JP2005257536A - 親和性物質測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】測定対象である親和性物質と、この親和性物質との結合親和性を有する結合パートナーとの結合反応が、凝集反応によって測定される。結合パートナーは担体粒子に結合されており、結合反応によって担体粒子が凝集する。本発明は、電場を印加する前に反応液をインキュベートすることによって、凝集反応を増強する。また本発明は、電界中に置かれた反応液の温度や粘度の調整によって、凝集反応を増強する。本発明は、測定感度の向上に貢献する。
【選択図】なし
Description
本発明は、親和性物質と結合パートナーとの結合によって担体粒子を凝集させる方法において、両者の結合を促進することができる方法の提供を課題とする。あるいは本発明の課題は、両者の結合の阻害要因の影響を抑制するための方法を提供することである。
〔1〕次の工程を含む、親和性物質の測定方法。
(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液をインキュベートする工程、
(2)工程(1)の反応液に、電圧パルスを印加する工程、
(3)工程(2)の後に、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなかった担体粒子のいずれかまたは両方を計数する工程、および
(4)工程(3)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程
〔2〕工程(1)が、前記反応液を37〜90℃でインキュベートする工程である〔1〕に記載の方法。
〔3〕工程(1)が、前記反応液を40〜90℃でインキュベートする工程である〔2〕に記載の方法。
〔4〕前記反応液中に水溶性高分子が含有されていることを特徴とする〔1〕に記載の方法。
〔5〕工程(2)における反応液の粘度を0.8〜3mPasに調整する〔1〕に記載の方法。
〔6〕工程(2)を0〜20℃で行うことを特徴とする〔1〕に記載の親和性物質の測定方法。
〔7〕工程(2)を0〜10℃で行うことを特徴とする〔6〕に記載の親和性物質の測定方法。
〔8〕凝集塊および凝集塊を形成しなかった担体粒子のいずれか、または両方を、その三次元情報を指標として計数する〔1〕に記載の方法。
〔9〕親和性物質と結合パートナーの結合が、抗原抗体反応による結合である〔1〕に記載の方法。
〔10〕親和性物質が抗原であり、結合パートナーが抗体またはその抗原結合領域を含む断片である〔9〕に記載の方法。
〔11〕親和性物質が抗体またはその抗原結合領域を含む断片であり、結合パートナーが抗原またはその抗原決定基を含む断片である〔9〕に記載の方法。
〔12〕電圧パルスが交流電圧パルスである〔1〕に記載の方法。
〔13〕次の工程を含む、親和性物質の測定方法。
(1’)少なくとも測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを含む反応液を、凝集試薬成分と混合する前または後にインキュベートする工程であって、前記担体粒子は凝集試薬によって凝集し、かつ測定対象親和性物質によってその凝集は阻害される工程
(2’)凝集試薬成分の存在下で工程(1’)の反応液に、電圧パルスを印加する工程、
(3’)工程(2’)の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれかまたは両方を計数する工程、および
(4)工程(3’)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程
〔14〕工程(1’)において、前記反応液をインキュベート後、工程(2’)の前に凝集試薬を混合する〔13〕に記載の方法。
〔15〕凝集試薬を混合後に、工程(2’)の前に更にインキュベートする工程を含む〔13〕に記載の方法。
〔16〕工程(1’)において、前記反応液を凝集試薬の存在下でインキュベートした後、工程(2’)を実施する〔13〕に記載の方法。
〔17〕特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する手段を含む、担体粒子を凝集させるための装置において、反応液の温度を37℃〜90℃に加熱するための手段を有することを特徴とする装置。
〔18〕特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する工程を含む、担体粒子を凝集させるための方法において、電圧を印加している間の反応液の温度を0℃〜20℃とすることを特徴とする方法。
〔19〕結合パートナーと特定の物質との結合が、抗原抗体反応である〔18〕に記載の方法。
〔20〕電圧パルスが交流電圧パルスである〔18〕に記載の方法。
〔21〕反応液に水溶性高分子を添加する〔18〕に記載の方法。
〔22〕反応液の粘度を0.8〜3mPasに調整する〔18〕に記載の方法。
〔23〕前記担体粒子と特定の物質とを、電圧パルスを印加する前に37℃〜90℃でインキュベートする工程を含む〔18〕に記載の方法。
〔24〕特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する手段を含む、担体粒子を凝集させるための装置において、電圧を印加している間の反応液の温度を0℃〜20℃にするための手段を有することを特徴とする装置。
〔25〕 以下の要素を含む、測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定すべき親和性物質との結合を、前記担体粒子の親和性物質または凝集試薬による凝集を指標として測定するための測定装置。
a:反応液を保持するための空間、
b:反応液の温度を37℃〜90℃でインキュベートするための手段、
c:反応液に電圧パルスを印加するための手段、
d:パルス電圧の印加時における反応液の温度を0℃〜20℃とするための手段、および
e:反応液に含まれる担体粒子と担体粒子の凝集塊のいずれか、または両方を計数するための手段
(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液をインキュベートする工程、
(2)工程(1)の反応液に、電圧パルスを印加する工程、
(3)工程(2)の後に、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなかった担体粒子のいずれかまたは両方を計数する工程、および
(4)工程(3)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程
本発明においては、より長いインキュベート時間をも含まれることは言うまでもない。しかし、反応時間の短縮が望まれる場合には、5秒以上の短い時間を採用することによって、反応時間を犠牲にすることなく目的とする反応促進効果を期待することができる。また、たとえば80℃を越える高温条件においては、インキュベート時間を5−180秒とすることで、蛋白質の変性を避けることができる。
一次反応:担体粒子上の結合パートナーが親和性物質を捕捉する反応。このとき、必ずしも親和性物質を介した担体粒子間の架橋構造は形成されなくても良い。
二次反応:複数の担体粒子上の結合パートナーが親和性物質に結合する反応。その結果、親和性物質を介した担体粒子間の架橋構造(すなわち凝集塊)が形成される。
二次反応は電圧パルスの印加によって促進される。しかし一次反応を促進するための具体的な条件は明らかにされていなかった。したがって本発明は、一次反応の促進のための条件を提供したと捉えることもできる。すなわち本発明における電圧パルスの印加前のインキュベート工程は、一次反応の促進のための工程であると言うこともできる。
好ましくは、2試薬系とし、緩衝液などの第一試薬に含有させておき、担体を含む第二試薬と混合して測定に使用する。このとき、第一試薬中には異好性抗体(heterophile antibody)などの非特異物質を吸収する非特異吸収剤やリウマチ因子を吸収するための物質を添加することができる。
(1’)少なくとも測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを含む反応液を、凝集試薬成分と混合する前または後にインキュベートする工程であって、前記担体粒子は凝集試薬によって凝集し、かつ測定対象親和性物質によってその凝集は阻害される工程
(2’)凝集試薬成分の存在下で工程(1’)の反応液に、電圧パルスを印加する工程、
(3’)工程(2’)の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれかまたは両方を計数する工程、および
(4)工程(3’)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程
(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液に、0℃〜20℃の条件下で電圧パルスを印加する工程、
(2)工程(1)の後に、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなかった担体粒子のいずれかまたは両方を計数する工程、および
(3)工程(2)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程
(1’)少なくとも測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質および凝集試薬成分を含む反応液に、0℃〜20℃の条件下で電圧パルスを印加する工程、
(2’)工程(1’)の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれかまたは両方を計数する工程、および
(3)工程(2’)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程
(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液に電圧パルスを印加する工程、
(2)工程(1)の後に、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなかった担体粒子のいずれかまたは両方を計数する工程、および
(3)工程(2)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程
(1’)少なくとも測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質および凝集試薬成分を含む反応液に電圧パルスを印加する工程、
(2’)工程(1’)の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれかまたは両方を計数する工程、および
(3)工程(2’)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程
抗原またはハプテンと抗体との反応(免疫反応)
相補的な塩基配列を有する核酸間のハイブリダイゼーション
レクチンとそのレセプターとの反応
レクチンと糖鎖の反応
リガンドとレセプターの反応
DNAと転写調節因子の反応
腫瘍マーカー:
AFP、CEA、CA19−9、PSA等
凝固線溶糸マーカー:
プロテインC、プロテインS、アンチトロンビン(AT)III、FDP、FDP−D−ダイマー等
感染症マーカー:
CRP、ASO、HBs抗原等
ホルモン:
甲状腺刺激ホルモン(TSH)、プロラクチン、インシュリン等
組織成分:
ミオグロビン、ミオシン、ヘモグロビン等
その他:
DNA等の核酸など
測定対象物質と担体粒子上の結合パートナーとの反応による、担体粒子の凝集が検出される。たとえば、抗原分子を結合パートナーである抗体によって測定する場合が、この原理に含まれる。あるいは逆に、抗原を結合した担体粒子の凝集を指標として、親和性物質である抗体を測定する場合も、この原理に含まれる。直接凝集反応においては、通常、凝集のレベルと測定対象物質である親和性物質の量は正比例する。
ハプテンと呼ばれる低分子抗原は、担体粒子の凝集に必要な抗原を介した架橋構造を作りにくい。そのため、直接凝集反応の原理ではハプテンを検出することができない。そこで、複数分子のハプテンまたはそのエピトープを含む断片を担体に結合したポリハプテンと、担体粒子上の抗体との結合による凝集反応が利用される。ポリハプテンは、複数の抗体分子を架橋することができるので、担体粒子を凝集させる。しかしハプテンが存在すると、ポリハプテンと抗体との反応が阻止され、担体粒子の凝集が阻止される。凝集阻止のレベルは、ハプテンの存在と正比例する。言い換えれば、測定対象物質の量と、凝集反応のレベルは逆比例する。
ホルモン:
エストロゲン、エストラジオール
薬剤:
テオフィリン
あるいは本発明においては、担体粒子を、三次元情報を指標として計数することもできる。本発明において、三次元情報を指標とする計数とは、粒子および/または凝集塊の三次元情報を測定し、その結果に基づいて粒子および/または凝集塊を計数することを言う。三次元情報に基づく担体粒子の計数は、本発明における計数方法として好ましい。
アパーチャーサイズは、解析対象となる粒子に合わせて適宜調節することができる。一般的な免疫学的な粒子凝集反反応に用いられる担体粒子の凝集を検出する場合、アパーチャーサイズとしては、通常30〜1000μm、好ましくは50〜200μmを示すことができる。
あるいは前記標準曲線を回帰式として表すこともできる。回帰式が得られれば、凝集率を回帰式に代入することによって、測定対象親和性物質の濃度を算出することもできる。
遠心沈降法:液中における粒子の沈降速度と粒径の関係を示すストークスの式により粒径分布を測定する方法。(光透過式遠心沈降法では、ストークスの法則を適用し、同じ比重の粒子ならば大粒のものの方が小粒のものよりも早く沈降することを利用する。その時の粒子濃度を光透過による濁度変化として解析し、粒度分布を求めることができる。)
抗体が感作された粒子は、抗原の濃度に応じて、2個以上の粒子からなる凝集塊の割合が多くなる。そして2個以上に凝集した粒子数/総粒子数で表される凝集率は、1.00(100%)に収束する。
a:反応液を保持するための空間、
b:反応液の温度を37℃〜90℃でインキュベートするための手段、
c:反応液に電圧パルスを印加するための手段、
d:パルス電圧の印加時における反応液の温度を0℃〜20℃とするための手段、および
e:反応液に含まれる担体粒子と担体粒子の凝集塊のいずれか、または両方を計数するための手段
更に、異なる方向の電圧パルスを印加するために、電極を駆動する機構を備えることができる。たとえば、反応液の中で電極を回転させることにより、複数の異なる方向から電圧パルスを印加することができる。
本発明の装置には、上記測定方法を実施するための付加的な機構を組み合わせることができる。本発明の装置に組み合わせることができる付加的な機構を、以下に例示する。
試料の分取機構
試料の希釈機構
測定結果の記録機構
測定結果の表示機構
測定結果の印刷機構
以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
(1)AFP抗体感作ラテックス試薬の調製
0.1mgの抗αフェトプロテイン(AFP)抗体(ダコ社製)を1mLのグリシン緩衝液(50mMグリシン、50mM塩化ナトリウム、0.09%アジ化ナトリウム含有、以下GBSと略す)に溶解し、2.0μmのラテックス(積水化学工業製、固形分1%懸濁液)1mLを加えて37℃で2時間攪拌した後、感作したラテックスを遠心分離して上清を除去した。沈殿を0.5%牛血清アルブミンのグリシン緩衝液(0.5%BSA-GBS)1mLに懸濁させ、抗AFP抗体感作ラテックス試薬を調製した。
図1(A)の装置を使用して、親和性物質(AFP)を抗原抗体反応によって測定した。
図1の装置は、検体と試薬1(緩衝液)を分注して混合し、更に試薬2(ラテックス試薬)を分注して混合し、反応液とするための分注・攪拌槽1及び温度コントロール機構2を備える。ただし実際には、1試薬系の場合には試薬1(緩衝液)の分注は省略できる。次に反応槽3(パルス印加槽)に反応液を移動させ、電極4を介して反応液に電圧パルスを数秒から数十秒間印加される。電場に置かれた担体粒子は、パールチェイン化される。電圧パルスを印加された反応液は、希釈槽5で希釈され、粒度分布計6を用いて担体の凝集状態が測定される。図1(B)は、パルス印加槽の断面を示す図である。電極間の距離は0.8mm、電極の厚さは0.03mm、電極の長さは20mmである。
0.5%BSA-GBSを用いて、AFP抗原液を希釈して濃度0、0.0075及び0.015ng/mLの検体液を調製した。これらの検体3μLと前述した抗AFP抗体感作ラテックス試薬3μLを試験管にとり、混和し20秒間45℃〜80℃でインキュベーションした後、直ちに電極付き反応セルに注入した。(2)の装置を用いて、周波数200KHzの交流電圧(矩形波)±12V/mmの電解強度で30秒間、電圧パルスを印加した。30秒間の印加後、直ちに電場を切り、反応液を生理食塩水に希釈してコールター・マルチサイザーを使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率(Agglutination Ratio;AR;%)を、以下の式により求めた。
AR=(2個以上に凝集した粒子数)/(総粒子数)×100 (%)
本発明の条件:電圧パルスを印加する前の反応液を高温下(45℃、62℃、80℃)で20秒間インキュベート
従来法の条件:電圧パルスを印加する前の反応液は室温(25℃)で調整し、高温処理なし
この結果により、本発明によって、従来法よりも更に高感度に測定できることがわかる。また、パルス電圧を印加しない一般的なラテックス凝集法において、37℃20分間のインキュベートでは、0.015pg/mLの低濃度域の反応は認められなかった。
実施例1の各検体と抗AFP感作ラテックス試薬3μLずつを試験管にとり、25℃で20秒間インキュベーションした後、電極付き反応セル注入して、実施例1と同様に高周波電圧を印加した。25℃のインキュベーション以外の操作は実施例1の操作に従った。結果を図2に示した。
実施例1の各検体と抗AFP感作ラテックス試薬3μLずつを試験管にとり、37℃で20分間インキュベーションした。この反応液0.5μLを20mLの生理食塩水20mLに希釈して、実施例1のようにコールター・マルチサイザーを使用してラテックス粒子の粒度分布を測定して、同様に凝集率を算出した。結果を図2に示した。図2から、本発明は従来法(パルス電圧を印加する前の温度処理なし)に比べ高感度に測定することができることがわかる。
(1)AFP抗体感作ラテックス試薬の調製
実施例1と同様にして、抗AFP抗体感作ラテックス試薬を調製した。
(2)測定装置
図1の装置を使用して、親和性物質(抗原抗体反応)を測定した。
(3)測定方法
0.5%BSA-GBSを用いて、AFP抗原液を希釈して濃度0、0.0075及び0.015ng/mLの検体液を調製した。これらの検体3μLと前述した抗AFP抗体感作ラテックス試薬3μL試験管にとり、混和し62℃で0から180秒間インキュベーションした後、直ちに電極付き反応セル注入して、前述の装置を用いて、周波数200KHzの交流電圧(矩形波)±12V/mmの電解強度で30秒間印加しパールチェインを形成させた。この30秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液を生理食塩水に希釈してコールター・マルチサイザーを使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率(Agglutination Ratio;AR;%)を、以下の式により求めた。
結果を図3に示した。図3に示すように、本発明の条件においては、従来法に比べて凝集率が高くなった。
本発明の条件:電圧パルスを印加する前の反応液を高温下(62℃)で5〜180秒間(5sec、20sec、180sec) インキュベート
従来法の条件:電圧パルスを印加する前に高温処理なし(0sec)
すなわち本発明によって、従来法よりも更に高感度に測定できることがわかる。
(1)PSA抗体感作ラテックス試薬(試薬2)の調製
0.1mgの抗PSA抗体(ダコ社製)を1mLのグリシン緩衝液(50mMグリシン、50mM塩化ナトリウム、0.09%アジ化ナトリウム含有、以下GBSと略す)に溶解し、2.0μmのラテックス(積水化学工業製、固形分1%懸濁液)1mLを加えて37℃で2時間攪拌した後、感作したラテックスを遠心分離して上清を除去した。沈殿を0.5%牛血清アルブミンのグリシン緩衝液(0.5%BSA-GBS)1mLに懸濁させ、抗PSA抗体感作ラテックス試薬を調製した。
0.5%牛血清アルブミンの50mM−Tris塩酸緩衝液(50mM Tris、50mM塩化ナトリウム、0.09%アジ化ナトリウム含有、pH8.4)にポリエチレングリコール(分子量20000、以下PEG20000と略す)を0.1〜1.0%含有する反応促進試薬を調製した。対照法としてPEG20000を0濃度の試薬を調製した。
図1の装置を使用して、親和性物質(抗原抗体反応)を測定した。(温度コントロール機構2は室温設定とした。)
0.5%BSA-GBSを用いて、PSA抗原液を希釈して濃度0、及び9.5ng/mLの検体液を調整した。これらの検体1μLとPEG20000を0〜1.0%含有する0.5%BSA-Tris塩酸緩衝液3μLを混和した後、前述した抗PSA抗体感作ラテックス試薬3μL試験管にとり、混和後、直ちに電極付き反応セル注入た。前述の装置を用いて、周波数200KHzの交流電圧(矩形波)±12V/mmの電解強度で電圧パルスを30秒間印加した。30秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液を生理食塩水に希釈してコールター・マルチサイザーを使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率(Agglutination Ratio;AR;%)を、以下の式により求めた。
AR=(2個以上に凝集した粒子数)/(総粒子数)×100 (%)
(5)結果
結果を図4に示した。図4から、本発明は対照法に比べ更に高感度に測定できることがわかる。
(1)抗AFP抗体感作ラテックス試薬の調製
実施例1と同様にして、抗AFP抗体感作ラテックス試薬を調製した。
(2)測定装置
図5(A)の装置を使用して、AFPを抗原抗体反応により測定した。
図5(A)の装置は、検体と試薬1(緩衝液)を分注して混合し、更に試薬2(ラテックス試薬)を分注して混合し、反応液とするための分注・攪拌槽及び温度コントロール機構を備える。ただし実際には、1試薬系の場合には緩衝液の分注を省略できる。次に反応槽2(パルス印加槽)に反応液を移動させ、電極3を介して電圧パルスを数秒から数十秒間印加する。このとき反応槽は温度コントロールユニットにより4℃に冷却される。電圧パルスを印加された反応液は、希釈槽5で希釈され、粒度分布計6を用いて担体の凝集状態が測定される。図5(B)は、パルス印加槽の断面を示す図である。電極間の距離は0.8mm、電極の厚さは0.03mm、電極の長さは20mmである。
0.5%BSA-GBSを用いて、AFP抗原液を希釈して濃度0及び0.0075ng/mLの検体液を調製した。これらの検体3μLと前述した抗AFP抗体感作ラテックス試薬3μL試験管にとり、混和し直ちに電極付き反応セルに注入した。前述の装置を用いて、周波数200KHzの交流電圧(矩形波)±12V/mmの電解強度で反応液に電圧パルスを30秒間印加した。このとき、反応セルの温度は4℃に維持した。30秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液を生理食塩水に希釈してコールター・マルチサイザーを使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率(Agglutination Ratio;AR;%)を、以下の式により求めた。
AR=(2個以上に凝集した粒子数)/(総粒子数)×100 (%)
前述の操作を同様に5回繰り返して測定を行い、測定結果の平均値および平均値±2.6SDを求め、図6に示した。
実施例4の各検体と抗AFP感作ラテックス試薬を用いて、反応セルの温度を22℃とするほかは全て実施例4の操作にしたがった。結果を図7に示した。
実施例4の各検体と抗AFP感作ラテックス試薬3μLずつを試験管にとり、37℃で20分間インキュベーションした。この反応液0.5μLを20mLの生理食塩水20mLに希釈して、実施例4のようにコールター・マルチサイザーを使用してラテックス粒子の粒度分布を測定して、同様に凝集率を算出した。また、実施例4と同様に5回繰り返し測定を行い、その結果を図8に示した。
測定値A:抗原量0ng/mLと0.0075ng/mLを繰り返し測定したとき、「0ng/mLを測定した凝集率の平均値+2.6SD
測定値B:0.0075ng/mLを測定した凝集率の平均値−2.6SD
図6、図7、および図8から各条件における検出限界を比較すると、本発明の方法(図6)の検出限界は0.0075ng/mLといえる。一方、従来法(図7および図9)においては、この濃度は検出できない。このことから、電圧パルスを印加中の反応液を低温に維持する本発明は、従来法に比べ非常に短時間で更に高感度に測定できることがわかる。
(1) 抗PSA抗体感作ラテックス試薬(試薬2)の調製
実施例3と同様にして、抗PSA抗体感作ラテックス試薬を調製した。
(2)Tris塩酸緩衝液(試薬1)の調製
Tris塩酸緩衝液(50mM Tris、50mM塩化ナトリウム、0.09%アジ化ナトリウム、0.25%PEG20000を含有、pH8.4)に牛血清アルブミン(以下、BSAと略す)を0.5%、2.5%、5%、7.5%及び10%含有する試薬1をそれぞれ調製した。
(3)測定装置
図1の装置を使用して、親和性物質(抗原抗体反応)を測定した。温度コントロール機構2は室温設定とした。
0.5%BSA-GBSを用いて、PSA抗原液を希釈して濃度0、9.5及び32ng/mLの検体液を調製した。これらの検体1μLと0.5%又は、2.5%又は、5%又は、7.5%又は、10%のBSAを含むTris緩衝液3μLを混和した後、前述した抗PSA抗体感作ラテックス試薬3μLを加え、混和後、直ちに電極付き反応セル注入した。前述の装置を用いて、周波数200KHzの交流電圧(矩形波)±12V/mmの電解強度で電圧パルスを30秒間印加した。30秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液を生理食塩水に希釈してコールター・マルチサイザーを使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率(Agglutination Ratio;AR;%)を、以下の式により求めた。
なお、最終反応液中のBSA濃度は、0.5%、1.4%、2.4%、3.5%、4.6%である。ここで最終反応液中のBSA濃度0.5%は対照法として比較した。
(5)反応液の温度測定
前述の測定方法により、パールチェインを形成させたときの反応液の温度変化を測定した。
(6)最終反応液の粘度測定
前述の最終反応液(BSA濃度0.5%〜4.6%)、BSA濃度0.3%及び6.8%の反応液の4〜52℃での粘度を、振動式粘度計(ビスコメイト)を使用して測定した。
-------------------------------------------
最終反応液中のBSA濃度 印加前 遮断直前
0.5% 24℃ 37℃
1.4% 24℃ 38℃
2.4% 25℃ 37℃
3.5% 25℃ 38℃
4.6% 24℃ 37℃
-------------------------------------------
結果を図9および図10、ならびに表1に示した。
図9に示すように、最終反応液中のBSA濃度0.5%から3%に増加させるにつれて各濃度の凝集率が大きくなった。PSA 0ng/mL(ブランク)においても凝集率が上昇する傾向であったためブランク補正した凝集率を比較した。その結果、最終反応液中のBSA濃度を0.5%から3%に増加させることによって、顕著に凝集率が上昇することが確認された。すなわち本発明により、更に高感度化できることがわかる。
1:分注+攪拌手段 2:温度コントロール機構
3:反応槽 4:電極(パルス印加手段)
5:希釈手段 6:粒度分布測定手段
1:分注+攪拌手段 2:反応槽
3:電極(パルス印加手段) 4:温度コントロール機構
5:希釈手段 6:粒度分布測定手段
Claims (25)
- 次の工程を含む、親和性物質の測定方法。
(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液をインキュベートする工程、
(2)工程(1)の反応液に、電圧パルスを印加する工程、
(3)工程(2)の後に、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなかった担体粒子のいずれかまたは両方を計数する工程、および
(4)工程(3)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程 - 工程(1)が、前記反応液を37〜90℃でインキュベートする工程である請求項1に記載の方法。
- 工程(1)が、前記反応液を40〜90℃でインキュベートする工程である請求項2に記載の方法。
- 前記反応液中に水溶性高分子が含有されていることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 工程(2)における反応液の粘度を0.8〜3mPasに調整する請求項1に記載の方法。
- 工程(2)を0〜20℃で行うことを特徴とする請求項1に記載の親和性物質の測定方法。
- 工程(2)を0〜10℃で行うことを特徴とする請求項6に記載の親和性物質の測定方法。
- 凝集塊および凝集塊を形成しなかった担体粒子のいずれか、または両方を、その三次元情報を指標として計数する請求項1に記載の方法。
- 親和性物質と結合パートナーの結合が、抗原抗体反応による結合である請求項1に記載の方法。
- 親和性物質が抗原であり、結合パートナーが抗体またはその抗原結合領域を含む断片である請求項9に記載の方法。
- 親和性物質が抗体またはその抗原結合領域を含む断片であり、結合パートナーが抗原またはその抗原決定基を含む断片である請求項9に記載の方法。
- 電圧パルスが交流電圧パルスである請求項1に記載の方法。
- 次の工程を含む、親和性物質の測定方法。
(1’)少なくとも測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを含む反応液を、凝集試薬成分と混合する前または後にインキュベートする工程であって、前記担体粒子は凝集試薬によって凝集し、かつ測定対象親和性物質によってその凝集は阻害される工程
(2’)凝集試薬成分の存在下で工程(1’)の反応液に、電圧パルスを印加する工程、
(3’)工程(2’)の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれかまたは両方を計数する工程、および
(4)工程(3’)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのいずれか、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定する工程 - 工程(1’)において、前記反応液をインキュベート後、工程(2’)の前に凝集試薬を混合する請求項13に記載の方法。
- 凝集試薬を混合後に、工程(2’)の前に更にインキュベートする工程を含む請求項13に記載の方法。
- 工程(1’)において、前記反応液を凝集試薬の存在下でインキュベートした後、工程(2’)を実施する請求項13に記載の方法。
- 特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する手段を含む、担体粒子を凝集させるための装置において、反応液の温度を37℃〜90℃に加熱するための手段を有することを特徴とする装置。
- 特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する工程を含む、担体粒子を凝集させるための方法において、電圧を印加している間の反応液の温度を0℃〜20℃とすることを特徴とする方法。
- 結合パートナーと特定の物質との結合が、抗原抗体反応である請求項18に記載の方法。
- 電圧パルスが交流電圧パルスである請求項18に記載の方法。
- 反応液に水溶性高分子を添加する請求項18に記載の方法。
- 反応液の粘度を0.8〜3mPasに調整する請求項18に記載の方法。
- 前記担体粒子と特定の物質とを、電圧パルスを印加する前に37℃〜90℃でインキュベートする工程を含む請求項18に記載の方法。
- 特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する手段を含む、担体粒子を凝集させるための装置において、電圧を印加している間の反応液の温度を0℃〜20℃にするための手段を有することを特徴とする装置。
- 以下の要素を含む、測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定すべき親和性物質との結合を、前記担体粒子の親和性物質または凝集試薬による凝集を指標として測定するための測定装置。
a:反応液を保持するための空間、
b:反応液の温度を37℃〜90℃でインキュベートするための手段、
c:反応液に電圧パルスを印加するための手段、
d:パルス電圧の印加時における反応液の温度を0℃〜20℃とするための手段、および
e:反応液に含まれる担体粒子と担体粒子の凝集塊のいずれか、または両方を計数するための手段
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