JP2005528384A - 増殖性細胞においてアポトーシスを誘導するための化合物および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、望まない増殖性細胞(癌細胞が挙げられる)にアポトーシスを誘導するために有用な化合物に関する。本発明はまた、本発明の化合物を、望まない急速な細胞増殖によって特徴付けられる障害(癌が挙げられるが、これに限定されない)の発症を処置、予防、または遅延するために使用する方法にも関する。本発明はまた、本発明の化合物を、特定の種類の癌(白血病、非小細胞肺癌、結腸癌、CNS癌、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、リンパ腫、および乳癌が挙げられるが、これらに限定されない)を処置するために使用する方法にも関する。さらに、アンドロゲン非依存性の癌の発症を処置、予防、および遅延する方法に関する。なおさらに、進行した前立腺癌を処置する方法に関する。
Description
(関連出願の相互参照)
本願は、米国仮特許出願第60/370,664号(2002年4月8日出願)(その全体が、本明細書において参考として援用される)による優先権を主張する。
本願は、米国仮特許出願第60/370,664号(2002年4月8日出願)(その全体が、本明細書において参考として援用される)による優先権を主張する。
(連邦の資金提供を受けた研究または開発に関する陳述)
本発明は、少なくとも部分的には、国立癌研究所により授与された国立衛生研究所補助金CA92307およびCA94829によって、そして、陸軍補助金DAMD17−02−1−0117の下で政府に支援されてなされた。米国政府は、この発明において一定の権利を有し得る。
本発明は、少なくとも部分的には、国立癌研究所により授与された国立衛生研究所補助金CA92307およびCA94829によって、そして、陸軍補助金DAMD17−02−1−0117の下で政府に支援されてなされた。米国政府は、この発明において一定の権利を有し得る。
本発明は、ヒトの癌、特に前立腺癌および他の癌(特に、アンドロゲン非感受性の癌)を処置するための薬剤および方法に関する。
(発明の背景)
転移性前立腺癌のための処置の柱は、ホルモン療法または内分泌療法である(Kozlowski,J.M.ら Urol.Clin.North Am. 18:15−24(1991),およびBalmer,C.ら,Finley,R.S.とBalmer,C.(編),Concepts on Oncology Therapeutics,pp.211−229,Bethesda:ASHP(1998))。それは、前立腺癌内でのアンドロゲン生産またはアンドロゲンの作用のいずれかによって妨害することによる、アンドロゲン除去を目指す。生化学的証拠および形態学的証拠によって、ホルモン除去が、アンドロゲン感受性前立腺癌においてアポトーシス(プログラム細胞死)を起こす活性プロセスを誘導することが実証されている(Kyprianou,N.Cancer Res.50:3748−53(1990))。しかし、患者の前立腺癌が第一線のホルモン療法を受けている間に進行する場合、または、患者が第一線のホルモン療法に全く応答しない場合、その癌は、アンドロゲン非感受性またはホルモン療法抵抗性の前立腺癌(HRPC)として、分類される(Kypianou,N.World J.Urol. 12:299−303(1994)およびBosland,M.C.,Bertino,J.R.(編) Encyclopedia of Cancer,第二巻,pp.1283−96,New York:Academic Press(1997))。アンドロゲン非依存的な状態への進行の原因である機構については、分かりにくいままであるが、この機構は、抗アポトーシスタンパク質 BCL−2の過剰発現、または、プロアポトーシスタンパク質 p53の異常と関連する。アポトーシス耐性にも関わらず、アンドロゲン非依存的な前立腺癌細胞は、アポトーシスに必要とされる基本的な機構をまだ保持している。にもかかわらず、HRPCは、現在利用できる化学療法レジメンは、HRPCを有する患者の生存に対して制限的な影響しか有さないので、常に、致死性の結果を有する(Kozlowski,J.M.ら Urol.Clin.North AM.18:15−24(1991),およびTANNOCLC,I.F. J.Clin.Oncol.3:1013−21(1985))。
転移性前立腺癌のための処置の柱は、ホルモン療法または内分泌療法である(Kozlowski,J.M.ら Urol.Clin.North Am. 18:15−24(1991),およびBalmer,C.ら,Finley,R.S.とBalmer,C.(編),Concepts on Oncology Therapeutics,pp.211−229,Bethesda:ASHP(1998))。それは、前立腺癌内でのアンドロゲン生産またはアンドロゲンの作用のいずれかによって妨害することによる、アンドロゲン除去を目指す。生化学的証拠および形態学的証拠によって、ホルモン除去が、アンドロゲン感受性前立腺癌においてアポトーシス(プログラム細胞死)を起こす活性プロセスを誘導することが実証されている(Kyprianou,N.Cancer Res.50:3748−53(1990))。しかし、患者の前立腺癌が第一線のホルモン療法を受けている間に進行する場合、または、患者が第一線のホルモン療法に全く応答しない場合、その癌は、アンドロゲン非感受性またはホルモン療法抵抗性の前立腺癌(HRPC)として、分類される(Kypianou,N.World J.Urol. 12:299−303(1994)およびBosland,M.C.,Bertino,J.R.(編) Encyclopedia of Cancer,第二巻,pp.1283−96,New York:Academic Press(1997))。アンドロゲン非依存的な状態への進行の原因である機構については、分かりにくいままであるが、この機構は、抗アポトーシスタンパク質 BCL−2の過剰発現、または、プロアポトーシスタンパク質 p53の異常と関連する。アポトーシス耐性にも関わらず、アンドロゲン非依存的な前立腺癌細胞は、アポトーシスに必要とされる基本的な機構をまだ保持している。にもかかわらず、HRPCは、現在利用できる化学療法レジメンは、HRPCを有する患者の生存に対して制限的な影響しか有さないので、常に、致死性の結果を有する(Kozlowski,J.M.ら Urol.Clin.North AM.18:15−24(1991),およびTANNOCLC,I.F. J.Clin.Oncol.3:1013−21(1985))。
HRPCのようなホルモン療法抵抗性の癌を有する患者においてアポトーシスを誘導し得る薬物に対する、長きにわたり感じられていた必要性がある。これらの薬物は、アンドロゲン応答性、BCL−2レベル、およびp53の機能的な状態に非依存的に機能すべきである。これらの薬物は、正常な細胞は悪影響を受けないが、癌細胞においてアポトーシスを誘導する高い能力を有するべきである。これらの薬物はさらに、ヒトにおいて十分に許容されるべきであり、あったとしても少しの副作用しか有すべきではない。
(発明の要旨)
増殖性の細胞(癌細胞が挙げられるが、これに限定されない)にアポトーシスを誘導するために有用な化合物を、式Iにおいて与える:
増殖性の細胞(癌細胞が挙げられるが、これに限定されない)にアポトーシスを誘導するために有用な化合物を、式Iにおいて与える:
本発明のさらなる化合物は、式IIに対応する化合物である:
式IIの好ましい化合物としては、以下が挙げられる:4−[5−(4−アジドフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4[5−(4−(2−アジドエチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(3−アジドプロピル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−メチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−ブチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−アジドブチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−アジドフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−アジドメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−クロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(2,3−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(3,5−ジメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(2,4,5−トリクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(2−フェナントレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(3−インドリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(2−ピロリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−ベンジルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−アジドフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2−アジドエチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3−アジドプロピル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−アジドブチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−アジドフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−L−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−アジドメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2,5−ジメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−プロピルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−ブロモメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2−ブロモエチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3−ブロモプロピル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−ブロモブチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1Hピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−ブロモメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−tert−ブチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(9−アントリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2−フルオレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド4−[5−(4−(4−メチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−ブチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド4−[5−(4−(4−クロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2,3−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3,5−ジメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2,4,5−トリクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2−フェナントレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(3−インドリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2−ピロリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;および4−[5−(4−ベンジルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド。4−[5−(2−フェナントレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミドが、式IIの特に好ましい化合物である。
式IおよびIIの化合物は、増殖性の細胞(癌細胞が挙げられるが、これに限定されない)にアポトーシスを誘導する際に有用である。この化合物はさらに、哺乳動物、特にヒトにおいて、癌の発症を処置、阻害、および遅延するために有用である。これらの化合物が特によく機能する癌としては、白血病、非小細胞肺癌、結腸癌、CNS癌、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、リンパ腫、および乳癌が挙げられるが、これらに限定されない。驚くべきことに、本発明の化合物は、Bcl−2の発現レベルおよびp53の機能状態から独立して、癌細胞にアポトーシスを誘導し得、これは、本発明の化合物が、ホルモン療法耐性前立腺癌のようなアンドロゲン非依存性である癌に対してさえも、強力であることを意味する。
従って、本発明は、望まない増殖性細胞(癌細胞が挙げられる)にアポトーシスを誘導するために有用な化合物に関する。本発明はまた、本発明の化合物を、望まない急速な細胞増殖によって特徴付けられる障害(癌が挙げられるが、これに限定されない)の発症を処置、予防、または遅延するために使用する方法にも関する。本発明はまた、本発明の化合物を、特定の種類の癌(白血病、非小細胞肺癌、結腸癌、CNS癌、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、リンパ腫、および乳癌が挙げられるが、これらに限定されない)を処置するために使用する方法にも関する。さらに、アンドロゲン非依存性の癌の発症を処置、予防、および遅延する方法に関する。なおさらに、進行した前立腺癌を処置する方法に関する。
(発明の詳細な説明)
本発明は、望ましくない増殖性の細胞にアポトーシスを誘導するために有用な化合物、およびこれらの化合物を、このような処置を必要としている被験体中の望ましくない増殖性の細胞にアポトーシスを誘導するために使用する方法を提供する。この方法は、このような処置を必要としている被験体を、本発明の化合物またはその誘導体、あるいは薬学的に受容可能なそれらの塩の治療的有効量で処置する工程を包含する。
本発明は、望ましくない増殖性の細胞にアポトーシスを誘導するために有用な化合物、およびこれらの化合物を、このような処置を必要としている被験体中の望ましくない増殖性の細胞にアポトーシスを誘導するために使用する方法を提供する。この方法は、このような処置を必要としている被験体を、本発明の化合物またはその誘導体、あるいは薬学的に受容可能なそれらの塩の治療的有効量で処置する工程を包含する。
本発明の化合物および方法は、これらには限られないが、癌の発症を処置、阻害、または遅延するために有用である。この化合物および方法はまた、前癌およびその他の望ましくない細胞増殖の発生を処置する際にも有用である。本発明に従って、式IおよびIIの化合物は、望ましくない細胞増殖に罹患している被験体に投与される。本化合物および方法は、癌(白血病、非小細胞肺癌、結腸癌、CNS癌、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、リンパ腫、および乳癌が挙げられるが、これらに限定されない)を処置するために有用である。さらに、それらは、前癌を有する個体、およびこれらの疾患に対する素因を有する個体におけるこれらの癌の予防において有用である。
用語「処置」は、正常な細胞への最小の破壊的効果を有する、望ましくない増殖性の細胞の部分的または全体的破壊を含む。本発明に従って、細胞レベルでの処置の所望される機構は、アポトーシスである。
用語「予防」は、臨床的に明らかな望まない細胞増殖の発生をときに予防すること、または、リスクを有する個体において前臨床的に明らかな段階の望まない急速な細胞増殖の発生を予防することのいずれかを含む。また、悪性細胞の転移の予防、あるいは、悪性細胞の進行を止めるか、または元に戻すことも、この定義に含まれることが意図される。これは、前癌および癌を発症するリスクを有する人の予防的(prophylactic)処置を含む。
用語「治療的に有効」および「薬学的に有効」は、代表的には代替的な療法に関連する副作用を避けながら、各薬剤それ自体の処置による疾患の重篤度および発症頻度の改善の目的を達成する各薬剤の量を定めることを意図する。
処置の目的としての用語「被験体」は、望まない急速な細胞増殖によって特徴付けられる障害を有する、任意のヒトまたは動物の被験体を含む。このような疾患としては、癌および前癌が挙げられるが、これらに限定されない。予防する方法について、被験体は、任意のヒトまたは動物の被験体であり、好ましくは、癌のような望まない急速な細胞増殖によって特徴付けられる障害を得るリスクのあるヒト被験体である。被験体は、発癌性因子への曝露、望まない急速な細胞増殖によって特徴付けられる障害に対して遺伝的な素因を有することなどに起因するリスクを有し得る。ヒトの処置に対して有用であることに加えて、本発明の化合物はまた、哺乳動物(ペットおよび家畜(例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、およびブタが挙げられるが、これらに限定されない))の獣医学的な処置においても有用である。好ましくは、被験体は、ヒトを意味する。
本発明の化合物は、多数の異なる機構によって細胞死を引き起こし得るが、本発明の化合物の1つの局面は、それらが望まない増殖性の細胞にアポトーシスを誘導し得るということである。用語「アポトーシス」とは、プログラム細胞死のプロセスをいう。全ての人において、数百、数千の古い細胞または損傷した細胞が、アポトーシスのプロセスによって毎日死に、そして置き換えられて、体内の生存する細胞の一定数を維持するように盛衰する。古い細胞および損傷した細胞は、標的細胞に自らを破壊するように細胞表面上で誘導するシグナルに応答して死ぬ。アポトーシスは、炎症(膨らみ、赤み、痛みおよび圧痛を含む)を引き起こす、壊死のような他の細胞死とは区別される。アポトーシスは、このような反応を刺激しない。アポトーシスでは、細胞がしぼみ、壊れて断片となり、そしてその内容物が、炎症を誘導しない方法で速やかに除去される。これらの理由から、癌細胞のような急速に増殖する細胞においては、壊死よりもアポトーシスを誘導することが非常に望ましい。しかし、いくつかの癌細胞における変異によって、これらの細胞はアポトーシスに対して耐性を得る。式IおよびIIの化合物は、変異のために、他の方法ではアポトーシスに対して耐性である癌細胞においてでさえ、アポトーシスを誘導することが見出された。アポトーシスは、顕微鏡観察のような当該分野で公知の方法によって、他の処置機構とは区別され得る。
用語「増殖性細胞」、「増殖性の細胞」、「急速に増殖する細胞」、「望まれない増殖性の細胞」、「望まれない急速に増殖する細胞」、「望まない増殖性の細胞」、「望まない急速に増殖する細胞」などは、癌細胞、前癌細胞、および被験体中の他の異常な急速に分裂する細胞をいう。
本明細書で使用される場合、用語「COX−2阻害」とは、シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)酵素を効果的に阻害し得る化合物であり、一般的にIC50値(50%阻害のための濃度)として表現される。不幸なことに、COX−2阻害剤は、非常に重篤な胃腸毒性(GI潰瘍、大量の出血、潰瘍の形成、および胃、小腸、または大腸の穿孔を含む)を有し、時々死に至ることが見出されている。消化性潰瘍および/または胃腸潰瘍の以前の病歴を有する患者、ならびに抗凝固剤などの特定の投薬を受けているか、または喫煙している患者、ならびに高齢または一般的に健康状態が良くない患者にとっては、これらのリスクは非常に大きい。さらに、これらのリスクは、処置が進行するにつれて増大する。これらのリスクのために、本発明の化合物は、COX−2阻害的ではないことが望ましい。従って、本発明の化合物は、COX−2に対して100μM以上のIC50を有することが、非常に望ましい。
本発明の化合物は、式Iで示される:
本発明の化合物の好ましいクラスは、R1が、カルボキシアミドであり、R2が、トリフルオロメチルであり、そして、Arが、2−ナフチル、4−ビフェニル、9−アントリル、2−フルオレニル、4−アジドフェニル、4−アジドメチルフェニル、4−(2−アジドエチル)フェニル、4−(3−アジドプロピル)フェニル、4−(4−アジドブチル)フェニル、4−(4−アジドフェニル)フェニル、4−(4−アジドメチルフェニル)フェニル、4−メチルフェニル、4−エチルフェニル、4−プロピルフェニル、4−ブチルフェニル、4−(2−ブロモエチル)フェニル、4−(3−ブロモプロピル)フェニル、4−(4−ブロモブチル)フェニル、4−(トリフルオロメチル)フェニル、4−(4−メチルフェニル)フェニル、4−(4−ブロモメチルフェニル)フェニル、4−(4−ブチルフェニル)フェニル、4−(4−tert−ブチルフェニル)フェニル、2−クロロフェニル、4−クロロフェニル、2,4−ジクロロフェニル、3,4−ジクロロフェニル、2,5−ジクロロフェニル、2,4−ジメチルフェニル、2,5−ジメチルフェニル、3,4−ジメチルフェニル、3,5−ジメチルフェニル、4−(4−クロロフェニル)フェニル、4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル、4−(2,3−ジクロロフェニル)フェニル、4−(3,5−ジメチルフェニル)フェニル、4−(2,4,5−トリクロロフェニル)フェニル、4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル、2−フェナントレニル、3−インドリル、2−ピロリル、および4−(ベンジル)フェニルから選択される式Iの化合物である。当業者は、使用され得る他の置換アリールラジカルを認識する。
式Iの特定の化合物のファミリーは、以下の化合物およびその薬学的に受容可能な塩からなる:4−[5−(2−ナフチル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−ビフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(9−アントリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2−フルオレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−アジドフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−アジドメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2−アジドエチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3−アジドプロピル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−アジドブチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−アジドフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−アジドメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−メチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−エチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−プロピルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−ブチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2−ブロモエチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3−ブロモプロピル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−ブロモブチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(トリフルオロメチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−メチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−ブロモメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−ブチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−tert−ブチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2,4−ジクロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(3,4−ジクロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2,5−ジクロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2,4−ジメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2,5−ジメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(3,4−ジメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(3,5−ジメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−クロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2,3−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3,5−ジメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2,4,5−トリクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2−フェナントレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(3−インドリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2−ピロリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;および4−[5−(4−(ベンジル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド。
本発明の第2のクラスの化合物は、式IIの化合物である:
式II内の特に興味深い特定の化合物のファミリーは、以下の化合物ならびにそれらの誘導体、および薬学的に受容可能な塩からなる:4−[5−(4−アジドフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(2−アジドエチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(3−アジドプロピル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−アジドブチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−ブチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−メチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−アジドフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−アジドメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−クロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(2,3−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(3,5−ジメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(2,4,5−トリクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1Hピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(2−フェナントレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(3−インドリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(2−ピロリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−ベンジルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−アジドフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2−アジドエチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3−アジドプロピル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−アジドブチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−アジドフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−アジドメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2,5−ジメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−プロピルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2−ブロモエチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−ブチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−メチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3−ブロモプロピル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−ブロモブチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−ブロモメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−tert−ブチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(9−アントリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2−フルオレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−クロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2,3−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3,5−ジメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2,4,5−トリクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2−フェナントレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(3−インドリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2−ピロリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;および4−[5−(4−ベンジルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド。
誘導体は、式IおよびIIの化合物に構造的に関連するか、または、実質的に等価の活性(その誘導体の、実質的なCOX−2阻害を伴うことなく、急速に増殖する細胞にアポトーシスを誘導する能力によって測定される)を有する任意の化合物を含むことが意図される。例示の様式によって、このような化合物としては、それらのプロドラッグが挙げられ得るが、これらに限定されない。このような化合物は、例えば、代謝機構などによって、インビボで形成され得る。
本発明はまた、望ましくない急速に増殖する細胞(癌細胞が挙げられるが、これに限定されない)にアポトーシスを誘導する治療法に関する。本方法は、障害を有するか、または急速に増殖する細胞を伴う障害の素因を有する被験体に、治療的有効量の式Iまたは式IIの化合物を投与する工程を包含する。
単独でか、または他の用語と共に(例えば、ハロアルキル、またはアルキルアリール)、アルキルという用語を使用する場合、それは、C1〜C10の直鎖状かまたは分岐したアルキルラジカルを含み、例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、tert−ブチルなどが挙げられる。用語「ハロアルキル」は、1つ以上のハロラジカルで置換された、C1〜C10の直鎖状または分岐したアルキルラジカルを含む。ハロアルキルラジカルのいくつかの例としては、トリフルオロメチル、1,2−ジクロロエチル、3−ブロモプロピルなどが挙げられる。用語「ハロ」は、F、Cl、Br、およびIから選択されたラジカルを含む。本発明のアルキルラジカルの置換基はまた、アジド(例えば、アジドメチル、2−アジドエチル、3−アジドプロピルなど)のような他の基によって置換され得る。
用語「アリール」は、単独でか、または他の用語と組合わせて(例えば、アルキルアリール、ハロアリール、ハロアルキルアリールなど)使用され、芳香ラジカル(フェニル、ビフェニル、およびベンジルなど)および融合アリールラジカル(例えば、ナフチル、アントリル、フェナントレニル、フルオレニル、およびインデニルなど)を含む。用語「アリール」はまた、芳香環中に炭素および1つ以上のヘテロ原子(例えば、O、N、またはS)を有するアリールである「ヘテロアリール」を含む。ヘテロアリールの例としては、インドリル、ピロリルなどが挙げられる。「アルキルアリール」または「アリールアルキル」とは、アルキルで置換したアリール基(例えば、ブチルフェニル、プロピルフェニル、エチルフェニル、メチルフェニル、3,5−ジメチルフェニル、tert−ブチルフェニルなど)をいう。「ハロアリール」とは、1つ以上の置換可能な位置が、ハロラジカルで置換されている、アリールラジカルをいい、例としては、フルオロフェニル、4−クロロフェニル、2,5−クロロフェニルなどが挙げられる。「ハロアルキルアリール」とは、ハロアルキル置換基を有するアリールラジカルをいう。ハロアルキルアリールの例としては、ブロモメチルフェニル、4−ブロモブチルフェニルなどのラジカルが挙げられる。カルボキシアミドとは、−CONH2という基をいい、そしてスルホンアミドとは、−SO2NH2という基をいう。
それらの薬学的に受容可能な塩もまた、式IおよびIIの化合物のファミリーに含まれる。語句「薬学的に受容可能な塩」は、アルカリ金属塩を形成するため、および遊離酸または遊離塩基の付加塩を形成するために一般に使用される塩を含む。薬学的に受容可能である場合、その塩の性質は重要ではない。式IおよびIIの化合物の適した薬学的に受容可能な酸付加塩は、無機酸から、または有機酸から調製され得る。このような無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、およびリン酸である。適切な有機酸は、有機酸の脂肪族、シクロ脂肪族、芳香族、アルリファティック(araliphatic)、複素環、カルボン酸、およびスルホン酸の有機酸クラスから選択され得、その例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルコロン酸(glucoronic acid)、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸(mesylic acid)、サリチル酸、p−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、アンボン酸(ambonic acid)、パモイック酸(pamoic acid)、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロへキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルゲン酸(algenic acid)、β−ヒドロキシブチル酸(β−hydroxybutyric acid)、粘液酸、およびガラクツロン酸が挙げられる。式Iおよび式IIの化合物の適切な薬学的に受容可能な塩基付加塩としては、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、および亜鉛からなる金属塩が挙げられる。あるいは、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン(N−メチルグルカミン)およびプロカインからなる有機塩が、式Iおよび式IIの化合物の塩基付加塩を形成するために使用され得る。これらの全ての塩は、従来の手段を使用して、例えば、適切な酸または塩基を式Iおよび式IIの化合物と反応させることによって、式Iおよび式IIの対応する化合物から調製され得る。
本明細書で開示される全ての例は、単なる例示の目的のみであり、いかなる様式でも特許請求される発明を制限することを意味しない。
(一般的合成手順)
式Iのカルボキシアミド化合物の合成についての一般的スキームを下に示す。詳細な合成を以下に示す。
式Iのカルボキシアミド化合物の合成についての一般的スキームを下に示す。詳細な合成を以下に示す。
(b)(4−カルバモイルフェニル)ヒドラジン−HCl、C2H5OH、還流
( 4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼン−カルボキシアミド )
表題の化合物を、2工程の合成によって合成した。(工程a) 4,4,4−トリフルオロ−1−(4−クロロフェニル)ブタン−1,3−ジオンの調製を、以下のようにして行った。5mLのメチルtert−ブチルエーテル(MTBE)中のエチルトリフルオロアセテート(1.08g、7.61mmol)溶液にメタノール(1、8mL)中の25%のナトリウムメトキシドを2分間にわたり添加した。2mLのMTBE中の4−クロロアセトフェノン(1g,6.46mmol)溶液をこの混合物に5分間にわたって滴加した。16時間の混合後、3N HCl(3.4mL)を添加した。有機層を収集し、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、そして濃縮して黄橙色の固体を得た。へキサンからの再結晶化により、ジオン(1.18g、86%)を得た。(工程b) (4−カルバモイルフェニル)ヒドラジン塩酸塩(228mg、1.21mmol)を20mLのエタノール中の上述のジオン(300mg、1.21mmol)の攪拌している溶液に添加した。この混合物を24時間還流下で攪拌し、室温まで冷却し、そして濃縮して乾燥させた。この残留物を酢酸エチルに溶解し、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、そして濃縮して明るい茶色の固体を得た。酢酸エチルとへキサンからの再結晶化により、表題の化合物を得た(350mg、80%)。
上述の2工程の手順を使用して、表題の化合物を2’,4’−ジクロロアセトフェノンから合成した(全体収率 52%)。
上述の2工程の手順を使用して、表題の化合物を2’,5’−ジクロロアセトフェノンから合成した(全体収率 60%)
上述の2工程の手順を使用して、表題の化合物を3’,4’−ジクロロアセトフェノンから合成した。(全体収率 55%)
上述の2工程の手順を使用して、表題の化合物を4’−メチルアセトフェノンから合成した。(全体収率 65%)
上述の2工程の手順を使用して、表題の化合物を4’−トリフルオロメチルアセトフェノンから合成した。(全体収率 53%)
上述の2工程の手順を使用して、表題の化合物を4’−エチルアセトフェノンから合成した。(全体収率 44%)
上述の2工程の手順を使用して、表題の化合物を2’,4’−ジメチルアセトフェノンから合成した。(全体収率 62%)
上述の2工程の手順を使用して、表題の化合物を2’,5’−ジメチルアセトフェノンから合成した。(全体収率 58%)
上述の2工程の手順を使用して、表題の化合物を3’,5’−ジメチルアセトフェノンから合成した。(全体収率 56%)
( 4−[5−(4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミドの合成 )
表題の化合物を3工程の合成によって合成した。(工程a) 4−(4−トリフルオロメチルフェニル)アセトフェノンの調製を以下のようにして行った。4−ブロモベンゾトリフルオライド(1.0g、4.4mmol)と4−アセチルフェニルボロン酸(0.739g、4.4mmol)の混合物に、Pd(OAc)2(1.97mg)、K2CO3(1.54g)、Bu4NBr(1.43g)およびH2O(7mL)を添加し、この混合物をアルゴン下で30分間攪拌し、70℃まで温め、そして1時間攪拌を続けた。この溶液を室温まで冷却し、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。この中間体をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した(収率86%)。(工程b) 冷却したCH2Cl2中のエチルトリフルオロアセテート(1.0g、7.04mmol)溶液に、NaH(338mg、14.1mmol)を添加し、15分間攪拌し、次いで、CH2Cl2中の4−(4−トリフルオロメチルフェニル)アセトフェノン(1.86g、7.04mmol)溶液を添加した。この混合物を室温で6時間攪拌し、シリカゲルクロマトグラフィーにより4,4,4−トリフルオロ−1−(4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル)ブタン−1,3−ジオン(2.1g、収率83%)を得た。(工程c) 20mLの酢酸エチル中の上記のジオン(320mg、0.89mmol)の攪拌している溶液に(4−スルファモイルフェニル)ヒドラジン塩酸塩(200mg、0.89mmol)を添加し、この混合物を加熱して還流し、24時間攪拌した。室温まで冷却した後で、この反応混合物を真空で濃縮した。残存物を酢酸エチルに溶解し、水とブラインで洗浄した。生成物をクロマトグラフィーで精製し、表題の化合物を得た(290mg、収率71%)。
表題の化合物を3工程の合成によって合成した。(工程a) 4−(4−トリフルオロメチルフェニル)アセトフェノンの調製を以下のようにして行った。4−ブロモベンゾトリフルオライド(1.0g、4.4mmol)と4−アセチルフェニルボロン酸(0.739g、4.4mmol)の混合物に、Pd(OAc)2(1.97mg)、K2CO3(1.54g)、Bu4NBr(1.43g)およびH2O(7mL)を添加し、この混合物をアルゴン下で30分間攪拌し、70℃まで温め、そして1時間攪拌を続けた。この溶液を室温まで冷却し、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。この中間体をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した(収率86%)。(工程b) 冷却したCH2Cl2中のエチルトリフルオロアセテート(1.0g、7.04mmol)溶液に、NaH(338mg、14.1mmol)を添加し、15分間攪拌し、次いで、CH2Cl2中の4−(4−トリフルオロメチルフェニル)アセトフェノン(1.86g、7.04mmol)溶液を添加した。この混合物を室温で6時間攪拌し、シリカゲルクロマトグラフィーにより4,4,4−トリフルオロ−1−(4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル)ブタン−1,3−ジオン(2.1g、収率83%)を得た。(工程c) 20mLの酢酸エチル中の上記のジオン(320mg、0.89mmol)の攪拌している溶液に(4−スルファモイルフェニル)ヒドラジン塩酸塩(200mg、0.89mmol)を添加し、この混合物を加熱して還流し、24時間攪拌した。室温まで冷却した後で、この反応混合物を真空で濃縮した。残存物を酢酸エチルに溶解し、水とブラインで洗浄した。生成物をクロマトグラフィーで精製し、表題の化合物を得た(290mg、収率71%)。
( 4−[5−(4−ブチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミドの合成 )
表題の化合物を2工程の合成によって合成した。(工程a) 冷却したCH2C12中のエチルトリフルオロアセテート(1.0g、7.04mmol)溶液に、NaH(338mg、14.1mmol)を添加し、15分間攪拌し、次いで、CH2C12中の4−ブチルアセトフェノン(1.23g、7.04mmol)溶液を添加した。この混合物を室温で6時間攪拌した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、4,4,4−トリフルオロ−1−(4−ブチルフェニル)ブタン−1,3−ジオン(1.63g、収率85%)を得た。(工程b) (4−スルファモイルフェニル)ヒドラジン塩酸塩(200mg、0.89mmol)を攪拌している20mLの酢酸エチル中の上述のジオン(244mg、0.89mmol)に添加し、この混合物を加熱し、還流して、24時間攪拌した。室温まで冷却した後で、この反応混合物を真空で濃縮した。残留物を酢酸エチルに溶解し、水およびブラインで洗浄した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、表題の化合物を得た(246mg、収率65%)。
表題の化合物を2工程の合成によって合成した。(工程a) 冷却したCH2C12中のエチルトリフルオロアセテート(1.0g、7.04mmol)溶液に、NaH(338mg、14.1mmol)を添加し、15分間攪拌し、次いで、CH2C12中の4−ブチルアセトフェノン(1.23g、7.04mmol)溶液を添加した。この混合物を室温で6時間攪拌した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、4,4,4−トリフルオロ−1−(4−ブチルフェニル)ブタン−1,3−ジオン(1.63g、収率85%)を得た。(工程b) (4−スルファモイルフェニル)ヒドラジン塩酸塩(200mg、0.89mmol)を攪拌している20mLの酢酸エチル中の上述のジオン(244mg、0.89mmol)に添加し、この混合物を加熱し、還流して、24時間攪拌した。室温まで冷却した後で、この反応混合物を真空で濃縮した。残留物を酢酸エチルに溶解し、水およびブラインで洗浄した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、表題の化合物を得た(246mg、収率65%)。
( 4−[5−(2−フェナントレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミドの合成 )
表題の化合物をマルチグラム(multigram)スケールで、以下のスキームに従って合成した:
表題の化合物をマルチグラム(multigram)スケールで、以下のスキームに従って合成した:
精製に関して、1,3−ジカルボニル中間体をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、最終生成物を反応混合物からの結晶化によって98%よりも大きい純度で単離し得る。全体的に、合成と精製の手順は、簡単であり、大規模な生産に適合しやすい。
(実施例1〜13)
以下の手順を用いて、サンプル1〜13を、アポトーシスを誘導する能力にについて試験した。結果を化合物についてのIC50と共に表1に列挙する。
以下の手順を用いて、サンプル1〜13を、アポトーシスを誘導する能力にについて試験した。結果を化合物についてのIC50と共に表1に列挙する。
(アポトーシスについての分析)
(アポトーシスELISA)
アポトーシスの誘導もまた、製造者の指示に従って「細胞死検出ELISA」アッセイ(Boehringer−Mannheim)を用いて評価した。この試験は、アポトーシス死を誘導した後で、モノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームの形態の細胞質のヒストン結合DNAフラグメントの定量的測定に基づく。簡潔には、PC−3細胞(2.5×106)を、実験の24時間前にT−75フラスコに入れた。細胞を5mLの無血清RPMI1640培地で2回洗浄し、次いで、異なる濃度の試験物質またはDMSOビヒクルで異なる時間間隔の間処理した。浮かんでいる細胞および接着している細胞の両方を収集し、そして、104個の細胞と等価の細胞溶解液をELISA分析のために使用した。
(アポトーシスELISA)
アポトーシスの誘導もまた、製造者の指示に従って「細胞死検出ELISA」アッセイ(Boehringer−Mannheim)を用いて評価した。この試験は、アポトーシス死を誘導した後で、モノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームの形態の細胞質のヒストン結合DNAフラグメントの定量的測定に基づく。簡潔には、PC−3細胞(2.5×106)を、実験の24時間前にT−75フラスコに入れた。細胞を5mLの無血清RPMI1640培地で2回洗浄し、次いで、異なる濃度の試験物質またはDMSOビヒクルで異なる時間間隔の間処理した。浮かんでいる細胞および接着している細胞の両方を収集し、そして、104個の細胞と等価の細胞溶解液をELISA分析のために使用した。
本明細書に記載される全ての化合物を、3つの別の細胞系統(アンドロゲン依存性LNCaP(p53+/+)、アンドロゲン非依存性PC−3(p53−/−)およびBcl−2過剰発現PC−3(PC−3/Bcl−2)を含む)においてアポトーシス死を誘導する能力について評価した。個々の化合物の能力は、指示する濃度で50%のアポトーシス死を生じさせるために必要な時間を示すT1/2として表した。これらの細胞系列を用いて得られた結果はほとんど同じであり、これは、アポトーシスの誘導が、アンドロゲン感受性、p53の機能的状態、およびBcl−2の発現レベルに非依存的であったことを示す。
本発明の化合物を、National Cancer Institute Developmental Therapeutics Programによって、以下の細胞系統について試験した。
実施例14〜19 白血病
CCRF−CEM
HL−60
K−562
MOLT−4
RPMI−8826
SR
実施例20〜28 非小細胞肺癌
A549/ATCC
EKVX
HOP−62
HOP−92
NCI−H226
NCI−H23
NCI−H322M
NCI−H460
NCI−522
実施例29〜34 結腸癌
COLO 205
HCT−116
HCT−15
HT29
KM12
SW−620
実施例35〜40 CNS癌
SF−268
SF−295
SF−539
SNB−19
SNB−75
U251
実施例41〜47 黒色腫
LOX IMVI
MALME−3M
M14
SK−MEL−2
SK−MEL−5
UACC−257
UACC−62
実施例48〜53 卵巣癌
IGROV1
OVCAR−3
OVCAR−4
OVCAR−5
OVCAR−8
SK−OV−3
実施例54〜61 腎臓癌
786−0
A498
ACHN
AKI−1
RXF 393
SN12C
TK−10
UO−31
実施例62〜63 前立腺癌
PC−3
DU−145
実施例64〜71 乳癌
MCF−7
NCI/ADR−RES
MDA−MB−231/ATCC
HS 578T
MDA−MB−435
MDA−N
BT−549
T−47D
本発明は、望ましくない急速に増殖する細胞に、例えば、このような処置を必要とする被験体における癌の発症を処置、予防、または遅延するために、アポトーシスを誘導するための薬学的組成物を含む。薬学的組成物は、少なくとも1種類の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、または希釈剤(本明細書では、集合的に「キャリア材料」という)、および所望の場合には、他の活性成分と組合わせて、治療的有効量の式IまたはIIの化合物、あるいはその薬学的に受容可能な塩を含む。本発明の活性化合物は、当業者に公知の任意の適切な経路によって、好ましくはこのような経路に適合した薬学的組成物の形態で、および意図する処置について有効な用量で投与され得る。例えば、活性化合物および活性組成物は、経口投与、脈菅内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、気管支内投与、皮下投与、筋肉内投与または局所投与(エアロゾルを含む)され得る。いくつかの被験体については、全身投与ではなく、局所投与が好ましい。液体ビヒクル内への処方が、生物利用性を増大させるために使用され得る。
CCRF−CEM
HL−60
K−562
MOLT−4
RPMI−8826
SR
実施例20〜28 非小細胞肺癌
A549/ATCC
EKVX
HOP−62
HOP−92
NCI−H226
NCI−H23
NCI−H322M
NCI−H460
NCI−522
実施例29〜34 結腸癌
COLO 205
HCT−116
HCT−15
HT29
KM12
SW−620
実施例35〜40 CNS癌
SF−268
SF−295
SF−539
SNB−19
SNB−75
U251
実施例41〜47 黒色腫
LOX IMVI
MALME−3M
M14
SK−MEL−2
SK−MEL−5
UACC−257
UACC−62
実施例48〜53 卵巣癌
IGROV1
OVCAR−3
OVCAR−4
OVCAR−5
OVCAR−8
SK−OV−3
実施例54〜61 腎臓癌
786−0
A498
ACHN
AKI−1
RXF 393
SN12C
TK−10
UO−31
実施例62〜63 前立腺癌
PC−3
DU−145
実施例64〜71 乳癌
MCF−7
NCI/ADR−RES
MDA−MB−231/ATCC
HS 578T
MDA−MB−435
MDA−N
BT−549
T−47D
本発明は、望ましくない急速に増殖する細胞に、例えば、このような処置を必要とする被験体における癌の発症を処置、予防、または遅延するために、アポトーシスを誘導するための薬学的組成物を含む。薬学的組成物は、少なくとも1種類の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、または希釈剤(本明細書では、集合的に「キャリア材料」という)、および所望の場合には、他の活性成分と組合わせて、治療的有効量の式IまたはIIの化合物、あるいはその薬学的に受容可能な塩を含む。本発明の活性化合物は、当業者に公知の任意の適切な経路によって、好ましくはこのような経路に適合した薬学的組成物の形態で、および意図する処置について有効な用量で投与され得る。例えば、活性化合物および活性組成物は、経口投与、脈菅内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、気管支内投与、皮下投与、筋肉内投与または局所投与(エアロゾルを含む)され得る。いくつかの被験体については、全身投与ではなく、局所投与が好ましい。液体ビヒクル内への処方が、生物利用性を増大させるために使用され得る。
本発明の投与は、予防目的または処置目的のいずれかのためであり得る。本明細書で使用される方法および組成物は、単独で、または、望まない細胞の急速な増殖によって特徴付けられる障害の予防または処置において当業者に公知のさらなる治療剤と組合わせて使用され得る。あるいは、本明細書で記載される方法および組成物は、付属的療法として使用され得る。例として、本発明のアポトーシス誘導性化合物は、単独で、あるいは他の抗新生物薬剤、または他の成長阻害薬剤または他の薬物または栄養分と組合わせて、投与され得る。
商業的使用、臨床的評価、および前臨床的開発に利用可能な抗新生物薬剤は多く存在し、癌または、細胞の急速な増殖によって特徴付けられる他の障害の多剤併用化学療法による処置のために選択され得る。このような抗新生物薬剤は、いくつかの主要なカテゴリー、すなわち、抗生物質型薬剤、アルキル化薬剤、抗代謝産物薬剤、ホルモン薬剤、免疫学的薬剤、インターフェロン型薬剤、および混合薬剤のカテゴリーに入る。あるいは、MMP−13阻害剤(バチアスタット(batiastat)、マリマスタット(marimastat)、Agouron Pharmaceuticals AG−3340、およびRoche RO−32−3555が挙げられる)のようなメタロマトリクス プロテアーゼ インヒビター(MMP)またはα1’β3阻害剤などの他の抗新生物薬剤が使用され得る。併用療法において使用され得る適切な薬剤は、当業者によって認識される。同様に、併用療法が望ましい場合、当業者に公知の放射線防護活性の薬剤もまた使用され得る。
語句「補助療法」(または「併用療法」)は、本発明の化合物と1種類以上の他の薬学的薬剤の使用を定義している場合、薬物の併用の有効な効果を提供する治療レジメンにおいて、連続的な様式での各薬剤の投与を含むことが意図され、同様に、実質的に同時の様式(例えば、固定した比のこれらの活性薬剤を有する1回の処方として、または複数回の各薬剤の別個の処方として)でのこれらの薬剤の同時投与を含むことも意図される。
経口投与について、薬学的組成物は、例えば、錠剤、カプセル、懸濁液または液体の形態であり得る。薬学的組成物は、好ましくは、特定の量の活性成分を含む投薬単位の形態で製造される。このような投薬単位の例は、カプセル、錠剤、粉末、顆粒または懸濁液であり、従来の添加物(例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはポテトスターチ)を有する;結合剤(例えば、結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン)を有する;崩壊剤(disintegrator)(例えば、コーンスターチ、ポテトスターチまたは、ナトリウムカルボキシメチル−セルロース)を有する;および潤滑剤(例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム)を有する。活性成分はまた、組成物としての注射により投与され得、ここで、例えば、生理食塩水、ブドウ糖または水が適切なキャリアとして使用され得る。
静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、または腹腔内投与について、化合物は、好ましくはレシピエントの血液と等張性である滅菌した水溶液と組合わせられ得る。生理学的に適合性の物質(例えば、塩化ナトリウム、グリシンなど)を含有し、生理学的条件に適合性のpHに緩衝した水に、固体の活性成分を溶解して水溶液を作製し、そしてこの溶液を滅菌状態にすることによって、このような処方物を調性し得る。この処方物は、単位容器または多用量容器(例えば、密封されたアンプルまたはバイアル)中に存在し得る。
望まない増殖性の細胞が、G.I.菅に局在している場合、化合物は、当該分野で公知の酸安定性で、塩基不安定性であるコーティングにと共に処方され得、このコーティングは、pHが高い小腸において溶解し始める。局所的な薬理学的効果を増強し、全身での取り込みを軽減するための処方物が、好ましい。
非経口的投与に適した処方物は、好ましくは等張性にされた、滅菌した活性化合物の水性調製物を好都合に含む。注射のための調製物はまた、非水性溶媒(例えば、植物油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコール)に化合物を懸濁するか、または乳化することによっても処方され得る。
局所的使用のための処方物は、公知のゲル、クリーム、オイルなどを含む。エアロゾル送達について、化合物は、生理食塩水のような公知のエアロゾル賦形剤と共に処方され得、市販の噴霧器を使用して投与され得る。脂肪酸供給源中への処方は、生物適合性を増大させるために使用され得る。
直腸投与について、活性成分は、室温では固体であり、体温では溶けるか、または溶解する基材を用いて、坐剤中に処方され得る。一般的に使用される基材としては、カカオ脂、グリセリンゼラチン、水素添加した植物油、種々の分子量のポリエチレングリコール、およびポリエチレンステアレートの脂肪酸エステルが挙げられる。
投薬形態および投薬量は、公知の処置または予防レジメンを参照して、容易に確立され得る。投与される治療的活性化合物の量、ならびに、本発明の化合物および/または組成物で疾患状態を処置するための投薬レジメンは、種々の因子(被験体の年齢、体重、性別、および医学的状態、疾患の重篤度、投与の経路および頻度、ならびに使用される特定の化合物、望まない増殖性の細胞の位置、ならびに処置される個体の薬物速度論的特性が挙げられる)に依存し、従って、大きく変動し得る。化合物が全身的ではなく局所的に投与される場合、および治療のためではなく予防のために投与される場合、投薬量は、一般的にはより低い。このような処置は、必要な頻度で、および処置医によって必要と判断された期間で、行われ得る。投薬プログラムまたは投与される阻害剤の治療的有効量は、各個体について最適化される必要があり得ることを当業者は理解する。薬学的組成物は、約0.1〜2000mgの範囲、好ましくは約0.5〜500mgの範囲、そして最も好ましくは約1mgと200mgとの間で、活性成分を含み得る。1日の用量は、体重1kgあたり約0.01〜100mg、好ましくは体重1kgあたり約0.1と約50mgとの間が適切であり得る。1日の用量は、1日あたり1〜4回で投与され得る。
(シクロオキシゲナーゼ−2、前立腺癌細胞でのシクロオキシゲナーゼ−2阻害剤誘導性アポトーシスにおけるプレイヤーまたはスペクテーター)
(背景:)シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤の抗腫瘍活性は、COX−2酵素の阻害およびアポトーシスの誘導に関すると考えられているが、COX−2の阻害が、アポトーシスに必要であるのか否かについては未解明である。種々のCOX−2阻害剤は、COX−2の阻害については類似するIC50値(50%阻害についての濃度)を有するが、アポトーシスを誘導する能力においては非常に異なり、このことは、COX−2非依存的な経路が、アポトーシスに関与しているかもしれないことを示唆する。この仮説を試すために、本発明者らは、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞系統PC−3において、COX−2除去のアポトーシスに対する影響を調査し、COX−2阻害剤であるセレコキシブ(celecoxib)の構造−活性研究を行った。(方法:)Tet−On COX−2アンチセンスクローンを単離して、COX−2阻害剤によるアポトーシス誘導に対する細胞の生存および感受性についてのCOX−2発現の影響を評価した。差次的にCOX−2を発現する未処理のTet−Onクローン、およびドキシサイクリンで処理したクローンからCOX−2を除去した。本発明者らは、種々のCX−2阻害活性を有する種々のセレコキシブアナログを合成して、特徴づけし、そして、PC−3細胞において、それらのアポトーシス活性を測定した。アポトーシスは、4回の試験で評価した。全ての統計的試験は、両側試験である。
(背景:)シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤の抗腫瘍活性は、COX−2酵素の阻害およびアポトーシスの誘導に関すると考えられているが、COX−2の阻害が、アポトーシスに必要であるのか否かについては未解明である。種々のCOX−2阻害剤は、COX−2の阻害については類似するIC50値(50%阻害についての濃度)を有するが、アポトーシスを誘導する能力においては非常に異なり、このことは、COX−2非依存的な経路が、アポトーシスに関与しているかもしれないことを示唆する。この仮説を試すために、本発明者らは、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞系統PC−3において、COX−2除去のアポトーシスに対する影響を調査し、COX−2阻害剤であるセレコキシブ(celecoxib)の構造−活性研究を行った。(方法:)Tet−On COX−2アンチセンスクローンを単離して、COX−2阻害剤によるアポトーシス誘導に対する細胞の生存および感受性についてのCOX−2発現の影響を評価した。差次的にCOX−2を発現する未処理のTet−Onクローン、およびドキシサイクリンで処理したクローンからCOX−2を除去した。本発明者らは、種々のCX−2阻害活性を有する種々のセレコキシブアナログを合成して、特徴づけし、そして、PC−3細胞において、それらのアポトーシス活性を測定した。アポトーシスは、4回の試験で評価した。全ての統計的試験は、両側試験である。
(結果:)アポトーシスを誘導するCOX−2阻害剤の効果とは対照的に、COX−2除去は、細胞死を誘導しなかった。COX−2阻害剤誘導性のアポトーシスの感受性は、COX−2発現のレベルに非依存的であった。構造−活性分析により、アポトーシス誘導とCOX−2阻害との間に相関は見出せなかった。逆に、COX−2活性阻害活性を欠乏した親化合物のいくつかの誘導体は、アポトーシスを促進した。さらに、セレコキシブおよびアポトーシス活性セレコキシブ誘導体は、AktおよびERK2シグナル伝達を阻害することによって、細胞死を媒介した。
(結論:)本発明者らは、COX−2阻害剤であるセレコキシブの構造的改変によって、アポトーシス誘導活性をCOX−2阻害活性から切り離した。この活性の分離により、新たなクラスのアポトーシス誘導性薬剤の開発のための分子的な基礎が与えられ得る。
癌細胞にアポトーシス死を媒介するために、シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤によって使用されるシグナル伝達機構は、多くの調査の焦点である(1〜10)。まだ解明されていない重要な問題は、COX−2阻害が、COX−2阻害剤によるアポトーシスの誘導において、必須の役割を果たしているのか否かということである(11)。COX−2阻害は、抗腫瘍効果に必要であるという前提は、プロスタグランジンおよび他のCOX−2が生成する下流メディエーターが、オートクラインおよび/またはパラクリンの様式で、腫瘍細胞の増殖、生存、ならびに血管新生を促進する(12〜16)という推定に基づく。COX−2の過剰発現は、胃腸系の上皮細胞(17、18)、およびPC−12褐色細胞腫細胞(19)において、アポトーシスの阻害、または細胞周期速度の変化を誘導することが報告された。さらに、COX−2遺伝子のノックアウトは、ポリープ形成についての遺伝学的素因を有するマウスにおいて、腫瘍新生を抑制し得る(20)。動物での研究により、効果的な腫瘍の成長には、腫瘍宿主中にCOX−2の存在が必要であること(8)、およびCOX−2発現の増強は、乳腺での腫瘍新生を誘導するために十分であること(21)が示されている。他方、いくつかの証拠は、COX−2非依存的な機構が、COX−2阻害剤の抗腫瘍効果に関連し得ることを示す。例えば、スリンダク代謝物は、COX活性を阻害しないが、高い効力で前立腺癌細胞にアポトーシスを誘導した(22)。胃腸の細胞およびPC−12細胞とは対照的に、不死化ヒト臍帯静脈上皮細胞である、HEK−293細胞、COX−7細胞、およびNIH3T3細胞におけるCOX−2の過剰発現は、細胞死の増大および/または細胞周期の停止を誘導した(23、24)。細胞成長に対するCOX−2の過剰発現の両面性効果は、部分的には、異なる細胞型の間の生理学的差異に起因し得る。さらに、報告によると、胚性線維芽細胞における悪性の形質転換は、COX発現の状態に非依存的であった。
既に、本発明者らは、セレコキシブは、複数のシグナル伝達を行う標的(Akt、ERK2、および小胞体Ca2+−ATPaseが挙げられる)を妨害することにより、前立腺癌細胞にアポトーシスを誘導したことを示した(10、15)。これらのシグナル伝達経路の破壊により、従来の抗癌剤とは大きく異なる機構である、アポトーシスが迅速に誘導される。セレコキシブのアポトーシスに対する効果は、癌細胞中のアンドロゲン応答性、Bcl−2発現のレベル、およびp53の機能的状態に非依存的であった(10、25)ことは、注目すべきである。にもかかわらず、他のCOX−2阻害剤(レフェコシブ、NS398、およびDuP697が挙げられる)のアポトーシスを誘導する能力は、セレコキシブよりもはるかに低かったので、アポトーシスのこの迅速な誘導は、セレコキシブに特有のものであった(25)。この相違は、これらのCOX−2阻害剤が、前立腺癌細胞にアポトーシスを媒介する機構の相違を強調する。COX−2阻害剤誘導性のアポトーシスは、COX−2酵素阻害を必要とするか否かという問題を整理するために、本発明者らは、テトラサイクリン−オン(Tet−On)アンチセンスCOX−2 PC−3クローンにおけるアポトーシスに対するCOX−2除去の影響を試験し、アンドロゲン非依存性PC−3前立腺癌細胞において、種々のセレコキシブ誘導体の構造−活性分析を行った。
(細胞および試薬)
本発明者らは、3つの異なる前立腺癌細胞系統を使用して、セレコキシブおよびその誘導体によるアポトーシスの誘導に対する、アンドロゲン応答性およびp53の機能的状態の影響を評価した。使用した細胞系統としては、アンドロゲン応答性LNCaP(p53+/+)ならびに、アンドロゲン非応答性PC−3およびDU−145(p53−/−)が挙げられた。アンチセンスCOX−2構築物は、Rebecca Chinery博士とJason Morrow博士(Vanderbilt University Medical School)から贈られたものであった。それは、TRE(テトラサイクリン応答エレメント)−応答性プラスミドpUHD.2neoのXbaI/EcoRV部位にクローニングされた、ほぼ完全なヒトCOX−2挿入物(1.93キロベース)を含んでいた(26)。このテトラサイクリン誘導性アンチセンスCOX−2構築物を結腸直腸癌細胞中で使用して、細胞増殖におけるプロスタグランジンの役割が評価された(26)。セレコキシブおよびレフェコシブを、溶媒抽出によって市販のカプセルから得て、続いて、再結晶化した。DuP697は、Hsin−Hsiung Tai教授(University of Kentucky)から贈られたものであり、NS398は、Calbiochem (La Jolla,CA)から入手した。4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(化合物1)、4−[5−フェニル−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(化合物2)、4−[5−(4−アミノフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(化合物3)、4−[5−(4−エチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(化合物4)、4−[5−(4−トリフルオロメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(化合物5)、4−[5−(2,5−ジクロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(化合物6)、4−[5−(2,5−ジメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(化合物7)は、公開されている手順(27)に従って合成した。ウサギ抗COX−2抗体は、Cayman Chemical Co.(Ann Arbor,MI)から得た。Akt、ホスホ−Ser473−Akt、ERK、およびホスホ−ERKに対するウサギポリクローナル抗体は、New England Biolabs(Beverly,MA)から購入し、マウス抗アクチンモノクローナル抗体は、ICN(Costa Mesa,CA)から入手した。ヤギ抗ウサギIgG−セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合体は、Jackson ImmunoResearch(West Groove,PA)から購入した。ウサギ抗ポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼ(PARP)抗体は、PharMingen(San Diego,CA)から入手した。
本発明者らは、3つの異なる前立腺癌細胞系統を使用して、セレコキシブおよびその誘導体によるアポトーシスの誘導に対する、アンドロゲン応答性およびp53の機能的状態の影響を評価した。使用した細胞系統としては、アンドロゲン応答性LNCaP(p53+/+)ならびに、アンドロゲン非応答性PC−3およびDU−145(p53−/−)が挙げられた。アンチセンスCOX−2構築物は、Rebecca Chinery博士とJason Morrow博士(Vanderbilt University Medical School)から贈られたものであった。それは、TRE(テトラサイクリン応答エレメント)−応答性プラスミドpUHD.2neoのXbaI/EcoRV部位にクローニングされた、ほぼ完全なヒトCOX−2挿入物(1.93キロベース)を含んでいた(26)。このテトラサイクリン誘導性アンチセンスCOX−2構築物を結腸直腸癌細胞中で使用して、細胞増殖におけるプロスタグランジンの役割が評価された(26)。セレコキシブおよびレフェコシブを、溶媒抽出によって市販のカプセルから得て、続いて、再結晶化した。DuP697は、Hsin−Hsiung Tai教授(University of Kentucky)から贈られたものであり、NS398は、Calbiochem (La Jolla,CA)から入手した。4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(化合物1)、4−[5−フェニル−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(化合物2)、4−[5−(4−アミノフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(化合物3)、4−[5−(4−エチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(化合物4)、4−[5−(4−トリフルオロメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(化合物5)、4−[5−(2,5−ジクロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(化合物6)、4−[5−(2,5−ジメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド(化合物7)は、公開されている手順(27)に従って合成した。ウサギ抗COX−2抗体は、Cayman Chemical Co.(Ann Arbor,MI)から得た。Akt、ホスホ−Ser473−Akt、ERK、およびホスホ−ERKに対するウサギポリクローナル抗体は、New England Biolabs(Beverly,MA)から購入し、マウス抗アクチンモノクローナル抗体は、ICN(Costa Mesa,CA)から入手した。ヤギ抗ウサギIgG−セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合体は、Jackson ImmunoResearch(West Groove,PA)から購入した。ウサギ抗ポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼ(PARP)抗体は、PharMingen(San Diego,CA)から入手した。
(PC−3 Tet−OnアンチセンスCOX−2クローンの開発)
PC−3細胞を、加湿したCO2インキュベーター中で37℃で、T−25フラスコ中の10%ウシ胎児血清(FBS)を補充したRPMI1640培地で、80%の密集度(confluency)になるまで培養した。各フラスコを6mLの無血清Opti−MEM(Invitrogen Life Technologies;Carlsbad,CA)で洗浄し、次いで、3mLの無血清Opti−MEMを添加した。150μLの無血清OPTI−MEM培地中に0.12μgのTet−On調節プラスミド pTet−On(Clontech;Palo Alto,CA)および0.12μgのアンチセンスCOX−2構築物を含むアリコートを、LipofectAMINE Plus Reagentキット(Invitrogen Life Technologies)からの3μLのPlus試薬で、25℃で15分間プレインキュベートし、続いて、150μLのOpti−MEM培地中の12μLのLipofectAMINE試薬を添加した。生じた混合物を25℃で15分間インキュベートし、次いで、穏やかに混合しながら各フラスコに添加した。37℃で5時間後、トランスフェクション培地を、10% Tet−System−approved FBS(Clontech)を含有する5mLのPRMI1640培地で置き換えた。48時間後、細胞を100μg/mLでG418を含有する新鮮な培地で培養し、トランスフェクトされたクローンを選択した。G418補充培地を4日ごとに交換した。3週間後、G418耐性細胞を、最終細胞濃度が1ウェルあたり約0.5細胞である限界希釈によって、96ウェルプレートにサブクローニングした。12日後(4日ごとにG418含有培地を交換した)、生存クローンをさらに12ウェルプレートにサブクローニングした。4または5日後、各ウェルの細胞を3つのT−25フラスコに分割した。細胞をドキシサイクリン(2μg/mL)に曝露した120時間後に、ウエスタンブロット分析によって、COX−2発現のレベルを決定した。この手順によって、以下の4個の独立したクローン(2F6、1F2、3D9、および7D9)を分析のために選択した:2F6はCOX−2欠損クローンであり、1F2、3D9、および7D9は、ドキシサイクリンの非存在下で異なるレベルのCOX−2を発現した。
PC−3細胞を、加湿したCO2インキュベーター中で37℃で、T−25フラスコ中の10%ウシ胎児血清(FBS)を補充したRPMI1640培地で、80%の密集度(confluency)になるまで培養した。各フラスコを6mLの無血清Opti−MEM(Invitrogen Life Technologies;Carlsbad,CA)で洗浄し、次いで、3mLの無血清Opti−MEMを添加した。150μLの無血清OPTI−MEM培地中に0.12μgのTet−On調節プラスミド pTet−On(Clontech;Palo Alto,CA)および0.12μgのアンチセンスCOX−2構築物を含むアリコートを、LipofectAMINE Plus Reagentキット(Invitrogen Life Technologies)からの3μLのPlus試薬で、25℃で15分間プレインキュベートし、続いて、150μLのOpti−MEM培地中の12μLのLipofectAMINE試薬を添加した。生じた混合物を25℃で15分間インキュベートし、次いで、穏やかに混合しながら各フラスコに添加した。37℃で5時間後、トランスフェクション培地を、10% Tet−System−approved FBS(Clontech)を含有する5mLのPRMI1640培地で置き換えた。48時間後、細胞を100μg/mLでG418を含有する新鮮な培地で培養し、トランスフェクトされたクローンを選択した。G418補充培地を4日ごとに交換した。3週間後、G418耐性細胞を、最終細胞濃度が1ウェルあたり約0.5細胞である限界希釈によって、96ウェルプレートにサブクローニングした。12日後(4日ごとにG418含有培地を交換した)、生存クローンをさらに12ウェルプレートにサブクローニングした。4または5日後、各ウェルの細胞を3つのT−25フラスコに分割した。細胞をドキシサイクリン(2μg/mL)に曝露した120時間後に、ウエスタンブロット分析によって、COX−2発現のレベルを決定した。この手順によって、以下の4個の独立したクローン(2F6、1F2、3D9、および7D9)を分析のために選択した:2F6はCOX−2欠損クローンであり、1F2、3D9、および7D9は、ドキシサイクリンの非存在下で異なるレベルのCOX−2を発現した。
(イムノブロッティング)
ウエスタンブロット分析のために、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲル充填バッファー(50mM Tris−HCl、pH6.8、100mM ジチオトレイトール、2% SDS、0.1% ブロモフェノールブルー、および10% グリセロールからなる)に再懸濁し、超音波ソニケーター(Virsonic 300、出力4.5)で5秒間音波破砕し、そして、5分間煮沸した。簡単な遠心分離の後で、可溶画分由来の等量のタンパク質(60〜100μg)をMinigel装置上で10%SDS−ポリアクリルアミドゲルで分離し、セミドライ式トランスファーセル中のニトロセルロース膜へと移転した。トランスブロットした膜を、0.05% Tween20を含有するTris緩衝生理食塩水(TBS)(TBST)で2回洗浄した。5%脱脂ミルクを含有するTBSで60分間ブロッキングした後で、膜を、適切な1次抗体(抗COX−2抗体、抗Akt抗体、抗P−473Ser Akt抗体、抗ERK抗体、および抗ホスホ−ERK抗体(1:1,000希釈);抗アクチンモノクローナル抗体(1:5,000希釈))と、TBS−1%脱脂ミルクにおいて4℃で12時間インキュベートし、TBSTで2回洗浄した。膜をヤギ抗ウサギIgG−セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合体(1:5,000希釈)で室温で1時間プローブし、TBSTで2回洗浄した。バンドを増強化学発光によって可視化した。
ウエスタンブロット分析のために、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲル充填バッファー(50mM Tris−HCl、pH6.8、100mM ジチオトレイトール、2% SDS、0.1% ブロモフェノールブルー、および10% グリセロールからなる)に再懸濁し、超音波ソニケーター(Virsonic 300、出力4.5)で5秒間音波破砕し、そして、5分間煮沸した。簡単な遠心分離の後で、可溶画分由来の等量のタンパク質(60〜100μg)をMinigel装置上で10%SDS−ポリアクリルアミドゲルで分離し、セミドライ式トランスファーセル中のニトロセルロース膜へと移転した。トランスブロットした膜を、0.05% Tween20を含有するTris緩衝生理食塩水(TBS)(TBST)で2回洗浄した。5%脱脂ミルクを含有するTBSで60分間ブロッキングした後で、膜を、適切な1次抗体(抗COX−2抗体、抗Akt抗体、抗P−473Ser Akt抗体、抗ERK抗体、および抗ホスホ−ERK抗体(1:1,000希釈);抗アクチンモノクローナル抗体(1:5,000希釈))と、TBS−1%脱脂ミルクにおいて4℃で12時間インキュベートし、TBSTで2回洗浄した。膜をヤギ抗ウサギIgG−セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合体(1:5,000希釈)で室温で1時間プローブし、TBSTで2回洗浄した。バンドを増強化学発光によって可視化した。
(プロスタグランジンE2(PGE2)免疫アッセイ)
ドキシサイクリン(2μg/mL)前処理をしたか、またはしていない親細胞およびトランスフェクトした細胞を、T−75フラスコ中で、ドキシサイクリンを有するか、または有さない10%FBSを補充したRPMI1640培地で、10×106細胞になるまで増殖させた。培養培地を交換し、そして、24時間後に馴化培地を収集して、PGE2をアッセイした。馴化培地を遠心分離して粒子状物質を除去し、次いで、細胞を擦り取ることで収集し、タンパク質濃度を決定した。製造者の指示(R&D Systems,Inc.;Minneapolis,MN)に従って、PGE2を3連で100μLの培地中でアッセイした。PGE2のデータをタンパク質含量について規格化した。
ドキシサイクリン(2μg/mL)前処理をしたか、またはしていない親細胞およびトランスフェクトした細胞を、T−75フラスコ中で、ドキシサイクリンを有するか、または有さない10%FBSを補充したRPMI1640培地で、10×106細胞になるまで増殖させた。培養培地を交換し、そして、24時間後に馴化培地を収集して、PGE2をアッセイした。馴化培地を遠心分離して粒子状物質を除去し、次いで、細胞を擦り取ることで収集し、タンパク質濃度を決定した。製造者の指示(R&D Systems,Inc.;Minneapolis,MN)に従って、PGE2を3連で100μLの培地中でアッセイした。PGE2のデータをタンパク質含量について規格化した。
(細胞生存)
ドキシサイクリン(2μg/mL)前処理をしたか、またはしていない親タンパク質またはトランスフェクトしたPC−3細胞を12ウェルプレートにプレートし、2μg/mLのドキシサイクリンの非存在下または存在下で、10%FBSを補充したRPMI1640培地で48時間培養した。次いで、ジメチルスルホキシド(DMSO;最終濃度0.1%)に溶解させた種々の濃度のCOX−2阻害剤を血清飢餓RPMI1640培地中の細胞に添加した。コントロール細胞は、同じ濃度のDMSOビヒクルを受容した。処理の間、浮いている細胞のパーセンテージは、経時的に増加した。処理の終了時に、接着している細胞をトリプシン処理によって収集し、そして浮いている細胞を遠心分離(3,200×g、5分間)によって回収した。細胞の形態を光学顕微鏡を用いて×400で評価した。接着している細胞および浮いている細胞の両方を混ぜて、そして細胞生存をトリパンプルー染料排除によって評価した。
ドキシサイクリン(2μg/mL)前処理をしたか、またはしていない親タンパク質またはトランスフェクトしたPC−3細胞を12ウェルプレートにプレートし、2μg/mLのドキシサイクリンの非存在下または存在下で、10%FBSを補充したRPMI1640培地で48時間培養した。次いで、ジメチルスルホキシド(DMSO;最終濃度0.1%)に溶解させた種々の濃度のCOX−2阻害剤を血清飢餓RPMI1640培地中の細胞に添加した。コントロール細胞は、同じ濃度のDMSOビヒクルを受容した。処理の間、浮いている細胞のパーセンテージは、経時的に増加した。処理の終了時に、接着している細胞をトリプシン処理によって収集し、そして浮いている細胞を遠心分離(3,200×g、5分間)によって回収した。細胞の形態を光学顕微鏡を用いて×400で評価した。接着している細胞および浮いている細胞の両方を混ぜて、そして細胞生存をトリパンプルー染料排除によって評価した。
(アポトーシスの分析)
位相差顕微鏡により観察される表面の形態変化に加えて、4つの方法を用いて、薬物誘導性のアポトートーシス細胞死を評価した。
位相差顕微鏡により観察される表面の形態変化に加えて、4つの方法を用いて、薬物誘導性のアポトートーシス細胞死を評価した。
(ホスファチジルセリン外部化(externalization))
約2.5×105個の細胞をガラス性のカバーガラスで24時間増殖させた。薬物処理後の種々の時間で、細胞をPBSで穏やかに洗浄し、次いで、0.5mLの結合バッファー(150mM NaCl、2.5mM CaCl2、1mM MgCl2、および4% ウシ血清アルブミンを含有する10mM HEPES(pH7.4))に曝露し、続いて、0.6mLのアネキシンV−イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)(200μg/mL)に30分間曝露した。結合バッファーで洗浄した後、蛍光顕微鏡の下で外側の膜上にアネキシンV−FITCを有する細胞として、アポトーシス細胞を直接的に同定した。コントロールの集団では、試験薬物の代わりにDMSOビヒクルを含有する培地を受容した。
約2.5×105個の細胞をガラス性のカバーガラスで24時間増殖させた。薬物処理後の種々の時間で、細胞をPBSで穏やかに洗浄し、次いで、0.5mLの結合バッファー(150mM NaCl、2.5mM CaCl2、1mM MgCl2、および4% ウシ血清アルブミンを含有する10mM HEPES(pH7.4))に曝露し、続いて、0.6mLのアネキシンV−イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)(200μg/mL)に30分間曝露した。結合バッファーで洗浄した後、蛍光顕微鏡の下で外側の膜上にアネキシンV−FITCを有する細胞として、アポトーシス細胞を直接的に同定した。コントロールの集団では、試験薬物の代わりにDMSOビヒクルを含有する培地を受容した。
(核の4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)染色)
異なる試験物質を用いた処理の後の種々の時間で、DNA結合蛍光色素であるDAPIを用いた染色によって、形態変化をアポトーシス細胞の核において検出した。接着しているPC−3細胞について、細胞をガラス性のカバーガラス上で約70%の密集度まで増殖させ、種々の時間で50μMの試験物質に曝露した。次いで、上澄液を注意深く除去し、接着している細胞をPBS、DAPI(0.5μg/mL)で洗浄し、固定溶液(PBS中、4% パラホルムアルデヒド、2mM EGTA(エチレングリコールビス(β−アミノエチルエーテル)N,N,N’,N’−四酢酸)、および13.7% スクロース)に添加し、この混合物を暗黒下で室温で20分間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで20分間隔で洗浄した。浮いているPC−3細胞は、上記の方法の変法によって試験した。PC−3細胞をT−25フラスコで培養し、試験物質で処理した。次いで、浮いている細胞を収集し、洗浄し、上述のようにDAPIで染色した。細胞をポリ−L−リシンでコーティングしたカバーガラスに接着させ、顕微鏡によって400×の倍率で観察した。
異なる試験物質を用いた処理の後の種々の時間で、DNA結合蛍光色素であるDAPIを用いた染色によって、形態変化をアポトーシス細胞の核において検出した。接着しているPC−3細胞について、細胞をガラス性のカバーガラス上で約70%の密集度まで増殖させ、種々の時間で50μMの試験物質に曝露した。次いで、上澄液を注意深く除去し、接着している細胞をPBS、DAPI(0.5μg/mL)で洗浄し、固定溶液(PBS中、4% パラホルムアルデヒド、2mM EGTA(エチレングリコールビス(β−アミノエチルエーテル)N,N,N’,N’−四酢酸)、および13.7% スクロース)に添加し、この混合物を暗黒下で室温で20分間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで20分間隔で洗浄した。浮いているPC−3細胞は、上記の方法の変法によって試験した。PC−3細胞をT−25フラスコで培養し、試験物質で処理した。次いで、浮いている細胞を収集し、洗浄し、上述のようにDAPIで染色した。細胞をポリ−L−リシンでコーティングしたカバーガラスに接着させ、顕微鏡によって400×の倍率で観察した。
(酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)によるアポトーシスの検出)
また、アポトーシスの誘導を、製造者の指示に従って「Cell Death Detection ELISA」アッセイ(Boehringer−Mannheim)を用いることによっても、評価した。この試験は、アポトーシス死を誘導した後のモノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームの形態の細胞質のヒストン結合DNAフラグメントの定量的決定に基づく。簡潔には、2.5×106個のPC−3細胞をT−75フラスコ中で、実験の24時間前に培養した。細胞を5mLの無血清RPMI培地で2回洗浄し、次いで、示すように、試験物質またはDMSOビヒクルで処理した。浮いている細胞および接着している細胞の両方を収集し、104個の細胞と等価の細胞溶解液をELISAにおいて使用した。
また、アポトーシスの誘導を、製造者の指示に従って「Cell Death Detection ELISA」アッセイ(Boehringer−Mannheim)を用いることによっても、評価した。この試験は、アポトーシス死を誘導した後のモノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームの形態の細胞質のヒストン結合DNAフラグメントの定量的決定に基づく。簡潔には、2.5×106個のPC−3細胞をT−75フラスコ中で、実験の24時間前に培養した。細胞を5mLの無血清RPMI培地で2回洗浄し、次いで、示すように、試験物質またはDMSOビヒクルで処理した。浮いている細胞および接着している細胞の両方を収集し、104個の細胞と等価の細胞溶解液をELISAにおいて使用した。
(PARP切断のウエスタンブロット分析)
薬物処理した細胞を収集し、氷冷PBSで洗浄し、そして溶解バッファー(20mM Tris−HCl(pH8)、137mM NaCl、1mM CaCl2、10% グリセロール、1% Nonidet P−40,0.5% デオキシコレート、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム、100μM 4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオライド、10μg/mL ロイペプチン、および10μg/mL アプロチニン)に再懸濁した。1,500×gで5分間の遠心分離の後で、可溶性の細胞溶解液を収集した。各溶解液に由来する等量のタンパク質(60〜100μg)を10%SDS−ポリアクリルアミドゲル中で分離した。バンドをニトロセルロース膜に移転し、上述のように、抗PARP抗体を用いて、免疫ブロッティングにより分析した。
薬物処理した細胞を収集し、氷冷PBSで洗浄し、そして溶解バッファー(20mM Tris−HCl(pH8)、137mM NaCl、1mM CaCl2、10% グリセロール、1% Nonidet P−40,0.5% デオキシコレート、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム、100μM 4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオライド、10μg/mL ロイペプチン、および10μg/mL アプロチニン)に再懸濁した。1,500×gで5分間の遠心分離の後で、可溶性の細胞溶解液を収集した。各溶解液に由来する等量のタンパク質(60〜100μg)を10%SDS−ポリアクリルアミドゲル中で分離した。バンドをニトロセルロース膜に移転し、上述のように、抗PARP抗体を用いて、免疫ブロッティングにより分析した。
(統計学的分析)
各実験を3連で行った。全ての実験を少なくとも2回、異なる機会に行った。適切である場合、データは平均値±95%信頼区間として示される。
各実験を3連で行った。全ての実験を少なくとも2回、異なる機会に行った。適切である場合、データは平均値±95%信頼区間として示される。
(Tet−OnアンチセンスCOX−2クローンの単離および特徴付け)
COX−2酵素活性の細胞増殖に対する影響を評価するために、本発明者らは、親PC−3細胞をテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にあるアンチセンスCOX−2 cDNA構築物でトランスフェクトすることによって、Tet−OnアンチセンスCOX−2クローンを調製した。G418耐性細胞を限界希釈によってサブクローニングした後で、4つのTet−OnアンチセンスCOX−2クローン(2F6、1F2、3D9、および7D9)を選択した。2F6は、COX−2欠損クローンであり、COX−2タンパク質がほぼ検出できない。1F2、3D9、および7D9は、アンチセンスCOX−2クローンである。これらのクローンにおいて、ドキシサイクリンの非存在下では、COX−2が異なるように発現されるが、ドキシサイクリンの存在下では、COX−2は、取り除かれる(図2B)。図2Aは、Tet−Onクローン3D9における、10日間の期間にわたるドキシサイクリン(2μg/mL)のCOX−2発現に対する効果のウエスタンブロット分析を示す。ドキシサイクリンの添加後4日目までは、3D9細胞において、COX−2タンパク質は取り除かれており、ドキシサイクリンが存在する限り、COX−2は検出されなかった。これらのクローンでは、COX−1発現は微々たる物であったので(データは示さず)、COX−2が、主要なプロスタグランジンの生産者であった。従って、COX−2発現のレベルは、PGE2生産のレベルに反映した。1F2細胞と親PC−3細胞でのPGE2のレベルは匹敵していたが、親細胞のレベルよりも、3D9でのレベルは2倍高く、7D9でのレベルは10倍高かった(図2C)。しかし、50μMのロフェコキシブ、NS398、またはDuP697で処理した場合、PGE2の生産は、1F2、3D9,および7D9、ならびに親PC−3細胞において同程度にまで減少した(データは示さず;セレコキシブ処理した細胞のPGE2は、急速なアポトーシスに起因して決定できなかった)。抗アポトーシス性タンパク質Bcl−2の発現の減少は、COX−2阻害剤であるSC−58125およびNS−398のアポトーシス機構には関係ない(1、2)ので、COX−2切断は、本質的にBcl−2の発現に対して影響を与えない(図2D)ことも注目される。
COX−2酵素活性の細胞増殖に対する影響を評価するために、本発明者らは、親PC−3細胞をテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にあるアンチセンスCOX−2 cDNA構築物でトランスフェクトすることによって、Tet−OnアンチセンスCOX−2クローンを調製した。G418耐性細胞を限界希釈によってサブクローニングした後で、4つのTet−OnアンチセンスCOX−2クローン(2F6、1F2、3D9、および7D9)を選択した。2F6は、COX−2欠損クローンであり、COX−2タンパク質がほぼ検出できない。1F2、3D9、および7D9は、アンチセンスCOX−2クローンである。これらのクローンにおいて、ドキシサイクリンの非存在下では、COX−2が異なるように発現されるが、ドキシサイクリンの存在下では、COX−2は、取り除かれる(図2B)。図2Aは、Tet−Onクローン3D9における、10日間の期間にわたるドキシサイクリン(2μg/mL)のCOX−2発現に対する効果のウエスタンブロット分析を示す。ドキシサイクリンの添加後4日目までは、3D9細胞において、COX−2タンパク質は取り除かれており、ドキシサイクリンが存在する限り、COX−2は検出されなかった。これらのクローンでは、COX−1発現は微々たる物であったので(データは示さず)、COX−2が、主要なプロスタグランジンの生産者であった。従って、COX−2発現のレベルは、PGE2生産のレベルに反映した。1F2細胞と親PC−3細胞でのPGE2のレベルは匹敵していたが、親細胞のレベルよりも、3D9でのレベルは2倍高く、7D9でのレベルは10倍高かった(図2C)。しかし、50μMのロフェコキシブ、NS398、またはDuP697で処理した場合、PGE2の生産は、1F2、3D9,および7D9、ならびに親PC−3細胞において同程度にまで減少した(データは示さず;セレコキシブ処理した細胞のPGE2は、急速なアポトーシスに起因して決定できなかった)。抗アポトーシス性タンパク質Bcl−2の発現の減少は、COX−2阻害剤であるSC−58125およびNS−398のアポトーシス機構には関係ない(1、2)ので、COX−2切断は、本質的にBcl−2の発現に対して影響を与えない(図2D)ことも注目される。
(前立腺癌細胞におけるCOX−2切断およびその後のアポトーシスに対する効果)
これらのCOX−2アンチセンスクローンを用いて、本発明者らは、COX−2阻害剤のアポトーシスに対する効果が、COX−2阻害活性に依存しないということの2つの証拠を得た。第1に、アンチセンスCOX−2 cDNAおよびCOX−2阻害剤の両方が、プロスタグランジン生産を完全に阻止したが、その細胞生存に対する効果は、顕著に異なっていた。PC−3細胞または4つのクローンのいずれかを個々のCOX−2阻害剤によって処理することにより、アポトーシス死が引き起こされたが、一方で、アンチセンスcDNAによるCOX−2の除去、従ってPGE2生産の阻害は、これらのアンチセンスクローンの生存に悪影響を与えない、すなわち、この処理は、細胞死を誘導しなかった。
これらのCOX−2アンチセンスクローンを用いて、本発明者らは、COX−2阻害剤のアポトーシスに対する効果が、COX−2阻害活性に依存しないということの2つの証拠を得た。第1に、アンチセンスCOX−2 cDNAおよびCOX−2阻害剤の両方が、プロスタグランジン生産を完全に阻止したが、その細胞生存に対する効果は、顕著に異なっていた。PC−3細胞または4つのクローンのいずれかを個々のCOX−2阻害剤によって処理することにより、アポトーシス死が引き起こされたが、一方で、アンチセンスcDNAによるCOX−2の除去、従ってPGE2生産の阻害は、これらのアンチセンスクローンの生存に悪影響を与えない、すなわち、この処理は、細胞死を誘導しなかった。
第2に、これらの4つのクローンにおけるCOX−2の基本レベルは異なるが、全てのクローンおよび親PC−3細胞は、COX−2阻害剤によって誘導されるアポトーシスに等しく感受性であり、この感受性は、ドキシサイクリン誘導性のCOX−2除去の後で変化しなかった。言い換えると、COX−2阻害剤誘導性のアポトーシスに対する感受性は、COX−2発現のレベルに非依存的であった。図3Aは、PC−3細胞、COX−2欠損2F6細胞、およびCOX−2を過剰発現する7D9細胞における、COX−2除去の存在下または非存在下での50μMのセレコキシブの存在下での細胞死の時間経過を示す。50μMのセレコキシブと共にインキュベートされた全てのクローンの50%の細胞死に必要な時間(T1/2)は、約2時間であった。同様の結果が1F2細胞および3D9細胞について記された。
既に、本発明者らは、セレコキシブは、AktおよびERKシグナル伝達経路を阻害することによって、アンドロゲン応答性LNCaP(p53+/+)およびアンドロゲン非応答性PC−3(p53−/−)前立腺癌細胞の両方に迅速なアポトーシス死を誘導することを実証した(10、25)。この研究では、4つのクローン全てにおいて誘導されたアポトーシス死もまた、親PC−3細胞において観察されるように、AktおよびERK2のリン酸化の減少に関連しており、7D9細胞において、AktおよびERK2の脱リン酸化の時間経過(図2B)は、細胞死の時間経過と一致していた。同様の結果を他の3つのクローンについて得た。
他の3つのCOX−2阻害剤である、ロフェコキシブ、NS398、およびDuP697によって誘導されるアポトーシスに対するCOX−2除去の影響もまた、COX−2アンチセンスクローンにおいて試験した。これらの化合物は、セレコキシブとは異なる機構によって、親PC−3細胞にアポトーシスを引き起こした(25)。アポトーシスの発生は、セレコキシブと比べて有意に遅れ、ロフェコキシブ、NS398、またはDuP697(それぞれ100μM)についてのT1/2値は、96時間〜120時間の範囲であった。図4は、ドキシサイクリンによる前処理をした場合、またはしない場合の7D9細胞の100μMのロフェコキシブへの曝露の後での細胞生存を示す。セレコキシブのデータと一致するように、COX−2発現の消失は、これらのクローンのロフェコキシブによるアポトーシスの誘導に対する感受性を変えなかった。同様の結果をNS398およびDuP697について得た(データは示さず)。
(構造−活性分析)
本発明者らの仮説をさらに裏付けるために、セレコキシブの構造改変を行い、COX−2阻害とアポトーシスの誘導を分離した。本発明者らは、末端フェニル環に異なる置換基を有する一連のセレコキシブ誘導体を合成し、各々のアポトーシス誘導能力を試験した。図5は、セレコキシブおよび7つの代表的アナログの、構造、COX−2阻害活性(IC50=50%までCOX−2活性を阻害する薬物の濃度)、およびアポトーシス誘導活性(T1/2)をまとめている。
本発明者らの仮説をさらに裏付けるために、セレコキシブの構造改変を行い、COX−2阻害とアポトーシスの誘導を分離した。本発明者らは、末端フェニル環に異なる置換基を有する一連のセレコキシブ誘導体を合成し、各々のアポトーシス誘導能力を試験した。図5は、セレコキシブおよび7つの代表的アナログの、構造、COX−2阻害活性(IC50=50%までCOX−2活性を阻害する薬物の濃度)、およびアポトーシス誘導活性(T1/2)をまとめている。
構造−活性分析により、COX−2阻害とアポトーシス誘導活性との間に相関は見出せなかった。末端フェニル環の極性の増大(すなわち、4−アミノ−導入化合物 3a)または大きさの増大(すなわち、4−エチル−、4−トリフルオロメチル−、2,5−ジクロロ−、および2,5−ジメチル−導入化合物 それぞれ4a〜7a)により、これらの化合物のCOX−2活性を阻害する能力は減少した。対照的に、置換フェニル環の一定の程度の大きさおよび疎水性は、アポトーシス誘導活性について高度に望ましいものであった。例えば、化合物2aは、セレコキシブの4−メチル部分が水素原子で置換されており、高度に強力なCOX−2阻害剤であった(IC50=32nM)が、アポトーシス誘導活性は欠落していた(T1/2>100時間)。逆に、化合物6aおよび7aは、COX−2阻害活性を全く有していなかった(IC50>100μM)が、PC−3細胞において、高度に強力なアポトーシス死のメディエーターであった(T1/2≦2時間)。化合物7aの細胞生存に対する時間依存的かつ用量依存的な効果が、図6Aに示される。細胞の50μMの化合物7aへの曝露により、セレコキシブの2時間と比較して、1時間以内に細胞生存の50%の減少が生じた。PC−3細胞におけるアポトーシス死の特徴を図6B〜Dに示す。図6Bは、化合物7aによる処理の後の形態および膜組成の明らかな変化を示す。位相差顕微鏡によって示されるように、処理した細胞は、縮んでおり、丸くなっており、そしてディッシュから離れており、化合物7aを添加した1時間後にはブレブ形成が明らかであった(左パネル)。アポトーシスの形態学的証拠は、細胞をDAPIで染色することにより検出される核のフラグメント化として評価され、化合物7aで処理した細胞は、凝集した核およびフラグメント化した核を有することが見出された(中央パネル)。化合物7aによって誘導されるアポトーシスについての別の試験は、FITC結合体化アネキシンVと蛍光顕微鏡によって検出する際のホスファチジルセリンの外部化(externalization)であった(右パネル)。他の指標のうち、DNAのヌクレオソームフラグメントへの分解、および、PARPのアポトーシス特異的な85kDaのフラグメントへの切断もまた、アポトーシス細胞死のよく特徴付けられた事象である。これらの試験の結果をそれぞれ図6CおよびDに示す。
さらに、Bcl−2に非依存的なAktおよびERK2の即時の脱リン酸を介してアポトーシスを促進するために、化合物1aおよび4a〜7aによって使用される機構は、親化合物によって使用される機構と同じであったことに注目すべきである。図7A〜Cは、それぞれ、PC−3細胞における、化合物7aのBcl−2の発現レベルに対する影響ならびに、AktおよびERK2のリン酸化状態を示す。
PC−3細胞に加えて、本発明者らは、アンドロゲン応答性LNCaP(p53+/+)およびアンドロゲン非依存性DU−145(p53−/−)前立腺癌細胞系統における、化合物1aおよび4a〜7aのアポトーシスに対する影響についても試験した。LNCaP細胞およびDU−145細胞において、セレコキシブならびに化合物1aおよび4a〜7aによって、アポトーシスが誘導され、感受性はPC−3細胞と同じであった(データは示さず)。従って、これらのデータは、これらの活性化合物がアポトーシスを媒介する機構は、アンドロゲンの状態、p53の機能的状態、およびBcl−2の発現レベルに非依存的であることを示す。
(考察)
化学予防法におけるCOX−2阻害剤の臨床的関連性は実証されているが、これらの化合物によって使用される抗腫瘍機構は、よく規定されていない(11)。癌細胞において非ステロイド性抗炎症薬物により誘導されるアポトーシスを説明するために、種々のシグナル伝達性の標的を伴う機構が提案されている。これらの推定上の機構は、Bcl−2発現の阻害(1、2)、アラキドン酸の蓄積(28)、セラミド生産の刺激(3)、Aktタンパク質およびERK2タンパク質の脱リン酸化(10、25)、PPARδ(ペルオキシソーム増殖体活性化レセプター)の阻害(29)、および核因子NF−κBシグナル伝達経路の妨害(30)を含む。種々の異なるCOX−2阻害剤は、異なる機構を介してアポトーシスを媒介しているということももっともらしい。しかし、COX−2阻害が、COX−2阻害剤のアポトーシス効果において必須の役割を果たしているか否かは、まだ解明されていない。この研究において、本発明者らは、この問題を解明するために、アンチセンスCOX−2 cDNAを介したCOX−2除去および、セレコキシブ誘導体の構造−活性分析を使用した。
化学予防法におけるCOX−2阻害剤の臨床的関連性は実証されているが、これらの化合物によって使用される抗腫瘍機構は、よく規定されていない(11)。癌細胞において非ステロイド性抗炎症薬物により誘導されるアポトーシスを説明するために、種々のシグナル伝達性の標的を伴う機構が提案されている。これらの推定上の機構は、Bcl−2発現の阻害(1、2)、アラキドン酸の蓄積(28)、セラミド生産の刺激(3)、Aktタンパク質およびERK2タンパク質の脱リン酸化(10、25)、PPARδ(ペルオキシソーム増殖体活性化レセプター)の阻害(29)、および核因子NF−κBシグナル伝達経路の妨害(30)を含む。種々の異なるCOX−2阻害剤は、異なる機構を介してアポトーシスを媒介しているということももっともらしい。しかし、COX−2阻害が、COX−2阻害剤のアポトーシス効果において必須の役割を果たしているか否かは、まだ解明されていない。この研究において、本発明者らは、この問題を解明するために、アンチセンスCOX−2 cDNAを介したCOX−2除去および、セレコキシブ誘導体の構造−活性分析を使用した。
Tet−OnアンチセンスCOX−2クローンの使用は、これらのクローンが同系の細胞系統を示し、それによって、異なる細胞系統間の遺伝的変化の問題を緩和するため、および、これらのクローンが、ドキシサイクリン処理によって停止され得る異なるCOX−2発現を示すために、有利であった。本発明者らは、COX−2阻害剤のアポトーシスに対する効果が、COX−2阻害活性に非依存的であることを実証した。COX−2除去およびCOX−2阻害剤の両方が、PGE2生産を阻害したが、これらの2つの処理は、細胞生存に対して非常に異なる影響を有していた。COX−2阻害剤による処理は、細胞死を引き起こしたが、COX−2除去は引き起こさなかった。COX−2阻害剤が誘導するアポトーシスへの感受性は、アンチセンスクローンにおいて、COX−2発現のレベルに非依存的であり、実際に、親PC−3細胞のアポトーシスと変わらなかった。
本発明者らは、セレコキシブの構造的改変を介して、アポトーシス誘導活性をCOX−2阻害活性から分離することができた。この発見は、スリンダク代謝物である、スリンダクスルフィドおよびスリンダクスルホンは、COX−非依存的な機構を介して、前立腺癌細胞においてアポトーシスを誘導し得る(22)という以前の報告を思わせる。いくつかのセレコキシブ誘導体は、COX−2阻害活性を欠いていたが、PC−3細胞にアポトーシスの誘導において、親化合物と同程度に強力であった。これらの化合物は、ホルモン応答性の前立腺癌細胞およびホルモン非応答性の前立腺癌細胞の両方にアポトーシスを誘導する。さらに、これらの化合物および親化合物であるセレコキシブがアポトーシスを誘導する機構は、同じままであった、すなわち、AktおよびERK2の脱リン酸化を促進していた。
(新たなクラスのアポトーシス誘導性薬剤を開発するための分子的プラットフォームとしてのシクロオキシゲナーゼ−2阻害剤)
(背景:)本発明者らは、既に、前立腺癌細胞において、シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤のアポトーシスに対する効果が、COX−2阻害活性に非依存的であることを実証した。この発見により、機構様式が従来の化学療法薬の機構様式とは大きく異なる、新たなクラスの抗癌化合物の開発のための分子的基盤が与えられる。ここで、本発明者らは、これらの化合物がアポトーシスを媒介する構造的基礎を理解するため、およびそれらの前立腺癌細胞においてアポトーシスを誘導する能力を最適化するための分子的プラットフォームとして、セレコキシブおよびレフェコシブを使用する計画を開始する。(方法:)構造−活性分析とコンピューターモデリングを組合わせた統合アプローチを使用した。種々のCOX−2阻害剤の構造改変を系統だった様式で行い、アポトーシスの誘導における個々の機能的部分の役割を評価した。さらに、アポトーシス誘導におけるセレコキシブとロフェコキシブとの間の機能の大きな相違の観点から、分子モデリングを行い、不規則な構造の関与を解明した。(結果:)構造分析およびコンピューター分析に基づいて、本発明者らは、アポトーシスを引き起こすために必須の種々の構造的特徴を示す作業モデルを提案した。アポトーシス誘導についての構造的要求は、COX−2阻害のものとは異なっている。それらの中でも、スルファモイル部分への水素結合、および複素環式環の周囲の負の静電ポテンシャルが特に注目される。このモデルは、このモデルによって示される構造を満足させるロフェコキシブ構造の変化を介してアポトーシス誘導能力が10倍に増大したことによって立証される。(結論:)本発明者らは、既存のCOX−2阻害剤の分子的プラットフォームに基づいて、新たなクラスのアポトーシス誘導性薬剤を開発し得る。
(背景:)本発明者らは、既に、前立腺癌細胞において、シクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)阻害剤のアポトーシスに対する効果が、COX−2阻害活性に非依存的であることを実証した。この発見により、機構様式が従来の化学療法薬の機構様式とは大きく異なる、新たなクラスの抗癌化合物の開発のための分子的基盤が与えられる。ここで、本発明者らは、これらの化合物がアポトーシスを媒介する構造的基礎を理解するため、およびそれらの前立腺癌細胞においてアポトーシスを誘導する能力を最適化するための分子的プラットフォームとして、セレコキシブおよびレフェコシブを使用する計画を開始する。(方法:)構造−活性分析とコンピューターモデリングを組合わせた統合アプローチを使用した。種々のCOX−2阻害剤の構造改変を系統だった様式で行い、アポトーシスの誘導における個々の機能的部分の役割を評価した。さらに、アポトーシス誘導におけるセレコキシブとロフェコキシブとの間の機能の大きな相違の観点から、分子モデリングを行い、不規則な構造の関与を解明した。(結果:)構造分析およびコンピューター分析に基づいて、本発明者らは、アポトーシスを引き起こすために必須の種々の構造的特徴を示す作業モデルを提案した。アポトーシス誘導についての構造的要求は、COX−2阻害のものとは異なっている。それらの中でも、スルファモイル部分への水素結合、および複素環式環の周囲の負の静電ポテンシャルが特に注目される。このモデルは、このモデルによって示される構造を満足させるロフェコキシブ構造の変化を介してアポトーシス誘導能力が10倍に増大したことによって立証される。(結論:)本発明者らは、既存のCOX−2阻害剤の分子的プラットフォームに基づいて、新たなクラスのアポトーシス誘導性薬剤を開発し得る。
最近の疫学的研究および動物モデル研究によって、特に結腸癌における化学的予防薬剤としての、非ステロイド性抗炎症性薬物(NSAID)の臨床的適用が示唆されている(31〜39)。COX−2が生成する生物学的メディエーターの細胞増殖における重要性を考慮すると(40〜44)、NSAIDは、COX−2酵素活性をブロックすることによって、癌細胞をアポトーシスに対して感作していることが考えられるが、正確な機構は不明なままである。それにもかかわらず、多くの証拠により、COX−2阻害はNSAID媒介性アポトーシス細胞死において主要な役割を果たしていないことが示唆されている(45)。例えば、スリンダクの代謝物である、スリンダクスルフィドおよびスリンダクスルホンは、COX非依存的な機構を介して、癌細胞にアポトーシスを媒介し得ることが報告された(46〜48)。より最近に、Tet−OnTMアンチセンスCOX−2クローンを開発することによって、本発明者らは、COX−2阻害剤誘導性のアポトーシスに対する前立腺癌細胞の感受性がCOX−2の発現状態に非依存的であることを実証した(J.Natl.Cancer Inst.,印刷中)。臨床的観点から、これらの2つの薬理学的効果の分離は、重要な治療的含蓄を有する。この発見により、作用様式が、従来の化学療法薬剤の機構とは大きく異なる、新たなクラスの抗癌化合物の設計のための分子的基板が提供される。本発明者らのセレコキシブについての最近の研究は、それは、前立腺癌細胞において、複数のシグナル伝達性の標的(AktおよびERK2(細胞外シグナル調節性キナーゼ2)を含む)を妨害することを示す(49、50)。これらのシグナル伝達経路を破壊することにより、細胞増殖および細胞生存を支配する細胞機能の調節の消失が生じ、急速なアポトーシス死が引き起こされる。
しかし、試験した他のCOX−2阻害剤(例えば、ロフェコキシブ、NS398、およびDuP697)は、同等のCOX−2阻害能力を有するにも関わらず(50)、セレコキシブに対してほぼ2桁低いアポトーシス誘導能力を示すので、このアポトーシスの急速な誘導は、セレコキシブに独特なものである。従って、本発明者らは、この相違の背景にある構造的基礎を理解するため、およびそれらの前立腺癌細胞においてアポトーシスを誘導する能力を最適化するための分子的プラットフォームとして、セレコキシブおよびレフェコシブを使用する計画を開始した。構造的データおよびコンピューターモデリングデータに基づいて、本発明者らは、前立腺癌細胞に急速なアポトーシス死を引き起こすために必須の構造的特徴についての知見を提供する作業モデルを描くことができた。より重要なことには、高い能力を有する一連の新しいアポトーシス誘導性薬剤を開発した。これらの合成的誘導体は、前立腺癌細胞において、アンドロゲン感受性、p53の機能的状態、およびBcl−2の発現レベルに関わりなく、アポトーシス死を媒介し、従って、前立腺癌の治療または予防において強力な適応を有する。
(材料)
セレコキシブおよびロフェコキシブは、溶媒抽出、それに続く再結晶化によって、市販のカプセルから入手した。NS398は、Calbiochem(San Diego,CA)から購入した。以下の化合物を合成するために、公開された手順を使用した:1bおよび1b−NH2(51)、2b〜29bおよび40b(52)、41b(53)、43b〜46b(54)。これらの公知の化合物の同定は、1H NMR分析および質量スペクトル分析によって確認した。Akt、ホスホ−473Ser Akt、p44/42 ERK、およびphospho−P44/42 ERKに対するウサギポリクローナル抗体は、Cell Signaling Technologies(Beverly,MA)から購入した。ウサギ抗ポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼ(PARP)ポリクローナル抗体は、PharmMingen(San Diego,CA)の製品であった。使用した他の化学試薬および生化学試薬は、Sigma(St.Louis,MO)から入手した。
セレコキシブおよびロフェコキシブは、溶媒抽出、それに続く再結晶化によって、市販のカプセルから入手した。NS398は、Calbiochem(San Diego,CA)から購入した。以下の化合物を合成するために、公開された手順を使用した:1bおよび1b−NH2(51)、2b〜29bおよび40b(52)、41b(53)、43b〜46b(54)。これらの公知の化合物の同定は、1H NMR分析および質量スペクトル分析によって確認した。Akt、ホスホ−473Ser Akt、p44/42 ERK、およびphospho−P44/42 ERKに対するウサギポリクローナル抗体は、Cell Signaling Technologies(Beverly,MA)から購入した。ウサギ抗ポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼ(PARP)ポリクローナル抗体は、PharmMingen(San Diego,CA)の製品であった。使用した他の化学試薬および生化学試薬は、Sigma(St.Louis,MO)から入手した。
( 4−[5−(4−クロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−lH−ピラゾール−1−イル]ベンゼン−カルボキシアミド(30b) )
表題の化合物を2工程の合成により合成した。(工程a.)4,4,4−トリフルオロ−1−(4−クロロフェニル)ブタン−1,3−ジオンの調製を以下のように行った。5mLのメチルtert−ブチルエーテル(MTBE)中のエチルトリフルオロアセテート(1.08g、7.61mmol)溶液中に、メタノール(1.8mL)中の25% ナトリウムメトキシドを2分間にわたって添加した。2mLのMTBE中の4’−クロロアセトフェノン(1g、6.46mmol)溶液にこの混合物を5分間にわたって滴下した。16時間の攪拌後、3N HCl(3.4mL)を添加した。この有機層を集め、ブラインで洗浄し、硫化マグネシウムで乾燥し、そして濃縮して黄橙色の固体を得た。へキサンからの再結晶化により、ジオン(1.18g、86%)を得た。(工程b.)(4−カルバモイルフェニル)ヒドラジンヒドロクロライド(228mg、1.21mmol)を、20mL中のエタノール中の上記のジオン(300mg、1.21mmol)の攪拌している溶液に添加した。この混合物を還流下で24時間攪拌し、室温まで冷却し、そして乾燥するまで濃縮した。この残留物を酢酸エチルに溶解し、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、そして濃縮して明茶色の固体を得た。酢酸エチルとへキサンからの再結晶化により、30bを得た(350mg、80%):
表題の化合物を2工程の合成により合成した。(工程a.)4,4,4−トリフルオロ−1−(4−クロロフェニル)ブタン−1,3−ジオンの調製を以下のように行った。5mLのメチルtert−ブチルエーテル(MTBE)中のエチルトリフルオロアセテート(1.08g、7.61mmol)溶液中に、メタノール(1.8mL)中の25% ナトリウムメトキシドを2分間にわたって添加した。2mLのMTBE中の4’−クロロアセトフェノン(1g、6.46mmol)溶液にこの混合物を5分間にわたって滴下した。16時間の攪拌後、3N HCl(3.4mL)を添加した。この有機層を集め、ブラインで洗浄し、硫化マグネシウムで乾燥し、そして濃縮して黄橙色の固体を得た。へキサンからの再結晶化により、ジオン(1.18g、86%)を得た。(工程b.)(4−カルバモイルフェニル)ヒドラジンヒドロクロライド(228mg、1.21mmol)を、20mL中のエタノール中の上記のジオン(300mg、1.21mmol)の攪拌している溶液に添加した。この混合物を還流下で24時間攪拌し、室温まで冷却し、そして乾燥するまで濃縮した。この残留物を酢酸エチルに溶解し、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、そして濃縮して明茶色の固体を得た。酢酸エチルとへキサンからの再結晶化により、30bを得た(350mg、80%):
表題の化合物を上記の2工程の手順を用いて、2’,4’−ジクロロアセトフェノンから合成した(全収率53%)。
表題の化合物を上記の2工程の手順を用いて、2’,5’−ジクロロアセトフェノンから合成した(全収率60%)。
表題の化合物を上記の2工程の手順を用いて、3’,4’−ジクロロアセトフェノンから合成した(全収率55%)。
表題の化合物を上記の2工程の手順を用いて、4’−メチルアセトフェノンから合成した(全収率65%)。
表題の化合物を上記の2工程の手順を用いて、4’−トリフルオロメチルアセトフェノンから合成した(全収率53%)。
表題の化合物を上記の2工程の手順を用いて、4’−エチルアセトフェノンから合成した(全収率44%)。
表題の化合物を上記の2工程の手順を用いて、2’,4’−ジメチルアセトフェノンから合成した(全収率62%)。
表題の化合物を上記の2工程の手順を用いて、2’,5’−ジメチルアセトフェノンから合成した(全収率58%)。
表題の化合物を上記の2工程の手順を用いて、3’,5’−ジメチルアセトフェノンから合成した(全収率56%)。
合成をスキーム2に記載したように行った。(工程.a)4−(メチルスルホニル)アセトフェノン(5.5g、27.8mmol)、モルホリン(2.5mL)、およびイオウ(0.89g、27.8mmol)の混合物を10時間還流し、氷に注いだ。沈殿した固体を濾過し、そして冷やした酢酸エチルで洗浄した。この固体を10%水酸化ナトリウム(55mL)に添加し、12時間で84℃まで加熱し、そしてこのアルカリ溶液を12N HClで酸性化した。生じた固体を濾過し、乾燥し、そしてへキサン−酢酸エチル(1:1)から再結晶化して、4−メチルスルホニルフェニル酢酸(白色固体、4.2g、全収率52%)を得た。(工程b.)アセトニトリルに溶解した2−ブロモアセトフェノン(1.02g、5.12mmol)をEt3N(1.74mL)に添加し、続いて4−メチルスルホニルフェニル酢酸(1g、4.67mmol)を添加した。室温で1.5時間後、1,8−ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデク−7−エン(1.67mL)を添加した。この反応混合物をさらに1時間攪拌し、次いで1N HCl(35mL)で処理した。この生成物を酢酸エチルで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥し、そして酢酸エチル−へキサン(1:1)から再結晶化して46b(880mg、全収率60%)を得た。
表題の化合物を47bと同様の様式で、4−スルファモイルフェニル酢酸および2−ブロモアセトフェノンから合成した(収量40%)。
表題の化合物を47bと同様の様式で、4−スルファモイルフェニル酢酸および2−ブロモ−l−(3’,4−ジクロロフェニル)アセトフェノンから合成した(収量32%)。
表題の化合物を47bと同様の様式で、4−スルファモイルフェニル酢酸および2−ブロモ−l−(2’,4−ジクロロフェニル)アセトフェノンから合成した(収量30%)。
ヒト前立腺癌細胞系統であるLNCaPおよびPC−3は、American Type Culture Collection (Rockville,MD)から購入した。細胞を、10%胎仔性ウシ血清(FBS)を補充したRPMI1640培地で、37℃、湿らせた5%CO2のインキュベーターで培養した。細胞には毎日新しい培地を補充し、3日ごとに新しい培地で1:4で継代した。
(細胞生存分析)
前立腺癌細胞を10%FBSを補充したRPMI1640培地中で48時間増殖させ、血清飢餓RPMI培地中で、異なる時間間隔で、DMSO(最終濃度は、0.1%)に溶解させた種々の濃度のセレコキシブに曝露した。コントロールは、セレコキシブ処理した細胞と等しい濃度のDMSOビヒクルを受容した。処理の間、培地中に浮いている細胞のパーセンテージは経時的に増大した。接着している細胞をトリプシン処理によって収穫し、浮いている細胞は、3,200×gで5分間の遠心分離により回収した。細胞形態を光学顕微鏡で200×で観察した。接着している細胞および浮いている細胞の両方を細胞生存についての評価のために混合した。細胞生存は、トリパンブルー排除によって決定した。
前立腺癌細胞を10%FBSを補充したRPMI1640培地中で48時間増殖させ、血清飢餓RPMI培地中で、異なる時間間隔で、DMSO(最終濃度は、0.1%)に溶解させた種々の濃度のセレコキシブに曝露した。コントロールは、セレコキシブ処理した細胞と等しい濃度のDMSOビヒクルを受容した。処理の間、培地中に浮いている細胞のパーセンテージは経時的に増大した。接着している細胞をトリプシン処理によって収穫し、浮いている細胞は、3,200×gで5分間の遠心分離により回収した。細胞形態を光学顕微鏡で200×で観察した。接着している細胞および浮いている細胞の両方を細胞生存についての評価のために混合した。細胞生存は、トリパンブルー排除によって決定した。
(アポトーシスについての分析)
(アポトーシスELISA)アポトーシスの誘導もまた、製造者に指示に従って「Cell Death Detection ELISA」アッセイ(Boehringer−Mannheim)を用いて、評価した。この試験は、誘導されたアポトーシス死の後でのモノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームの形態の細胞質のヒストン結合DNAフラグメントの定量的決定に基づく。簡潔には、実験の24時間前に、PC−3細胞(2.5×106)をT−75フラスコにプレートした。細胞を5mLの無血清RPMI1640培地で2回洗浄し、次いで、異なる時間間隔で、異なる濃度の試験物質またはDMSOビヒクルで処理した。浮いている細胞および接着している細胞の両方を収集し、そして、104個の細胞と等価の細胞溶解液をELISA分析のために使用した。
(アポトーシスELISA)アポトーシスの誘導もまた、製造者に指示に従って「Cell Death Detection ELISA」アッセイ(Boehringer−Mannheim)を用いて、評価した。この試験は、誘導されたアポトーシス死の後でのモノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソームの形態の細胞質のヒストン結合DNAフラグメントの定量的決定に基づく。簡潔には、実験の24時間前に、PC−3細胞(2.5×106)をT−75フラスコにプレートした。細胞を5mLの無血清RPMI1640培地で2回洗浄し、次いで、異なる時間間隔で、異なる濃度の試験物質またはDMSOビヒクルで処理した。浮いている細胞および接着している細胞の両方を収集し、そして、104個の細胞と等価の細胞溶解液をELISA分析のために使用した。
(切断のウエスタンブロット分析)薬物で処理した細胞を収集し、氷冷したPBSで洗浄し、そして、溶解バッファー(20mM Tris−HCl(pH8)、137mM NaCl、1mM CaCl2、10%グリセロール、1% Nonidet P−40、0.5% デオキシコレート、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、100μM 4−(2−アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオライド、10μg/mL ロイペプチン、および10μg/mL アプロチニンからなる)に再懸濁した。1,500×gで5分間の遠心分離の後で、可溶性の細胞溶解液を収集した。等しいタンパク質濃縮物を10% SDS−ポリアクリルアミドゲルで分解し、そして、ニトロセルロース膜に移転した。抗−PARP抗体によるイムノブロッティングを上述のように行った。
(イムノブロッティング)Akt、ホスホ−Akt、ERK、およびホスホ−ERKのウエスタンブロット分析についての一般的な手順を以下のように記載する。細胞をPBS中で洗浄し、SDS−ゲル充填バッファーに再懸濁し、超音波ソニケーターで5秒間音波破砕し、そして、5分間煮沸した。簡単な遠心分離の後で、可溶性画分由来の等しいタンパク質濃縮物をMinigel装置上で10% SDS−ポリアクリルアミドゲルにおいて分離し、そして、セミドライトランスファーセルを使用してニトロセルロース膜に移転した。トランスブロットした膜を0.05% Tween20を含有するTBS(TBST)で2回洗浄し、5%脱脂乳を含有するTBSで60分間ブロッキングした後、この膜を、TBS−1%低脂肪乳中において、1次抗体(1:1,000希釈)と4℃で12時間インキュベートし、そして、TBSTで2回洗浄した。この膜をヤギ抗ウサギIgG−HRP結合体(1:5,000希釈)で室温で1時間プローブし、そして、TBSTで2回洗浄した。イムノブロットを増強化学発光により可視化した。
(分子モデリング実験)セレコキシブ、ロフェコキシブおよび47b(図11)のそれぞれの化合物を、まず、Macromodel7.0中で利用可能なMerck Molecular Force Field (MMFF)を用いる1000工程のMonte−Carlo(MC)シミュレーションに供した(55)。次いで、MCシミュレーションによって到達した最小構成を、気相において、Gaussian 98A7を用いて、B3LYP/6−31G*のDensity Functional Theory(DFT)レベルで完全に最適化した。3つの最小エネルギー構造の全てを、通常モードの分析で確認し、ネガティブ周波数は見出されなかった。次いで、静電ポテンシャル(EP)および電子密度についての計算を、Gaussian 98A7を用いて、216,000ポイントのグリッドで、完全に最適化された構造の各々について行った。各化合物についての静電ポテンシャル地図の写真をgOpenMol(57、58)によって生成し、静電ポテンシャルを電子密度上にマッピングした。アイソサーフィス(isosurface)値は、0.0004であり、EPについての範囲は、−0.03〜0.03であった。
(統計学的分析)各実験を3連で行い、種々の条件において、少なくとも2回は繰り返した。
(結果)
(戦略A:)末端芳香環を種々の置換基で改変するか(化合物2b〜23b、表2)、または別の環系によって置換した(24b〜29b、表2)。
(戦略A:)末端芳香環を種々の置換基で改変するか(化合物2b〜23b、表2)、または別の環系によって置換した(24b〜29b、表2)。
(戦略B:)スルホンアミド活性基(pharmacophore)およびメチルスルホン活性基は両方とも、COX−2阻害においては同等の能力を示す(52)が、セレコキシブのスルファモイル部分をメチルスルホニル基で置換した場合、アポトーシス誘導活性はなくなる。本発明者らは、カルボキシアミド基が、一連のセレコキシブアナログ(30b〜39b、図10)のスルホンアミドにとって適した生物学的同配体(bioisostere)であるのか否かをさらに調査した。
(戦略C:)本発明者らは、化合物40b〜46bを調製し、アポトーシス誘導能力の調節における複素環系の効果を評価した。セレコキシブ 対 ロフェコキシブのコンピュータモデリング分析は、複素環系の周囲の表面静電ポテンシャルとアポトーシス誘導能力との間の相関を示唆する。最終的なより理解しやすい戦略は、表面静電ポテンシャル(前述)に関して、活性セレコキシブおよび不活性ロフェコキシブの全ての分子について比較することであった。この比較により電子密度の重要な相違が明らかになったので、ロフェコキシブ分子を改変して、セレコキシブの表面静電ポテンシャルに近づける努力によって、構造的改変体47b〜50bを設計した。
(スルファモイル部分は、セレコキシブのアポトーシスに対する作用において中心的な役割を果たしている)COX−2阻害において類似するIC50値を有する別のCOX−2阻害剤は、前立腺癌細胞におけるアポトーシス誘導能力に大きな相違を示す。従って、COX−2阻害剤は、速効性のアポトーシス誘導剤および遅効性のアポトーシス誘導剤に分類することができた(図8)。遅効性のアポトーシス誘導剤の代表としては、ロフェコキシブ、NS398、DuP697、およびテルフェニル誘導体1bが挙げられた。この相違は、これらのCOX−2阻害剤のアポトーシス作用の背景にある生化学的機構の相違を明らかにする。図8に示すように、セレコキシブと遅効性アポトーシス誘導性COX−2阻害剤との間には明らかな構造的相違(すなわち、スルホンアミド 対 メチルスルホン)がある。この大きな相違は、アポトーシスの誘導におけるセレコキシブの高い能力において、スルファモイル部分が役割を果たしていることを示唆している。この前提は、セレコキシブのメチルスルホン対応物への変換の後での高い能力の消失によって裏付けられる(図8B、左パネル)。さらに、化合物1bから1b−NH2への変換(51)により、アポトーシス誘導活性が1桁の増大した(図8B、右パネル)。しかし、ロフェコキシブおよびDuP697のスルホンアミド対応物への変換は、それぞれのアポトーシス誘導活性に優位な変化を有さず、このことは、他の構造要素がアポトーシス機構の活性化に関与していることを示した。
(戦略A.)一連の誘導体を合成して、末端フェニル環のアポトーシス誘導能力に対する影響を評価した(この誘導体の多くはまた、強力なCOX−2阻害剤でもあった(52))(表2)。本発明者らの予備的なデータ(J.Natl.Cancer Inst.,印刷中)と比較して、アポトーシス誘導活性とCOX−2阻害活性との間には直接的な相関はなく、このことから、これらの2つの薬理学的活性が分離され得ることが確認された。
(戦略B.)スルホンアミド化合物とメチルスルホン化合物との間のアポトーシス誘導活性における不一致は、前者の活性基(pharmacophore)が、アポトーシス誘導において最適な能力を与えることを示唆する。本発明者らはさらに、この官能基が活性を失うことなくカルボキシアミド部分で置換され得るのか否かを調査した。従って、本発明者らは、セレコキシブおよび化合物6b、8b〜10b、15b、および18b〜21bに存在するスルホンアミドの位置にカルボキシアミド基を有する化合物30b〜39bを調査した(図10A)。図10Aに示されるように、8b→31b、9b→32b、10b→33b、および19b→37bにおける−CONH2による−SO2NH2の置換は、アポトーシス誘導の能力において感知できる違いを有していなかった。しかし、試験した残りの化合物について、この置換は、活性の有意な減少を生じた。この観察は、これらの2つの活性基の標的タンパク質との相互作用の様式が異なることを示唆する。しかし、この構造改変は、これらのカルボキシアミドがアポトーシスを媒介する、すなわち、AktおよびERK2の脱リン酸化を促進する機構は変更しなかった。例として化合物37bを用いて、図10BおよびCはそれぞれ、アポトーシス死およびAktとERKに対する得時間依存的な影響の証拠を示す。
(戦略C.)前述のように、ロフェコキシブおよびDuP697のスルホンアミド対応物は、アポトーシス誘導において弱い活性を示した。さらに、本発明者らは、PC−3細胞の細胞生存に対する、異なる複素環式環を有する多数のベンゼンスルホンアミド(40b〜45b)の効果を試験した。スルホンアミド基が存在するにも関わらず、これらの化合物の全てが、アポトーシス誘導において弱い能力を示した(50μMでのT1/2は、>100時間)。トリフルオロメチル部分の除去(化合物40b)のようなセレコキシブのピラゾール環の少しの改変でさえ、高い能力の喪失を生じた。これらのデータは、複素環式環が、アポトーシスを担うシグナル伝達の標的と相互作用する際に必須の役割を果たしているという概念を思わせた。従って、本発明者らは、これら2つの基本型薬物(セレコキシブとロフェコキシブ)の分子モデリング分析を行い、それぞれの複素環系の周囲の静電ポテンシャルを試験した(図11AおよびB)。個々の領域の電子密度を色によって印をつけ、青および赤は、それぞれ負の静電ポテンシャルおよび正の静電ポテンシャルを示す。これらの間の変化は、青から赤への変換として見られる。示されるように、かなりの違いが、ピラゾール環とラクトン環との間に示され、これらは、赤色と青色が示すように反対の電子密度プロフィールを有するようである。この知見は、ロフェコキシブの複素環式環が、セレコキシブよりも正電荷性であることを示唆する。
これらのコンピュータモデリングのデータに基づいて、本発明者らは、ラクトンカルボニルを反対の方向に再配置することにより、ロフェコキシブの表面ポテンシャルを変え、セレコキシブの表面ポテンシャルを模倣した(図11C)。この変化を起こした場合、生じる異性体47bの全体的電子密度地図は、セレコキシブの全体的電子密度地図と類似した(A対C)。しかし、メチルスルホン47bは、PC−3細胞においてアポトーシスを引き起こす弱い活性を示すので、本発明者らは、対応するスルホンアミド対応物48b、ならびにそのジクロロ−アナログである49bおよび50bに本発明者らの関心を向けた。
これらのデータは、全体的結合系の立体電子効果が、構造的変化をアポトーシス誘導活性と相関付ける新規の方法を示し得ることを実証する。
本研究において、本発明者らは、セレコキシブおよびロフェコキシブの分子プラットホームに基づく構造改変を介して、アポトーシス誘導活性およびアポトーシス誘導能力を最適化するための計画を始めた。構造−活性データに従い、本発明者らは、セレコキシブと、前立腺癌細胞におけるアポトーシスを引き起こすその標的タンパク質との間の相互作用を説明するために図12に示すような作業モデルを提案する。
PC−3細胞におけるアポトーシス死の誘導について、アミド部分および複素環系に関してストリンジェントな構造要件がある。対照的に、末端フェニル環は、構造的変化において高い程度の耐性を示す。本発明者らのデータは、アポトーシス誘導能力が、メチル基を種々の極性置換基で置換することによって増強され得ることを示す。しかし、これらの置換基のサイズの減少また親水性の増大は、活性を激しく弱める。
総括して、本研究の成果は多岐にわたる。第1に、臨床的観点から、COX−2阻害活性をアポトーシス誘導効果から分離することによって、新たなクラスのアポトーシス誘導薬剤の設計のための分子的基盤が提供される。第2に、PC−3細胞に加えて、これらの分子は、アンドロゲン依存性LNCaP前立腺癌細胞およびBcl−2過剰発現PC−3細胞において同等に有効である(データは示さず)。この観察は、これらの新規の薬剤によるアポトーシスの誘導が、アンドロゲン感受性および進行した前立腺癌に関連する遺伝子的異常に非依存的であることを示す。同時に、これらのアポトーシス誘導性薬剤は、ヒト前立腺癌の化学的予防または療法についての強力な候補を示す。
本明細書で参考とした全ての文章は、参考として援用される。
本発明を特定の実施形態に関して記載してきたが、これらの実施形態の詳述は、制限として解釈されるべきではない。
(参考文献)
Claims (28)
- 増殖性の細胞にアポトーシスを誘導するための式Iの化合物、またはその薬学的に受容可能な塩であって:
R1は、カルボキシアミドであり;
R2は、アルキルおよびハロアルキルからなる群から選択され;ならびに
Arは、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントリル、フェナントレニル、およびフルオレニルから選択されるアリールラジカルであって、ここで、Arが、必要に応じて、ハロ、アジド、C1〜C4アルキル、C1〜C4ハロアルキル、C1〜C4アジドアルキル、アリール、アルキルアリール、ハロアリール、ハロアルキルアリール、およびそれらの組合せからなる群から選択される1つ以上のラジカルで置換される、
化合物。 - R2が、C1〜C4アルキルおよびトリフルオロメチルから選択される、請求項1に記載の化合物。
- Arが、2−ナフチル、4−ビフェニル、9−アントリル、2−フルオレニル、4−アジドフェニル、4−アジドメチルフェニル、4−(2−アジドエチル)フェニル、4−(3−アジドプロピル)フェニル、4−(4−アジドブチル)フェニル、4−(4−アジドフェニル)フェニル、4−(4−アジドメチルフェニル)フェニル、4−メチルフェニル、4−エチルフェニル、4−プロピルフェニル、4−ブチルフェニル、4−(2−ブロモエチル)フェニル、4−(3−ブロモプロピル)フェニル、4−(4−ブロモブチル)フェニル、4−(トリフルオロメチル)フェニル、4−(4−メチルフェニル)フェニル、4−(4−ブロモメチルフェニル)フェニル、4−(4−ブチルフェニル)フェニル、4−(4−tert−ブチルフェニル)フェニル、2−クロロフェニル、4−クロロフェニル、2,4−ジクロロフェニル、3,4−ジクロロフェニル、2,5−ジクロロフェニル、2,4−ジメチルフェニル、2,5−ジメチルフェニル、3,4−ジメチルフェニル、3,5−ジメチルフェニル、4−(4−クロロフェニル)フェニル、4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル、4−(2,3−ジクロロフェニル)フェニル、4−(3,5−ジメチルフェニル)フェニル、4−(2,4,5−トリクロロフェニル)フェニル、4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル、2−フェナントレニル、3−インドリル、2−ピロリル、および4−(ベンジル)フェニルからなる群から選択される、請求項2に記載の化合物またはその薬学的に受容可能な塩。
- 処置を必要とする被験体において癌の発症を処置、阻害、または遅延する方法であって、該方法が、式Iの化合物:
R1は、カルボキシアミドであり;
R2は、アルキルおよびハロアルキルからなる群から選択され;ならびに
Arは、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントリル、フェナントレニル、およびフルオレニルから選択されるアリールラジカルであって、ここで、Arが、必要に応じて、ハロ、アジド、C1〜C4アルキル、C1〜C4ハロアルキル、C1〜C4アジドアルキル、アリール、アルキルアリール、ハロアリール、ハロアルキルアリール、およびそれらの組合せからなる群から選択される1つ以上のラジカルで置換される、化合物またはその薬学的に受容可能な塩の治療的有効量を、このような処置を必要とする該被験体に投与する工程を包含する、方法。 - 前記癌が、白血病、非小細胞肺癌、結腸癌、CNS癌、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、リンパ腫、および乳癌からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記癌が、前立腺癌である、請求項5に記載の方法。
- 前記化合物が、4−[5−(2,4−ジクロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2,5−ジクロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(3,4−ジクロロフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−ビフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−ブロモメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−ブチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−ブロモメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−ブチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2,4,5−トリクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2,4−ジメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;またはそれらの薬学的に受容可能な塩からなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記化合物が、COX−2阻害剤ではない、請求項4に記載の方法。
- 急速に増殖する細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、該方法が、式Iの化合物:
R1は、カルボキシアミドであり;
R2は、アルキルおよびハロアルキルからなる群から選択され;ならびに
Arは、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントリル、フェナントレニル、およびフルオレニルから選択されるアリールラジカルであって、ここで、Arが、必要に応じて、ハロ、アジド、C1〜C4アルキル、C1〜C4ハロアルキル、C1〜C4アジドアルキル、アリール、アルキルアリール、ハロアリール、ハロアルキルアリール、およびそれらの組合せからなる群から選択される1つ以上のラジカルで置換される、化合物またはその薬学的に受容可能な塩の薬理学的有効量を、該急速に増殖する細胞に導入する工程を包含する、方法。 - 前記急速に増殖する細胞が、癌細胞である、請求項9に記載の方法。
- 前記癌細胞が、白血病、非小細胞肺癌、結腸癌、CNS癌、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、リンパ腫、および乳癌からなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記癌細胞が、前立腺癌である、請求項11に記載の方法。
- 処置を必要とする被験体において、癌の発症を処置、阻害、または遅延する方法であって、該方法が、式I:
R1は、カルボキシアミドであり;
R2は、アルキルおよびハロアルキルからなる群から選択され;ならびに
Arは、2−ナフチル、4−ビフェニル、9−アントリル、2−フルオレニル、4−アジドフェニル、4−アジドメチルフェニル、4−(2−アジドエチル)フェニル、4−(3−アジドプロピル)フェニル、4−(4−アジドブチル)フェニル、4−(4−アジドフェニル)フェニル、4−(4−アジドメチルフェニル)フェニル、4−メチルフェニル、4−エチルフェニル、4−プロピルフェニル、4−ブチルフェニル、4−(2−ブロモエチル)フェニル4−(3−ブロモプロピル)フェニル、4−(4−ブロモブチル)フェニル、4−(トリフルオロメチル)フェニル、4−(4−ブロモメチルフェニル)フェニル、4−(4−メチルフェニル)フェニル、4−(4−ブチルフェニル)フェニル、4−(4−tert−ブチルフェニル)フェニル、2−クロロフェニル、4−クロロフェニル、2,4−ジクロロフェニル、3,4−ジクロロフェニル、2,5−ジクロロフェニル、2,4−ジメチルフェニル、2,5−ジメチルフェニル、3,4−ジメチルフェニル、3,5−ジメチルフェニル、4−(4−クロロフェニル)フェニル、4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル、4−(2,3−ジクロロフェニル)フェニル、4−(3,5−ジメチルフェニル)フェニル、4−(2,4,5−トリクロロフェニル)フェニル、4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル、2−フェナントレニル、3−インドリル、2−ピロリル、4−(ベンジル)フェニルからなる群から選択される1つ以上のラジカルで置換される、式Iを有する化合物またはその薬学的に受容可能な塩の治療的有効量を投与する工程を包含する、方法。 - 前記癌が、前立腺癌である、請求項13に記載の方法。
- 癌細胞にアポトーシスを誘導するために有用である、式IIの化合物
R3は、カルボキシアミドおよびスルホンアミドからなる群から選択され;
R4は、アルキルおよびハロアルキルから選択され;および
Ar’は、4−アジドフェニル、4−(2−アジドエチル)フェニル、4−(3−アジドプロピル)フェニル、4−(4−アジドブチル)フェニル、4−(4−アジドフェニル)フェニル、4−(4−アジドメチルフェニル)フェニル、2,5−ジメチルフェニル、4−プロピルフェニル、4−ブロモメチルフェニル、4−(2−ブロモエチル)フェニル、4−(3−ブロモプロピル)フェニル、4−(4−ブロモブチル)フェニル、4−(4−ブロモメチルフェニル)フェニル、4−(4−tert−ブチルフェニル)フェニル、9−アントリル、4−(4−ブチルフェニル)フェニル、4−(4−メチルフェニル)フェニル、4−(4−クロロフェニル)フェニル、4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル、4−(2,3−ジクロロフェニル)フェニル、4−(3,5−ジメチルフェニル)フェニル、4−(2,4,5−トリクロロフェニル)フェニル、4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル、2−フェナントレニル、3−インドリル、2−ピロリル、4−(ベンジル)フェニル、および2−フルオレニルからなる群から選択される、化合物。 - 4−[5−(4−アジドフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(2−アジドエチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(3−アジドプロピル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−アジドブチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−ブチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−メチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−アジドフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−アジドメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−クロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(2,3−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(3,5−ジメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(2,4,5−トリクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(2−フェナントレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(3−インドリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(2−ピロリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−ベンジルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド;4−[5−(4−アジドフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2−アジドエチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3−アジドプロピル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−アジドブチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−アジドフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−アジドメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2,5−ジメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−プロピルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2−ブロモエチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−ブチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−メチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3−ブロモプロピル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−ブロモブチル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−ブロモメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−tert−ブチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(9−アントリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2−フルオレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−クロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2,3−ジクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(3,5−ジメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(2,4,5−トリクロロフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2−フェナントレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(3−インドリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;4−[5−(2−ピロリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミド;および4−[5−(4−ベンジルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンカルボキシアミドからなる群から選択される、請求項15に記載の化合物、およびその薬学的に受容可能な塩。
- 前記化合物が、4−[5−(2−フェナントレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミドである、請求項16に記載の化合物。
- 急速に増殖する細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、該方法が、治療的有効量の式II:
R3は、カルボキシアミドおよびスルホンアミドからなる群から選択され;
R4は、アルキルおよびハロアルキルから選択され;ならびに
Ar’は、4−アジドフェニル、4−(2−アジドエチル)フェニル、4−(3−アジドプロピル)フェニル、4−(4−アジドブチル)フェニル、4−(4−アジドフェニル)フェニル、4−(4−アジドメチルフェニル)フェニル、2,5−ジメチルフェニル、4−プロピルフェニル、4−ブロモメチルフェニル、4−(2−ブロモエチル)フェニル、4−(3−ブロモプロピル)フェニル、4−(4−ブロモブチル)フェニル、4−(4−ブロモメチルフェニル)フェニル、4−(4−tert−ブチルフェニル)フェニル、9−アントリル、4−(4−ブチルフェニル)フェニル、4−(4−メチルフェニル)フェニル、4−(4−クロロフェニル)フェニル、4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル、4−(2,3−ジクロロフェニル)フェニル、4−(3,5−ジメチルフェニル)フェニル、4−(2,4,5−トリクロロフェニル)フェニル、4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル、2−フェナントレニル、3−インドリル、2−ピロリル、4−(ベンジル)フェニル、および2−フルオレニルからなる群から選択される、
化合物またはその薬学的に受容可能な塩を該急速に増殖する細胞に導入する工程を包含する、方法。 - 前記急速に増殖する細胞が、癌細胞であって、該癌細胞が、白血病、非小細胞肺癌、結腸癌、CNS癌、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、リンパ腫、および乳癌からなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記癌細胞が、前立腺癌細胞である、請求項19に記載の方法。
- 前記化合物が、4−[5−(2,5−ジメチルフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミドである請求項18に記載の方法。
- 前記化合物が、4−[5−(2−フェナントレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミドである、請求項18に記載の方法。
- 処置を必要とする患者において癌の発症を治療、阻害、または遅延するための方法であって、該癌が、白血病、非小細胞肺癌、結腸癌、CNS癌、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、膀胱癌、リンパ腫、および乳癌からなる群から選択され、該方法が、治療的有効量の式II:
R3は、カルボキシアミドおよびスルホンアミドからなる群から選択され;
R4は、アルキルおよびハロアルキルから選択され;ならびに
Ar’は、4−アジドフェニル、4−(2−アジドエチル)フェニル、4−(3−アジドプロピル)フェニル、4−(4−アジドブチル)フェニル、4−(4−アジドフェニル)フェニル、4−(4−アジドメチルフェニル)フェニル、2,5−ジメチルフェニル、4−プロピルフェニル、4−ブロモメチルフェニル、4−(2−ブロモエチル)フェニル、4−(3−ブロモプロピル)フェニル、4−(4−ブロモブチル)フェニル、4−(4−ブロモメチルフェニル)フェニル、4−(4−tert−ブチルフェニル)フェニル、9−アントリル、4−(4−ブチルフェニル)フェニル、4−(4−メチルフェニル)フェニル、4−(4−クロロフェニル)フェニル、4−(3,5−ジクロロフェニル)フェニル、4−(2,3−ジクロロフェニル)フェニル、4−(3,5−ジメチルフェニル)フェニル、4−(2,4,5−トリクロロフェニル)フェニル、4−(4−トリフルオロメチルフェニル)フェニル、2−フェナントレニル、3−インドリル、2−ピロリル、4−(ベンジル)フェニル、および2−フルオレニルからなる群から選択される、
化合物、またはその薬学的に受容可能な塩をこのような処置を必要とする該被験体に投与する工程を包含する、方法。 - 前記化合物が、4−[5−(2−フェナントレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミドである、請求項23に記載の方法。
- 前記癌が、前立腺癌である、請求項23に記載の方法。
- 前記前立腺癌が、アンドロゲン非依存的な前立腺癌である、請求項25に記載の方法。
- 前記癌が、アンドロゲン非依存的である、請求項23に記載の方法。
- 前立腺癌の処置のために4−[5−(2−フェナントレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミドを使用する方法であって、該方法が、治療的有効量の4−[5−(2−フェナントレニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド、またはその薬学的に受容可能な塩をこのような処置を必要とする被験体に導入する工程を包含する、方法。
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