CN116751781A - 蛋白酶体激活子3相互作用蛋白1基因去磷酸化定点突变小鼠模型的构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋白酶体激活子3相互作用蛋白1(Psme3ip1)基因去磷酸化定点突变小鼠模型的构建及应用。Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型的构建方法如下:1、确定Psme3ip1突变基因的特异性靶位点,并构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变敲入的打靶载体;2、设计sgRNA1序列并制备成质粒,通过体外转录的方式,获得Cas9mRNA和sgRNA 1;3、将Cas9mRNA、sgRNA1和打靶载体转染至显微注射入小鼠受精卵中,培育受精卵并进行传代鉴定,构建获得Psme3ip1基因去磷酸化定点突变敲入的小鼠动物模型。本发明首次公开了Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型的构建方法,在制备检测/治疗结肠癌药物中有很大的应用价值,为结肠癌药物的研发提供了动物模型。
Description
技术领域
本发明属于生命科学和生物技术领域,涉及一种蛋白酶体激活子3相互作用蛋白1(Psme3ip1)基因去磷酸化定点突变小鼠模型的构建及应用。
背景技术
蛋白酶体激活子3相互作用蛋白1(proteasome activator subunit3interactingprotein 1),又称FAM192A或者NIP30,位于人类染色体16q13,含有12个外显子,编码PSME3IP1蛋白。首次于2016年在骨骼肌中被报道,含有核定位序列。Psme3ip1基因位于小鼠的8号染色体上,Gene ID:102122。
目前,我国恶性肿瘤发病、死亡数持续上升,每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2200亿。结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤。据2022年中国癌症报告显示,结肠癌的发病率40.8/10万人,男性多于女性,城市高于农村;死亡率19.6/10万,男性多于女性,城市高于农村。随着人们生活水平的提高和生活方式改变,以及人口年龄结构的改变,结肠癌的发病率不断上升。约五分之三的结肠癌患者在初诊时已处于病程的中晚期,大大降低了治疗的机会。研究发现,早期患者治疗后,一旦发生复发转移,患者的生活质量和生存期大大降低。因此,深入探索结肠癌的发生发展机制,有助于优化结肠癌患者个体化精准治疗。
DSS/AOM诱导结肠癌小鼠模型对于探索结肠癌的发病机制和治疗有重要的意义。
CRISPR-Cas9技术在生物工程和生物医学方面有广泛的应用。可以快速建立基因突变的动物模型和细胞模型,用于探究遗传变异与疾病之间的关系。然而,在现有的基因敲入小鼠库中尚未发现有Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠及其与结肠癌相关的研究。通过体外转录的方式,获得Cas9mRNA和sgRNA构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型,为进一步研究Psme3ip1的功能奠定了良好的基础。
基于以上,本发明利用CRISPR/Cas9技术构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型,为结肠癌的研究以及药物研发及药效评价提供有效的实验动物模型。
发明内容
本发明的主要目的在于:利用CRISPR/Cas9技术构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型型的方法和应用,为结肠癌的研究以及药物研发及药效评价提供有效的实验动物模型。
本发明的目的通过以下技术手段得以实现:
本发明提供了一种用于构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型的特异性靶位点导向RNA,即sgRNA 1,所述sgRNA 1的核苷酸序列如下:
sgRNA 1:GGTGCCTTCACTGTCTGAACTGG(SEQ ID NO:1)。
本发明还提供了所述sgRNA 1在构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型中的应用。
本发明还提供了一种Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型的构建方法,其包括以下步骤:
步骤(1)将如上所述的sgRNA 1与Cas9质粒体外转录成mRNA,获得有活性的sgRNA
1和Cas9 mRNA;
步骤(2)构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变的打靶载体-T Easy-Psme3ip14A;
步骤(3)将有活性的sgRNA1和Cas9 mRNA以及-T Easy-Psme3ip14A注射入小鼠受精卵中;
步骤(4)再将受精卵移植到受体小鼠中孕育,构建获得Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型。
本发明首次通过CRISPR/Cas9技术构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型,设计了特异性位点切割的gRNA 1和同源重组修复的Donor DNA片段。本发明在CRISPR/Cas9技术构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型的过程中,需要克服的困难是gRNA的靶向性和Donor DNA片段的设计。对于定点突变小鼠,gRNA的设计可选择性不多,一般都在定点突变序列附近,所以设计较困难。此外,Donor DNA片段的设计不能太长或者太短,本发明设计了合适长度的Donor DNA片段。
在前述的Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型的构建方法中,sgRNA1、Cas9mRNA和打靶载体的用量根据实际操作常规选择。
步骤(2)中,构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变的打靶载体的步骤包括:
步骤(2-1)根据打靶策略设计引物,构建左边同源臂片段(LHAF)、右边同源臂片段(RHAF)和引入点突变的序列片段4A;
步骤(2-2)将LHAF、RHAF和4A通过搭桥PCR实验获得LHAF-4A-RHAF片段;
步骤(2-3)将LHAF-4A-RHAF片段克隆组装到-T Easy载体上,构建获得打靶载体/>-T Easy-Psme3ip14A;
步骤(2-4)通过菌落PCR鉴定和测序,确认打靶载体构建成功。
在前述的Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型的构建方法中,根据打靶策略设计引物,包括:
构建LHAF片段的引物序列如下:
LHAF-F:
GCTGTGTGCATCGGCATCCTCCCTGGCTTGGGCGCCTACTCTGGGAGCAGTGACT CCGAA(SEQ IDNO:2)
LHAF-R:
TTCGGAGTCACTGCTCCCAGAGTAGGCGCCCAAGCCAGGGAGGATGCCGATGCA CACAGC(SEQ IDNO:3)
构建RHAF片段的引物序列如下:
RHAF-F:
GAAGGCACCATCAATGCTACAGGGAAGATCGTCTCCTCCATCTTCCGAACCAAC ACCTT(SEQ IDNO:4)
RHAF-R:
AAGGTGTTGGTTCGGAAGATGGAGGAGACGATCTTCCCTGTAGCATTGATGGTG CCTTC(SEQ IDNO:5)
构建点突变的序列片段4A的引物序列如下
4A-F:
CAGTGACTCCGAAGCGGCCGCAGACGCTGAAGGCACCATCA(SEQ ID NO:6)
4A-R:
TGATGGTGCCTTCAGCGTCTGCGGCCGCTTCGGAGTCACTG(SEQ ID NO:7)搭桥PCR的引物序列如下:
搭桥PCR-F:GCTGTGTGCATCGGCAT(SEQ ID NO:8)
搭桥PCR-R:AGGTGTTGGTTCGG(SEQ ID NO:9)
步骤(2-1)中,LHAF、RHAF和4A片段的PCR反应体系分别为:
LHAF的PCR反应体系:
5μL正向引物LHAF-F
5μL反向引物LHAF-R
5μL 10xbuffer 2
35μL ddH2O
PCR反应条件为:95℃4分钟,缓慢降至室温。
RHAF的PCR反应体系:
5μL正向引物RHAF-F
5μL反向引物RHAF-R
5μL 10xbuffer 2
35μL ddH2O
PCR反应条件为:95℃4分钟,缓慢降至室温。
4A的PCR反应体系:
5μL正向引物4A-F
5μL反向引物4A-R
5μL 10xbuffer 2
35μL ddH2O
PCR反应条件为:95℃4分钟,缓慢降至室温。
步骤(2-2)中,LHAF、RHAF和4A塔桥PCR的反应体系为:
2μL LHAF-F
2μL 4A-R
2μL搭桥PCR-F
2μL搭桥PCR-R
25μL 2×PhantaMax Master Mix
1μL LHAF
1μL RHAF
1μL 4A
18μL ddH2O
PCR反应条件为:
预变性:95℃3分钟;
变性:95℃15秒,退火:56℃15秒,延伸:72℃30秒,共35个循环;
彻底延伸:72℃5分钟。
在前述的Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型的构建方法中,所述打靶策略为:将Psme3ip1基因第226、227、228和230这四个位点的氨基酸Ser突变为Ala,即S226A,相对应的碱基由TCC变成GCG;S227A,相对应的碱基由AGT变成GCC;S228A,相对应的碱基由TCA变成GCA,S230A,相对应的碱基由AGT变成GCT。
在前述的Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型的构建方法中,所述小鼠受精卵是通过小鼠促排卵并经过体外受精培育获得的。
在前述的Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型的构建方法中,将受精卵移植到受体小鼠中孕育具体步骤是指将显微注射后存活的受精卵移植到到母鼠体内并进行阳性小鼠传代,具体步骤包括:
步骤(4-1)将显微注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内,生出的子代小鼠即为F0代小鼠;
步骤(4-2)剪取F0代小鼠脚趾DNA,PCR扩增后进行测序鉴定,获得阳性F0代小鼠;
步骤(4-3)将阳性F0代小鼠与野生型交配获得F1代小鼠,并剪取子代小鼠,经PCR扩增后进行测序鉴定;
步骤(4-4)将F1代阳性小鼠杂交获得F2代小鼠;
步骤(4-5)剪取F2代小鼠脚趾,PCR扩增获得产物,纯化产物,接着将PCR产物酶切,酶切后有2条带的为Psme3ip1基因去磷酸化定点突变阳性小鼠。
在前述的Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型的构建方法中,获得F0代小鼠、F1代或者F2代小鼠脚趾DNA PCR扩增产物的引物序列包括:
Psme3ip1-4A-F:TGGGAATGGCCCTTCAGCATT(SEQ ID NO:10);
Psme3ip1-4A-R:ATCAATGGGACAGGTTTGGTCATCT(SEQ ID NO:11);
在前述的Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型的构建方法中,野生型(Wild type)C57BL/6小鼠小鼠酶切后序列大小为:489bp;Psme3ip14A/-杂合子小鼠基因型鉴定的PCR产物酶切后序列大小为:489bp、192bp和297bp;Psme3ip1基因去磷酸化定点突变Psme3ip14A/4A小鼠基因型鉴定的PCR产物酶切后序列大小为:192bp和297bp。
本发明还提供了由所述方法构建得到的Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型。
本发明还提供了所述Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型在作为筛查防治结肠癌药物和/或研究临床结肠癌发生发展病程的动物模型中的应用。
本发明的有益效果在于:本发明方法构建获得的Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型,经DSS/AOM诱导后,更易发生结肠癌,肿瘤的数量和体积更大,能模拟结肠癌发生发展病程,可以单独研究该基因缺陷在结肠癌发病机制中的作用,为防治结肠癌提供一个新的思路。
附图说明
图1为Psme3ip1基因去磷酸化定点突变设计策略示意图。
图2为Psme3ip1基因去磷酸化定点突变前后序列和gRNA切割位点。
图3为Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠F1代鉴定PCR产物测序结果。
图4为突变后的氨基酸序列。
图5为Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠F2代基因型PCR产物和酶切鉴定结果。
图6为对照和Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠纯合子肠道WB结果。
图7为AOM/DSS诱导结肠肿瘤模型示意图。
图8为对照和Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠纯合子经AOM/DSS诱导的结肠肿瘤代表图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清晰、完整地描述。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1:
本实施例提供一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术建立Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型的方法,具体步骤如下:
1、敲入的Psme3ip1基因的基本信息如下:
A敲入基因名称(Gene ID号):Psme3ip1(102122)
B敲入针对的exon:exon 8
野生型鼠Psme3ip1基因核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。其中,该序列第102-104位为起始密码子,第864-866位为终止密码子。
野生型Psme3ip1基因氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
2、Cas9/sgRNA的设计与构建:
Psme3ip1基因去磷酸化定点突变设计策略示意图,如图1所示。
A打靶策略具体为:根据人PSME3IP1基因上的点突变对应找到小鼠的同源点突变,将小鼠Psme3ip1基因的第226、227、228和230这四个位点的氨基酸Ser突变为Ala。
B Psme3ip1基因去磷酸化定点突变的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。其中,该序列该序列第102-104位为起始密码子,第864-866位为终止密码子。序列中编码氨基酸的S226A,相对应的碱基由TCC变成GCG;S227A,相对应的碱基由AGT变成GCC;S228A,相对应的碱基由TCA变成GCA,S230A,相对应的碱基由AGT变成GCT。
C Psme3ip1基因去磷酸化定点突变的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。其中,SEQID NO:13氨基酸序列中的第226、227、228和230位的S突变为A,即为该SEQ ID NO:15序列。
D sgRNA设计在exon8上,其序列如SEQ ID NO:1所示。
3、打靶载体的构建
A根据图1Psme3ip1基因去磷酸化定点突变的设计策略示意图,构建左边同源臂片段(LHAF)、右边同源臂片段(RHAF)和引入点突变的序列片段4A;
构建LHAF片段的引物序列如下:
LHAF-F:
GCTGTGTGCATCGGCATCCTCCCTGGCTTGGGCGCCTACTCTGGGAGCAGTGACT CCGAA(SEQ IDNO:2)
LHAF-R:
TTCGGAGTCACTGCTCCCAGAGTAGGCGCCCAAGCCAGGGAGGATGCCGATGCA CACAGC(SEQ IDNO:3)
构建RHAF片段的因为序列如下:
RHAF-F:
GAAGGCACCATCAATGCTACAGGGAAGATCGTCTCCTCCATCTTCCGAACCAAC ACCTT(SEQ IDNO:4)
RHAF-R:
AAGGTGTTGGTTCGGAAGATGGAGGAGACGATCTTCCCTGTAGCATTGATGGTG CCTTC(SEQ IDNO:5)
构建点突变的序列片段4A的引物序列如下:
4A-F:
CAGTGACTCCGAAGCGGCCGCAGACGCTGAAGGCACCATCA(SEQ ID NO:6)
4A-R:
TGATGGTGCCTTCAGCGTCTGCGGCCGCTTCGGAGTCACTG(SEQ ID NO:7)
PCR反应体系为:
LHAF的PCR反应体系:
5μL正向引物LHAF-F
5μL反向引物LHAF-R
5μL 10xbuffer 2
35μL ddH2O
PCR反应条件为:95℃4分钟,缓慢降至室温。
RHAF的PCR反应体系:
5μL正向引物RHAF-F
5μL反向引物RHAF-R
5μL 10xbuffer 2
35μL ddH2O
PCR反应条件为:95℃4分钟,缓慢降至室温。
4A的PCR反应体系:
5μL正向引物4A-F
5μL反向引物4A-R
5μL 10xbuffer 2
35μL ddH2O
PCR反应条件为:95℃4分钟,缓慢降至室温。步骤(2-2)中,LHAF、RHAF和4A塔桥PCR的反应体系为:
2μL LHAF-F
2μL 4A-R
2μL搭桥PCR-F
2μL搭桥PCR-R25μL 2×Phanta Max Master Mix
1μL LHAF
1μL RHAF
1μL 4A
18μL ddH2O
PCR反应条件为:
预变性:95℃3分钟;
变性:95℃15秒,退火:56℃15秒,延伸:72℃30秒,共35个循环;
彻底延伸:72℃5分钟。
C将LHAF-4A-RHAF片段克隆组装到-T Easy载体上,构建获得打靶载体-T Easy-Psme3ip14A;
D通过菌落PCR鉴定和测序,确认打靶载体构建成功。
4、Psme3ip1基因去磷酸化定点突变的小鼠动物模型构建过程
A准备显微注射混合液:将Cas9 mRNA、打靶载体、sgRNA1按照200ng/μL、200ng/μL、200ng/μL混合,加无RNA酶的水补至40μL;
B显微注射采用Narishige NT-88-V3显微操作系统,具体操作步骤见说明书。用吸卵针吸取受精卵于M2培养基中,并区分可用和不可用受精卵。将固定针、注射针固定于显微操作操作仪的机械臂上,使用固定针固定一个受精卵,将注射针扎入细胞质或者原核部位,将注射后的受精卵进行体外培养,筛选存活的受精卵用作后续实验。
C胚胎移植:根据常规操作将受精卵移植到受体雌鼠,缝合后放入准备好的鼠盒内,进行常规喂养。移植后的小鼠预计20天后出生F0代。
5、Psme3ip1基因去磷酸化定点突变的小鼠繁育路线及其基因型鉴定
A剪取上述F0代小鼠脚趾DNA,PCR扩增后进行测序鉴定,获得阳性F0代小鼠;
B将阳性F0代小鼠与野生型交配获得F1代小鼠,并剪取子代小鼠,经PCR扩增后进行测序鉴定;
C将F1代阳性小鼠杂交获得F2代小鼠;
D剪取F2代小鼠脚趾,PCR扩增获得产物,纯化产物,接着将PCR产物酶切,野生型(Wild type)C57BL/6小鼠小鼠酶切后序列大小为:489bp;Psme3ip14A/-杂合子小鼠基因型鉴定的PCR产物酶切后序列大小为:489bp、192bp和297bp;Psme3ip1基因去磷酸化定点突变Psme3ip14A/4A小鼠基因型鉴定的PCR产物酶切后序列大小为:192bp和297bp。
F0代小鼠、F1代或者F2代小鼠脚趾DNA PCR扩增产物的引物序列包括:
Psme3ip1-4A-F:TGGGAATGGCCCTTCAGCATT(SEQ ID NO:10);
Psme3ip1-4A-R:ATCAATGGGACAGGTTTGGTCATCT(SEQ ID NO:11);
实施例2:
提取结肠组织的全蛋白通过Western Blot实验分析Psme3ip1的功能
1、全蛋白提取具体步骤为:
A取小鼠结肠组织:将野生型小鼠和本发明实施例1培育的Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型分别安乐死,解剖取出小鼠结肠组织;
B将取的结肠组织剪碎,放入已加好组织裂解液的组织裂解管中,于组织破碎仪上破碎3分钟,然后冰浴30分钟;
C 12000转,4℃离心15分钟,并将上清转移至新的预冷EP管中,采用BCA法测定蛋白浓度。
D加入适量的上样缓冲液,100℃10分钟,50μL/管分装,-80℃保存。
2、Western Blot具体步骤为:
A安装跑胶装置,10μL/孔上样;
B先低压跑,再高压跑,当指示剂溴酚兰至底部时,终止电泳;
C转膜,100V,60分钟;
D封闭,5%牛奶,60分钟;
E孵育一抗(REGγ、p21、Psme3ip1和β-Actin),4℃,过夜;
F孵育二抗,4℃,1小时;
G用Odessy机器扫膜,数据处理。
野生型小鼠和Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠结肠组织的Western Blot结果如图6所示,说明本发明实施例1培育的Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型结肠组织中p21的蛋白水平显著下调,说明Psme3ip1基因去磷酸化通过影响REGγ的功能,进而影响其底物蛋白的稳定性。
实施例3:
构建小鼠结肠癌模型,分析Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型与野生型的结肠癌表型的差别(图7和图8)。
1、准备小鼠
将Psme3ip1基因去磷酸化定点突变杂合子Psme3ip14A/-小鼠自交,获得足够多同窝的野生型小鼠和Psme3ip14A/4A小鼠。
2、AOM诱导
A当小鼠6周龄,腹腔注射偶氮甲烷AOM(10mg/kg);
3、DSS诱导
A常规水喂食1周;
B 2.5%DSS饮用水喂食1周;
C常规水喂食2周;
D 2.5%DSS饮用水喂食1周;
E常规水喂食2周;
F 2.5%DSS饮用水喂食1周;
G常规水喂食2周。
3、结肠癌表型分析
A小鼠安乐死;
B解剖小鼠取出完整结肠并拍照和分析表型;
C组织-80℃冻存,为后续结肠癌发生发展的研究提供材料。
由图5-8的结果可以看出,根据本发明的方法成功构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型,且Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠更易被AOM/DSS诱发结肠癌,为结肠癌发生发展相关研究提供新的研究方向。
SEQ ID NO:12
GATTGGACTATGCCGCCGGAAGCGGGGTGGAAATGTGTTGTGGCTGTAAGGAACAG
GAAGCCCCGAAGGGTCAAAAGGAATACAATAGCGAAGTGTGTTTTCTTCCTTTAAGC
CGTCGTTCTTTTCTTGGTTTCTTTTCTAGTTTTTTAAGAGCGAGAGTGGCCTTGGCGGC
GACGGTTTACGGTAGGCGCCGCGGAGGTGAGGGCGGCTCGCCTCCCGCGCTCTCGTA
GATCTGCCACCTCCCTCCTTCATAGACGGGACTTGACTGCTAAAGCGCCTTGAGTACC
TGAGAGTCTCCATTAGAATCTGCTTTGGAAGCAAGAACAGACTGTACCATTATGGAT
GGAGAGGACGATAGTAACCTTGTCATCAAAAAGAGGTTTGTGTCTGAGGCAGAGCTA
GATGAGCGGCGCAAAAGGAGGCAAGAAGAATGGGAGAAAGTGCGAAAACCAGAAG
ACCCAAAAGAATGTCCAGAGGAGGCGTATGACCCTCGGTCTCTGTACGAACGGCTGC
AGGAACAGAAAGACAGGAAGCAGCAGGAGTATGAGGAGCAATTCAAATTCAAAAA
CATGGTAAGAGGGTTAGACGAAGATGAGACCAACTTCCTTGATGAGGTTTCTCGGCA
GCAGGAGCTGATAGAGAAGCAGCGGCGAGAAGAAGAACTAGAGGAACTGAAGGAG
TACAGAAGTAATCTCAACAAGGTTGGAATTTCTGCAGAAAATAAAGAAGTAGAGAA
GAAGCTGGCCGTGAAACCCATAGAAACCAAGAACAAGTTCTCCCAGGCAAAGCTGT
TGGCAGGAGCTGTGAAACATAAGAGCTCAGAGAGTGGCAATAGTGTGAAGAGACTG
AAACCAGACCCCGACCCAGATGACAAGGCTCAAGAGGCCCCGTCCTGCATGTCTCTT
GGAAGCTCTTCTCTGAGCGGACCTCCCTCCATCCACTGCCCGTCGGCTGCTGTGTGCA
TCGGCATCCTCCCTGGCTTGGGCGCCTACTCTGGGAGCAGTGACTCCGAATCCAGTTC
AGACAGTGAAGGCACCATCAATGCTACAGGGAAGATCGTCTCCTCCATCTTCCGAAC
CAACACCTTCCTCGAGGCACCCTAGCTCCTGATATTACCACAGGGAGCATCTCAGAG
GGTTGGATGCCAGTTCTGCCTCGGCATCACCTCCCTCAGAAAACTTACTCACCTGCTT
CCTGTGCACATGTGACATTTTAACCTAACTCAGAAATGTGTCTCAGTCCACTTGTGGC
TCAAACTCGGCTTGATTTCTCTTTATACTCCTGTGCAGATGACCAAACCTGTCCCATT
GATATGAGGAGTCGGGGTTCAGGCTTGTCTCAGAAATGTCACGGACAGTGCAAGGAC
AGGCAGCAGCTGGCCTGCCAGGGTTTGGTGTACCTTGTTGCTGTCTTGTTTATCTCCT
TACCTAGCAGCACAGGAAGCAAGGGCAGCGTTAGCTTCATATGTTGTTGTAGATGAA
TGGGTTTCTTGGTTCTACCATGTTGTGTGTGGGCATAGAGAAAGGGGCTGACCAGCT
GGTGACATGGAGCTGTCCCCTAGAACTAACCCTTCCTGGGTGTTGTGTGACTTAAGTA
AAAATCTCAAGCCTCACCCACAAGGCTGTGAGCCAACGACAGCCCTTGAGCAGAGA
CTCTTCCATGTCCTCCCCTCTCCATCCAGCCTGAGGAGGTAGGAAGGAGCTGACCAC
GAGAACATGACCATCCTCTGCCCACCTTCTCTCTCTGAAAAAATGTTTTGATTTTGTT
TTTGAAATAAAAGATTTAGTTTAAGATTCTAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:13
MDGEDDSNLVIKKRFVSEAELDERRKRRQEEWEKVRKPEDPKECPEEAYDPRSLYERLQ
EQKDRKQQEYEEQFKFKNMVRGLDEDETNFLDEVSRQQELIEKQRREEELEELKEYRSN
LNKVGISAENKEVEKKLAVKPIETKNKFSQAKLLAGAVKHKSSESGNSVKRLKPDPDPD
DKAQEAPSCMSLGSSSLSGPPSIHCPSAAVCIGILPGLGAYSGSSDSESSSDSEGTINATGKI
VSSIFRTNTFLEAP
SEQ ID NO:14
GATTGGACTATGCCGCCGGAAGCGGGGTGGAAATGTGTTGTGGCTGTAAGGAACAG
GAAGCCCCGAAGGGTCAAAAGGAATACAATAGCGAAGTGTGTTTTCTTCCTTTAAGC
CGTCGTTCTTTTCTTGGTTTCTTTTCTAGTTTTTTAAGAGCGAGAGTGGCCTTGGCGGC
GACGGTTTACGGTAGGCGCCGCGGAGGTGAGGGCGGCTCGCCTCCCGCGCTCTCGTA
GATCTGCCACCTCCCTCCTTCATAGACGGGACTTGACTGCTAAAGCGCCTTGAGTACC
TGAGAGTCTCCATTAGAATCTGCTTTGGAAGCAAGAACAGACTGTACCATTATGGAT
GGAGAGGACGATAGTAACCTTGTCATCAAAAAGAGGTTTGTGTCTGAGGCAGAGCTA
GATGAGCGGCGCAAAAGGAGGCAAGAAGAATGGGAGAAAGTGCGAAAACCAGAAG
ACCCAAAAGAATGTCCAGAGGAGGCGTATGACCCTCGGTCTCTGTACGAACGGCTGC
AGGAACAGAAAGACAGGAAGCAGCAGGAGTATGAGGAGCAATTCAAATTCAAAAA
CATGGTAAGAGGGTTAGACGAAGATGAGACCAACTTCCTTGATGAGGTTTCTCGGCA
GCAGGAGCTGATAGAGAAGCAGCGGCGAGAAGAAGAACTAGAGGAACTGAAGGAG
TACAGAAGTAATCTCAACAAGGTTGGAATTTCTGCAGAAAATAAAGAAGTAGAGAA
GAAGCTGGCCGTGAAACCCATAGAAACCAAGAACAAGTTCTCCCAGGCAAAGCTGT
TGGCAGGAGCTGTGAAACATAAGAGCTCAGAGAGTGGCAATAGTGTGAAGAGACTG
AAACCAGACCCCGACCCAGATGACAAGGCTCAAGAGGCCCCGTCCTGCATGTCTCTT
GGAAGCTCTTCTCTGAGCGGACCTCCCTCCATCCACTGCCCGTCGGCTGCTGTGTGCA
TCGGCATCCTCCCTGGCTTGGGCGCCTACTCTGGGAGCAGTGACTCCGAAGCGGCCG
CAGACGCTGAAGGCACCATCAATGCTACAGGGAAGATCGTCTCCTCCATCTTCCGAA
CCAACACCTTCCTCGAGGCACCCTAGCTCCTGATATTACCACAGGGAGCATCTCAGA
GGGTTGGATGCCAGTTCTGCCTCGGCATCACCTCCCTCAGAAAACTTACTCACCTGCT
TCCTGTGCACATGTGACATTTTAACCTAACTCAGAAATGTGTCTCAGTCCACTTGTGG
CTCAAACTCGGCTTGATTTCTCTTTATACTCCTGTGCAGATGACCAAACCTGTCCCAT
TGATATGAGGAGTCGGGGTTCAGGCTTGTCTCAGAAATGTCACGGACAGTGCAAGGA
CAGGCAGCAGCTGGCCTGCCAGGGTTTGGTGTACCTTGTTGCTGTCTTGTTTATCTCC
TTACCTAGCAGCACAGGAAGCAAGGGCAGCGTTAGCTTCATATGTTGTTGTAGATGA
ATGGGTTTCTTGGTTCTACCATGTTGTGTGTGGGCATAGAGAAAGGGGCTGACCAGC
TGGTGACATGGAGCTGTCCCCTAGAACTAACCCTTCCTGGGTGTTGTGTGACTTAAGT
AAAAATCTCAAGCCTCACCCACAAGGCTGTGAGCCAACGACAGCCCTTGAGCAGAG
ACTCTTCCATGTCCTCCCCTCTCCATCCAGCCTGAGGAGGTAGGAAGGAGCTGACCA
CGAGAACATGACCATCCTCTGCCCACCTTCTCTCTCTGAAAAAATGTTTTGATTTTGT
TTTTGAAATAAAAGATTTAGTTTAAGATTCTAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:15
MDGEDDSNLVIKKRFVSEAELDERRKRRQEEWEKVRKPEDPKECPEEAYDPRSLYERLQ
EQKDRKQQEYEEQFKFKNMVRGLDEDETNFLDEVSRQQELIEKQRREEELEELKEYRSN
LNKVGISAENKEVEKKLAVKPIETKNKFSQAKLLAGAVKHKSSESGNSVKRLKPDPDPD
DKAQEAPSCMSLGSSSLSGPPSIHCPSAAVCIGILPGLGAYSGSSDSEAAADAEGTINATG
KIVSSIFRTNTFLEAP
SEQ ID NO:16
GCTGTGTGCATCGGCATCCTCCCTGGCTTGGGCGCCTACTCTGGGAGCAGTGACTCCG
AAGCGGCCGCAGACGCTGAAGGCACCATCAATGCTACAGGGAAGATCGTCTCCTCCA
TCTTCCGAACCAACACCTTC
Claims (12)
1.一种用于构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型的特异性靶位点导向RNA,即sgRNA 1,其特征在于,所述sgRNA 1的核苷酸序列如下:
sgRNA 1:GGTGCCTTCACTGTCTGAACTGG(SEQ ID NO:1)。
2.根据权利要求1所述的sgRNA 1在构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型中的应用。
3.一种Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型的构建方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
步骤(1)将权利要求1所述sgRNA 1与Cas9质粒体外转录成mRNA,获得有活性的sgRNA 1和Cas9 mRNA;
步骤(2)构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变的打靶载体-T Easy-Psme3ip14A;
步骤(3)将有活性的sgRNA1和Cas9 mRNA以及-T Easy-Psme3ip14A注射入小鼠受精卵中;
步骤(4)再将受精卵移植到受体小鼠中孕育,构建获得Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型。
4.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,步骤(2)中,所述构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变的打靶载体的步骤包括:
步骤(2-1)根据打靶策略设计引物,构建左边同源臂片段LHAF、右边同源臂片段RHAF和引入点突变的序列片段4A;
步骤(2-2)将LHAF、RHAF和4A通过搭桥PCR实验获得LHAF-4A-RHAF片段;
步骤(2-3)将LHAF-4A-RHAF片段克隆组装到-T Easy载体上,构建获得打靶载体-T Easy-Psme3ip14A;
步骤(2-4)通过菌落PCR鉴定和测序,确认打靶载体构建成功。
5.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,步骤(2-1)中,所述根据打靶策略设计引物,包括:
构建LHAF片段的引物序列如下:
LHAF-F:
GCTGTGTGCATCGGCATCCTCCCTGGCTTGGGCGCCTACTCTGGGAGCAGTGACT CCGAA(SEQ ID NO:2)
LHAF-R:
TTCGGAGTCACTGCTCCCAGAGTAGGCGCCCAAGCCAGGGAGGATGCCGATGCA CACAGC(SEQ ID NO:3)
构建RHAF片段的因为引物如下:
RHAF-F:
GAAGGCACCATCAATGCTACAGGGAAGATCGTCTCCTCCATCTTCCGAACCAAC ACCTT(SEQ ID NO:4)
RHAF-R:
AAGGTGTTGGTTCGGAAGATGGAGGAGACGATCTTCCCTGTAGCATTGATGGTG CCTTC(SEQ ID NO:5)
构建点突变的序列片段4A的引物序列如下
4A-F:
CAGTGACTCCGAAGCGGCCGCAGACGCTGAAGGCACCATCA(SEQ ID NO:6)
4A-R:
TGATGGTGCCTTCAGCGTCTGCGGCCGCTTCGGAGTCACTG(SEQ ID NO:7)搭桥PCR的引物序列如下:
搭桥PCR-F:GCTGTGTGCATCGGCAT(SEQ ID NO:8)
搭桥PCR-R:AGGTGTTGGTTCGG(SEQ ID NO:9)。
6.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,所述步骤步骤(2-1)中所述PCR反应体系为:
LHAF的PCR反应体系:
5μL正向引物LHAF-F
5μL反向引物LHAF-R
5μL 10xbuffer 2
35μL ddH2O
PCR反应条件为:95℃4分钟,缓慢降至室温;
RHAF的PCR反应体系:
5μL正向引物RHAF-F
5μL反向引物RHAF-R
5μL 10xbuffer 2
35μL ddH2O
PCR反应条件为:95℃4分钟,缓慢降至室温;
4A的PCR反应体系:
5μL正向引物4A-F
5μL反向引物4A-R
5μL 10xbuffer 2
35μL ddH2O
PCR反应条件为:95℃4分钟,缓慢降至室温;
和/或,
所述步骤步骤(2-2)中所述PCR反应体系为:
2μL LHAF-F
2μL 4A-R
2μL搭桥PCR-F
2μL搭桥PCR-R
25μL 2×PhantaMax Master Mix
1μL LHAF
1μL RHAF
1μL 4A
18μL ddH2O
PCR反应条件为:
预变性:95℃3分钟;
变性:95℃15秒,退火:56℃15秒,延伸:72℃30秒,共35个循环;
彻底延伸:72℃5分钟。
7.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,步骤(2-1)中,所述打靶策略为:将Psme3ip1基因第226、227、228和230这四个位点的氨基酸Ser突变为Ala,即S226A,相对应的碱基由TCC变成GCG;S227A,相对应的碱基由AGT变成GCC;S228A,相对应的碱基由TCA变成GCA,S230A,相对应的碱基由AGT变成GCT。
8.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,步骤(3)中,所述小鼠受精卵是通过小鼠促排卵并经过体外受精培育获得的。
9.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,步骤(4)中,将受精卵移植到受体小鼠中孕育具体步骤是指将显微注射后存活的受精卵移植到到母鼠体内并进行阳性小鼠传代,具体步骤包括:
步骤(4-1)将显微注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内,生出的子代小鼠即为F0代小鼠;
步骤(4-2)剪取F0代小鼠脚趾DNA,PCR扩增后进行测序鉴定,获得阳性F0代小鼠;
步骤(4-3)将阳性F0代小鼠与野生型交配获得F1代小鼠,并剪取子代小鼠,经PCR扩增后进行测序鉴定;
步骤(4-4)将F1代阳性小鼠杂交获得F2代小鼠;
步骤(4-5)剪取F2代小鼠脚趾,PCR扩增获得产物,纯化产物,接着将PCR产物酶切,酶切后有2条带的为Psme3ip1基因去磷酸化定点突变阳性小鼠。
10.根据权利要求9所述的构建方法,其特征在于,获得F0代小鼠、F1代或者F2代小鼠脚趾DNA PCR扩增产物的引物序列包括:
Psme3ip1-4A-F:TGGGAATGGCCCTTCAGCATT(SEQ ID NO:10);
Psme3ip1-4A-R:ATCAATGGGACAGGTTTGGTCATCT(SEQ ID NO:11)。
11.根据权利要求9所述的构建方法,其特征在于,野生型C57BL/6小鼠小鼠基因型鉴定的PCR产物酶切后序列大小为:489bp;
Psme3ip14A/-杂合子小鼠基因型鉴定的PCR产物酶切后序列大小为:489bp、192bp和297bp;
Psme3ip1基因去磷酸化定点突变Psme3ip14A/4A小鼠基因型鉴定的PCR产物酶切后序列大小为:192bp和297bp。
12.根据权利要求3~11之任一项所述构建方法构建得到的Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠动物模型在作为筛查防治结肠癌药物和/或研究临床结肠癌发生发展病程的动物模型中的应用。
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