JP2005512547A5 - - Google Patents
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Description
従って、本発明は、デフィブロチドのサンプルの特異的生物学的活性を決定するための方法に関し、該方法は、下記工程：
ａ）デフィブロチド、プラスミンおよび、プラスミンとの反応によって測定可能な生成物を提供するところの、該プラスミンに特異的な基質を接触させる工程、および
ｂ）生成した生成物の量を経時的に測定する工程
を含む。
ａ）デフィブロチド、プラスミンおよび、プラスミンとの反応によって測定可能な生成物を提供するところの、該プラスミンに特異的な基質を接触させる工程、および
ｂ）生成した生成物の量を経時的に測定する工程
を含む。
本発明の決定法は、他の酵素的方法と同様に、媒体のｐＨに対して感受性である。事実、酵素系が不活性化されるであろうところの極端なｐＨでは一般に適用され得ない。また、測定が行われている間の任意の時に媒体のｐＨが変動を受けないことが好ましく、従って、溶液は一般に、プラスミン測定試験において一般に使用されるものから選択される緩衝剤系によって処理される。適する緩衝剤系は、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ＴＲＩＳ）緩衝液であり得る。操作は好ましくは、ＴＲＩＳの存在下で行われる。本発明方法では、媒体のｐＨを約７〜８の範囲、より好ましくは約７．４で維持することが通常好ましい。さらに、緩衝剤系の濃度を１０〜２００ｍＭの範囲、好ましくは約５０ｍＭで維持することが好ましい。
Claims (22)
- 下記工程：
ａ）デフィブロチド、プラスミンおよび、プラスミンとの反応によって測定可能な生成物を提供するところの、該プラスミンに特異的な基質を接触させる工程、および
ｂ）生成した生成物の量を経時的に測定する工程
を含む、デフィブロチドの生物学的活性を決定する方法。 - プラスミンが哺乳類プラスミンである、請求項１記載の方法。
- プラスミンがヒトプラスミンである、請求項２記載の方法。
- プラスミンに特異的な基質が下記式の化合物：
Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｘ
［式中、Ａ1およびＡ2は非極性アミノ酸であり、Ａ3はリシンまたはアルギニンであり、Ｘは測定可能な生成物である。］である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 - 測定可能な生成物Ｘがパラ−ニトロアニリンおよび２−ナフチルアミンから選択される、請求項４記載の方法。
- プラスミンのための基質がＨ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシン−ｐ−ニトロアニリンである、請求項４記載の方法。
- プラスミンが０．００６４〜０．０５０Ｉ．Ｕ．／ｍｌの濃度を有し、プラスミンのための基質が２．５〜３．５ｍＭの濃度を有する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
- プラスミンの濃度が０．０１２５Ｉ．Ｕ．／ｍｌであり、プラスミンのための基質の濃度が３ｍＭである、請求項７記載の方法。
- 測定可能な生成物Ｘが分光測光法によって測定される、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
- 反応媒体が、７〜８のｐＨに緩衝された水性溶液である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
- 反応媒体が、ｐＨ７．４に緩衝された水性溶液である、請求項１０記載の方法。
- 系の温度が３５〜３９℃で維持される、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
- 系の温度が３７℃で維持される、請求項１２記載の方法。
- プラスミンのための基質の濃度が０．３〜４ｍＭである、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
- プラスミンのための基質の濃度が２．５〜３．５ｍＭである、請求項１４記載の方法。
- プラスミンのための基質の濃度が３ｍＭである、請求項１５記載の方法。
- 下記段階：
ａ）標品および試験用の両方のデフィブロチドのサンプルの各々に関して、酵素反応の間の測定可能な生成物Ｘの放出速度を決定する段階、
ｂ）上記放出速度を、対応するデフィブロチド濃度と、数学的におよび／またはグラフを用いて相関させる段階、および
ｃ）デフィブロチドの試験サンプルの生物学的活性を得る段階
を含む、請求項１〜１６のいずれか１項記載のデフィブロチドの生物学的活性を決定する方法。 - ａ）測定された量の、プラスミンのための基質、および
ｂ）測定された量のプラスミン
を少なくとも含み、プラスミンに特異的な基質をプラスミン１単位当たり２０〜３０ｍｇ含む、請求項１〜１７のいずれか１項記載のデフィブロチドの生物学的活性を決定する方法のためのキット。 - プラスミンのための基質がＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡであり、プラスミンがヒトプラスミンである、請求項１８に記載のキット。
- プラスミンに特異的な基質をプラスミン１単位当たり２５ｍｇ含む、請求項１８または１９記載のキット。
- 請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法に付されるとき、０．５、２．０および８．０μｇ／ｍｌの濃度で夫々図３、４および５に示されるパラニトロアニリンの放出動力学を示すことを特徴とするデフィブロチド、ここで、上記放出動力学は下記実験条件下で決定される。
ヒトプラスミン濃度：０．０１２５ Ｉ．Ｕ．／ｍｌ；
基質：Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシン−ｐ−ニトロアニリン；
基質濃度：３ｍＭ；
緩衝剤：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、ｐＨ７．４；
反応温度：３７℃；
分光測光波長：４０５ｎｍ - 下記実験条件：
ヒトプラスミン濃度：０．０１２５ Ｉ．Ｕ．／ｍｌ；
基質：Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リシン−ｐ−ニトロアニリン；
基質濃度：３ｍＭ；
緩衝剤：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、ｐＨ７．４；
反応温度：３７℃；
分光測光波長：４０５ｎｍ
の下で請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法に付されるとき、下記式に従う、パラニトロアニリン（ｐＮＡ）の放出動力学を生じることを特徴とするデフィブロチド。
ｐＮＡ（μＭ／分）＝ａ＋ｂｌｏｇＸ
ここで、
ａ＝０．６９０８±０．０２９１
ｂ＝０．３１４０±０．０４３７
Ｘ＝デフィブロチドの濃度（μｇ／ｍｌ）
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