CN111690689A - 人源化ccr2基因改造动物模型的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法及其应用，涉及生物技术领域。本发明构建的人源化CCR2基因改造动物模型能够加速与人CCR2基因或蛋白相关的领域的研究进展，例如利用人源化CCR2基因改造动物模型代替人试药，为进行CCR2靶点药物的临床前实验提供有效的模型和有力的工具。优选的，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将鼠源的Ccr2基因替换为人源的CCR2基因，构建能与抗人源CCR2抗体相互作用的小鼠模型，该模型与普通小鼠相比，实现了关键靶分子的人源化改造，可用于筛选和评价针对人CCR2基因的药物，是非常理想的临床前药物测试模型。

Description

人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法及其应用。
背景技术
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。常见的实验动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠(仓鼠)、兔、犬、猴、猪、鱼等。虽然人类绝大部分基因在动物中存在同源基因，但在基因序列和蛋白质序列上，人类和动物仍然存在不少差异，导致许多针对人类靶点的药物不能与动物体内的同源蛋白结合产生药效，这在大分子抗体药物中尤其显著，因为大分子抗体药物的特异性很高，一个氨基酸的差异都有可能导致抗体不识别靶分子，例如针对人类PD-1靶点的抗肿瘤药物Keytruda，就不能识别小鼠的Pd-1蛋白，导致无法用这些动物进行临床前药理药效、药物代谢以及药物毒性安全性评价。因此，大量的临床前研究急需更好的动物模型。
随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类细胞或基因替代或置换动物的内源性同类细胞或基因，以建立更接近人类的生物体系或疾病模型，建立人源化实验动物模型(humanized animal model)，已经为临床上新的治疗方法或手段提供了重要工具。其中基因人源化动物模型，即利用基因修饰操作技术，用人类正常或突变基因替换动物同源基因，可在动物体内建立更接近人类疾病特征的正常或突变基因的基因人源化动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可提高药物对体内药靶的识别性，更重要的是，由于人类基因片段的存在，动物体内可表达或部分表达人类功能的蛋白质，从而大大减少临床前动物实验与临床实验结果的差异，为在临床前动物体内水平进行药物筛选和验证提供了可能。
CCR2属于G蛋白偶联受体，含有7个跨膜区，编码355个氨基酸残基蛋白，相对分子质量为41000。人类的CCR2基因定位于3p21，编码CCR2蛋白。CCR2在单核细胞中是组成性表达，而在T淋巴细胞中是诱导性表达。CCR2是CCL2的关键功能受体，也可以结合CCL7和CCL12。CCR2与CCL2结合，可以诱导单核/巨噬细胞趋化并激活，通过调节其它炎性介质的产生和释放形成级联反应，介导炎症反应。
目前，使用CCR2抑制剂靶向乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌和结直肠癌等恶性肿瘤的CCL2-CCR2轴是抑制肿瘤生长和转移的有效思路。而人源CCR2靶点药物的筛选及临床前试验需要在动物模型上进行评价，但由于种属性的差异，人源CCR2与鼠源Ccr2蛋白的同源性只有68％，在小鼠上筛选的靶点药物并不完全适用于人类，同样针对人源CCR2蛋白的药物也不一定能够识别小鼠的Ccr2蛋白。因此，构建具有人源CCR2靶点的人源化小鼠模型，在筛选评价人源CCR2靶点药物中具有非常高的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法及其应用，能够加速与人CCR2基因或蛋白相关的领域的研究进展。
为实现以上目的，本发明提供一种人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法，包括：
在非人动物细胞内导入人CCR2基因，使得该人CCR2基因在非人动物细胞中表达产生人源化的CCR2蛋白，同时降低或消除所述非人动物细胞内的内源CCR2基因的表达。
本发明一些实施例中，利用基因编辑技术实现所述CCR2基因人源化动物细胞的构建，在所述非人动物细胞内形成人源化CCR2基因；
可选的，所述非人动物为啮齿类动物；可选的，所述非人动物细胞为受精卵细胞；
可选的，所述啮齿类动物为小鼠，所述构建方法将小鼠的Ccr2基因的第3号外显子的全部或部分序列替换为人CCR2基因的第3号外显子的全部或部分序列。
本发明一些实施例中，所述人CCR2基因选自下列组中的至少一种：
(a)所述基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：6所示；
(b)所述基因转录的mRNA序列如SEQ ID NO：7所示；
(c)所述基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO：8所示。
本发明一些实施例中，所述构建方法使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术实现，所述构建方法具体包括：提供人CCR2基因同源重组载体、sgRNA以及Cas9的混合物，所述Cas9包括Cas9 mRNA和/或Cas9蛋白，将所述混合物注射到所述非人动物细胞中，将所述非人动物细胞转移至培养液中进行培养。
本发明一些实施例中，所述人CCR2基因同源重组载体包括从5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人CCR2基因编码区以及3’同源臂，所述5’同源臂为与小鼠Ccr2基因的第3号外显子5’端同源的DNA片段，所述3’同源臂为与小鼠Ccr2基因的第3号外显子3’端同源的DNA片段；
所述sgRNA在小鼠Ccr2基因的5’端靶位点和3’端靶位点均位于小鼠Ccr2基因的第3号外显子上。
可选的，所述5’同源臂的DNA序列如SEQ ID NO：9所示，所述3’同源臂的DNA序列如SEQ ID NO：10所示；
可选的，所述人CCR2基因编码区的DNA序列如SEQ ID NO：11所示；
可选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：18-27任一项所示，所述sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：28-37任一项所示；
优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：21所示，所述sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：35所示。
本发明还提供一种人源化CCR2基因改造动物细胞，所述人源化CCR2基因改造动物细胞由上述人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法获得。
本发明还提供一种人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法，将上述人源化CCR2基因改造动物细胞或者由所述人源化CCR2基因改造动物细胞发育得到的胚胎移植至代孕母体内进行发育，得到F0代动物；
对F0代动物进行检验，获得基因型鉴定正确的F0代阳性动物。
可选的，所述人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法还包括：将所述F0代阳性动物通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，同时杂合子小鼠自交获得纯合子小鼠，建立稳定的人源化CCR2基因改造小鼠品系。
本发明还提供一种细胞或细胞系或细胞培养物，所述细胞或细胞系或细胞培养物来源于人源化CCR2基因改造动物模型或其子代，所述人源化CCR2基因改造动物模型由上述人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法获得。
本发明还提供一种组织或器官，所述组织或器官来源于人源化CCR2基因改造动物模型或其子代，所述人源化CCR2基因改造动物模型由上述人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法获得。
本发明还提供由上述人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法获得的人源化CCR2基因改造动物模型、来源于所述人源化CCR2基因改造动物模型的细胞、细胞系或细胞培养物、组织、器官在与人CCR2基因或蛋白相关的领域中的应用。
可选的，所述应用包括人CCR2基因功能研究、人CCR2抗体研究、针对人CCR2靶位点的药物制备和药效研究中的至少一种。
本发明的有益效果：
本发明提供一种人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法及其应用，本发明构建的人源化CCR2基因改造动物模型能够加速与人CCR2基因或蛋白相关的领域的研究进展，例如利用人源化CCR2基因改造动物模型代替人试药，为进行CCR2靶点药物的临床前实验提供有效的模型和有力的工具。
优选的，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在免疫系统健全的小鼠上，将鼠源的Ccr2基因替换为人源的CCR2基因，构建能与抗人源CCR2抗体相互作用的小鼠模型，该模型与普通小鼠相比，实现了关键靶分子的人源化改造，并且保留了完整的免疫系统，可用于筛选和评价针对人CCR2基因的药物，是非常理想的临床前药物测试模型。
进一步的，本发明构建的CCR2人源化小鼠，将小鼠Ccr2基因的胞外区替换为人源序列，而胞内区则保留完整的鼠源序列。制作成功的人源化小鼠拥有人源胞外区，可筛选人源CCR2靶点药物，而鼠源胞内区则保证其胞内信号传导不受影响，将外部刺激忠实地转化为胞内行为。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。
图1为鼠Ccr2与人CCR2基因的对比示意图。
图2为改造后的人源化小鼠Ccr2基因示意图。
图3为对小鼠Ccr2基因进行人源化改造的打靶方案示意图。
图4为本申请实施例4的酶切结果示意图；1：EcoRI酶切鉴定结果，理论条带大小应为5614bp、4433bp、2759bp、1038bp；M：1kb DNA ladder。
图5为本申请实施例5中多个sgRNA的活性比较图。
图6为本申请实施例6中sgRNA体外转录产物的电泳结果示意图。
图7为本申请实施例8中F0代小鼠的PCR鉴定结果示意图。
图8为本申请实施例8中F1代小鼠的PCR鉴定结果示意图。
图9为本申请实施例9中的反转录PCR电泳结果示意图。
图10为本申请实施例10中流式细胞术检测不同基因型小鼠骨髓细胞鼠源、人源CCR2表达结果。
图11为本申请实施例10中流式细胞术检测不同基因型小鼠外周血细胞鼠源、人源CCR2表达结果。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明。
本申请实施例所用的小鼠品系、生化试剂、实验仪器为：
本申请所合成的引物合成和测序服务购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
C57BL/6，ICR小鼠购自上海灵畅生物科技有限公司。
EcoRI限制性内切酶购自NEB，货号为R3101M。
In-Fusion HD Cloning Kits购自Takara，货号为639650。
sgRNA体外转录试剂盒购自Ambion，货号为AM1354。
大肠杆菌DH5α感受态细胞购自TaKaRa公司，货号为9057。
Cas9 mRNA来源SIGMA，货号为CAS9MRNA-1EA。
PE-CyTM7 Rat Anti-CD11b抗体购自BD PharmingenTM，货号为552850；PE anti-mouse CD192(CCR2)Antibody抗体购自Biolegend，货号为150610；APC anti-human CD192(CCR2)Antibody抗体购自Biolegend，货号为375209。
流式细胞仪生产厂家为BECKMAN COΜLTER，型号为CytoFLEX Flow Cytometer。
T7核酸内切酶I检测试剂盒，购自NEB公司，货号为M0302S。
PCR产物凝胶回收试剂盒为QIAquick Gel Extraction Kit，购自QIAGEN，货号为28706。
实施例1序列设计
小鼠的Ccr2基因和人的CCR2基因均含有多个转录本，本实施例的序列设计主要以其中一个转录本为例进行阐述。即，将小鼠Ccr2基因(NCBI Gene ID：12772)第3号外显子的主要部分(基于NCBI登录号为NM_009915.2→NP_034045.1的转录本，其mRNA序列如SEQ IDNO：1所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示)用人CCR2基因(Gene ID：729230)的相应片段替换(基于NCBI登录号为NM_001123396.3→NP_001116868.1的转录本，其mRNA序列如SEQID NO：3所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：4所示)，其中，鼠Ccr2与人CCR2基因对比示意图见图1，最终得到的改造后的人源化小鼠CCR2基因示意图见图2，人源化小鼠CCR2基因DNA序列(嵌合CCR2基因DNA)如SEQ ID NO：5所示：
Figure BDA0002521693270000061
Figure BDA0002521693270000071
SEQ ID NO：5仅列出涉及改造部分的DNA序列，其中斜体下划线区域为插入的人CCR2基因编码序列，斜体是为了插入人CCR2基因编码序列引入的其他序列。
改造后的人源化小鼠CCR2的CDS区、mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
鉴于人CCR2基因和小鼠Ccr2基因有多个转录本，本实施例中的人源化序列设计的方法同样适用于其它转录本的人源化改造。可将上述小鼠Ccr2基因的转录本替换为其他转录本。
实施例2重组载体PBR322-CCR2的设计及构建
根据序列设计，发明人进一步的设计了如图3所示的打靶方案和包含5’同源臂、人CCR2基因片段、3’同源臂的载体。其中5’同源臂(SEQ ID NO：9)为NCBI登录号为NC_000075.6的第124102766-124105684位核苷酸，3’同源臂(SEQ ID NO：10)为NCBI登录号为NC_000075.6的第124106806-124110723位核苷酸，人CCR2(SEQ ID NO：11)基因片段为NCBI登录号为NC_000003.12的第46357528-46358610位核苷酸。
载体的构建过程如下：设计扩增3段同源重组片段(LA，KI，RA)的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。其中，5’同源臂对应LA片段，人CCR2基因片段对应KI片段，3’同源臂对应RA片段，引物序列如下：
LA(2919bp)：
F：5’-CGCGGTCGACAAGCTTAATGCCCAAAGTGATGCTC-3’(SEQID NO：12)
R：5’-GGACAGCATggtggcTTCCTTTGATTctgtggtca-3’(SEQ ID NO：13)
KI(1411bp)：
F：5’-gccaccATGCTGTCCACATCTCGTTC-3’(SEQ ID NO：14)
R：5’-TACTGTTTAAACCAACTCACCAGGTATGGCTCTTATAAACCAGCCGAGACTT-3’(SEQ IDNO：15)
RA(3918bp)：
F：5’-TTGGTTTAAACAGTATGGGTTCTGCCTTTTCTGTCAAGTAAGTGACAGTTTGCCTTT-3’(SEQID NO：16)
R：5’-CGACTCTAGAGGATCgactgcgataaactatggaa-3’(SEQ ID NO：17)
以C57BL/6小鼠基因组DNA或BAC文库为模板PCR扩增获得LA、RA片段，以人DNA或BAC文库为模板PCR扩增获得KI片段。通过In-fusion试剂盒将片段连接到PBR322-MCS质粒上，最终获得载体PBR322-CCR2。
实施例3载体PBR322-CCR2的验证
随机挑选5个PBR322-CCR2克隆，使用限制性内切酶EcoRI进行酶切验证，酶切产物电泳应出现5614bp+4433bp+2759bp+1038bp大小片段。酶切结果参见图4，质粒酶切结果均符合预期，表明质粒酶切验证结果正确。质粒经测序公司测序验证正确，进行后续实验。
实施例4 Ccr2基因sgRNA设计
sgRNA靶序列决定了其靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。
根据打靶方案，设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA10)、3’端靶位点(sgRNA11-sgRNA20)的sgRNA序列。
以小鼠为例，根据Ccr2基因的功能和序列特征，5’端靶位点和3’端靶位点均位于小鼠Ccr2基因的第3号外显子上，各sgRNA在Ccr2基因上的靶位点序列如下：
sgRNA-1靶位点序列(SEQ ID NO：18)：5’-TTCCATTTCCTTTGATTctgtgg-3’
sgRNA-2靶位点序列(SEQ ID NO：19)：5’-ttctctgaccacagAATCAAAGG-3’
sgRNA-3靶位点序列(SEQ ID NO：20)：5’-gaccacagAATCAAAGGAAATGG-3’
sgRNA-4靶位点序列(SEQ ID NO：21)：5’-AGTATGCCGTGGATGAACTGAGG-3’
sgRNA-5靶位点序列(SEQ ID NO：22)：5’-GAGATGTTGATAGTATGCCGTGG-3’
sgRNA-6靶位点序列(SEQ ID NO：23)：5’-ATGTTACCTCAGTTCATCCACGG-3’
sgRNA-7靶位点序列(SEQ ID NO：24)：5’-TGGCCCCTTCATCAAGCTCTTGG-3’
sgRNA-8靶位点序列(SEQ ID NO：25)：5’-AGTATCCAAGAGCTTGATGAAGG-3’
sgRNA-9靶位点序列(SEQ ID NO：26)：5’-GTATCCAAGAGCTTGATGAAGGG-3’
sgRNA-10靶位点序列(SEQ ID NO：27)：5’-TATCCAAGAGCTTGATGAAGGGG-3’
sgRNA-11靶位点序列(SEQ ID NO：28)：5’-ACCTCTTGCTCCCCAGTGGAAGG-3’
sgRNA-12靶位点序列(SEQ ID NO：29)：5’-CGAGACCTCTTGCTCCCCAGTGG-3’
sgRNA-13靶位点序列(SEQ ID NO：30)：5’-TCTACATTCACTCCTTCCACTGG-3’
sgRNA-14靶位点序列(SEQ ID NO：31)：5’-CTACATTCACTCCTTCCACTGGG-3’
sgRNA-15靶位点序列(SEQ ID NO：32)：5’-TACATTCACTCCTTCCACTGGGG-3’
sgRNA-16靶位点序列(SEQ ID NO：33)：5’-TCCTTCCACTGGGGAGCAAGAGG-3’
sgRNA-17靶位点序列(SEQ ID NO：34)：5’-CACTGGGGAGCAAGAGGTCTCGG-3’
sgRNA-18靶位点序列(SEQ ID NO：35)：5’-GGGGAGCAAGAGGTCTCGGTTGG-3’
sgRNA-19靶位点序列(SEQ ID NO：36)：5’-GGGAGCAAGAGGTCTCGGTTGGG-3’
sgRNA-20靶位点序列(SEQ ID NO：37)：5’-CAGTTTGCCTTTTTTTAAGCAGG-3’
实施例5针对不同靶位点sgRNA筛选
利用试剂盒检测多个sgRNA的活性。使用T7核酸内切酶I检测试剂盒检测，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果参见图5。
图5中，泳道1-20分别展示sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3、sgRNA-4、sgRNA-5、sgRNA-6、sgRNA-7、sgRNA-8、sgRNA-9、sgRNA-10、sgRNA-11、sgRNA-12、sgRNA-13、sgRNA-14、sgRNA-15、sgRNA-16、sgRNA-17、sgRNA-18、sgRNA-19、sgRNA-20的活性检测结果，泳道M表示DNAMarker，泳道WT表示以野生型小鼠基因组为模板扩增出的PCR产物用T7核酸内切酶I检测结果。
图5结果显示，sgRNA-4和sgRNA-18样品显示出更好的T7核酸内切酶I切割效果，表明具有更好的Cas9活性。从中优先选择sgRNA-4和sgRNA-18为后续实验的sgRNA。
实施例6 sgRNA体外转录
sgRNA的合成通过体外PCR扩增sgRNA模板，以该模板为底物，利用HiScribeTMT7High Yield RNA Synthesis Kit试剂盒进行体外转录。
sgRNA-4和sgRNA-18的体外转录模板DNA的PCR引物分别为：
SgRNA-F4(SEQ ID NO：38)：5’-gcTAATACGACTCACTATAgAGTATGCCGTGGATGAACTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’
SgRNA-F18(SEQ ID NO：39)：5’-gcTAATACGACTCACTATAgGGGGAGCAAGAGGTCTCGGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’
下游PCR通用引物：
SgRNA-R(SEQ ID NO：40)：5’-aaaAGCACCGACTCGGTGCC-3’
由DNA合成公司合成含有sgRNA scaffold的片段DNA，序列信息为：
sgRNA scaffold(SEQ ID NO：41)：
5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3'
使用含有sgRNA scaffold的片段DNA作为模板，四对引物(SgRNA-F4和SgRNA-R、SgRNA-F18和SgRNA-R)分别扩增出产物，利用凝胶回收试剂盒，回收PCR产物作为转录模板。根据体外转录试剂盒操作说明体外转录sgRNA-4和sgRNA-18。体外转录产物电泳结果请见图6。
实施例7受精卵显微注射及胚胎移植
取小鼠的受精卵，如C57BL/6小鼠的受精卵，利用显微注射仪将预混好的pU6-sgRNA-S4、pU6-sgRNA-S18质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书提供方法进行转录)、Cas9 mRNA和PBR322-CCR2质粒注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到首建鼠(即founder鼠，为F0代)。将获得的F0代小鼠通过与野生型小鼠杂交，扩大种群数量，然后自交获得纯合子小鼠，建立稳定的hCCR2人源化小鼠品系。
实施例8 CCR2人源化小鼠的鉴定
1、F0代同源重组阳性小鼠基因型鉴定
分别使用两对引物对得到的F0代hCCR2小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR鉴定，引物I位于5’同源臂左侧，引物IV位于3’同源臂右侧，引物II和引物III均位于插入的片段上，具体序列如下：
5’同源臂重组鉴定引物：
引物I：5’-TCTTAAAGTACCAACCGAAAAA-3’(SEQ ID NO：42)
引物II：5’-GACAGAAAAGGCAGAACCCATACT-3’(SEQ ID NO：43)
3’同源臂重组鉴定引物：
引物III：5’-GAGCCATACCTGGTGAGTTG-3’(SEQ ID NO：44)
引物IV:5’-AAGTGAAGCCTGGATTCTGTT-3’(SEQ ID NO：45)
PCR反应体系(20μL)如表3所示：
表3 PCR反应体系
Figure BDA0002521693270000111
PCR扩增反应条件如表4所示：
表4 PCR扩增反应条件
Figure BDA0002521693270000112
Figure BDA0002521693270000121
如果重组载体插入位置正确，5'同源臂鉴定引物对I和II，应只有1条6.3kb长度的PCR条带，3'同源臂鉴定引物对III和IV，应有1条4.4kb长度的PCR条带；阴性小鼠应均无条带。
F0代小鼠PCR鉴定结果见图7。
图7中，A展示编号为F0-1、F0-2、F0-3、F0-4、F0-5、F0-6、F0-7、F0-8、F0-9、F0-10、F0-11、F0-12、F0-13、F0-14(依次对应泳道1-14)的F0代小鼠的5'同源臂的PCR鉴定结果，M为DNA marker，WT为野生型小鼠对照。
B展示编号为F0-1、F0-2、F0-4、F0-3、F0-5、F0-10、F0-7、F0-8、F0-9、F0-6、F0-11、F0-12、F0-13、F0-14(依次对应泳道1-14)的F0代小鼠的3'同源臂的PCR鉴定结果，M为DNAmarker，WT为野生型小鼠对照。
从图7可以看出，编号为F0-4、F0-8、F0-10的3只小鼠双侧同源臂同源重组鉴定均为阳性，即编号为F0-4、F0-8、F0-10的3只小鼠为阳性小鼠。
F1代小鼠基因型鉴定：
将F0代阳性的小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。对F1代鼠尾基因组DNA进行PCR鉴定。PCR条件及引物同F0代基因型鉴定。F1代小鼠PCR实验结果见图8。
图8中，A表示编号为F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5、F1-6、F1-7、F1-8、F1-9、F1-10、F1-11、F1-12、F1-13、F1-14、F1-15、F1-16、F1-17、F1-18、F1-19、F1-20(依次对应泳道1-20)的F1代小鼠的5'同源臂的PCR鉴定结果，M为DNA marker，WT为野生型小鼠对照。
B表示编号为F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5、F1-6、F1-7、F1-8、F1-9、F1-10、F1-11、F1-12、F1-13、F1-14、F1-15、F1-16、F1-17、F1-18、F1-19、F1-20(依次对应泳道1-20)的F1代小鼠的3'同源臂的PCR鉴定结果，M为DNA marker，WT为野生型小鼠对照。
从图8可以看出，有7只F1代小鼠(编号为F1-5、F1-6、F1-10、F1-15、F1-16、F1-17、F1-18)两个同源臂同源重组鉴定均为阳性，另外有6只小鼠(编号为F1-4、F1-8、F1-9、F1-11、F1-12、F1-13)发现有单侧同源臂重组阳性情况，单侧同源臂重组阳性小鼠处理，不用于后续小鼠繁育。
将获得的双臂同源重组阳性的F1代小鼠分别与野生型小鼠交配，扩繁种群。同时杂合子小鼠自交获得纯合子小鼠。
实施例9人源化小鼠CCR2 RNA水平表达分析
选取一只F1代杂合子小鼠和一只野生型小鼠提取骨髓细胞，经红细胞裂解液裂解后，抽提总RNA，利用反转录试剂盒，反转录为cDNA后进行PCR，分别检测鼠源和人源CCR2mRNA的表达。
针对鼠源Ccr2 RNA的引物为：
mCCR2-F1：5’-CCCAGCTTTCATGTTAGAGGCA-3’(SEQ ID NO：46)，和
mCCR2-R1：5’-TGGTAATGTGAGCAGGAAGAG-3’(SEQ ID NO：47)；
可扩增出523bp大小的PCR产物。
针对人源CCR2 RNA的引物为：
hCCR2-F1：5’-CCCAGCTTTCATGTTAGAGGCA-3’(SEQ ID NO：48)，和
hCCR2-R1：5’-GCCCACAATGGGAGAGTAATAAG-3’(SEQ ID NO：49)；
可扩增出480bp大小的PCR产物。
PCR反应体系20μL，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，55sec，35个循环)；72℃，5min；12℃保温。
反转录PCR电泳结果显示(见图9)。
图9中，HE表示杂合子小鼠，WT表示野生型小鼠，M表示DNA Marker，M左侧两泳道展示人源CCR2 mRNA的检测结果，M右侧两泳道展示鼠源Ccr2 mRNA的检测结果。
从图9可以看出，野生型和杂合子小鼠骨髓细胞中均可检测到鼠源Ccr2 mRNA的表达；但是，杂合子小鼠中可以检测到人源CCR2 mRNA的表达，野生型小鼠中检测不到人源CCR2 mRNA的表达。
实施例10人源化小鼠CCR2蛋白水平表达分析
杂合子小鼠自交获得纯合子小鼠，选取一只hCCR2纯合子小鼠，一只同窝杂合子小鼠，一只同窝野生型小鼠(6-7周龄)，分别提取骨髓细胞和外周血细胞检测CCR2表达。骨髓细胞和外周血，加入红细胞裂解液，裂解5min后离心弃上清，用PBS清洗细胞1次，调整细胞浓度至107/ml，取100μl，用CD16/CD32 Fc receptor封闭试剂封闭5分钟后，进行抗体标记。分别用PE-CyTM7 Rat Anti-CD11b抗体标记CD11b细胞，用PE anti-mouse CD192(CCR2)抗体标记鼠源Ccr2，用APC anti-human CD192(CCR2)抗体标记人源CCR2。
图10为流式细胞术检测不同基因型小鼠骨髓细胞鼠源、人源CCR2表达结果，图11为流式细胞术检测不同基因型小鼠外周血细胞鼠源、人源CCR2表达结果。图10与图11中，HE表示杂合子小鼠，HO表示纯合子小鼠，WT表示野生型小鼠。
图10与图11的流式分析结果显示：在骨髓样品中(图10)，野生型小鼠只能检测到鼠源Ccr2蛋白的表达，纯合子小鼠只能检测到人源CCR2蛋白的表达，在杂合子小鼠中可以同时检测到鼠源和人源CCR2蛋白的表达，而且3种基因型小鼠阳性细胞的比例相近；与骨髓样品相似，在外周血样品中(图11)，野生型小鼠只能检测到鼠源Ccr2蛋白的表达，纯合子小鼠只能检测到人源CCR2蛋白的表达，在杂合子小鼠中可以同时检测到鼠源和人源CCR2蛋白的表达，3种基因型小鼠外周血中阳性细胞的比例相近。这些结果充分说明，在CCR2人源化纯合子小鼠中，只表达人源CCR2蛋白，不表达鼠源Ccr2蛋白，而且人源化对阳性细胞的表达比例没有影响。
序列表
<110> 上海南方模式生物科技股份有限公司
<120> 人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法及其应用
<160> 49
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3589
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 1
tgccatcata aaggagccat acctgtaaat gccatgcaag ttcagctgcc tgcaaagacc 60
agaagagggc attggattca ccacatgtgc taagaattga acttgaatca tctgcaaaaa 120
caaatcaaag gaaatggaag acaataatat gttacctcag ttcatccacg gcatactatc 180
aacatctcat tctctattta cacgaagtat ccaagagctt gatgaagggg ccaccacacc 240
gtatgactac gatgatggtg agccttgtca taaaaccagt gtgaagcaaa ttggagcttg 300
gatcctgcct ccactctact ccctggtatt catctttggt tttgtgggca acatgttggt 360
cattataatt ctgataggct gtaaaaagct gaagagcatg actgatatct atctgctcaa 420
cttggccatc tctgacctgc tcttcctgct cacattacca ttctgggctc actatgctgc 480
aaatgagtgg gtctttggga atataatgtg taaagtattc acagggctct atcacattgg 540
ttattttggt ggaatctttt tcattatcct cctgacaatt gataggtact tggctattgt 600
tcatgctgtg tttgctttaa aagccaggac agttaccttt ggggtgataa caagtgtagt 660
cacttgggtg gtggctgtgt ttgcctctct accaggaatc atatttacta aatccaaaca 720
agatgatcac cattacacct gtggccctta ttttacacaa ctatggaaga atttccaaac 780
aataatgaga aatatcttga gcctgatcct gcctctactt gtcatggtca tctgctactc 840
aggaattctc cacaccctgt ttcgctgtag gaatgagaag aagaggcaca gggctgtgag 900
gctcatcttt gccatcatga ttgtctactt tctcttctgg actccataca atattgttct 960
cttcttgacc accttccagg aatccttggg aatgagtaac tgtgtgattg acaagcactt 1020
agaccaggcc atgcaggtga cagagactct tggaatgaca cactgctgca ttaatcctgt 1080
catttatgcc tttgttggag agaagttccg aaggtatctc tccatatttt tcagaaagca 1140
cattgctaaa cgtctctgca aacagtgccc agttttctat agggagacag cagatcgagt 1200
gagctctaca ttcactcctt ccactgggga gcaagaggtc tcggttgggt tgtaaagtaa 1260
gtgacagttt gccttttttt aagcagggaa ggagggagca gtttgtacat agcaacaagc 1320
ctcaaagaca gtggttctta ctttgggtca tgatccctat gtgggggtca aatgaccctt 1380
tcacagaggt cactaaaacc attagaaaac ataggtattt acattataat tcataacagt 1440
agcaaaatta cagctatgaa gtagcagcaa aaataatttt attgttgtag atcaccacaa 1500
catgaggaac tgtattaaag ggtcacagga ttaggaaggt ttcaaaccac tgctcatgga 1560
tatattgaac aatagagacc tttaaatcag gtgcccagaa cgttataatt atgccgtgac 1620
tgaaccatat ctcttcttgt atatataata catgtttgag aaatatttta gaataataat 1680
tggtaaattc ttcagctttc cagggaactc tatccctatg aggagcctct ttgccttgtg 1740
gcaatattat tttaccaatc ttcaccatgt ttttccttac ttataacatg aaagacatgg 1800
aatttaagaa aggagggcat gaggctgcca ggactgagtg agaaggagga gatatgcact 1860
gttgctcctg agtgaaaatg gaaatgaaag tgagcagggc tctcaaattt ctttctcatt 1920
tgggaagaaa tgtcttgctc tttggttcct tctcctatct gtgtttaatt ttggaggctt 1980
tatcaggttg tggaaaatct agaaactgta ataggttgtt ggaaacctca tttgagtacc 2040
atagtccttt tatacataat tgcacaacac atttttgctt tgttattttt ttttatcttt 2100
gacaacatgg acaatttttt tcaatatcac actccactgt tgatatgttt ctcaagccac 2160
agttccttac atgatattta taaaattatt gtttataaaa tatgcattat tagtgattag 2220
actaaaaata ataagggctc ttgtttgatc tttccttctg ctttccaggg agagcagaag 2280
gctaaaagta gtgaatgacc aagaataagg agaaaagcca actccttcat caggcacaga 2340
gagctgcagc aaaaaggcag agatctgtgg gacagaggaa gtggtgtgct tagaactaca 2400
tagaatcaga agcaaaatgg atgccttagc actgaggaaa ggtttctgtc aggttataaa 2460
ctggttttat attattgctg ctattttctg cctcctcagt acctttgcaa ctgcctcttt 2520
cctcatagca tttatctctc aacctcttcc tgggaaaggt gtatatggaa tagccaaaca 2580
tgaaaacctg gatagttcta tgagaaaaaa aaaaaacact gttatattat gtttttgtgg 2640
gtaaaacaaa actggatgaa gcagggacag aagtcttgct ttgaaaataa tacttgggaa 2700
catatcttaa ttacaggcaa aataaacctg gataaaaatg attataaatg gagtgggaag 2760
aagtatgtca cagattatct tccaatgcct tatttttgga tataaacata attcaaatat 2820
ttaaaaattg aaaatagaaa aaaaaataaa atcaagactg gaaacttcaa cttctaaatg 2880
tgatgaaata cctttgtaag agctcttatc ttgccaaggt tgaaaatagt tcattagtta 2940
taaaagaaat tctgactttg agcttatgaa ctaacataga cagctcagga ttaacaggga 3000
cttgtggttt gtggtctgtg ggcttatcca agcatggtga tttagactct aaggtccgtc 3060
tggatcctag catatgctac atagatgtca tgtgtgcatg caagtggtgt acttgctctt 3120
tcaccaaact cctttggatc ttttgtccta aatgtgatct tggtgaaaga ttgtcctttg 3180
agtgagtggg aactcctaag tcaaatcaac ttcttatcaa ggatttaaaa gtaaatatgc 3240
aaaggagaga agttagagaa actcctctca taagaaaaat gtcttccctg aattgagcca 3300
aaaatgttct tccctgtcca ctaatgcgtt tcttatctaa cagaagcaag aaacaaagga 3360
acagacaact tgagagttaa aagtcattgt ggtctggctt tgctaccaca tgatgagaag 3420
aaatttctga aagaagtagg ggatgagagt atcaccttca gatagcctaa cagtttcatt 3480
ttaatgataa tgagatgcaa atacctgtaa aactatgatt tagaaaataa accaatgctc 3540
tatctatatt gctagaaata ttaaaaagaa acaagcatat gctttgtta 3589
<210> 2
<211> 373
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 2
Met Glu Asp Asn Asn Met Leu Pro Gln Phe Ile His Gly Ile Leu Ser
1 5 10 15
Thr Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ser Ile Gln Glu Leu Asp Glu Gly
20 25 30
Ala Thr Thr Pro Tyr Asp Tyr Asp Asp Gly Glu Pro Cys His Lys Thr
35 40 45
Ser Val Lys Gln Ile Gly Ala Trp Ile Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu
50 55 60
Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Ile Ile Ile Leu
65 70 75 80
Ile Gly Cys Lys Lys Leu Lys Ser Met Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn
85 90 95
Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala
100 105 110
His Tyr Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ile Met Cys Lys Val
115 120 125
Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile Phe Phe Ile
130 135 140
Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe
145 150 155 160
Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Val Val
165 170 175
Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Ile Ile Phe Thr
180 185 190
Lys Ser Lys Gln Asp Asp His His Tyr Thr Cys Gly Pro Tyr Phe Thr
195 200 205
Gln Leu Trp Lys Asn Phe Gln Thr Ile Met Arg Asn Ile Leu Ser Leu
210 215 220
Ile Leu Pro Leu Leu Val Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu His
225 230 235 240
Thr Leu Phe Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg
245 250 255
Leu Ile Phe Ala Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr
260 265 270
Asn Ile Val Leu Phe Leu Thr Thr Phe Gln Glu Ser Leu Gly Met Ser
275 280 285
Asn Cys Val Ile Asp Lys His Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu
290 295 300
Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Ile Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe
305 310 315 320
Val Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu Ser Ile Phe Phe Arg Lys His
325 330 335
Ile Ala Lys Arg Leu Cys Lys Gln Cys Pro Val Phe Tyr Arg Glu Thr
340 345 350
Ala Asp Arg Val Ser Ser Thr Phe Thr Pro Ser Thr Gly Glu Gln Glu
355 360 365
Val Ser Val Gly Leu
370
<210> 3
<211> 3520
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 3
agatctgttt ggttcagttg ctgagaagcc tgacatacca ggactgcctg agacaagcca 60
caagctgaac agagaaagtg gattgaacaa ggacgcattt ccccagtaca tccacaacat 120
gctgtccaca tctcgttctc ggtttatcag aaataccaac gagagcggtg aagaagtcac 180
cacctttttt gattatgatt acggtgctcc ctgtcataaa tttgacgtga agcaaattgg 240
ggcccaactc ctgcctccgc tctactcgct ggtgttcatc tttggttttg tgggcaacat 300
gctggtcgtc ctcatcttaa taaactgcaa aaagctgaag tgcttgactg acatttacct 360
gctcaacctg gccatctctg atctgctttt tcttattact ctcccattgt gggctcactc 420
tgctgcaaat gagtgggtct ttgggaatgc aatgtgcaaa ttattcacag ggctgtatca 480
catcggttat tttggcggaa tcttcttcat catcctcctg acaatcgata gatacctggc 540
tattgtccat gctgtgtttg ctttaaaagc caggacggtc acctttgggg tggtgacaag 600
tgtgatcacc tggttggtgg ctgtgtttgc ttctgtccca ggaatcatct ttactaaatg 660
ccagaaagaa gattctgttt atgtctgtgg cccttatttt ccacgaggat ggaataattt 720
ccacacaata atgaggaaca ttttggggct ggtcctgccg ctgctcatca tggtcatctg 780
ctactcggga atcctgaaaa ccctgcttcg gtgtcgaaac gagaagaaga ggcatagggc 840
agtgagagtc atcttcacca tcatgattgt ttactttctc ttctggactc cctataatat 900
tgtcattctc ctgaacacct tccaggaatt cttcggcctg agtaactgtg aaagcaccag 960
tcaactggac caagccacgc aggtgacaga gactcttggg atgactcact gctgcatcaa 1020
tcccatcatc tatgccttcg ttggggagaa gttcagaagg tatctctcgg tgttcttccg 1080
aaagcacatc accaagcgct tctgcaaaca atgtccagtt ttctacaggg agacagtgga 1140
tggagtgact tcaacaaaca cgccttccac tggggagcag gaagtctcgg ctggtttata 1200
aaacgaggag cagtttgatt gttgtttata aagggagata acaatctgta tataacaaca 1260
aacttcaagg gtttgttgaa caatagaaac ctgtaaagca ggtgcccagg aacctcaggg 1320
ctgtgtgtac taatacagac tatgtcaccc aatgcatatc caacatgtgc tcagggaata 1380
atccagaaaa actgtgggta gagactttga ctctccagaa agctcatctc agctcctgaa 1440
aaatgcctca ttaccttgtg ctaatcctct ttttctagtc ttcataattt cttcactcaa 1500
tctctgattc tgtcaatgtc ttgaaatcaa gggccagctg gaggtgaaga agagaatgtg 1560
acaggcacag atgaatggga gtgagggata gtggggtcag ggctgagagg agaaggaggg 1620
agacatgagc atggctgagc ctggacaaag acaaaggtga gcaaagggct cacgcattca 1680
gccaggagat gatactggtc cttagcccca tctgccacgt gtatttaacc ttgaagggtt 1740
caccaggtca gggagagttt gggaactgca ataacctggg agttttggtg gagtccgatg 1800
attctctttt gcataagtgc atgacatatt tttgctttat tacagtttat ctatggcacc 1860
catgcacctt acatttgaaa tctatgaaat atcatgctcc attgttcaga tgcttcttag 1920
gccacatccc cctgtctaaa aattcagaaa atttttgttt ataaaagatg cattatctat 1980
gatatgctaa tatatgtata tgcaatatat ataggctctt gcttgatctc tccaggaggt 2040
agtgattatg agaagggggt ggagaatgat gagttccttc accaggagca aaggacgggg 2100
atcgtgtgga accactgcag aactatttcc gaaatcaact aagtggagag agccaggaag 2160
gctgcatcag aacccagtaa agcttcttgt ctggatctga gctggtttgt tttgtgcttg 2220
cttttccctg ccttgccact cccctcactc ttctcttttc cccacagcct ttttcacata 2280
gctcttggct gtaggattgc cccactccaa aaaccagtgt gtggaggtcc aggagtgaga 2340
ccaggaaaga atgtgaaagt gactacacaa ggactcctcg atggtcgtgg aaaaggaaag 2400
tcaattggca gagcccctga agccagtctt caggacaaag aaggagccta gagacagaaa 2460
tgacagatct ctgctttgga aatcacacgt ctggcttcac agatgtgtga ttcacagtgt 2520
gaatcttggt gtctacgtta ccaggcagga aggctgagag gagagagact ccagctgggt 2580
tggaaaacag tattttccaa actaccttcc agttcctcat ttttgaatac aggcatagag 2640
ttcagacttt ttttaaatag taaaaataaa attaaagctg aaaactgcaa cttgtaaatg 2700
tggtaaagag ttagtttgag ttactatcat gtcaaacgtg aaaatgctgt attagtcaca 2760
gagataattc tagctttgag cttaagaatt ttgagcaggt ggtatgtttg ggagactgct 2820
gagtcaaccc aatagttgtt gattggcagg agttggaagt gtgtgatctg tgggcacatt 2880
agcctatgtg catgcagcat ctaagtaatg atgtcgtttg aatcacagta tacgctccat 2940
cgctgtcatc tcagctggat ctccattctc tcaggcttgc tgccaaaagc cttttgtgtt 3000
ttgttttgta tcattatgaa gtcatgcgtt taatcacatt cgagtgtttc agtgcttcgc 3060
agatgtcctt gatgctcata ttgttcccta ttttgccagt gggaactcct aaatcaagtt 3120
ggcttctaat caaagctttt aaaccctatt ggtaaagaat ggaaggtgga gaagctccct 3180
gaagtaagca aagactttcc tcttagtcga gccaagttaa gaatgttctt atgttgccca 3240
gtgtgtttct gatctgatgc aagcaagaaa cactgggctt ctagaaccag gcaacttggg 3300
aactagactc ccaagctgga ctatggctct actttcaggc cacatggcta aagaaggttt 3360
cagaaagaag tggggacaga gcagaacttt caccttcata tatttgtatg atcctaatga 3420
atgcataaaa tgttaagttg atggtgatga aatgtaaata ctgtttttaa caactatgat 3480
ttggaaaata aatcaatgct ataactatgt tgataaaaga 3520
<210> 4
<211> 360
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 4
Met Leu Ser Thr Ser Arg Ser Arg Phe Ile Arg Asn Thr Asn Glu Ser
1 5 10 15
Gly Glu Glu Val Thr Thr Phe Phe Asp Tyr Asp Tyr Gly Ala Pro Cys
20 25 30
His Lys Phe Asp Val Lys Gln Ile Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu
35 40 45
Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Val
50 55 60
Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Lys Leu Lys Cys Leu Thr Asp Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Ile Thr Leu Pro
85 90 95
Leu Trp Ala His Ser Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ala Met
100 105 110
Cys Lys Leu Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile
115 120 125
Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His
130 135 140
Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Val Thr
145 150 155 160
Ser Val Ile Thr Trp Leu Val Ala Val Phe Ala Ser Val Pro Gly Ile
165 170 175
Ile Phe Thr Lys Cys Gln Lys Glu Asp Ser Val Tyr Val Cys Gly Pro
180 185 190
Tyr Phe Pro Arg Gly Trp Asn Asn Phe His Thr Ile Met Arg Asn Ile
195 200 205
Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Ile Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly
210 215 220
Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg
225 230 235 240
Ala Val Arg Val Ile Phe Thr Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp
245 250 255
Thr Pro Tyr Asn Ile Val Ile Leu Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe
260 265 270
Gly Leu Ser Asn Cys Glu Ser Thr Ser Gln Leu Asp Gln Ala Thr Gln
275 280 285
Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile
290 295 300
Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu Ser Val Phe Phe
305 310 315 320
Arg Lys His Ile Thr Lys Arg Phe Cys Lys Gln Cys Pro Val Phe Tyr
325 330 335
Arg Glu Thr Val Asp Gly Val Thr Ser Thr Asn Thr Pro Ser Thr Gly
340 345 350
Glu Gln Glu Val Ser Ala Gly Leu
355 360
<210> 5
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcattttgtt ctctgaccac agaatcaaag gaagccacca tgctgtccac atctcgttct 60
cggtttatca gaaataccaa cgagagcggt gaagaagtca ccaccttttt tgattatgat 120
tacggtgctc cctgtcataa atttgacgtg aagcaaattg gggcccaact cctgcctccg 180
ctctactcgc tggtgttcat ctttggtttt gtgggcaaca tgctggtcgt cctcatctta 240
ataaactgca aaaagctgaa gtgcttgact gacatttacc tgctcaacct ggccatctct 300
gatctgcttt ttcttattac tctcccattg tgggctcact ctgctgcaaa tgagtgggtc 360
tttgggaatg caatgtgcaa attattcaca gggctgtatc acatcggtta ttttggcgga 420
atcttcttca tcatcctcct gacaatcgat agatacctgg ctattgtcca tgctgtgttt 480
gctttaaaag ccaggacggt cacctttggg gtggtgacaa gtgtgatcac ctggttggtg 540
gctgtgtttg cttctgtccc aggaatcatc tttactaaat gccagaaaga agattctgtt 600
tatgtctgtg gcccttattt tccacgagga tggaataatt tccacacaat aatgaggaac 660
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accctgcttc ggtgtcgaaa cgagaagaag aggcataggg cagtgagagt catcttcacc 780
atcatgattg tttactttct cttctggact ccctataata ttgtcattct cctgaacacc 840
ttccaggaat tcttcggcct gagtaactgt gaaagcacca gtcaactgga ccaagccacg 900
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tggtttaaac agtatgggtt ctgccttttc tgtcaagtaa gtgacagttt gccttttttt 1200
aagcagggaa ggagggagca g 1221
<210> 6
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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cacatcggtt attttggcgg aatcttcttc atcatcctcc tgacaatcga tagatacctg 420
gctattgtcc atgctgtgtt tgctttaaaa gccaggacgg tcacctttgg ggtggtgaca 480
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ttccacacaa taatgaggaa cattttgggg ctggtcctgc cgctgctcat catggtcatc 660
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attgtcattc tcctgaacac cttccaggaa ttcttcggcc tgagtaactg tgaaagcacc 840
agtcaactgg accaagccac gcaggtgaca gagactcttg ggatgactca ctgctgcatc 900
aatcccatca tctatgcctt cgttggggag aagttcagaa ggtatctctc ggtgttcttc 960
cgaaagcaca tcaccaagcg cttctgcaaa caatgtccag ttttctacag ggagacagtg 1020
gatggagtga cttcaacaaa cacgccttcc actggggagc aggaagtctc ggctggttta 1080
taa 1083
<210> 7
<211> 3609
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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caaatcaaag gaagccacca tgctgtccac atctcgttct cggtttatca gaaataccaa 180
cgagagcggt gaagaagtca ccaccttttt tgattatgat tacggtgctc cctgtcataa 240
atttgacgtg aagcaaattg gggcccaact cctgcctccg ctctactcgc tggtgttcat 300
ctttggtttt gtgggcaaca tgctggtcgt cctcatctta ataaactgca aaaagctgaa 360
gtgcttgact gacatttacc tgctcaacct ggccatctct gatctgcttt ttcttattac 420
tctcccattg tgggctcact ctgctgcaaa tgagtgggtc tttgggaatg caatgtgcaa 480
attattcaca gggctgtatc acatcggtta ttttggcgga atcttcttca tcatcctcct 540
gacaatcgat agatacctgg ctattgtcca tgctgtgttt gctttaaaag ccaggacggt 600
cacctttggg gtggtgacaa gtgtgatcac ctggttggtg gctgtgtttg cttctgtccc 660
aggaatcatc tttactaaat gccagaaaga agattctgtt tatgtctgtg gcccttattt 720
tccacgagga tggaataatt tccacacaat aatgaggaac attttggggc tggtcctgcc 780
gctgctcatc atggtcatct gctactcggg aatcctgaaa accctgcttc ggtgtcgaaa 840
cgagaagaag aggcataggg cagtgagagt catcttcacc atcatgattg tttactttct 900
cttctggact ccctataata ttgtcattct cctgaacacc ttccaggaat tcttcggcct 960
gagtaactgt gaaagcacca gtcaactgga ccaagccacg caggtgacag agactcttgg 1020
gatgactcac tgctgcatca atcccatcat ctatgccttc gttggggaga agttcagaag 1080
gtatctctcg gtgttcttcc gaaagcacat caccaagcgc ttctgcaaac aatgtccagt 1140
tttctacagg gagacagtgg atggagtgac ttcaacaaac acgccttcca ctggggagca 1200
ggaagtctcg gctggtttat aagagccata cctggtgagt tggtttaaac agtatgggtt 1260
ctgccttttc tgtcaagtaa gtgacagttt gccttttttt aagcagggaa ggagggagca 1320
gtttgtacat agcaacaagc ctcaaagaca gtggttctta ctttgggtca tgatccctat 1380
gtgggggtca aatgaccctt tcacagaggt cactaaaacc attagaaaac ataggtattt 1440
acattataat tcataacagt agcaaaatta cagctatgaa gtagcagcaa aaataatttt 1500
attgttgtag atcaccacaa catgaggaac tgtattaaag ggtcacagga ttaggaaggt 1560
ttcaaaccac tgctcatgga tatattgaac aatagagacc tttaaatcag gtgcccagaa 1620
cgttataatt atgccgtgac tgaaccatat ctcttcttgt atatataata catgtttgag 1680
aaatatttta gaataataat tggtaaattc ttcagctttc cagggaactc tatccctatg 1740
aggagcctct ttgccttgtg gcaatattat tttaccaatc ttcaccatgt ttttccttac 1800
ttataacatg aaagacatgg aatttaagaa aggagggcat gaggctgcca ggactgagtg 1860
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ggaaacctca tttgagtacc atagtccttt tatacataat tgcacaacac atttttgctt 2100
tgttattttt ttttatcttt gacaacatgg acaatttttt tcaatatcac actccactgt 2160
tgatatgttt ctcaagccac agttccttac atgatattta taaaattatt gtttataaaa 2220
tatgcattat tagtgattag actaaaaata ataagggctc ttgtttgatc tttccttctg 2280
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gtggtgtgct tagaactaca tagaatcaga agcaaaatgg atgccttagc actgaggaaa 2460
ggtttctgtc aggttataaa ctggttttat attattgctg ctattttctg cctcctcagt 2520
acctttgcaa ctgcctcttt cctcatagca tttatctctc aacctcttcc tgggaaaggt 2580
gtatatggaa tagccaaaca tgaaaacctg gatagttcta tgagaaaaaa aaaaaacact 2640
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attataaatg gagtgggaag aagtatgtca cagattatct tccaatgcct tatttttgga 2820
tataaacata attcaaatat ttaaaaattg aaaatagaaa aaaaaataaa atcaagactg 2880
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cagctcagga ttaacaggga cttgtggttt gtggtctgtg ggcttatcca agcatggtga 3060
tttagactct aaggtccgtc tggatcctag catatgctac atagatgtca tgtgtgcatg 3120
caagtggtgt acttgctctt tcaccaaact cctttggatc ttttgtccta aatgtgatct 3180
tggtgaaaga ttgtcctttg agtgagtggg aactcctaag tcaaatcaac ttcttatcaa 3240
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cagaagcaag aaacaaagga acagacaact tgagagttaa aagtcattgt ggtctggctt 3420
tgctaccaca tgatgagaag aaatttctga aagaagtagg ggatgagagt atcaccttca 3480
gatagcctaa cagtttcatt ttaatgataa tgagatgcaa atacctgtaa aactatgatt 3540
tagaaaataa accaatgctc tatctatatt gctagaaata ttaaaaagaa acaagcatat 3600
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<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Glu Glu Val Thr Thr Phe Phe Asp Tyr Asp Tyr Gly Ala Pro Cys
20 25 30
His Lys Phe Asp Val Lys Gln Ile Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu
35 40 45
Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Val
50 55 60
Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Lys Leu Lys Cys Leu Thr Asp Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Ile Thr Leu Pro
85 90 95
Leu Trp Ala His Ser Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ala Met
100 105 110
Cys Lys Leu Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile
115 120 125
Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His
130 135 140
Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Val Thr
145 150 155 160
Ser Val Ile Thr Trp Leu Val Ala Val Phe Ala Ser Val Pro Gly Ile
165 170 175
Ile Phe Thr Lys Cys Gln Lys Glu Asp Ser Val Tyr Val Cys Gly Pro
180 185 190
Tyr Phe Pro Arg Gly Trp Asn Asn Phe His Thr Ile Met Arg Asn Ile
195 200 205
Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Ile Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly
210 215 220
Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg
225 230 235 240
Ala Val Arg Val Ile Phe Thr Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp
245 250 255
Thr Pro Tyr Asn Ile Val Ile Leu Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe
260 265 270
Gly Leu Ser Asn Cys Glu Ser Thr Ser Gln Leu Asp Gln Ala Thr Gln
275 280 285
Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile
290 295 300
Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu Ser Val Phe Phe
305 310 315 320
Arg Lys His Ile Thr Lys Arg Phe Cys Lys Gln Cys Pro Val Phe Tyr
325 330 335
Arg Glu Thr Val Asp Gly Val Thr Ser Thr Asn Thr Pro Ser Thr Gly
340 345 350
Glu Gln Glu Val Ser Ala Gly Leu
355 360
<210> 9
<211> 2919
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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aggtggatga aaacaaattt atagctgata tcaggaaaaa gtagtcttaa caatcaaatc 360
taatgatgtt acattttata tcttataatt attatagact tttgtgcact ctttcagtga 420
acctttactg tttactcttt tagccaggtg aaattataag agtcagagat taacaacatt 480
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gggaagtttt aagtaggagg tagaataaat aggaaccatt ttaggtcaag agacaagaac 660
agagtaaatc actaaggcat aaaggaagtg gtgagtttgg aggaaatgga gagaagacag 720
ttgtgggtgt gcacaggact gggaatgtga gagcaggtca accactgtga agtcccacca 780
catccaagtc atgtggctat tgggggtttc aggatgagga gtacatatgc actgttaact 840
gttggggcag acagaatgag agggatgagc tatgagtgaa ggagagatca atatgaagtg 900
gatagcagat gagacaagaa actagcagcc catagaaggc aacaaggatg aatttgaaaa 960
gaatgtaggg gtagaattcc tatggcacaa ttctaacata gaacattcat ctgtagcaca 1020
tgatgagcct tcacctcaga tggacctcac agcaacttag ggagtttcta tacaggaaag 1080
cagatgcttg actttaagtt acccagcttt catgttagag gcaggagttt tttatttttg 1140
aaatctcatt gattatttta tttattttat atgtgtgtgt ctgcaccagt aaatgccatg 1200
caagttcagc tgcctgcaaa gaccagaaga gggcattgga ttcaccacat gtgctaagaa 1260
ttgaacttga atcatctgca aaaacagtag gtactcttaa ctgctgaatc atctgtctag 1320
ttatctaatt tggaggcagg ttttgaaact aatcttgttg gttctgacaa acagccttta 1380
attttctgaa gaggaattat ttggaataat actagagttt tcttataaaa atgtactgga 1440
tgataataac taagatgaag ttctcataat ttggtcagca agatggttcc tgtgttaaag 1500
tacttgccgt gaaaacctag tcacctgagt tcaaatccct gtagcttata taggagggaa 1560
agagcaaatt atcttctgac ctccaaacac ttacagcagt gtatgtgtgt acccctcatg 1620
tataagtcat agcagatgct agttaaatat tgaccatgta gacaaattca tgatgagata 1680
ccatgaaatg tgaaaaatta aactctggtg tttcagagaa ggtgggactt gaacatagag 1740
ccttggaaaa cataagcata taggagagta aaaatcctga gatcagctga tataattcag 1800
ataaaaatct gaattagaag aattttgaag caagaataaa aagaaaaaaa ggcaaaagtt 1860
ggcaaaagcc aaatacagtg ccttgaggtt ttatgaagtt tgcagggata tgtcacagaa 1920
atattaataa gcagccacgt aggtgtcttt ctagaagcta aaagcaatat ttttaagatt 1980
tatctgtttt tttattttgt gtaagtatct gtgccttaag tcacatatag tttatgtgac 2040
ttaagtgtgt gcaggtgcca atggagttca aaaagtgata gatccactaa aactggaatt 2100
acaggtggtt atgagctccc tgctgtgggt ataggaaatc aacttgggtt ctatgcaaga 2160
aaagtaagtg cctttgaccc ctgagccatc tctaatccct tcaaaagagt tttaaatggg 2220
ggaaattcat gctcaatgaa aagaatttgg aatgacatta aggtatttga acattaaatt 2280
aacattgcaa ccttatcaaa agtgtgagtg agagcaaggg gaagatgaaa gttgagaggg 2340
ttattagaat gcttttgggt acaatgaata gatgatgaaa tttataatgg tttattttct 2400
ttctgaaata agaagtcaga aagtgagccc tctgtatggc ttgtgtacaa tgtctaggtc 2460
ttttgtttat aatcccaagc ataaagccta tgctacacaa gttgaaatag gagaaggggc 2520
ctattctctt ctgtatctct tttgttgtgg aagaaactcc ctagaaacct tagagcagac 2580
tctaattaca tcttattggt cataaacctg gtcataaacc tggtcaccac atgcagagaa 2640
gtagtaaatg aagacatgta ccctttgtag ccttacattg agaaacatgc tcaccaggaa 2700
atgccaagga tgttaaggaa atggttgcag agttgaaaag ttgtgactcc tgttaggaat 2760
aaaagaaaag taatgtacac aaggtatcaa agagatgact ataaaggaga aaccaaagat 2820
ggggatactg cttaaatggc gcaaggctat ttggattaag gaatttggca tttgtgttac 2880
aaataatcat tttgttctct gaccacagaa tcaaaggaa 2919
<210> 10
<211> 3918
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aagtaagtga cagtttgcct ttttttaagc agggaaggag ggagcagttt gtacatagca 60
acaagcctca aagacagtgg ttcttacttt gggtcatgat ccctatgtgg gggtcaaatg 120
accctttcac agaggtcact aaaaccatta gaaaacatag gtatttacat tataattcat 180
aacagtagca aaattacagc tatgaagtag cagcaaaaat aattttattg ttgtagatca 240
ccacaacatg aggaactgta ttaaagggtc acaggattag gaaggtttca aaccactgct 300
catggatata ttgaacaata gagaccttta aatcaggtgc ccagaacgtt ataattatgc 360
cgtgactgaa ccatatctct tcttgtatat ataatacatg tttgagaaat attttagaat 420
aataattggt aaattcttca gctttccagg gaactctatc cctatgagga gcctctttgc 480
cttgtggcaa tattatttta ccaatcttca ccatgttttt ccttacttat aacatgaaag 540
acatggaatt taagaaagga gggcatgagg ctgccaggac tgagtgagaa ggaggagata 600
tgcactgttg ctcctgagtg aaaatggaaa tgaaagtgag cagggctctc aaatttcttt 660
ctcatttggg aagaaatgtc ttgctctttg gttccttctc ctatctgtgt ttaattttgg 720
aggctttatc aggttgtgga aaatctagaa actgtaatag gttgttggaa acctcatttg 780
agtaccatag tccttttata cataattgca caacacattt ttgctttgtt attttttttt 840
atctttgaca acatggacaa tttttttcaa tatcacactc cactgttgat atgtttctca 900
agccacagtt ccttacatga tatttataaa attattgttt ataaaatatg cattattagt 960
gattagacta aaaataataa gggctcttgt ttgatctttc cttctgcttt ccagggagag 1020
cagaaggcta aaagtagtga atgaccaaga ataaggagaa aagccaactc cttcatcagg 1080
cacagagagc tgcagcaaaa aggcagagat ctgtgggaca gaggaagtgg tgtgcttaga 1140
actacataga atcagaagca aaatggatgc cttagcactg aggaaaggtt tctgtcaggt 1200
tataaactgg ttttatatta ttgctgctat tttctgcctc ctcagtacct ttgcaactgc 1260
ctctttcctc atagcattta tctctcaacc tcttcctggg aaaggtgtat atggaatagc 1320
caaacatgaa aacctggata gttctatgag aaaaaaaaaa aacactgtta tattatgttt 1380
ttgtgggtaa aacaaaactg gatgaagcag ggacagaagt cttgctttga aaataatact 1440
tgggaacata tcttaattac aggcaaaata aacctggata aaaatgatta taaatggagt 1500
gggaagaagt atgtcacaga ttatcttcca atgccttatt tttggatata aacataattc 1560
aaatatttaa aaattgaaaa tagaaaaaaa aataaaatca agactggaaa cttcaacttc 1620
taaatgtgat gaaatacctt tgtaagagct cttatcttgc caaggttgaa aatagttcat 1680
tagttataaa agaaattctg actttgagct tatgaactaa catagacagc tcaggattaa 1740
cagggacttg tggtttgtgg tctgtgggct tatccaagca tggtgattta gactctaagg 1800
tccgtctgga tcctagcata tgctacatag atgtcatgtg tgcatgcaag tggtgtactt 1860
gctctttcac caaactcctt tggatctttt gtcctaaatg tgatcttggt gaaagattgt 1920
cctttgagtg agtgggaact cctaagtcaa atcaacttct tatcaaggat ttaaaagtaa 1980
atatgcaaag gagagaagtt agagaaactc ctctcataag aaaaatgtct tccctgaatt 2040
gagccaaaaa tgttcttccc tgtccactaa tgcgtttctt atctaacaga agcaagaaac 2100
aaaggaacag acaacttgag agttaaaagt cattgtggtc tggctttgct accacatgat 2160
gagaagaaat ttctgaaaga agtaggggat gagagtatca ccttcagata gcctaacagt 2220
ttcattttaa tgataatgag atgcaaatac ctgtaaaact atgatttaga aaataaacca 2280
atgctctatc tatattgcta gaaatattaa aaagaaacaa gcatatgctt tgttatacta 2340
gtgtgcttga ctattttgtt cgtaactaca caactctttc cctgtactac tttacaattg 2400
tatatacctg gtgcttgatg gagaagtatg acttacagct tgccttccag aatatacacc 2460
cttctatagc tcgtctgcta gaagacaaac acaagtgaca tcaatttctt ccgattatag 2520
tcccagcaag actgagctga gacaattttc agtaaaatgt agccctccat cttggtgagt 2580
aaacagatat gaggactgaa gctaggatcc cagccatgga gaagaggagt aagaaatcca 2640
tgtccactat gataagccac tgggtcaggg ggttatttgt taaataaaat gctgatcaat 2700
acacatggga caggatgctt attaaaataa tgttttccta ctgtggcatg cagtatgaca 2760
agcagactgt gggtctatag attaagtggg tgatatgaaa acgggtatca ctgccatgat 2820
tttcatgttg ttcagacctt acagcctagt ccctgtagat aggcagtggg tactgaggac 2880
tcagatataa tcacataaac acagggaaag aagagtatgt agaacttttt ttgagaaccc 2940
agaggttggg ggaccaactc aatgatggcc atatatcaca acatgaacat ctatagtagg 3000
attttcttgc cacagaacaa actgccttgt aggagttgcc ttctgtgtat ttccagaggt 3060
aagttctaaa gtcatctgga gaggagcttt gagtggacag ctggaagaaa gtggaaataa 3120
gtggaaaaaa tggccttttg tctgtactgt caaaggagag gctgagtgtg tgcagagggc 3180
cctacagctg cttgcaagaa ctccattaaa acctgccctt tcctgctttt actcattact 3240
tagacttctc taacaaacaa aatggtttta aatgagatta tgcagcaaga atgattacct 3300
cagtatctct agggaactac atcatgtgag ataaggagtc ttggctttga gtgattctac 3360
aaggtagctc aggaatatag tggacaaaga atgggcatag gtttagggag tgaccaaaag 3420
aggttataat ttgttagaag atagggacac tttagcatat tgtctttgtc cttgttctat 3480
tgctgtgaag agatactatg accatggcaa ctcttataaa ggaaagtact taattggacc 3540
tagcttacag tttcagaggc ttagtctatt gtcatagtgg cagggagcat agcagcatgc 3600
atacataaca ctgaagaaat agctgaaaga tctatatcca aaggcagtag gaagagcaag 3660
acctgggtct ggcttgggtc cttgaaacct caaagatcat ccttagtgac acatttccct 3720
caataaagcc acatctcata atactttcaa attgtggtac tccctggaaa gtgcacattc 3780
gaatctatga gcctacgagg tgtcattttc attcaaatta ccacaatctg atacctggtt 3840
cccataagct tgttactgta ccataatgca aaaatgcatt cagttcaact tcaaaagttt 3900
ccatagttta tcgcagtc 3918
<210> 11
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人(human)
<400> 11
atgctgtcca catctcgttc tcggtttatc agaaatacca acgagagcgg tgaagaagtc 60
accacctttt ttgattatga ttacggtgct ccctgtcata aatttgacgt gaagcaaatt 120
ggggcccaac tcctgcctcc gctctactcg ctggtgttca tctttggttt tgtgggcaac 180
atgctggtcg tcctcatctt aataaactgc aaaaagctga agtgcttgac tgacatttac 240
ctgctcaacc tggccatctc tgatctgctt tttcttatta ctctcccatt gtgggctcac 300
tctgctgcaa atgagtgggt ctttgggaat gcaatgtgca aattattcac agggctgtat 360
cacatcggtt attttggcgg aatcttcttc atcatcctcc tgacaatcga tagatacctg 420
gctattgtcc atgctgtgtt tgctttaaaa gccaggacgg tcacctttgg ggtggtgaca 480
agtgtgatca cctggttggt ggctgtgttt gcttctgtcc caggaatcat ctttactaaa 540
tgccagaaag aagattctgt ttatgtctgt ggcccttatt ttccacgagg atggaataat 600
ttccacacaa taatgaggaa cattttgggg ctggtcctgc cgctgctcat catggtcatc 660
tgctactcgg gaatcctgaa aaccctgctt cggtgtcgaa acgagaagaa gaggcatagg 720
gcagtgagag tcatcttcac catcatgatt gtttactttc tcttctggac tccctataat 780
attgtcattc tcctgaacac cttccaggaa ttcttcggcc tgagtaactg tgaaagcacc 840
agtcaactgg accaagccac gcaggtgaca gagactcttg ggatgactca ctgctgcatc 900
aatcccatca tctatgcctt cgttggggag aagttcagaa ggtatctctc ggtgttcttc 960
cgaaagcaca tcaccaagcg cttctgcaaa caatgtccag ttttctacag ggagacagtg 1020
gatggagtga cttcaacaaa cacgccttcc actggggagc aggaagtctc ggctggttta 1080
taa 1083
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgcggtcgac aagcttaatg cccaaagtga tgctc 35
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggacagcatg gtggcttcct ttgattctgt ggtca 35
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gccaccatgc tgtccacatc tcgttc 26
<210> 15
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tactgtttaa accaactcac caggtatggc tcttataaac cagccgagac tt 52
<210> 16
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttggtttaaa cagtatgggt tctgcctttt ctgtcaagta agtgacagtt tgccttt 57
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgactctaga ggatcgactg cgataaacta tggaa 35
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttccatttcc tttgattctg tgg 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttctctgacc acagaatcaa agg 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaccacagaa tcaaaggaaa tgg 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agtatgccgt ggatgaactg agg 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gagatgttga tagtatgccg tgg 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atgttacctc agttcatcca cgg 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tggccccttc atcaagctct tgg 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agtatccaag agcttgatga agg 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gtatccaaga gcttgatgaa ggg 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tatccaagag cttgatgaag ggg 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acctcttgct ccccagtgga agg 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cgagacctct tgctccccag tgg 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tctacattca ctccttccac tgg 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctacattcac tccttccact ggg 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tacattcact ccttccactg ggg 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tccttccact ggggagcaag agg 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cactggggag caagaggtct cgg 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggggagcaag aggtctcggt tgg 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gggagcaaga ggtctcggtt ggg 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cagtttgcct ttttttaagc agg 23
<210> 38
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gctaatacga ctcactatag agtatgccgt ggatgaactg gttttagagc tagaaatagc 60
aag 63
<210> 39
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gctaatacga ctcactatag ggggagcaag aggtctcggt gttttagagc tagaaatagc 60
aag 63
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aaaagcaccg actcggtgcc 20
<210> 41
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt 80
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tcttaaagta ccaaccgaaa aa 22
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gacagaaaag gcagaaccca tact 24
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gagccatacc tggtgagttg 20
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
aagtgaagcc tggattctgt t 21
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cccagctttc atgttagagg ca 22
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tggtaatgtg agcaggaaga g 21
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cccagctttc atgttagagg ca 22
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gcccacaatg ggagagtaat aag 23

Claims (10)

1.一种人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，包括：
在非人动物细胞内导入人CCR2基因，使得该人CCR2基因在非人动物细胞中表达产生人源化的CCR2蛋白，同时降低或消除所述非人动物细胞内的内源CCR2基因的表达。
2.如权利要求1所述的人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，利用基因编辑技术实现所述CCR2基因人源化动物细胞的构建，在所述非人动物细胞内形成人源化CCR2基因；
可选的，所述非人动物为啮齿类动物；可选的，所述非人动物细胞为受精卵细胞；
可选的，所述啮齿类动物为小鼠，所述构建方法将小鼠的Ccr2基因的第3号外显子的全部或部分序列替换为人CCR2基因的第3号外显子的全部或部分序列。
3.如权利要求2所述的人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，所述人CCR2基因选自下列组中的至少一种：
(a)所述基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：6所示；
(b)所述基因转录的mRNA序列如SEQ ID NO：7所示；
(c)所述基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO：8所示。
4.如权利要求2所述的人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术实现，所述构建方法具体包括：提供人CCR2基因同源重组载体、sgRNA以及Cas9的混合物，所述Cas9包括Cas9 mRNA和/或Cas9蛋白，将所述混合物注射到所述非人动物细胞中，将所述非人动物细胞转移至培养液中进行培养。
5.如权利要求4所述的人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，所述人CCR2基因同源重组载体包括从5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人CCR2基因编码区以及3’同源臂，所述5’同源臂为与小鼠Ccr2基因的第3号外显子5’端同源的DNA片段，所述3’同源臂为与小鼠Ccr2基因的第3号外显子3’端同源的DNA片段；
所述sgRNA在小鼠Ccr2基因的5’端靶位点和3’端靶位点均位于小鼠Ccr2基因的第3号外显子上。
6.如权利要求5所述的人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法，其特征在于，可选的，所述5’同源臂的DNA序列如SEQ ID NO：9所示，所述3’同源臂的DNA序列如SEQ ID NO：10所示；
可选的，所述人CCR2基因编码区的DNA序列如SEQ ID NO：11所示；
可选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：18-27任一项所示，所述sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：28-37任一项所示；
优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：21所示，所述sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：35所示。
7.一种人源化CCR2基因改造动物细胞，其特征在于，所述人源化CCR2基因改造动物细胞由权利要求1-6中任一项所述的人源化CCR2基因改造动物细胞的构建方法获得。
8.一种人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法，其特征在于，将如权利要求7所述的人源化CCR2基因改造动物细胞或者由所述人源化CCR2基因改造动物细胞发育得到的胚胎移植至代孕母体内进行发育，得到F0代动物；
对F0代动物进行检验，获得基因型鉴定正确的F0代阳性动物。
9.如权利要求8所述的人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法，其特征在于，还包括：将所述F0代阳性动物通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，同时杂合子小鼠自交获得纯合子小鼠，建立稳定的人源化CCR2基因改造小鼠品系。
10.一种细胞或细胞系或细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或细胞培养物来源于人源化CCR2基因改造动物模型或其子代，所述人源化CCR2基因改造动物模型由权利要求8-9中任一项所述的人源化CCR2基因改造动物模型的构建方法获得。
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