JP2006512098A - 水性種の合成核酸 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照してここに組み込まれる、2000年8月24日出願の米国特許出願第09/645,706号の米国特許法第120条に基づく優先権を主張する。
文中でカッコ内の第一著者の姓で記される文献の完全な参考文献一覧を参考文献の項に記載した。
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本発明のために、以下の定義を適用する:
ここで用いられる用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたはタンパク質前駆体の生産に必要なコーディング配列を含有するDNA配列を意味する。ポリペプチドは、所望のタンパク質活性が保持される限り、全長コーディング配列により、またはコーディング配列のいかなる部分によりコードされる。
ここで用いられる「アミノ酸」は、J. Biol. Chem., 243: 3557-59 (1969)中の標準的なポリペプチド命名法に従って記載される。
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参照。アラインメントはまた、検査により手動で行われる。
本発明は蛍光タンパク質をコードする合成核酸分子を含有する組成物ならびに、特定の細胞型で発現される際に、減少した不適切なまたは意図しない転写特性を含む所望の特性を有するポリペプチドまたはタンパク質として効果的に発現される合成核酸分子を得る前記分子を調製する方法を提供する。
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)およびBCM Gene Finderを用いて同定することができる。配列を同定した後、修飾を導入する。所望の核酸配列が得られると、当業者に周知の方法(例えば、重複プライマーを用いたPCRまたは市販の遺伝子合成)により該配列を調製できる。標的核酸配列と比較されるその構造的、および機能的特性として、パーセント同一性、ある配列、例えば制限配列の存在の有無、改変コドンのパーセント(例えば、あるコドンの使用の増減)および発現率をあげることができるが、これに限定されない。
本発明の合成遺伝子は好ましくは、その元の一部(または殆ど全て)として同一タンパク質をコードし、元のタンパク質と比較すると、改良されたコドン使用を有し、その一方で、コーディング領域中の既知の転写調節配列を大きく欠いている。(少数のアミノ酸変化が天然の部分タンパク質の特性を増強する、例えば、蛍光タンパク質の蛍光特性を増強するのに望ましいことが認識される。)これは合成遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベルを増加し、タンパク質の異常発現のリスクを減少する。例えば、遺伝子制御の多くの重要な事象についての研究は、弱いプロモーターにより仲介されるが、レポータータンパク質の不適切な発現の不十分なレポーターシグナルにより限定される。ここに記述される合成蛍光タンパク質遺伝子は、発現レベルを大きく増加しているために、弱いプロモーター活性の検出ができ、検出感度を増加することが可能である。さらなる利点は、限られた量しか得られない転写因子が、非生産的結合事象では細胞により利用されないことである。また、いくつかの選択マーカーの利用が外来細胞中のマーカーの発現により限定される。それゆえ、その細胞における改良されたコドン使用を有し、他の好ましくない配列(例えば、転写因子結合配列)が減少している合成選択マーカー遺伝子が、それらのマーカーの宿主として同様に好ましくない細胞で、マーカーとしての利用を可能にする。
Green II、すなわちMontastraea cavernosaから単離された野生型遺伝子から作製された変異緑色蛍光タンパク質の遺伝子が、本発明を実証するために用いられた。Green IIは、光退色に対して高度の耐性を有している。それゆえ、例えば細胞のモニタリングに有用である。光退色は、蛍光プローブ中の光により誘導された変化であり、蛍光プローブによる特定波長光の吸収の消失および蛍光プローブの蛍光の消失をもたらす。この特性は、例えば、写真が得られる時間、または試料を観察する時間を減少することにより、いくつかの蛍光タンパク質の有用性を限定できる。したがって、高度の光退色耐性を有する蛍光タンパク質は、持続性の蛍光が所望される場合には有利である。
McGFPは、Montastraea cavernosaから単離された緑色蛍光タンパク質(GFP)である。McGFPを第一回目の低ストリンジェンシーPCRの間に変異させ、野生型遺伝子に突然変異を導入した。第一回目のPCRから、Green Iを製造した。Green Iは、野生型GFPよりも比較的高い蛍光強度を有していた。Green Iを、Green IをコードするDNAに対して行った第二回目の低ストリンジェンシーPCRの間に変異させ、Green IIを作出した。Green IをコードするDNA配列と比較すると、Green IIをコードするDNAは、一個のヌクレオチドの変化:ヌクレオチド527のシトシンのチミンへの突然変異を含んでいる。この結果、Green Iの76番目のSが、Green IIの同位置ではFとなる。Green IIは光退色に対して高い耐性を有していた。
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)で見出すことができる。
SequenceShaper標準パラメーター:
・Remaining threshold: 0.70コア類似性/最適化-0.20マトリックス類似性(初期値)
・別の部位を挿入しない
・オープンリーディングフレーム(ORF)を保存する
「Remaining threshold」は、突然変異が導入された後にそれぞれの同定された配列が有するスコアを特定する。可能な突然変異が見出されないならば、これらのthresholdは増加する。「別の部位を挿入しない」ことにより、MatInspectorプロフェッショナルを用いた配列の同定に用いられるユーザー定義マトリックスに含まれる別の配列の生成が妨げられる。「オープンリーディングフレーム(ORF)を保存する」ことにより、提起されるべき、配列がコードするアミノ酸に影響しない唯一の突然変異が得られる。可能な突然変異のリストから、好ましいコドンを導入したものを好ましく選択した。マイナス鎖の大腸菌リボソーム結合配列および下流21塩基より短い位置のメチオニンコドンが続かないものは無視した。いくつかの転写調節配列または制限酵素認識配列は、新たな転写調節配列または制限酵素認識配列を導入せずに削除することは不可能であった。そのような場合には、記述した設計基準に最も一致するいずれかの配列を保守するように決定した。
Claims (64)
- 蛍光タンパク質をコードする元の核酸配列のコドンと25%超の異なるコドン組成を有する蛍光ポリペプチドのコーディング領域のヌクレオチドを含有する合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が前記元の核酸配列のそのような配列の平均数に比べて少なくとも3倍より少ない転写調節配列を有している合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記転写調節配列が転写因子結合配列、イントロンスプライス配列、ポリ(A)付加配列およびプロモーター配列からなる群から選択される合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が前記元の核酸配列のそのような配列の平均数に比べて少なくとも5倍少ない転写調節配列を有している合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子によりコードされるポリペプチドが前記元の核酸配列によりコードされるポリペプチドと少なくとも85%の配列同一性を有する合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子によりコードされるポリペプチドが前記元の核酸配列によりコードされるポリペプチドと少なくとも90%の連続した配列同一性を有する合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子のコドン組成が前記元の核酸配列と35%超のコドンで異なる合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子のコドン組成が前記元の核酸配列と45%超のコドンで異なる合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子のコドン組成が前記元の核酸配列と55%超のコドンで異なる合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、異なるコドンの大部分が望ましい宿主細胞の好ましいコドンである合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が緑色蛍光ポリペプチドをコードする合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が元々Montastraea cavernosaから単離された核酸に由来する緑色蛍光ポリペプチドをコードする合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が配列番号:1(hGreen II)を含有する合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記元の核酸配列が緑色蛍光ポリペプチドをコードする合成核酸分子。
- 請求項13記載の合成核酸分子であって、前記元の核酸配列がMontastraea cavernosaから単離された緑色蛍光ポリペプチドをコードする合成核酸分子。
- 請求項14記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が配列番号:2のアミノ酸をコードする合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子中で異なるコドンの大部分が哺乳動物でより頻度高く用いられるコドンである合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子中で異なるコドンの大部分がヒトで好ましく用いられるコドンである合成核酸分子。
- 請求項17記載の合成核酸分子であって、異なるコドンの大部分がヒトのコドンCGC、CTG、TCT、AGC、ACC、CCA、CCT、GCC、GGC、GTG、ATC、ATT、AAG、AAC、CAG、CAC、GAG、GAC、TAC、TGCおよびTTCである合成核酸分子。
- 請求項17記載の合成核酸分子であって、異なるコドンの大部分がヒトのコドンCGC、CTG、TCT、ACC、CCA、GCC、GGC、GTCおよびATC、またはコドンCGT、TTG、AGC、ACT、CCT、GCT、GGT、GTGおよびATTである合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子中で異なるコドンの大部分が植物で好ましく用いられるコドンである合成核酸分子。
- 請求項20記載の合成核酸分子であって、異なるコドンの大部分が植物のコドンCGC、CTT、TCT、TCC、ACC、CCA、CCT、GCT、GGA、GTG、ATC、ATT、AAG、AAC、CAA、CAC、GAG、GAC、TAC、TGCおよびTTCである合成核酸分子。
- 請求項20記載の合成核酸分子であって、異なるコドンの大部分が植物のコドンCGC、CTT、TCT、ACC、CCA、GTC、GGA、GTCおよびATC、またはコドンCGT、TGG、AGC、ACT、CCT、GCC、GGT、GTGおよびATTである合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が哺乳動物宿主細胞中で、前記元の核酸配列のレベルよりも高いレベルで発現される合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が増加したCTGまたはTTGのロイシンをコードするコドン数を有する合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が増加したGTGまたはGTCのバリンをコードするコドン数を有する合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が増加したGGCまたはGGTのグリシンをコードするコドン数を有する合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が増加したATCまたはATTのイソロイシンをコードするコドン数を有する合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が増加したCCAまたはCCTのプロリンをコードするコドン数を有する合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が増加したCGCまたはCGTのアルギニンをコードするコドン数を有する合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が増加したAGCまたはTCTのセリンをコードするコドン数を有する合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が増加したACCまたはACTのスレオニンをコードするコドン数を有する合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が増加したGCCまたはGCTのアラニンをコードするコドン数を有する合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子中の異なるコドンが前記元の核酸配列中の対応するコドンと同一のアミノ酸をコードする合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が前記元の核酸配列のレベルの少なくとも110%のレベルで同一条件下細胞または細胞抽出物に発現される合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子によりコードされるポリペプチドがアミノ酸配列において、前記元の核酸配列によりコードされるポリペプチドと同一である合成核酸分子。
- 請求項1記載の合成核酸分子であって、前記合成核酸分子が配列番号:1(hGreen II)、配列番号:3のヌクレオチド22から702(2M1-h)、配列番号:5のヌクレオチド22から702(2M1-h1)、配列番号:7のヌクレオチド22から702(2M1-h2)、配列番号:9のヌクレオチド22から702(2M1-h3)、配列番号:11のヌクレオチド22から702(2M1-h4)、配列番号:13のヌクレオチド22から702(2M1-h5)、配列番号:15のヌクレオチド39から719(2M1-h6)、または配列番号:17のヌクレオチド38から718(2M1-h7)を含有する合成核酸分子。
- 元のベクター骨格に比べて少なくとも3倍少ない転写調節配列を有する合成ベクター骨格と請求項1記載の核酸を含有するベクター構築物。
- 請求項1記載の合成核酸分子を含有するプラスミド。
- 細胞中で機能するプロモーターを連結した請求項1記載の合成核酸分子を含有する発現ベクター。
- 請求項39記載の発現ベクターであって、前記合成核酸分子が操作できるようにコザックコンセンサス配列に連結している発現ベクター。
- 請求項39記載の発現ベクターであって、前記プロモーターが哺乳動物細胞中で機能する発現ベクター。
- 請求項39記載の発現ベクターであって、前記プロモーターがヒト細胞中で機能する発現ベクター。
- 請求項39記載の発現ベクターであって、前記プロモーターが植物細胞中で機能する発現ベクター。
- 請求項39記載の発現ベクターであって、前記発現ベクターがさらにマルチクローニング部位を含有する発現ベクター。
- 請求項44記載の発現ベクターであって、前記マルチクローニング部位が前記プロモーターと前記合成核酸分子との間に位置する発現ベクター。
- 請求項44記載の発現ベクターであって、前記マルチクローニング部位が前記合成核酸分子の下流に位置する発現ベクター。
- 請求項39記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
- 適当な容器中に請求項39記載の発現ベクターを含有するキット。
- 少なくとも低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下、配列番号:1(hGreen II)、配列番号:3のヌクレオチド22から702(2M1-h)、配列番号:5のヌクレオチド22から702(2M1-h1)、配列番号:7のヌクレオチド22から702(2M1-h2)、配列番号:9のヌクレオチド22から702(2M1-h3)、配列番号:11のヌクレオチド22から702(2M1-h4)、配列番号:13のヌクレオチド22から702(2M1-h5)、配列番号:15のヌクレオチド39から719(2M1-h6)、または配列番号:17のヌクレオチド38から718(2M1-h7)を含有する前記合成核酸分子またはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
- 請求項49記載のポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で、配列番号:1(hGreen II)を含有する前記合成核酸分子またはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
- a)蛍光ポリペプチドをコードする元の核酸配列に比べて少なくとも3倍少ない転写調節配列を有する合成核酸分子を得るために、前記元の核酸配列中にある複数の転写調節配列を変化させること、および
b)さらに合成核酸分子を得るために、転写調節配列を減少させた前記合成核酸配列中にある25%より多くののコドンを変化させること、
を特徴とする、オープンリーディングフレームを含有する合成核酸分子を調製する方法であって、変化させるコドンが転写調節配列を増加させず、前記さらなる合成核酸分子が、前記元の核酸配列によりコードされるポリペプチドと85%以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする方法。 - a)コドンを変化させた合成核酸分子を得るために、蛍光ポリペプチドをコードする元の核酸配列中にある25%より多くのコドンを変化させること、および
b)前記元の核酸配列の対応するコドンとは異なるコドンを有する合成核酸分子と比べて少なくとも3倍少ない転写調節配列を有するさらなる合成核酸分子を得るために、前記コドンを変化させた合成核酸分子中にある複数の転写調節配列を変化させること、
を特徴とする、オープンリーディングフレームを含有する合成核酸分子を調製する方法であって、前記さらなる合成核酸分子が、前記元の核酸配列によりコードされるポリペプチドと85%以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする方法。 - 請求項51または52に記載の方法であって、前記転写調節配列が転写因子結合配列、イントロンスプライス配列、ポリ(A)付加配列、エンハンサー配列およびプロモーター配列からなる群から選択される方法。
- 請求項51または52に記載の方法であって、前記元の核酸配列が緑色蛍光ポリペプチドをコードする方法。
- 請求項51または52に記載の方法であって、前記元の核酸配列がMontastraea cavernosaから単離された緑色蛍光ポリペプチドをコードする方法。
- 請求項51または52に記載の方法であって、前記合成核酸分子が中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下、前記元の核酸配列とハイブリダイズする方法。
- 請求項51または52に記載の方法であって、変化したコドンが前記元の核酸配列中の対応するアミノ酸と同一のアミノ酸をコードする方法。
- 請求項52または53に記載の方法により調製された前記さらなる合成核酸分子である合成核酸分子。
- 請求項51または52に記載の方法であって、前記元の核酸配列によりコードされるポリペプチドと比べて少なくとも一つのアミノ酸置換があるポリペプチドをコードするために、前記さらなる合成核酸分子を変化させることをさらに特徴とする方法。
- 請求項51または52に記載の方法であって、転写調節配列の前記変化が前記合成核酸分子によりコードされるポリペプチドの1%未満のアミノ酸置換を誘導する方法。
- a)前記元の核酸配列中にあるコドンの数に比べより頻繁に宿主細胞中で用いられる第一の複数のコドンが増加した合成核酸配列を得るために元の核酸配列を変化させること;および
b)前記元の核酸配列中にあるコドンの数に比べより頻繁に宿主細胞中で用いられる第二の複数のコドンが増加したさらなる合成核酸配列を得るために前記元の核酸配列を変化させること、
を特徴とする蛍光ポリペプチドをコードする元の核酸配列の異なる種類のコドンである少なくとも二つの合成核酸分子を調製する方法であって、前記第一の複数のコドンが前記第二の複数のコドンより異なり、前記合成核酸分子および前記さらなる合成核酸分子が同一のポリペプチドをコードする方法。 - 請求項61に記載の方法であって、前記合成核酸分子、前記さらなる合成核酸分子、もしくはその両者と比べ、少なくとも3倍少ない転写調節配列を有する少なくとも一つのさらにさらなる合成核酸分子を得るために、前記合成核酸分子、前記さらなる合成核酸分子、もしくはその両者中の複数の転写調節配列を変化させることをさらに特徴とする方法。
- 請求項61に記載の方法であって、第一の合成核酸配列によりコードされるポリペプチドと比べ、少なくとも一つのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする第一の変化した合成配列を得るために、前記第一の合成配列中の少なくとも一つのコドンを変化させることをさらに特徴とする方法。
- 請求項61に記載の方法であって、第一の合成核酸配列によりコードされるポリペプチドと比べ、少なくとも一つのアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする第二の変化した合成配列を得るために、前記第二の合成配列中の少なくとも一つのコドンを変化させることをさらに特徴とする方法。
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