JP2006000120A - 遺伝子発現を調節しうる新規な化学組成を有する核酸分子 - Google Patents

Abstract

【課題】 遺伝子発現の調節に有用な新規な核酸分子を提供すること。
【解決手段】 （ａ）標的ＲＮＡまたはその一部のヌクレオチド配列に相補的な１４−２４ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列；
（ｂ）二本鎖核酸分子の一方の鎖上の５’−キャップ，３’−キャップ，または５’−キャップと３’−キャップとの両方；および
（ｃ）修飾されたヌクレオチドおよび修飾されていないヌクレオチドの混合物，ここで，修飾されたヌクレオチドは２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’Ｈまたはこれらの組み合わせであり，修飾されていないヌクレオチドはリボヌクレオチドである，
を含む化学的に合成された二本鎖核酸分子が開示される。
【選択図】なし

Description

本出願は，"ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ ＷＩＴＨ ＮＯＶＥＬ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＣＡＰＡＢＬＥ ＯＦ ＭＯＤＵＬＡＴＩＮＧ ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ"と題する出願（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／０８２，４０４，１９９８年４月２０日に米国特許商標庁に出願）に関連する。先の出願は，発明者としてＴｈｏｍｐｓｏｎらを記載している。

発明の背景
本発明は，種々のメカニズムにより遺伝子発現を調節しうる，新規な化学的に修飾した核酸分子に関する。より詳細には，本発明は，オリゴヌクレオチド中の，ヌクレアーゼ耐性，結合親和性，および／または抗力を増強する化学修飾の新規な組み合わせに関する。

以下は関連する技術の議論であり，これらのいずれも本発明に対する先行技術であると認めるものではない。

遺伝子発現，特に核酸に基づく転写および翻訳のメカニズムの発見以来，種々の目的で，例えば生物学，遺伝子機能，疾患プロセスを理解するため，および新規な治療の標的を同定するため，これらのプロセスを遮断または変更することに多大な努力が払われてきた。遺伝子発現を調節するための，核酸分子を含むアプローチが近年普及してきた。例えば，ワトソン−クリック塩基対形成相互作用により特定のｍＲＮＡ配列に結合して翻訳を妨害することができる核酸分子が設計されてきた（Ｃｒｏｏｋｅ，１９９６，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１６，３１９−３４４）。別のアプローチは，ＤＮＡをトリプレックス形成オリゴヌクレオチドと複合体形成させて，結合したＤＮＡ配列の転写を防止し，このことにより遺伝子発現を阻害することを含む（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３７，２２９９−２３０４）。アンチセンスオリゴヌクレオチド，２−５Ａアンチセンスキメラ，またはリボザイムと標的ＲＮＡとの相互作用が，遺伝子発現を妨害するために用いられてきた。これらの核酸分子はすべて，それがマッチする標的配列に高度に特異的であり，したがって，化学療法等の伝統的アプローチと比較して低い毒性を示すであろう。

遺伝子発現の調節のためにオリゴヌクレオチドを用いることは，一般に，生物学的系に存在するヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを安定化させることを必要とする。核酸分子がその所望の標的に到達する前に分解されれば，細胞での効力が得られるであろう。核酸分子の化学修飾が，それらを細胞性ヌクレアーゼによる分解を受けにくくするために有利であることが見いだされている。Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ，１９９０，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０，５４３，は，アンチセンスオリゴヌクレオチドを安定化するためのヌクレオシド修飾の使用を概説している。安定性の改良に加えて，化学修飾はまた，結合親和性を増加させ，細胞への侵入を改良し，標的特異性を増強することが見いだされている（Ｍｏｎｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４５１４−１４５２２；Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，１９９４，ＢｉｏＰｈａｎｎ，２２−３３）。

最も研究され利用されているオリゴヌクレオチドの化学的変更の１つは，ホスホロチオエート等の主鎖修飾である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは，酸素原子の代わりにイオウ原子で置換することによりホスホジエステル結合が修飾されている核酸分子である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは，ヌクレアーゼ耐性の増加に加えて，リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）の基質である（Ｍｏｎｉａ，（上掲）；Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１１１２，５９９−６０８）。ＲＮａｓｅＨは，ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロデュープレックス中のＲＮＡの分解を触媒するエンドヌクレアーゼである（Ｈｏｓｔｏｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮＹ，３４１−３７６）。自然には，ＤＮＡ複製の間にオカザキフラグメントと称されるＲＮＡ／ＤＮＡヘテロデュープレックスが形成される。したがって，ＲＮａｓｅＨの通常の機能は，ヘテロデュープレックス中のＲＮＡ部分を分解して，ＤＮＡ複製を完了させることである。Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨを用いる実験においては，ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは，標準的なホスホジエステル含有オリゴヌクレオチドと比較して，酵素をより効率的に（２−５倍）活性化した（Ｃｒｏｏｋｅ，１９９５，（上掲））。

ＤＮＡのＲＮＡへの結合は，ＲＮＡとＲＮＡとの相互作用ほど熱力学的に有利ではない（Ａｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｈｉｍｉａ ５０，１６８−１７６）。ＩｎｏｅおよびＯｈｔｓｕｋａ（１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１５，６１３１）は，２'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド領域によりフランキングされたオリゴデオキシヌクレオチドからなる中心領域を有するオリゴヌクレオチドを最初に提唱した。そのようなキメラ分子中のオリゴデオキシヌクレオチドの領域は，標的ＲＮＡと結合したときにＲＮａｓｅＨにより認識され，ＲＮａｓｅＨにより標的ＲＮＡが切断される（Ｉｎｏｅ＆Ｏｈｔｓｕｋａ，１９８７，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５，３２７；Ｓｈｉｂａｈａｒａ＆Ｍｏｒｉｓａｖａ，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５，４４０３）。そのようなキメラオリゴヌクレオチドは，全ＤＮＡオリゴヌクレオチドよりも安定に標的ＲＮＡと相互作用すると提唱された。

続く開発には，キメラオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性修飾の導入が含まれ，例えば，メチルホスホネート（Ｔｉｄｄ＆Ｇｉｂｓｏｎ，１９８８，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３，１１７），ホスホロチオエート（Ａｇｒａｗａｌ＆Ｐｅｄｅｒｓｏｎ，１９９０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，１４０７），およびホスホルアミデート（Ｐｏｔｔｓ＆Ｒｕｎｙｕｎ，１９９１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８，１５１６）がある。さらに，フランキング配列を２'−Ｏ−メチルおよび２'−Ｆで修飾した（Ｃｏｏｋ，１１９３，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１５０−１８１）。

Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６５２，３５５は，５'および３'末端において少なくとも２つの２'−Ｏ−メチル修飾を有するホスホロチオエート含有核酸分子を記載する。

Ａｇｒａｗａｌ，米国特許５，６５２，３５６は，２つのオリゴデオキシリボヌクレオチド領域の間に位置する２'−Ｏ−置換オリゴヌクレオチドの領域からなるオリゴヌクレオチドを記載する。この核酸分子のＤＮＡ領域は，すべての位置においてホスホロチオエート修飾からなる。

Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６２３，０６５は，ある種の特別に修飾したヌクレオチドによりフランキングされたＲＮａｓｅＨ切断可能領域を含有する核酸分子を，ｒａｓ遺伝子の遺伝子発現の阻害において使用することを記載する。

Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，５８７，３６２は，"実質的にキラル的に純粋な糖間結合"を有する，遺伝子発現を調節するための核酸分子を記載する。

Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，０１３，８３０は，ＤＮＡ領域および２'−Ｏ−メチル修飾領域を有し，遺伝子発現の調節に有用な混合オリゴマーを記載する。

Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，４９１，１３３は，３'−ホスホジエステル結合修飾を有するキメラオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を調節する方法を記載する。

Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，２７６，０１９およびＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，２６４，４２３は，外来核酸の複製を妨害しうる，少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含有する，３２ヌクレオチド以下の長さのオリゴデオキシヌクレオチドの使用を記載する。

Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，２８６，７１７は，オンコジンを阻害しうる，少なくとも１つのホスホロチオエート修飾を含有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを記載する。

Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，３３４，７１１は，２'−Ｏ−Ｒ修飾ハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムを記載し，ここで，Ｒは，アルキル，アルキニルまたはアルケニルである。

Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ ６，８５５は，アンチセンス技術の分野における種々の特許およびＰＣＴ公開を列挙し，議論している。

Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６７８，７３１は，２'−Ｏ−Ｒ修飾オリゴヌクレオチドを記載し，ここで，Ｒは，アルキル，アルキニルまたはアルケニルである。

Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６５２，０９４は，核酸類似体またはデオキシリボヌクレオチドを含有する酵素的核酸分子を記載する。

Ｊｏｙｃｅ，国際公開ＷＯ９６／１７０８６は，ＲＮＡを切断しうるＤＮＡ酵素を記載する。

Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，１４４，０１９は，デオキシリボヌクレオチドで修飾した結合アームおよびステムＩｌ領域を有するキメラハンマーヘッドリボザイムを記載する。

核酸に結合しうる，非ヌクレオチドを含む分子が考案されている。これらのペプチド核酸（ＰＮＡ）分子は，ワトソン−クリック塩基対形成により結合し，これもアンチセンスメカニズムを介して機能しうる。これらの分子を用いて，標的ＲＮＡの構造を変更し，切断部位のアクセス可能性を増加させることにより，ハンマーヘッドリボザイムの活性を増大させている（Ｊａｎｋｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５，２６９０−２６９３）。

発明の概要
本発明は，遺伝子発現の調節に有用な新規な核酸分子に関する。本発明の核酸分子は，当該技術分野において知られる他の核酸分子とは異なるものである。詳細には，本発明の核酸分子は，化学修飾の新規な組み合わせを有し，ＲＮＡまたはＤＮＡに結合して遺伝子発現の調節をすることができる。これらの化学修飾の新規な組み合わせを用いて，アンチセンスオリゴヌクレオチド，トリプレックス形成オリゴヌクレオチド，２−５Ａアンチセンスキメラ，および酵素的核酸分子を形成することができる。

好ましい態様においては，本発明は，以下の式を有する核酸分子を特徴とする：式Ｉ：

式ＩＩ：

式ＩＩＩ：

好ましい態様においては，本発明は以下の式を有する酵素的核酸分子を特徴とする：式ＩＶ：

式Ｖ：

式ＶＩ：

式ＶＩＩ：

上述の式（Ｉ−ＶＩＩ）のそれぞれにおいて，Ｘは，独立して，同一であっても異なっていてもよいヌクレオチドを表し；ｍおよびｏは，独立して，４以上の整数であり，好ましくは約１００より小さく，より好ましくは５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１５または２０であり；ｒは，４以上の整数，より好ましくは５，６，７，１０，１５または２０であり；核酸分子は，対称（ｍ＝Ｏ）であっても非対称（ｍ Ｏ）でもよく；（Ｘ）ｍ，（Ｘ）ｏ，および（Ｘ）ｑは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり（標的は，ＲＮＡ，ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ混合ポリマーでありうる）；Ｙは，独立して，同一であっても異なっていてもよいデオキシリボヌクレオチドを表し；ｎは，４以上の整数，好ましくは５，６，７，８，９，１０，１１または１２であり；Ｚは，標的配列の切断を容易にすることができるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを表し；ｐは４以上１００未満の長さであり，好ましくは５，１０−２０，特に２５−５５，特に３０−４５，より好ましくは３５−５０であり；ｑは，０以上の整数，好ましくは１，２，３，４，５，６，７，８，１０，１５，２０であり； は，化学結合（例えば，リン酸エステル結合，アミド結合または当該技術分野において知られる他の結合）を表し；各（Ｘ）ｍ，（Ｘ）ｏ，（Ｘ）ｒ，（Ｘ）ｑ，および／または（Ｙ）ｎは，独立して，ホスホロチオエート結合を含み，より好ましくは，各（Ｘ）ｍ，（Ｘ）ｏ，（Ｘ）ｒ，（Ｘ）ｑ，および／または（Ｙ）ｎは，独立して，少なくとも１つのホスホジエステル結合および１つのホスホロチオエート結合を含み；各ＣおよびＣ'は，独立して，キャップ構造を表し，これは独立して存在してもしなくてもよく；（Ｚ）ｐは任意にホスホロチオエート結合を含有していてもよい。式Ｉ−ＶＩＩのそれぞれのヌクレオチドは，当該技術分野において知られるように，糖，塩基，および／またはホスフェートにおいて修飾されていてもされていなくてもよい。

好ましくは，各Ｘは，独立して，同一であっても異なっていてもよいヌクレオチドを表し；ここでｍおよびｏは，独立して，５以上の整数であり；（Ｘ）ｍおよび（Ｘ）ｏは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；各（Ｘ）ｒは，独立して，少なくとも１つのホスホジエステル結合および１つのホスホロチオエート結合を含み；Ｙは，独立して，同一であっても異なっていてもよいデオキシリボヌクレオチドを表し；（Ｙ）ｎは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；ｎは，４以上の整数であり；各（Ｘ）ｍ，および（Ｘ）ｏは，独立して，少なくとも１つのホスホジエステル結合および１つのホスホロチオエート結合を含み；（Ｙ）ｎは，ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合または５'−Ｓ−ホスホロチオエート，または５'−Ｓ−ホスホロジチオエート，または３'−Ｓ−ホスホロチオエートまたは３'−Ｓ−ホスホロジチオエート結合またはこれらの混合物を含み，各ＣおよびＣ'は，独立して，キャップ構造を表し，これは独立して存在してもしなくてもよい。

本明細書において用いる場合，"ヌクレオチド"とは，当該技術分野において認識されているように，天然の塩基（標準），および当該技術分野においてよく知られる修飾塩基を含む。そのような塩基は，一般に糖成分の１'位に位置する。ヌクレオチドは一般に，塩基，糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは，糖，リン酸および／または塩基成分において修飾されていてもされていなくてもよい（また，ヌクレオチド類似体，修飾ヌクレオチド，非天然ヌクレオチド，非標準ヌクレオチド等として，互換的に称される，例えば，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，（上掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｕｓｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ（上掲）（すべて本明細書の一部としてここに引用する）を参照）。当該技術分野において知られる修飾核酸塩基のいくつかの例があり，最近その概要がまとめられている（Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ １９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３）。酵素的核酸中に導入しうる塩基修飾の非限定的な例としては，イノシン，プリン，ピリジン−４−オン，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメトキシベンゼン，３−メチルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミノフェニル，５−アルキルシチジン（例えば，５−メチルシチジン），５−アルキルウリジン（例えば，リボチミジン），５−ハロウリジン（例えば，５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば６−メチルウリジン），プロピンおよびその他のもの（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０，Ｕｓｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ（上掲））が挙げられる。この観点において，"修飾塩基"とは，１'位に存在する，アデニン，グアニン，シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基，またはその同等物を意味する。そのような塩基は，酵素的核酸分子の触媒コア中でおよび／または核酸分子の基質結合領域中で用いることができる。

"非修飾ヌクレオチド"とは，β−Ｄ−リボ−フラノースの１'炭素に結合した，アデニン，シトシン，グアニン，チミン，ウラシルのいずれかの塩基を有するヌクレオチドを意味する。

"修飾ヌクレオチド"とは，非修飾ヌクレオチドの塩基，糖および／またはリン酸の化学構造中に修飾を含むヌクレオチドを意味する。

"十分な長さ"とは，４以上のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを意味する。

"安定して相互作用する"とは，オリゴヌクレオチドと標的核酸との相互作用（例えば，生理学的条件下で標的中の相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することにより）を意味する。相互作用は，単独で，または適用しうる場合には（Ｙ）ｎおよび（Ｚ）ｐとともに，安定である。

"キメラ核酸分子"または"キメラオリゴヌクレオチド"とは，分子が修飾されたおよび修飾されていないＤＮＡまたはＲＮＡの両方から構成されていてもよいことを意味する。

"キャップ構造"とは，オリゴヌクレオチドの末端に組み込まれた化学修飾を意味する。これらの末端修飾は，核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し，細胞中における輸送および／または局在化を助けることができる。

別の好ましい態様においては，（Ｘ）ｍ，（Ｘ）ｏ，（Ｘ）ｑ，（Ｙ）ｎおよび／または（Ｚ）ｐは，独立して，２'−Ｏ−アルキル（例えば，２'−Ｏ−アリル；Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．，（上掲））；２'−Ｏ−アルキルチオアルキル（例えば，２'−Ｏ−メチルチオメチル；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １６，９５５−９５８）；Ｌ−ヌクレオチド（Ｔａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４９９；Ａｓｈｌｅｙ，１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，９７３１；Ｋｌｕｂｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４，１１１２）；２'−Ｃ−アルキル（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２）；１−５−アンヒドロヘキシトール；２，６−ジアミノプリン（Ｓｔｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３，１３８２４−１３８３５）；２'−（Ｎ−アラニル）アミノ−２'−デオキシヌクレオチド；２'−（Ｎ−ベータ−アラニル）アミノ；２'−デオキシ−２'−（リシル）アミノ；２'−Ｏ−アミノ（Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９，１１３１）；２'−デオキシ−２'−（Ｎ−ヒスチジル）アミノ；５−メチル（Ｓｔｒｏｂｅｌ，（上掲））；２'−（Ｎ−ｂ−カルボキシアミジン−ベータ−アラニル）アミノ；２'−デオキシ−２'−（Ｎ−ベータ−アラニル）（Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｒｎｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５，２７２１−２７２４）；キシロフラノシル（Ｒｏｓｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ，７４，７４８；Ｓｅｅｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ，７７，８８３；Ｓｅｅｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＨｅｌｖｅｌｉｃａＣｈｅｍ．Ａｃｔａ，７９，１４５１）を含む群より選択される修飾を含む。

好ましい態様においては，本発明は，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの核酸分子を特徴とし，ここで，各Ｘおよび／またはＺは，独立して，式ＩＸを有するヌクレオチド修飾を含む：

式中，各Ｂは，独立して，修飾されたまたは修飾されていない核酸塩基であり；Ｒ１は，独立して，フルオロアルキルまたはアルキルチオフルオロアルキルであり；Ｅは，独立して，リン含有基であり；Ｄは，独立して，Ｏ，ブロッキング基またはリン含有基である。

別の好ましい態様においては，本発明は，式Ｉ−ＶＩＩのいずれかの核酸分子を特徴とし，ここで，各Ｘおよび／またはＺは，独立して，式Ｘを有するヌクレオチド修飾を含む：

式中，各Ｂは，独立して，修飾されたまたは修飾されていない核酸塩基であり；Ｒ１は，独立して，アルキル，アルキルチオアルキル，フルオロアルキルまたはアルキルチオフルオロアルキルであり；Ｅは，独立して，リン含有基であり；Ｄは，独立して，Ｏ，ブロッキング基またはリン含有基である。

"アルキル"基とは，飽和脂肪族炭化水素を表し，直鎖，分枝鎖およびシクロアルキル基を含む。好ましくは，アルキル基は，１−１２個の炭素を含む。より好ましくは，これは１−７個の炭素，より好ましくは１−４個の炭素の低級アルキルである。アルキル基は，置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合には，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ₂またはＮ（ＣＨ₃）₂，アミノ，またはＳＨである。この用語はまた，少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む不飽和炭化水素基であるアルケニル基を含み，直鎖，分枝鎖および環状基を含む。好ましくは，アルケニル基は１−１２個の炭素を含む。より好ましくは，これは１−７個の炭素，より好ましくは１−４個の炭素の低級アルケニルである。アルケニル基は，置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合には，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ₂，ハロゲン，Ｎ（ＣＨ₃）₂，アミノ，またはＳＨである。"アルキル"との用語はまた，少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む不飽和炭化水素基を有するアルキニル基を含み，直鎖，分枝鎖および環状基を含む。好ましくは，アルキニル基は，１−１２個の炭素を含む。より好ましくは，これは１−７個の炭素，より好ましくは１−４個の炭素の低級アルキニルである。アルキニル基は，置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合には，置換基は，好ましくは，ヒドロキシル，シアノ，アルコキシ，＝Ｏ，＝Ｓ，ＮＯ₂またはＮ（ＣＨ₃）₂，アミノまたはＳＨである。

このようなアルキル基はまた，アリール，アルキルアリール，炭素環式アリール，ヘテロ環式アリール，アミドおよびエステル基を含んでいてもよい。"アリール"基は，共役パイ電子系を有する少なくとも１つの環を有する芳香族基を表し，炭素環式アリール，ヘテロ環式アリールおよびビアリール基が含まれる。これらはすべて，任意に置換されていてもよい。アリール基の好ましい置換基は，ハロゲン，トリハロメチル，ヒドロキシ，ＳＨ，ＯＨ，シアノ，アルコキシ，アルキル，アルケニル，アルキニル，およびアミノ基である。"アルキルアリール"基は，アリール基（上述したとおり）に共有結合したアルキル基（上述したとおり）を表す。炭素環式アリール基は，芳香族環上の環原子がすべて炭素原子である基である。炭素原子は，任意に置換されていてもよい。ヘテロ環式アリール基は，芳香族環において環原子として１−３個のヘテロ原子を有し，環原子の残りが炭素原子である基である。適当なヘテロ原子としては，酸素，イオウおよび窒素が挙げられ，フラニル，チエニル，ピリジル，ピロリル，Ｎ−低級アルキルピロロ，ピリミジル，ピラジニル，イミダゾリル等が含まれる。これらはすべて置換されていてもよい。"アミド"とは，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ（式中，Ｒはアルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素のいずれかである）を表す。"エステル"とは，−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ'（式中，Ｒ'は，アルキル，アリール，アルキルアリールまたは水素のいずれかである）を表す。

"ブロッキング基"とは，ポリヌクレオチド合成の後に除去することができる，および／または固相ポリヌクレオチド合成に適合しうる基である。

"リン含有基"は，ジチオエート，ホスホルアミダイトの形で，および／またはオリゴヌクレオチドの一部として，リンを含むことができる。

さらに別の好ましい態様においては，Ｃ'は，反転脱塩基残基，４'，５'−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド，４'−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３'，４'−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，３'−３'−反転ヌクレオチド部分；３'−３'反転脱塩基部分；３'−２'−反転ヌクレオチド部分；３'−２'−反転脱塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３'−ホスホルアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３'−ホスフェート；３'−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋または非架橋のメチルホスホネート部分（詳細については，Ｂｅｉｇｅｌｒｎａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９７／２６２７０を参照；本明細書の一部としてここに引用する）からなる群より選択される。

さらに別の好ましい態様においては，Ｃは，４'，５'−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４'−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；５'−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート，３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド−ホスホロジチオエート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３'，４'−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５'−５'−反転ヌクレオチド部分；５'−５'−反転脱塩基部分；５'−ホスホルアミデート；５'−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５'−アミノ；架橋および／または非架橋５'−ホスホルアミデート，ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート，架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５'−メルカプト部分（詳細については，Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９，１９２５を参照；本明細書の一部としてここに引用する）からなる群より選択される。

別の好ましい態様においては，（Ｚ）ｐは，非ヌクレオチドリンカーを含む。すなわち，好ましい態様においては，本発明は，１またはそれ以上の非ヌクレオチド部分を有し，ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を切断する酵素的活性を有する酵素的核酸分子を特徴とする。"非ヌクレオチド"との用語は，１またはそれ以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖中に組み込むことができ，糖および／またはホスフェート置換のいずれかを含み，残りの塩基がその酵素的活性を示すことを可能とする任意の基または化合物を意味する。この基または化合物は，脱塩基，すなわち，一般に認識されているヌクレオチド塩基，例えばアデノシン，グアニン，シトシン，ウラシルまたはチミンを含まなくてもよい。本明細書において用いる場合，"脱塩基"または"脱塩基ヌクレオチド"との用語は，塩基を欠失しているかまたは１'位に塩基の代わりに他の化学基を有する糖部分を包含する。

"酵素的核酸"との句は，種々の反応を触媒しうる（その速度および／または率を変更しうる）核酸分子を意味し，これには，他の別の核酸分子をヌクレオチド塩基配列特異的様式で繰り返し切断する能力（エンドヌクレアーゼ活性）が含まれる。そのようなエンドヌクレアーゼ活性を有する分子は，基質結合領域（例えば，式ＩＶ−ＶＩＩにおける（Ｘ）ｍ，（Ｘ）ｏ，（Ｘ）ｑおよび（Ｙ）ｎにおいて特定の遺伝子標的に対する相補性を有し，かつその標的中のＲＮＡまたはＤＮＡを特異的に切断する酵素的活性を有する。すなわち，エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子は，分子内または分子間でＲＮＡまたはＤＮＡを切断することができ，このことにより標的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を不活性化することができる。この相補性は，酵素的ＲＮＡ分子が標的ＲＮＡまたはＤＮＡに十分にハイブリダイズしうるよう機能し，切断が生ずることを可能とする。１００％の相補性が好ましいが，５０−７５％程度の低い相補性でも本発明においては有用である。核酸は，塩基，糖，および／またはホスフェート基で修飾されていてもよい。酵素的核酸との用語は，リボザイム，触媒的ＲＮＡ，酵素的ＲＮＡ，触媒的ＤＮＡ，ヌクレオザイム，ＤＮＡザイム，ＲＮＡ酵素，エンドリボヌクレアーゼ，エンドヌクレアーゼ，ミニザイム，リードザイム，オリゴザイム，キメラリボザイム，キメラ酵素的核酸，またはＤＮＡ酵素等の用語と互換的に用いられる。これらの用語はすべて，酵素的活性を有する核酸分子を記述する。

"相補性"とは，伝統的なワトソン−クリックまたは他の非伝統的なタイプ（例えばフーグスティーンタイプ）の塩基対形成相互作用により，他のＲＮＡ配列と水素結合を形成しうる核酸を意味する。

本明細書において用いる場合，"オリゴヌクレオチド"とは，２以上のヌクレオチドを含む分子を意味する。

"酵素的部分"とは，酵素的核酸分子の，核酸基質の切断に必須の部分を意味する。

"基質結合領域"または"基質結合ドメイン"とは，核酸分子（例えばリボザイム）の，その基質の部分に相補的な（すなわち，それと塩基対を形成しうる）部分／領域を意味する。一般に，そのような相補性は１００％であるが，所望の場合にはより低くてもよい。例えば，１４塩基中の１０塩基程度でも塩基対形成しうる。そのようなアームは，一般的に図１および３に示される。すなわち，リボザイムの例においては，これらのアームは，リボザイムと標的ＲＮＡとを相補的塩基対形成により一緒にすることが意図される配列をリボザイム中に含む。本発明のリボザイムは，連続するまたは連続しない結合アームを有していてもよく，種々の長さのものでありうる。結合アームの長さは，好ましくは，４ヌクレオチド以上；特に１２−１００ヌクレオチド；より好ましくは１４−２４ヌクレオチドの長さである。２つの結合アームが選択される場合，結合アームの長さが対称的（すなわち，各結合アームが同じ長さ；例えば，５ヌクレオチドと５ヌクレオチド，６ヌクレオチドと６ヌクレオチドまたは７ヌクレオチドと７ヌクレオチドの長さ）または非対称的（すなわち，結合アームが異なる長さ；例えば，６ヌクレオチドと３ヌクレオチド；３ヌクレオチドと６ヌクレオチド長；４ヌクレオチドと５ヌクレオチド長；４ヌクレオチドと６ヌクレオチド長；４ヌクレオチドと７ヌクレオチド長等）であるように設計することができる。

"ＤＮＡザイム"または"触媒的ＤＮＡ"または"ＤＮＡ酵素"とは，２'−ＯＨ基を欠失した酵素的核酸分子を意味する。

本明細書において用いる場合，"核酸分子"とは，ヌクレオチドを含む分子を意味する。核酸は，修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドまたは非ヌクレオチドまたはそれらの種々の混合物および組み合わせから構成されることができる。

別の好ましい態様においては，本発明の核酸分子を他の部分とコンジュゲートさせることができる。これらには，脱塩基ヌクレオチド，ポリエーテル，ポリアミン，ポリアミド，ペプチド，炭水化物，脂質，またはポリ炭化水素化合物が含まれるが，これらに限定されない。当業者は，これらの分子が，核酸分子を構成する１またはそれ以上の任意のヌクレオチドに，糖，塩基またはホスフェート基上のいくつかの位置で結合していてもよいことを認識するであろう。

さらに別の好ましい態様においては，本発明の核酸分子は，アンチセンス，トリプレックス，２−５Ａキメラアンチセンス，または酵素的核酸（リボザイム）の構造を形成することができるが，これらに限定されない。

"アンチセンス"とは，例えば，ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＰＮＡ（蛋白質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６５，５６６）相互作用により標的ＲＮＡに結合し，標的ＲＮＡの活性を変化させる非酵素的核酸分子を意味する（総説として，Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ，１９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１００４を参照）。

"２−５Ａアンチセンスキメラ"とは，５'ホスホリル化２'−５'−結合アデニレート残基を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。これらのキメラは，配列特異的様式で標的ＲＮＡに結合して，細胞性２−５Ａ−依存性リボヌクレアーゼを活性化し，次にこれは標的ＲＮＡを切断する（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｍａｄ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，１３００）。

"トリプレックスＤＮＡ"とは，配列特異的様式で二重鎖ＤＮＡに結合して，三重鎖ヘリックスを形成しうるオリゴヌクレオチドを意味する。三重ヘリックス形成は，標的とする遺伝子の転写を阻害することが示されている（Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｍａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，５０４）。

別の好ましい態様においては，本発明は，標的ＲＮＡと相互作用して翻訳を立体的に妨害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを特徴とする。ここで，オリゴヌクレオチドは，５'および３'キャップ構造を有し，オリゴヌクレオチドは，塩基，糖またはホスフェート基に修飾を含んでいてもよい。

本発明の他の特徴および利点は，以下の好ましい態様の説明および特許請求の範囲から明らかであろう。

好ましい態様の説明
最初に図面を簡単に説明する。

図面
図１は，９塩基の非デオキシリボヌクレオチド含有オリゴヌクレオチドによりフランキングされた７−９塩基のホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド配列を有する核酸分子の，標的分子への結合の図式的描写である。

図２は，本発明の核酸分子中に組み込むことができるある種の化学構造の概略図を示す。

図３は，７つの異なる種類の酵素的核酸分子の二次構造モデルを示す。矢印は切断の部位を示す。−−−−−−−−−は標的配列を示す。点が散在する線は，三次相互作用を示す。−は塩基対形成相互作用を示す。グループＩイントロン：Ｐ１−Ｐ９．０は種々のステム−ループ構造を表す（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏ．，１，２７３）。ＲＮａｓｅ Ｐ（Ｍ１ＲＮＡ）：ＥＧＳは外部ガイド配列を表す（Ｆｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，７８３；Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，３５８７）。グループＩＩイントロン：５'ＳＳは５'スプライシング部位を意味する；３'ＳＳは３'−スプライシング部位を意味する；ＩＢＳはイントロン結合部位を意味する；ＥＢＳはエクソン結合部位を意味する（Ｐｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，２７１６）。ＶＳ ＲＮＡ：Ｉ−ＶＩは，６つのステム−ループ構造を示す；陰領域は三次相互作用を意味する（Ｃｏｌｌｉｎｓ，国際公開ＷＯ９６／１９５７７）。ＨＤＶリボザイム：Ｉ−ＩＶは４つのステム−ループ構造を示す（Ｂｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６２５，０４７）。ハンマーヘッドリボザイム：Ｉ−ＩＩＩは，３つのステム−ループ構造を示す；ステムＩ−ＩＩＩは，任意の長さであってよく，対称でも非対称でもよい（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．，１，５２７）。ヘアピンリボザイム：ヘリックス１，４および５は任意の長さでありうる；ヘリックス２は３−８塩基対の長さである；Ｙはピリミジンである；ヘリックス２（Ｈ２）は少なくとも４塩基対で与えられ（すなわち，ｎは１，２，３または４），ヘリックス５は任意に２塩基またはそれ以上の長さでありうる（好ましくは３−２０塩基，すなわち，ｍは１−２０またはそれ以上）。ヘリックス２およびヘリックス５は，１またはそれ以上の塩基により共有結合していてもよい（すなわち，ｒは１塩基以上）。ヘリックス１，４または５はまた，リボザイム構造を安定化するために，２塩基対またはそれ以上長くてもよく（すなわち４−２０塩基対），好ましくは蛋白質結合部位である。それぞれの例において，各ＮおよびＮ'は，独立して，任意の正常または修飾塩基であり，各ダッシュは潜在的塩基対相互作用を表す。これらのヌクレオチドは，糖，塩基またはリン酸で修飾されていてもよい。ヘリックス中では完全な塩基対形成は必要ではないが，好ましい。ヘリックス１および４は，ある程度の塩基対形成が保持される限り，任意のサイズでありうる（すなわち，ｏおよびｐは，それぞれ独立して，０から任意の数，例えば２０である）。必須塩基は，構造中に特定の塩基として示されるが，当業者は，１またはそれ以上が化学的に修飾（脱塩基，塩基，糖および／またはリン酸修飾）されていてもよく，または著しい影響なしで他の塩基で置き換えられていてもよいことを認識するであろう。ヘリックス４は，２つの別々の分子から，すなわち接続ループなしで形成してもよい。接続ループは，存在する場合，その塩基，糖またはリン酸に修飾を有するかまたは有しないリボヌクレオチドである。ｑは２塩基以上である。接続ループはまた，非ヌクレオチドリンカー分子で置き換えられていてもよい。Ｈは塩基Ａ，Ｕ，またはＣを表す。Ｙはピリミジン塩基を表す。" "は，共有結合を表す（Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，１２９；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６３１，３５９）。

図４は，ＧＳＶトランスフェクション試薬とともに輸送された，エストロゲンレセプターを標的とするミスマッチアームを有する活性および不活性リボザイムで処理したＭＣＦ−７細胞の細胞増殖速度を比較したグラフである。活性なリボザイムの配列は，配列番号２７２５として与えられ，不活性な配列は２７２６として与えられる。

図５は，アンチセンス（配列番号２７１７）およびスクランブルアンチセンス（ミスマッチ）対照で処理した後の，ＰＣ−３細胞におけるｃ−ｒａｆ ＲＮＡのＲＮＡレベルを比較したグラフである。

図６ａおよび６ｂは，オリゴデオキシリボヌクレオチドを含有するいくつかの可能なリボザイムを示す。図中で用いられる記号：Ｎ'は，標的分子中のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを表す；Ｎ７は，リボザイム分子中の７位を表す（Ｈｅｒｔｅｌ，Ｋ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，３２５２）；Ｎ'は，標的分子中のヌクレオチドに相補的なデオキシリボヌクレオチドを表す；ｓは，ホスホロチオエート修飾を表す；Ｃは，リボザイムの５'末端における化学修飾を表す；Ｃ'は，３'末端における化学修飾を表す。

図７は，オリゴヌクレオチド中に組み込むためのヌクレオチド修飾の例を示す。

図８は，ｃ−ｒａｆ配列を標的とするアンチセンス核酸分子で処理した後の，ＰＣ−３細胞におけるｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。アンチセンス分子は，イントロン／エクソン接合部（配列番号２７３１−２７３５），イントロン（配列番号２７３６）およびエクソン（配列番号２７３７）中の領域を標的とする。結果は，２種類の濃度で，非処理またはミスマッチ対照と比較したときの，ｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡを阻害する分子の能力を示す。

図９は，配列番号２７３８（すべてのデオキシヌクレオチド位置でホスホロチオエート修飾）で示されるアンチセンス分子が，３つの異なる濃度で，５日間で，ＰＣ−３細胞においてｃ−ｒａｆメッセージを阻害する能力を，未処理およびミスマッチ対照と比較して示すグラフである。

図１０は，配列番号２７３７（オリゴヌクレオチドの５'末端および３'末端の両方における３つのホスホロチオエート修飾ヌクレオチド）で示されるアンチセンス分子が，３つの異なる濃度で，５日間で，ＰＣ−３細胞においてｃ−ｒａｆメッセージを阻害する能力を，未処理対照と比較して示すグラフである。

図１１は，配列番号２７４４（５'末端および３'末端で７塩基の２'−Ｏ−メチルチオメチルＲＮＡヌクレオチドによりフランキングされた９塩基のホスホロチオエート修飾ＤＮＡ）で示されるアンチセンス分子が，３つの異なる濃度で，５日間で，ＰＣ−３細胞においてｃ−ｒａｆメッセージを阻害する能力を，未処理およびミスマッチ対照と比較して示すグラフである。

図１２は，配列番号２７３８および２７４１で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチドが示す細胞増殖の阻害のレベルを示すグラフである。グラフにはまた，細胞をミスマッチ対照（配列番号２７３９）で処理した後の細胞増殖も示される。

図１３は，種々の化学修飾を有するオリゴヌクレオチドがｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡを阻害する能力を示すグラフである。各アンチセンス分子は，未処理およびミスマッチ対照と比較されている。

図１４は，アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号２７４１および２７３８）で処理した後の，ＰＣ−３細胞におけるＣ−ｒａｆの用量依存的阻害を示すグラフである。

図１５は，アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの阻害を未処理およびミスマッチ対照と比較して示すグラフである。

図１６は，ｋ−ｒａｓを標的とするいくつかのアンチセンス分子がｋ−ｒａｓメッセージを阻害する能力を示すグラフである。

図１７は，種々の化学修飾を有するオリゴヌクレオチドがエストロゲンレセプターｍＲＮＡを阻害する能力を示すグラフである。各アンチセンス分子は，未処理およびミスマッチ対照と比較されている。

図１８は，３'−デオキシ−３'−チオグアノシンヌクレオシドの合成のスキームを示す（スキーム１）。

図１９は，Ｓ−（ピリジル−２−ジスルファニル）誘導体の合成のスキームを示す（スキーム２）。

図２０は，３'−デオキシ−３'−チオグアノシンホスホルアミダイトの合成のスキームを示す。

図２１は，５'−チオ−ヌクレオシドホスホルアミダイトおよびスクシネートの製造のスキームを示す。

図２２は，３'−チオ−２'−Ｏ−メチルウリジンの合成のスキームを示す。

核酸分子の合成
１００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は，自動化方法を用いては困難であり，そのような分子の治療的コストは非常に高くなる。本発明においては，小さい核酸モチーフ（例えば，アンチセンスオリゴヌクレオチド，ハンマーヘッドまたはヘアピンリボザイム）が外的輸送に用いられる。これらの分子は構造が簡単であるため，核酸がＲＮＡ構造の標的領域に進入する能力が高い。本発明の分子は化学的に合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチドは，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９（本明細書の一部としてここに引用する）により記載される標準的プロトコルを用いて合成した。

ある種の酵素的核酸分子等の通常のＲＮＡについて用いられる合成の方法は，Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４に記載される方法にしたがい，慣用の核酸保護基およびカップリング基，例えば，５'末端にジメトキシトリチル，および３'−末端にホスホルアミダイトを用いた。非限定的例においては，３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機で，改変した２．５μｍｏｌスケールのプロトコルを用いて，アルキルシリル保護ヌクレオチドについては５分間のカップリング工程を，２'−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程を行い，小スケールの合成を行った。表ＩＩは，合成サイクルにおいて用いた試薬の量および接触時間の概要を示す。各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５'−ヒドロキシルに対して６．５倍過剰（１６３μＬの０．１Ｍ＝１６．３μｍｏｌ）のホスホルアミダイトおよび２４倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（２３８μＬの０．２５Ｍ＝５９．５μｍｏｌ）を用いた。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分の比色定量により決定して，９７．５−９９％であった。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中２％ＴＣＡ（ＡＢＩ）；キャッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）；酸化溶液は，１６．９ｍＭ Ｉ₂，４９ｍＭピリジン，ＴＨＦ中９％水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。Ｂ＆Ｊ合成等級アセトニトリルは，試薬瓶から直接用いた。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成した。

ＲＮＡの脱保護は以下のように実施した。ポリマー結合オリゴリボヌクレオチド（トリチルオフ）を合成カラムから４ｍＬガラスねじ蓋バイアルに移し，メチルアミン（ＭＡ）の溶液中に６５℃で１０分間懸濁した。−２０℃に冷却した後，上清をポリマー支持体から除去した。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ₂Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清に加えた。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を得た。

塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ・ＨＦ／ＮＭＰ溶液（２５０μL溶液，１．５ｍＬ Ｎ−メチルピロリジノン，７５０μL ＴＥＡおよび１．０ｍＬ ＴＥＡ・３ＨＦから１．４Ｍ ＨＦ濃度を得る）に再懸濁し，６５℃に１．５時間加熱した。得られた完全に脱保護したオリゴマーを，５０ｍＭ ＴＥＡＢ（９ｍＬ）で急冷し，次にアニオン交換脱塩に供した。

脱保護オリゴマーのアニオン交換脱塩のためには，５０ｍＭ ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）であらかじめ洗浄したＱｉａｇｅｎ５００（登録商標）アニオン交換カートリッジ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）にＴＥＡＢ溶液を負荷した。負荷したカートリッジを５０ｍＭ ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）で洗浄した後，２Ｍ ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）でＲＮＡを溶出し，乾燥して白色粉末とした。

Ｇ５をＵで，およびＡ１４をＵで置換することにより，不活性なハンマーヘッドリボザイムを合成した（番号付けは，Ｈｅｒｔｅｌ，Ｋ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．，１９９２， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，３２５２による）。

平均段階カップリング収率は，＞９８％（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）であった。

あるいは，本発明の核酸分子は，別々に合成してライゲーションにより一緒に結合させることもできる（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／２３５６９；Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９，４２４７）。

核酸分子の投与
核酸分子の輸送の方法は，Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２，１３９；およびＤｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５に記載されており，これらの両方とも本明細書の一部としてここに引用する。Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５はさらに，酵素的ＲＮＡ分子を輸送するための一般的な方法を記載する。これらのプロトコルを利用して，事実上いかなる核酸分子をも輸送することができる。核酸分子は当業者に知られる種々の方法によって細胞に投与することができ，これにはリポソームへの封入，イオントホレシス，または他のベヒクル，例えば，ヒドロゲル，シクロデキストリン，生分解性ナノカプセル，および生体接着性小球体への組み込みが含まれるが，これらに限定されない。ある適応症に対しては，核酸分子をエクスビボで，上記ビヒクルを用いてまたは用いずに，細胞または組織に直接輸送することができる。あるいは，核酸／ビヒクルの組み合わせを，直接注入により，またはカテーテル，注入ポンプもしくはステントを用いることにより局所的に輸送する。他の輸送経路には，静脈内，筋肉内，皮下または関節注射，エアロゾル吸入，経口（錠剤またはピル形態），局所，全身，眼，腹腔内および／またはくも膜下腔内輸送が含まれるが，これらに限定されない。核酸の輸送および投与のより詳細な説明はＳｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）およびＤｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９に提供されており，これらを本明細書の一部としてここに引用する。

本発明の分子は医薬として用いることができる。医薬は患者の疾病状態を予防し，発症を阻害し，またはそれを治療する（症状をある程度，好ましくは全ての症状を緩和する）。

本発明の負に荷電したポリヌクレオチド（例えば，ＲＮＡ，ＤＮＡまたは蛋白質）は，医薬組成物を形成するために安定化剤，緩衝剤等を用いて，または用いることなく，任意の標準的手段により患者に投与および導入することができる。リポソーム輸送メカニズムを用いることが望ましい場合，リポソームの形成のための標準的プロトコルに従うことができる。本発明の組成物はまた，経口投与用の錠剤，カプセルまたはエリキシル；直腸投与用の座剤；無菌溶液；注射投与用の懸濁液等として，処方して用いることもできる。

本発明はまた，記載される化合物の薬学的に許容しうる処方を含む。これらの処方には，上述の化合物の塩，例えば，酸付加塩（例えば，塩酸，シュウ酸，酢酸およびベンゼンスルホン酸の塩）が含まれる。

医薬組成物または処方は，細胞または患者への投与（例えば全身投与），好ましくはヒトへの投与に適当な形態の組成物または処方を表す。適当な形態は，部分的には，使用する投与経路（例えば経口，経皮，または注射）に依存する。そのような形態は，組成物または処方が標的細胞（すなわち，負に荷電したポリマーが輸送されることが望まれる細胞）に到達することを妨害してはならない。例えば，血流中に注入される医薬組成物は可溶性でなければならない。他の因子は当該技術分野において知られており，例えば，毒性，および組成物または処方がその効果を発揮することを妨害する形態等を考慮することが含まれる。

"全身投与"とは，インビボでの全身吸収，または血流中における薬剤の蓄積の後に全身に分配されることを意味する。全身的吸収をもたらす投与経路には，静脈内，皮下，腹腔内，吸入，経口，肺内および筋肉内が含まれるが，これらに限定されない。これらの投与経路のそれぞれは，所望の負に荷電したポリマー（例えば核酸）をアクセス可能な疾病組織に暴露する。薬剤が循環中に入る速度は，分子量またはサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリポソームまたは他の薬剤担体を使用することにより，薬剤を，例えば，あるタイプの組織（例えば網状内皮系（ＲＥＳ）の組織）に局在化させることができる。薬剤と細胞（例えば白血球およびマクロファージ）の表面との会合を容易にすることができるリポソーム処方もまた有用である。この方法は，マクロファージおよび白血球による異常な細胞（例えば癌細胞）の免疫認識の特異性を利用することにより，薬剤の標的細胞への輸送を増強するであろう。

本発明はまた，ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ−修飾，または長期間循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含む，表面修飾リポソームを含む組成物の使用を特徴とする。これらの処方は，標的組織における薬剤の蓄積を増加させる方法を提供する。この種類の薬剤担体は，単核食細胞システム（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および排除に抵抗性であり，したがって，封入された薬剤の血流循環時間を長くし，組織への暴露を増強する（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。そのようなリポソームは，おそらくは脈管新生標的組織における溢出および捕獲のため，腫瘍中に選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，２６７，１２７５−１２７６；Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期間循環リポソームは，特に，ＭＰＳの組織で蓄積することが知られている慣用のカチオン性リポソームと比べて，ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態学および薬力学を増強する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９２；これらをすべて本明細書の一部としてここに引用する）。長期間循環リポソームはまた，代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織（例えば肝臓および脾臓）における蓄積を回避する能力に基づいて，カチオン性リポソームと比較して，ヌクレアーゼ分解から薬剤をより高い程度で保護するであろう。これらの参考文献はすべて本明細書の一部としてここに引用する。

本発明はまた，薬学的に有効量の所望の化合物を薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む，保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用いるための許容しうる担体または希釈剤は，医薬の技術分野においてよく知られており，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編 １９８５）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。例えば，保存剤，安定剤，染料，および風味剤を用いることができる（同上，１４４９）。これらには，安息香酸ナトリウム，ソルビン酸，およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに，抗酸化剤および懸濁剤を用いてもよい（同上）。

薬学的に有効な用量とは，疾病状態の予防，発症の阻害または治療（症状をある程度緩和し，好ましくはすべての症状を緩和する）に必要な用量である。薬学的に有効な用量は，疾病の種類，用いる組成物，投与の経路，治療する哺乳動物の種類，考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性，同時投与される薬剤，および医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に，負に荷電したポリマーの効力に依存して，０．１ｍｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の活性成分を投与する。

本発明の核酸分子の作用のメカニズム
アンチセンス：アンチセンス分子は，ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドであることができ，主として，マッチした配列に特異的に結合することにより機能して，ペプチド合成を阻害する（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，Ｎｏｖ １９９４，ＢｉｏＰｈａｒｍ，２０−３３）。オリゴヌクレオチドは，ワトソン−クリック塩基対形成により標的ＲＮＡに結合し，結合した配列のリボソーム翻訳を防止することにより遺伝子発現を妨害する。アンチセンス分子はまた，ＲＮＡのプロセシングまたは核から細胞質への輸送を妨害することにより，蛋白質の合成を変化させることができる（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ＆Ｒｏｔｈ，１９９６，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅｉｓ ７，１５１−１９０）。

さらに，一本鎖ＤＮＡのＲＮＡへの結合により，ヘテロデュープレックスのヌクレアーゼ分解が生ずるであろう（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，（上掲）；Ｃｒｏｏｋｅ，（上掲））。これまで，ＲＮａｓｅＨの基質として作用するであろう主鎖修飾ＤＮＡ化学は，ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートのみである。Ｅ．ｃｏｌｉを用いる実験においては，ホスホロチオエート修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドは，天然のホスホジエステル含有オリゴデオキシヌクレオチドと比較してより効率的に（２−５倍）ＲＮａｓｅＨを活性化する（Ｃｒｏｏｋｅ，１９９５，（上掲））。本出願人は，本明細書において初めて，５'−チオホスフェート修飾を有するオリゴヌクレオチドがＲＮＡのＲＮａｓｅＨ切断を活性化しうることを記載する。

トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）：一本鎖ＤＮＡを，配列特異的様式でゲノムＤＮＡに結合するように設計することができる。ＴＦＯは，ピリミジンリッチオリゴヌクレオチドから構成され，フーグスティーン塩基対形成によりＤＮＡヘリックスに結合する（Ｗｕ−Ｐｏｎｇ，（上掲））。得られる，ＤＮＡセンス，ＤＮＡアンチセンス，およびＴＦＯからなる三重ヘリックスは，ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成を中断させる。結合は非可逆性であるため，ＴＦＯメカニズムにより，遺伝子発現または細胞死が生ずるであろう（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ＆Ｒｏｔｈ，（上掲））。

２−５Ａアンチセンスキメラ：２−５Ａシステムは，高等脊椎動物において見いだされる，ＲＮＡ分解のインターフェロン媒介性メカニズムである（Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３，６７８０−６７８５）。ＲＮＡ切断には，２種類の酵素，すなわち２−５ＡシンターゼとＲＮａｓｅＬが必要である。２−５Ａシンターゼは，二本鎖ＲＮＡを要求して，２'−５'オリゴアデニレート（２−５Ａ）を形成する。次に，２−５Ａは，アロステリックエフェクターとして作用して，一本鎖ＲＮＡを切断する能力を有するＲＮａｓｅＬを利用する。二本鎖ＲＮＡとともに２−５Ａ構造を形成する能力は，この系をウイルス複製の阻害に特に有用なものにしている。

（２'−５'）オリゴアデニレート構造は，アンチセンス分子と共有結合して，ＲＮＡを切断しうるキメラオリゴヌクレオチドを形成することができる（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，（上掲））。これらの分子が２−５Ａ依存性ＲＮａｓｅに結合してこれを活性化し，次にオリゴヌクレオチド／酵素複合体が標的ＲＮＡ分子に結合し，次にこれがＲＮａｓｅ酵素により切断されると推定されている。

酵素的核酸：これまでに，天然に生ずる酵素的ＲＮＡの７つの基本的変種が知られている。さらに，いくつかのインビトロ選択（進化）戦略（Ｏｒｇｅｌ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ２０５，４３５）を用いて，ホスホジエステル結合の切断およびライゲーションを触媒しうる新たな核酸触媒が発展してきた（Ｊｏｙｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｅ，８２，８３−８７；Ｂｅａｕｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，６３５−６４１；Ｊｏｙｃｅ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６７，９０−９７；Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＴＩＢＴＥＣＨ １２，２６８；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９３，ＴＩＢＳ １７，８９−９３；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋｅｒ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４，４２６２；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＲＮＡ ３，９１４；Ｎａｋａｍａｙｅ＆Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９４，（上掲）；Ｌｏｎｇ＆Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９９４，（上掲）；Ｉｓｈｉｚａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，（上掲）；Ｖａｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６，６４９５；（これらのすべてを本明細書の一部としてここに引用する）。それぞれは，生理学的条件下で，ホスホジエステル結合をトランスで加水分解することを含む一連の反応を触媒することができる（したがって，他のＲＮＡ分子を切断しうる）。表Ｉは，これらのリボザイムのいくつかの特性をまとめたものである。一般に，酵素的核酸は，最初に標的ＲＮＡに結合することにより作用する。そのような結合は，標的ＲＮＡを切断する作用をする分子の酵素的部分に近接して保持された，酵素的核酸の標的結合部分により生ずる。すなわち，酵素的核酸は，まず標的ＲＮＡを認識し，次に相補的塩基対形成によりこれに結合し，いったん正しい部位に結合したら，酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は，コードされる蛋白質の合成を指示するその能力を破壊するであろう。酵素的核酸は，そのＲＮＡ標的を結合し切断した後，そのＲＮＡから離れて別の標的を探し，新たな標的に繰り返し結合して切断することができる。

リボザイムの酵素的性質は，治療を行うのに必要なリボザイムの濃度が低いため，他の技術より有利である。この利点は，リボザイムが酵素的に作用する能力を反映している。すなわち，１つのリボザイム分子が多くの標的ＲＮＡ分子を切断することができる。さらに，リボザイムは，高度に特異的な阻害剤であり，その阻害の特異性は，標的ＲＮＡへの結合の塩基対形成メカニズムのみならず，標的ＲＮＡ切断のメカニズムにも依存する。切断の部位の近くにおける１つのミスマッチまたは塩基置換を選択して，リボザイムの触媒活性を完全に排除することができる。

エンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸分子は，ヌクレオチド塩基配列に特異的な様式で他の別のＲＮＡ分子を繰り返し切断することができる。そのような酵素的核酸分子は，事実上すべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができ，インビトロで有効な切断を達成することができる（Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，３２４，Ｎａｔｕｒｅ ４２９ １９８６；Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８７ Ｎａｔｕｒｅ ３２８，５９６；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，８４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７８８，１９８７；Ｄｒｅｙｆｕｓ，１９８８，Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．，６，９２；Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，３３４ Ｎａｔｕｒｅ ５８５，１９８８；Ｃｅｃｈ，２６０ ＪＡＭＡ ３０３０，１９８８；Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３７１，１９８９；Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７（上掲））。

その配列特異性のため，トランス切断リボザイムは，ヒトの疾病の治療剤として有望である（Ｕｓｍａｎ＆ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，１９９５ Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｍａｒｒ，１９９５ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２０２３−２０３７）。リボザイムは，細胞性ＲＮＡのバックグラウンド中で特定のＲＮＡ標的を切断するよう設計することができる。そのような切断事象は，ＲＮＡを非機能性にし，そのＲＮＡからの蛋白質発現を排除する。このようにして，疾病状態に関連する蛋白質の合成が選択的に阻害される。

リボザイム活性の最適化
本発明に記載されるリボザイムの触媒活性は，Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，（上掲）に記載のように最適化することができる。詳細はここでは繰り返さないが，例えば，リボザイム結合アームの長さの変更，または血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぎ，および／またはその酵素的活性を増強する修飾（塩基，糖および／またはリン酸）を有するリボザイムの化学的合成が挙げられる（例えば，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９１／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１；およびＢｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照；これらはすべて酵素的ＲＮＡ分子の塩基，リン酸および／または糖成分になしうる種々の化学修飾を記載する）。細胞中におけるその抗力を増強する修飾，およびＲＮＡ合成時間を短縮し化学物質の必要性を減少するためにステムループ構造から塩基を除去することが望ましい（これらの刊行物のすべてを本明細書の一部としてここに引用する）。

当該技術分野には，触媒活性に有意に影響することなくそのヌクレアーゼ安定性および効力を有意に増強することができる，酵素的核酸分子に導入することができる糖，塩基およびリン酸修飾を記述するいくつかの例がある。リボザイムは，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２'−アミノ，２'−Ｃ−アリル，２'−フルオロ，２'−Ｏ−メチル，２'−Ｈ，ヌクレオチド塩基修飾で修飾することにより，安定性を高め，および／または触媒活性を増強するために修飾する（総説については，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２ ＴＩＴＢＳ １７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１４０９０を参照）。酵素的核酸分子の糖修飾は，当該技術分野において広く記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．国際公開ＷＯ９３／１５１８７；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許５，３３４，７１１およびＢｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２を参照，これらの参考文献はすべて，その全体を本明細書の一部としてここに引用する）。このような文献は，触媒活性を阻害することなく，糖，塩基および／またはリン酸修飾等をリボザイム中に組み込む位置を決定する一般的方法および戦略を記載しており，本明細書の一部としてここに引用する。これらの教示に基づいて，同様の修飾を本明細書に記載されるように用いて，本発明の核酸触媒を修飾することができる。

酵素的活性を維持または増強する化学的修飾を有する核酸触媒が提供される。そのような核酸はまた，一般に，非修飾核酸よりヌクレアーゼに対して耐性が高い。すなわち，細胞においておよび／またはインビボで，活性は有意に低下しないであろう。本明細書に例示されるように，そのようなリボザイムは，たとえ全体的活性が１０倍低下しても，細胞においておよび／またはインビボで有用である（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）。そのようなリボザイムは，本明細書において，全ＲＮＡリボザイムの酵素的活性を"維持する"と称される。

外的に輸送された治療用リボザイムは，最適には，望ましくない蛋白質のレベルが低下するのに十分長い間標的ＲＮＡの翻訳が阻害されるまで，細胞中で安定でなければならない。この期間は，疾病の状態により，数時間から数日まで様々であろう。明らかに，リボザイムは，有効な細胞内治療剤として機能するためには，ヌクレアーゼに耐性でなければならない。ＲＮＡの化学合成の改良（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７；本明細書の一部としてここに引用する）は，ヌクレオチド修飾を導入して，上述のように，そのヌクレアーゼ安定性を増強することにより，リボザイムを修飾する能力を拡大した。

"増強された酵素的活性"とは，活性が触媒的活性とリボザイム安定性の両方を反映している，細胞および／またはインビボで測定された活性を含むことを意味する。本発明においては，インビボで，全ＲＮＡリボザイムと比較して，これらの特性の積が増加しているかまたは著しく減少していない（１０倍未満）。

さらに別の好ましい態様においては，化学修飾を有し，酵素的活性が維持されるか増強されている核酸触媒が提供される。そのような核酸はまた，一般にヌクレアーゼに対して未修飾核酸より耐性が高い。すなわち，細胞および／またはインビボにおいて，活性は著しく低下しない。本明細書に例示されるように，そのようなリボザイムは，たとえ全体の活性が１０倍低下していても，細胞および／またはインビボで有用である（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）。そのようなリボザイムは，本明細書において，全ＲＮＡリボザイムの酵素的活性を"維持する"と言われる。

エストロゲンレセプター遺伝子発現の阻害
乳癌は，女性の死亡の主要な原因の１つである（Ｊｉａｎｇ ａｎｄ Ｊｏｒｄａｎ，１９９２，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８４，５８０−５９１）。最近の数十年間，乳癌における細胞増殖のホルモン性制御の分子メカニズムを理解するために多くの努力が払われてきた。多くの乳癌および子宮内膜癌は，その成長および進行がエストロゲンに依存性であることが示されている（Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４８，３２５−３３６）。エストロゲンレセプターは，これらの癌において中枢の役割を果たし，したがって，この遺伝子の発現を制御することは，研究者および臨床医にとって非常に興味深い。エストロゲンレセプターは，リガンド結合依存性転写因子としてその生物学的機能を示すステロイドホルモンレセプター遺伝子ファミリーのメンバーである。タモキシフェンは，乳癌のすべての段階を治療する非ステロイド性抗エストロゲンであり，乳癌にかかりやすい者において予防用化合物として使用することができる（Ｊｏｒｄａｎ ａｎｄ Ｍｕｒｐｈｙ，１９９０，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１１；５７８−６１０）。

ほとんどの乳癌腫瘍は，初期には成長がエストロゲン依存性であり，エストロゲンレセプターは，内分泌応答，乳癌からの予後および生存の鍵となる指標であった。ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株は，高レベルのエストロゲンレセプターを発現しており，添加されたエストロゲンの影響に感受性である（Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５７，２０３−２１３；Ｐｉｎｋ ａｎｄ Ｊｏｒｄａｎ，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６，２３２１−２３３０）。これらは乳癌におけるエストロゲンレセプターの制御の影響を研究する上で優れたモデル系である。リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは，エストロゲンレセプターメッセージのレベルに影響を与える直接的な手段である。エストロゲン依存性細胞株においては，エストロゲンレセプター転写産物の量の低下は，エストロゲンレセプター蛋白質の全体の量を低下させ，これらの細胞の増殖を妨害するはずである。脳の性分化に及ぼすエストロゲンレセプターの影響が，アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて実験されている（ＭｃＣａｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３，４３３−４３９）。本発明は，エストロゲンレセプターＲＮＡレベルおよびＭＣＦ−７細胞の増殖に及ぼすリボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響を証明する。

エストロゲンレセプターは，本発明の核酸分子等の核酸分子を用いて阻害することができる。他の文献は，アンチセンス分子を用いてエストロゲンレセプターＲＮＡをダウンレギュレートすることを記載する（Ｄｅｆａｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．８，９０３−９１１；Ｓａｎｔａｇａｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１，９３８−９４９；Ｗｉｌｌｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｇｅｎｅ １４９，２１−２４；Ｊｉａｎｇ＆Ｊｏｒｄａｎ，（上掲））。

核酸分子は，化学的に合成し，上述の方法を用いて輸送することができ，あるいは，細胞中で真核生物プロモーターから発現させることもできる（例えば，Ｉｚａｎｔ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙ ａｎｄ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２ＪＶｉｒｏｌ，６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１ＪＶｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｑｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５；すべての参考文献の全内容を本明細書の一部としてここに引用する）。当業者は，真核生物細胞中で適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから任意の核酸を発現させうることを理解するであろう。そのような核酸の活性は，リボザイムにより一次転写産物からそれらを放出させることにより増強することができる（Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴＷＯ９３／２３５６９，Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ，ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５；Ｏｈｋａｗａ ｅｔ ａｌ，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａ ｅｔ ａｌ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ ｅｔ ａｌ，１９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ ｅｔ ａｌ，１９９４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５８５６；すべての参考文献の全内容を本明細書の一部としてここに引用する）。

リボザイムとして知られる，標的分子を切断することができるある種の核酸分子は，ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される（例えばＣｏｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。組換えベクターは，好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。リボザイムを発現するウイルスベクターは，アデノ関連ウイルス，レトロウイルス，アデノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築することができるが，これらに限定されない。好ましくは，リボザイムを発現しうる組換えベクターは，上述のように輸送され，標的細胞中に残留する。あるいは，リボザイムの過渡的発現を与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは，必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，リボザイムは標的ｍＲＮＡを切断する。活性なリボザイムは，実施例に記載されるものと同等の酵素的中心またはコア，および標的部位における切断が生ずるように標的核酸分子に結合しうる結合アームを含む。そのような切断を妨害しない他の配列が存在していてもよい。リボザイムを発現するベクターの輸送は，全身的（例えば，静脈内または筋肉内投与により），患者から外植された標的細胞に投与した後，患者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれかの手段により行うことができる（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。

本発明の１つの観点においては，本発明の核酸触媒の少なくとも１つをコードする核酸配列を含む発現ベクターが開示される。本発明の核酸触媒をコードする核酸配列は，その核酸分子の発現を可能とする様式で動作可能なように連結されている。

本発明の別の観点においては，発現ベクターは，転写開始領域（例えば真核生物ｐｏｌ Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの開始領域）；ｂ）転写終止領域（例えば真核生物ｐｏｌ Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの終止領域）；ｃ）本発明の核酸触媒の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている。ベクターは，任意に，本発明の核酸触媒をコードする遺伝子の５'側または３'側に動作可能なように連結された蛋白質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；および／またはイントロン（介在配列）を含んでいてもよい。

リボザイム配列の転写は，真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ），ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ），またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）のプロモーターにより推進される。ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからの転写産物は，すべての細胞において高いレベルで発現されるであろう。所定の細胞タイプ中における所定のｐｏｌ ＩＩプロモーターのレベルは，近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー，サイレンサー等）の性質に依存するであろう。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞中で発現される限り，原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた用いられる（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８７，６７４３−７；Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ １９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９９３ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。何人かの研究者が，そのようなプロモーターから発現したリボザイムが哺乳動物細胞中で機能しうることを示している（例えば，Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４；Ｌ'Ｈｕｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ．１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ＆Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より詳細には，転写ユニット，例えばＵ６小核（ｓｎＲＮＡ），転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびアデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものは，細胞中において高濃度の所望のＲＮＡ分子（例えばリボザイム）を生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）；Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，６２４，８０３；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４，４５；Ｂｅｉｃｒｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１８７３６；（これらのすべての刊行物を本明細書の一部としてここに引用する）。上述のリボザイム転写ユニットは，哺乳動物細胞中に導入するために種々のベクター中に組み込むことができる。ベクターとしては，プラスミドＤＮＡベクター，ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイルスまたはアデノ関連ウイルスベクター），またはウイルスＲＮＡベクター（例えばレトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）が挙げられるが，これらに限定されない（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）を参照）。

本発明のさらに別の観点は，本発明の触媒的核酸分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を，その核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクターを特徴とする。１つの態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み；前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている。別の好ましい態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）オープンリーディングフレーム；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３'−末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている。さらに別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イントロン；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み；前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記イントロンおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている。別の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；ｅ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３'−末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記イントロン，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている。

標的の確認
薬剤発見における最も難しい課題の１つは，治療標的の選択である。歴史的には，伝統的な生化学および他の研究は，この点に関してほとんど情報を提供してこなかった。しかし，ゲノミクスの最近の進歩は，治療標的を同定する速度および確実性の両方に大変革をもたらす可能性を提供する。ヒトゲノム中の遺伝子の特性決定の進歩は非常に早く，現在，ヒトゲノム中の遺伝子の全相補物が今世紀末までには配列決定されるであろうと予測されている。しかし，この大量の情報は，道路地図なしで科学の世界に到来しつつある。純粋な遺伝子配列情報をヒトの疾患におけるその役割の機能的理解に変換することは，はるかに困難な問題であることが証明されつつある。ある一群の遺伝子が特定の疾患と関連づけられた後であっても，いずれの遺伝子が治療標的として用いるのに適当であるかを確認するプロセスは，しばしば遅く，コストを要する。ゲノミクスの事業を行っているほとんどの会社は，現在，無数の部分配列または全配列にアクセスすることができるが，これらの配列のいずれが適当な治療標的であるかを決定する適切な技術を有していない。その結果，特定の疾患の原因物質であると明確に同定された遺伝子はわずかしかない。

本発明の核酸分子は，目的とする遺伝子に対応するｍＲＮＡに結合しその切断を引き起こし，このことにより遺伝子産物の産生を妨害することにより，遺伝子発現を高度に特異的様式で阻害することができる（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１９９７，２，４８３−４８４）。適当な輸送ベヒクル（例えば，ポリマー，カチオン性脂質，リポソーム等）をこれらの核酸分子と組み合わせて，上述したように，適当な培養細胞またはインビボで動物疾患モデルに輸送することができる。遺伝子発現の阻害および表現型の結果との関連性をモニターすることにより，特定の遺伝子配列の疾患病理学における相対的重要度を評価することができる。このプロセスは，高速かつ高度に選択的であるため，生物の発生の任意の時点において用いることができる。これらの核酸分子の新規な化学組成により，さらに高い安定性を得ることができ，したがって，増加した効力を得ることができるであろう。

実施例
以下は，本発明の核酸分子の有用性を示す非限定的例である。当業者は，ある実験条件，例えば温度，反応時間，培地条件，トランスフェクション試薬およびＲＮＡアッセイは，限定を意味するものではなく，プロトコルを著しく変更することなく容易に改変しうることを理解するであろう。

実施例１：潜在的核酸分子結合部位の同定
標的ＲＮＡの配列を，コンピュータ折り畳みアルゴリズムを用いてアクセス可能部位についてスクリーニングした。二次折り畳み構造を形成しないｍＲＮＡの領域を同定した。リボザイム部位については，二次構造を形成せず，潜在的ハンマーヘッドおよび／またはヘアピン切断部位を含むｍＲＮＡの領域を同定した。

実施例２：エストロゲン−レセプターＲＮＡ中のリボザイム切断部位の選択
コンピュータに基づくＲＮＡ折り畳みアルゴリズムにより推定された部位がエストロゲンレセプターのアクセス可能部位に対応するか否かを試験するために，Ｇｅｎｂａｎｋ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＨＳＥＲＲＩ（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２０，１３４−１３９）のゲノム配列を分析し，折り畳みに基づいて部位に優先順位をつけることにより，リボザイム標的部位を選択した。各標的（図３を参照）に結合することができるようにリボザイムを設計し，コンピュータ折り畳みにより別々に分析して（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｔｈｅｏｃｈｅｍ，３１１，２７３；Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７７０６），リボザイム配列が適当な二次構造に折り畳まれるか否かを評価した。結合アームと触媒コアとの間に望ましくない分子内相互作用を有するリボザイムは考慮から除外した。以下に記載するように，種々の結合アームの長さを選択して活性を最適化することができる。一般に，少なくとも各アーム上の５塩基が，標的ＲＮＡに結合するかさもなくばこれと相互作用することができる。ハンマーヘッド（配列番号１−１２４５）およびヘアピンリボザイム（２４９１−２６０３）は，それぞれ表ＩＶおよびＶに挙げられる。

実施例３：核酸分子を用いるｃ−ｒａｆ ＲＮＡ標的の阻害
前立腺癌細胞（ＰＣ−３）を，Ｋａｉｇｈｎ'ｓ Ｆ−１２Ｋ培地，１０％ＦＢＳ，１％グルタミン，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，および１％ペニシリン／ストレプトマイシンからなる成長培地で準コンフルエントの密度まで成長させた。２ｍｇ／ｍＬ保存溶液から４Ｘ濃度（１０μｇ／ｍＬ）のＧＳＶ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を調製し，アンチセンスおよびそのスクランブル（ミスマッチ）対照の１０μＭ溶液も調製した。アンチセンスおよびＧＳＶのチャンネルピペッティングにより，９６ウエルプレート上でアンチセンスとＧＳＴとの複合体を形成させ，最終濃度の２倍濃度の複合体溶液を得た。５０μＬの複合体溶液および５０μLの成長培地（抗生物質なし）をＰＣ−３細胞に加え，２４時間インキュベートした。用いたアンチセンスの最終濃度は，４００，２００，および１００ｎＭであり，ＧＳＶ濃度は２．５μｇ／ｍＬで一定とした。次に，１５０μLのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）でＰＣ−３細胞を回収した。Ｑｉａｇｅｎの指示を用いてＲＮＡを精製し，Ｔａｑｍａｎ試薬および７７００Ｐｒｉｓｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて，製造元のプロトコルにしたがい，ＲＮＡを定量した。ｃ−ｒａｆ ＲＮＡ濃度は，スクランブル対照のｃ−ｒａｆ ＲＮＡ濃度に対して標準化した。アンチセンス配列（配列番号２７１７）およびデータは，表ＩＩＩＡおよび図５に示される。アンチセンス分子は，ＰＣ−３細胞において，いくつかのアンチセンス分子濃度において，ｃ−ｒａｆ ＲＮＡレベルをミスマッチ対照と比較して８０％まで低下させることができた。

実施例４：リボザイムインビトロ切断アッセイ
リボザイムおよび相補的基質を上述のように合成した。これらのリボザイムは，例えば以下の方法を用いてインビトロで切断活性を試験することができる。リボザイム配列は図７に示される。

切断反応：リボザイム切断アッセイのための，完全長または部分的完全長の，内部標識された標的ＲＮＡを，［ａ−³²Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写により調製し，スピンクロマトグラフィーによりＧ５０ Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムを通し，さらに精製することなく基質ＲＮＡとして用いる。あるいは，Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて基質を５'−³²Ｐ−末端標識してもよい。アッセイは，リボザイム切断緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，３７℃，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂）中で２Ｘ濃度の精製リボザイムを予熱することにより実施し，２Ｘリボザイムミックスを，やはり切断緩衝液中で予熱した等量の基質ＲＮＡ（最大１−５ｎＭ）に加えることにより切断反応を開始した。アッセイは，最終濃度１μＭのリボザイム，すなわちリボザイム過剰を用いて，３７℃で１時間行った。等量の９５％ホルムアミド，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレンシアノールを加えることにより反応を停止し，次に試料を９５℃に２分間加熱し，急冷し，変性ポリアクリルアミドゲルに負荷した。基質ＲＮＡおよびリボザイム切断により生成した特異的ＲＮＡ切断生成物は，ゲルのオートラジオグラフィーにより可視化した。切断のパーセントは，ホスファーイメージャー（登録商標）を用いて，無傷の基質と切断生成物を表すバンドを定量することにより決定した。リボザイムは，２時間後，その相補的基質の１−８０．８％を切断することができた（表ＶＩ）。

実施例５：エストロゲンレセプターを標的とするリボザイムを用いる細胞増殖の阻害
ＭＣＦ−７細胞を，Ｔ−７５フラスコで成長培地中で８０％コンフルエントまで成長させた。この培地は，５００ｍＬアルファ−ＭＥＭ，１０ｍＬ １Ｍ Ｈｅｐｅｓ，５ｍＬピルビン酸ナトリウム，５ｍＬ ＮＥＡＡ，５ｍＬ Ｌ−グルタミン，２５０μL ２．０ｍｇ／ｍｌインスリン，５００μLゲンタマイシンおよび１０％ＦＢＳを混合し，滅菌濾過することにより調製した。

リボザイムおよびカチオン性脂質を実施例４に記載したように混合し，最終濃度を２０，４０，および８０ｎＭのリボザイムおよび１μｇ／ｍＬのＧＳＶとした。ＭＣＦ−７細胞は，リボザイム／トランスフェクション試薬複合体に暴露する前に，無血清アルファ−ＭＥＭで２４時間処理した。複合体を細胞に加え，１，２，３，４，および５日間連続的にトランスフェクトさせた。各時点の最後に，培地を細胞から除去し，ＣｙＱｕａｎｔキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて増殖を測定した。インキュベーションの１０分後に４８５ｎｍ（励起）および５３８ｎｍ（放出）で蛍光を測定した。活性なリボザイムによる細胞増殖の阻害を，不活性スクランブルリボザイム対照と比較した。活性なリボザイムの配列は配列番号２７２５として与えられ，不活性スクランブル対照は配列番号２７２６として与えられる。キメラ酵素的核酸は，試験したすべての濃度でＭＣＦ−７の細胞増殖を阻害することができた（図４）。

実施例６：アンチセンス核酸分子を用いるエストロゲンレセプターＲＮＡ標的の阻害
オリゴヌクレオチドの５Ｘ濃縮溶液（１μＭ）およびＧＳＶの１０Ｘ溶液（２５μｇ／ｍＬ）（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を作成した後，複合体を形成させた。５Ｘオリゴヌクレオチド溶液（８μL），１０ＸＧＳＶ溶液（４０μL），およびＯｐｔｉｍｅｍ培地（３２μL）を一緒に混合し，３７℃で１５分間インキュベートした。培地を細胞から吸引除去し，８０μＬの新鮮な成長培地（Ｏｐｔｉｍｅｍ培地，１０％ＦＢＳ，１％非必須アミノ酸，１％ピルビン酸ナトリウム，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１μｇ／ｍＬインスリン）および２０μＬの５Ｘ複合体溶液を加えた。複合体を細胞上に２０時間放置し，次に１５０μＬのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）で回収した。次に，ＲＮＡレベルをＴａｑｍａｎ試薬および７７００Ｐｒｉｓｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて製造元のプロトコルに従って定量した。この細胞輸送アッセイをいくつかのＲＰＩ標的について種々の細胞株において用いた。データは，表ＩＩＩＡに示される。標的ＲＮＡのレベルは，ミスマッチ対照ＲＮＡまたは内部ハウスキーピング遺伝子（例えばアクチン）のいずれかに対して標準化した。配列番号２７１８−２７２３として与えられるアンチセンス核酸分子は，エストロゲンレセプターＲＮＡを種々の程度でノックダウンすることができた。ＲＮＡ阻害のレベルは，アンチセンス配列により異なり，４８−６４％であった。

実施例７：リボザイムを用いるエストロゲンレセプターＲＮＡの阻害
実施例６におけるものと同様のプロトコルを用いて，リボザイムとＧＳＶトランスフェクション試薬とを混合した。標的ＲＮＡは，Ｑｉａｇｅｎキットを用いて精製した。次に，ＲＮＡレベルをＴａｑｍａｎ試薬および７７００Ｐｒｉｓｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて製造元のプロトコルに従って定量した。エストロゲンレセプターに特異的なリボザイムは，配列番号２７２４として与えられ，遺伝子を５０％阻害することができた。

実施例８：アンチセンス核酸分子を用いるｃ−Ｒａｆ ｍＲＮＡおよび細胞増殖の阻害
２４時間ＲＮＡエンドポイントアッセイ：イントロン，エクソン，およびイントロン−エクソン接合部位を標的とするアンチセンス分子がｃ−ｒａｆ ＲＮＡに及ぼす影響を，インビトロ細胞培養アッセイを用いて試験した。種々の化学修飾を有する７種類のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを試験し，結果を未処理対照および各ヌクレオチド位置をホスホロチオエートで修飾したオリゴヌクレオチドと比較した。前立腺癌細胞（ＰＣ−３）を，９６ウエルプレート（ウエルあたり１５，０００細胞）で，Ｋａｉｇｈｎ'ｓ Ｆ−１２Ｋ培地，１０％ＦＢＳ，１％グルタミン，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，および１％ペニシリン／ストレプトマイシンからなる成長培地で成長させた。２４時間輸送実験のためには，２．５ｍｇ／ｍＬのＧＳＶトランスフェクション試薬（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を２００または４００ｎＭのいずれかの濃度のアンチセンス分子と複合体化させた。複合体を細胞上に２４時間放置し，次に細胞を１５０μLのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）で回収した。ＲＮＡレベルは，Ｔａｑｍａｎ試薬および７７００Ｐｒｉｓｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて，製造元のプロトコルにしたがって定量した。Ｃ−ｒａｆ ＲＮＡレベルはアクチン対照に対して標準化した。データは図８に示される。すべての化合物は，ｃ−ｒａｆメッセージを阻害する能力を示した。試験した化合物のうち，配列番号２７３２，２７３６および２７３７は特に有効なようであった。

持続輸送ＲＮＡエンドポイントアッセイ：前立腺癌細胞（ＰＣ−３）を，９６ウエルプレート中（ウエルあたり１５，０００細胞）で，Ｋａｉｇｈｎ'ｓ Ｆ−１２Ｋ培地，１０％ＦＢＳ，１％グルタミン，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，および１％ペニシリン／ストレプトマイシンからなる成長培地中で成長させた。細胞を９６ウエルプレートにウエルあたり２５００細胞で播種し，３７℃でインキュベートした。実施例４に記載されるように，アンチセンス核酸分子（配列番号２７３８，２７３７，２７４４；表ＩＶ）およびＧＳＶトランスフェクション試薬を複合体化させ，アンチセンス分子１００，２００または４００ｎＭおよびＧＳＶトランスフェクション試薬１．０μｇ／ｍＬの最終濃度とした。配列番号２７４４については，同様の塩基組成を有するミスマッチ対照もまた対照として試験した。複合体を細胞上に放置し，１，３，または５日間連続してトランスフェクトさせた。各時点の終わりに，細胞を１５０μLのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）で回収した。ＲＮＡレベルは，Ｔａｑｍａｎ試薬および７７００Ｐｒｉｓｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて製造元のプロトコルにしたがって定量した。配列番号２７３８，２７３７，および２７４４（表ＩＶ）で表される分子によるｃ−ｒａｆ発現の阻害は，それぞれ図９，１０，および１１に示される。これらの３つの分子すべてが，ｃ−ｒａｆ ＲＮＡを未処理対照と比較して６０−９０％減少させる能力を示した。

増殖アッセイ：キメラオリゴヌクレオチドおよび輸送試薬を実施例６に記載されるように混合し，アンチセンスオリゴヌクレオチド２００ｎＭ（配列番号２７３８および２７４１）およびＧＳＶ １μｇ／ｍＬの最終濃度とした。この実験においては，ミスマッチアンチセンス対照もまた試験した（配列番号２７３９）。ＭＣＦ−７細胞を無血清アルファ−ＭＥＭで２４時間処理した後，アンチセンス／トランスフェクション試薬複合体に暴露した。複合体を細胞に加え，１，３，または５日間連続してトランスフェクトさせた。各時点の終わりに，培地を細胞から除去し，増殖をＣｙＱｕａｎｔキット（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を用いて測定した。１０分間インキュベートした後，４８５ｎｍ（励起）および５３８ｎｍ（放出）で蛍光を測定した。活性なオリゴヌクレオチドによる細胞増殖の阻害をスクランブルミスマッチ対照と比較した。ｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス分子は，細胞増殖を５５％まで阻害することができた。

種々の化学修飾：図１３および表ＩＶを参照すると，オリゴヌクレオチド配列を一定にして，アンチセンス分子の化学組成を変化させた。ミスマッチ対照および他のものより短い２つのヌクレオチドである配列番号２７３８および２７３９（表ＩＶ）を除き，すべての配列は同じであった。実施例６に記載されるプロトコルを用いて，アンチセンス分子とＧＳＶトランスフェクション試薬とを混合した。複合体を細胞に加え，２４時間連続的にトランスフェクトさせた。次に細胞を１５０μLのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）で回収した。次に，Ｔａｑｍａｎ試薬および７７００Ｐｒｉｓｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて製造元のプロトコルにしたがってＲＮＡレベルを定量した。すべてのｃ−ｒａｆレベルはアクチンＲＮＡを対照として標準化した。図１３を参照すると，ホスホロチオエート修飾，反転脱塩基キャップ，２'−Ｏ−メチルまたは２'−Ｏ−メチルチオメチル修飾を用いたアンチセンス分子は，ｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡを阻害した。

用量依存的阻害：０，５０，１００，１５０，および２００ｎＭのアンチセンス分子（配列番号２７３８または２７３７）をミスマッチ対照アンチセンス分子と混合して，各サンプルについてアンチセンス／ミスマッチアンチセンス濃度２００ｎＭの最終濃度とした。実施例６に記載されるように，アンチセンス核酸およびＧＳＶを複合体化して，ＧＳＶトランスフェクション試薬濃度を２．５μｇ／ｍＬの最終濃度とした。複合体を細胞に加え，２４時間連続的にトランスフェクトさせた。各時点の終わりに，細胞を１５０μLのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）で回収した。次に，Ｔａｑｍａｎ試薬および７７００Ｐｒｉｓｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて製造元のプロトコルにしたがってＲＮＡレベルを定量した。すべてのｃ−ｒａｆレベルは，アクチンＲＮＡを対照として用いて標準化した。結果（図１４）は，ｃ−ｒａｆが用量依存的様式で阻害されること，および各アンチセンス分子についてＩＣ５０が約３５ｎＭであることを示した。

実施例９：ＢＣＬ−２を標的とするアンチセンス核酸分子で処理したＭＣＦ−７細胞のリボヌクレオチド保護アッセイ
ＭＣＦ−７細胞をＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ，１％ｌ−グルタミン，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）中でウエルあたり１００，０００細胞で２４時間播種した。翌日，細胞を，５．４μＭのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ＬＦＡ）と複合体化した１５０ｎＭのアンチセンス核酸分子（配列番号２７４９−２７５３；表ＶＩＩＩ）で４時間処理した。次に，アンチセンス／ＬＦＡ複合体を吸引除去し，新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地を細胞に加えた。２４時間後，ＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞を回収した。次に，製造元のプロトコルを用いてリボヌクレアーゼ保護アッセイ（Ａｍｂｉｏｎ）を実施して，ＲＮＡレベルを定量し，次に１５０μLのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）で回収した。次に，Ｔａｑｍａｎ試薬および７７００Ｐｒｉｓｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて，製造元のプロトコルにしたがってＲＮＡレベルを定量した。Ｂｃｌ−２ ＲＮＡレベルは，ＧＡＰＤＨ対照に対して標準化し，図１５に示される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，ＭＣＦ−７細胞においてＢｃｌ−２発現を特異的に阻害した。

実施例１０：ＤＬＤ−１細胞におけるｋ−ｒａｓの阻害
ＤＬＤ−１細胞をウエルあたり１０，０００細胞で有する９６ウエルプレートに完全ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ，１％ｌ−グルタミン，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１％ペニシリン／ストレプトマイシン）を加えた。実施例６に記載した方法を用いて，アンチセンス分子（配列番号２７５４−２７５７；表ＶＩＩＩ）をＧＳＶトランスフェクション試薬（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と複合体化させた。細胞に輸送した最終濃度は，２００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび１．２５μｇ／ｍＬのＧＳＶであった。複合体を細胞に２６時間加え，その期間の終わりに，細胞を１５０μLのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）で回収した。次に，Ｔａｑｍａｎ試薬および７７００Ｐｒｉｓｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて製造元のプロトコルにしたがってＲＮＡレベルを定量した。すべてのｋ−ｒａｓレベルは，アクチンＲＮＡを対照として用いて標準化した。データ（図１６）は，アンチセンス分子が，未処理またはミスマッチ対照と比較して，ｋ−ｒａｓ発現を約５０−９０％阻害しうることを示す。

実施例１１：種々の化学組成のアンチセンス分子を用いるエストロゲンレセプターｍＲＮＡの阻害
オリゴヌクレオチド配列を一定に保持して，アンチセンス分子の化学組成を変化させた。ミスマッチ対照（表ＶＩＩ，配列番号２７５９，２７６１，２７６３，２７６５，２７６７，２７６９）を除き，すべての配列（表ＶＩＩ：配列番号２７５８，２７６０，２７６２，２７６４，２７６６，２７６８）は同じであった。アンチセンス分子およびＧＳＶトランスフェクション試薬を実施例６に記載されるプロトコルを用いて混合した。複合体をＭＣＦ−７細胞に加え，２４時間連続的にトランスフェクトさせた。細胞を１５０μLのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）で回収した。次に，Ｔａｑｍａｎ試薬および７７００Ｐｒｉｓｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて，製造元のプロトコルにしたがってＲＮＡレベルを定量した。すべてのエストロゲンレセプターｍＲＮＡレベルは，アクチンＲＮＡを対照として用いて標準化した。ホスホロチオエート修飾，反転脱塩基キャップ，２'−Ｏ−メチルまたは２'−Ｏ−メチルチオメチル修飾を含むアンチセンス分子は，エストロゲンレセプターＲＮＡを低下させるようであった（図１７）。

実施例１２：３'−デオキシ−３'−チオグアノシンおよびその３'−チオホスホルアミダイトの合成
図１８を参照すると，本出願人は，グアノシンから３'−デオキシ−３'−チオグアノシン（１３）およびその３'−チオホスホルアミダイト２３を合成する効率的な方法を開発した。適切に保護されたグアノシンを臭化ａ−アセトキシイソブチリル（ａ−ＡＩＢＢｒ）と反応させることにより，立体選択的に３'−デオキシ−３'−ブロモ−２'−Ｏ−アセチル−ｂ−Ｄ−キシロフラノシル誘導体３が得られ，これをＳ−アシルリボフラノシル誘導体５（または６）と３'，４'−不飽和誘導体４の７：３混合物に変換した。次に，Ｓ−アシル化誘導体５および６を３段階で３'−デオキシ−３'−Ｓ−ピリジルスルファニル−５'−Ｏ−（４，４'−ジメトキシトリチル）グアノシン（１１）に変換した。これは，遊離ヌクレオシド１３および３'−チオホスホルアミダイト２３の製造の共通の中間体として働いた。

３'−Ｓ−ホスホロチオエート結合を含有するオリゴヌクレオチドは，核酸とそのプロセシング酵素との相互作用を研究するためのプローブとして関心が高まっている。特に，これらの類似体は，ＲＮＡ（Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，１０３４１）およびリボヌクレオ蛋白質酵素（Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９７，３０８，８０１）により触媒されるホスホエステル転移反応における金属イオンの関与を明らかにするのに用いられてきた。溶液化学および固相化学を用いる３'−Ｓ−ホスホロチオレート連結デオキシリボジヌクレオチドの合成が報告されている（Ｃｏｓｓｔｉｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８，８２９；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８，２７２９；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ １９９４，２１２３；Ｖｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２，３１，３０１２）。

リボヌクレオチド３'−Ｓ−ホスホロチオレート類似体の合成は，溶液化学を用いる，ＵｓｐＵ（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，９２５）およびＩｓｐＵ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，１０３４１）のダイマーの製造に限定されていた。最近，Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（ＲＮＡ １９９７，３，１３５２）は，標準的ホスホルアミダイト固相合成を用いる３'−ＳホスホロチオアミダイトのＲＮＡへの直接取り込みを記載した。

３'−チオリボヌクレオシドの合成の１つの一般的アプローチは，３−チオリボース誘導体の製造，続いて所望のヌクレオシド塩基の付加を含む（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９６８，３３，１７８３；Ｃａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９４，４，８０７）。ピリミジンを用いるグリコシル化反応は高収率で進行するが，プリン塩基は一般に，プリン塩基のＮ−７およびＮ−９の両方がグリコシル化に対して反応性であるため，より複雑な混合物を与える。Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）は，上述のアプローチを用いる３'−チオグアノシン誘導体の最初の合成を報告している。過アシル化３'−チオリボースと過シリル化Ｎ²−アセチルグアニンとのカップリングは，約４０％の収率で進行し，続く合成工程は低い全体的収率で進行した。

あらかじめ形成されたヌクレオシドから出発する，３'−チオアデノシン（Ｍｅｎｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９７７，１１７７），３'−チオウリジン（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６（上掲））および３'−チオイノシン（Ｈｉｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９６，５２，１０２７）の合成もまた報告されている。

本出願人は，グアノシンを出発物質とする，３'−デオキシ−３'−チオグアノシン（１３）およびそのホスホルアミダイト２３の合成の新規かつ改良された方法を記載する。最近，Ｎ²−（ジメチルアミノメチレン）−グアノシン１とａ−ＡＩＢＢｒ（Ｍａｔｔｏｃｋｓ−Ｍｏｆｆａｔｔ試薬；Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９７３，９５，４０２５）との反応が立体選択的に進行し，３'−ブロモ−３'−デオキシ−ｂ−Ｄ−キシロフラノシル誘導体のみが得られることが報告されている（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９５，３９，６９９１）。一般に，塩基非保護プリンヌクレオシドとこの試薬との反応により，キシロコンフィギュレーション−とアラビノコンフィギュレーションのトランスブロモ酢酸の混合物が生ずる。本出願人は，適切に５'−保護したＮ²−（ジメチルアミノメチレン）グアノシン誘導体２においてこの反応を用いた（スキーム１；図１８）。２を５'保護することにより，ａ−ＡＩＢＢｒとの反応において５'−ＯＨ，５'−（２，５，５−トリメチル−１，３−ジオキソラン−４−オン−イル）および／または５'−Ｏ−アクリル誘導体の混合物の形成の可能性を排除することにより，反応生成物の複雑さを減少させることができた。このようにして，反応生成物が直接同定された。本出願人は，湿ったアセトニトリル中でのａ−ＡＩＢＢｒとの反応の間に必要な酸性条件に対する比較的高い安定性のため，ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）保護を選択した。この基はまた，Ｓ−アシル基の存在下で選択的に切断されると予測される。１とＴＢＤＰＳ−Ｃｌとの反応は定量的に進行して，５'−Ｏ−シリル誘導体２が得られ，これをａ−ＡＩＢＢｒと好都合に反応させて所望の３'−ブロモ−３'−デオキシ−ｂ−Ｄ−キシロフラノシル誘導体３を高収率で得る。３とチオ酢酸カリウムまたはチオ安息香酸カリウムとの反応により，３'−Ｓ−Ａｃまたは３'−Ｓ−Ｂｚ誘導体（それぞれ５および６）が，３'，４'−不飽和誘導体４とともに得られる。後者は，競合的脱離反応により形成される。比率は７：３で置換生成物５および６が多かったが，この段階では脱離生成物４から分離することはできなかった。４と５の混合物（または４と６）を過剰の酢酸で緩衝化したフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）で処理した。次にクロマトグラフィーにより分離して所望の５'脱保護誘導体７を良好な収率で得た。不飽和誘導体４は酸性反応条件下で不安定であり，シリカゲルカラムクロマトグラフィーによっては純粋な状態で単離することができなかった。トリエチルアミン三フッ化水素酸（ＴＥＡ・３ＨＦ）試薬を脱保護に用いたとき，脱シリル化は完了まで進行しなかった。

非保護誘導体が有する溶解性の問題のため，合成的変換の間，グアノシン誘導体を親油性基で保護したままにすることが望ましい。この理由のため，７および８を４，４'−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基で高収率で再保護して，それぞれ完全に保護された誘導体９および１０を得た。ＤＭＴ基は疎水性タグを提供し，これは次の合成中間体の後処理および精製を簡単にした。次に，水性メチルアミンを用いて，次に２，２'−ジピリジルジスルフィドとのジスルフィド交換反応により，９および１０をＳ−（ピリジル−２−ジスルファニル）誘導体１１に変換した。９および１０に類似するリボフラノシル誘導体の２'−Ｏ−アシル保護の除去は進行が困難であることが報告されている。本出願人は，４０％水性メチルアミンが９および１０からすべてのアシル保護基を容易に除去し，これが選択の基となることを見いだした。これは，水性アンモニアとは異なり，全部保護された基質を完全に可溶化するためである。ＤＭＦ中２，２'−ジピリジルジスルフィドを用いて，ＳＨをＳ−ピリジル−２−ジスルファニル誘導体としてインサイチオ保護して，１１を２段階収率８５％で得た。

遊離ヌクレオシド１３を合成するために，１１をクロロホルム中ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理した。トリエチルアミンを反応混合物に加えると，反応はそれがないときより早かったが，同時に１２がそのＳ−ＴＥＡ塩に変換された。１２のＤＭＴ基の最終的な脱保護は，放出されたＤＭＴ−カチオンを消滅させるＤＴＴの存在下で，メタノール中１Ｎ ＨＣｌで行った。ＤＴＴの非存在下では，定量的Ｓ−アルキル化が生じた。本出願人は，グアノシン３'−チオ類似体１３の合成を報告した最初の者である。ＴＨＦ中の緩衝化されないＴＢＡＦを用いて４と５の混合物を脱シリル化すると，Ｓ−Ａｃ保護基もまた除去され，ジスルフィド１４が形成される（スキーム２；図１９）。これらの条件下では，３'，４'−不飽和誘導体１５はそのまま残留し，これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより１４から分離した。生成物には常にＴＢＡＦが混入していた。しかし，１５の再クロマトグラフィーを試みると，これは分解した。ジスルフィド１４を５'−ＤＭＴ保護して１６を得た。

１６の３'−アセチル基を選択的に除去し（スキーム２；図１９），続いて２'−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）保護を導入し，次に３'−ジスルフィドの還元および３'−ホスフィチル化を行うことが，所望の３'−チオホスホルアミダイト構築ブロックを製造する最短経路であろう。１６と穏やかな脱アシル化試薬（例えばＯＨ^-またはＣＮ^-形の塩基性イオン交換）との反応により，２'−Ｏ−アセチル保護が選択的に除去されるが，同時にヌクレオシドが樹脂に強く吸着され，回収率が低かった。本出願人は，Ｓ−アシル化９および１０からＳ−ピリジル−２−ジスルファニル誘導体１１を製造するのに用いたように，塩基処理およびＳ−ピリジル基によるＳ−保護を用いた。このようにして，ジスルフィド１６から１１を収率６７％で得た。

ホスホルアミダイト合成は，スキーム３（図２０）に示される。１１とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタールとの反応により，所望のＮ−保護誘導体１８が収率２３％で得られる。残念なことに，この試薬はまたＳ−ピリジル保護を切断し，収率３３％でジスルフィド１７が形成される。１８は，ｔ−ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＢＤＭＳ−Ｔｆ）を用いて好都合にＴＢＤＭＳ基で２'保護された。あるいは，１１をＴＢＤＭＳ−Ｃｌでシリル化して２０を得，次に４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で無水イソブチル（ｉ−Ｂｕ₂Ｏ）を用いてＮ−保護して，完全に保護された２１を得る。ＤＭＡＰの非存在下では，出発物質のみが回収される。一方，２０と塩化イソブチリルとの反応により，Ｎ−ビス−アシル化が生ずる。２１をＤＴＴで還元すると，３'−ＳＨ誘導体２２が得られ，これは¹Ｈ ＮＭＲでは２つの回転異性体の混合物として現れる。主要な回転異性体の共鳴は，Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．による報告にしたがう。標準的条件下における２２のホスフィチル化により，３'−チオホスホルアミダイト２３が得られる。本出願人は，３'−デオキシ−３'−チオグアノシンの効率的な合成を記載してきた。すべての合成中間体を親油性基で保護したままにすることにより，それらをクロマトグラフィー精製することが可能となり，したがって，優れた回収率で生成物が得られる。

実験の部
一般
すべての反応は，無水溶媒中，アルゴンの正圧下で実施した。市販の試薬および無水溶媒はさらに精製することなく用いた。とくに記載しない限り，¹Ｈ（４００．０７５ＭＨｚ）および³¹Ｐ（１６１．９４７ＭＨｚ）ＮＭＲスペクトルは，ＣＤＣｌ₃中で記録し，化学シフトはそれぞれＴＭＳおよびＨ₃ＰＯ₄に対するｐｐｍで記録した。分析的薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は，Ｍｅｒｃｋ Ａｒｔ．５５５４ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ₂₅₄プレートを用いて行い，フラッシュカラムクロマトグラフィーは，Ｍｅｒｃｋ ０．０４０−０．０．６３ｍｍシリカゲル６０を用いて行った。質量スペクトルは，高速原子衝撃法により得た。

５'−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｎ²−（ジメチルアミノメチレン）グアノシン（２）
ピリジン（１００ｍＬ）中のＮ²−（ジメチルアミノメチレン）グアノシン（１）（５．５ｇ，１６．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に，塩化ｔ−ブチルジフェニルシリル（６．２ｍｌ，２３．８ｍｍｏｌ）をアルゴン下で加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌し，次にメタノール（２０ｍｌ）で急冷し，真空下で蒸発させてシロップとした。残渣をエタノール−エーテルから再結晶した（９ｇ，９６％）ｍｐ．

１−（２−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−３−デオキシ−３−ブロモ−ｂ−Ｄ−キシロフラノシル）−Ｎ²−（ジメチルアミノメチレン）グアノシン（３）
アセトニトリル（１３０ｍｌ）中の２（５．８ｇ，１０ｍｍｏｌ）および水（０．１２ｍｌ）の冷却溶液（０℃）に，臭化ａ−アセトキシイソブチリル（５．５６ｍｌ，３８ｍｍｏｌ）を加え，混合物を室温で３時間撹拌した。溶液を飽和水性ＮａＨＣＯ₃（１００ｍＬ）に注加し，ＣＨ₂Ｃｌ₂（３ｘ２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）し，濃縮して，クロマトグラフィー的に純粋な白色泡状物（６ｇ，８７％）を得た。

１−（２−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−３−デオキシ−ｂ−Ｄ−グリセロ−ペント−３−エノフラノシル−Ｎ²−（ジメチルアミノメチレン）グアノシン（４）および２'−Ｏ−アセチル−５'−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニル−シリル−３'−デオキシ−３'−Ｓ−チオアセチル−Ｎ²（ジメチルアミノメチレン）−グアノシン（５）
３（５．４ｇ，７．９ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解し，チオ酢酸カリウム（２．７ｇ，２３．６ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。反応混合物を６０℃で１６時間撹拌し，次に減圧下で蒸発させてシロップとした。残渣を水性ＮａＨＣＯ₃−ブラインの１：１溶液とジクロロメタンとの間に分配し，有機相を乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）し，蒸発乾固し，ジクロロメタン中メタノールの２−１０％勾配を用いてシリカゲルのカラムでクロマトグラフィーを行った。４および５がともに溶出され，蒸発させた後，黄味を帯びた泡状物（４．８ｇ）を得た。¹Ｈ ＮＭＲは，４と５の比率が３：７であることを示した。

チオ酢酸カリウムの代わりにチオ安息香酸カリウムを用いたとき，４と２'−Ｏ−アセチル−５'−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−３'−デオキシ−３'−Ｓ−チオベンゾイル−Ｎ²（ジメチルアミノメチレン）グアノシン（６）との分離できない混合物が，上述と同様の収率および不飽和誘導体４に対する比率で得られた。

２'−Ｏ−アセチル−３'−デオキシ−３'−Ｓ−チオアセチル−Ｎ²（ジメチルアミノメチレン）グアノシン（７）
上述の４と５の混合物（０．９ｇ）をＴＨＦ（１５ｍｌ）に溶解し，酢酸（０．３７ｍｌ，６．５ｍｍｏｌ）を加え，次にＴＢＡＦ・３Ｈ₂Ｏ（０．８２ｇ，２．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で５時間撹拌し，次にジクロロメタンで希釈し，水および１０％水性ＮａＨＣＯ₃で洗浄した。水相をジクロロメタンで逆洗浄し，有機相を合わせ，乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）し，蒸発乾固した。ジクロロメタン中メタノールの２−１０％勾配を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い，７を黄味を帯びた泡状物（３００ｍｇ，約７４％）として得た。

２'−Ｏ−アセチル−３'−デオキシ−３'−Ｓ−チオベンゾイル−Ｎ²（ジメチルアミノメチレン）グアノシン（８）
上述と同じ方法を用いて，４と６との混合物から約７０％の収率で８を合成した。

２'−Ｏ−アセチル−３'−デオキシ−３'−Ｓ−チオアセチル−５'−Ｏ−（４，４'−ジメトキシトリチル）−Ｎ²（ジメチルアミノ−メチレン）グアノシン（９）
７（７２０ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１５ｍｌ）に溶解し，ＤＭＴ−Ｃｌ（１．１ｇ，３．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で４時間撹拌し，メタノールで急冷し，蒸発させてシロップとし，これを５％水性ＮａＨＣＯ₃とＣＨ₂Ｃｌ₂との間に分配した。有機相をブラインで洗浄し，乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）し，真空下で蒸発乾固した。残渣をジクロロメタン中メタノールの１−５％勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して，生成物を無色泡状物（０．８５ｇ，７０％）として得た。

２'−Ｏ−アセチル−３'−デオキシ−３'−Ｓ−チオベンゾイル−５'−Ｏ−（４，４'−ジメトキシトリチル）−Ｎ²−（ジメチル−アミノメチレン）グアノシン（１０）
上述と同様の方法を用いて，８を１０に転換した。収率６９％。

３'−デオキシ−３'−Ｓ−ピリジルスルファニル−５'−Ｏ−（４，４'−ジメトキシトリチル）−グアノシン（１１）
Ａ．９（５３０ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ）を４０％水性メチルアミン（５０ｍｌ）に溶解し，混合物を室温で１６時間維持した。溶媒を真空下で除去し，残留シロップを，２，２'−ジピリジルジスルフィド（３４０ｍｇ，１．５４ｍｍｏｌ）を含むアルゴンをパージしたＤＭＦ（３０ｍｌ）に溶解した。反応混合物を６０℃で１０時間加熱し，次に真空下で蒸発させてシロップとした。ジクロロメタン中メタノールの１−１２％勾配を用いてシリカゲルでカラムクロマトグラフィーを行い，１１を無色固体（４６０ｍｇ，８５％）として得た。

Ｂ．上述と同様の方法を用いて，ただしＳ−ベンゾイル誘導体１０から出発して，１１を収率８０％で製造した。

Ｃ．１６（８３０ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ）から出発し，上述の条件を用いて，１１（５７０ｍｇ，６７％）を得た。

３'−デオキシ−３'−チオ−５'−Ｏ−（４，４'−ジメトキシトリチル）−グアノシン（１２）
クロロホルム（１４ｍｌ）中の１１（２４０ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）の溶液に，ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（１２５ｍｇ，０．８１ｍｍｏｌ）を加え，反応混合物を室温で３時間撹拌した。次にこれを真空下で蒸発させてシロップとした。過酸化物非含有エーテルを加えることにより生成物を沈殿させ，沈殿物を濾別し，エーテルで洗浄し，乾燥した（粗生成物２３０ｍｇ）。

３'−デオキシ−３'−チオ−グアノシン（１３）
粗生成物１２（２３０ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）およびＤＴＴ（１５０ｍｇ）の混合物を１Ｎメタノール性ＨＣｌ（１２ｍｌ）に溶解し，反応混合物を室温で３時間維持した。次にこれを真空下で濃縮し，残渣をトルエンで２回共蒸発させた。酢酸エチルを加えると沈殿物が生成し，これを濾別し，酢酸エチルでよく洗浄し，乾燥して，１３（９０ｍｇ，７９％）を得た。生成物は，水から再沈殿させた。

ビス（２−Ｏ−アセチル−Ｎ²−（ジメチルアミノメチレン）グアノシン−３−イル）ジスルフィド（１４）および１−（２−Ｏ−アセチル−３−デオキシ−ｂ−Ｄ−グリセロ−ペント−３−エノフラノシル）−Ｎ²−（ジメチルアミノメチレン）グアノシン（１５）
４と５の混合物（４．８ｇ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解し，ＴＨＦ（１０ｍＬ）中１Ｍ ＴＢＡＦを加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌し，次に真空下で蒸発させてシロップとした。ジクロロメタン中メタノールの２−１０％勾配を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い，より早く溶出する１５（１ｇ，３５％；３から２段階；無色泡状物）を得た。

より遅く溶出する１４は，黄色みを帯びた固体として得た（０．９ｇ，２段階で２９％）。

ビス（２−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−（４，４'ジメトキシトリチル）−Ｎ²−（ジメチルアミノメチレン）グアノシン−３−イル）ジスルフィド（１６）
１４（４００ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）の乾燥ピリジン（１０ｍｌ）中の溶液に，ＤＭＴ−Ｃｌ（５０８ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）を加え，混合物を室温で４時間撹拌した。メタノール（１０ｍｌ）を加え，溶液を蒸発乾固させた。残渣を飽和ＮａＨＣＯ₃とジクロロメタンとの間に分配し，有機相をブラインで洗浄し，乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）し，蒸発させてシロップとした。ジクロロメタン中メタノールの２−１０％勾配を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い，生成物を黄味を帯びた泡状物として得た（６２０ｍｇ，収率７１％）。

ビス（５−Ｏ−（４，４'ジメトキシトリチル）−Ｎ²−（ジメチルアミノメチレン）グアノシン−３−イル）ジスルフィド（１７）
Ａ．１６（６０ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を乾燥メタノールに溶解し，イオン交換樹脂ＡＧ１Ｘ８（ＯＨ^-）（１ｇ）を加えた。混合物を５５℃で１６時間撹拌し，樹脂を濾別し，熱メタノールでよく洗浄した。濾液を真空下で蒸発乾固させて，純粋な１７を無色固体として得た（１６ｍｇ，２８％）。

Ｂ．ＡｍｂｅｒｌｙｓｔＡ−２６（ＣＮ^-）を用いて上述の反応条件で，１６から収率２１％で１７を得た。

３'−デオキシ−３'−Ｓ−ピリジルスルファニル−５'−Ｏ−（４，４'−ジメトキシトリチル）−Ｎ²−（ジメチルアミノメチレン）グアノシン（１８）および１７
乾燥ピリジン（５ｍｌ）中の１１（４００ｍｇ，０．５６ｍｍｏｌ）の溶液にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（１．２ｍｌ，９ｍｍｏｌ）を加え，反応混合物を室温で１６時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し，残基をジクロロメタン中メタノールの１−５０％勾配を用いるシリカゲルのカラムでクロマトグラフィーを行った。より早く移動する物質を含有する画分を合わせ，真空下で濃縮して，化合物１８（１１０ｍｇ，２３％）を得た。

より遅く移動する化合物を含有する画分を回収し，真空下で蒸発乾固して，１７を無色泡状物（１２０ｍｇ，３３％）として得た。¹Ｈ ＮＭＲは，上述の方法を用いて得た１７のものと同一であった。

２'−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−３'−デオキシ−３'−Ｓ−ピリジルスルファニル−５'−Ｏ−（４，４'ジメトキシトリチル）−Ｎ²−（ジメチルアミノ−メチレン）グアノシン（１９）
１８（１１０ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（１ｍｌ）に溶解し，ＴＢＤＭＳ−Ｔｆ（０．１０３ｍｌ，０．４５ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。反応混合物を室温で５時間撹拌し，次にメタノールで急冷し，真空下で蒸発させてシロップとした。残渣をジクロロメタンに溶解し，５％水性ＮａＨＣＯ₃で，次にブラインで洗浄し，有機相を乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）し，濃縮してシロップとした。酢酸エチル中メタノールの１−１０％勾配を用いてシリカゲルでカラムクロマトグラフィーを行い，１９を無色固体（９０ｍｇ，７１％）として得た。

２'−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−３'−デオキシ−３'−Ｓ−ピリジルスルファニル−５'−Ｏ−（４，４'−ジメトキシトリチル）グアノシン（２０）
３'−デオキシ−３'−Ｓ−ピリジルスルファニル−５'−Ｏ−（４，４'−ジメトキシトリチル）グアノシン１１（４１０ｍｇ，０．５８ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（３６ｍｌ）に溶解し，イミダゾール（２．３６ｇ，３５ｍｍｏｌ）およびＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（４．２９ｇ，２８ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で１６時間撹拌し，次に真空下で蒸発させてシロップとした。残渣をジクロロメタンと飽和水性ＮａＨＣＯ₃との間に分配し，有機相を水で洗浄し，乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）し，濃縮してシロップとした。ジクロロメタン中メタノールの１−１０％勾配を用いてシリカゲルでカラムクロマトグラフィーを行い，生成物を白色泡状物（４３０ｍｇ，８５％）として得た。

２'−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−３'−デオキシ−３'−Ｓ−ピリジルスルファニル−５'−Ｏ−（４，４'−ジメトキシトリチル）−Ｎ²−イソブチリルグアノシン（２１）
乾燥ピリジン（５ｍｌ）中の２０（３１０ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ）の溶液に無水イソ酪酸（０．１９ｍｌ，１．１４ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（４６ｍｇ，０．３８ｍｍ）を加え，混合物を室温で１６時間撹拌した。次にこれを５０℃で５時間撹拌し，メタノール（２ｍｌ）で急冷し，真空下で蒸発させてシロップとした。残渣をジクロロメタンと５％水性ＮａＨＣＯ₃との間に分配し，有機相をブラインで洗浄し，乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）し，蒸発させてシロップとした。ＣＨ₂Ｃｌ₂中メタノールの１−５％勾配を用いてシリカゲルでカラムクロマトグラフィーを行い，生成物を無色泡状物（３２０ｍｇ，９５％）として得た。

２'−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−３'−デオキシ−３'−チオ−５'−Ｏ−（４，４'−ジメトキシトリチル）−Ｎ²−イソブチリルグアノシン（２２）
クロロホルム（２０ｍｌ）中の２１（３４０ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ）の溶液に，ＴＥＡ（０．４ｍｌ）およびジチオスレイトールＤＴＴ（１４０ｍｇ，０．９１ｍｍｏｌ）を加え，反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を飽和水性ＮａＨＣＯ₃，水で洗浄し，乾燥（Ｎａ₂ＳＯ₄）し，濃縮してシロップとした。ＣＨ₂Ｃｌ₂中メタノールの０．５−２％勾配を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い，２２（２７０ｍｇ，９０％）を得た。主要な回転異性体の¹Ｈ ＮＭＲ：

２'−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−３'−デオキシ−３'−チオ−５'−Ｏ−（４，４'−ジメトキシトリチル）−Ｎ²−イソブチリルグアノシン
３'−Ｓ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（２３） Ｓｕｎらにより記載されたように２２をホスフィチル化して生成物を得，これを１％ＴＥＡを含有するＣＨ₂Ｃｌ₂中０．５％エタノールを用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。トルエン−ペンタンから０℃で沈殿させて，最終生成物を白色粉状物として得た（収率７６％）。

実施例１３：５'−チオホスフェートヌクレオシドホスホルアミダイトの合成および固体支持体の調製
図２１を参照すると，５'−デオキシ−５'−チオヌクレオシドホスホルアミダイトおよびスクシネートを合成するスキームが示される。例えば，Ｌｅｈｍａｎｎら（ＮＡＲ １９８９，１７，２３７９；本明細書の一部としてここに引用する）は，より塩基に安定なサルコシル修飾固体支持体の製造を記載する。

Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃら（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ １９９７，１６，１９３３）は，５'−チオ修飾のオリゴヌクレオチド中への組み込みを記載する。本出願人は，さらに，ＣＨ₃ＣＮ中ＡｇＮＯ₃の代わりにＣＨ₃ＣＮ中０．１Ｍ １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ），またはＣＨ₃ＣＮ中２０％ピペリジンを用いることにより，鎖の伸長のために固体支持体上の５'−保護基を切断する方法を記載する。

５'Ｓ−ＤＭＴ保護は，ヨウ素により切断され（Ｈｅｎｎｉｎｇｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．ＪＡＣＳ １９９６，１１８，１１７０１），したがってオリゴの合成を複雑化するが，Ｓ−ＦｍはＤＭＦ中０．１Ｍヨウ素に耐性であることが報告されていることに注目されたい。

オリゴヌクレオチドは，５'−チオホスフェート結合を有するように合成し，ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，米国特許５，５２５，４６８（本明細書の一部としてここに引用する）に記載される標準的ＲＮａｓｅＨ切断アッセイによりインビトロで試験した。

実施例１４：５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−３'−デオキシ−３'−チオ−３'−Ｓ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト−２'−Ｏ−メチルウリジン（６）（図２２）の合成
５'−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２'−Ｏ−メチルウリジン（１）：０℃で正圧のアルゴン下で撹拌している無水ピリジン中の２'−Ｏ−メチルウリジンの溶液に，塩化ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（１．２当量）を加えた。反応混合物を室温まで暖まらせ，室温で１８時間維持した。エタノールを加え，ピリジンを真空下で除去し，反応残渣をジクロロメタンと飽和水性炭酸水素ナトリウムとの間に分配した。次に有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。酢酸エチル／ヘキサン勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより，（１）を白色泡状物として得た。

５'−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２'−Ｏ−メチル−２，３'−アンヒドロウリジン（２）：０℃でアルゴン下で撹拌している無水ＴＨＦ中の（１）およびＤＥＡＤ（３．５当量）の溶液に，トリフェニルホスフィン（３．５当量）を加えた。反応混合物を室温まで暖め，室温でアルゴン下で１８時間撹拌し，次にＴＨＦを真空下で除去した。粗反応残渣をジクロロメタンと飽和水性炭酸水素ナトリウムとの間に分配し，有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し，酢酸エチル／ヘキサン勾配のフラッシュクロマトグラフィーを行い，（２）を灰白色泡状物として得た。

５'−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−３'−Ｓ−アセチル−２'−Ｏ−メチルウリジン（３）：化合物（２）を，ステンレスボンベ中で撹拌しながら，ジオキサン中チオール酢酸で１００℃で１８時間処理した。反応混合物を真空下で蒸発させ，次にフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して，（３）を淡黄色泡状物として得た。

５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−３'−Ｓ−アセチル−２'−Ｏ−メチルウリジン（４）：（３）の溶液に，室温でアルゴンの正圧下で撹拌しながら，酢酸で緩衝化されたＴＨＦ中の１Ｍ ＴＢＡＦを加えた。得られた透明な淡黄色の溶液を室温で１時間撹拌し，次にＴＨＦを真空下で除去した。粗生成物（４）を，エタノール／ジクロロメタン勾配を用いるフラッシュシリカにより精製した。次に，精製物を無水ピリジンと共蒸発させ，次に無水ピリジン中に溶解した。塩化ジメトキシトリチルを反応液に室温で加え，得られた透明な赤みを帯びた溶液を室温で１８時間撹拌した。エタノールで急冷した後，ピリジンを真空下で除去し，得られた粗泡状物を，ジクロロメタンと飽和水性炭酸水素ナトリウムとの間に分配し，有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。酢酸エチル／ヘキサン勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより，純粋な（４）を得た。

５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−３'−デオキシ−３'−チオ−２'−Ｏ−メチルウリジン（５）：化合物（４）をＤＴＴの存在下で４０％水性メチルアミンに溶解した。反応混合物を室温で１時間撹拌し，次に真空下で蒸発させた。酢酸エチル／ヘキサン勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより，（５）を灰白色泡状物として得た。

５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−３'−デオキシ−３'−チオ−３'−Ｓ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト−２'−Ｏ−メチルウリジン（６）：（５）の冷却した溶液（０℃）および乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂中のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンに，２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトをシリンジにより滴加した。混合物を室温で，すべての出発物質が消費されるまで撹拌した（５時間）。反応混合物を無水エタノールで急冷し，ヘキサンで希釈した。酢酸エチル／ヘキサン勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーにより純粋な（６）を得た。

診断用途
本発明のリボザイムは，診断道具として用いて，疾患細胞内の遺伝的浮動および突然変異を試験するか，または細胞内における特定のＲＮＡの存在を検出するために用いることができる。例えば，リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係により，分子の任意の領域において，標的ＲＮＡの塩基対形成および三次構造を変化させる突然変異の検出が可能となる。本発明に記載される多重リボザイムを用いることにより，ＲＮＡの構造，およびインビトロでのならびに細胞および組織における機能に重要なヌクレオチド変化を位置づけることができる。リボザイムによる標的ＲＮＡの切断を用いて，遺伝子発現を阻害し，疾病の進行における特定の遺伝子産物の役割（本質的な）を特定することができる。このようにして，疾病の重要な媒介物として他の遺伝的標的を特定することができる。このような実験は，組み合わせ治療（例えば，異なる遺伝子を標的とする多重リボザイム，既知の小分子阻害剤と結合させたリボザイム，またはリボザイムおよび／または他の化学的もしくは生物学的分子の組合せによる断続的治療）の可能性を与えることにより，疾病進行のよりよい治療をもたらすであろう。本発明のリボザイムの他のインビトロの用途は当該技術分野においてよく知られており，これには種々の状態に関連するＲＮＡの存在の検出が含まれる。そのようなＲＮＡは，例えば酵素的核酸分子により処理した後に，切断生成物の存在を標準的方法論を用いて決定することにより検出される。

特定の例においては，野生型または突然変異型の標的ＲＮＡのみを切断しうるリボザイムをアッセイに用いる。第１のリボザイムを用いて試料中に存在する野生型ＲＮＡを同定し，第２のリボザイムを用いて試料中の変異型ＲＮＡを同定する。反応対照として，野生型および変異型ＲＮＡの両方の合成基質を両方のリボザイムで切断して，反応における相対的なリボザイム効率および"非標的"ＲＮＡ種の切断がないことを示すことができる。合成基質からの切断生成物はまた，試料集団中の野生型および変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーを生成するためにも役立つ。すなわち，各分析は，２つのリボザイム，２つの基質および１つの未知の試料を必要とし，これらを組み合わせて６つの反応とする。切断生成物の存在は，各ＲＮＡの完全長および切断フラグメントがポリアクリルアミドゲルの１つのレーンで分析することができるように，ＲＮＡｓｅ保護アッセイを用いて決定される。変異ＲＮＡの発現および標的細胞における所望の発現型の変化の推定リスクを見抜くためには，結果を定量することは必ずしも必要ではない。その蛋白質生成物が発現型の発生に関与していると考えられるｍＲＮＡが発現していることは，リスクの確立に適当である。匹敵する特異的活性を有するプローブを両方の転写産物について用いれば，ＲＮＡレベルの定性的比較が適当であり，初期診断のコストを下げるであろう。ＲＮＡレベルを定性的に比較しようと定量的に比較しようと，野生型に対する変異型の比率がより高いことは，よりリスクが高いことと相関しているであろう。

追加の用途
本発明の配列特異的酵素的核酸分子の潜在的有用性は，ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼがＤＮＡの研究に対して有していたものと同じ用途の多くを，ＲＮＡの研究に対しても有するであろう（Ｎａｔｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９７５ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：２７３）。例えば，制限酵素フラグメントのパターンを用いて，２つの関連するＲＮＡの配列の関係を確立し，大きいＲＮＡをより研究に有用なフラグメントに特異的に切断することができる。リボザイムの配列特異性を遺伝子工学的に処理することが可能であることは，未知の配列のＲＮＡの切断に理想的である。

他の態様は特許請求の範囲の範囲内である。

表１
天然に存在するリボザイムの特徴
グループＩイントロン
・サイズ：約１５０〜１０００以上のヌクレオチド。
・標的配列中の切断部位の５'側に隣接してＵを必要とする。
・切断部位の５'側で４〜６のヌクレオチドと結合する。
・反応メカニズム：グアノシンの３'−ＯＨによって攻撃し，３'−ＯＨおよび５'グアノシンを有する切断産物を生成する。
・活性構造の折り畳みおよび維持を助けるために，場合により，蛋白質の補因子をさらに必要とする。
・このクラスには３００以上の種類が知られている。テトラヒメナ・サーモフィラのｒＲＮＡ，真菌ミトコンドリア，葉緑体，ファージＴ４，らん藻類，その他において，介在配列として見出されている。
・主要な構造上の特徴は，系統発生比較，突然変異原性および生化学的研究によってほぼ確立されている［１，２］。
・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが立証されている［３，４，５，６］。
・リボザイムの折り畳みおよび基質ドッキングに関する研究が進行中［７，８，９］。
・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている［１０，１１］。
・このリボザイムは，結合部位が小さい（４〜６ヌクレオチド）ため，標的ＲＮＡ切断に対して非常に非特異的になる場合があるが，テトラヒメナのグループＩイントロンは，「欠損」β−ガラクトシダーゼのメッセージに新たなβ−ガラクシダーゼ配列を結合することによってこのメッセージを修復するのに利用されている［１２］。
ＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（Ｍ１ＲＮＡ）
・サイズ：約２９０〜４００のヌクレオチド。
・偏在するリボ核蛋白質酵素のＲＮＡ部分。
・ｔＲＮＡ前駆体を切断し，成熟ｔＲＮＡを形成する［１３］。
・反応メカニズム：恐らくはＭ²⁺−ＯＨによって攻撃し，３'−ＯＨおよび５'リン酸を有する切断産物を生成する。
・ＲＮａｓｅＰは原核生物および真核生物全体に見出されている。このＲＮＡサブユニットは，細菌，酵母，げっ歯類および霊長類から配列決定されている。
・外部ガイド配列（ＥＧＳ）と標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションによって，内因性ＲＮａｓｅＰを治療応用に活用することが可能である［１４，１５］。
・リン酸と２'ＯＨとの接触の重要性が最近判明した［１６，１７］。
グループＩＩイントロン
・サイズ：１０００以上のヌクレオチド。
・標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［１８，１９］。
・配列要求性は完全には決定されていない。
・反応メカニズム：内部アデノシンの２'−ＯＨが３'−ＯＨ，および３'−５'および２'−５'分岐点を含む「ラリアット（ｌａｒｉａｔ）」ＲＮＡを有する切断産物を生成する。
・ＲＮＡの切断および結合に加えて，ＤＮＡ切断への関与が実証された［２０，２１］唯一の天然リボザイムである。
・主要な構造上の特徴は，系統発生比較によってほぼ確立されている［２２］。
・２'ＯＨ接触の重要性が判明しはじめている［２３］。
・力学的フレームワークは検討中である［２４］。
Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡ
・サイズ：約１４４ヌクレオチド。
・ヘアピン標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［２５］。
・配列要求性は完全には決定されていない。
・反応メカニズム：２'−ＯＨが切れやすい結合の５'側を攻撃し，２'，３'−サイクリックリン酸および５'−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていない。
・このクラスは１種しか知られていない。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡに見出されている。
ハンマーヘッド・リボザイム（本文を参照のこと）
・サイズ：約１３〜４０ヌクレオチド。
・切断部位の５'に隣接した標的配列ＵＨを必要とする。
・切断部位の両側で可変数のヌクレオチドと結合する。
・反応メカニズム：２'−ＯＨによって切れやすい結合の５'側を攻撃し，２'，３'−サイクリックリン酸および５'−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・このクラスには１４種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する多くの植物病原体（ウィルソイド）において見出されている。
・２つの結晶構造を含め，本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている。［２６，２７］
・（インビトロ選択による工学的処理に対し）ごくわずかなライゲーション活性が実証された。［２８］
・２つまたはそれ以上のリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている。［２９］
・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている。［３０］
ヘアピンリボザイム
・サイズ：約５０ヌクレオチド。
・切断部位の３'に隣接した標的配列ＧＵＣを必要とする。
・切断部位の５'側で４〜６のヌクレオチドと，切断部位の３'側で可変数のヌクレオチドと結合する。
・反応メカニズム：２'−ＯＨによって切れやすい結合の５'側を攻撃し，２'，３'−サイクリックリン酸および５'−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・このクラスには３種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する３種の植物病原体（タバコ・リングスポット・ウィルス，アラビス・モザイク・ウィルスおよびチコリー黄色斑ウィルスのサテライトＲＮＡ）に見出されている。
・本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている［３１，３２，３３，３４］。
・（切断活性に加えて）ライゲーション活性があるためにこのリボザイムはインビトロ選択による工学処理が可能である［３５］。
・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている［３６］。
・重要な残基の化学修飾検討が着手された［３７，３８］。
デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイム
・サイズ：約６０ヌクレオチド。
・標的ＲＮＡのトランス切断であることが実証されている［３９］。
・結合部位および構造上の要求性は完全には決定されていないが，切断部位の５'側の配列は要求されない。折りたたまれたリボザイムはシュードノット構造を含む［４０］。
・反応メカニズム：２'−ＯＨによって切れやすい結合の５'側を攻撃し，２'，３'−サイクリックリン酸および５'−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。
・このクラスは２種しか知られていない。ヒトＨＤＶに見出されている。
・環状のＨＤＶは活性があり，ヌクレアーゼ安定性が増加している［４１］。

本発明の種々の態様は以下のとおりである：
（１） 式１：

［式中，各Ｘは，独立して，同一であっても異なっていてもよいヌクレオチドを表し；ｍおよびｏは，独立して，５以上の整数であり；（Ｘ）ｍおよび（Ｘ）ｏは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；Ｙは，独立して，同一であっても異なっていてもよいデオキシリボヌクレオチドを表し；（Ｙ）ｎは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；ｎは４以上の整数であり；＿は，化学結合を表し；各（Ｘ）ｍおよび（Ｘ）ｏは，独立して，少なくとも１つのホスホジエステル結合および１つのホスホロチオエート結合を含み；（Ｙ）ｎは，ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合または５'−チオホスフェート結合またはそれらの混合物を含み，および各ＣおよびＣ'は，独立して，キャップ構造を表し，これは独立して存在してもしなくてもよい］
を有する核酸分子。

（２） 式ＩＩ：

［式中，Ｘは，同一であっても異なっていてもよいヌクレオチドを表し；ｒは４以上の整数であり；（Ｘ）ｒは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；Ｙは，独立して，同一であっても異なっていてもよいデオキシリボヌクレオチドを表し；ｎは４以上の整数であり；（Ｙ）ｎは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり； は，化学結合を表し；（Ｙ）ｎは，ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合または５'−チオホスフェート結合またはそれらの混合物を含み；各（Ｘ）ｒは，独立して，少なくとも１つのホスホジエステル結合および１つのホスホロチオエート結合を含み；および各ＣおよびＣ'は，独立して，キャップ構造を表し，これは独立して存在してもしなくてもよい］
を有する核酸分子。

（３） 式ＩＩＩ：

［式中，Ｘは，同一であっても異なっていてもよいヌクレオチドを表し；ｒは，４以上の整数であり；（Ｘ）ｒは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；Ｙは，独立して，同一であっても異なっていてもよいデオキシリボヌクレオチドを表し；ｎは４以上の整数であり；（Ｙ）ｎは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり； は，化学結合を表し；（Ｙ）ｎは，ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合またはホスホロチオエートとホスホロジチオエート結合との混合物を含み；各（Ｘ）ｒは，独立して，少なくとも１つのホスホジエステル結合および１つのホスホロチオエート結合を含み；および各ＣおよびＣ'は，独立して，キャップ構造を表し，これは独立して存在してもしなくてもよい］
を有する核酸分子。

（４） 式ＩＶ：

［各Ｘは，独立して，同一であっても異なっていてもよいヌクレオチドを表し；ｍ，ｏおよびｑは，独立して，５以上の整数であり；（Ｘ）ｍおよび（Ｘ）ｏは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；（Ｘ）ｑは，任意に標的核酸分子と相互作用することができ；Ｙは，独立して，同一であっても異なっていてもよいデオキシリボヌクレオチドを表し；（Ｙ）ｎは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；ｎは４以上の整数であり； は，化学結合を表し；各（Ｘ）ｍ，（Ｘ）ｏおよび（Ｘ）ｑは，独立して，少なくとも１つのホスホジエステル結合を含み；（Ｙ）ｎは，ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合または５'−チオホスフェート結合またはそれらの混合物を含み；Ｚは，標的核酸分子の切断を容易にしうるオリゴヌクレオチドを表し；ｐは４以上の長さであり；および各ＣおよびＣ'は，独立して，キャップ構造を表し，これは独立して存在してもしなくてもよい］
で表される，エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素的核酸分子。

（５） 式Ｖ：

［式中，各Ｘは，独立して，同一であっても異なっていてもよいヌクレオチドを表し；ｍ，ｏおよびｑは，独立して，５以上の整数であり；（Ｘ）ｍおよび（Ｘ）ｏは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；（Ｘ）ｑは，任意に標的核酸分子と相互作用することができ；（Ｙ）ｎは，独立して，同一であっても異なっていてもよいデオキシリボヌクレオチドを表し；（Ｙ）ｎは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；ｎは４以上の整数であり； は，化学結合を表し；各（Ｘ）ｍ，（Ｘ）ｏおよび（Ｘ）ｑは，独立して，少なくとも１つのホスホジエステル結合を含み；（Ｙ）ｎは，ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合または５'−チオホスフェート結合またはそれらの混合物を含み；Ｚは，標的核酸分子の切断を容易にしうるオリゴヌクレオチドを表し；ｐは４以上の長さであり；および各ＣおよびＣ'は，独立して，キャップ構造を表し，これは独立して存在してもしなくてもよい］
で表される，エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素的核酸分子。

（６） 式ＶＩ：

［式中，Ｘは，独立して，同一であっても異なっていてもよいヌクレオチドを表し；ｑは，独立して，１以上の整数であり；（Ｘ）ｑは，任意に，標的核酸分子と相互作用することができ；Ｙは，独立して，同一であっても異なっていてもよいデオキシリボヌクレオチドを表し；（Ｙ）ｎは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；ｎは４以上の整数であり；＿は，化学結合を表し；（Ｙ）ｎは，ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合または５'−チオホスフェート結合またはそれらの混合物を含み；Ｚは，標的核酸分子の切断を容易にしうるオリゴヌクレオチドを表し；ｐは４以上の長さであり；および各ＣおよびＣ'は，独立して，キャップ構造を表し，これは独立して存在してもしなくてもよい］
で表される，エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素的核酸分子。

（７） 式ＶＩＩ：

［式中，Ｘは独立して，同一であっても異なっていてもよいヌクレオチドを表し；ｑは，独立して，１以上の整数であり；（Ｘ）ｑは，任意に，標的核酸分子と相互作用することができ；Ｙは，独立して，同一であっても異なっていてもよいデオキシリボヌクレオチドを表し；（Ｙ）ｎは，標的核酸分子と独立して安定して相互作用するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり；，ｎは４以上の整数であり；＿は，化学結合を表し；（Ｙ）ｎは，ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合または５'−Ｓ−ホスホロチオエート結合または５'−Ｓホスホロジチオエート結合または３'−Ｓ−ホスホロチオエート結合または３'−Ｓホスホロジチオエート結合またはそれらの混合物を含み；Ｚは，標的核酸分子の切断を容易にしうるオリゴヌクレオチドを表し；ｐは４以上の長さであり；および各ＣおよびＣ'は，独立して，キャップ構造を表し，これは独立して存在してもしなくてもよい］
で表される，エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素的核酸分子。

（８） 各Ｘが，独立して，２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−アリル，２’−Ｏ−メチルチオメチル，Ｌ−ヌクレオチド；２’−Ｃ−アリル；１−５−アンヒドロヘキシトール；２，６−ジアミノプリン；２'−フルオロ；２’−デオキシ−２’−アミノ；２'−（Ｎ−アラニル）アミノ；２’−（Ｎ−フェニルアラニル）アミノ；２’−デオキシ−２’−（Ｎ−β−アラニル）アミノ；２'−デオキシ−２'−（リシル）アミノ；２’−Ｏ−アミノ；２'−デオキシ−２'−（Ｎ−ヒスチジル）アミノ；６−メチルウリジン；５−メチルシチジン；２'−（Ｎ−β−カルボキシアミジン−β−アラニル）アミノ−２'−デオキシ−ヌクレオチド；２’−Ｏ−メチルチオアリル；２'−Ｏ−メチルチオエチル；２’−Ｏ−メチルチオメチル；２’−Ｏ−メチル−３’−チオホスフェートおよびキシロフラノシルからなる群より選択されるヌクレオチド修飾を含む，上記核酸分子。

（９） 各Ｘ，Ｚ，またはＸおよびＺの両方が，独立して，２'−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−アリル，２'−Ｏ−メチルチオメチル，Ｌ−ヌクレオチド；２'−Ｃ−アリル；１−５−アンヒドロヘキシトール；２，６−ジアミノプリン；２'−フルオロ；２'−デオキシ−２'−アミノ；２'−Ｈ；２'−（Ｎ−アラニル）アミノ；２'−（Ｎ−フェニルアラニル）アミノ；２'−デオキシ−２’−（Ｎ−β−アラニル）アミノ；２'−デオキシ−２'（リシル）アミノ；２'−Ｏ−アミノ；２'−デオキシ−２'−（Ｎ−ヒスチジル）アミノ；６−メチルウリジン；５−メチルシチジン；２'−（Ｎ−β−カルボキシアミジン−β−アラニル）アミノ−２'−デオキシ−ヌクレオチド；２'−Ｏ−メチルチオアリル；２'−Ｏ−メチルチオエチル；２'−Ｏ−メチルチオメチル；２'−Ｏ−メチル−３'−チオホスフェートおよびキシロフラノシルからなる群より選択されるヌクレオチド修飾を含む，上記酵素的核酸分子。

（１０） 前記核酸分子中のＺが触媒コアである，上記酵素的核酸分子。

（１１） 前記酵素的核酸がハンマーヘッドリボザイムコンフィギュレーションのものである，上記酵素的核酸分子。

（１２） 前記酵素的核酸がヘアピンリボザイムコンフィギュレーションのものである，上記酵素的核酸分子。

（１３） 前記酵素的核酸が，デルタ肝炎ウイルス，グループＩイントロン，ＶＳ ＲＮＡ，グループＩＩイントロン，またはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡのコンフィギュレーションのものである，上記酵素的核酸分子。

（１４） ＲＮＡ分子を切断する方法であって，上記酵素的核酸分子を，前記酵素的核酸分子による前記ＲＮＡ分子の切断に適当な条件下でＲＮＡ分子と接触させる工程を含む方法。

（１５） 前記切断が二価カチオンの存在下で実施される，上記方法。

（１６） 前記二価カチオンがＭｇ²⁺である，上記方法。

（１７） 前記Ｃ'が，存在する場合には，反転脱塩基残基；４'，５'−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４'−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３'，４'−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，３'−３'−反転ヌクレオチド部分；３'−３'−反転脱塩基部分；３'−２'−反転ヌクレオチド部分；３'−２'−反転脱塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３'−ホスホルアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３'−ホスフェート；３'−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；およびメチルホスホネート部分からなる群より選択されるキャップである，上記核酸分子。

（１８） 前記核酸分子が前記３’末端において３'−３'結合反転リボース部分を含む，上記核酸分子。

（１９） 前記核酸分子がアンチセンス核酸分子である，上記核酸分子。

（２０） 前記核酸分子が２−５Ａアンチセンスキメラである，上記核酸分子。

（２１） 前記核酸分子がトリプレックス形成オリゴヌクレオチドである，上記核酸分子。

（２２） 配列番号１−３０として規定される配列のいずれかを含む核酸分子。

（２３） 上記酵素的核酸分子を含有する哺乳動物細胞。

（２４） 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，上記哺乳動物細胞。

（２５） 細胞において遺伝子の発現を調節する方法であって，前記遺伝子のダウンレギュレーションに適当な条件下で，前記細胞に上記核酸分子を投与する工程を含む方法。

（２６） 細胞において遺伝子の発現を調節する方法であって，前記遺伝子のダウンレギュレーションに適当な条件下で，前記細胞に上記酵素的核酸分子を投与する工程を含む方法。

（２７） 前記Ｃ'が，存在する場合には，反転脱塩基残基；４'，５'−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４'−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３'，４'−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，３'−３'−反転ヌクレオチド部分；３'−３'−反転脱塩基部分；３'−２'−反転ヌクレオチド部分；３'−２'−反転脱塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３'−ホスホルアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３'−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；およびメチルホスホネート部分からなる群より選択されるキャップである，上記酵素的核酸分子。

（２８） 前記Ｃが，存在する場合には，４'，５'−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４'−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；５'−アミノアルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート，３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３'，４'−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５'−５'−反転ヌクレオチド部分；５'−５'−反転脱塩基部分；５'−ホスホルアミデート；５'−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５'−アミノ；架橋および／または非架橋５'−ホスホルアミデート，ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート，架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５'−メルカプト部分からなる群より選択されるキャップである，上記酵素的核酸分子。

（２９） 前記Ｃが，存在する場合には，４'，５−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４'−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート，３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３'，４'−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５'−５'−反転ヌクレオチド部分；５'−５'−反転脱塩基部分；５'−ホスホルアミデート；５'−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５'−ホスホルアミデート，ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート，架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５'−メルカプト部分からなる群より選択されるキャップである，上記核酸分子。

（３０） 上記核酸分子を含有する哺乳動物細胞。

（３１） 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，上記哺乳動物細胞。

（３２） 前記酵素的核酸分子が前記３'末端において３'−３'結合反転リボース部分を含む，上記酵素的核酸分子。

（３３） 前記（Ｘ）ｍおよび（Ｘ）ｏが対称的な長さのものである，上記核酸分子。

（３４） 前記（Ｘ）ｍおよび（Ｘ）ｏが非対称的な長さのものである，上記核酸分子。

（３５） 前記（Ｘ）ｍおよび（Ｘ）ｏが対称的な長さのものである，上記酵素的核酸分子。

（３６） 前記（Ｘ）ｍおよび（Ｘ）ｏが非対称的な長さのものである，上記酵素的核酸分子。

（３７） 前記ｏ，ｎおよびｑの合計が前記ｍと等しい，上記酵素的核酸分子。

（３８） 前記ｏ，ｎおよびｍの合計が前記ｑと等しい，上記酵素的核酸分子。

（３９） 前記ｏ，ｎおよびｑの合計が前記ｍより大きい，上記酵素的核酸分子。

（４０） 前記ｏ，ｎおよびｍの合計が前記ｑより大きい，上記酵素的核酸分子。

（４１） 前記ｏ，ｎおよびｑの合計が前記ｍより小さい，上記酵素的核酸分子。

（４２） 前記ｏ，ｎおよびｍの合計が前記ｑより小さい，上記酵素的核酸分子。

（４３） ＲＮＡ切断活性を有する酵素的核酸分子であって，エストロゲンレセプター遺伝子の発現を調節することを特徴とする酵素的核酸分子。

（４４） 前記酵素的核酸分子がハンマーヘッドコンフィギュレーションのものである，上記酵素的核酸分子。

（４５） 前記酵素的核酸分子が，２塩基対以上の長さのステムＩＩ領域を含む，上記酵素的核酸分子。

（４６） 前記酵素的核酸分子がヘアピンコンフィギュレーションのものである，上記酵素的核酸分子。

（４７） 前記酵素的核酸が，デルタ肝炎ウイルス，グループＩイントロン，グループＩＩイントロン，ＶＳ核酸またはＲＮａｓｅＰ核酸のコンフィギュレーションのものである，上記酵素的核酸分子。

（４８） 前記酵素的核酸分子が，３−７塩基対の長さのステムＩＩ領域を含む，上記酵素的核酸。

（４９） 前記核酸が，前記ＲＮＡに相補的な１２−１００塩基を含む，上記酵素的核酸分子。

（５０） 前記核酸が，前記ｍＲＮＡに相補的な１４−２４塩基を含む，上記酵素的核酸分子。

（５１） 前記酵素的核酸分子が，配列番号１−１２４５に規定される配列のいずれかから本質的になる，上記酵素的核酸分子。

（５２） 上記酵素的核酸分子を含む哺乳動物細胞。

（５３） 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，上記哺乳動物細胞。

（５４） 上記酵素的核酸分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を，その酵素的核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクター。

（５５） 上記発現ベクターを含む哺乳動物細胞。

（５６） 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，上記哺乳動物細胞。

（５７） 癌を治療する方法であって，患者に上記酵素的核酸分子を投与する工程を含む方法。

（５８） 癌を治療する方法であって，患者に上記発現ベクターを投与する工程を含む方法。

（５９） 癌を治療する方法であって，ａ）患者から細胞を単離し；ｂ）前記細胞に上記酵素的核酸分子を投与し；そしてｃ）前記細胞を前記患者に再導入する，の各工程を含む方法。

（６０） 上記酵素的核酸分子を含む医薬組成物。

（６１） エストロゲンレセプターのレベルに関連する状態を有する患者を治療する方法であって，前記患者に上記酵素的核酸分子を投与することを含む方法。

（６２） エストロゲンレセプターのレベルに関連する状態を有する患者を治療する方法であって，前記患者の細胞を上記核酸分子と接触させることを含み，および１またはそれ以上の薬剤療法を使用することをさらに含む方法。

（６３） 前記核酸分子が，少なくとも５つのリボース残基を含み，前記核酸が，５'末端ヌクレオチドの少なくとも３つにおいてホスホロチオエート結合を含み，前記核酸が前記核酸の４位において２’−Ｃ−アリル修飾を含み，前記核酸が少なくとも１０個の２'−Ｏ−メチル修飾を含み，かつ前記核酸が３’末端修飾を含む，上記酵素的核酸分子。

（６４） 前記核酸が，前記３’末端において３'−３'結合反転リボース部分を含む，上記酵素的核酸。

（６５） 前記核酸分子が，少なくとも５つのリボース残基を含み，前記核酸分子が，５'末端ヌクレオチドの少なくとも３つにおいてホスホロチオエート結合を含み，前記核酸が，前記核酸分子の４位および／または７位において２’−アミノ修飾を含み，前記核酸分子が少なくとも１０個の２'−Ｏ−メチル修飾を含み，かつ前記核酸が３’−末端修飾を含む，上記酵素的核酸分子。

（６６） 前記核酸分子が，少なくとも５つのリボース残基を含み，前記核酸分子が，５'末端ヌクレオチドの少なくとも３つにおいてホスホロチオエート結合を含み，前記核酸分子が，前記核酸分子の４位および／または７位において脱塩基置換を含み，前記核酸が，少なくとも１０個の２'−Ｏ−メチル修飾を含み，かつ前記核酸分子が３’−末端修飾を含む，上記酵素的核酸分子。

（６７） 前記核酸分子が，少なくとも５つのリボース残基を含み，前記核酸が，５'末端ヌクレオチドの少なくとも３つにおいてホスホロチオエート結合を含み，前記核酸分子が，前記核酸分子の４位および／または７位において６−メチルウリジン置換を含み，前記核酸分子が，少なくとも１０個の２'−Ｏ−メチル修飾を含み，かつ前記核酸分子が，３'末端修飾を含む，上記酵素的核酸分子。

（６８） 哺乳動物細胞においてエストロゲンレセプター遺伝子の発現を調節する方法であって，前記細胞に上記酵素的核酸分子を投与することを含む方法。

（６９） 別のＲＮＡ分子を切断する方法であって，上記酵素的核酸分子を，前記別のＲＮＡ分子の切断に適当な条件下で前記別のＲＮＡ分子と接触させることを含む方法。

（７０） 前記切断が二価カチオンの存在下で実施される，上記方法。

（７１） 前記二価カチオンがＭｇ²⁺である，上記方法。

（７２） 前記核酸が化学的に合成されたものである，上記核酸分子。

（７３） 前記ベクターが，
ａ）転写開始領域；
ｂ）転写終止領域；
ｃ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子；
を含み，
前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている，上記発現ベクター。

（７４） 前記ベクターが，
ａ）転写開始領域；
ｂ）転写終止領域；
ｃ）オープンリーディングフレーム；
ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子
を含み，
前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３'−末端に動作可能なように連結されており，
前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている，上記発現ベクター。

（７５） 前記ベクターが，
ａ）転写開始領域；
ｂ）転写終止領域；
ｃ）イントロン；
ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子
を含み，
前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記イントロンおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている，上記発現ベクター。

（７６） 前記ベクターが，
ａ）転写開始領域；
ｂ）転写終止領域；
ｃ）イントロン；
ｄ）オープンリーディングフレーム；
ｅ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子
を含み，
前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３’−末端に動作可能なように連結されており，
前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記イントロン，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている，上記発現ベクター。

（７７） 前記酵素的核酸が，配列番号１２４６−２４９０として規定される配列のいずれかに相補的な配列を含む，上記酵素的核酸分子。

（７８） 前記酵素的核酸分子が，配列番号２４９１−２６０３として規定される配列のいずれかから本質的になる，上記酵素的核酸分子。

（７９） 前記酵素的核酸が，配列番号２６０４−２７１６として規定される配列のいずれかに相補的な配列を含む，上記酵素的核酸分子。

（８０） 前記酵素的核酸がＤＮＡ酵素である，上記酵素的核酸分子。

（８１） 前記酵素的核酸が少なくとも１つの２'−糖修飾を含む，上記酵素的核酸分子。

（８２） 前記酵素的核酸が少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む，上記酵素的核酸分子。

（８３） 前記酵素的核酸が少なくとも１つのホスホロチオエート修飾を含む，上記酵素的核酸分子。

（８４） 前記酵素的核酸分子が，前記３'末端において３'−３'結合反転デオキシリボース部分を含む，上記酵素的核酸分子。

（８５） 前記酵素的核酸分子が，前記３'末端において３'−３'結合反転デオキシリボース部分を含む，上記核酸分子。

（８６） 前記酵素的核酸分子が，前記５'末端において５'−５'結合反転デオキシリボース部分を含む，上記核酸分子。

（８７） 前記酵素的核酸分子が，前記５'末端において５'−５'結合反転デオキシリボース部分を含む，上記酵素的核酸分子。

（８８） 各Ｘが，独立して，式ＩＸ：

［式中，各Ｂは，独立して，修飾されたまたは修飾されていない核酸塩基であり；Ｒ１は，独立して，アルキル，アルキルチオアルキル，フルオロアルキルまたはアルキルチオフルオロアルキルであり；Ｅは，独立して，リン含有基であり；およびＤは，独立して，Ｏ，ブロッキング基またはリン含有基である］
を有するヌクレオチド修飾を含む，上記核酸分子。

（８９） 各Ｘが，独立して，式Ｘ：

［式中，各Ｂは，独立して，修飾されたまたは修飾されていない核酸塩基であり；Ｒ１は，独立して，アルキル，アルキルチオアルキル，フルオロアルキルまたはアルキルチオフルオロアルキルであり；Ｅは，独立して，リン含有基であり；およびＤは，独立して，Ｏ，ブロッキング基またはリン含有基である］
を有するヌクレオチド修飾を含む，上記核酸分子。

（９０） 各Ｘ，Ｚ，またはＸおよびＺの両方が，独立して，式Ｘ：

［式中，各Ｂは，独立して，修飾されたまたは修飾されていない核酸塩基であり；Ｒ１は，独立して，アルキル，アルキルチオアルキル，フルオロアルキルまたはアルキルチオフルオロアルキルであり；Ｅは，独立して，リン含有基であり；およびＤは，独立して，Ｏ，ブロッキング基またはリン含有基である］
を有するヌクレオチド修飾を含む，上記核酸分子。

（９１） 各Ｘ，Ｚ，またはＸおよびＺの両方が，独立して，式ＩＸ：

［式中，各Ｂは，独立して，修飾されたまたは修飾されていない核酸塩基であり；Ｒ１は，独立して，アルキル，アルキルチオアルキル，フルオロアルキルまたはアルキルチオフルオロアルキルであり；Ｅは，独立して，リン含有基であり；およびＤは，独立して，Ｏ，ブロッキング基またはリン含有基である］
を有するヌクレオチド修飾を含む，上記核酸分子。

（９２） （Ｙ）ｎがホスホロチオエート結合を含む，上記核酸分子。

（９３） （Ｙ）ｎがホスホロジチオエート結合を含む，上記核酸分子。

（９４） （Ｙ）ｎが５'−Ｓ−ホスホロチオエート結合を含む，上記核酸分子。

（９５） （Ｙ）ｎがすべての位置においてホスホロチオエート結合からなる，上記核酸分子。

（９６） （Ｙ）ｎがすべての位置においてホスホロジチオエート結合からなる，上記核酸分子。

（９７） （Ｙ）ｎがすべての位置において５'−Ｓ−ホスホロチオエート結合からなる，上記核酸分子。

（９８） （Ｙ）ｎが，ホスホロチオエート結合およびホスホロジチオエート結合の組み合わせを含む，上記核酸分子。

（９９） （Ｙ）ｎがホスホロチオエート結合および５'−Ｓ−ホスホロチオエート結合の組み合わせを含む，上記核酸分子。

（１００） （Ｙ）ｎがホスホロジチオエート結合および５'−Ｓ−ホスホロチオエート結合の組み合わせを含む，上記核酸分子。

（１０１） （Ｙ）ｎがホスホロチオエート結合，ホスホロジチオエート結合および５'−Ｓ−ホスホロチオエート結合の組み合わせを含む，上記核酸分子。

（１０２） （Ｙ）ｎがホスホロチオエート結合および５'−Ｓ−ホスホロジチオエート結合の組み合わせを含む，上記核酸分子。

（１０３） （Ｙ）ｎがホスホロジチオエート結合および５'−Ｓ−ホスホロジチオエート結合の組み合わせを含む，上記核酸分子。

（１０４） （Ｙ）ｎがホスホロチオエート結合および３'−Ｓ−ホスホロチオエート結合の組み合わせを含む，上記核酸分子。

（１０５） （Ｙ）ｎがホスホロジチオエート結合および３'−Ｓ−ホスホロチオエート結合の組み合わせを含む，上記核酸分子。

（１０６） （Ｙ）ｎがホスホロチオエート結合および３'−Ｓ−ホスホロジチオエート結合の組み合わせを含む，上記核酸分子。

（１０７） （Ｙ）ｎがホスホロジチオエート結合および３'−Ｓ−ホスホロジチオエート結合の組み合わせを含む，上記核酸分子。

図１は，９塩基の非デオキシリボヌクレオチド含有オリゴヌクレオチドによりフランキングされた７−９塩基のホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチド配列を有する核酸分子の，標的分子への結合の図式的描写である。 図２は，本発明の核酸分子中に組み込むことができるある種の化学構造の概略図を示す。 図３は，７つの異なる種類の酵素的核酸分子の二次構造モデルを示す。 図４は，ＧＳＶトランスフェクション試薬とともに輸送された，エストロゲンレセプターを標的とするミスマッチアームを有する活性および不活性リボザイムで処理したＭＣＦ−７細胞の細胞増殖速度を比較したグラフである。 図５は，アンチセンス（配列番号２７１７）およびスクランブルアンチセンス（ミスマッチ）対照で処理した後の，ＰＣ−３細胞におけるｃ−ｒａｆ ＲＮＡのＲＮＡレベルを比較したグラフである。 図６Ａは，オリゴデオキシリボヌクレオチドを含有するいくつかの可能なリボザイムを示す。 図６Ｂは，オリゴデオキシリボヌクレオチドを含有するいくつかの可能なリボザイムを示す。 図７は，オリゴヌクレオチド中に組み込むためのヌクレオチド修飾の例を示す。 図８は，ｃ−ｒａｆ配列を標的とするアンチセンス核酸分子で処理した後の，ＰＣ−３細胞におけるｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。 図９は，配列番号２７３８（すべてのデオキシヌクレオチド位置でホスホロチオエート修飾）で示されるアンチセンス分子が，３つの異なる濃度で，５日間でＰＣ−３細胞においてｃ−ｒａｆメッセージを阻害する能力を，未処理およびミスマッチ対照と比較して示すグラフである。 図１０は，配列番号２７３７（オリゴヌクレオチドの５'末端および３'末端の両方における３つのホスホロチオエート修飾ヌクレオチド）で示されるアンチセンス分子が，３つの異なる濃度で，５日間で，ＰＣ−３細胞においてｃ−ｒａｆメッセージを阻害する能力を，未処理対照と比較して示すグラフである。 図１１は，配列番号２７４４（５'末端および３'末端で７塩基の２'−Ｏ−メチルチオメチルＲＮＡヌクレオチドによりフランキングされた９塩基のホスホロチオエート修飾ＤＮＡ）で示されるアンチセンス分子が，３つの異なる濃度で，５日間で，ＰＣ−３細胞においてｃ−ｒａｆメッセージを阻害する能力を，未処理およびミスマッチ対照と比較して示すグラフである。 図１２は，配列番号２７３８および２７４１で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチドが示す細胞増殖の阻害のレベルを示すグラフである。 図１３は，種々の化学修飾を有するオリゴヌクレオチドがｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡを阻害する能力を示すグラフである。 図１４は，アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号２７４１および２７３８）で処理した後の，ＰＣ−３細胞におけるＣ−ｒａｆの用量依存的阻害を示すグラフである。 図１５は，アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの阻害を未処理およびミスマッチ対照と比較して示すグラフである。 図１６は，ｋ−ｒａｓを標的とするいくつかのアンチセンス分子がｋ−ｒａｓメッセージを阻害する能力を示すグラフである。 図１７は，種々の化学修飾を有するオリゴヌクレオチドがエストロゲンレセプターｍＲＮＡを阻害する能力を示すグラフである。 図１８は，３'−デオキシ−３'−チオグアノシンヌクレオシドの合成のスキームを示す（スキーム１）。 図１９は，Ｓ−（ピリジル−２−ジスルファニル）誘導体の合成のスキームを示す（スキーム２）。 図２０は，３'−デオキシ−３'−チオグアノシンホスホルアミダイトの合成のスキームを示す。 図２１は，５'−チオ−ヌクレオシドホスホルアミダイトおよびスクシネートの製造のスキームを示す。 図２２は，３'−チオ−２'−Ｏ−メチルウリジンの合成のスキームを示す。

Claims (8)

1. （ａ）標的ＲＮＡまたはその一部のヌクレオチド配列に相補的な１４−２４ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列；
   （ｂ）二本鎖核酸分子の一方の鎖上の５’−キャップ，３’−キャップ，または５’−キャップと３’−キャップとの両方；および
   （ｃ）修飾されたヌクレオチドおよび修飾されていないヌクレオチドの混合物，ここで，修飾されたヌクレオチドは２’−フルオロ，２’−Ｏ−メチル，２’Ｈまたはこれらの組み合わせであり，修飾されていないヌクレオチドはリボヌクレオチドである，
   を含む化学的に合成された二本鎖核酸分子。
2. 前記キャップが反転ヌクレオチドを含む，請求項１記載の二本鎖核酸分子。
3. 前記反転ヌクレオチドが反転デオキシヌクレオチドを含む，請求項２記載の二本鎖核酸分子。
4. 前記キャップが反転無塩基成分を含む，請求項１記載の二本鎖核酸分子。
5. 前記反転無塩基成分が反転デオキシ無塩基成分を含む，請求項４記載の二本鎖核酸分子。
6. 前記核酸が，１またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む，請求項１記載の二本鎖核酸分子。
7. 前記標的ＲＮＡが哺乳動物遺伝子によりコードされる，請求項１記載の二本鎖核酸分子。
8. 請求項１記載の二本鎖核酸分子を薬学的に許容しうる担体または希釈剤中に含む組成物。
   

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