CN113558011B - 基于γ-分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于γ‑分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法，小鼠Gsap基因位于小鼠5号染色体上；外显子5将被选为目标位点；将小鼠Gsap基因的gRNA、含P118T(CCA‑to‑ACA)突变位点的供体寡核苷酸和cas9mRNA一起注射到受精卵中产生靶向敲除子代；用PCR方法鉴定F0代小鼠，并进行序列分析，将其育成野生型小鼠，进行种系传递和F1代动物的研究。本发明不仅具有高效、快速、经济的优点，而且极易推广并广泛使用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种基于γ-分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法。
背景技术
原发干燥综合征(pSS)是一种主要侵犯外分泌腺为主要特征的慢性炎症性自身免疫性疾病，在中医学方面，pSS属“燥证”、“燥病”等范畴，以口眼干燥为主症，随着疾病的进展，可造成多器官、多系统受累。pSS患病率为0.1％-1％，仅次于类风湿关节炎居第二位，男女比例为1:9。其发病机制不明，pSS被认为是一个起源于遗传因素与能够触发异常自身免疫应答的外源性因素之间的相互作用而发病的多因素致病过程。在特定表观遗传因素，遗传易感性和激素调节作用下，触发外分泌腺上皮细胞(SGEC)功能失调，在pSS的发病中至关重要，是T淋巴细胞、B细胞过活跃和自身抗体产生的基础。既往的研究已将免疫应答基因的SNP与pSS易感性联系起来，两项全基因组关联研究进一步证实了免疫在pSS发育中的关键作用。但是已鉴定的基因的单核苷酸多态性(SNP)仅能解释对疾病的易感性。因为大多数都很常见，并且不会改变编码的蛋白质。且治疗手段非常有限，主要以人工唾液、人工泪液改善症状为主。
干燥综合征不仅起病隐蔽病程长,而且发病的病因病机尚无一个明确的定论,所以对该病的研究就显得异常的迫切。建立动物模型利用动物疾病模型来研究人类疾病，可以克服平时一些不易见到，而且不便于在病人身上进行实验的各种人类疾病的研究。同时还可克服人类疾病发生发展缓慢，潜伏期长，发病原因多样，经常伴有各种其它疾病等因素的干扰，可以用单一的病因，在短时间内复制出典型的动物疾病模型，对于研究人类各种疾病的发生、发展规律和防治疾病疗效的机理等是极为重要的手段和工具。但在实验室中对动物模型的建立又是对干燥综合征研究提出的另一个难题。干燥综合征的动物模型主要是鼠类,而大鼠的不经济性，建模成本高，所以小鼠模型较受欢迎。
前期我们发现了一个四代有五个发病的pSS家系，呈常染色体显性遗传。全基因组测序，经过变体过滤和分离分析确定为γ-分泌酶激活蛋白基因(GSAP)基因中的p.Pro122Thr是唯一的候选变体。所有受影响的家庭成员均携带杂合突变的等位基因，而未受影响的成员具有野生型等位基因，公共变体数据库中也没有该变体。GSAP在阿尔茨海默病中发挥重要作用，但本家族未发现阿尔茨海默病病例。我们的研究首次确定了家族性pSS的致病性突变。
综上所述，现有技术存在的问题是：
目前研究用到的两种较为普遍的pSS模型为自发型和诱导型，均存在弊端。自发型动物模型往往是继发于另一种疾病而产生SS症状，对于其发病原因和病理生理机制的研究无法深入开展。如NOD小鼠常伴发1型糖尿病。诱导性鼠模型是指通过对正常的鼠做出一些相关的处理以诱导其产生局部的干燥综合征的症状。目前主要使用的诱导方法为注射同种鼠或异种鼠的抗原或组织匀浆进行免疫；或用佐剂进行免疫；还有通过接种病毒进行诱导。一些诱导型小鼠，如干燥综合征抗原A诱导的pSS动物模型，造模周期较长，造模过程烦琐。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种基于γ-分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于γ-分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法：小鼠Gsap基因位于小鼠5号染色体上；其中共鉴定出31个外显子，ATG起始密码子位于外显子1，TGA终止密码子位于外显子31；突变位P118位于外显子5上；外显子5将被选为目标位点；
gRNA靶序列：gRNA1(与基因正向链匹配)：AATGACCTTCAGCCAGGTAATGG；通过同源性定向修复，将供体寡核苷酸P118T(CCA-ACA)突变位点导入第5外显子；
采用crispr-cas9基因编辑技术建立GSAP基因错义突变的小鼠模型，突变位点是P118T(CCA>ACA)。将小鼠Gsap基因的gRNA、含P118T(CCA-to-ACA)突变位点的供体寡核苷酸和cas9mRNA一起注射到受精卵中产生靶向敲除子代；用PCR方法鉴定F0代小鼠，并进行序列分析，与野生型小鼠杂交，进行种系传递和F1代动物的研究。
具体包括以下步骤：
步骤1：向预先准备好的雌鼠腹腔注射激素，注射激素分别为血促性素和人绒毛膜促性腺激素；
步骤1中向每只雌鼠注射血促性素的剂量为4.5-5.5U,向每只雌鼠注射人绒毛膜促性腺激素的剂量为4.5-5.5U,两次注射间隔42-54h；
步骤2：在给药后,将雄鼠以及注射激素后的雌鼠处死,分别取出雌鼠的输卵管膨大部以及雄鼠的附睾；
步骤3：在体视显微镜下分别收集卵子和精子；
步骤4：使精子在获能液中获能,取液体边缘的精子滴加到短暂培养的卵细胞中,体外受精；
步骤5：将体外转录成功的sgRNA与Cas9mRNA分别用无RNA酶水稀释，得到稀释sgRNA溶液和稀释Cas9mRNA溶液,通过显微注射的方式将稀释sgRNA溶液和稀释Cas9mRNA溶液分别导入到小鼠受精卵细胞质中；
步骤6：将存活的受精卵移植到与结扎雄鼠合笼后见栓的ICR雌鼠输卵管膨大部,缝合；
步骤7：F0代鼠出生后6-8天剪取小鼠脚趾并编号,使用动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取小鼠DNA；
步骤8：根据被编辑的序列位置设计鉴定用PCR扩增引物；
步骤9：对PCR扩增产物进行T-A克隆,并进行DNA测序；
步骤10：筛选出成功发生基因突变的阳性首建鼠与野生型小鼠进行交配；
步骤11：待F1代小鼠出生后,再次利用步骤8中的鉴定方法对敲除情况进行鉴定,筛选出敲除情况相同且性别不同的F1代小鼠进行近交；
步骤12：F2代小鼠继续进行基因型鉴定,以建立稳定遗传GSAP基因错位突变小鼠品系。
优选的：步骤7中提取小鼠DNA的方法为：
步骤71：剪取小鼠尾巴，每尾片大小为2-5mm，每尾片加入170-190μL缓冲液GL、15-25μL蛋白酶K和5-15μL核糖核酸酶a于微量离心管中；
步骤72：将微量离心管在56℃下培养过夜；
步骤73：将微量离心管放入微型离心机中，以离心去除杂质；
步骤74：加入180-220μL缓冲液GB和180-220μL无水乙醇，充分混合；
步骤75：将旋转柱放入收集管中；将样品旋转并离心，丢弃滤液；
步骤76：向旋转柱中添加450-550μL缓冲液WA，离心丢弃滤液；
步骤77：向旋转柱中加入650-750μL缓冲液WB，并离心丢弃滤液；
步骤78：重复步骤77；
步骤79：将旋转柱置于收集管中，离心；
步骤710：将旋转柱放入新的试管中；在柱膜中心加入50-200μL灭菌水或洗脱缓冲液，使旋转柱静置；
步骤711：洗脱DNA时，在旋转柱膜中心加入50-200μL灭菌水或洗脱缓冲液，静置离心；
步骤712：定量得到基因组DNA；洗脱的基因组DNA通过电泳进行定量。
优选的：步骤7中提取小鼠DNA的方法为：
步骤a、剪取小鼠尾巴，每尾片大小为2-5mm，在微量离心管中为每个尾片添加80-120μL尾消化缓冲液；
步骤b、将微量离心管培养过夜；
步骤c、在98℃下培养，使蛋白酶K变性；
步骤d、将微量离心管放入离心机中旋转离心；直接从微量离心管中取上清液进行PCR扩增。
优选的：步骤8中被编辑的序列位置PCR区域1：
小鼠GSAP(A130V)-F：GAGAACAGTGCTTGGTGAGTTGAGATC
小鼠GSAP(A130V)-R：AATCTTCAGGCACGAATTAGCATCTC
突变等位基因：571bp；
野生型等位基因：571bp。
优选的：步骤8中鉴定用PCR扩增引物：序列引物(正序)：GAGAACAGTGCTTGGTGAGTTGAGATC；序列引物(反序)：AATCTTCAGGCACGAATTAGCATCTC”。
病理分析：最后我们得到的稳定遗传GSAP基因错位突变小鼠品系，进行小鼠颌下腺病理分析，将颌下腺进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片最后镜检合格的样片。将待测样本经4％多聚甲醛固定，固定状态良好后，在显微镜下浏览切片或使用CaseViewer2.2浏览数字切片，在不同倍数下详细观察组织结构，观察切片是否出现典型病理改变如炎症、坏死、变性、增生以及纤维化。
分析结果：显示杂合子和野生型动物反应正常，而纯合子小鼠有小范围浆液腺萎缩，腺上皮细胞胞质内嗜酸性颗粒减少或消失，腺管变小，间质少量结缔组织增生，伴少量淋巴细胞等炎性细胞浸润；局部还见浆液腺坏死，腺管上皮细胞排列紊乱，并见上皮细胞坏死，胞核固缩深染或碎裂溶解。诱导后小鼠的病理症状与pSS患者症状相符，包括pSS关键临床特征。本实验利用C57BL/6小鼠品系(非遗传易感性小鼠)成功构建pSS的小鼠模型。
本发明相比现有技术，具有以下有益效果：
GSAP基因在体敲除的确破坏了小鼠唾液腺功能，出现炎性细胞浸润，从而在生理水平模拟了人类pSS疾病特征，与以往易感基因不同，本发明的全新的致病基因GSAP小鼠动物模型，提供了很好的机会来进一步研究pSS发病机制，为pSS治疗提供了新思路，新方案。与自发型动物模型与诱导型动物模型不同，自发型动物模型往往是继发于另一种疾病而产生SS症状，对于其发病原因和病理生理机制的研究无法深入开展。诱导型动物模型，造模周期较长，造模过程烦琐。该动物模型建模方式具有高效、快速、经济的优点，极易推广并广泛使用。
附图说明
图1是小鼠GSAP基因敲除示意图；
图2是基因分型策略图；
图3是PCR结果图；
图4是小鼠GSAP基因测序结果图；
图5是目的等位突变基因的氨基酸序列图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
一种基于γ-分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法，包括以下步骤：
步骤1：向预先准备好的4周龄左右的C57BL/6雌鼠腹腔注射血促性素和人绒毛膜促性腺激素,每只注射剂量约为5U,两次注射间隔48h。
步骤2：在给药18h后,将注射激素后的C57BL/6雌鼠以及1只8-12周龄C57BL/6雄鼠处死,分别取出雌鼠的输卵管膨大部以及雄鼠的附睾。
步骤3：在体视显微镜下分别收集卵子和精子。
步骤4：使精子在获能液中获能,取液体边缘的精子滴加到短暂培养的卵细胞中,体外受精3-4h。
步骤5：将体外转录成功的sgRNA与Cas9mRNA分别用无RNA酶水稀释到25ng/μL和50ng/μL,通过显微注射的方式导入到小鼠受精卵细胞质中。
目的等位突变基因的氨基酸序列如图5所示。
步骤6：将存活的状态良好的受精卵移植到与结扎雄鼠合笼后见栓的ICR雌鼠输卵管膨大部,缝合,将代孕雌鼠饲养于IVC环境。
步骤7：F0代鼠出生后约一周龄剪取小鼠脚趾并编号,使用动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取小鼠DNA。
上述步骤7中，对于DNA提取进一步说明，Taq-DNA聚合酶为Taq-HS-DNA聚合酶。
我们建议使用TaKaRaMiniBEST通用基因组DNA提取试剂盒(版本5.0，代码9765)获得高纯度的基因组DNA。
a、每尾片(2-5mm)加入180μL缓冲液GL、20μL蛋白酶K和10μL核糖核酸酶a于微量离心管中。小心不要剪太多的尾巴。
b、将试管在56℃下培养过夜。
c、以12000转/分的转速旋转微型离心机2分钟，以去除杂质。
d、加入200μL缓冲液GB和200μL无水乙醇，充分混合。
e、将旋转柱放入收集管中。将样品以12000rpm的转速旋转并离心2分钟。丢弃滤液。
f、向旋转柱中添加500μL缓冲液WA，并以12000rpm离心1分钟。丢弃滤液。
g、向旋转柱中加入700μL缓冲液WB，并以12000rpm离心1分钟。丢弃滤液。(注：确保缓冲液WB已与100％乙醇预混合。添加缓冲液WB时，添加到管壁以冲洗残余盐。)
h、重复步骤g。
i、将旋转柱置于收集管中，以12000rpm离心2分钟。
j、将旋转柱放入新的1.5ml试管中。在柱膜中心加入50～200μL灭菌水或洗脱缓冲液，使柱静置5min(注：灭菌水或洗脱缓冲液加热至65℃可提高洗脱收率)
k、洗脱DNA时，以12000转/分离心2分钟，为提高DNA得率，在旋转柱膜中心加入通流和/或50～200μL灭菌水或洗脱缓冲液，静置5分钟，12000转/分离心2分钟。
l、定量到基因组DNA。洗脱的基因组DNA可以通过电泳或电泳进行定量。
一种获得粗DNA的低成本取样方法。
a、在微量离心管中为每个尾片(2-5mm)添加100μL尾消化缓冲液。小心不要剪太多的尾巴。
b、将试管在56℃下培养过夜。
c、在98℃下培养13分钟，使蛋白酶K变性。
d、以最高速度旋转微型离心机15分钟。直接从试管中取一小份上清液(50μL反应中取2μL)进行PCR。
尾部消化缓冲液的最终浓度：
步骤8：根据被编辑的序列位置设计鉴定用PCR扩增引物,基因敲除示意图及引物，PCR扩增体系及反应式。
上述步骤8中对于序列设计进一步说明，
PCR筛选PCR区域1(退火温度60.0℃)：
小鼠GSAP(A130V)-F：GAGAACAGTGCTTGGTGAGTTGAGATC
小鼠GSAP(A130V)-R：AATCTTCAGGCACGAATTAGCATCTC
突变等位基因：571bp；
野生型等位基因：571bp；
鉴定出来的PCR产物测序引物为：序列引物(正序)：GAGAACAGTGCTTGGTGAGTTGAGATC；序列引物(反序)：AATCTTCAGGCACGAATTAGCATCTC。
对于PCR扩增具体说明：
在标准条件下，在30μL体积中进行35个周期的PCR，将上述所有引物添加到每个反应中。
PCR基因分型中使用的两个对照是：
水质控制：未添加DNA模板。
野生型对照：400ng小鼠基因组DNA。
PCR反应体系如下：
在PCR扩增程序中，根据引物的Tm值及目的基因片段的大小，所需要的退火温度及延伸时间如下：
然后通过PCR对幼崽进行基因分型，然后进行序列分析。
小鼠GSAP基因组区域图1所示(基因从左向右排列，总大小为105，44kb。)，实心条表示URP；开放条表示UTR。
图2是基因分型策略图。图3是PCR结果图.
步骤9：对PCR扩增产物进行T-A克隆,并进行DNA测序。
步骤10：筛选出成功发生基因突变的阳性首建鼠与C57BL/6野生型小鼠进行交配。
步骤11：待F1代小鼠出生后,再次利用上述鉴定方法对敲除情况进行鉴定,筛选出敲除情况相同且性别不同的F1代小鼠进行近交。
步骤12：F2代小鼠继续进行基因型鉴定,以建立稳定遗传GSAP基因错位突变小鼠品系。
如图4所示，如图4中上面一个测序结果为野生型小鼠的DNA序列，下面一个测序结果为Mouse-ID-18的DNA序列，测序结果分别如下：
MouseID:18,19,20,22,23,24,26,27(一个等位基因发生单点突变(CCA到ACA))。
ID18：5’-CCACAGAGGGAGTAAAGAATGACCTTCAGACAGGTAATGGAATTATTCTTCCTTTGTACG-3’(CCA>ACA)。
本发明填补了致病基因动物模型的空白，弥补了以往模型的一些劣势，更加利于深入探讨pSS的发病机制，为pSS的精准治疗提供分子基础理论支持。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种基于γ-分泌酶激活蛋白基因的干燥综合征动物模型的建立方法，其特征在于：
小鼠Gsap基因位于小鼠5号染色体上；其中共鉴定出31个外显子，ATG起始密码子位于外显子1，TGA终止密码子位于外显子31；突变位P118位于外显子5上；外显子5将被选为目标位点；
与基因正向链匹配的gRNA靶序列：gRNA1：AATGACCTTCAGCCAGGTAATGG；通过同源性定向修复，将供体寡核苷酸P118T(CCA-ACA)突变位点导入第5外显子；
将小鼠Gsap基因的gRNA、含P118T(CCA-to-ACA)突变位点的供体寡核苷酸和cas9mRNA一起注射到受精卵中产生靶向敲除子代；用PCR方法鉴定F0代小鼠，并进行序列分析，与野生型小鼠杂交，进行种系传递和F1代动物的研究，最终获得的干燥综合征动物模型小鼠为纯合子。
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