JP2017226673A - Erストレスを刺激することによりアポトーシスを誘導するための方法および化合物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ERストレスの悪化は、SERCA(筋形質/小胞体カルシウムATPアーゼの阻害して、細胞質のカルシウム濃度の上昇したレベルを導くことにより、COX-2(シクロオキシゲナーゼ-2)の活性化の阻害またはヒスタミンの放出を引き起こすことなく、特異的な様式において達成される。アポトーシスの誘導は、プロテアソームまたはプロテアーゼの阻害を介してERストレスを第一に誘導すること、または更に悪化することにより増強されてよい。また、ERストレス悪化剤として有用な化合物および組成物、それをスクリーニング、選択、同定および設計する方法、並びにERストレスの特異的且つ選択的な悪化を介してアポトーシスを誘導することにより病的な状態を治療する方法も提供される。
【選択図】なし
Description
本出願は、腫瘍細胞死を引き起こす腫瘍細胞における小胞体(ER)ストレス反応を刺激するための化合物の使用(USE OF CHEMICAL COMPOUNDS TO STIMULATE THE ENDOPLASMIC RETICULUM (ER) STRESS RESPONSE IN TUMOR CELLS CAUSING TUMOR CELL DEATH)の表題で2007年3月26日に出願された仮出願番号60/908,107に開示された発明の権利を主張する。当該米国仮出願の35 USC §119(e)の利益が、それにより権利主張される。上記の優先権出願は、これによって引用によりここに組み込まれる。
本発明は、分子的な医薬の分野に属する。より詳しくは、本発明は、ERストレス反応を悪化させることにより細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導するための方法、化合物および組成物に属する。本発明はまた、治療が困難な癌、薬物耐性の癌および繰り返し発生する癌を含む、癌を治療する方法に関する。
アポトーシスは、プログラム細胞死(programmed cell death)または「細胞の自殺(cellular suicide)」に関連する工程であり、細胞表面死受容体が種々の遺伝毒性剤により占有されたか、または活性化された後に生じる生理学的な状態での工程である。この工程は、チトクロムCのミトコンドリアからの放出を導き、その結果として、アポトーシスを促進するカスパーゼ酵素を活性化する。
従って、本発明の目的は、新規治療の基礎として役立ち得るアポトーシスを誘導する方法を提供することである。
R1は、メチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキルまたはカルボキシアルキルであり;
R2は、水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキルまたはカルボキシアルキルであり;
R3 - R7は、水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、アロキシ、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキルまたはカルボキシアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より独立して選択され;
R8 - R11は、水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、複素環式、アリールまたはヘテロアリールからなる群より独立して選択され;および
R12は、水素、アセチル、アシル、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アミノアシル、アミノアルキル、シクロアルキル、複素環式、アリールまたはヘテロアリールである;を有するERストレス悪化剤として有用な化合物を提供する。
概要において記載した通り、本発明は、アポトーシスを誘導するためのERストレス反応機序を用いるための新規戦略の予期せぬ発見に基づく。本発明の戦略に従うと、本発明の態様は、当該戦略を実行するための方法および手段が提供される。特に、本発明は、活動的に増殖するがん細胞および静止した癌細胞の両方においてアポトーシス(細胞死)を誘導する小胞体ストレス(endoplasmic reticulum stress、ESR)を調節することが可能な新たな部類の化学療法の化合物を提供する。これらの化合物はまた、腫瘍の浸潤、血管形成および血管新生を阻害する。更に、これらの化合物は、(CNSを含む)高い生物学的利用能により特徴付けられ、毒性を殆ど示さず、経口投与が可能であり、抗癌作用を増強するための標準的な化学療法剤との組み合わせが可能である。本発明の幾つかの側面に従う治療方法は、異常細胞のコレクションとしてではなく、生きている存在物としての癌の治療に向けられ、全ての癌に適用されてよい。
小胞体(ER)ストレス反応(ESR)は、通常のER機能、例えば、未折り畳み蛋白質の蓄積、脂質若しくは糖蛋白質の不均衡またはERルーメンのイオン条件の変化などの異なる原因により引き起こされ得る適応性の一組の経路からなる(概説について(5,6)を参照されたい)。ESRの主たる目的は、ストレスの多い障害を緩和すること、および適切なER恒常性を回復することであるが、強度または持続するERストレスの場合では、これらの経路はプログラム細胞死/アポトーシスを引き起こすであろう。ESRの主要なプロサバイバルレギュレーターの1つは、グルコース調節化蛋白質78(glucose-regulated protein 78、GRP78/BiP)であり、これは、分解のための誤って折り畳まれた蛋白質の標的化における、ERC2+結合における、および膜貫通ERストレスのセンサーの活性化の調節における、蛋白質の折り畳みとアッセンブリにおいて重要な役割を有する(7)。他方、CCAAT/エンハンサー結合蛋白質相同翻訳因子(CCAAT/enhancer binding protein homologous transcription factor、CHOP/GADD153)およびカスパーゼ4は、ESRのプロアポトーシス性の武器の重要な実行物である(8,9)。
腫瘍増殖および生存に対するERストレスの妥当性が理解され始めたが、腫瘍治療の目的の他ためのその潜在的な活用に関しては全く殆ど知られていない。より重要なことには、ERストレス反応経路における攻撃点や生存治療法のための基礎を提供し得る化合物が未だに知られていない。
ここで使用されるとき、「ERストレス」の語は、ERにおける蛋白質合成を傷害し得る種々の生理学的または病理学的な状態を一括していう。
この明細書で用いられるとき、アルキル基は約20炭素を上回る、または1から16炭素を含む直鎖、分岐、環状 アルキル基を含むことができ、かつ直線または分岐である。ここでのアルキル基の例は、限定されないが、メチル, エチル、プロピル、イソプロピル、n−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert−ペンチル、およびイソヘキシルを含む。ここで用いられるとき、低アルキルは 約1または約2炭素から約6炭素を有する炭素鎖を指す。適切なアルキル基は飽和または不飽和であってもよい。更に、アルキルもまたC1-C15 アルキル、アリル、アレニル、アルケニル、C3-C7ヘテロ複素環 アリール、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、オキソチオ、アルコキシ、ホルミル、カルボキシ,カルビキシアミノ、ホスホリル、ホスホナート、ホスホアミド、スルホニル、アルキルスルホネートおよびスルホンアミドからなる群から選択される置換基で1つまたはそれ以上の炭素を1またはそれ以上の回数で置換されてもよい。また、アルキル基は10を上回るヘテロ原子、ある態様において1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8または9 ヘテロ原子置換基を含んでもよい。適切なヘテロ原子は窒素、酸素、硫黄およびリンを含む。
ここで用いられるとき、「シクロアルキル」 は単または多環式環系、ある態様で3から10炭素原子、他の態様で3から6炭素原子を指す。シクロアルキル基の環系は融合、架橋、スピロ接続様式で互いに結合され得る1環または2以上の環で構成されてもよい。
ここで用いられるとき、「アリール」は3から16炭素原子を含む芳香族単環式または多環式基を指す。この明細書で用いるとき、アリール基は10を上回るヘテロ原子、ある態様において 1, 2, 3または 4ヘテロ原子を含み得るアリール基である。アリール基もまたアリール基または低アルキル基で1またはそれ以上の回数、ある態様において、1から3または4回任意に置換されてもよく、且つそれは他のアリールまたはシクロアルキルリングと融合されてもよい。適切なアリール基は、例えばフェニル、ナフチル、トリル、イミダゾリル、ピリジル、ピロイル、チエニル、ピリミジル、チアゾイルおよびフリル基を含む。
この明細書で用いられるとき、環は1またはそれ以上の窒素、酸素、硫黄またはリン原子を含み得る20原子を上回って有するように規定され、且つ環が水素, アルキル, アリル, アルケニル, アルキニル, アリール, ヘテロアリール, クロロ,ヨード, ブロモ, フルオロ, ヒドロキシ, アルコキシ, アリールオキシ, カルボキシ, アミノアルキルアミノ,ジアルキルアミノアシルアミノ, カルボキシアミノ, アイアノ,オキソ ,チオ, アルキルチオ, アリールチオ, アシルチオ, アルキルスルホネート, アリールスルホネート,ホスホリルホスホネート、ホスホアミドおよびスルホニルからなる群から選択される1またはそれ以上の置換基を有することができ、且つ更に環が炭素環式を含む1またはそれ以上の融合環、複素環式, アリールまたは ヘテロアリール環を含んでもよい。
ここで用いるとき、アルケニル および アルキニル 炭素鎖は、明記がない限り、2から20炭素または2から16炭素を含み、且つ直線または分岐である。2から20炭素のアルケニル炭素鎖はある態様において、1から8の二重結合を含み、且つ2から16炭素のアルケニル炭素鎖はある態様において1から5の二重結合を含む。2から20炭素のアルキニル炭素鎖はある態様において1から8の三重結合を含み、かつ2から16炭素のアルキニル炭素鎖はある態様において1から5の三重結合を含む。
ここで用いられるとき、「ヘテロアリール」はある態様において約5から約15要素の単環式または多環式芳香族環系を指し、ここで環系中の1つまたはそれ以上、ある態様において1から3の原子はヘテロ原子、すなわち限定されないが、窒素、酸素または硫黄を含む炭素以外の元素である。ヘテロアリール基はベンゼン環に任意に融合してもよい。ヘテロアリール 基は限定されないが、フリル、イミダゾリル、ピロリジニル、ピリミジニル、テトラゾリル、チエニル、ピリジル、ピロリル、N−メチル、ピロリル、キノリニルおよびイソキノリニルを含む。ここで用いるとき、「ヘテロ環式」はある態様において3から10要素、別の態様において4から7要素、更に他の態様において5から6の要素の、単または多環式非芳香族環系を指し、ここで環系中の1またはそれ以上、ある態様において1から3の原子はヘテロ原子、すなわち限定されないが窒素、酸素または硫黄を含む炭素以外の元素である。態様において、ヘテロ原子は窒素であり、窒素はアルキル, アルケニル, アルキニル, アリール, ヘテロアリール, アラルキル, ヘテロアラアルキル, シクロアルキル, ヘテロ複素環式、 シクロアルキルアルキル, ヘテロ複素環式アルキル, アシル, グアニジノ、で任意に置換され、または窒素は置換基が前記から選択されるアンモニウム基を形成するために四級化されてもよい。
本発明の代表的な態様
1.アポトーシスを誘引するために細胞のERにおいてストレスを誘導または悪化する方法
第一の側面において、本発明は、アポトーシスを引き起こす細胞の小胞体(ER)におけるストレスを誘導または悪化する方法を提供する。
幾つかの好ましい態様において、ERストレス悪化剤が化合物または当該化合物を含む薬学的組成物であり、当該化合物は一般式;
R1 はメチル, フルオロメチル, ジフルオロメチル, トリフルオロメチル, アルキル, フルオロアルキル, ジフルオロアルキル, トリフルオロアルキル, ポリフルオロアルキル, ヒドロキシアルキルまたはカルボキシアルキルであり;
R2は水素, フルオロ, クロロ, ブロモ; フルオロメチル, ジフルオロメチル, トリフルオロメチル, アルキル, フルオロアルキル, ジフルオロアルキル, トリフルオロアルキル, ポリフルオロアルキル, ヒドロキシアルキルまたはカルボキシアルキルであり;
R3 - R7 はare independently selected from a group consisting of: 水素, フルオロ, クロロ, ブロモ, アロキシ, アルキル, フルオロアルキル, ジフルオロアルキル,トリフルオロアルキル, ポリフルオロアルキル, ヒドロキシアルキル, or カルボキシアルキル, アリールおよびヘテロアリールからなる群から独立して選択され;
R8 - R11 are independently selected from a group consisting of: 水素, フルオロ, クロロ, ブロモ; フルオロメチル, ジフルオロメチル, トリフルオロメチル, アルキル, フルオロアルキル, ジフルオロアルキル, トリフルオロアルキル, ポリフルオロアルキル, ヒドロキシアルキル, カルボキシアルキル, アルケニル, アルキニル, シクロアルキル, 複素環式, アリール, or ヘテロアリール; および
R12は水素, アセチル, アシル, アルキル, フルオロアルキル, ジフルオロアルキル, トリフルオロアルキル, ポリフルオロアルキル, ヒドロキシアルキル, カルボキシアルキル; アミノアシル, アミノアルキル, シクロアルキル, 複素環式, アリールまたはヘテロアリールである;を有するものである。
上述の通り、本発明はまた、直接的または間接的の何れかでSERCAを阻害し、それによりERストレスを悪化するそれらの態様を含む。1つの典型的な態様において、悪化剤は、代謝または他の変換手段を介してSERCAを阻害できる活性な化合物に変換され得るプロドラッグである。例えば、悪化剤が組換え分子であるこれらの態様において、トランスロケーションペプチドが付着して、薬物を膜を横切って転位置することが可能である。他の態様において、提供される化合物は、代謝性の酸化、蛋白質分解性の切断または加水分解において、提供された化合物をER悪化剤に変換する官能基を含む。当業者は、そのような官能基が、これに限定するものではないが、メチル基またはアルキル基、エステル基、カルボネート基、アミド基、ペプチドまたはそれらの環式または高分子誘導体を含む。
本発明の幾つかの態様に従う方法は、更なる1または1以上のERストレス悪化剤を適用する工程を更に含んでもよい。好ましくは、この更なる1または1以上のERストレス悪化剤は、異なるストレス誘導機序を介して作用する。
本発明の幾つかの更なる態様において、ERストレス悪化剤は、更に細胞に対してアポトーシスエンハンサーを適用することにより補助されてもよい。本発明と関連して、アポトーシスエンハンサーはアポトーシスの誘導に対する関連においてERストレスの効果を増幅するものである。好ましい、アポトーシスエンハンサーはCHOPの発現を上方制御すること、GRP78の保護効果を克服すること、およびカスパーゼ4および/またはカスパーゼ7などのカスパーゼを活性することが可能な化学的または物理的薬剤(物理的作用因子)である。典型的なアポトーシスエンハンサーは、GRP78のためのsiRNAまたはGRP78機能の阻害剤を含んでよいが、これらに限定するものではない。加えて、アポトーシスエンハンサーはまた、合成化合物または天然化合物であってもよく、これらに限定するものではないが、Bcl-2ファミリー、例えば、ABT-737などの抗アポトーシス蛋白質の活性化を阻害するBH3-ミメティックを含む。
第二の側面において、本発明は、細胞においてアポトーシスを引き起こすために細胞におけるERストレスを誘導または悪化するために有用な化合物をスクリーニング、選択および設計する方法を提供する。
第3側面において、本発明は一般式;
R1 はメチル, フルオロメチル, ジフルオロメチル, トリフルオロメチル, アルキル, フルオロアルキル, ジフルオロアルキル, トリフルオロアルキル, ポリフルオロアルキル, ヒドロキシアルキル, またはカルボキシアルキルである;
R2は水素, フルオロ, クロロ, ブロモ; フルオロメチル, ジフルオロメチル, トリフルオロメチル, アルキル, フルオロアルキル, ジフルオロアルキル, トリフルオロアルキル, ポリフルオロアルキル, ヒドロキシアルキル, または カルボキシアルキルである;
R3 - R7 は水素, フルオロ, クロロ, ブロモ, アロキシ, アルキル, フルオロアルキル, ジフルオロアルキル, トリフルオロアルキル, ポリフルオロアルキル, ヒドロキシアルキル,または カルボキシアルキル, アリールおよびヘテロアリールからなる群から独立して選択される;
R8 - R11 は、水素, フルオロ, クロロ, ブロモ; フルオロメチル, ジフルオロメチル, トリフルオロメチル, アルキル, フルオロアルキル, ジフルオロアルキル, トリフルオロアルキル, ポリフルオロアルキル, ヒドロキシアルキル, カルボキシアルキル, アルケニル, アルキニル, シクロアルキル, 複素環式, アリールまたはヘテロアリールからなる群より独立して選択され; および
R12は水素, アセチル, アシル, アルキル, フルオロアルキル, ジフルオロアルキル,トリフルオロアルキル, ポリフルオロアルキル, ヒドロキシアルキル, カルボキシアルキル; アミノアシル, アミノアルキル, シクロアルキル, 複素環式, アリールまたはヘテロアリールである;を有する、ERストレス悪化剤として有用な化合物をまた提供する。
前述の通り、本発明はまた、細胞においてアポトーシスを引き起こすために細胞におけるERストレスを誘導または悪化するために有用な薬学的組成物を提供する。本発明の態様は、一般的にERストレス悪化剤と、薬学的に許容される担体とを含む。
第5の側面において、本発明はまた、選択された病的な細胞においてERストレスを誘導または悪化して当該細胞においてアポトーシスを引き起こすことにより患者における病的な状態を治療する方法を提供する。
例1:2,5-ジメチル-セレコキシブ(ジメチル-セレコキシブ(DMC))、セレコキシブの非コキシブ類似体により誘導される腫瘍細胞死の主要な成分としてのカルシウム活性化ERストレス
[材料および方法]
[材料]
セレコキシブは4-[5-(4-メチルフェニル)-3-(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル]ベンゼンスルホンアミドである(24)。DMCは、近い構造類似体であり、その5-アリール部分が moiety has been altered by replacing 4-メチルフェニルが2,5-ジメチルフェニルでの置換により変わり、結果として4-[5-(2,5-ジメチルフェニル)-3-(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル]ベンゼンスルホンアミド(20, 19)を生じたものである。両化合物は以前発行された手順に従って我々の実験室で合成された(参考文献24をセレコキシブについて、および参考文献19をDMCについて参照されたい)。各薬物をDMSOに100 mmol/L (ストック溶液)に溶解した。ヴァルデコキシブ(valdecoxib (25))およびロフェコキシブ(rofecoxib (26))については、ベキストラ(Bextra (Pfizer, New York, NY))およびヴィオック((Merck, Whitehouse Station, NJ))の商業的なキャプレッツをそれぞれをH2Oに懸濁し、賦形剤を崩壊し、その活性成分を25mmol/LでDMSOに溶解した。加えて、われわれは、確立された手順に従って、我々の実験室において合成した純粋なロフェコキシブ末を使用した(27)。全ての伝統的なNSAIDをシグマから粉末化形態でシグマ(St. Louis, MO)から入手し、100mmol/LでDMSOに溶解した。タプシガルジンおよびBAPTA-AMをシグマから入手し、DMSOに溶解した。全ての薬物を、溶媒(DMSO)の最終濃度が<0.5%に維持される方法で細胞培養用培地に添加した。
殆どの細胞株はthe American Type Culture Collection (Manassas, VA)から入手し、10% ウシ胎児血清, 100 units/mL ペニシリン, および 0.1 mg/mL ストレプトマイシンを補ったDMEMまたはRPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY)にで、37℃で5%CO2雰囲気で加湿インキュベータ内で培養した。グリオブラストーマ細胞株U251およびLN229はFrank B. Furnari and Webster K. Cavenee (Ludwig Institute of Cancer Research, La Jolla, CA)から提供された。
総細胞溶解物をラジオ免疫沈澱アッセイ用緩衝液で細胞を溶解することにより調製し(28)、蛋白質濃度を二シンコニン酸蛋白質アッセイ試薬(Pierce, Rockford, IL)を使用して測定した。ウェスタンブロットアッセイについては、50 Agの各サンプルを記載される通りに処理した(29)。一次抗体はCell Signaling Technologies (Beverly, MA), Cayman Chemical (Ann Arbor, MI), またはSanta Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA)から入手し、製造者の推奨に従って使用した。二次抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼと組み合わせて、the SuperSignal West substrate from Pierce を用いた化学発光により検出した。全てのイムノブロットを結果を確認するために少なくとも1度繰り返した。
腫瘍組織における蛋白質発現の免疫組織化学的な分析をベクタステインアビジン-ビオチン複合体法キット(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を使用して製造者の推奨に従って行った。この手順はビオチン標識した二次抗体と予備形成したアビジン:ビオチン化酵素複合体を使用した。アビジン-ビオチン複合体法技術と呼ばれる。一次抗体として、我々は抗CHOP抗体(Santa Cruz Biotechnology)を1:100で2%の正常ヤギブロッキング血清に希釈した。
腫瘍区画におけるアポトーシスを末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPニック末端標識アッセイ(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling assay、(30))の使用により定量的に測定した。この手順のための全ての成分は、the ApopTag In situ Apoptosis Detection kit (Chemicon, Temecula, CA)からのものであり、これを製造者の説明書に従い使用した。
小型干渉RNA(siRNA)のトランスフェクションの24時間後、細胞を6穴プレートに1穴当たり200細胞で播種した。細胞の付着が完了した後、細胞を48時間の薬物処理に暴露した。その後、薬物を除去し、新鮮な増殖培地を添加し、細胞を12〜14日間に亘り妨害をせずに培養し、その間、生存細胞は増殖細胞のコロニーを形成した。コロニーは、4時間の1%メチレンブルー(メタノール中)で染色することにより可視化して、次にカウントした。
細胞を6穴プレートにおいてLipofectAMINE 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて製造者の説明書に従ってトランスフェクションした。異なるsiRNAをサザンカリフォルニア大学のミクロケミカル・コア・ラボラトリー(the microchemical core laboratory of the University of Southern California/K. Norris Jr. Comprehensive Cancer Center)で合成し、それらの配列は以下の通りである;
緑色蛍光蛋白質を標的とするsiRNA (si-GFP); 5’-CAAGCUGACCCUGAAGUUCTT-3’ (センス)、および5’-GAACUUCAGGGUCAGCUUGTT-3’ (アンチセンス);
si-GRP78 5’-GGAGCGCAUUGAUACUAGATT-3’ (センス)、および5’-UCUAGUAUCAAUGCGCUCCTT-3’ (アンチセンス);並びに
si-カスパーゼ-4; 5’-AAGUGGCCUCUUCACAGUCAUTT-3’ (センス)、および5’-AAAUGACUGUGAAGAGGCCACTT-3’ (アンチセンス)。
細胞を4 Amol/L Fura-2/AM (Invitrogen)と共に30分間室温で138 mmol/L NaCl, 5.6 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L MgCl2, 2.6 mmol/L CaCl2, 10 mmol/L HEPESおよび 4 mmol/L グルコース (pH 7.4)を含む外部溶液中でインキュベートすることによりロードした。ロード後、細胞を洗浄し、画像処理用の固定のために移した。細胞を個々の薬物で10秒間処理し、他方では、ポリクロメータV(Polychromator V (TILL Photonics GmbH, Grafelfing, Germany))を使用して350と380nmの間で交互の励起波長蛍光で励起し、ツァイス・フルア40Γ オイル対物レンズ(Zeiss Fluar 40γ oil objective (Carl Zeiss, Jena, Germany))を有するツァイス・アクシオバート100顕微鏡(Zeiss Axiovert 100 microscope)を介して照明を提供した。画像は、メタフルオ・ソフトウェア(MetaFluor software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA))で制御されたカスケード512B CCDカメラ(Cascade 512B CCD camera (Photometrics, Tucson, AZ))を使用して0.5Hzの入手頻度で捕捉した。350と380nmの励起で得られた画像の比を、Grynkiewicz et al. (31)により開発された原理に従って細胞質カルシウム濃度の変化を示すために使用した。
4から6種齢の雄性無胸腺症 nu/nu マウスをHarlan (Indianapolis, IN)から入手し、皮下注射で5 × 105 U87グリオブラストーマ細胞を他の詳細な記載(32)の通りに移植した。数週間の間の持続的な薬物処理の間の腫瘍増殖を測定するために、DMCまたはロフェコキシブを毎日固形飼料(150 mg/kg のDMC; 40 mg/kg のロフェコキシブ)に混合し、記載(32)の通りに腫瘍増殖をモニタリングし、記録した。インビボでのCHOP発現と細胞死における薬物の短期間の影響を分析し、且つ血漿および腫瘍組織における薬物濃度を決定するために、腫瘍を有する動物を1日当たり30, 90, 150, or 180 mg/kgの薬物を50時間処理した;ステンレススチールのバルヘッド栄養管(a stainless steel ballhead feeding needle (Popper and Sons, Inc., New Hyde Park, NY))で胃内への直接投与を介して12時間毎にそれぞれの薬物の一日用量の半分を各動物に与えた。全ての動物を薬物の最終適用後2時間で屠蓄し、腫瘍および血液を分析のために回収した。全ての実験において、動物は体重、飼料消費および毒性の臨床サインを厳密にモニターした;薬物処理なしのコントロール動物と薬物処理動物の間に差は検出されなかった。
血液は、ヌードマウスの心臓穿刺によりヘパリン処理シリンジに採取した。血液は30分間室温で放置し、続いて2,000rpmで5分間4℃で遠心した。血漿を細胞から分離し、新しい試験管に移した。標準参照を確立するために、25μLの1.0 μg/mL DMCまたはセレコキシブを未処理コントロール動物からの50μL血漿に対して添加した。試験サンプルについては、同量のDMCを、セレコキシブで処理した動物からの血漿に対して内部標準として添加し、他方で同量のセレコキシブを内部標準としてDMCで処理した動物からの血漿に対して添加した。徹底的なボルテックスの後、血漿蛋白質を425μLのアセトニトリルを使用して沈殿し、1分間ボルテックスした。全体の混合物を4,500rpmで5分間遠心し、蛋白沈殿物を分離し、400μLの上清を新しい試験管に移した。サンプルを空気の定常流を用いて蒸発し、乾燥させた残渣を、80:20 (v/v)のメタノール:10 mmol/L 酢酸アンモニウム (pH 4.5)からなる150μLの移動相を用いて再構成した。何れの未溶解の沈殿物を除去するために、サンプルを再度4,500rpmで5分間遠心し、上清を新しい試験管に移した。10ミリリットルの各サンプルを2つ組で液体クロマトグラフィ質量分析により分析した。
DMCはセレコキシブの近い構造類似体であり、COX-2の阻害能を欠く。この化合物がESR誘導をできるか否かを試験するために、我々は種々の細胞株をDMCで、同時にセレコキシブで処理し、CHOP蛋白質の発現レベルを測定した。CHOPはESRのプロアポトーシス要素であり、ERストレス後の細胞死の開始に極めて関係する;そのため、我々はそれを良好に確立されたESRの指標として、実験系において使用した。図3に示す通り、DMCおよびセレコキシブ共にグリオブラストーマ、乳癌、膵臓癌、バーキットリンパ腫、および多発性骨髄腫株において強力にCHOPを誘導できた。このように、両薬物はESRを刺激するようであり、それに対してセレコキシブは若干グリオブラストーマおよびバーキットリンパ腫細胞株においてDMCよりも弱い能力であるように見えた。
[材料および方法]
[材料]
ボルテゾミブは、3.5mlの生理食塩水に懸濁される3.5mgのヴェルケードとして薬局から入手した(Millennium Pharmaceuticals)。セレコキシブは、カプセルとして薬局から入手し、または、以前に記述された方法(24)に従って研究室にて合成した。DMCは、セレコキシブと構造的に近いアナログであり、5-アリール成分が、4-メチルフェニルを2,5-ジメチルフェニルに置換することで変更されている;この化合物は、以前に記述された方法(19)に従って研究室で合成した。セレコキシブおよびDMCを、100mmol/LとなるようにDMSOに溶解し(ストック溶液)、終濃度が0.1%未満となるように細胞培養液に添加した。合成した新鮮なセレコキシブのCOX-2阻害活性、およびDMCにおけるその欠如は、精製されたCOX-2タンパク質の使用により(例えば、参考文献42参照)、インビトロで確認された。
全ての細胞は、10%ウシ胎児血清、100ユニット/Lのペニシリンおよび0.1mg/mLのストレプトマイシンが添加されたDMEM(Cellgro)にて、37℃および5%CO2大気の加湿したインキュベーター中で増殖させた。4つのヒトグリオブラストーマ細胞株(LN229、U251、T98GおよびU87MG)および1つの多発性ミエローマ細胞株(RPMI/8226)を使用した。T98G、U87MGおよびRPMI/8226細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した。LN229およびU251は、Frank B. Furnari (Ludwig Institute of Cancer Research, La Jolla, CA)から入手した。これらの細胞における、COX-2発現レベルおよびプロスタグランジン生産に対する薬剤の効果は、以前の文献に記述されている。
3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイは、以前に詳述されるとおりに(19)、1ウェル当たり3.0x103から8.0x103細胞を使用した96-ウェルプレートにて行った。
細胞は、96-ウェルプレート上で、1,000細胞/mL(100μL/ウェル)で4重に播種した。翌日、それらを薬剤で24時間処理し、市販のELISAキット(Roche Diagnostics)を説明書に従って使用して、ヒストン複合型DNA断片の存在を分析した。当該キットは、ネクローシスではなくアポトーシスを特異的に定量化する様式で使用した。
全細胞ライセートを作製し、以前に記述されるとおりに(19)、ウェスタンブロット分析によって分析した。腫瘍組織におけるタンパク質発現の免疫組織化学的分析を、以前に記述されるとおりに(32)、ベクタステインアビジン-ビオチン複合体法キット(Vector Laboratories)を使用して行った。一次抗体は、Cell Signaling TechnologyまたはSanta Cruz Biotechnology, Inc.から購入し、説明書に従って使用した。全ての免疫ブロットおよび染色は、少なくとも1回繰り返し、結果を確認した。
腫瘍切片におけるアポトーシスを、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素媒介dUTPニック末端標識(TUNEL)アッセイを使用して、定量的に測定した。この方法のための全ての構成成分は、ApopTagインサイチューアポトーシス検出キット(Chemicon)のものであり、これを説明書に従って使用した。それぞれの腫瘍切片についてのTUNEL陽性細胞のパーセンテージを、10枚のランダムな顕微鏡写真(200倍で取得)にて決定した。
種々の低分子干渉RNA(siRNA)を、南カリフォルニア大学/Norris Comprehensive Cancer Centerのthe microchemical core laboratoryで合成した;それらの配列は、参考文献32に記述されている。これらのsiRNAの細胞への形質移入およびコロニー形成アッセイによる細胞生存の分析は、以前に記述されている(32)。
4から6週齢のオスの無胸腺症nu/nuマウスをHarlanから入手し、5x105のU87グリオブラストーマ細胞を皮下注射で移植した。腫瘍が~300mm3まで発達したら、動物に薬剤治療を施した。ヴェルケードを、単一用量で、尾静脈注射で投与した。DMCは、ステンレススチール製ボールヘッドフィーディング針(Popper and Sons, Inc.)を使用して、1日に2回(12時間ごとに一日量の半分)、胃に直接投与した。全50時間後、動物を犠牲にし、分析のために腫瘍を採取した。全ての実験において、体重、食糧消費および毒性の臨床的徴候に関して、動物を厳密にモニターした;非薬剤処理コントロール動物と薬剤処理動物との間で、差は検出されなかった。
グリオブラストーマ多形、不良な予後を示す癌の治療困難種を代表する。より効果的な治療が緊急に必要であるため、我々は、我々が選択した薬剤の併用された効果を調査するためのモデルとして、様々なヒトグリオブラストーマ細胞株を選択した。細胞成長の50%の阻害(IC50)をもたらす、それぞれの薬剤の濃度を確立するために、我々は、まず、それぞれの細胞を、ボルテゾミブ、セレコキシブまたは非コキシブセレコキシブアナログDMCの何れかで処理した。ボルテゾミブによる処理の48時間後のIC50の結果は、U251、U87MGおよびT98Gグリオブラストーマ細胞株について~10 nmol/Lであり、LN229グリオブラストーマ細胞株にて5 nmol/Lより僅かに低かった(図12A)。ボルテゾミブは、多発性ミエローマ治療のために開発され、そのような腫瘍細胞株において高度に毒性であるため、我々は、さらに、比較の目的で、代表的多発性ミエローマ細胞株RPMI/8226におけるIC50を決定した。図12Aに示され、また、予想されたように、RPMI/8226細胞は、ボルテゾミブに対して高い感受性を示した;しかしながら、この細胞種は、グリオブラストーマ細胞株よりも感受性は高くなかった。この発見から、グリオブラストーマ細胞は、ボルテゾミブに対して感受性が高かったことが示され、このことは、潜在的なグリオブラストーマ療法としてこの薬剤を研究することの我々の理論的根拠を支持する。
[材料および方法]
腫瘍関連脳内皮細胞(Tumor-associated Brain Endothelial Cells (TuBEC))をTMZ(300uM)と20uMのDMCで48時間処理した。薬物を回収し、細胞を更なる12日間に亘りインキュベートし、そのときの細胞障害性をトリパンブルー排除技術を使用して評価した。結果は、1群当たりの生存細胞の数として示す。
グリオーマの治療の標準であるテモゾロミド(TMZ)は腫瘍細胞に対して非常に有効である。しかしながら、この薬物は、腫瘍関連脳内皮細胞(TuBEC)における細胞障害性が殆ど引き起こされない。図18に概説される我々は実験は、ER悪化剤DMCがTMZに対して感受性のある腫瘍血管内皮細胞の感受性を増加することを示している。このようにDMCは、公知の治療薬に対してこれらの細胞を化学受容性化することにより抗血管形成剤として機能する。
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[1] アポトーシスを引き起こす細胞の小胞体(ER)におけるストレスを誘導または悪化する方法であって、COX-2活性を阻害することなく選択的に前記細胞におけるSERCA活性を阻害すること;および前記細胞におけるCHOPの発現を上昇することを含み、ここにおいて、SERCA活性の阻害とCHOP発現の上昇の組み合わせが当該細胞におけるアポトーシスの阻害に適好な条件を結果として生じる方法。
[2][1]に記載の方法であって、SERCAの選択的阻害の工程が、直接的または間接的に、アポトーシスを引き起こすために有意に正常レベルを上回って細胞質カルシウム濃度を上昇するために十分な持続時間に亘って、SERCAの選択的阻害が可能なERストレス悪化剤の薬学的に有効な量を投与することにより成し遂げられる方法。
[3][2]に記載の方法であって、前記ERストレス悪化剤がCOX-2を阻害しない1である方法。
[4][2]に記載の方法であって、前記ERストレス悪化剤がヒスタミン放出を引き起こさない方法。
[5][3]に記載の方法であって、前記ERストレス悪化剤が一般式;
R 1 は、メチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキルまたはカルボキシアルキル;
R 2 は、水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキルまたはカルボキシアルキル;
R 3 -R 7 は、水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、アロキシ、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキル、またはカルボキシアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より独立して選択され;
R 8 -R 11 は水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、複素環式、アリールまたは ヘテロアリールからなる群より独立して選択され;および
R 12 は、水素、アセチル、アシル、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アミノアシル、アミノアルキル、シクロアルキル、複素環式、アリールまたはヘテロアリールである;を有する化合物を含む方法。
[6][5]の方法であって、R 1 がトリフルオロメチルである方法。
[7][5]の方法であって、R 2 、R 8 -R 12 が水素である方法。
[8][5]の方法であって、R 4 、R 5 およびR 7 が水素である方法。
[9][5]の方法であって、R 1 がトリフルオロメチル、R 2 、R 4 、R 5 、R 7 − R 12 が水素である方法。
[10][5]の方法であって、R 3 およびR 6 が水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、アルキル、アリール、ヘテロアリール、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキルまたはカルボキシアルキルからなる群より選択される方法。
[11][2]の方法であって、前記ERストレス悪化剤が4-[5-(2,5-ジメチルフェニル)-3-(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル]ベンゼンスルホアミド、4-[5-(2,5-ジ(トリフルオロメチル)フェニル)-3-(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル]ベンゼンスルホンアミドおよび4-[5-(2,5-ジブロモフェニル)-3-(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル]ベンゼンスルホンアミドまたはその類似体である方法。
[12][2]の方法であって、前記ERストレス悪化剤がSERCA阻害剤に代謝されるプロドラッグを含む方法。
[13][1]の方法であって、更に、ERにおける誤った折り畳まれたまたは障害された蛋白質の濃度を増加することが可能な第二のERストレス悪化剤を適用する工程を含む方法。
[14][13]の方法であって、前記ERストレス悪化剤がプロテアソーム阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤を含む方法。
[15][14]の方法であって、前記プロテアソーム阻害剤がボルテゾミブまたはその類似体である方法。
[16][14]の方法であって、前記プロテアーゼ阻害剤が、ニルフィナヴィル、アタザナビル、ホサムプレナビル、インジナビルまたはその類似体から選択されるHIVプロテアーゼ阻害剤である方法。
[17][1]の方法であって、更に、アポトーシスエンハンサーの適用する工程を含む方法。
[18][17]の方法であって、前記アポトーシスエンハンサーが、CHOPの発現を上方制御し、GRP78の保護機能に打ち勝ち、カスパーゼを活性化することが可能な1である方法。
[19][17]の方法であって、前記アポトーシスエンハンサーがGRP78のsiRNAまたはGRP78機能の阻害剤である方法。
[20]細胞においてアポトーシスを引き起こすために細胞におけるERストレスを誘導または悪化するために有用な化合物をスクリーニング、選択または設計するための方法であって、試験化合物についての情報を得ること;前記情報は、SERCA阻害活性、COX-2阻害活性およびヒスタミン放出活性を含む;および前記化合物がSERCAの阻害剤であり、COX-2の阻害剤でない場合に、前記試験化合物を潜在的なERストレス悪化剤と同定すること;を含む方法。
[21][20]の方法であって、前記得ることの工程が生化学的アッセイ、細胞に基づくアッセイまたはオンラインデータベース検索を含む方法。
[22][20]の方法であって、更に、複数の試験化合物について得ることおよび同定することを含む方法。
[23][22]の方法であって、前記得ること、同定することおよび繰り返すことの工程がハイスループットスクリーニング形式である方法。
[24][22]の方法であって、前記複数の試験化合物が化学的ライブラリーから得られる方法。
[25][22]の方法であって、更に、定量的構造活性相関(QSAR)分析を、潜在的なERストレス悪化剤として同定された選択された化合物の組について行うこと;当該QSAR分析の結果を使用して1または1以上の新規の試験化合物を設計すること;および当該新規化合物について得ることおよび同定することを適用すること;を含む方法。
[26]細胞いおいてアポトーシスを引き起こす細胞におけるERストレスを誘導または悪化するために有用な薬学的組成物であって、ERストレス悪化剤;および薬学的に許容される担体を含む組成物。
[27][26]の薬学的組成物であって、前記ERストレス悪化剤が、[5]に従う化合物から選択される1である組成物。
[28][26]の薬学的組成物であって、前記ERストレス悪化剤がSERCA阻害剤に代謝され得るプロドラッグである組成物。
[29][26]の薬学的組成物であって、前記ERストレス悪化剤がERにおいて誤って折り畳まれたまたは障害された蛋白質の濃度を増加できる組成物。
[30][29]の薬学的組成物であって、前記第二のERストレスがプロテアソーム阻害またはプロテアソーム阻害である組成物。
[31][5]に従う第一のERストレス悪化剤と、ERにおいて誤って折り畳まれたまたは障害された蛋白質の濃度を上昇できる第二のERストレス悪化剤とを含む組成物。
[32]細胞においてアポトーシスを引き起こす選択された病的な細胞においてERストレスを誘導または悪化することにより患者における病的な状態を治療する方法であって、[26]に従う薬学的組成物の薬学的な有効量を投与すること;を含む方法。
[33][32]の方法であって、前記病的な細胞が当該投与することの工程に先駆けてERストレスの状態にある方法。
[34][22]の方法であって、[18]に従うアポトーシスエンハンサーの薬学的な有効量を投与することを更に含む方法。
[35][32]の方法であって、ERにおける誤って折り畳まれたまたは障害された蛋白質の濃度を増加できる異なるERストレス悪化剤を含む第二の薬学的組成物の薬学的な有効量を投与することを更に含む方法。
[36][35]の方法であって、前記異なるERストレス悪化剤がプロテアソーム阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤である方法。
[37][32]の方法であって、前記病的状態がアポトーシス非調節により引き起こされる方法。
[38][7]の方法であって、前記状態が癌である方法。
[39][38]の方法であって、前記癌が多形性グリオブラストーマである方法。
[40][38]の方法であって、前記癌が、乳癌、膵臓癌、バーケットリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、前立腺癌、直腸癌、再発性癌、転移性乳癌、化学療法耐性腫瘍および薬物耐性癌から選択される方法。
[41]正常細胞における通常のレベルよりも高いGRP78のレベルにより立証されるように細胞が低ERストレスの状態にある場合、アポトーシスを引き起こす細胞の小胞体(ER)においてストレスを悪化する方法であって、前記細胞におけるSERCA活性を阻害し、結果としてCHOP発現が上昇される化合物を提供することを含み、前記SERCA活性の阻害とCHOP発現の上昇との組み合わせが結果として前記細胞のアポトーシスの開始のために適好な条件になる方法。
[42][41]の方法であって、前記化合物がCOX-2阻害剤またはヒスタミン放出剤ではない方法。
[43][41]の方法であって、前記化合物が[5]に従って選択される方法。
Claims (43)
- アポトーシスを引き起こす細胞の小胞体(ER)におけるストレスを誘導または悪化する方法であって、COX-2活性を阻害することなく選択的に前記細胞におけるSERCA活性を阻害すること;および前記細胞におけるCHOPの発現を上昇することを含み、ここにおいて、SERCA活性の阻害とCHOP発現の上昇の組み合わせが当該細胞におけるアポトーシスの阻害に適好な条件を結果として生じる方法。
- 請求項1に記載の方法であって、SERCAの選択的阻害の工程が、直接的または間接的に、アポトーシスを引き起こすために有意に正常レベルを上回って細胞質カルシウム濃度を上昇するために十分な持続時間に亘って、SERCAの選択的阻害が可能なERストレス悪化剤の薬学的に有効な量を投与することにより成し遂げられる方法。
- 請求項2に記載の方法であって、前記ERストレス悪化剤がCOX-2を阻害しない1である方法。
- 請求項2に記載の方法であって、前記ERストレス悪化剤がヒスタミン放出を引き起こさない方法。
- 請求項3に記載の方法であって、前記ERストレス悪化剤が一般式;
R1は、メチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキルまたはカルボキシアルキル;
R2は、水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキルまたはカルボキシアルキル;
R3-R7 は、水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、アロキシ、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキル、またはカルボキシアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より独立して選択され;
R8-R11 は水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、複素環式、アリールまたは ヘテロアリールからなる群より独立して選択され;および
R12 は、水素、アセチル、アシル、アルキル、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル、アミノアシル、アミノアルキル、シクロアルキル、複素環式、アリールまたはヘテロアリールである;を有する化合物を含む方法。 - 請求項5の方法であって、R1がトリフルオロメチルである方法。
- 請求項5の方法であって、R2、R8-R12が水素である方法。
- 請求項5の方法であって、R4、R5およびR7が水素である方法。
- 請求項5の方法であって、R1がトリフルオロメチル、R2、R4、R5、R7− R12が水素である方法。
- 請求項5の方法であって、R3およびR6 が水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、アルキル、アリール、ヘテロアリール、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキル、ポリフルオロアルキル、ヒドロキシアルキルまたはカルボキシアルキルからなる群より選択される方法。
- 請求項2の方法であって、前記ERストレス悪化剤が4-[5-(2,5-ジメチルフェニル)-3-(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル]ベンゼンスルホアミド、4-[5-(2,5-ジ(トリフルオロメチル)フェニル)-3-(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル]ベンゼンスルホンアミドおよび4-[5-(2,5-ジブロモフェニル)-3-(トリフルオロメチル)-1H-ピラゾール-1-イル]ベンゼンスルホンアミドまたはその類似体である方法。
- 請求項2の方法であって、前記ERストレス悪化剤がSERCA阻害剤に代謝されるプロドラッグを含む方法。
- 請求項1の方法であって、更に、ERにおける誤った折り畳まれたまたは障害された蛋白質の濃度を増加することが可能な第二のERストレス悪化剤を適用する工程を含む方法。
- 請求項13の方法であって、前記ERストレス悪化剤がプロテアソーム阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤を含む方法。
- 請求項14の方法であって、前記プロテアソーム阻害剤がボルテゾミブまたはその類似体である方法。
- 請求項14の方法であって、前記プロテアーゼ阻害剤が、ニルフィナヴィル、アタザナビル、ホサムプレナビル、インジナビルまたはその類似体から選択されるHIVプロテアーゼ阻害剤である方法。
- 請求項1の方法であって、更に、アポトーシスエンハンサーの適用する工程を含む方法。
- 請求項17の方法であって、前記アポトーシスエンハンサーが、CHOPの発現を上方制御し、GRP78の保護機能に打ち勝ち、カスパーゼを活性化することが可能な1である方法。
- 請求項17の方法であって、前記アポトーシスエンハンサーがGRP78のsiRNAまたはGRP78機能の阻害剤である方法。
- 細胞においてアポトーシスを引き起こすために細胞におけるERストレスを誘導または悪化するために有用な化合物をスクリーニング、選択または設計するための方法であって、試験化合物についての情報を得ること;前記情報は、SERCA阻害活性、COX-2阻害活性およびヒスタミン放出活性を含む;および前記化合物がSERCAの阻害剤であり、COX-2の阻害剤でない場合に、前記試験化合物を潜在的なERストレス悪化剤と同定すること;を含む方法。
- 請求項20の方法であって、前記得ることの工程が生化学的アッセイ、細胞に基づくアッセイまたはオンラインデータベース検索を含む方法。
- 請求項20の方法であって、更に、複数の試験化合物について得ることおよび同定することを含む方法。
- 請求項22の方法であって、前記得ること、同定することおよび繰り返すことの工程がハイスループットスクリーニング形式である方法。
- 請求項22の方法であって、前記複数の試験化合物が化学的ライブラリーから得られる方法。
- 請求項22の方法であって、更に、定量的構造活性相関(QSAR)分析を、潜在的なERストレス悪化剤として同定された選択された化合物の組について行うこと;当該QSAR分析の結果を使用して1または1以上の新規の試験化合物を設計すること;および当該新規化合物について得ることおよび同定することを適用すること;を含む方法。
- 細胞いおいてアポトーシスを引き起こす細胞におけるERストレスを誘導または悪化するために有用な薬学的組成物であって、ERストレス悪化剤;および薬学的に許容される担体を含む組成物。
- 請求項26の薬学的組成物であって、前記ERストレス悪化剤が、請求項5に従う化合物から選択される1である組成物。
- 請求項26の薬学的組成物であって、前記ERストレス悪化剤がSERCA阻害剤に代謝され得るプロドラッグである組成物。
- 請求項26の薬学的組成物であって、前記ERストレス悪化剤がERにおいて誤って折り畳まれたまたは障害された蛋白質の濃度を増加できる組成物。
- 請求項29の薬学的組成物であって、前記第二のERストレスがプロテアソーム阻害またはプロテアソーム阻害である組成物。
- 請求項5に従う第一のERストレス悪化剤と、ERにおいて誤って折り畳まれたまたは障害された蛋白質の濃度を上昇できる第二のERストレス悪化剤とを含む組成物。
- 細胞においてアポトーシスを引き起こす選択された病的な細胞においてERストレスを誘導または悪化することにより患者における病的な状態を治療する方法であって、請求項26に従う薬学的組成物の薬学的な有効量を投与すること;を含む方法。
- 請求項32の方法であって、前記病的な細胞が当該投与することの工程に先駆けてERストレスの状態にある方法。
- 請求項22の方法であって、請求項18に従うアポトーシスエンハンサーの薬学的な有効量を投与することを更に含む方法。
- 請求項32の方法であって、ERにおける誤って折り畳まれたまたは障害された蛋白質の濃度を増加できる異なるERストレス悪化剤を含む第二の薬学的組成物の薬学的な有効量を投与することを更に含む方法。
- 請求項35の方法であって、前記異なるERストレス悪化剤がプロテアソーム阻害剤またはプロテアーゼ阻害剤である方法。
- 請求項32の方法であって、前記病的状態がアポトーシス非調節により引き起こされる方法。
- 請求項7の方法であって、前記状態が癌である方法。
- 請求項38の方法であって、前記癌が多形性グリオブラストーマである方法。
- 請求項38の方法であって、前記癌が、乳癌、膵臓癌、バーケットリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、前立腺癌、直腸癌、再発性癌、転移性乳癌、化学療法耐性腫瘍および薬物耐性癌から選択される方法。
- 正常細胞における通常のレベルよりも高いGRP78のレベルにより立証されるように細胞が低ERストレスの状態にある場合、アポトーシスを引き起こす細胞の小胞体(ER)においてストレスを悪化する方法であって、前記細胞におけるSERCA活性を阻害し、結果としてCHOP発現が上昇される化合物を提供することを含み、前記SERCA活性の阻害とCHOP発現の上昇との組み合わせが結果として前記細胞のアポトーシスの開始のために適好な条件になる方法。
- 請求項41の方法であって、前記化合物がCOX-2阻害剤またはヒスタミン放出剤ではない方法。
- 請求項41の方法であって、前記化合物が請求項5に従って選択される方法。
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