CN115843747A - 一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法 - Google Patents
一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115843747A CN115843747A CN202211536289.XA CN202211536289A CN115843747A CN 115843747 A CN115843747 A CN 115843747A CN 202211536289 A CN202211536289 A CN 202211536289A CN 115843747 A CN115843747 A CN 115843747A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mouse
- lama3
- point mutation
- gene
- generation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 67
- 101100127666 Mus musculus Lama3 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims abstract description 57
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims abstract description 37
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 9
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 claims description 15
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 14
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 11
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims description 8
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 claims description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 claims description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 5
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims description 5
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 abstract description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 abstract description 4
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 abstract description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 abstract description 3
- 208000025309 Hair disease Diseases 0.000 abstract 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 abstract 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 16
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 210000001732 sebaceous gland Anatomy 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 230000031774 hair cycle Effects 0.000 description 4
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 4
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 4
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 3
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 208000004631 alopecia areata Diseases 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000023643 hair follicle morphogenesis Effects 0.000 description 2
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 2
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 2
- 108010038862 laminin 10 Proteins 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 206010014989 Epidermolysis bullosa Diseases 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002951 depilatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000003699 hair surface Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 108010028309 kalinin Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000006128 skin development Effects 0.000 description 1
- 230000008491 skin homeostasis Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法，并初步分析了Lama3基因点突变对毛发生长的影响。该构建方法包括如下步骤：(1)靶点构建：寻找Lama3基因的CDS区，明确外显子部分，确定基因突变位点；(2)获取受精卵，在体外通过显微注射技术将Cas9mRNA和gRNA以及合成的donor oligo一同注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代杂合小鼠；(3)将F0代杂合小鼠自交后得到F1代小鼠；(4)F1代小鼠经测序确认获得纯合子点突变小鼠，表明模型构建成功；(5)表型分析显示Lama3基因点突变小鼠出生后第80天出现区域性脱毛。该突变小鼠模型可用于人类毛发异常疾病的药物及治疗方法的研究，为探求疾病治疗方法具有重要的实际意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种Lama3基因点突变的小鼠模型，具体涉及一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法，属于动物模型领域。
背景技术
层粘连蛋白(Laminin,LN)又称板层素，是基底膜的主要组成成分，存在于各种动物的胚胎及成体组织的各种基膜中，包括Laminin-511、Laminin-332、Laminin-211三种亚型。现有研究表明，Laminin-511的缺失将导致毛乳头发育缺陷，干扰初级纤毛的形成和毛发的发育。
基底膜介导的表皮和真皮间的分子信号是皮肤发育和毛发动态平衡的主要驱动力，Lama3基因编码Laminin-322的α亚基，其无义突变是引起表皮大泡性松解的主要原因。然而，Lama3基因在毛囊形态发生和毛发周期转换中发挥的功能仍待进一步阐明。Lama3基因可作为毛发异常相关疾病模型小鼠的理论基础。
发明内容
基于现有技术的状况，本发明目的在于提供一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法，在毛发异常相关疾病的治疗手段及其治疗药物研发方面具有重要意义。本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种Lama3基因点突变的小鼠模型，所述小鼠模型的突变位点为小鼠第18号染色体的Lama3基因第4外显子第854位碱基由C突变为T，蛋白质第217位氨基酸从R突变为C，由精氨酸变为半胱氨酸。
进一步地，所述小鼠模型为Lama3基因点突变纯合子F1代小鼠。
本发明还保护一种Lama3基因点突变小鼠模型的构建方法，主要步骤如下：
(1)靶点选择：寻找Lama3基因的CDS区，明确外显子部分，确定基因突变位点，并对第4号外显子E4进行基因替换，
野生型等位基因序列信息如下：
GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTCTGTGTCACGGAGTATTCCCGTATCGTGCCTCTGGAAAATGGCGAGGTAATCAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG，
其中野生型等位基因序列中第4号外显子E4碱基序列为：TCCCGTATCGTGCCTCTGGAAAAT，下划线部分的碱基为突变位点；
(2)设计能够特异性识别Lama3基因的gRNA，制备gRNA与Cas9mRNA的混合物，即Cas9混样体系，
所述gRNA的DNA序列为：
gRNA：5’-ATTACCTCGCCATTTTCCAGAGG-3’；
(3)利用In-Fusion克隆技术构建载体donor oligo，所述donor oligo的DNA序列为，
GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTCTGTGTCACGGAGTATAGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAATGGCGAGGTAATCAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG；
(4)F0代小鼠构建：包括小鼠的超排、受精卵注射及移植、F0代小鼠获得，具体如下，
A.选取实验对象：挑选挑选5-6周龄，体重为18-22g的C57BL/6J小鼠6只；
B.获取受精卵：先腹腔注射孕马血清促性腺激素PSMG，48h后注射人绒毛膜促性腺激素hCG，其中孕马血清促性腺激素PSMG以及人绒毛膜促性腺激素hCG的注射量各为5IU/只，14h后取卵，然后体外受精获得受精卵，将5μLCas9混样体系以及donor oligo混合注射到受精卵中，诱导受精卵的染色体基因进行突变；
突变型等位基因序列信息如下：
GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTCTGTGTCACGGAGTATAGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAATGGCGAGGTAATCAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG，其中突变后的第4号外显子E4碱基序列为：AGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAAT，下划线部分的碱基为突变位点；
C.受精卵移植：注射完成后，将受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，一笼两只饲养，受精卵发育并顺利被生产出，获得F0代小鼠；
(5)F0代小鼠的鉴定与繁育：将出生的F0代小鼠剪尾提取DNA进行PCR和测序鉴定，获得的F0代Lama3基因点突变杂合子小鼠自交后获得后代，对F0代突变杂合子小鼠的后代剪尾提取DNA进行鉴定，获得Lama3基因点突变纯合子F1代小鼠；
(6)F1代小鼠经测序确认筛选获得阳性纯合子，表明模型构建成功。
进一步地，所述突变位点为小鼠第18号染色体的Lama3基因第4外显子第854位碱基由C突变为T，突变导致蛋白质第217位氨基酸由精氨酸变为半胱氨酸，是一个未报道的SNP位点。
进一步地，所述Cas9混样体系来源于ThermoFisher，所述Cas9混样体系中包含1μg/μL的gRNA、3μg/μL的Cas9 mRNA和DEPC水，所述donor oligo购自苏州赛业生物科技有限公司。
进一步地，所述孕马血清促性腺激素PSMG以及人绒毛膜促性腺激素hCG均来源于北京索莱宝科技有限公司，Solarbio Life Science。
进一步地，所述F0/F1代小鼠剪尾提取DNA进行PCR所需的引物如下：
Lama3-F：5’-TGCTTACTTGAGACATGAAGAG-3’，
Lama3-R：5’-GTCCTGGATAGAGCTACTTGAG-3’，
PCR体系为：Tap DNA聚合酶12.5μL，10μM的上游引物1.0μL，10μM的下游引物1.0μL，鼠尾基因组DNA 1.5μL，ddH2O 9.0μL，总体系25μL。
8.根据权利要求3所述的一种Lama3基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述F0/F1代小鼠的测序鉴定引物为，5’-TTGTCCTAAGCCTTCACCTAG-3。
本发明还保护一种Lama3基因点R217C突变小鼠模型的表型验证，包括Lama3基因点突变小鼠毛发表型观察和Lama3基因点突变小鼠皮肤切片病理结构观察。
进一步地，所述Lama3基因点突变小鼠为Lama3点突变纯合子F1代小鼠。
有益效果
本发明公开的一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法，提供的小鼠模型是对毛发异常相关疾病发病机制研究的一个良好补充，模型制作简单，重复性好，制作成本低廉；其中Lama3基因点突变小鼠模型可用于毛发异常相关疾病的治疗手段及其治疗药物研发方面中的应用，可以在国内外推广应用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1A为采用CRISP-Cas9技术构建Lama3点突变小鼠示意图；
图1B为PCR鉴定F0代小鼠基因型的电泳和测序图；
图1C为鉴定F1代小鼠基因型的测序峰谱图；
图2A为F1代Lama3点突变纯合子小鼠出生后第80天、第85天和第150天的皮肤表型图，图中箭头标注的是脱毛区域；
图2B为F1代Lama3点突变纯合子小鼠和野生型对照小鼠第150天的皮肤切片染色结果示意图，图中箭头标注的是皮脂腺，矩形框标注的是毛囊结构。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验对象所选用的C57BL/6J小鼠购自长生生物技术股份有限公司，整个实验过程在吉林大学实验动物中心屏障设施饲养并开展实验(SYXK(吉)2021-0006)，整个过程在吉林大学动物伦理福利委员会监督下进行，遵守吉林大学及国家对于实验动物伦理福利的要求，饲养条件严格依照GB14925进行，实验动物自由饮水采食。
实施例一Lama3基因点突变小鼠模型的构建方法，主要包括以下步骤：
(1)靶点构建：寻找Lama3基因的CDS区，明确外显子部分，确定基因突变位点；
(2)获取受精卵，在体外通过显微注射技术将Cas9 mRNA和gRNA以及合成的donoroligo一同注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代杂合小鼠；
(3)将F0代杂合小鼠自交后得到F1代小鼠；
(4)F1代小鼠经测序确认筛选获得阳性纯合子，表明模型构建成功。
具体步骤如下：
(1)靶点构建
A.确定突变位点
如图1A构建策略图所示，寻找Lama3基因的CDS区，明确外显子部分，确定基因突变位点，并对第4号外显子E4进行基因替换，
野生型等位基因序列信息如下：
GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTCTGTGTCACGGAGTATTCCCGTATCGTGCCTCTG↑GAAAATGGCGAGGTAATCAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG，
其中野生型等位基因序列中第4号外显子E4碱基序列为：TCCCGTATCGTGCCTCTG↑GAAAAT，下划线部分的碱基为突变位点，箭头处表示野生型等位基因的被剪接位点；
B.设计能够特异性识别Lama3基因的gRNA
利用In-Fusion克隆技术构建载体donor oligo，donor oligo的DNA序列如SEQ IDNO:2所示：
SEQ ID NO:2：
GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTCTGTGTCACGGAGTATAGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAATGGCGAGGTAATCAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG；
从ThermoFisher直接购买Cas9混样体系，Cas9混样体系中包含gRNA、Cas9 mRNA、DEPC水，浓度分别为Cas9 mRNA 3μg/μL，gRNA 1μg/μL，其中，gRNA的DNA序列如SEQ ID NO:1所示：
SEQ ID NO:1：
gRNA：5’-ATTACCTCGCCATTTTCCAGAGG-3’。
(2)显微注射及受精卵移植
制备F0代小鼠的方法包括如下步骤：小鼠的超排、注射受精卵及移植、F0代小鼠获得；其中小鼠品系为C57BL/6J。
具体方法如下：
A.挑选实验小鼠：挑选5-6周龄，18-22g的C57BL/6J小鼠。
B.小鼠超排和受精卵注射：选择4周龄的雌鼠，先注射孕马血清促性腺激素(PSMG)，48h后注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)，14h后取卵。然后体外受精获得受精卵。将Cas9混样体系以及体外合成的载体donor oligo混合注射5μL到受精卵中(以上激素均来源于Solarbio)。
小鼠的超排、取卵以及体外受精技术参考[徐平.不同日龄和品系小鼠超排卵、体外受精及受孕率的比较研究[J].中国实验动物学杂志,2001(02):15-18.]。
将Cas9混样体系以及体外合成的载体donor oligo混合注射5μL到受精卵中后，gRNA对野生型等位基因序列的箭头处进行剪接，野生型等位基因序列经gRNA剪接后突变成突变型等位基因，突变型等位基因序列信息如下所示：
突变型等位基因序列：GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTCTGTGTCACGGAGTATAGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAATGGCGAGGTAATCAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG，其中突变后的第4号外显子E4碱基序列为：AGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAAT，下划线部分的碱基为突变位点；
C.受精卵移植：注射完成后，将受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，一笼两只饲养，术后一周持续观察，若小鼠出现疼痛反应及时补充注射镇痛剂，终获得F0代小鼠。
(3)F0代小鼠的鉴定与繁育
将出生的F0代小鼠进行PCR和电泳鉴定，其中PCR引物如下：
Lama3-F：5’-TGCTTACTTGAGACATGAAGAG-3’，
Lama3-R：5’-GTCCTGGATAGAGCTACTTGAG-3’，
PCR体系如下：
PCR流程如下：
F0代小鼠的测序鉴定引物如SEQ ID NO:3所示：
SEQ ID NO:3：
5’-TTGTCCTAAGCCTTCACCTAG-3。
经过PCR扩增以及电泳鉴定，结果如图1B所示，确定6只F0代小鼠均为Lama3基因点突变杂合子。
(4)小鼠的验证与鉴定
F0代Lama3基因点突变杂合子交配后获得后代，剪尾提取DNA进行PCR和电泳鉴定，其中PCR引物如下：
Lama3-F：5’-TGCTTACTTGAGACATGAAGAG-3’，
Lama3-R：5’-GTCCTGGATAGAGCTACTTGAG-3’，
PCR体系如下：
PCR流程如下：
F1代小鼠的测序鉴定引物如SEQ ID NO:3所示：
SEQ ID NO:3：
5’-TTGTCCTAAGCCTTCACCTAG-3。
经过测序鉴定，结果如图1C所示，获得6只Lama3基因点突变纯合子F1代小鼠。
实施例二Lama3基因点突变小鼠模型的表型验证
本实验F1代Lama3点突变纯合子小鼠在吉林大学实验动物中心屏障设施饲养并开展实验(SYXK(吉)2021-0006)，整个过程在吉林大学动物伦理福利委员会监督下进行，遵守吉林大学及国家对于实验动物伦理福利的要求，饲养条件严格依照GB14925进行，实验动物自由饮水采食。
如无特殊说明，本实施例中所有的试剂均采购自国药集团化学试剂有限公司。
具体步骤如下：
(1)Lama3点突变纯合子小鼠毛发表型观察
F1代Lama3点突变纯合子小鼠分别于出生后第21天、28天、33天、42天、50天、60天、70天、80天、85天、90天、95天、100天、150天拍照观察F1代小鼠毛发生长状况，相应日龄的野生型C57BL/6J小鼠作为对照。结果如图2A所示，F1代Lama3点突变纯合子小鼠在前两个毛发生长周期表现正常，而从第三个毛发生长周期的生长期开始(即80天)出现以背部中心为起始的脱发，随时间推移脱发区域逐渐扩大，最后形成边界清晰的区域性斑秃(150天)。
(2)Lama3点突变纯合子小鼠皮肤切片病理结构观察
步骤(1)中毛发表型观察结果显示，Lama3基因点突变小鼠150天呈现边界清晰的区域性斑秃，因此本部分通过取材150天小鼠的背部皮肤制备石蜡切片并进行HE染色，观察皮肤结构，以及毛囊、皮脂腺等皮肤附属器的病理改变。
A.取材、固定：取Lama3基因点突变150天小鼠脱毛区域1X1cm大小的皮肤块，同时野生型C57BL/6J小鼠用电动剃毛器剃毛后取相应位置、相同大小的背部皮肤作为对照，二者做好标记，将两块皮肤平铺于滤纸上，然后置于4％多聚甲醛中固定48h；
B.脱水：固定结束的皮肤组织经修剪后放入包埋盒中，按照如下流程进行脱水，50％乙醇浸泡0.5h，70％乙醇浸泡24h，然后依次在80％，90％，100％A，100％B乙醇中浸泡1h；
C.透明：将脱水后的样本放入二甲苯A和二甲苯B中各浸泡30min；
D.浸蜡、包埋：将透明后的样本放入石蜡缸A、B中各1h；随后置于模具中进行包埋，并将其石蜡块修剪为梯形；
E.切片：上述包埋后的样本经石蜡切片机(上海徕卡仪器有限公司，RM2016)切片，厚度4μm，展片于防脱载玻片上；
F.烤片：将切片放置于65℃烘箱(上海慧泰仪器制造有限公司，DHG-9140A)中烤片1.5h，然后放置于二甲苯A和二甲苯B中各10min脱蜡，直至切片上无蜡痕；
G.复水：将烤片后的样本依次置于100％A，100％B，90％，80％，70％乙醇中各3min复水；
H.HE染色：将复水后的样本经苏木素染核5min，流水冲洗1min，于流水中静置5min，再继续伊红染色1min，流水冲洗1min；
J.脱水、封片：将HE染色后的切片依次置于95％乙醇A，95％乙醇B，100％乙醇A，100％乙醇B中各3min脱水，然后放置于二甲苯A和二甲苯B中各5min透明，滴加中性树胶封片；
K.拍照观察：观察切片，拍照保存。
组织切片染色的结果如图2B所示，野生型C57BL/6J小鼠(野生型-150天)皮肤结构完整正常，毛囊隆突部有皮脂腺围绕，同时毛囊向下延伸至皮下组织中，符合毛发生长期的特点；而Lama3基因点突变纯合子小鼠(突变型-150天)皮肤整体分层正常，但是毛囊结构缺失，并且相较于对照组其真皮层中皮脂腺的数量明显增多。
图2B中箭头标注的是皮脂腺，矩形框标注的是毛囊结构。
结果表明，Lama3基因突变破环了毛囊正常结构及毛发正常周期转换，使得毛发生长周期停滞于第二周期的静止期无法进入第三周期的生长期，从而影响毛发正常生长，终表现为脱毛。
综上所述，Lama3基因在毛囊形态发生和毛发周期转换中发挥重要作用，并可作为毛发异常相关疾病模型小鼠的理论基础。
需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种Lama3基因点突变的小鼠模型，其特征在于：所述小鼠模型的突变位点为小鼠第18号染色体的Lama3基因第4外显子第854位碱基由C突变为T，蛋白质第217位氨基酸从R突变为C，由精氨酸变为半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种Lama3基因点突变的小鼠模型，其特征在于：所述小鼠模型为Lama3基因点突变纯合子F1代小鼠。
3.一种Lama3基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于：主要步骤如下：
(1)靶点选择：寻找Lama3基因的CDS区，明确外显子部分，确定基因突变位点，并对第4号外显子E4进行基因替换，
野生型等位基因序列信息如下：
GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTC TGTGTCACGGAGTATTCCCGTATCGTGCCTCTGGAAAATGGCGAGGTAAT CAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG，
其中野生型等位基因序列中第4号外显子E 4碱基序列为：TCCCGTATCGTGCCTCTGGAAAAT，下划线部分的碱基为突变位点；
(2)设计能够特异性识别Lama3基因的gRNA，制备gRNA与Cas9mRNA的混合物，即Cas9混样体系，
所述gRNA的DNA序列为：
gRNA：5’-ATTACCTCGCCATTTTCCAGAGG-3’；
(3)利用In-Fusion克隆技术构建载体donor oligo，所述donor oligo的DNA序列为，
GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTC TGTGTCACGGAGTATAGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAATGGCGAGGTAAT CAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG；
(4)F0代小鼠构建：包括小鼠的超排、受精卵注射及移植、F0代小鼠获得，具体如下，
A.选取实验对象：挑选挑选5-6周龄，体重为18-22g的C57BL/6J小鼠6只；
B.获取受精卵：先腹腔注射孕马血清促性腺激素PSMG，48h后注射人绒毛膜促性腺激素hCG，其中孕马血清促性腺激素PSMG以及人绒毛膜促性腺激素hCG的注射量各为5IU/只，14h后取卵，然后体外受精获得受精卵，将5μLCas9混样体系以及donor oligo混合注射到受精卵中，诱导受精卵的染色体基因进行突变；
突变型等位基因序列信息如下：
GGGCAAGAAGCAAACATGGCAATTACCCAGGACGACCAGATGCTC TGTGTCACGGAGTATAGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAATGGCGAGGTAAT CAGCTTTGGGAAGCTGTAACACCAAAGACTCATGAATGGGTTG，
其中突变后的第4号外显子E 4碱基序列为：AGTTGTATCGTGCCTTTAGAAAAT，下划线部分的碱基为突变位点；
C.受精卵移植：注射完成后，将受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，一笼两只饲养，受精卵发育并顺利被生产出，获得F0代小鼠；
(5)F0代小鼠的鉴定与繁育：将出生的F0代小鼠剪尾提取DNA进行PCR和测序鉴定，获得的F0代Lama3基因点突变杂合子小鼠自交后获得后代，对F0代突变杂合子小鼠的后代剪尾提取DNA进行鉴定，获得Lama3基因点突变纯合子F1代小鼠；
(6)F1代小鼠经测序确认筛选获得阳性纯合子，表明模型构建成功。
4.根据权利要求3所述的一种Lama3基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述突变位点为小鼠第18号染色体的Lama3基因第4外显子第854位碱基由C突变为T。
5.根据权利要求3所述的一种Lama3基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述Cas9混样体系来源于ThermoFisher，所述Cas9混样体系中包含1μg/μL的gRNA、3μg/μL的Cas9 mRNA和DEPC水，所述donor oligo购自苏州赛业生物科技有限公司。
6.根据权利要求3所述的一种Lama3基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述孕马血清促性腺激素PSMG以及人绒毛膜促性腺激素hCG均来源于北京索莱宝科技有限公司，Solarbio Life Science。
7.根据权利要求3所述的一种Lama3基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述F0/F1代小鼠剪尾提取DNA进行PCR所需的引物如下：
Lama3-F：5’-TGCTTACTTGAGACATGAAGAG-3’，
Lama3-R：5’-GTCCTGGATAGAGCTACTTGAG-3’，
PCR体系为：Tap DNA聚合酶12.5μL，10μM的上游引物1.0μL，10μM的下游引物1.0μL，鼠尾基因组DNA 1.5μL，ddH2O 9.0μL，总体系25μL。
8.根据权利要求3所述的一种Lama3基因点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述F0/F1代小鼠的测序鉴定引物为，5’-TTGTCCTAAGCCTTCACCTAG-3。
9.一种Lama3基因点R217C突变小鼠模型的表型验证，其特征在于：包括Lama3基因点突变小鼠毛发表型观察和Lama3基因点突变小鼠皮肤切片病理结构观察。
10.根据权利要求8所述的一种Lama3基因点突变小鼠模型的表型验证，其特征在于：所述Lama3基因点突变小鼠为Lama3点突变纯合子F1代小鼠。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211536289.XA CN115843747A (zh) | 2022-12-02 | 2022-12-02 | 一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211536289.XA CN115843747A (zh) | 2022-12-02 | 2022-12-02 | 一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115843747A true CN115843747A (zh) | 2023-03-28 |
Family
ID=85669226
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211536289.XA Pending CN115843747A (zh) | 2022-12-02 | 2022-12-02 | 一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115843747A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116751781A (zh) * | 2023-06-26 | 2023-09-15 | 华东师范大学 | 蛋白酶体激活子3相互作用蛋白1基因去磷酸化定点突变小鼠模型的构建及应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102858985A (zh) * | 2009-07-24 | 2013-01-02 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 基因组编辑方法 |
| CN108359719A (zh) * | 2009-05-26 | 2018-08-03 | 奎斯特诊断投资公司 | 基因失调的检测方法 |
| CN112005968A (zh) * | 2020-09-02 | 2020-12-01 | 南京农业大学 | 半乳糖基转移酶GalT基因点突变小鼠模型的构建方法及其用途 |
| CN113234756A (zh) * | 2021-04-16 | 2021-08-10 | 河南省人民医院 | 一种基于CRISPR/Cas9技术的LAMA3基因敲除动物模型的构建方法 |
| US20220002366A1 (en) * | 2018-09-18 | 2022-01-06 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Immunotherapy with a*01 restricted peptides and combination of peptides against cancers and related methods |
| DE102020120218A1 (de) * | 2020-07-31 | 2022-02-03 | KBHB Consult GmbH | Gegen das ribosomale Protein rpL35/uL29 gerichtete Moleküle zur Verwendung in der Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Epidermolysis bullosa (EB) |
-
2022
- 2022-12-02 CN CN202211536289.XA patent/CN115843747A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108359719A (zh) * | 2009-05-26 | 2018-08-03 | 奎斯特诊断投资公司 | 基因失调的检测方法 |
| CN102858985A (zh) * | 2009-07-24 | 2013-01-02 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 基因组编辑方法 |
| US20220002366A1 (en) * | 2018-09-18 | 2022-01-06 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Immunotherapy with a*01 restricted peptides and combination of peptides against cancers and related methods |
| DE102020120218A1 (de) * | 2020-07-31 | 2022-02-03 | KBHB Consult GmbH | Gegen das ribosomale Protein rpL35/uL29 gerichtete Moleküle zur Verwendung in der Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Epidermolysis bullosa (EB) |
| CN112005968A (zh) * | 2020-09-02 | 2020-12-01 | 南京农业大学 | 半乳糖基转移酶GalT基因点突变小鼠模型的构建方法及其用途 |
| CN113234756A (zh) * | 2021-04-16 | 2021-08-10 | 河南省人民医院 | 一种基于CRISPR/Cas9技术的LAMA3基因敲除动物模型的构建方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 冀中豪: "NIH稀毛小鼠的皮肤转录组分析及其对单增李斯特杆菌的易感性研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑, no. 2018, 15 December 2018 (2018-12-15), pages 12 - 18 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116751781A (zh) * | 2023-06-26 | 2023-09-15 | 华东师范大学 | 蛋白酶体激活子3相互作用蛋白1基因去磷酸化定点突变小鼠模型的构建及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| McClatchey et al. | The Nf2 tumor suppressor gene product is essential for extraembryonic development immediately prior to gastrulation. | |
| CN104928321A (zh) | 一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式及建立方法 | |
| Kuales et al. | Boule-like genes regulate male and female gametogenesis in the flatworm Macrostomum lignano | |
| CN115843747A (zh) | 一种Lama3基因点突变的小鼠模型及其构建方法 | |
| CN106591429B (zh) | 半滑舌鳎性逆转遗传控制位点的筛选方法、试剂盒及应用 | |
| JP2023116719A (ja) | 安定した表現型を示す疾患モデルブタおよびその作製方法 | |
| CN109022485A (zh) | 一种视神经萎缩动物模型的构建方法、试剂盒和应用 | |
| EP1661456B1 (en) | Method of constructing nuclear-transplanted egg, parthenogenetic embryo and parthenogenetic mammal | |
| CN113558011B (zh) | 基于γ-分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法 | |
| Blackler et al. | Transmission of sex cells of one species through the body of a second species in the genus Xenopus. I. Intraspecific matings | |
| Kamimura et al. | Medaka factor in the germline alpha (Figα) is indispensable for oogenesis but not for gonadal sex differentiation | |
| US20200263198A1 (en) | Methods and compositions for in situ germline genome engineering | |
| CN113549637A (zh) | 一种小鼠phex基因snp位点及其应用 | |
| CN109897867B (zh) | 基因改造方法 | |
| EP2617284B1 (en) | Model animal for studying hair growth cycle | |
| CN113584030A (zh) | 基于Cre-FloxP系统的CNN3基因敲除小鼠模型的构建方法 | |
| CN110218743A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9技术的牛磺酸转运体基因敲除大鼠模型的构建方法 | |
| CN104388560A (zh) | 一种y染色体标记方法及其应用 | |
| CN115029382B (zh) | 一种能够区分Tbx1两种可变剪切体的基因修饰小鼠的制备方法 | |
| CN114410691B (zh) | Slc35e1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用 | |
| Delhotal | Characterization of NHLRC2 gene-edited mice: a model for bovine developmental duplications | |
| CN113201515B (zh) | 一种与动物不孕相关的基因、sgRNA及应用和构建动物模型的方法 | |
| Curantz et al. | A positive feedback loop between germ cells and gonads induces and maintains cnidarian sexual reproduction | |
| JP5078074B2 (ja) | 核移植卵、単為発生胚および単為発生非ヒト哺乳動物の作出方法 | |
| Reilly et al. | [26] Preparation of recombinant hemoglobin in transgenic mice |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |