JP2006320330A - ハムスターのユビキチン遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ハムスターのハムスターのUb/S27a遺伝子、および、同遺伝子の配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列を有する核酸分子。
【選択図】なし
Description
ユビキチンは76のアミノ酸からなる高度に保存されたポリペプチドであり、全ての真核細胞の多くで見いだされ、多様な遺伝子ファミリーによってコードされている(総説:Jentsch et al.,1991;Schlesinger & Bond,1987)。標的タンパク質を修飾することにより、ユビキチンは、ユビキチン−プロテオソーム経路によるATP依存性のタンパク質分解のような様々な生体内過程において明確な役割を演じる(Ciechanover,1994)。その構造に基づいて、ユビキチン遺伝子は2つのグループに分けることができる。第1のグループは、228bp のユビキチンコーディング単位(=76アミノ酸)が頭- 尾配列で並んでいるポリユビキチン遺伝子を含む (Jentsch et al.,1991; Schlesinger & Bond,1987)。大部分の生体は異なる長さの二つのポリユビキチン遺伝子を含むが(Fornace et al.,1989; Wiborg et al.,1985)、単位の数は種によって変動する。これらの遺伝子のプロモーター領域はTATAボックスおよびヒートショック誘導因子に対するプロモーター/エンハンサーエレメントを含む(Schlesinger & Bond,1987)。
ユビキチン融合遺伝子が第2のグループに属する。これらはユビキチン単位とリボソームタンパク質との間で融合したものである(Jentsch et al.,1991; Schlesinger & Bond,1987)。二つの既知のユビキチン融合遺伝子は、長さととリボソームタンパク質の配列の違いに基づいて同定できる。一方では、このリボソームタンパク質は52アミノ酸長のリボソーム大サブユニットのタンパク質であり(Baker et al.,1991)、他の場合は、このリボソームタンパク質は76から81アミノ酸の種依存性の長さのリボソーム小サブユニットのタンパク質(哺乳動物ではS27aタンパク質と呼ばれる)である(Redman & Rechsteiner,1989)。これらの融合タンパク質のユビキチン部分はリボソームタンパク質がリボソームに効果的に組み込まれるのを明らかに補助するものである(Finley et a l.,1989)。
個々のユビキチン遺伝子は、生体の全種類の組織、および発生の種々の段階で異なる程度で発現している。このように、ポリユビキチン遺伝子は低レベルで構成的に発現しており、ストレス下でのみ急激に増加する(Fornace et al.,1989; Schlesinger & Bond,1987)。ユビキチン融合遺伝子は主として指数関数増殖期の間、より強く発現する。一方、最終分化して増殖を停止した細胞で発現は減少する(Schlesinger & Bond,1987; Shimbara et al.,1993; Wong et al.,1993)。
本発明はまた、Ub/S27a遺伝子のプロモーター配列および/または他の調節配列を含む核酸分子に関する。好ましくは、このプロモーター配列および/または他の調節配列はハムスターのUb/S27a-遺伝子に由来する。特に、本発明は図5に示した配列に含まれるプロモーター配列および/または他の調節配列を含む組換え核酸分子に関する。
本発明は好ましくは、図5中の位置 -161〜-45に対応する領域に由来する配列を含む核酸分子に関する。実施例4に記載した方法を用いて本発明による配列の部分配列を含む核酸分子を調製すること、特に-151から-45領域の部分配列、これも強いプロモーター活性を与えるが、これを調製することは当業者の能力の範囲である。従って、本発明はこの種の部分配列に関する。
実施例4に記載した方法を用いて測定することができるプロモーター活性を顕著に低下させずに、1塩基、2塩基、3塩基またはそれ以上の塩基の置換、挿入、欠失または付加によって図5に示された配列からプロモーター配列を変化させることもまた当業者の能力の範囲である。プロモーター活性の顕著な低下とは、同様な条件下の実施例4のCATアッセイにおいて、表1の272塩基欠失断片により得られる値の50%を越える低下を意味する。従って、プロモーター配列のこのような変異体も明らかに本発明に含まれる。
本発明の核酸分子において、プロモーター配列および/または調節配列は遺伝子に有利であるように機能的に結合され、その遺伝子がこれらの配列の制御下で発現できるようになる。この種の遺伝子は、例えば、従来技術で公知の、組織プラスミノーゲン活性化因子(EP 0093619)、第二世代プラスミノーゲン活性化因子、例えばtnk-t-PA(WO 93/24635)、インターフェロン、例えばインターフェロン−α(EP 0595241)、インターフェロン−β(EP 0041313,EP 0287075)、インターフェロン−γ(EP 0146354)、またはインターフェロン−ω(EP 0170204)、腫瘍壊死因子(EP 0168214)、エリスロポイエチン(WO 86/03520)、顆粒球コロニー刺激因子(EP 0220520,EP0237545)またはマンガンスーパーオキシドジスムターゼ(EP 0282899)をコードしていてもよい。また、免疫グロブリン鎖、免疫グロブリン鎖の可変領域、ヒト化抗体(humanised antibody)(EP 0230400,EP0451216 )、一本鎖抗体などをコードする遺伝子であっても良い。特に、こうした遺伝子はCD44ヴァリアント特異的なヒト化免疫グロブリン鎖(WO 95/33771)をコードしていてもよい。この種の核酸分子は発現ベクターであるのが適切かもしれない (Sambrook et al.,16.3-16.29,1989)。本発明はまた、特に、真核宿主細胞に導入された後に組換えによってそのゲノムに組み込まれる発現ベクターに関する。
本発明はさらに、真核宿主細胞、好ましくはハムスター細胞、最も好ましくはCHO-細胞、において異種遺伝子産物を調製する方法であって、上述したの核酸分子の一つが真核宿主細胞に導入され、その宿主細胞が培養されて合成された遺伝子産物が単離されることを特徴とする方法に関する。本発明の方法では、異種遺伝子産物は、好ましくはハムスター由来の、Ub/S27a 遺伝子のプロモーター配列および/または調節配列の制御下で発現される。このような方法において、図5に含まれるようなプロモーター配列および/または調節配列を含む核酸分子を利用することは有利である。特に好ましい方法は、図5の-161〜-45位置に対応する配列にプロモーター配列が含まれているものである。ここでもまた、開示された配列のプロモーター活性を持つ部分配列または同等なバリアントを調製することは当業者の能力の範囲である。
本発明はまた、ハムスター細胞、好ましくはCHO-細胞またはBHK-細胞で異種遺伝子産物を調製するために本明細書中で前述したプロモーターの利用に関する。
本発明はさらに、ハムスターのUb/S27a遺伝子に関する。好ましくは、こうした遺伝子は図1に示した配列、又は、図1の配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列を有する。他の好ましい実施態様では、こうした遺伝子は図5の配列に含まれるようなプロモーターおよび/または調節配列を含む。
本出願に開示された事項を知る当業者は、公知でありかつ実施例に詳細に示される方法を用いて本発明を実施することができる。
得られたベクターを宿主細胞に導入する方法および形質転換体の選抜と培養方法は標準的な参考図書に記載されている(例えば、Sambrook et al.,16.3-16.81,1989)。
プロモーターの最適化とは別に、産生量を改良する全く異なる方法、すなわち、遺伝子量効果による方法がある。ゲノムに挿入されたベクター構築物のコピー数が増えるに従って、転写産物の量もまた増加するはずである。導入された構築物の自発的増殖は、多数のコピーの安定な組込みをもたらすが、これは、「増幅促進配列」と言われる、増幅促進的性質をもつ配列によって達成される。こうした配列は、非常に高いAT含量を有し、例えば、マウスのリボソーム遺伝子の非転写遺伝子間領域から単離され(Wegner et al.,1989)、すでにアンチセンスRNAによるHIV-1複製の安定かつ効果的な抑制に用いられ成功している(Meyer et al.,1993)。Ub/S27a 5'-非翻訳領域の88%という高いAT含量の49bpの長い配列(位置 -1477から-1429 ;図4)は上述したマウスにある増幅促進配列とかなりのホモロジーを示す。このCHO-配列領域もこうした性質をもつことは、このCHO配列を接続したUB/S27a-プロモーター構築物を用いて調べることができる。
プラスミド
全ての遺伝子操作はベクターpBluescript SK(Stratagene Cloning System,Stratagene GmbH,Heidelberg,Germany によって作られた)を用いて行った。レポーター遺伝子として利用されるバクテリアのクロラムフェニコール-アセチルトランスフェラーゼ(CAT)-遺伝子を含む真核発現ベクターを発現解析のために用いた。CAT-遺伝子をいろいろなウイルスプロモーターに融合させた。そのプロモーターはpBL-CAT5ではヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼプロモーター(tk)であり(Boshart et al.,1992; GenBank アクセス番号M80483で編集された配列が入手できる)、pCMVtkCATではヒトサイトメガロウイルス(CMV )のエンハンサーと結合したtk-プロモーター(Christoph Winkler,Wurzburg)、および、pKSSV2CATではSV-40 プロモーターである(Tsonis,et al.,1988)。pBL-CAT6をネガティブコントロールとして用いたが、これはプロモーターのないCAT-遺伝子を含んでいる(Boshart et al.,1992; 編集した配列がGenBank アクセス番号M80484で入手可能)。ベクターpCMVtklacZにおいては、バクテリアのβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現はCMV-エンハンサー/tk-プロモーターの組み合わせの制御下にある(Christoph Winkler,Wurzburg)。
CHO-DUKX細胞(Urlaub and Chasin,1980)を、5%仔ウシ血清添加ダルベッコ修正イーグル(Dulbecco's Modified Eagle's )培地/ハム(Ham's)F12培地(1:1)、Rouxフラスコ中、CO2で満たせるインキュベーター内で、相対湿度90%、37℃、5%CO2中で培養した。無血清培養のためには、血清のない培地中で増殖できるようゆっくりと慣らされ、無血清培地で永久に培養できるようになったCHO-DUKX細胞を用いた。この細胞は、低分子ペプトン(Aldag,Hamburg)、インシュリンおよびトランスフェリン(Packars,Canada)を添加してイスコフ修正ダルベッコ(Iscove's Modified Dulbecco's)培地/ハム F12培地(1:1)中、スピナーフラスコ内で懸濁培養物として培養した。
血清入り又は血清無しで培養されたCHO-細胞からのポリアデニレートmRNAを用いて、まず、4.2x106または2.9x105の組換えファージクローンからなる2つのcDNA遺伝子バンクをλZAPII中に作成した。
細胞質RNAをNP40-溶解細胞から調製し、フェノール/クロロホルム抽出によって精製した(Nicolaides and Stoeckert,1990)。血清入り又は血清無しで培養されたCHO-細胞からのポリアデニレートmRNAはオリゴ(dT)-セルロースカラムのアフィニティークロマトグラフィーによって得た(Sambrook et al.,1989)。ファルマシアLKB によって作られたcDNA合成キットをcDNAを調製するために用い、最初の鎖を合成するためにオリゴ(dT)-プライマーを用いた。このcDNAをEcoRI消化したλZAPII ベクター(Stratagene Cloning Systems)中にクローニングした。無血清培養したCHO-細胞の非増幅CHO cDNA遺伝子バンクの2枚の重複するフィルターをディファレンシャルハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。血清培養及び無血清培養したCHO-細胞の全DNA をプローブとして用い、(α-32P)dCTP(6000Ci/mmol; Amersham International plc,Amersham-Buchler,Brounschweig,Germany)で「ランダムプライミング」によってラベルした(Prime a Geneキット; Promega Cooperation,Promega Biotec,Madison,WI,USA)。ハイブリダイゼーションはノーザンブロット解析(以下の実施例2を参照のこと)に記載したように行った。両方のcDNAプローブと強いハイブリダイゼーションを示すファージプラークを単離し、さらにディファレンシャルハイブリダイゼーションにかけた。ヘルパーファージR408を用いたin vivo切り出しによって、組換え体λZAPIIファージからファージミドを得た(λZAPII クローニングキットプロトコル;Stratagene Cloning Systems)。
Ub/S27a 遺伝子発現の程度を、血清培養および無血清培養したCHO細胞の細胞質全RNA を用いてノーザンブロット実験で調べた。
細胞質RNAはNP−40溶解細胞から調製しフェノール/クロロホルム抽出によって精製した(Nicolaides and Stoechkert,1990 )。全RNA(10μg)をホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動的に分離し、ナイロン膜(Hybond N,Amersham International plc)に移行させ(Sambrook et al.,1989 )、5分間のUV照射(254nm )によってナイロン膜と共有結合的に架橋した。このRNA フィルターを、4xSSC 、10xデンハルト、0.1%SDS 、および1x106cpm/mlの32P-ラベルしたcDNAプローブからなる溶液中65℃で一晩ハイブリダイズした。cDNA断片は「ランダムプライマー」を用いてラベルし(Prime a Gene labeling kit;Promega Corporation )、DNA プローブの比放射能は4−8x108cpm/μgDNAであった。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを0.2xSSC/0.1%SDS で20分間、2回洗浄した。キッチンホイル(Curix; Agfa-GevaertN.V.)で包んだフィルター上にX-線フィルムを置き、オートラジオグラフィーを−70℃にて3時間で行った。
血清を含む標準的な条件下で培養されたCHO 細胞および無血清に適応して増殖するCHO 細胞の双方において、多くの細胞において同等量の、おおよそ600 塩基の長さのUb/S27a 転写物が検出された(図3)。おおよそ1500および2800塩基の2つの他の転写物はポリユビキチン転写物で、多数のユビキチンモノマー単位が一つに融合している。ポリユビキチン転写物は、これらの条件では非常に低いレベルで発現しているが、ノーザンブロット解析においてプローブとして使用したUb/S27a cDNAのユビキチン部分とハイブリダイズする。Ub/S27a 転写物のレベルは、無血清培地で恒久的に増殖しているCHO 細胞が血清含有培地で24時間培養された場合も変化せず高く維持された(図3)。標準的条件で血清存在下で培養されたCHO細胞を無血清培地に24時間移したときは、状況は異なっていた。Ub/S27a-転写物の数はかなり減少した(図3)。これは、無血清培地での培養中にはCHO 細胞はもはや分裂せず、また細胞体積の減少をも示すという事実によるものとすることができる。このような状態の細胞においては、転写は起こるとしてもごく僅かの転写が起こるのみである。
Ub/S27a遺伝子のプロモーター領域を単離するため、まず、血清-培養CHO細胞のゲノムDNAを用いて、100万以上の組換えファージクローンによってCHOゲノム遺伝子バンクを調製した。
ゲノムDNA はNP40-溶解細胞からニコライデスとストッカート(Nicolaides&Stoeckert)の方法に従って調製した(Nicolaides & Stoeckert,1990)。しかしながら、記載された塩析法に対して、DNAをプロテイナーゼK1消化後にフェノール/クロロホルムで3回抽出した。
平均20Kbの大きさの、Sau3AIで部分消化したゲノムDNA 断片の末端は一方の鎖をdGTPとdATPで埋め、XhoI-消化したベクターλGEM-12(DNA末端は、一方の鎖をdTTPとdCTPで埋めた;Promega Corporation)にライゲーションした。商業的に入手可能なエクストラクトをパッケージングに用いた(Gigapack II PLus packaging extracts; Stratagene Cloning Systems )。
5'非翻訳領域の両方のDNA 鎖を完全にシーケンシングした(方法は実施例1を参照のこと)。これはサブクローニングした制限断片をシーケンシングし、エキソヌクレアーゼIII 消化によって作成したオーバーラップ欠失クローンをシーケンシングすることによって行った(図4)。プロモーターの可能性のある領域はTATAボックスを含まないが、CpG-リッチ配列領域(-144から+129、67%GC)を含み、ここには転写因子Sp1 のただ1つの結合領域があることが見いだされており(Dynan & Tjian,1983)、また、そのようなGC- リッチ領域に特異的なEagIおよびSacIIの制限切断部位を含み、ポリピリミジン-リッチ配列領域も含んでいる(図5)。
転写開始点の位置を決めるため、血清-培養CHO 細胞の全RNA に対してプライマーエクステンションおよびS1ヌクレアーゼマッピングの両方を行った。ポリユビキチン転写物を伸長するのを避けるため、プライマーエクステンションではUb/S27a mRNAのS27a部分(cDNA配列のヌクレオチド+256-276bpに相補的な部分)とハイブリダイズするプライマーを用いた。
S1ヌクレアーゼマッピングに用い、ゲノムUb/S27a 配列の-2289から+176領域を含む一本鎖プローブは、以下のようにPCR によって得た。Ub/S27a-ゲノム配列の5'非翻訳領域(-2289 から+240)をベクターpBluescript SK-(Stratagene Cloning Systems)中に5'-3' 方向でクローニングした。このハイブリッドプラスミドをPCR の基質として用いた。ビオチン化T3-プロモータープライマーおよび[γ-32P]ATPでラベルしたUb/S27a-特異的プライマー(Ub/S27a-ゲノム配列のヌクレオチド+157から+176に相補的な、5'-CTCGAGCGTGATCGTTTTCC-3')を増幅のために用いた。RNA 配列に相補的な一本鎖はストレプトアビジン磁気ビーズ(Dynabeads M-280 ストレプトアビジン法;Dymal A.S.,Norway)に結合させたPCR 産物をアルカリ変性させて回収した。2x105cpmの一本鎖プローブを55℃で一晩、血清-培養CHO細胞の全RNA5μgとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした産物を続けてS1ヌクレアーゼで処理した(Ausubel et al.,1987)。
プライマーエクステンションによって得られた産物は304ヌクレオチドの長さであり(図6)、これは転写開始点は開始コドンの44bp上流、ポリピリミジンエレメント中にあることを示すであろう(図5)。しかしながら、この転写開始点はS1ヌクレアーゼマッピングでは確認できなかった。S1ヌクレアーゼマッピングを利用すると二つの転写開始点が決定され(図7)、それぞれ開始コドンの128bpおよび116bp上流、ポリピリミジン配列中にあり、これらの位置は以後位置+1および+13 と記載する(図5、図7)。2つのマッピング法で見られた不一致のもっとも適切な説明はプライマーエクステンション反応の未熟な終結である。S27a配列中のプライマー位置の関係上、予想される伸長産物の長さは、およそ100 塩基という最適な長さを超えて300 塩基以上になる。プライマーの位置と求める転写開始点との距離が大きくなるほど、mRNA中のGC-リッチ配列及び2次構造による逆転写の未熟な停止の可能性が大きくなる。一方、S1ヌクレアーゼマッピングのためには、PCR産物から得られた、5'非翻訳領域を完全に含む1本鎖プローブ(配列領域-2289から+176、図5)が用いられ、これによりプライマーエクステンションの時に起こるGC-リッチ配列の逆転写の問題が回避されている。
2.5Kbの5'非翻訳領域を調べたところ、このプロモーターの可能性のあるものはTATAボックスもCAATボックスもないことが分かった。しかしながら、開始コドンの上流にある配列は高いGC含量で特徴づけられた。この配列中に転写因子Sp1の唯一の結合領域が存在した。S1ヌクレアーゼマッピングによって、ポリピリミジン配列中に2つの顕著な転写開始点、それぞれ開始コドンの上流128bpおよび116bp、が同定された。
エキソヌクレアーゼIII による欠失クローンの調製
エキソヌクレアーゼIII 消化によって5'欠失クローンの組を調製した(表1)。Ub/S27a 遺伝子の5'非翻訳領域(-2289から+240)をベクターpBluescript SK-(Stratagene Cloning Systems)のHincII切断部位に両方向にクローニングした。一方向性の欠失を導入するために、これらのハイブリッドプラスミドをKpnIおよびXhoIで消化し、使用した「Erase-a-base」キット(Promega Corporation)の説明書に記載されたようにエキソヌクレアーゼIIIで処理した。得られたDNA 断片をベクターpBL-CAT6の唯一のBamHI切断部位にBamHI断片として挿入した。
エキソヌクレアーゼIII消化を始める前に、ベクターpBluescript SK-を、後の遺伝子クローニング実験を容易にするために適当な制限切断部位を含むアダプターを挿入することによって修飾しても良い。このように、BamHIに加えて他の制限酵素切断部位もクローニング目的に使用できる。たとえば、以下のように計画できる。
5'欠失断片
トランスフェクションの前日に2x105の細胞を20cm2シャーレにまいた。細胞を、10μgのプラスミドDNA(CATレポーター構築物)および500ng のプラスミドpCMVtklacZによって、修正リン酸カルシウム法(Chen & Okayama,1987)を用いてトランスフェクションした。対照ベクターであるpCMVtklacZのβ-ガラクトシダーゼ活性をトランスフェクション効率の決定に用いた。37℃かつ5%CO2で4時間のインキュベーション後、過剰なDNA沈殿物をPBSで洗浄して除去した。
48時間のインキュベーション後、細胞を先ずPBS で洗浄した。次に1mlの氷冷却NTE 緩衝液(0.1M Nacl、10mM Tris-HCl pH7.8、1mM EDTA)を各シャーレに加え、スクレーパーを用いて細胞をシャーレから剥し、エッペンドルフ管に移した。9000rpm 3分間の遠心で細胞をペレット化し70μlの0.25MTris-HCl pH7.8に再懸濁して−70℃に保存した。各細胞懸濁液の30μlを、スレイ(Sleigh)の方法(Sleigh,1986)に従ってクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性を決定するために用いた。各トランスフェクションのCAT相対活性を、ノートンとコフィン(Norton & Coffin)の方法(Norton & Coffin,1985 )を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性に基づいて標準化した。細胞懸濁液の10μlをこのテストのために用いた。どの場合でも、使用したタンパク質量に関して修正を行った。タンパク質の濃度はブラッドフォード法(Ausubel et al.,1987)によって決定した。
図8のヒストグラムは4つの独立なトランジェント発現実験の結果を示す。CAT 遺伝子発現が構成的なウイルスプロモーターによって制御されるプラスミドを対照として用いた。pBL-CAT5では、このプロモーターはヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼプロモーターである。pCMVtkCAT ではこのプロモーターはヒトサイトメガロウイルスとの組み合わせであり、pKSSV2CAT ではSV40プロモーターである。pBLCAT6 は負の対照として用いられ、プロモーターを持たないCAT 遺伝子をもつ。
156bp断片を例外として、プロモーターを持たないCATレポーター遺伝子の前に5'-3'方向にクローニングされたUb/S27a 断片はヘルペス単純ウイルスのtkプロモーターの2.5倍から3倍高い、強いプロモーター活性を示した(図8)。
pKSSSV2CATのSV40プロモーターに匹敵する、最も強いプロモーター活性は、483bpおよび272bp断片によって示された。pCMVtkCAT中のCMV-エンハンサー/tk-プロモーターの組み合わせのみが、およそ10%高いCAT活性を生じさせた。-45位置まで欠失が拡大すると(156bp 断片)、この欠失は唯一のSp1結合部位を含むが、もはやCAT活性は検出されなかった(図8)。強いプロモーター活性を与えるに充分なUb/S27a 5'非翻訳領域は、このようにして272bp 断片の5'端である-161bpから156bp 断片の5'端である-45 の領域に限定することができる。唯一のSp1 結合部位も117bpからなるこの領域中に位置する。
予期しなかった結果のひとつは、より短い断片も3'-5'方向でプロモーター活性を示したことである(図8)。実は、負鎖にあるこのプロモーター活性はUb/S27aプロモーターほど強くなく、42%まで下がっている。ここでもまた、483bp断片および272bp断片は最大の活性を示した。この活性はpBL-CAT5中のtkプロモーターに匹敵した。これまでに、この負鎖のプロモーターによってその発現が制御されている関連遺伝子を同定することはできていない。従って、上述した117bp プロモーター領域は双方向性プロモーター領域かもしれない。
要約すると、本発明の発明者らによって初めて単離されたCHO細胞のUb/S27a-プロモーターはハムスターの非常に強い構成的同種プロモーターを提供するということができる。ステーブルトランスフェクションされた血清-培養CHO細胞を調べると、Ub/S27aプロモーターは細胞のゲノムに組み込まれた後でも非常に活性があり、CATレポーター遺伝子の非常に強い発現を保証することが分かる。
同様に、Ub/S27a プロモーター領域の種々の断片を含むCATレポーター構築物をBHK-21細胞(ATCC CCL 10)に導入し、トランスフェクタントのCAT活性を測定した。図9は、本発明のプロモーター配列によってBHK細胞においても非常に高い発現率を達成することができることを示す。
ステーブルトランスフェクタントを以下のようにして調製した。トランスフェクションの前日に200,000個の細胞を20cm2シャーレにまいた。細胞を修正リン酸カルシウム沈殿法(Chen & Okayama,1987)を用いて10μgのプラスミド-DNA(CATレポーター構築物)と500ngのプラスミドpSV2pac(Vara et al.,1986)でトランスフェクトした。プラスミドpSV2pacはピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ(pac)をコードする遺伝子をもち、従ってタンパク質の生合成を阻害する抗生物質に対する耐性を与える。37℃、5%CO2で4時間のインキュベーション後PBSで洗浄することによって過剰なDNA沈殿物を除去した。さらに24時間後10μg/mlのピューロマイシンを添加することによりトランスフェクタントの選抜を開始した。2日又は3日ごとに培地をピューロマイシンを含む培地と交換した。選抜したトランスフェクタントを希釈クローニングすることにより単一細胞クローンを得た。図10−12は、pCMVtkCAT cl.6(クローン6、pCMVtkCAT-トランスフェクションされた最も高いCAT 活性をもつクローン)に対する、ステーブルトランスフェクタントの種々のクローンのCAT発現率を示す。
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- 配列番号2記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子。
- 配列番号1記載の配列を有する核酸分子、または、配列番号1記載の配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子であって、前記ストリンジェントな条件が、4xSSC、10xデンハルト溶液、0.l% SSC、65℃のハイブリダイゼーションおよび0.2xSSC、0.1%SDS中20分間の洗浄を含む、前記核酸分子、である請求項1記載の核酸分子。
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EP0496453A1 (en) | Human glut4 gene promoter |
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