JP2021046441A - 心組織を修復するための心外膜由来パラクリン因子 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2015年4月9日に出願された米国仮特許出願第62/145,480号および2015年7月24日に出願された米国仮特許出願第62/196,766号(これらの開示は、それらの全体が参考として本明細書に援用される)への優先権を主張する。
とりわけ本明細書において、心血管系疾患、心筋梗塞(MI)、または他の虚血性事象によって引き起こされる心組織(たとえば心筋組織)への損傷を処置し修復するための、心外膜由来パラクリン因子(たとえば低グリコシル化フォリスタチン様1(FSTL1))を含む組成物およびキット、ならびにこれらを使用するための方法が提供される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
傷害後の心組織の修復を必要とする被験体において傷害後に心組織を修復するための方法であって、前記心組織を低グリコシル化フォリスタチン様1(FSTL1)ポリペプチドと接触させるステップを含む、方法。
(項目2)
前記傷害が、虚血再灌流心傷害である、虚血性心臓疾患によるものである、および/または発育不全心によるものである、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記傷害が心筋梗塞であり、および/または心臓が瘢痕組織を含有する、項目1に記載の方法。
(項目4)
心組織の修復が、前記心組織における心筋細胞の数を増加させることを含む、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
心組織の修復が、心筋細胞および/または心血管系を含む損傷を受けた心組織の回復の増大を含む、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
心筋細胞の数が、傷害後に心外膜由来パラクリン因子が接触しなかった心組織における心筋細胞の数と比較して少なくとも3倍に増加する、項目4または5に記載の方法。
(項目7)
心組織の修復が、傷害後に心外膜由来パラクリン因子が接触しなかった心組織における短縮率の量と比較した心組織の短縮率の改善を含む、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
心組織の修復が、傷害後の心外膜由来パラクリン因子の接触、送達、またはゲノム編集による処置前の同一心臓における線維化の量と比較して、少なくとも2%の瘢痕面積(線維化)の低減を含む、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
心臓組織の修復が、傷害後の心外膜由来パラクリン因子の接触、送達、またはゲノム編集による処置前の同一心臓における灌流面積の量と比較して、少なくとも2%の血管灌流面積の増大を含む、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
心組織の修復が、傷害後に心外膜由来パラクリン因子が接触しなかった心組織における心筋細胞の細胞質分裂の量と比較した前記心組織における心筋細胞の細胞質分裂の量の増大を含む、項目1から5のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
心筋細胞の細胞質分裂の量の増大が、Aurora Bキナーゼの発現によって決定される、項目10に記載の方法。
(項目12)
心組織の修復が、心筋細胞のアポトーシスの減少を含む、項目1から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
心筋細胞における心特異的収縮性タンパク質をコードする転写物のレベルの増大をもたらす、項目1から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
心筋細胞における心特異的収縮性タンパク質をコードする転写物のレベルの2倍の増大をもたらす、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記心特異的収縮性タンパク質が、myh6、mlc2v、およびmlc2aからなる群より選択される、項目13または項目14に記載の方法。
(項目16)
心筋細胞における律動的収縮性Ca2+を伴うアクチニン+細胞の増加をもたらす、項目1から10のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記心組織を、前記傷害の直後に前記心外膜由来パラクリン因子と接触させる、項目1から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記心組織を、前記傷害後、任意の時間で前記心外膜由来パラクリン因子と接触させる、項目1から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
心事象および入院を減少させる、項目1から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記傷害後に前記心組織における線維化を減弱させる、項目1から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記心組織の傷害を受けた領域の血管新生の増大をもたらす、項目2または項目3に記載の方法。
(項目22)
前記血管新生の増大が血管細胞中のフォン・ビルブラント因子(vWF)または平滑筋アクチンの発現によって決定される、項目21に記載の方法。
(項目23)
心筋細胞の細胞周期のエントリーを誘起する、項目1から22のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記心筋細胞の細胞周期のエントリーがホスホ−ヒストンH3の発現によって評価される、項目23に記載の方法。
(項目25)
傷害後に心外膜由来パラクリン因子が接触しなかった心組織における心筋細胞の細胞周期のエントリーの量と比較して、心筋細胞の細胞周期のエントリーの少なくとも2倍の増大をもたらす、項目23または項目24に記載の方法。
(項目26)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、原核細胞中で合成される、項目1に記載の方法。
(項目27)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、グリコシル化阻害剤で処理された真核細胞中で合成される、項目1に記載の方法。
(項目28)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、1つまたは複数のグリコシル化アミノ酸を1つまたは複数のグリコシル化に不適格なアミノ酸で置換することによって産生される、項目1に記載の方法。
(項目29)
前記1つまたは複数のグリコシル化アミノ酸が、N144、N175、N180、およびN223からなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目30)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが心組織を修復する、項目26から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記低グリコシル化FSTL1が、傷害後に心筋細胞をアポトーシスから保護する、項目26から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、コラーゲンパッチによって傷害を受けた心筋組織に送達される、項目1から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、傷害を受けた心筋組織に直接注入される、項目1から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが全身に送達される、項目1から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、心内膜に送達される、項目1から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記心内膜送達がカテーテルによる、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、心外膜にカテーテルによって送達される、項目1から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、薬物溶出ステントを使用してカテーテルによって送達される、項目1から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記低グリコシル化Fstl1ポリペプチドが、三次元コラーゲンパッチ中に埋め込まれるか、または播種されている、項目1から38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記心組織を、心外膜部位、心内膜部位の1つもしくは複数から、および/または心筋への直接注入によって接触させる、項目1から39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、修飾されたRNA(modRNA)の使用によって前記心臓内で発現される、項目1から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、ゲノム編集によって発現される、項目1から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
傷害後の心組織の修復を必要とする被験体において傷害後に心組織を修復するための方法であって、前記心組織を心外膜由来パラクリン因子と接触させるステップを含む、方法。
(項目44)
低グリコシル化フォリスタチン様1(FSTL1)ポリペプチドおよび1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、無菌の医薬組成物。
(項目45)
FSTL1のグリコシル化阻害剤をさらに含む、項目44に記載の無菌の医薬組成物。
(項目46)
前記FSTL1のグリコシル化阻害剤が、ツニカマイシンを含む、項目45に記載の無菌の医薬組成物。
(項目47)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、原核細胞中で合成される、項目44に記載の無菌の医薬組成物。
(項目48)
前記原核細胞が細菌細胞である、項目47に記載の無菌の医薬組成物。
(項目49)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、グリコシル化阻害剤で処理された真核細胞中で合成される、項目44に記載の無菌の医薬組成物。
(項目50)
前記グリコシル化阻害剤がツニカマイシンである、項目49に記載の無菌の医薬組成物。
(項目51)
傷害を受けた心組織に直接注入するために製剤化されている、項目44から50のいずれか一項に記載の無菌の医薬組成物。
(項目52)
全身投与のために製剤化されている、項目44から50のいずれか一項に記載の無菌の医薬組成物。
(項目53)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、修飾されたRNA(modRNA)を含む細胞中で合成される、項目44に記載の無菌の医薬組成物。
(項目54)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、ゲノム編集によって発現される、項目44に記載の無菌の医薬組成物。
(項目55)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、三次元(3D)コラーゲンパッチ中に埋め込まれるか、または播種されている、項目44から54のいずれか一項に記載の無菌の医薬組成物。
(項目56)
前記3Dコラーゲンパッチが、12±4kPaの弾性係数を有する、項目55に記載の無菌の医薬組成物。
(項目57)
(i)低グリコシル化フォリスタチン様1(FSTL1)ポリペプチド;および(ii)1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、キット。
(項目58)
(iii)三次元(3D)コラーゲンパッチをさらに含む、項目57に記載のキット。(項目59)
前記低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、三次元(3D)コラーゲンパッチ中に埋め込まれるか、または播種されている、項目57または58に記載のキット。
(項目60)
前記3Dコラーゲンパッチが、12±4kPaの弾性係数を有する、項目57または58に記載のキット。
(項目61)
(iv)前記3Dコラーゲンパッチを傷害を受けた心臓の心外膜または心筋に接着させるための接着手段をさらに含む、項目57から60のいずれか一項に記載のキット。
(項目62)
前記接着手段が縫合糸である、項目61に記載のキット。
(項目63)
傷害後の心組織の修復を必要とする被験体において傷害後に心組織を修復するための方法であって、前記心組織または心外膜を、組換え低グリコシル化フォリスタチン様1(FSTL1)ポリペプチドが播種または注入された三次元(3D)コラーゲンパッチと接触させるステップを含む、方法。
(項目64)
前記傷害が虚血再灌流傷害である、項目63に記載の方法。
(項目65)
前記傷害が心筋梗塞である、項目63に記載の方法。
(項目66)
前記3Dコラーゲンパッチが、前記心組織または心外膜に縫合される、項目63から65のいずれか一項に記載の方法。
(項目67)
組換え低グリコシル化フォリスタチン様1(FSTL1)ポリペプチドが注入または播種された三次元(3D)コラーゲンパッチ。
(項目68)
前記組換え低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、原核細胞中で合成される、項目67に記載のコラーゲンパッチ。
(項目69)
前記原核細胞が細菌細胞である、項目68に記載のコラーゲンパッチ。
(項目70)
前記組換え低グリコシル化FSTL1ポリペプチドが、グリコシル化阻害剤で処理された真核細胞中で合成される、項目67に記載のコラーゲンパッチ。
(項目71)
前記グリコシル化阻害剤がツニカマイシンである、項目70に記載のコラーゲンパッチ。
(項目72)
12±4kDaの弾性係数を有する、項目67から71のいずれか一項に記載のコラーゲンパッチ。
本明細書において使用する「心組織」という語句は、心臓の任意の組織を指す。心組織には心筋組織、心外膜の組織、および心内膜の組織が含まれる。心組織は心臓内に見出される細胞型のいずれかを含む。
本明細書において、心外膜由来パラクリン因子(たとえば、低グリコシル化FSTL1等のFSTL1)および1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または担体を含有する医薬組成物が提供される。
Molecular Biology (F. M. Ausubelら編、9章、1987年;Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、3版、Cold Spring Harbor、2001年;およびCampbellら、Curr Genet、16巻、53〜56頁、1989年を参照されたい)。これらは特に形質転換の方法に関してそれぞれ参照によりその全体を本明細書に組み込まれる)。導入された核酸は宿主細胞の染色体DNAに一体化され、または染色体外の複製性配列として維持され得る。さらに別の実施形態では、FSTL1ポリペプチドは変異Fstl1グリコシル化欠乏ポリペプチドをコードする化学修飾されたmRNAの送達によって宿主細胞中で産生され得る(Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.、Zangi Lら、Nat Biotechnol. 2013年10月、31巻(10号)、898〜907頁を参照されたい。これは参照によりその全体を本明細書に組み込まれる)。化学修飾されたRNAは、本明細書においてmodRNAとも称されるが、たとえばホスフェートのホスホロチオエートインターヌクレオチド結合への修飾、リボースの2’−ヒドロキシル基の修飾、またはmRNAのホスフェート骨格もしくは糖部分への他の修飾を含んでよい。
Neelら、Soft Matter、2006年、2巻、986〜992頁に見出すことができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において、それを必要とする被験体において傷害後に心組織(たとえば心筋組織)を修復するための方法であって、心組織(たとえば心筋組織)を心外膜由来パラクリン因子と接触させるステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、心外膜由来パラクリン因子は低グリコシル化フォリスタチン様1(FSTL1)ポリペプチドである。本発明の他の実施形態では、低グリコシル化FSTL1の投与によってAkt−1シグナル伝達活性は活性化されない(図20参照)。本発明の他の実施形態では、低グリコシル化FSTL1の投与によって心筋細胞のアポトーシスの低下はもたらされない(図6参照)。
Internationalから入手可能なもの)に含浸して低グリコシル化FSTL1を配置することによって達成することができる。
本明細書において、(i)心外膜由来パラクリン因子(たとえば低グリコシル化FSTL1ポリペプチド);および(ii)1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含むキットも提供される。これらのキット構成要素の一方または両方は、必要な個体(たとえば、MI等の心傷害を有する個体)に投与できるように無菌にすることができる。キットは、被験体への投与の前に心外膜由来パラクリン因子を播種または注入できる3Dコラーゲンパッチ(たとえば、本明細書に開示したもののいずれか)を任意選択で含有してもよい。あるいは、予め播種した、または予め注入した3Dコラーゲンパッチを、それを必要とする被験体の傷害を受けた心組織(たとえば心筋組織)または心外膜への使用および適用に関する指示とともに、キットに含ませてもよい。キットは、限定するものではないが縫合材料等の、3Dコラーゲンパッチを心外膜または傷害を受けた心組織(たとえば心筋組織)に接着させる手段をさらに含んでもよい。
心臓の心外膜は、前駆細胞1、2ならびにFGF、IGF2、およびPDGFを含む有糸分裂促進因子3〜5を提供することにより、発生中の心筋の成長に寄与する外部上皮層である。最近の研究により、心外膜は、おそらく筋原性前駆体の供給源として傷害後の成体心筋の機能を維持することもできることが示唆されている6、7。しかし、心外膜由来パラクリン因子が、哺乳動物における心筋の再生を支持することは示されていないが、それらの正体および作用機序は、この十分に理解されていない、本質的に非効率なプロセスに対する洞察を提供すると思われる8。この実施例は、そのような心外膜由来パラクリン因子の同定を説明する。
前駆細胞Sca1+,Myh6−の心筋細胞の前駆体を、記載されたように19、Schneider laboratoryにより得た。
心臓発生を促進する心外膜シグナルを探るために、心外膜の中皮細胞(EMC)株を、Myh6+マウス胚性幹細胞(ESC)由来心筋細胞(mCMsESCと称される)と共培養した。mCMsESCは、分化したMyh6−PurorマウスESCのピューロマイシン選択から調製した(詳細および細胞の表現型については図8および材料および方法)。EMCとの共培養は、α−アクチニン+筋細胞の数(図1a〜c)ならびにMyh6、Myh7、Mlc2aおよびMlc2vを含む心筋細胞マーカーの発現(図1d)を一貫して増大させた。希釈されていないEMC馴化培地は、筋細胞の数(2.4倍のα−アクチニン+細胞が検出された、図1e〜g)ならびにMyh6(1.8倍)、Mlc2v(1.9倍)、およびMlc2a(1.3倍)の発現(図1h)を増大させることにより、共培養の効果を再現した。さらに、EMC馴化培地は、律動的収縮性Ca2+のトランジェントを示したα−アクチニン+細胞の数を、標準的な培地と比較して増加させた(8.6倍)(図1i)。したがって、心外膜様の培養物から分泌された因子(複数可)は、ESC由来心筋細胞培養物中の収縮性細胞の数を増加させた。共培養は、未分化の(Myh6−)ESCの心臓発生を促進しなかった(示していない)。
この実施例は、成体心臓における心外膜により分泌された因子の効果を説明する。
成体心室筋細胞を、月齢3カ月のFVBマウスから、以前公開されたようにして35単離した。簡単に説明すると、マウスをペントバルビタールナトリウム(100mg/kg、ip)で麻酔した。心臓を取り出して、Ca2+を含まない溶液(mMで、120のNaCl、14.7のKCl、0.6のKH2PO4、0.6のNa2HPO4、1.2のMgSO4−7H2O、4.6のNaHCO3、10のNa−HEPES、30のタウリン、10のBDM、5.5のグルコース)を用いて37℃で逆方向に灌流し、続いてコラゲナーゼで酵素的に消化した。心室を小片に切ってさらに消化した。停止緩衝液(Ca2+を含まない溶液+CaCl2 12.5μM+10%仔牛血清)を添加して、細胞懸濁液を40gで3分間遠心分離した。筋細胞を、1mMになるまでCaCl2濃度を増大させて、停止緩衝液中に再懸濁させた。次いで、細胞をMEM+5%仔牛血清+10mM BDM+2mM L−グルタミン中に再懸濁させて、コラーゲン溶液に添加し、予備的に重合させた(1mlあたりまたは1パッチあたり250,000細胞)。コラーゲンのゲル化および塑性圧縮に続いて、細胞のパッチを前に述べた(プレーティング)培地中で終夜培養して、次いで培養培地(MEM+1mg/mlウシ血清アルブミン+25μMブレビスタチン+2mM L−グルタミン)中に、組換えFSTL1(AVISCERA BIOSCIENCE、10ng/ml)の存在または非存在下で移した。7日目に、蛍光性ユビキチン化に基づく細胞周期インジケーター(FUCCI、Premo(商標)FUCCI細胞周期センサー、Life Technologies、US)アッセイを、前に記載されているように36、3D培養検体に対して実施した。このアッセイにおいて、G1およびS/G2/M細胞は、赤色および緑色の蛍光を、それぞれ発する。Premo(商標)geminin−GFPおよびPremo(商標)Cdt1−RFPの体積は、下の方程式を使用して計算した。
次に、成体の心臓における心外膜により分泌された因子の効果を、心外膜の3Dコラーゲンパッチを使用して馴化培地を送達することにより、評価した。3Dコラーゲンパッチ(図2a)は、胚性心外膜について報告された弾性係数(E 約12±4kPa)10に匹敵する弾性係数を有するように設計した。これは、成熟心外膜(E>30〜40kPa)および線維化心組織(E>100kPa)のものより低いが、現在使用されている足場の生体材料の大部分(E≦1kPa)のものより高い(図2bおよび図9)。作出されたパッチに、EMC馴化培地を播種して、梗塞した成体マウスの心臓の心外膜上に縫合した(図2c、d)。パッチの埋植は、左前下行(LAD)冠状動脈の永久的結紮(心筋梗塞(MI))後直ちに実施した。2週間後に、心外膜−培地−パッチ(MI+パッチ+CMコホート)および空のパッチ(MI+パッチ、馴化培地なし)で処置した心臓は、MIのみの動物と比較して、拡張末期および収縮末期における左心室の内径(それぞれLVIDdおよびLVIDs)、ならびに拡張末期および収縮末期における左心室の後壁寸法(それぞれLVPWdおよびLVPWs)を含む、有意に優れた形態計測パラメーターを示し(図2eおよび表1)、コラーゲンパッチが病的リモデリングを阻害する機械的支持を提供するモデル10と一致した。特に、MI+パッチ+CM処置は、心室の収縮性の有意に優れたパラメーターを有するという、全ての他の条件と比較して追加の利益を提供し(図2e、fおよび表1)、したがって機能維持に関与する、心外膜により分泌された活性を示した。
この実施例は、FSTL1が心筋形成を促進する心外膜と心筋とのクロストークにおいて役割を演じることを示唆するデータを提供する。
馴化培地のLC−MS/MS解析:最初に、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)を1mLの馴化培地に10mMになるように添加して、タンパク質試料を37℃で30分間還元した。次いでヨードアセトアミドを20mMになるように添加して、溶液を37℃で40分間暗所でアルキル化した。次いで、質量分析グレードのトリプシン(Promega)を溶液に1:100の比で添加した。終夜37℃で消化した後、次いでSepPackカートリッジを使用して試料を脱塩し、SpeedVacを使用して乾燥して、100μLの5%ギ酸中に再懸濁した。生じたペプチドを、Michrom HPLC、15cmのMichrom Magic C18カラム、低流量ADVANCED Michrom MS源、およびLTQ−Orbitrap XL(Thermo
Scientific、Waltham、MA)からなるLC−MSMSシステムによりオンラインで解析した。120分、0〜30%B(0.1%ギ酸、100%アセトニトリル)の勾配を使用してペプチドを分離して、総LC時間は141分であった。LTQ−Orbitrap XLをセットして、前駆物質をOrbitrapで、60,000の分解能で走査した後、上位の4種の前駆物質のデータ依存MS/MSを行った。次いで、IPIラットタンパク質データベースに対してタンパク質を同定するために、2箇所までの切断ミス(missed cleavages)の許容値および50.0ppmの前駆物質の質量許容差で、半トリプシンによって生じたペプチドの配列を含有する粗LC−MSMSデータをSorcerer Enterprise(Sage−N Research Inc.)に提出した。カルボキシアミドメチル化を説明するために、57Daの分子量を全てのシステインに加えた。差分検索はメチオニン酸化のための16Daを含む。検索結果を吟味し、分類し、選別して、PeptideProphetおよびProteinProphet(ISB)を使用して統計的に解析した。タンパク質およびペプチドのための最少トランス−プロテオミクスのパイプライン(TPP)の確率スコアは、0.01未満のTPP誤差率を保証するために、それぞれ0.95に設定した。
生物活性の心外膜に分泌されたタンパク質(複数可)を同定するために、EMC馴化培地を質量分析により解析した。スペクトルをIPIラットデータベースと比較して、311種の固有のタンパク質に対応する1596種のペプチドの読み取りを同定したが、そのうち95種の読み取りは、16種の別個の分泌されたタンパク質に起因していた。最高のスペクトルカウントを有する10種のタンパク質を、mCMsESCアッセイで試験するために選択した。これらについて、心原性活性は、フォリスタチン様−1(FSTL1、FRPまたはTSC36としても公知)でのみ認められ(図3a)、それは、単一のシステインに富むドメインをフォリスタチンと共有する、BM−40/SPARC/オステオネクチンファミリーの分泌型糖タンパク質である。フォリスタチンとは異なり、FSTL1はアクチビンをブロックせず、その生化学的および生物学的機能は、十分に特徴付けられていない11。心臓におけるFSTL1の送達は、短期の抗アポトーシス効果を生じるが12、13、心筋の修復機能がFSTL1に帰することはなく、実際、FSTL1レベルは、急性MI後に血流中で増大するので、この理由で、それは、急性冠動脈症候群のためのバイオマーカーと考えられてきた14。
以前の研究で、心筋細胞におけるFSTL1の一過性過剰発現、またはヒト組換えFSTL1の直接全身注入は、急性虚血/再灌流後、抗アポトーシス性であることが示された12、13。しかし、それが何らかの長期の利益を与えるかどうかをこの実施例で調べる。
in vivoにおける遅延強調磁気共鳴イメージング(DEMRI):走査に備えて、麻酔の誘導は2%イソフルランで達成され、呼吸数をモニターして1.25〜1.5%イソフルランを維持した。ECGのリード線を皮下に挿入して心拍数をモニターする一方、体温を37℃に維持した。専用のマウスコイル(Rapid MR International、ドイツ)を取り付けた3T GE Signa Excite臨床的スキャナーを使用して、機能的パラメーターを、処置の1週間後および4週間後に記録した。MRIの取得は、以下の順序で実施した。(1)DEMRIは、FOV3.4cm、スライス厚さ0.9mm、マトリックス128×128、TE 5ms、TI 150〜240ms、およびFA60°を備えたゲート付きfGRE−IR配列を使用する0.2mmol/kgガドペンテト酸ジメグルミン(Magnevist、Berlex Laboratories)のIP注射の後で実施した、;ならびに(2)体積(volume)の心MRIを、FOV 7cm、スライス厚さ0.9mm、マトリックス256×256、TE 5.5ms、およびFA30のfSPGRを使用して実施した。冠状および軸性のスカウト画像を使用して、左心室(LV)空洞の短軸に沿った2次元のイメージング平面を位置決めした。1実験群あたり2匹のマウスの最小数(n)をこの定性的研究のために使用した。
心機能を、横紋筋に限定されるMCKプロモーターの制御下でFSTL1を発現するトランスジェニックマウスで評価した(FSTL1−TG16、図11a、b)。FSTL1−TGマウスは、永久的LAD結紮後に収縮性における小さいが有意の改善を示したが、豊富なFSTL1過剰発現にもかかわらず、形態計測パラメーターまたは瘢痕サイズの長期的好転を示さなかった(図11a〜j)。したがって、心筋のFSTL1の過剰発現は、心外膜の表面に送達された、心外膜馴化培地の心保護効果を再現するには不十分である。心外膜のhFSTL1送達の心機能に対する効果を次に評価した。コラーゲンパッチを、前のように調製したが、今回は、重合および梗塞した心臓の心外膜の表面上への適用前に、細菌で合成された組換えhFSTL1を10μg/パッチをロードした(詳細については材料および方法を参照されたい)。パッチは免疫検出可能なhFSTL1を、試験された最長時間、in vitroで21日まで、およびin vivoで28日まで保持した(図12)。新たに作成されたhFSTL1パッチ(パッチ+FSTL1)をMI後直ちに心臓の心外膜の表面に適用した。パッチ+FSTL1は、MIのみおよびパッチ単独の動物と比較して動物の有意に改善された生存をもたらした(図4a)。
この実施例は、心外膜に送達されたFSTL1が、FSTL1が心筋で産生した異なった機能を有し得ることを示す。
実施例5で使用した方法は、本明細書で記載された通りである。
パッチ+FSTL1コホートは、α−アクチニン+の証拠、パッチ内の線状の筋細胞を示した(図5a〜d)。線状の細胞は、FSTL1の非存在下ではパッチ中に稀にしか観察されなかった。重要なことに、FSTL1は、ホスホ−ヒストンH3(Ser10)(pH3)についても陽性であったα−アクチニン+心筋細胞の出現率において、MIのみの動物で見られる出現率に対して6.2倍の増大を生じさせ(MIのみにおける断面あたり2.5(図5i)〜MI+パッチ+FSTL1処置群における切片あたり15.6、p<0.05;図5e〜kおよび図16)、FSTL1が、S期へのエントリーおよびDNA複製を促進することを示唆した。分裂する細胞を接続する一過性の架橋である中心体への局在化は、α−アクチニン染色された細胞間のAurora Bキナーゼ免疫反応性の検出および共焦点の光学的切片の3次元再構築において核DAPI染色で重なりのないこと(図5l)、ならびにMI+パッチ+FSTL1心臓における中心体に局在化されたAurora Bキナーゼを有する心筋細胞の、他の条件と比較して有意に増大した出現率により確認されたが(図5m)、そのことは、α−アクチニン+細胞が、細胞質分裂するように誘起されることを示唆する。PCM1を心筋細胞核のためのマーカー17として使用して、pH3に対して陽性のPCM1+核の出現率の有意な増大が観察された(図5n、o)。増大した心筋細胞増殖は、I/R傷害後にパッチ+FSTL1で処置した心臓における生着の4週間後でも観察される(図15)。FSTL1は、アポトーシスを防止することが示されており、虚血性傷害後の炎症を急性にモジュレートする可能性もあるが12、13、16、MI直後の心筋細胞のアポトーシスもしくはリスクのエリアに対して、またはMI後4日目および8日目におけるアポトーシスならびに炎症に対して、FSTL1の効果はなかった(図17)。
この実施例は、FSTL1のグリコシル化状態がその機能的状態における変化と結びついていることを示す。
新生児ラット心室心筋細胞(NRVC)を、新生児ラット心室心筋細胞単離キット(Cellutron)を用いて単離して、37℃で5%CO2を用いて培養した。簡単に説明すると、心室を日齢1〜2日のHsd:SDラット(Sprague Dawley)から切開して、次いで5回各15分間、酵素カクテルを用いて37℃で消化した。細胞をプールして、コーティングされていない細胞培養ディッシュ上で90分間予備的にプレーティングして線維芽細胞を除去し、1%ゼラチンでコーティングされた細胞培養プラスチックディッシュ上、高血清培地(DME/F12[1:1]、0.2%BSA、3mMピルビン酸ナトリウム、0.1mMアスコルビン酸、4mg/リットルのトランスフェリン、2mM L−グルタミン、および5mg/リットルのシプロフロキサシン、10%ウマ血清および5%ウシ胎仔血清(FBS)を補充)中で、3×105細胞/cm2でプレーティングした。24時間後に、培地を低血清培地(0.25%FCSを含む以外は同じ)と交換して、使用するまで細胞を培養した。
in vivoで、FSTL1によって細胞周期に入るように誘起された心筋細胞は、既存の筋細胞(Myh6+細胞)からまたは新たに前駆体集団から生じることもある。これらの可能性の間を見分けるために、既存のMyh6+心筋細胞を、タモキシフェン誘導性Creを心筋細胞特異的Myh6プロモーター18の制御下で使用して、遺伝的に標識して、それらの運命をMIおよびパッチ+FSTL1の生着(図5p)の後で追跡した。Myh6mERCremER:Rosa26Z/EGマウスに注射された4−OHタモキシフェンは、MI前に、既存の心筋細胞をeGFPで効率的に標識した(図5q)。パッチ生着の4週間後、eGFP+、pH3+細胞は、梗塞エリアおよび境界ゾーンで明瞭に可視であり(図5r〜u)、パッチ+FSTL1が、Myh6をLAD結紮およびパッチ生着前に発現した細胞に作用することを示した。
この実施例は、心外膜におけるパッチ+FSTL1送達の復元効果は進化的に保存されるようであることを示す。
虚血−再灌流のブタモデルにおけるパッチの適用:ブタにおける研究は、ヨークシャーブタ(日齢45日)でLADを閉塞するための経皮冠動脈血管形成術の拡張カテーテルの膨張により実施した。90分間の閉塞時間に続いて、臨床的MI疾患モデルを模倣する完全再灌流を行った。MIの1週間後に、左開胸を実施して、パッチを梗塞上に縫合した。動物群には:偽対照、無処置でI/R(n=3)、パッチ単独で処置したI/R(I/R+パッチ、n=1)、およびFSTL1を負荷したパッチで処置したI/R(I/R+パッチ+FSTL1、n=2)が含まれた。EdU送達:250mg/週のEdUを、研究の4週間の時間経過中に(I/R後、1週目〜5週目)、浸透圧ミニポンプを使用して、循環中に注入した。
FSTL1の作出された心外膜への送達を、心筋の虚血−再灌流傷害のブタモデルで評価した。梗塞前に、駆出率(EF)は、磁気共鳴イメージング(MRI)によって決定された約50%であった。I/Rの1週間後に、EF%は約30%に低下し、その後で、パッチ+FSTL1を傷害を受けた組織の心外膜に適用した。パッチ+FSTL1で処置したブタは、処置の2週目(実験の3週目)までに収縮性を回復し、約40%のEFを達成して、解析した最長時間である2週間にわたり安定を保った(図7a、b)。これは、未処置動物およびパッチ単独で処置した動物における心臓機能の定常的な低下と対照的であった(図7b)。パッチ+FSTL1で処置したブタは、パッチのみ動物を含む全ての処置の線維化組織の形成(瘢痕サイズ)中で最小の含有量を示した(代表的MRI画像(図7c、d)を参照されたい)。パッチグラフティングの4週間後(実験の5週目)に解析されたブタの組織は、パッチの宿主組織中への一体化および限定された線維化(図7e)ならびに血管平滑筋細胞のEdU標識化(図7f〜h)ならびに虚血性エリアの境界ゾーンにおける心筋細胞(図7i〜m)を示した。Aurora Bキナーゼが中心体に局在化された心筋細胞(細胞質分裂を示す)もパッチ+FSTL1で処置した心臓の境界ゾーンで検出された(図7n)。したがって、心外膜におけるパッチ+FSTL1の送達の復元効果は、進化的に保存されるようである。
この実施例は、mCMsESCのFSTL1処置はAkt−1の活性化を生じさせないことを示す。
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