CN112481301A - Stap2基因点突变敲入模式小鼠的打靶载体和构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Stap2基因点突变敲入模式小鼠的打靶载体和构建方法，其构建方法包括构建打靶载体，设计sgRNA并制备其显微注射RNA，利用Cas9、显微注射RNA、打靶载体制备F0代小鼠并进行基因型鉴定，制备F1代小鼠并进行基因型鉴定及Southern blot鉴定等。Stap2基因属于重要的接头蛋白家族，可通过感受胞外细胞信号进行信号转导功能。本发明首次提出的Stap2蛋白Tyr250缺失小鼠的打靶载体和Stap2蛋白Tyr250缺失小鼠的构建方法，可为Stap2蛋白Tyr位点缺失的研究提供具体模型，填补该研究方向的空白，有利于对该位点的作用进行更深入地探索。

Description

Stap2基因点突变敲入模式小鼠的打靶载体和构建方法

技术领域

本发明属于小鼠模型构建技术领域，具体涉及一种Stap2基因点突变敲入模式小鼠的打靶载体和构建方法。

背景技术

胞内信号的激活是由许多信号分子通过胞外配体(例如细胞因子、激素和生长因子)转导调节。而在信号通路中，接头蛋白在信号转导中起着重要作用。尽管接头蛋白没有任何催化功能，但其特有的结构域可以帮助其转导信号到特定靶点。

Stap2基因(全称为signal transducing adaptor family member 2，又名:AW049765、STA、STAP-2)在17号染色体反链上，全长约 8.53kb。Gene ID:106766。Stap2基因，是在2000年首次从人类乳腺的cDNA文库中通过酵母双杂交技术获得，其被鉴定可与非受体酪氨酸激酶结合。随后，2003年鼠中该同源基因在胎肝cDNA文库中被克隆鉴定。而该基因全缺失的小鼠模型也被构建用于研究功能。

Stap2基因表达的蛋白是一个新奇的信号转导接头蛋白，其包含 PH结构域、SH2样结构域及C端脯氨酸富集结构域。该蛋白属于 Stap2信号转导家族，可结合信号或是转录分子，并且调控先天和适应性免疫系统。在细胞因子信号通路中，该蛋白可功能性结合STAT3或STAT5进行调节，同时其可结合MyD88及IKK-α/β调节TLR4 信号通路。通过对Stap2基因缺失小鼠的研究发现该基因可调控T 细胞的活性、存活与死亡。

Stap2蛋白的tyrosine-250(Tyr250)，是v-Src,Jak2 and LIF作用的主要磷酸化位点，其可增强STAT3的转录活性，其可能对于炎症因子信号的调控有一定作用。而对其以往研究主要在细胞系中，且相关研究报道甚少，对生物体内Stap2蛋白的Tyr250功能未有阐明，尚待深入研究。同时目前仅有Stap2基因缺失小鼠，无法研究该蛋白具体Tyr250位点所起到的功能。

因此Stap2蛋白的Tyr250缺失小鼠模型的构建十分有必要，可深入探究生物体中该蛋白Tyr250位点的影响及其与别的重要蛋白是否有相关作用，可在该蛋白功能的探索领域有着重要的贡献。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Stap2基因点突变敲入模式小鼠的打靶载体和构建方法，为Stap2蛋白Tyr位点缺失的研究提供具体模型，填补该研究方向的空白，有利于对该位点的作用进行更深入地探索。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种Stap2基因点突变敲入模式小鼠的打靶载体，所述打靶载体包含DNA片段结构LR-A-RR，其中，LR为左同源臂序列，A为 stap2的突变序列，RR为右同源臂序列，同时LR和A之间有12bp 的酶切位点序列，A和RR之间有17bp的酶切位点序列；酶切位点用于后续的Southern blot鉴定。

进一步的，所述打靶载体中LR-A-RR片段结构的核苷酸序列如 SEQ ID NO.25所示。

进一步的，所述打靶载体的构建方法为，将小鼠stap2基因的第 250位氨基酸Tyr突变为Phe，相对应的碱基由TAT变为TTT，在基因的intron4-5和intron9-10内查找特异的sgRNA识别位点，进而用于设计与该位点结合的sgRNA，根据sgRNA理论切口位置进行打靶载体设计，合成LR-A-RR序列后得到含有LR-A-RR序列的打靶载体。

一种Stap2基因点突变敲入模式小鼠的构建方法，包括以下步骤：

步骤1)构建打靶载体；

将小鼠stap2基因的第250位氨基酸Tyr突变为Phe，相对应的碱基由TAT变为TTT，在基因的intron4-5和intron9-10内查找特异的sgRNA识别位点，进而用于设计与该位点结合的sgRNA，根据 sgRNA理论切口位置进行打靶载体设计，合成LR-A-RR序列后得到含有LR-A-RR序列的打靶载体，然后再通过酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建完成；

所述打靶载体包含DNA片段结构LR-A-RR，其中，LR为左同源臂序列，A为stap2的突变序列，RR为右同源臂序列，同时LR 和A之间有12bp的酶切位点序列，A和RR之间有17bp的酶切位点序列，酶切位点用于后续的Southern blot鉴定；所述打靶载体中 LR-A-RR片段结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；

步骤2)设计sgRNA并制备sgRNA的显微注射RNA；

根据查找到的intron4-5和intron9-10内查找特异的sgRNA识别位点设计2条sgRNA，这2条sgRNA的靶位点序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.20所示，然后将这2条sgRNA的序列连入带T7启动子的PT7-4G质粒载体上，并将质粒测序验证正确后，使用通用扩增引物进行扩增T7启动子及sgRNA序列，最后以该PCR 产物为模板进行体外转录，得到这2条sgRNA的显微注射RNA；

步骤3)制备F0代小鼠；

采用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法构建基因敲入小鼠，将 Cas9、显微注射RNA、打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，注射后获得F0代小鼠；

步骤4)F0代小鼠基因型鉴定；

对F0代小鼠鼠尾基因进行PCR扩增并测序验证，并给出相应鉴定结果；由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的F0代小鼠为嵌合体；故以F0代小鼠鼠尾进行鉴定得到的F0代小鼠基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待F1代小鼠鼠尾检测后确定；

步骤5)制备F1代小鼠；

选择F0代小鼠基因型鉴定结果中的F0代阳性小鼠，使其与野生型小鼠进行交配，从而获得具有稳定基因型的F1代小鼠；

步骤6)F1代小鼠基因型及Southern blot鉴定；

对F1代小鼠进行F1代小鼠基因型鉴定，并给出相应鉴定结果，然后选择F1代小鼠基因型鉴定结果中的F1代阳性小鼠，即F1代阳性同源重组小鼠，提取其鼠尾DNA进行Southern blot检测及测序，从而筛选出发生正确重组的基因打靶小鼠，即获得Stap2基因点突变敲入模式小鼠。

进一步的，步骤1)中，筛选sgRNA的方法为，根据所设计的 sgRNA，分别构建相对应的Cas9/sgRNA质粒，然后分别对各个构建好的Cas9/sgRNA质粒进行活性检测，最后根据检测结果，选择其中活性和特异性最好的两个Cas9/sgRNA质粒对应的sgRNA。

进一步的，采用CRISPR/Cas9活性检测方法中的UCATM方式来对Cas9/sgRNA质粒进行检测活性。

进一步的，步骤1)中，Cas9/sgRNA质粒的构建方法为，按照所设计的sgRNA的序列合成相应引物，通过GibsonAssembly的方式连入pCS-3G载体，连接产物转化后送样测序验证正确，从而完成 Cas9/sgRNA质粒的构建。

进一步的，在构建Cas9/sgRNA质粒前，需要首先对C57BL/6N 小鼠尾靶位点序列进行PCR扩增并测序验证，以确认sgRNA识别序列与C57BL/6N鼠尾DNA序列完全一致，从而保证所设计 Cas9/sgRNA质粒的效率。

进一步的，步骤1)中，制备进行显微注射的sgRNA的反应条件为65℃下反应5min。

进一步的，步骤2)中，对打靶载体进行酶切鉴定和测序时所采用的酶分别为BamHI限制酶、SacI限制酶和EcoRV+HindIII限制酶。

进一步的，在进行F0、F1代小鼠基因型进行鉴定时，所设计并采用的PCR引物均分别为Stap2-L-GT-F引物、Stap2-L-GT-R引物、Stap2-R-GT-F引物和Stap2-R-GT-R引物，其中，

所述Stap2-L-GT-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

所述Stap2-L-GT-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；

所述Stap2-R-GT-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；

所述Stap2-R-GT-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

进一步的，在对F0、F1代小鼠鼠尾基因进行鉴定时，PCR反应条件依次为：

阶段1、94℃5min；

阶段2、98℃10sec，67℃30sec，68℃1kb/min，15cycles；

阶段3、98℃10sec，57℃30sec，68℃1kb/min，25cycles；

阶段4、68℃10min；

阶段5、4℃forever；

其中，在阶段2进行67℃30sec的反应时，其温度每循环一次降低0.7℃。

进一步的，步骤6)中，在对F1代阳性小鼠鼠尾DNA进行 Southern blot检测及测序时，Southern blot的筛选策略为利用ScaI 限制酶和EcoNI限制酶作为Southern blot酶切位点，并同时利用3’ Probe探针和A Probe探针验证F1代阳性小鼠，从而筛选出发生正确重组的基因打靶小鼠；其中，

3’Probe探针用于检测是否发生正确重组，若发生正确重组，则会出现野生型和突变型两个条带；A Probe探针用于检测是否含有随机插入，若没有随机插入，则会出现野生型和突变型两个条带。

本发明的有益效果为：

Stap2基因所属于重要的接头蛋白家族，可通过感受胞外细胞信号进行信号转导功能。目前的研究表明，Stap2蛋白在先天免疫以及适应性免疫系统中起着重要的作用。但目前仅有Stap2基因全缺失的小鼠模型进行研究，Tyr250作为其非常重要的酪氨酸激酶位点，现尚未构建出Tyr250位点缺失的小鼠模型，对其具体生物学功能进行研究。因此本发明首次提出的这种Stap2蛋白Tyr250缺失小鼠的打靶载体和Stap2蛋白Tyr250缺失小鼠的构建方法，可为Stap2蛋白Tyr位点缺失的研究提供具体模型，填补该研究方向的空白，有利于对该位点的作用进行更深入地探索。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明的打靶载体构建策略示意图；

图2为本发明所采用的Southern blot筛选策略的示意图；

图3为本发明所采用的pCS-3G载体的载体图谱；

图4为本发明对16个构建好的Cas9/sgRNA质粒的活性检测结果图；

图5为本发明得到进行显微注射的RNA的电泳图；

图6为本发明构建的打靶载体的载体图谱；

图7为本发明对打靶载体进行酶切鉴定和测序的结果图；

图8为本发明在F0和F1代小鼠基因型鉴定时的PCR引物设计原则示意图；

图9a和图9b为本发明的F0代小鼠基因型鉴定的鉴定结果图；

图10a和图10b为本发明的F1代小鼠基因型鉴定的鉴定结果图。

图11为本发明的F1代阳性同源重组小鼠Southern blot检测的结果图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

首先设计打靶方案，参见图1所示，图1表示打靶载体构策略建示意图，本发明的打靶方案为通过分析Stap2基因的结构，将小鼠 stap2基因的第250位氨基酸Tyr突变为Phe，相对应的碱基由TAT 变为TTT，在基因的intron4-5和intron9-10内查找特异的sgRNA 识别位点，进而用于设计与该位点结合的sgRNA，根据sgRNA理论切口位置进行打靶载体设计，合成LR-A-RR序列后得到含有 LR-A-RR序列的打靶载体。

其次确定筛选策略，为了筛选到发生正确重组的基因打靶小鼠，我们采用PCR和Southern blot方法，并同时利用3’Probe探针和A Probe探针验证F1代阳性小鼠。Southernblot筛选策略的示意图如图2所示，具体设计如表1所示：

表1

Restrictionenzyme	Probe	WT	Targeted
				ScaI	3’Probe	14.5kb	9.8kb
EcoNI	AProbe	5.5kb	4.2kb

其中，利用ScaI限制酶和EcoNI限制酶作为Southern blot酶切位点，3’Probe探针用于检测是否发生正确重组，若发生正确重组，将会出现野生型和突变型两个条带；AProbe探针用于检测是否含有随机插入，若没有随机插入，将会出现野生型和突变型两个条带。

然后开始Stap2基因点突变敲入模式小鼠的构建，本发明采用基于CRISPR/Cas9开发的EGE系统制备Stap2基因点突变敲入模式小鼠，具体包括以下步骤：

1、靶序列的测序确认；

不同品系，靶基因序列可能有所差异。为了保证所设计的sgRNA 的效率，首先需要对C57BL/6N小鼠尾靶位点序列进行PCR扩增并测序验证，以确认sgRNA识别序列与C57BL/6N鼠尾DNA序列完全一致。PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示，其具体信息如表2所示：

表2

对C57BL/6N鼠尾DNA进行PCR扩增及测序验证，结果证明 C57BL/6N鼠尾靶序列与Genebank和Ensembl所给序列完全一致。

2、Cas9/sgRNA质粒的设计及构建；

2.1、Cas9/sgRNA质粒的设计；

基于sgRNA的设计原则，在靶位点区域共设计16条sgRNA，即sgRNA1～sgRNA16。该16条sgRNA对应的靶位点序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.20所示，具体如表3所示：

表3

5’Guide	Sequence(5’-3’)
		Guide#1	TAAAAAGTTGAGGCCAACTTAGG
Guide#2	CCTGTAATAACTACTGCTCCAGG
		Guide#3	CCTGGAGCAGTAGTTATTACAGG
Guide#4	TGCACAAGTTGCTCTCAGTCTGG
		Guide#5	CTCTGAATTGATGGGGACATGGG
Guide#6	CTTGTGCACTCTGAATTGATGGG
		Guide#7	GTTTCACTCAATGAAATTGAAGG
Guide#8	AAAACAGAAGACCTCTCATTGG
		3’Guide	Sequence(5’-3’)
Guide#9	CATGTGCTCTCACGTAGCCGTGG
		Guide#10	AATCGCTAGGATCTCCGTGTAGG
Guide#11	ATGCCTGTCATCTGAATCCACGG
		Guide#12	AACTAATGGTCTGGCTCCAAAGG
Guide#13	AGGACCGTGCCGTGCCCCTCAGG
		Guide#14	GGTCCTCCCGAGCCCAGCTCTGG
Guide#15	TCAAAGGTTCTATACACCTCTGG
		Guide#16	GACCTGTATAATGAATGGGCTGG

2.2、Cas9/sgRNA质粒的构建；

按照已设计的16条sgRNA序列合成相应引物，通过Gibson Assembly的方式分别连入如图3所示的pCS-3G载体，连接产物分别转化后送样测序验证正确，从而构建出16个Cas9/sgRNA质粒。

3、Cas9/sgRNA质粒的活性检测；

对于sgRNA的活性检测，本发明采用了一种本申请人自主研发的CRISPR/Cas9活性检测方法，即UCATM方式，其具有无物种限制，高通量，适应性广，灵敏度高，简便性等优点。

对16个构建好的Cas9/sgRNA质粒进行活性检测后，得出如图 4所示的检测结果。从图4中可以看出，第2个和第16个Cas9/sgRNA 质粒的的活性和特异性明显优于其他14个Cas9/sgRNA质粒的活性和特异性，因此综合选择这2个Cas9/sgRNA质粒所对应的sgRNA，即sgRNA2和sgRNA16进行下一个步骤；

sgRNA2的靶位点序列为CCTGTAATAACTACTGCTCC AGG；

sgRNA2的序列为CCTGTAATAACTACTGCTCC；

sgRNA16的靶位点序列为GACCTGTATAATGAATGGGC TGG；

sgRNA16的序列为GACCTGTATAATGAATGGGC。

4、sgRNA的显微注射RNA的制备；

先将sgRNA2和sgRNA16的序列分别连入带T7启动子的 PT7-4G质粒载体上，然后将两个质粒测序验证正确后，使用通用扩增引物进行扩增T7启动子及sgRNA核苷酸序列，最后以该PCR 产物为模板进行体外转录，得到sgRNA2和sgRNA16的显微注射 RNA；并且其制备时反应条件为65℃下反应5min，RNA电泳图如图5所示，图5表示sgRNA2和sgRNA16在所需浓度下成功转录。

5、打靶载体的构建；

首先根据设计好的打靶方案，设计引物，构建打靶载体，所述打靶载体的图谱如图6所示，所述打靶载体包含DNA片段结构 LR-A-RR，其中，LR为左同源臂序列，A为stap2的突变序列，RR 为右同源臂序列，同时LR和A之间有12bp的酶切位点序列，A和 RR之间有17bp的酶切位点序列，酶切位点用于后续的Southern blot 鉴定；

所述打靶载体中LR-A-RR片段结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，具体如下所示：

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然后将得到的打靶载体再通过酶切鉴定和测序，从而确认打靶载体构建完成；打靶载体酶切鉴定和测序的结果如图7所示，图7 中代号1表示采用BamHI限制酶进行酶切鉴定，其预期结果为 1293bp+1780bp+4730bp；代号2表示采用SacI限制酶进行酶切鉴定，其预期结果为3109bp+4694bp；代号3表示采用EcoRV+HindIII限制酶进行酶切鉴定，其预期结果为634bp+7169bp。

6、F0代小鼠的制备；

将Cas9、sgRNA的显微注射RNA及打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，注射后F0代小鼠出生情况如表4所示：

表4

7、F0代小鼠基因型检测；

本发明采用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法构建基因敲入小鼠；由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的F0代小鼠为嵌合体；故以 F0代小鼠鼠尾进行鉴定得到的F0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待F1代小鼠鼠尾检测后确定。

7.1、按照如图8所示的PCR引物设计原则，设计F0代小鼠基因型鉴定引物。

其PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.24所示，其具体信息如表5所示：

表5

PCR条件(Touchdown)如表6所示：

表6

7.2、对F0代小鼠鼠尾基因型进行鉴定，部分鉴定结果如图9a 和图9b所示。其中，图9a表示引物为Stap2-L-GT-F/Stap2-L-GT-R 的鉴定结果，图9b表示引物为Stap2-R-GT-F/Stap2-R-GT-R的鉴定结果。

结论：通过PCR产物和测序表明，1E1L83-009、1E1L83-010、 1E1L83-011和1E1L83-013为阳性F0代小鼠。

8、F1代小鼠的制备；

选择F0代小鼠鼠尾基因型鉴定结果中阳性小鼠与野生型交配获得具有稳定基因型的F1代小鼠，交配结果如表7所示：

表7

9、F1代小鼠基因型及Southern blot鉴定；

9.1、F1代小鼠基因型鉴定；

其PCR引物设计原则、PCR引物信息以及PCR条件与F0代小鼠基因型鉴定的条件相同。部分鉴定结果如图10a和图10b所示。其中，图10a表示引物为Stap2-L-GT-F/Stap2-L-GT-R的鉴定结果，图10b表示引物为Stap2-R-GT-F/Stap2-R-GT-R的鉴定结果。

结论：通过PCR鉴定和点突变位点测序结果表明，1E1L83-002、 1E1L83-003、1E1L83-005、1E1L83-007、1E1L83-008、1E1L83-009、 1E1L83-012、1E1L83-014、1E1L83-017和1E1L83-024为F1代PCR 阳性小鼠。

9.2、F1代阳性同源重组小鼠Southern blot检测；

提取上述PCR鉴定为阳性的F1代小鼠鼠尾DNA进行Southern blot检测及测序，检测结果如图11所示。检测结果表明：1E1L83-002、 1E1L83-003、1E1L83-005、1E1L83-007、1E1L83-008、1E1L83-009、 1E1L83-012、1E1L83-014、1E1L83-017和1E1L83-024为正确重组，且没有随机插入。

需要说明的是，附图中Wild type allele表示野生型小鼠，Targeted allele表示通过代受精卵注射得到的阳性小鼠，或者F0带阳性小鼠与野生型小鼠交配获得的F1代阳性杂合子小鼠。

对于小鼠ID的命名，以1E1L83-002为例，其原则为1表示F1 代，E1L83表示Stap2的实验课题代号的缩写，002表示剪尾编号。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州大学

<120> Stap2基因点突变敲入模式小鼠的打靶载体和构建方法

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcatcaagct tggtaccgat cttgatttga aggcaggagg atggc 45

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acttaatcgt ggaggatgat caggttcaac gaggagccaa agaca 45

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatcaagct tggtaccgat ctctccttga ccattgcagg accag 45

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acttaatcgt ggaggatgat atgcttcctg ccatgatgac cacaa 45

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taaaaagttg aggccaactt agg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctgtaataa ctactgctcc agg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctggagcag tagttattac agg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgcacaagtt gctctcagtc tgg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctctgaattg atggggacat ggg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cttgtgcact ctgaattgat ggg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtttcactca atgaaattga agg 23

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaaacagaag acctctcatt gg 22

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

catgtgctct cacgtagccg tgg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aatcgctagg atctccgtgt agg 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgcctgtca tctgaatcca cgg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aactaatggt ctggctccaa agg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aggaccgtgc cgtgcccctc agg 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggtcctcccg agcccagctc tgg 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tcaaaggttc tatacacctc tgg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gacctgtata atgaatgggc tgg 23

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcaaaggtgc ttcagcagga aagag 25

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gtataatgaa tggatatccc tggcttagg 29

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gggtgttgga tcccctggaa atattagtac t 31

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cccctgagtg aggatagagc tggaa 25

<210> 25

<211> 5642

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gaaaagctgg acctgaggct gttttcaaag ctcagagatg aggctctgct gggaagctca 60

cgggacactg cctatcactt cagcctggtt ctccgggacc aggaggtgaa attcaaggta 120

agtgagaagg gggtaatcct ctctcgattc caacattcac aacaaaaaca tggagtcaca 180

caaagtaccc ctctgggatc ctcttactct gcaagtcact gggcctttct gtgactctag 240

atgactttga aggggccggt ctgcataaag acacagatgg gggctgggga gatggtcctg 300

agttcaaatc ccagcaacca catggtggct cacaactatc tgtaatgaga tctaatgccc 360

tcttctggtg tgtctgaaga cagctatggt gtacttatat ataataataa ataaatcttt 420

aaaaaaaatg agggccttac tccactttta caaggaacat atccaacctt cttctcctcc 480

tccacctcct ccaccttctt cctcctcctc ctcctcttcc tcctcctcca ctttcttcct 540

ccttctcctc ctcttcctcc ttctcctcca cctcctcttc ctccttctcc tccacctcct 600

cttcctcctc ttcttcctcc tcctcttcct cttcctcctc ttcctcttcc tcctcttctt 660

cttcttcttc ttcctcctcc tcctcctcct cctcctcctc ctcctcctcc ttctttttct 720

tctagacaga gtttctctgt gtagccctgg ctttcctgga actcactctg tagaccaggc 780

tggcctcgaa ctcagaaatc cgcctgcctc tgcctcccaa gtgttgggtt taaaggcgtg 840

ctccaccact gcccttctac atccattttt cttaacataa actctttccc tctctctcta 900

ggtggagagc ctggagtctt gtgagatgtg gaaaggattt atcttgactg tggtagaggt 960

aacgtcagct tttacttctc tattacttat ttttgtcacc acaagataat tggcacaagc 1020

atcttaagga agtggggggt tattcttgat ttgaaggcag gaggatggct ctacaaggag 1080

cagagtgagt gtgatgagtt gtcactcagg tcacctggct gttcagtttg gggtccctac 1140

ccacgggatg gttctcaaag tgtggctccc cacttcaatc aatgaaaact agaagacctc 1200

tcattggtgt gcccagaggt ctgtttccat ggtgaccttc aatttcattg agtgaaaccg 1260

ttagaaacaa ttgagataaa tcattagaat ctctgtccca tgtccccatc aattcagagt 1320

gcacaagttg ctctcagtct ggaagctcac agcctgaagc cagacaagga aactaaaact 1380

tttcatttaa tttttaaagt ttttattttt agattgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1440

tgtgtgtgta catgagtgca gtgctctcag gggccagaag agggtgttgg atcccctgga 1500

aatattagta ctgcagtagt tattacagga gtttgagagc tgctgagtag gtgttagaaa 1560

cagaactcca gtcctctgtg tggctatgcc tgagctccag ttccttgttc tgtttttgag 1620

atagggtctt ctgtagccta agttggcctg aactttttat atagctgaga gtgacttccc 1680

tcctttgccc ccacctcctg agtgctgggg taacaggtgt gcatcaccac acacagttta 1740

caacttcaaa tttttgtctt tggctcctcg ttgaacctga gagttgccta acactaggag 1800

caaggttcta gcaccttttg aatctgcttc agggtctttc tctgagtgcc tacgtatctg 1860

tgtgctgtga ggggtccggt agtgtcgggc acagagggac ttctctctgg ctacacatgc 1920

cggcctcagt ttaccttttg ggtccccacc catgcattct ctacctggat tatccttcag 1980

ctccgtgtcc catctaacct gaccctgctg cccggacacc tgtacatgat ggccgaggtc 2040

ctgaccaaag aggaggtacg gagggcagcc gaggtgccct ggtgagtgct ggccgcccgt 2100

ggggtgggca aggaacccac tctagagcgg gctctttctg agggcctggg tccctggggg 2160

agagggctgt attcaaaaga aggacggggc ttttgtcttg ggcagtgcct cagtttagaa 2220

agggagacct gggtccagag tttctgagta ggcgggacct atgccgagga gcgggggtct 2280

ctcggcggtg gccggtgtgt ggcctctgag gcctagtaca gtgtgggcct gcgtggctct 2340

ctccatctcc cgtgcgtggt cgcccaggtg ctttcttcag gtgagcaggc tcgaggcgca 2400

gctgctcctg gagcgctacc cagagtgcgg gaacctgctt ctgcggcctg gcggggatgg 2460

caaggacagt gtgtctgtca ccacccggca gattctcaat gggtgcgtat gctggaccta 2520

gtatgggggc tctagctggg ggcttagtaa ccagaggctg ccgggaaaat ggttagtcca 2580

ggcccgggcc atgacttggg atgaggttag gactaggggt gcacctccag gggcggggtc 2640

atgcctaggg gtagggtttc tgcaaggtgg ctctcatatg gggtgaggtc tcgtgggcgt 2700

ggccataact gggcgggcct agaggcggga ccatggctac cggcggggtc ttgaggttag 2760

cctcataggg ggctggtttc ctggggtgtg gcatcccagc tacccagttg cccacttctg 2820

ttcaggtctc ccgtggtcaa acactacaaa gtgaagcggg caggttctaa gtatgtgatc 2880

gacgtggaag acccggtgag ttttgggacg tccttggctc tgtcttcctt ccgcccctcc 2940

ttgaccgacc atcttctctc gcccagtttt cctgcccctc gctggaagct gtagtcaact 3000

attttgtgac gcacaccaag agggcgctgg tccccttctt gttggatgag gactttgaga 3060

aggttctagg tgtgtgcgat gtggggctgc caggcttgga cagggatact ctctcggggg 3120

gctagctccg ggcctccacg ctgcctccag gctgcccgcc ctctctgttt caggcttcgt 3180

ggactcggat cgggagaatg gcgagagtgc atgggctgtg ccctccttcc gagcctcagg 3240

tgactctcct tgaccattgc aggaccaggg atccacaccc caaaggctct atttatttgc 3300

ttgttttgtt ttgtgtttgt ttgttttggt tttggtttgt tttgagacag ggtttctctg 3360

tgtagccctg gttgccctgg aactcactct atagaccagg ttgaccttga actcacagat 3420

ccatctgcct ctgcctccta agtgtaagga tcaaagtgtg ccacgccacc tgtttttttg 3480

ttttgttttg tttttgtttt tgccaggctc tcatgtgctc tcacgtagcc gtggattcag 3540

atgacaggca tcagctccta cacggagatc ctagcgattt gatttttaaa ttttattatc 3600

attattatta tcatcatcat tcgttttttg agactctgga aatcacagag gttcacctgc 3660

ctctgcttcc tgagtgctgg aactaatggt ctggctccaa aggattttat taatagagat 3720

ggcgaaagaa gagagacctg gggtgggagc taggcaggaa ggggattcga agtctcattt 3780

accaactgag aggaagaggc agcatgcctt gctggggcct gaggggcacg gcacggtcct 3840

cccgagccca gctctggcca catgtatttg gatgctgtgc atctgaggtg tgtgtccatg 3900

tcaaaggttc tatacacctc tggatattca tgtcttttta aaaatataat ttatttattt 3960

ttgttttatg tgcattggtg ttttgtctgc ctgcgtgtct gtgtgaagct gtcagatctt 4020

agagctacag acagttgtga gctgccatgt gggtgctggg atttgaaccc ttggtcttct 4080

ggaagagcaa ttagtgccct caactgctga gccgactctc cagcccctaa gccagggata 4140

tccattcatt atacaggtct tagagtttca ttgctgtgaa gagacaccat gactatggca 4200

actcttatca agaaaaagca ggggctggag agatggctca gtggttaaga gcactgactg 4260

ctcttccaga gatcctaagt tcaattccca gcaaccacat ggtggctcac aactatctgt 4320

aatgggatct gatgccctct tctggtgtga ctgaagacag ttacagtgta ctcatatata 4380

cataaaatga gtaaataaat cttttttttt tttttttttt ttttggtttt tcaagacagg 4440

gtttctctgt atagccctgg ctttcctgga actcactttg tagaccaggc tggtctcgaa 4500

cttagaaatc tgcctgcctc tgcctcccaa gtgctgggat taaaggcgtt cgccatcatc 4560

gccctgcaaa taaataaatc ttaaaaataa aacaaaaagt aattatgggt ggcttacagt 4620

ttcagagatt tagttcattt tcattgtggt catcatggca ggaagcatgg cggcgtgcag 4680

gcagacatgg tgctggagga gagctccaca tcttgatcca caggcagcag gagactgtgt 4740

gccacactag gcatagcata ggagacctca aagcttgttc cccctcagtg acacacttcc 4800

cccaacaagg cctaataata ctactcccta tgggccaagc attcaaacat gagtctgggg 4860

gtgggggcag gccaccatca tacacatata cgtatacact tgtacctgtc taaagctgag 4920

attccatatg catcccagag tgcagacaca ttgtgattgg caggtgggca cacttgtgta 4980

tctcagtagg tgctccctaa ggggtttgta tcacataggc tctgacagtg actctggttc 5040

tcatcaggcc ctgccctccc tgctaatgtc ctgaagccac tcccacctgt acctgtgtct 5100

gtgtccagcc aggaagacaa gttgcctcaa ctacctcccc tgcctcagtt accagacacg 5160

gatgagaact acgtgactcc cattgaagac tccccagcag ccgaatacat gaatcaggat 5220

ggtaagccca ggttggggcg ccaacaccgg agttgggaga aacaggtagc accctgtgac 5280

atctctctct tgtccatgca gtgtctctct ccagtcaggc agtccctctg aagcccaaga 5340

agccggcaag gctcccagca aaacccccaa agccatcagt tgtgcctaag ccaggtaggg 5400

ctctagtctc cccatttcct cctcagtgac attggccttg gacctcatct gcctctttct 5460

gcagatctca aagccattac cagcgtttgg accaggaagc taggtggaag ctcgtcccag 5520

gcttcctccc ttgtgacaag taaggagact ttgggggctt agatgcatgg tgggcaggcc 5580

caggatttgg ggcacagccc aaggtaccct agctaaccct ggactcctac ccaccaggac 5640

tt 5642

Claims (10)

1.Stap2基因点突变敲入模式小鼠的打靶载体，其特征在于：所述打靶载体包含DNA片段结构LR-A-RR，其中，LR为左同源臂序列，A为stap2的突变序列，RR为右同源臂序列，同时LR和A之间有12bp的酶切位点序列，A和RR之间有17bp的酶切位点序列；酶切位点用于后续的Southern blot鉴定。

2.根据权利要求1所述的Stap2基因点突变敲入模式小鼠的打靶载体，其特征在于：所述打靶载体中LR-A-RR片段结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。

3.根据权利要求2或3所述的Stap2基因点突变敲入模式小鼠的打靶载体，其特征在于：所述打靶载体的构建方法为，将小鼠stap2基因的第250位氨基酸Tyr突变为Phe，相对应的碱基由TAT变为TTT，在基因的intron4-5和intron9-10内查找特异的sgRNA识别位点，进而用于设计与该位点结合的sgRNA，根据sgRNA理论切口位置进行打靶载体设计，合成LR-A-RR序列后得到含有LR-A-RR序列的打靶载体。

4.Stap2基因点突变敲入模式小鼠的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)构建打靶载体；

将小鼠stap2基因的第250位氨基酸Tyr突变为Phe，相对应的碱基由TAT变为TTT，在基因的intron4-5和intron9-10内查找特异的sgRNA识别位点，进而用于设计与该位点结合的sgRNA，根据sgRNA理论切口位置进行打靶载体设计，合成LR-A-RR序列后得到含有LR-A-RR序列的打靶载体，然后再通过酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建完成；

所述打靶载体包含DNA片段结构LR-A-RR，其中，LR为左同源臂序列，A为stap2的突变序列，RR为右同源臂序列，同时LR和A之间有12bp的酶切位点序列，A和RR之间有17bp的酶切位点序列，酶切位点用于后续的Southern blot鉴定；所述打靶载体中LR-A-RR片段结构的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；

步骤2)设计sgRNA并制备sgRNA的显微注射RNA；

根据查找到的intron4-5和intron9-10内查找特异的sgRNA识别位点设计2条sgRNA，这2条sgRNA的靶位点序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.20所示，然后将这2条sgRNA的序列连入带T7启动子的PT7-4G质粒载体上，并将质粒测序验证正确后，使用通用扩增引物进行扩增T7启动子及sgRNA序列，最后以该PCR产物为模板进行体外转录，得到这2条sgRNA的显微注射RNA；

步骤3)制备F0代小鼠；

采用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法构建基因敲入小鼠，将Cas9、显微注射RNA、打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，注射后获得F0代小鼠；

步骤4)F0代小鼠基因型鉴定；

对F0代小鼠鼠尾基因进行PCR扩增并测序验证，并给出相应鉴定结果；由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的F0代小鼠为嵌合体；故以F0代小鼠鼠尾进行鉴定得到的F0代小鼠基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待F1代小鼠鼠尾检测后确定；

步骤5)制备F1代小鼠；

选择F0代小鼠基因型鉴定结果中的F0代阳性小鼠，使其与野生型小鼠进行交配，从而获得具有稳定基因型的F1代小鼠；

步骤6)F1代小鼠基因型及Southern blot鉴定；

对F1代小鼠进行F1代小鼠基因型鉴定，并给出相应鉴定结果，然后选择F1代小鼠基因型鉴定结果中的F1代阳性小鼠，即F1代阳性同源重组小鼠，提取其鼠尾DNA进行Southernblot检测及测序，从而筛选出发生正确重组的基因打靶小鼠，即获得Stap2基因点突变敲入模式小鼠。

5.根据权利要求4所述的Stap2基因点突变敲入模式小鼠的构建方法，其特征在于：步骤1)中，筛选sgRNA的方法为，根据所设计的sgRNA序列，分别构建相对应的Cas9/sgRNA质粒，然后分别对各个构建好的Cas9/sgRNA质粒进行活性检测，最后根据检测结果，选择其中活性和特异性最好的两个Cas9/sgRNA质粒对应的sgRNA。

6.根据权利要求5所述的Stap2基因点突变敲入模式小鼠的构建方法，其特征在于：步骤1)中，Cas9/sgRNA质粒的构建方法为，按照所设计的sgRNA的序列合成相应引物，通过GibsonAssembly的方式连入pCS-3G载体，连接产物转化后送样测序验证正确，从而完成Cas9/sgRNA质粒的构建。

7.根据权利要求4所述的Stap2基因点突变敲入模式小鼠的构建方法，其特征在于：步骤2)中，对打靶载体进行酶切鉴定和测序时所采用的酶分别为BamHI限制酶、SacI限制酶和EcoRV+HindIII限制酶。

8.根据权利要求4所述的Stap2基因点突变敲入模式小鼠的构建方法，其特征在于：在进行F0、F1代小鼠基因型进行鉴定时，所设计并采用的PCR引物均分别为Stap2-L-GT-F引物、Stap2-L-GT-R引物、Stap2-R-GT-F引物和Stap2-R-GT-R引物，其中，

所述Stap2-L-GT-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；

所述Stap2-L-GT-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；

所述Stap2-R-GT-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；

所述Stap2-R-GT-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。

9.根据权利要求8所述的Stap2基因点突变敲入模式小鼠的构建方法，其特征在于：在对F0、F1代小鼠鼠尾基因进行鉴定时，PCR反应条件依次为：

阶段1、94℃5min；

阶段2、98℃10sec，67℃30sec，68℃1kb/min，15cycles；

阶段3、98℃10sec，57℃30sec，68℃1kb/min，25cycles；

阶段4、68℃10min；

阶段5、4℃forever；

其中，在阶段2进行67℃30sec的反应时，其温度每循环一次降低0.7℃。

10.根据权利要求1所述的Stap2基因点突变敲入模式小鼠的构建方法，其特征在于：步骤6)中，在对F1代阳性小鼠鼠尾DNA进行Southern blot检测及测序时，Southern blot的筛选策略为利用ScaI限制酶和EcoNI限制酶作为Southern blot酶切位点，并同时利用3’Probe探针和A Probe探针验证F1代阳性小鼠，从而筛选出发生正确重组的基因打靶小鼠；其中，

3’Probe探针用于检测是否发生正确重组，若发生正确重组，则会出现野生型和突变型两个条带；A Probe探针用于检测是否含有随机插入，若没有随机插入，则会出现野生型和突变型两个条带。

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