得る。
【０１５３】
上記に指摘したように、当該「阻害剤」または「刺激剤」には、上記の定義のとおり小さな有機化合物を含むことも可能である。
【０１５４】
加えて、本発明は、本発明の核酸分子、本発明の（ポリ）ペプチド、本発明の融合タンパク質、抗体または断片またはその誘導体または本発明のアプタマーまたは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドから成る組成物に関連するものである。さらに、当該組成物には、本発明の方法によって同定したように、（ポリ）ペプチド、核酸分子、遺伝子および（または）化合物または薬剤を包含することが可能である。
【０１５５】
本発明の好適な実施例において、当該組成物は治療用の組成物である。医薬的受容が可能な担体から成る医薬組成物を、随意的に上記に記載した。本発明の医薬組成物は、食欲調節および（または）エネルギー代謝の複雑な障害の治療および（または）予防に特に有用である。限定するものではないが、当該医薬品成分が肥満症、脂肪過多症、摂食障害、過食症、体重／重量の障害、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）、ＲＯＳ産出に関連した障害などの治療および（または）防止に用いられることは特に好適である。但し、当該医薬組成物が、障害、特に消耗症（悪質液）、癌または感染性の疾患が原因の体重減少または免疫不全の患者、例えばＨＩＶ患者における体重減少において使用されることも構想される。
【０１５６】
さらに、本発明の医薬組成物は、体重／質量障害の治療において使用されたその他の薬剤と組み合わせて使用可能であることも構想される。当該薬剤には、食物摂取を減少／促進する薬剤、栄養素吸収を遮断／活性化する薬剤、熱産生を増加／減少する薬剤、脂肪および（または）タンパク質代謝または保管を調節する薬剤、体重を制御する中枢制御機構を調節する薬剤が包含されるがそれらに限定されるものではない。当該薬剤には、特に、シブトラミン、オーリスタット、エフェドリンまたはカフェイン、ジエチルプロピオン、フェンテルミン、フルオキセチン、セルトラリン、またはフェニルプロパノールアミンのような薬剤を含むことが可能である。
【０１５７】
さらに、本発明は、本発明の核酸分子、本発明の（ポリ）ペプチド、本発明の融合タンパク質、抗体、誘導体またはその断片、本明細書に定義した少なくともプライマーまたはプライマーのセットである本発明のアプタマー、または本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドから成る組成物に関連するものである。特に有用なプライマーは、特に補足実施例において使用したプライマーである。本発明の核酸分子から演繹されたプライマーは、診断または科学的な目的に使用されることが、例えば構想される。当該プライマーを用いて、特に、個々におけるＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ遺伝子の突然変異体を見出すこと、および（または）検証することが可能である。望ましくは、当該個体はヒトである。さらには、本明細書で開示した核酸配列から演繹したプライマーを用いて、さらなる種において相同性配列を検出するおよび（または）単離することが可能である。
【０１５８】
特定の好適な実施例において、当該組成物は診断用の組成物である。当該診断用の組成物には、上記に定義した成分を含むことができ、ここでは当該組成物は上記に定義したように、固形担体に結合／付着および（または）連鎖する。当該診断用の組成物が、（ミクロ）チップ上に本発明の化合物を包含することもさらに構想される。以上の点から、当該診断用の組成物には、特にいわゆる「遺伝子チップ」上の本発明の核酸分子、またはいわゆる「タンパク質チップ」上の本発明の（ポリ）ペプチドを包含することが可能である。診断遺伝子チップには、例えば、動物、具体的にはヒトのＵｎｃ−５１遺伝子において突然変異体を特異的に検出する本発明の核酸分子のコレクションを包含することが可能である。当該診断組成物および具体的には上記に記載された診断遺伝子チップは、例えば肥満症、脂肪過多症、体重／重量の障害、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）、ＲＯＳ産出に関連した障害などの根底にある（遺伝的な）欠陥に対して患者をスクリーニングするために特に有用である。
【０１５９】
診断用の組成物において使用される本発明の当該化合物は、検出可能な程度に標識化されることが好適である。生体分子標識化のための種々の技術は、入手可能であり、当業者に公知されており、本発明の範囲内に含まれるものとする。そのような技術は、例えば、Tijssen, "Practice and theory of enzyme immuno assays", Burden, RH および von Knippenburg （Eds）, Volume 15 （1985）, "Basic methods in molecular biology"； Davis LG, Dibmer MD； Battey Elsevier （1990）, Mayer らの（Eds） "lmmunochemical methods in cell and molecular biology" Academic Press, London （1987）, または"Methods in Enzymology", Academic Press, Inc. のシリーズに記載されている。
【０１６０】
多くの異なる標識および標識化の方法が当業者には公知である。本発明において使用する標識タイプの例には、酵素、放射性同位元素、コロイド性金属、蛍光性化合物、化学発光化合物、および生物発光の化合物が含まれる。
【０１６１】
さらに、本発明は下記の使用法に関連する。
（ａ）本発明の方法によって同定または精製された（ポリ）ペプチドの阻害（抑制）薬；
（ｂ）本発明の方法によって同定された遺伝子の発現の阻害（抑制）薬；および（または）
（ｃ）本発明の方法によって同定された化合物；
肥満症、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群（例えば悪質液）、ミトコンドリアの障害、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）、ＲＯＳ産出に関連した障害などの治療のための医薬組成物の調製（調合）用。
【０１６２】
同様に、本発明はまた下記の使用法も提供する。
（ａ）本発明の方法によって同定または精製された（ポリ）ペプチドの刺激剤；
（ｂ）本発明の方法によって同定された遺伝子の発現の刺激剤；および（または）
（ｃ）本発明の方法によって同定された化合物；
肥満症、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群（悪質液）、ミトコンドリアの障害、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）、ＲＯＳ産出に関連した障害などの治療のための医薬組成物の調製（調合）用。
【０１６３】
さらに本発明は、肥満症、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群（悪質液、また癌、ＨＩＶ-感染）、本明細書に記載したミトコンドリアの障害、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）（例：糖尿病）、障害に関連するＲＯＳ産出（例：癌、老化、感染）などに対する治療、軽減および（または）予防のための医薬組成物の調製（調合）用に、本発明の方法によって同定された薬剤の使用法に関連するものである。
【０１６４】
特定の好適な実施例において、本発明は、細胞小器官における膜安定性および（または）機能に寄与する能力があり、ミトコンドリアのタンパク質を修飾する能力があり、および（または）細胞代謝に影響を及ぼす能力のあるポリペプチドの検出に対する、上記に定義したショウジョウバエの使用法に関連するものである。
【０１６５】
さらに、本発明は、核酸分子、ベクター、宿主、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体または断片またはその誘導体または抗血清、アプタマーまたは他の受容体および本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのうち、少なくとも１つから成るキットを提供する。都合よく、本発明のキットには、随意的に反応緩衝剤、保管溶液および（または）残存試薬または科学的または診断的な測定法などを行なう上に必要とされる材料がさらに包含される。さらに、本発明のキットの部品は、バイアルまたはビンまたはその組み合わせ容器または多容器単位で個別にパッケージすることができる。
【０１６６】
本発明のキットは、特に本発明の（ポリ）ペプチド産出の方法を実行するために有利に使用することができ、本明細書で言及する種々のアプリケーション、例えば診断キット、研究用具または予防接種用具として使用することが可能である。その上、本発明のキットには、科学的な医療および（または）診断目的に好適な検出の手段を包含することが可能である。キットの製造は、望ましくは当業者に公知の標準製法に従うものとする。
【０１６７】
図１：ショウジョウバエ脱共役タンパク質（ＵＣＰｙ）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列
図ＩＡ：ショウジョウバエ脱共役タンパク質（ＵＣＰｙ）（配列識別番号１）の完全長ｃＤＮＡ
図１Ｂ：ショウジョウバエ脱共役タンパク質（ＵＣＰｙ）（配列識別番号２）の演繹オープンリーディングフレーム
図１Ｃ：ショウジョウバエ脱共役タンパク質（ＵＣＰｙ）（配列識別番号３）をコードするアミノ酸配列（単一文字コード）
図２Ａ-Ｅ：キイロショウジョウバエ、マウス、およびヒトからのＵＮＣ-５１様タンパク質のＣＬＵＳＴＡＬＸ（１．８）複数アミノ酸配列アライメントアライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＶソフトウェア（Higgins,D.G. および Sharp,P.M. （1989）. CABIOS, vol. 5, no. 2, 151-153.）の複数配列アライメントプログラムを使用して産生した。ｈｓＮＰ＿００３５５６はヒトＵＬＫ-１タンパク質であり、ｍｍＮＰ＿０３３４９５はマウスＵＬＫ-１を指し、ｈｓＮＰ＿０５５４９８はヒトＵＬＫ-２タンパク質であり、ｍｍＢＡＡ７７３４１はマウスＵＬＫ-２を指し、ｄｍＡＡＦ４９８７８はショウジョウバエＵＮＣ-５１様タンパク質を指す。同一のアミノ酸残基は星印でマークした。
【０１６８】
図３：哺乳動物の組織におけるＵｎｃ５１の発現
図３Ａ：野生型マウスの組織におけるＵｎｃ５１様キナーゼ１のリアルタイムＰＣＲ分析相対ＲＮＡ発現は左側に示し、テストした組織は水平線上に示した。ＷＡＴ＝白色脂肪組織、ＢＡＴ＝茶色脂肪組織
図３Ｂ：３Ｔ３-Ｌ１細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＵｎｃ５１様キナーゼ１発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較相対ＲＮＡ発現は左側に示し、日数差は水平線上に示した（ｄ０＝第０日目、実験開始、至ｄ１０＝第１０日目）。
【０１６９】
図３Ｃ：３Ｔ３-Ｆ４４２Ａ細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＵｎｃ５１様キナーゼ１発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較相対ＲＮＡ発現は左側に示し、日数差は水平線上に示した（ｄ０＝第０日目、実験開始、至ｄ１０＝第１０日目）。
【０１７０】
図４：Ｒｏｍａ１をコードするヌクレオチドおよびタンパク質配列
図４Ａ：キイロショウジョウバエＲｏｍａ１遺伝子をコードするオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（ＧＡＤＦＬＹアクセッション番号ＣＧＩ５０８１、ｐｐ-ＣＴ３４９５６）（配列識別番号４）
図４Ｂ：キイロショウジョウバエＲｏｍａ１タンパク質の演繹アミノ酸配列（文字コードで示した）（ＧＡＤＦＬＹアクセッション番号ＣＧ１５０８１、ｐｐ-ＣＴ３４９５６）（配列識別番号５）
図５：ＲＯＭＡ１タンパク質（ライン１；配列識別番号５）、ヒトＢＡＰ３７タンパク質（ライン２、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００６６３９．１）、マウスＢＡＰ３７タンパク質（ライン３、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３１５５７．１）間のアミノ酸配列アライメントを示す。アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＶソフトウェア（Higgins,D.G. および Sharp,P.M. （1989）. CABIOS, vol. 5, no. 2, 151-153.）の複数配列アライメントプログラムを使用して産生した。
【０１７１】
図６：哺乳動物の組織におけるＲＯＭＡ１の発現
図６Ａ：野生型マウスの組織におけるＲＯＭＡ発現のリアルタイムＰＣＲ分析相対ＲＮＡ発現は左側に示し、テストした組織は水平線上に示した。ＷＡＴ＝白色脂肪組織、ＢＡＴ＝茶色脂肪組織
図６Ｂ：３Ｔ３-Ｌ１細胞の前脂肪細胞から脂肪細胞への分化中のＲＯＭＡ発現のリアルタイムＰＣＲ法間接比較相対ＲＮＡ発現は左側に示し、日数差は水平線上に示した（ｄ０＝第０日目、実験開始、至ｄ１０＝第１０日目）。
【０１７２】
図７Ａ-Ｄ：ヒト２ＴＭ相同性タンパク質のアミノ酸配列（１文字コード）を示す
図８はキイロショウジョウバエからの２ＴＭタンパク質（ＧａｄＦｌｙアクセッション番号ＣＧ７６２０）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ２６１２４）、およびヒト（アクセッション番号ＥＮＳＰ０００００２４２５１８配列識別番号７、ＢＧ４３２９１４ - 配列識別番号６、ＥＮＳＰ０００００２４３７８５ - 配列識別番号８、およびＥＮＳＰ０００００２５０５９４ - 配列識別番号９）間のアミノ酸配列アライメントを示す。アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＶソフトウェア（Higgins,D.G. および Sharp,P.M. （1989）. CABIOS, vol. 5, no. 2, 151-153.）の複数配列アライメントプログラムを使用して産生した。
【０１７３】
図９はショウジョウバエ（図９Ａ）およびヒト（図９Ｂ；配列識別番号７）２ＴＭタンパク質の膜貫通ドメインプロットを示す。J.Glasgow らのProc.Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology. 175-182, AAAI Press, 1998 に従って計算した。
【０１７４】
図１０は形質移入哺乳動物のＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるタグ付き２ＴＭタンパク質のミトコンドリアの局在性を示す。マウス２ＴＭタンパク質の発現ベクターでＮＩＨ３Ｔ３細胞を一過性に形質移入し、フラグタグで特異的に標識し、そのフラグタグに対して抗血清で固定および免疫染色した（実施例を参照）。
【０１７５】
実施例
本発明のより良い理解およびその多くのメリットは、図示によって示された次の実施例から明らかであろう。
【０１７６】
実施例１：ヒト脱共役タンパク質（ＵＣＰｓ）に対して相同性を有するイロショウジョウバエ遺伝子のクローニング
ヒトＵＣＰ２およびＵＣＰ３遺伝子に対して配列相同性を有するショウジョウバエ遺伝子を探すために、「ブラスト」相同性検索を公共データベース（ＮＣＢＩ／ＮＩＨ）において実施した。検索は、ＵＣＰ相同性を有するショウジョウバエ遺伝子ファミリーの配列断片を産出した。それらは明らかに、隣接する関連ミトコンドリアのタンパク質（オキシグルタミン酸担体）と異なる。
【０１７７】
この遺伝子の１つの配列断片（ｄＵＣＰｙと称する）を用いて、
ＰＣＲ法プライマーペアを生成し（上位５'-ＣＴＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＡＣＡＴＡＧ（配列識別番号１０）、下位５'-ＡＡＡＡＧＡＣＡＴＡＧＡＡＡＡＴＡＣＧＡＴＡＧＴ（配列識別番号１１）および標準ＰＣＲ法条件を用いてＰＣＲ法反応をショウジョウバエｃＤＮＡ上に実施した。増幅生成物を放射的に標識化し、成体のショウジョウバエハエ（ストラタジーン社）から作成したｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために使用した。完全長ｃＤＮＡクローン化を単離、配列し、さらに後の実験に使用した。ＵＣＰｙのヌクレオチド配列および演繹オープンリーディングフレームを図１Ａおよび図１Ｂに示した。
【０１７８】
実施例２：ｄＵＣＰｙｃＤＮＡのショウジョウバエ発現ベクターへのクローニング
ショウジョウバエ細胞におけるｄＵＣＰｙの発現効果をテストするために、制限部位ＮｏｔｌおよびＫｐｎｌを用いて、ｄＵＣＰｙｃＤＮＡを発現ベクターｐＵＡＳＴにクローニングした（参照： Brand A & Perrimon N, Development 1993, 118：401-415）。結果として生じた発現構成物を、ショウジョウバエ胚の生殖細胞系列およびショウジョウバエの菌株に注入して、安定した構成物の統合を生成した。発現ベクターｐＵＡＳＴは、ショウジョウバエ細胞には通常存在しない酵母菌転写因子Ｇａｌ４によって活性化されるので、ｄＵＣＰｙは、これらの遺伝子組換え動物には未だ発現されていない。ｐＵＡＳＴ-ｄＵＣＰｙハエが、組織特定の様式でＧａｌ４を発現する第２のショウジョウバエ菌株と交雑する場合、この交配による子孫ハエは、組織を発現するＧａｌ４においてｄＵＣＰｙを発現する。
【０１７９】
その本体の全細胞においてＧａｌ４を発現する菌株とのｐＵＡＳＴ-ｄＵＣＰｙハエの交雑種は（アクチンプロモーターの制御下にて）生存可能な子孫を示さなかった。これは、全細胞におけるｄＵＣＰｙの過剰発現が致死的であることを意味する。この発見は、ｄＵＣＰｙの過剰発現が細胞エネルギーの産出の崩壊を引き起こすという仮定と一致している。
【０１８０】
眼（「無眼」遺伝子の眼特異性プロモーターの制御下にあるＧａｌ４）のような非重要器官におけるｄＵＣＰｙの発現は結果として、目に見えて損傷した眼を有するハエを生じる。この容易に可視の眼表現型は、ＵＣＰ活性を修飾できる遺伝子産物の遺伝的スクリーニングの根拠である。
【０１８１】
実施例３：ｄＵＣＰｙ修飾因子のスクリーニング
眼にＧａｌ４発現を有する菌株のゲノム部分とｐＵＡＳＴ-ｄＵＣＰｙ構成物を保有する菌株とを、ゲノム組換え（再結合）を用いて１つの染色体上に混合した。結果として生じたハエ菌株は、ｄＵＣＰｙ発現によって永久に損傷された眼を有する。この菌株のハエを、変異誘発したハエ菌株の大きな収集のハエと交雑種せしめた。この変異体収集において、特別発現システム（EP-element, 参照： Rorth P, Proc Natl Acad Sci U S A 1996, 93（22）：12418-22）を異なるゲノム座位でランダムに統合した。酵母菌転写因子Ｇａｌ４は、ＥＰエレメントに結合し、そしてＥＰエレメントの統合部位を閉じる内在性遺伝子の転写を活性化することができる。遺伝子の活性化は以上の点から、ｄＵＣＰｙを過剰発現する同一細胞（眼）において発生する。変異体収集は、ＥＰエレメントの異なる統合部位を有する数千の菌株を含むので、遺伝子の発現がｄＵＣＰｙ活性と相互作用するかどうかを確認するために、多数の遺伝子をテストすることが可能である。遺伝子が、ＵＣＰ活性エンハンサーとして作用する場合には、眼欠陥は悪化され；抑制因子として作用する場合には、その欠陥は回復される。
【０１８２】
このスクリーニングを用いて、ここにＲＯＭＡ１および（または）２ＴＭ（眼表現型を促進する遺伝子はＵｎｃ−５１）と称する抑制活性を有する新規遺伝子を発見した。
【０１８３】
実施例４：ショウジョウバエからのＵｎｃ−５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭのクローニング
ＥＰエレメントを救出する眼欠陥に近傍するゲノムＤＮＡを逆ＰＣＲ法によってクローニングし、配列した。この配列を、ショウジョウバエ遺伝子の公共データベースにおいて「ブラスト」検索に用いた。
【０１８４】
Ｕｎｃ−５１：データベース検索は、ＥＰエレメントがＣＧ１０９６７（ショウジョウバエゲノムプロジェクト）として注釈された予測転写物のＡＴＧの上流に統合されていることを示した。ＣＧ１０９６７の演繹タンパク質配列を図２に示した。
【０１８５】
ＲＯＭＡ１：データベース検索は、ＥＰエレメントがＣＧ１５０８１、ｐｐ-ＣＴ３４９５６（ショウジョウバエゲノムプロジェクト）として注釈された予測転写物のＡＴＧの２４６ｂｐ上流に統合されていることを示した。ＣＧ１５０８１、ｐｐ-ＣＴ３４９５６のヌクレオチド配列を図４Ａに示した。演繹タンパク質配列は図４Ｂに示した。
【０１８６】
２ＴＭ：データベース検索は、ＥＰエレメントがＣＧ７６２０（ショウジョウバエゲノムプロジェクト）として注釈された予測転写物の第２エキソン中に統合されていること；その統合部位のため、遺伝子ＣＧ７６２０はおそらく不活化されている（「ノックアウト」）ことを示した。ＣＧ７６２０の演繹タンパク質配列を図８に示した。
【０１８７】
実施例５：本発明によるタンパク質の配列分析
ショウジョウバエ遺伝子の配列を用いて、公共データベース（例えばNational Institutes of Health （NIH）のNational Center for Biotechnology Information （NCBI））で哺乳動物相同体のＢＬＡＳＴ検索を行った。その類似性は前出の表１に示した。Ｕｎｃ−５１のショウジョウバエ、ヒト、およびマウス相同体の配列は、複数配列アライメントとして図２に示した。アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＶソフトウェア（Higgins & Sharp, 1989, CABIOS 5, 151-153.）の複数配列アライメントプログラムを使用して産生した。
【０１８８】
ＲＯＭＡ１のヒト相同体は、「Ｂ細胞関連タンパク質」としてアクセッション番号ＸＰ＿００６６３９．１（同一性＝１８９／２６１（７２％）、ポジティブ＝２３６／２６１（９０％）；そのＤＮＡ配列はまた、特許申請ＷＯ００／４０７５２においてＡＸ０２６５４９として開示されている）の下に注釈した。マウス相同体は、アクセッション番号ＮＰ＿０３１５５７．１（同一性＝１８５／２６０（７１％）、ポジティブ＝２３１／２６０（８８％））の下に入手可能である。ＲＯＭＡ１のヌクレオチドおよびタンパク質配列はそれぞれ図４Ａおよび図４Ｂに示した。ヒトおよびマウス相同性タンパク質を有するショウジョウバエＲＯＭＡ１のタンパク質配列アライメントは図５に示した。アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＶソフトウェア（Higgins & Sharp, 1989, CABIOS 5, 151-153.）の複数配列アライメントプログラムを使用して産生した。
【０１８９】
ヒト相同体２ＴＭタンパク質のタンパク質配列は図７Ａ〜７Ｄに示し、類似性は前出の表２に示し、およびヒトおよびマウス相同性タンパク質を有するショウジョウバエ２ＴＭタンパク質のタンパク質配列の配列アライメントは図８に示した。２ＴＭタンパク質は２つの特有の膜貫通ドメインを示した。図８を参照。
【０１９０】
実施例６：哺乳動物の組織におけるポリペプチドの発現
本発明において開示した哺乳動物の組織におけるポリペプチドの発現を分析するため、いくつかのマウス菌株（望ましくは、標準モデル系における肥満症および糖尿病の研究であるマウス菌株Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ、Ｃ５７Ｂｌ／６ｏｂ／ｏｂおよびＣ５７Ｂｌ／ＫＳｄｂ／ｄｂ）は、Harlan Winkelmann （33178 Borchen、Germany）から購入し、一定の温度下に維持した（望ましくは２２℃）、湿度４０パーセントおよび明／暗サイクルは望ましくは１４／１０時間とする。マウスには標準食を与えた（例えば、ssniff Spezialitaten 有限責任会社、製品番号 ssniff M-Z VI 126-000）。動物は６〜８週間の年令で屠殺した。動物組織は、当業者であれば既知の標準手順に従って単離し、液体窒素で簡易冷凍し、必要となるまで零下８℃にて保管した。
【０１９１】
本発明において開示した生体外分化におけるタンパク質の役割を分析するため、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換のための異なる哺乳動物細胞の培養細胞、哺乳動物の線維芽細胞（３Ｔ３-Ｌ１）細胞（例えばGreen & Kehinde、Cell 1： 113-116、1974）を American Tissue Culture Collection（米国バージニア州ハナサスのATCC 社、ATCC-C1173）から入手した。３Ｔ３-Ｌ１細胞は線維芽細胞として維持し、従来の技術に記述されたように脂肪細胞へ分化した（例えばQiu. らの J. Biol. Chem. 276：11988-95、2001； Slieker らのBBRC 251： 225-9、1998）。分化手順のいくつかの時点、第０日目（密集日）を始めに、第２日目（ホルモン追加；例えば、デキサメタゾンおよび３-イソブチル-１-メチルキサンチン）、および１０日間を最大とする分化中には、好適な細胞のアリコットを２日毎に採取した。別法として、哺乳動物の線維芽細胞３Ｔ３-Ｆ４４２Ａ細胞（例えば、Green & Kehinde, Cell 7： 105-113, 1976）は、Harvard Medical School, Department of Cell Biology （米国ボストン州マサチューセッツ）から取得した。３Ｔ３-Ｆ４４２Ａ細胞は、線維芽細胞として維持し、前述のように脂肪細胞へ分化した（Djian、P. らの、J. Cell. Physiol.、124：554-556、1985）。分化手順のいくつかの時点、第０日目（密集日および（ホルモン追加；例えばインシュリン）を始めに、１０日間を最大とする分化中には、好適な細胞のアリコットを２日毎に採取した。３Ｔ３-Ｆ４４２Ａ細胞は、ホルモン（インシュリン）追加後に既に密集段階の生体外で分化している。
【０１９２】
ＲＮＡをTrizol試薬（例えば、ドイツ、Karlsruhe のInvitrogen 社製）を使用して、マウス組織または細胞の培養細胞から単離した。およびさらに、RNeasy キット（例えば、ドイツ、Qiagen 社製）と共に、DNase-treatment を使用し、製造者の指示に従って当業者であれば既知の方法で精製した。全ＲＮＡを逆転写し（望ましくはドイツ、Karlsruhe のInvitrogen 社製のSuperscript II RNaseH Reverse Transcriptase を用いる）、望ましくは Taqman 2xPCR Master Mix （ドイツ、Weiterstadt のApplied Biosystems 社；このミックスには、製造者によれば、例えばAmpliTaq ゴールド DNA ポリメラーゼ、AmpErase UNG、dUTP を有する dNTP、 Rox passive reference および最適化された緩衝液成分などが含まれている）を使用してTaqman 分析を GeneAmp 5700 配列検出システム（ドイツ、Weiterstadt のApplied Biosystems 社製）上で行った。
【０１９３】
Taqman 分析は、望ましくは下記のプライマー／プローブペアを用いて実施する：
Ｕｎｃ５１増幅用：
マウスＵｎｃ５１様キナーゼ１フォーワードプライマー（配列識別番号１２）：５'-ＣＣＡＴＧＣＴＧＴＧＣＡＡＡＴＧＧＴＡＣＡ-３'；マウスＵｎｃ５１様キナーゼ１逆プライマー（配列識別番号１３）：５'-ＴＣＧＧＴＡＣＡＣＡＧＣＣＣＴＣＴＣＧ-３'； Taqman プローブ（配列識別番号１４）：（5／&FAM）ＴＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧ（5／6-TAMRA）
ＲＯＭＡ１増幅用：
マウスＲＯＭＡフォーワードプライマー（配列識別番号１５）：５'-ＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＴＴＧＧＣＡ-３'；マウスＲＯＭＡ逆プライマー（ＳＥＣ２ＩＤＮＯ：１６）：５'-ＧＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＧ-３'； Taqman プローブ（配列識別番号１７）：（5／6-FAM）ＣＴＴＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣ（5／6-TAMRA）
図３Ａに示したように、哺乳動物（マウス）組織におけるＵｎｃ５１様タンパク質発現のリアルタイムＰＣＲ法（Taqman）分析は、Ｕｎｃ５１様キナーゼ１が異なる哺乳動物の組織において偏在的に発現され、心臓、罹病視床下部、筋肉、腎臓、肝臓、脳、および肺組織においてより高度なレベルの発現を示すことを明らかにした。白色脂肪細胞組織（ＷＡＴ）および茶色脂肪細胞組織（ＢＡＴ）における明らかな発現が観察され、エネルギー恒常性および熱産生の調節における役割を確認した。また、Ｕｎｃ５１様タンパク質を、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換のための生体外分化モデルにおいて上記のように検討した。図３に示したように、Ｕｎｃ５１様タンパク質は、３Ｔ３-Ｌ１細胞（図３Ｂ）における分化の第４日目および３Ｔ３-Ｆ４４２Ａ細胞（図３Ｃ）における分化の第８日目には、分化中にその発現の２〜３倍の誘発を示し始めた。
【０１９４】
図６Ａに示したように、哺乳動物（マウス）組織におけるＲＯＭＡ１タンパク質発現のリアルタイムＰＣＲ法（Taqman）分析は、ＲＯＭＡ１がさまざまな哺乳動物の組織において偏在的に発現され、茶色脂肪細胞組織（ＢＡＴ）、小腸、心臓、および腎臓組織において最も高度なレベルの発現を示すことを明らかにした。白色脂肪細胞組織（ＷＡＴ）における明らかな発現が観察され、エネルギー恒常性および熱産生の調節における役割を確認した。また、ＲＯＭＡ１タンパク質を、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換のための生体外分化モデルにおいて上記のように検討した。図６Ｂに示したように、３Ｔ３-Ｌ１細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への生体外分化中に（第４日目に始まる）、ＲＯＭＡ１の発現は明らかに増加される。
【０１９５】
実施例７：哺乳動物２ＴＭタンパク質の細胞内局在性
哺乳動物の細胞を、好適な抗血清で固定および免疫染色し、マウス２ＴＭタンパク質の発現ベクターで一過性に形質移入し、分析した。哺乳動物の２ＴＭタンパク質の細胞内局在性を決定するため、望ましくは、好適な発現ベクターにクローニングできるような（例えば、ｐｃＤＮ３．１；InVitrogen 社製；ＣＭＶプロモーターを有する原核発現用の標準ベクター）フラグタグおよびＨＡタグされた２ＴＭタンパク質を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質移入した。フラグタグは、プライマー２ＴＭFLAG.up（配列識別番号１８；５'-ＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＴＧＣＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ-３'）および２ＴＭFLAG.low（配列識別番号１９；５' - ＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＴＴＧＧＴＣＴＴＣ-３'）を用いてＰＣＲ法を介する変異誘発によって２ＴＭタンパク質の読み取りフレーム中に導入した。配列識別番号１８を有するプライマーは、特定のエンドヌクレアーゼ制限側（例えばＨｉｎｄｌｌｌ）の開始コドン（ＡＴＧ）の６塩基対上流を導入する。配列識別番号１９を有するプライマーは、フラグタグをフレーム内のタンパク質のオープンリーディングフレームの３'-プライム端部および特定のエンドヌクレアーゼ制限側（例えばＥｃｏＲＩ）終止コドンの６塩基対下流に導入する。
【０１９６】
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ法）を、望ましくは「高忠実度白金（プラチナ）Taq ポリメラーゼ」（望ましくはInvitrogen 社製、Karlsruhe、Germany）を用いて哺乳動物（例えばマウス）の骨格筋筋肉から取得したｃＤＮＡ上で実施した；任意の他のTaq ポリメラーゼの使用および当業者であれば周知の標準ＰＣＴ技術を用いることもできる。ｃＤＮＡ合成を、６ＲＮＡ、１リットルのオリゴｄＴプライマー（望ましくは濃度５００ gram／mlで）、および Superscript II キット（Invitrogen 社製、Karlsruhe、Germany）を供給元のプロトコルに従って用いて実施した。望ましくはエンドヌクレアーゼＥｃｏＲｌおよびＨｉｎｄｌｌｌによるエンドヌクレアーゼ制限の後、当業者であれば周知のように、ＰＣＲ法の産生物をｐｃＤＮＡ３．１ベクターに連結反応した。
【０１９７】
哺乳動物細胞の培養細胞、例えばＮＩＨ３Ｔ３細胞（ATCC、Hanassas、VA、USA）を、望ましくはウェル当たり２５．０００細胞の密度でPoly-D リジン被覆のカバーガラス（BD Biosciences 社製、Erembodegem、Belgium）を含んだ２４個のウェルプレートに播種した。播種の１日後、製造者（例えばInVitroGen 社、Karlsruhe、Germany）の指示に従ってリポフェクトアミン（Lipofectamin） Plus を用いて細胞を上記の２ＴＭ-ＦＬＡＧ発現構成物で一過性に形質移入した。形質移入の２日後、フラグタグに対する特定の抗体例えば抗フラグＭ２抗体（Sigma 社製、Taufkirchen、Germany）、およびＣｙ３標識抗マウス二次抗体（例えば、Dianova 社製、Hamburg、Germany）を用いて、従来の技術（Dorner らのJ. Biol Chem. （1998） Vol. 273、20267-75 を参照）に記載された方法で免疫蛍光検査をパラホルムアルデヒド固定細胞上に実施した。つまり、細胞を、ＰＢＳ（１時間ＰＢＳ緩衝液において０．１ＮａＢＨ４を用いた細胞の処理によって遮断された内在性自動蛍光）で０．７５％トリトンＸ-１００を用いて１０分間透過処理した（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、５％ヤギ血清、０．０４５％サカナゼラチン）。一次抗血清（抗フラグＭ２抗体、望ましくは０．２ μｇ／ｍｌで１昼夜）および二次抗体（抗マウスＣｙ３標識、望ましくは１：４００比率で希釈、１時間）を遮断緩衝液に投与し、その後遮断緩衝液において洗浄した。カバーガラスをガラスのスライド上に取り付け、Ｃｙ３用に設定した適切なフィルタを用いて免疫染色せしめた細胞を、蛍光マイクロスコープを用いて６３０ｘ拡大率にて検査した。
【０１９８】
図１０に示したように免疫蛍光は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のミトコンドリアにおける哺乳動物の２ＴＭタンパク質の明らかな局在性を明らかにする。
【０１９９】
本明細書において開示した全ての刊行物および特許を言及することをもって本明細書の一部となす。
【０２００】
本発明の方法およびシステムの種々の修正および改変は当業者に当然のことであり、本発明の範囲および精神から逸脱しない限り行い得るものとする。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことは当然のことながら共通認識とする。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】ショウジョウバエ脱共役タンパク質（ＵＣＰｙ）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列
【図２】キイロショウジョウバエ、マウス、およびヒトからのＵＮＣ-５１様タンパク質のＣＬＵＳＴＡＬＸ（１．８）複数アミノ酸配列アライメントアライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＶソフトウェア（Higgins,D.G. および Sharp,P.M. （1989）. CABIOS, vol. 5, no. 2, 151-153.）の複数配列アライメントプログラムを使用して産生した。ｈｓＮＰ＿００３５５６はヒトＵＬＫ-１タンパク質であり、ｍｍＮＰ＿０３３４９５はマウスＵＬＫ-１を指し、ｈｓＮＰ＿０５５４９８はヒトＵＬＫ-２タンパク質であり、ｍｍＢＡＡ７７３４１はマウスＵＬＫ-２を指し、ｄｍＡＡＦ４９８７８はショウジョウバエＵＮＣ-５１様タンパク質を指す。同一のアミノ酸残基は星印でマークした
【図３】哺乳動物の組織におけるＵｎｃ５１の発現
【図４】Ｒｏｍａ１をコードするヌクレオチドおよびタンパク質配列
【図５】ＲＯＭＡ１タンパク質（ライン１；配列識別番号５）、ヒトＢＡＰ３７タンパク質（ライン２、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００６６３９．１）、マウスＢＡＰ３７タンパク質（ライン３、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３１５５７．１）間のアミノ酸配列アライメントを示す。アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＶソフトウェア（Higgins,D.G. および Sharp,P.M. （1989）. CABIOS, vol. 5, no. 2, 151-153.）の複数配列アライメントプログラムを使用して産生した
【図６】哺乳動物の組織におけるＲＯＭＡ１の発現
【図７】ヒト２ＴＭ相同性タンパク質のアミノ酸配列（１文字コード）を示す
【図８】図８はキイロショウジョウバエからの２ＴＭタンパク質（ＧａｄＦｌｙアクセッション番号ＣＧ７６２０）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ２６１２４）、およびヒト（アクセッション番号ＥＮＳＰ０００００２４２５１８配列識別番号７、ＢＧ４３２９１４ - 配列識別番号６、ＥＮＳＰ０００００２４３７８５ - 配列識別番号８、およびＥＮＳＰ０００００２５０５９４ - 配列識別番号９）間のアミノ酸配列アライメントを示す。アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＶソフトウェア（Higgins,D.G. および Sharp,P.M. （1989）. CABIOS, vol. 5, no. 2, 151-153.）の複数配列アライメントプログラムを使用して産生した
【図９】図９はショウジョウバエ（図９Ａ）およびヒト（図９Ｂ；配列識別番号７）２ＴＭタンパク質の膜貫通ドメインプロットを示す。 J.Glasgow らのProc.Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology. 175-182, AAAI Press, 1998 に従って計算した
【図１０】図１０は形質移入哺乳動物のＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるタグ付き２ＴＭタンパク質のミトコンドリアの局在性を示す。マウス２ＴＭタンパク質の発現ベクターでＮＩＨ３Ｔ３細胞を一過性に形質移入し、フラグタグで特異的に標識し、そのフラグタグに対して抗血清で固定および免疫染色した（実施例を参照）

Claims

Ｕｎｃ-５１、ミトコンドリア活性１（ＲＯＭＡ１）の制御因子、および（または）ミトコンドリアの２ＴＭ遺伝子系の核酸分子またはそれによってコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、当該核酸分子を認識するアプタマーまたは別の受容体または、医薬的受容が可能なキャリア、希釈液および（または）アジュバントを合わせ、それによってコードされたポリペプチドから成る医薬品組成品。
核酸分子が脊椎動物または昆虫Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ核酸、特にヒト核酸、例えばヒトＵＮＣ-５１様キナーゼ１（ＵＬＫ-１）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ-００３５６５）またはヒトＫＩＡＡ０６２３遺伝子（ＵＬＫ-２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ-０１４６８３）またはヒトＢＡＰ３７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００６６３９．１）またはヒトミトコンドリアの２ＴＭ（配列識別番号７、配列識別番号６、配列識別番号８、または配列識別番号９）またはマウス核酸、例えばマウスＵＮＣ-５１様キナーゼ１（ＵＬＫ-１）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ-００９４６９）またはマウスＵＮＣ-５１様キナーゼ２（ＵＬＫ-２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１９５７７）またはマウスＢＡＰ３７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３１５５７．１）またはマウス２ＴＭ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＢ２６１２４）、または昆虫核酸、例えばキイロショウジョウバエＵｎｃ-５１（ＧａｄＦｌｙアクセッション番号ＣＧ１０９６７）、ＲＯＭＡ１（ＧａｄＦｌｙアクセッション番号ＣＧＩ５０８Ｉ）、および（または）２ＴＭ（ＧａｄＦｌｙアクセッション番号ＣＧ７６２０）、またはその断片またはその変異型である請求項１の組成物。
当該核酸分子が下記である場合の請求項１または２の組成物。
（ａ）請求項２において言及したタンパク質の１つをコードするヌクレオチド配列またはその補体から成る場合；
（ｂ）６５℃または６６℃にて、０．２ｘＳＳＣおよび０．１% ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶液において、請求項２のアミノ酸配列の１つをコードする核酸分子の相補鎖にハイブリタイズするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）の核酸分子に対して縮重する場合；
および（または）（ｂ）；
（ｄ）少なくとも８５%、望ましくは少なくとも９０%、より望ましくは少なくとも９５%、より望ましくは少なくとも９８%、および９９、６%までが請求項２のタンパク質の１つと同一のポリペプチドをコード化する場合；
（ｅ）突然変異のために（ａ）〜（ｄ）の核酸分子と異なり、当該突然変異がコードされたポリペプチドにおいて改変、除去、複製または早期停止の原因となる場合；または
（ｆ）少なくとも１５塩基の長さを有する（ａ）〜（ｅ）のヌクレオチド配列の任意の部分的配列から成る場合。
核酸分子がＤＮＡ分子、特にｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである請求項１〜３の任意の組成物。
当該核酸がポリペプチドををコードし、細胞小器官の膜安定性および（または）機能に寄与する請求項１〜４の任意の１項の組成物。
当該核酸が輸送体分子の制御因子であるポリペプチドをコードするような請求項１〜４の任意の１項の組成物。
当該核酸がミトコンドリアのタンパク質の修飾因子であるポリペプチドをコードするような請求項１〜６の任意の１項の組成物。
当該核酸分子が組換え核酸分子である請求項１〜７の任意の１項の組成物。
当該核酸分子がＤＮＡまたはＲＮＡである請求項１〜８の任意の１項の組成物。
組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである請求項１〜９の任意の１項の組成物。
ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項１〜８の任意の１項の組成物。
当該修飾ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項１１の組成物。
当該核酸分子がハイブリダイゼーションプローブ、プライマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される請求項１〜１０の任意の１項の組成物。
診断用組成物である請求項１〜１３の任意の１項の組成物。
治療用組成物である請求項１〜１３の任意の１項の組成物。
細胞、細胞塊、器官および（または）被験者における障害が代謝障害またはミトコンドリア障害、例えば肥満症、脂肪過多症、摂食／体重障害（神経性過食症、拒食症）、悪質液（消耗症）、膵臓の機能障害（糖尿病）、ミトコンドリア障害、および（または）ＲＯＳ産出関連障害などの検出用および（または）検証用、診断用、治療用、軽減用および（または）障害の予防用の薬剤を製造するための請求項１〜１５の任意の１項の組成物の使用法。
Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ遺伝子系またはそのコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、当該核酸分子を認識するアプタマーまたは別の受容体またはＵｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭポリペプチドによって影響および（または）修飾される遺伝子および（または）遺伝子産物の機能を制御するためにコードされたそのポリペプチドの核酸分子の使用法。
当該遺伝子および（または）遺伝子産物が細胞小器官において発現した遺伝子および（または）遺伝子産物である請求項１７に記載の使用法。
Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ遺伝子系またはそのコードされたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異型または当該ポリペプチドまたは抗体、当該核酸分子を認識するアプタマーまたは別の受容体またはＵｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭポリペプチドと相互作用する能力のある物質を同定するためのコードされたそのポリペプチドの核酸分子の使用法。
当該ポリペプチドと相互作用する能力のある当該物質が拮抗薬または作用薬である請求項１９に記載の使用法。
Ｕｎｃ-５１キナーゼ様、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子組換え動物。
Ｕｎｃ-５１キナーゼ様、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭポリペプチドの発現が増大または減少した請求項２１の動物。
Ｕｎｃ-５１キナーゼ様、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭポリペプチドの修飾発現を示す組換え宿主細胞。
ヒト細胞である請求項２３の細胞。
動物の細胞代謝に関与するか、または恒常性を修飾する能力のある、ポリペプチドまたは物質を同定する方法のステップは下記から成る：
（ａ）Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭポリペプチドまたはその断片との相互作用のためのポリペプチドまたは物質の収集を、読み出し装置を用いて検査するステップ；および
（ｂ）ステップ（ａ）において正の相互作用を示したポリペプチドまたは物質を同定するステップ。
（ｃ）同定されたポリペプチドにステップ（ａ）および（ｂ）を１回以上繰返すステップ。ここで、新規に同定されたポリペプチドは、さらに相互作用するポリペプチドを同定するために、以前に同定されたポリペプチドをベイトとして置換する。
１つ以上の相互作用する（ポリ）ペプチドをコード化する核酸分子を同定するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
哺乳動物における体重調節に関与するポリペプチドを同定する方法のステップは下記の通りである：
（ａ）Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ様ポリペプチドまたはその断片を、当該（ポリ）ペプチドの結合を可能にする条件下で（ポリ）ペプチドの回収と接触させるステップ。
（ｂ）ステップ（ａ）において、Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭポリペプチドに結合しなかった（ポリ）ペプチドの当該収集から（ポリ）ペプチドを除去するステップ；および
（ｃ）当該Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭポリペプチドまたはその断片に結合する（ポリ）ペプチドを同定するステップ。
１つ以上の結合する（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子を同定するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ遺伝子系の核酸分子の発現またはＵｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭポリペプチドの活性に影響を及ぼす化合物を同定する方法は以下のステップから成る。
（ａ）Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭの核酸分子、または化合物または化合物の収集で動作可能なように読み出し装置に連鎖した請求項２６または２８に記載の方法によって同定された核酸分子を包含する発現ベクターを保有する宿主に接触するステップ。
（ｂ）当該接触が、当該読み出し装置によって提供されるシグナル強度に変化をもたらすがどうかを測定するステップ；および、随意的に、
（ｃ）ステップ（ｂ）におけるシグナルの変化を誘発する化合物の当該収集内で化合物を同定するステップ；
ここでは、シグナル強度の当該変化は、当該核酸分子の発現の変化に相関する。
非ヒト動物における１つ以上のＵｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭポリペプチドの発現の影響を評価する下記のステップから成る方法。
（ａ）Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ遺伝子系の核酸分子、または当該動物において請求項２６または２８の方法に従って入手可能である核酸分子を過剰発現または低発現するステップ：および
（ｂ）当該動物の重量が増加したか減少したか、代謝変化が誘発されたかどうか、および（または）摂食行為が修飾されかたどうかを、それぞれ判定するステップ。
Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭポリペプチドの結合標的および薬剤との相互作用を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
（ａ）下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
（ａａ）Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭポリペプチド、またはその断片または融合タンパク質またはその断片；
（ａｂ）当該（ポリ）ペプチドまたは融合タンパク質またはその断片の結合標的および薬剤；および
（ａｃ）リファレンス親和性にて、当該（ポリ）ペプチド、融合タンパク質またはその断片が特異的に当該結合標的および薬剤に結合する条件下における候補薬剤；
（ｂ）（候補）薬剤偏向親和性を決定するため、当該結合標的に対する当該（ポリ）ペプチド、融合タンパク質またはその断片の結合親和性を検出するステップ；および
（ｃ）（候補）薬剤偏向親和性とリファレンス親和性間の差異を確定するステップ。
医薬用に許容できるキャリア、希釈剤および（または）アジュバントを有する、請求項２５または２７の方法によって識別された（ポリ）ペプチド、または請求項３１の方法によって識別された薬剤を包含する組成物を産出する方法。
当該組成物が、肥満症、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群（悪質液）、ミトコンドリアの障害、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）、ＲＯＳ産出に関連する障害を防止、緩和または治療するための医薬組成物である請求項３２に記載の方法。
組成物は下記の通りである。
（ａ）Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ（ポリ）ペプチドの阻害（抑制）薬または刺激装置、または同定するによる方法ｏｆ任意のの１つ請求項２５、または２７の任意の１項の方法によって同定された（ポリ）ペプチドまたは請求項３０に記載の方法によって精製された（ポリ）ペプチド；
（ｂ）請求項２６または２８に記載の方法によって同定された遺伝子の発現の阻害（抑制）薬；および（または）
（ｃ）請求項２９に記載の方法によって同定された化合物：
医薬組成物である請求項３４に記載の組成物。
使用法
（ａ）請求項２５〜３１の任意の１項に記載の方法によって同定（ポリ）ペプチド阻害（抑制）薬または刺激装置；
（ｂ）請求項２５または３１に記載の方法によって同定された遺伝子の発現の変調装置；
肥満症、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群（悪質液）、ミトコンドリアの障害、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）、ＲＯＳ産出に関連した障害の治療のための医薬組成物の調製（調合）用。
肥満症、脂肪過多症、摂食障害、消耗症候群（悪質液）、ミトコンドリアの障害、膵臓の機能障害（例えば糖尿病）、ＲＯＳ産出に関連する障害の治療、軽減および（または）予防のための医薬組成物の調製（調合）用に、請求項３１に記載の方法によって同定された薬剤の使用法。
Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト動物の準備(preparation)のためのＵｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭまたはその断片の核酸分子の使用法。
下記の最低１つを備えたキット。
（ａ）Ｕｎｃ-５１、ＲＯＭＡ１、および（または）２ＴＭ核酸分子、またはその断片；
（ｂ）（ａ）の核酸を備えているベクター；
（ｃ）（ａ）の核酸または＿のベクターを備えている宿主細胞；
（ｄ）（ａ）の核酸によってコードされたポリペプチド；
（ｅ）（ａ）の核酸によってコードされた融合ポリペプチド；
（ｆ）抗体または断片またはその誘導体または抗血清、アプタマー、または（ａ）の核酸または（ｄ）または（ｅ）のポリペプチドに対する別の受容体；および
アンチセンスオリゴヌクレオチド、ハイブリダイゼーションプローブまたは（ａ）の核酸のためのプライマー。