JP2007089487A

JP2007089487A - 組織培養によるリモニウム・シヌアータの大量増殖法

Info

Publication number: JP2007089487A
Application number: JP2005283808A
Authority: JP
Inventors: Yukimasa Hirata; 行正平田; Hiroko Yamashita; 裕子山下
Original assignee: WAKAYAMAKEN NOGYO KYODO KUMIAI; WAKAYAMAKEN NOGYO KYODO KUMIAI RENGOKAI
Current assignee: WAKAYAMAKEN NOGYO KYODO KUMIAI; WAKAYAMAKEN NOGYO KYODO KUMIAI RENGOKAI
Priority date: 2005-09-29
Filing date: 2005-09-29
Publication date: 2007-04-12

Abstract

【課題】リモニウム・シヌアータの組織培養を用いた増殖において、「叢生症」といわれる奇形株が発生し問題となっている。また、培養期間の長期化および煩雑な移植作業・回数の増加により、生産コストが増大している。このリモニウム・シヌアータの組織培養を用いた増殖において奇形の発生が無く、増殖率が高く、簡便かつ低コストに増殖する手法を提供する。
【解決手段】リモニウム・シヌアータの花穂を培養し、新たな花穂を形成させ、形成された花穂頭部より多芽体を誘導し、誘導された多芽体を分割・移植して伸長させ、ついで伸長したシュートを発根させることにより、リモニウム・シヌアータの植物体を大量かつ低コストに再生することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、リモニウム・シヌアータ（Ｌｉｍｏｎｉｕｍｓｉｎｕａｔｕｍ）の組織培養を利用した大量増殖法に関するものである。

従来、リモニウム・シヌアータの増殖は、播種、株分けなどによって行われてきた。ここで、種子による増殖法であれば、遺伝形質の純化が十分になされていないため、開花期などを始めとする各種の形質が均一にならない場合が多い。また、単なる株分けなどの栄養繁殖法であれば、増殖率が低く、しかも増殖率のバラツキが大きいことから、安定した技術として確立されていない。挿し芽技術も開発されているが、親株育成の手間、ウイルス感染の危険性、発根率が安定しないなどの理由で普及していない（特許文献１を参照）。

更に、組織培養による大量増殖法も実用化されているが、該法のみでは生産コストがかかり過ぎこと、「叢生症」といわれる奇形株が発生すること（非特許文献１を参照）が普及上のネックになっている。
特許登録第３３２５１４３号「花専科育種と栽培スターチス」、藤田政良編著、誠文堂新光社）新見芳二編図解花のバイオ技術１９９２. ｐ１７２-１７３誠文堂新光社板木利隆施設園芸装置と栽培技術１９８８. ｐ４０８誠文堂新光社移植前培地のＢＡ濃度がスターチス・シヌアータのｅｘ-ｖｉｔｒｏｒｏｏｔｉｎｇに及ぼす影響. 平田ら. 園学雑.６７別２. ５８１

リモニウム・シヌアータの組織培養による増殖は、増殖率が低く、また増殖率を高めるために、培地中に添加する植物ホルモンであるサイトカイニン濃度をあげることにより、「叢生症」といわれる奇形株が発生し問題となっている。さらに、奇形株の発生を恐れるがために、使用する植物ホルモン濃度を低くするため、増殖率が低くなり、培養期間の長期化および煩雑な移植作業・回数の増加により、生産コストが増大している。

本発明者らは、従来のリモニウム・シヌアータの組織培養による増殖には前記した問題点のあることを認知した上で、従来法とは異なる培養法を行い、リモニウム・シヌアータの奇形のない苗を効率よく低コストに増殖できる方法について検討した。

本発明は、リモニウム・シヌアータの花穂を培養し、新たな花穂を形成させ、形成された花穂頭部より多芽体を誘導し、誘導された多芽体を分割・移植して伸長させ、次いで伸長したシュートを発根させることにより植物体を再生することを特徴とするリモニウム・シヌアータの組織培養による大量増殖法である。

本発明では、リモニウム・シヌアータの花穂から花穂を形成させることによって、維持・増殖を行い、花穂頭部から多芽体を誘導し、誘導された多芽体を分割・移植して伸長させ、次いで伸長したシュートを発根させることにより、植物体を再生することができる。本発明により、短期間に大量に奇形のないリモニウム・シヌアータの苗を低コストに生産することが可能となった。

本発明で対象とする植物はリモニウム・シヌアータである。本発明は以下の段階に分けられる。
（１）花穂による増殖。リモニウム・シヌアータの花穂頭部又は腋芽が培養され、花穂が形成される。必要に応じて花穂を培養し再び花穂を形成させることにより繰り返し増殖が可能である。
（２）増殖された花穂頭部を培養し、多芽体を形成させる。
（３）形成された多芽体を分割移植し、培養し伸長させ培養シュートを得る。
（４）得られた培養シュートを支持材に挿し芽し、発根せしめ植物体とする。
以下、本発明を詳細に説明する。

（発明に用いられる培地）
本発明で使用される培地は、無機成分および炭素源を必須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類を添加し、更に必要に応じてアミノ酸類を添加した培地を用いるのが好ましい。前記培地に用いられる無機成分としては、窒素、リン、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルトなどの元素を含む無機塩をあげることができ、具体的には、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、硫酸亜鉛、ホウ酸、塩化コバルトなどの化合物を例示できる。炭素源としては、炭水化物、例えばショ糖、トレハロース、グルコース、マルトース、デンプンが用いられる。また、ココナッツウォータ、酵母エキスを用いることもできる。植物成長調節物質としては、例えばオーキシン、サイトカイニン、ジベレリンが用いられる。オーキシンとしては、例えば３−インドール酢酸（ＩＡＡ）、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２,４−ジクロロフェノキシ酢酸（２,４-Ｄ）、４−クロロ−２−メチルフェノキシ酢酸、ｐ−クロロフェノキシ酢酸、２,４,５−トリクロロフェノキシ酢酸等が挙げられ、サイトカイニンとしては、例えばベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、カイネチン、ゼアチン、６−（γ，γ−ジメチルアラミノ）プリン（２ｉＰ）、Ｎ−（２−クロロ−４−ピリド）−Ｎ’−フェニルウレア（ＣＰＰＵ）、１−フェニル−３−（１,２,３−ティアディアゾール−５−ＹＬ）ウレア（チディアズロン）、ジベレリンとしてはＧＡ３等が挙げられる。ビタミンとしては、例えばチアミン、ピリドキシン、ニコチン酸等が挙げられる。アミノ酸としては、例えばアデニン、グリシン、グルタミン酸、リジン等が挙げられる。

前記培地として具体的には、従来から知られている植物の組織培養に用いられている培地、例えば、ムラシゲ・スクーグ(１９６２)[Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ & Ｓｋｏｏｇ]の培地（以下、ＭＳ培地）、ホワイト(１９６３)[Ｗｈｉｔｅ]の培地、ガンボルグ[Ｇａｍｂｏｒｇ]のＢ-５培地、ニッチ・ニッチの培地[Ｎｉｔｃｈ & Ｎｉｔｃｈ]等に必要に応じて糖類などの炭素源、植物ホルモン、ビタミン類、アミノ酸類を添加して調整された培地を例示でき（非特許文献２を参照）、あるいは水耕栽培に用いる園試処方等の水耕液を例示できる（非特許文献３を参照）が特に限定はされない。また、培地固化剤としては、ゲルライト、寒天等が挙げられ、培地支持体としては、フロリアライト、バーミキュライト、パーライト、赤球土等が挙げられる。本発明では、花穂を培養し花穂を形成させる培地、花穂から多芽体を形成させる培地、及び多芽体を伸長させ培養シュートを形成させる培地は、ＭＳ培地及びその改変培地が好ましい。本発明で改変培地とは、培地中の各種成分量を、ＷＰ培地中の成分量未満から約２０％の量に減少させた培地を指し、例えば各種成分量を１／３、１／２、２／３等に減少させた培地が挙げられる。

（至適条件）
花穂を培養し、花穂の形成を促進するためには、ＢＡＰおよびアンシミドールを含有するＭＳ個体培地あるいはその改変培地で培養するのが好ましい。特に、ＢＡＰを０.０２〜２.２ｍｇ/ｌ、好ましくは０.０６〜０.６７ｍｇ/ｌ、アンシミドールを０.０１〜１０.０ｍｇ/ｌ、好ましくは０.１〜１.０ｍｇ/ｌ、ショ糖を２０〜８０ｇ/ｌ、好ましくは４０〜６０ｇ/ｌ含有するＭＳ個体培地あるいはその改変培地を用いることが好ましい。花穂の培養は１５〜２５℃で、５００〜３,０００ｌｕｘで２〜４週間ごとに移植することが望ましい。この培地で移植を続けることで、増殖をすることが可能である。また、貯蔵は、培養器ごと２〜１０℃で６ヶ月以上移植なしに保存することが可能である。

次いで、形成された花穂頭部を分割・移植し、多芽体形成を促進するためにはＢＡＰおよびアンシミドールを含有するＭＳ個体培地あるいはその改変培地で培養するのが好ましい。特に、ＢＡＰを０.０２〜６.７ｍｇ/ｌ、好ましくは０.７〜２.２ｍｇ/ｌ、アンシミドールを０.０１〜１０.０ｍｇ/ｌ、好ましくは０.１〜１.０ｍｇ/ｌ、ショ糖を５〜４０ｇ/ｌ、好ましくは１０〜２０ｇ/ｌ含有するＭＳ個体培地あるいはその改変培地を用いることが好ましい。花穂の培養は２０〜３０℃で、５００〜２,０００ｌｕｘで２〜４週間ごとに移植することが望ましい。

このようにして形成された多芽体を分割・移植し、培養シュートを形成させることができる。培地はＢＡＰを０〜０.２ｍｇ/ｌ、ショ糖を５〜２０ｇ/ｌ含有するＭＳ個体培地あるいはその改変培地で培養するのが好ましい。長さ３ｃｍ以上に伸長した培養シュートは、容易に発根せしめ植物体とすることができる（非特許文献４を参照）。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１）
リモニウム・シヌアータ品種‘ティンズブルー’の培養器内で維持している花穂を用いた。花穂を形成させる培地として、窒素分を１/２としたＭＳ改変培地に固化剤としてゲルライト３.０ｇ/ｌ、ショ糖４０ｇ/ｌ、コーンスターチ５ｇ/ｌ、ＮＡＡを０.００２ｍｇ/ｌ及びＢＡＰを０〜２.２ｍｇ/ｌ、アンシミドールを０〜１０ｍｇ/ｌ添加し、塩化カリウムでｐＨを５.７に調整後、オートクレーブ（１２１℃、１.２ａｔｍ、２０分の条件）で殺菌して用いた。培養は２２±２℃、１６時間日長（２,０００ｌｕｘ）で行った。各区５切片を植え込み、２週間後の平均花穂形成数の結果を表１に示した。

ＢＡＰの濃度が０.０６乃至０.６７ｍｇ/ｌにおいて、花穂より再び花穂を形成させることができたが、それ以下の濃度では、花穂は開花に至り、それ以上の濃度では萌芽し、葉を展開し、花穂の維持・増殖は困難だった。また、ＢＡＰの濃度が適当なとき、アンシミドールの添加により花穂の再形成は促進され、０.１ｍｇ/ｌの濃度で添加したときが最も効果的だった。

（実施例２）
リモニウム・スターチス品種‘ティンズブルー’の培養器内で維持している花穂を用いた。多芽体を形成させる培地として、窒素分を１/２としたＭＳ改変培地に固化剤としてゲルライト３.０ｇ/ｌ、ショ糖２０ｇ/ｌ、コーンスターチ５ｇ/ｌ、ＮＡＡを０.００２ｍｇ/ｌ及びＢＡＰを０〜２.２ｍｇ/ｌ、アンシミドールを０〜１ｍｇ/ｌ添加し、塩化カリウムでｐＨを５.７に調整後、オートクレーブ（１２１℃、１.２ａｔｍ、２０分の条件）で殺菌して用いた。培養は２２±２℃、１６時間日長（２,０００ｌｕｘ）で行った。各区１０切片を植え込み、４週間後に多芽体を形成した切片の数（多芽体形成数）および形成したものについて１つの多芽体から得られた平均シュート数の結果を表２に示した。

表２の結果から明らかなように、ＢＡＰの濃度が０.６７乃至２.２ｍｇ/ｌにおいて、花穂より多芽体を形成させることができたが、それ以下の濃度では、花穂は二次的に花穂を形成するか開花するかだった。ＢＡＰの濃度が０.６７ｍｇ/ｌでは、アンシミドールの添加により花穂の再形成は促進され、１ｍｇ/ｌの濃度で添加したときが最も効果的だった。ＢＡＰの濃度が２.２ｍｇ/ｌでは、アンシミドールの添加により花穂の再形成は促進されたが、このときの最も効果的な濃度は０.１ｍｇ/ｌだった。

（比較例１）
リモニウム・スターチス品種‘ティンズブルー’のハウスで栽培している株から形成された花穂を用いた。花穂頭部を７０％エタノール中で３０秒、２％次亜塩素酸ナトリウム中で７分間表面殺菌を行い、滅菌水で数回洗浄後、滅菌濾紙上で風乾した。風乾後、培地に植え付けた。培地組成ならびに培養条件は実施例１と同様とした。各区１０切片を植え込み、４週間後に多芽体を形成した切片の数（多芽体形成数）および形成したものについて１つの多芽体から得られた平均シュート数の結果を表２に示した。

また、表２および表３の結果から明らかなように、花穂からの多芽体形成には、培養で増殖・形成された花穂が適当で、栽培により形成された花穂を材料とした場合、多芽体は形成されなかった。

（実施例３）
実施例２により得られたリモニウム・シヌアータ品種‘ティンズブルー’の多芽体を用いた。多芽体を伸長させる培地として、窒素分を１/２としたＭＳ改変培地に固化剤としてゲルライト３.０ｇ/ｌ、ショ糖１０ｇ/ｌ、コーンスターチ５ｇ/ｌ添加し、塩化カリウムでｐＨを５.７に調整後、オートクレーブ（１２１℃、１.２ａｔｍ、２０分の条件）で殺菌して用いた。培養は２２±２℃、１６時間日長（３,０００ｌｕｘ）で行った。４週間後に伸長した培養シュートを１本ずつ切り分け、１０００ｐｐｍのＩＢＡを含浸させたロックウールに挿し芽を行い、発根を誘導し植物体を得た。無作為に１００本の苗を選び、苗の形状を調査した。葉序の配向の乱れているものを奇形株とした。結果を表４に示した。

（比較例２）
培養で維持しているリモニウム・シヌアータ品種‘ティンズブルー’の培養シュートを用いた。シュートを増殖させる培地として、窒素分を１/２としたＭＳ改変培地に固化剤としてゲルライト３.０ｇ/ｌ、ショ糖２０ｇ/ｌ、コーンスターチ５ｇ/ｌ、ＮＡＡを０.００２ｍｇ/ｌ及びＢＡＰを２.２ｍｇ/ｌ添加し、塩化カリウムでｐＨを５.７に調整後、オートクレーブ（１２１℃、１.２ａｔｍ、２０分の条件）で殺菌して用いた。培養は２２±２℃、１６時間日長（２,０００ｌｕｘ）で行った。培養は４週間ごとに移植を５回繰り返した。得られた増殖シュートは実施例３と同様にシュートを伸長させた後、苗として形状を調査した。結果を表４に示した。

表４に示したように、本発明による実施例３の手法で得られた苗からは奇形株が発生しなかったのに対し、従来法である比較例２の手法で得られた苗は１００株中３２株が異常な形態を示した。

Claims

リモニウム・シヌアータの花穂を培養し、新たな花穂を形成させ、得られた花穂頭部より多芽体を誘導し、得られた多芽体を分割・移植して伸長させ、次いで伸長したシュートを発根させることにより植物体を再生することを特徴とするリモニウム・シヌアータの組織培養による大量増殖法。
リモニウム・シヌアータの花穂を、ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、アンシミドールを含有する培地で培養し、再び花穂を形成させることを特徴とする請求項１記載の大量増殖法。
培養により形成されたリモニウム・シヌアータの花穂頭部を、ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、アンシミドールを含有する培地で培養し、多芽体を形成させることを特徴とする請求項１、または請求項２記載の大量増殖法。