WO2017033296A1 - 免疫学的測定装置及び免疫学的測定方法 - Google Patents

免疫学的測定装置及び免疫学的測定方法 Download PDF

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aggregation rate
reactive
electrode
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Inventor
樹 高倉
小原　賢信
Original Assignee
株式会社日立製作所
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to an immunological measurement apparatus and an immunological measurement method.
  • Patent Document 1 JP-A-2005-257536 (Patent Document 1) as background art in this technical field.
  • Patent Document 1 As an immunological measurement method for quantifying a detection target substance using a reagent that causes a specific antigen-antibody reaction with a detection target substance contained in a specimen, latex that measures aggregation of fine particles due to an antigen-antibody reaction An agglomeration method is described.
  • the binding reaction between the affinity substance to be measured and the binding partner having the binding affinity with the affinity substance is measured by an agglutination reaction.
  • the binding partner binds to the carrier particle.
  • the present invention enhances the agglutination reaction by incubating the reaction solution before applying an electric field, and the reaction solution is placed in an electric field.
  • the agglomeration reaction is enhanced by adjusting the temperature and viscosity of the liquid crystal.
  • the present invention contributes to the improvement of measurement sensitivity.” (See summary)
  • the reaction liquid containing the aggregate is separated and diluted after a certain time from the start of the latex agglutination reaction, and the aggregation rate is calculated by measuring after almost stopping the reaction. Yes.
  • Such a dilution operation is performed because the particle concentration suitable for the latex agglutination reaction is larger than the particle concentration suitable for a general resistance pulse measuring apparatus.
  • the aggregation rate may vary from measurement to measurement. Therefore, in order to improve the measurement accuracy, it is necessary to measure the aggregation rate for the same reaction solution a plurality of times to eliminate the influence of variation in the aggregation rate.
  • the configuration described in Patent Document 1 involves a dilution operation, it is difficult to continuously measure the aggregation rate of the same reaction solution a plurality of times.
  • the aggregates may be separated by dilution, and the aggregation rate may not be accurately measured.
  • costs such as measurement time and cost for adjusting dilution of the reaction solution are required.
  • the present invention has been made in consideration of the above problems, and an object of the present invention is to provide an immunological measurement apparatus and a measurement method that improve measurement accuracy and reduce cost for measurement.
  • the present application includes a plurality of means for solving the above-mentioned problems.
  • a reactive substance including a reactive particle in which a substance that generates an antigen-antibody reaction with respect to a detection target substance is modified and having conductivity.
  • a measuring vessel having a volume smaller than the volume of the permeated reaction solution and having a pore connecting the first compartment and the second compartment, and a first container provided in the first compartment
  • a pulse signal detection unit for detecting a pulse change in current or electrical resistance measured by the measurement unit and a pulse signal detected by the pulse signal detection unit are aggregated within a predetermined time to calculate the aggregation rate of the reactive particles.
  • an arithmetic processing unit that calculates the amount of the detection target substance in the specimen based on the aggregation rate.
  • the immunological measurement method includes a step of introducing a conductive liquid into the second compartment of the measurement container, and reactive particles in which a substance that generates an antigen-antibody reaction with respect to the detection target substance is modified. Introducing a reaction liquid in which a conductive liquid containing a sample and a specimen are mixed into the first compartment of the measurement container; and the reactive particles and their aggregates into pores connecting the first compartment and the second compartment.
  • FIG. 1 is a schematic view of an embodiment of an immunological measurement apparatus according to the present invention.
  • the immunological measurement apparatus 1 includes a first section 101 into which reactive particles modified with a substance that generates an antigen-antibody reaction with respect to a detection target substance and a sample are introduced, and unaggregated particles by a resistance pulse method. It comprises a measuring vessel 10 having at least one pore for measuring aggregates and aggregates and a second compartment 102 connected to the first compartment by the pore.
  • first electrode 121 and a second electrode 122 are provided inside the first compartment and the second compartment, respectively.
  • first electrode 121 is disposed on the side wall of the first section
  • second electrode 122 is disposed on the side wall of the second section so as to face the first electrode 121.
  • a liquid introduction channel 103 is provided, and a terminal portion of the liquid introduction channel may be opened.
  • the second compartment 102 may be provided with a flow path for introducing and discharging liquid.
  • a conductive reagent and a sample including reactive particles 111 modified with a substance that generates an antigen-antibody reaction with respect to a detection target substance are introduced.
  • a reagent similar to that introduced into the first compartment 101 may be introduced into the second compartment 102.
  • the reactive particle 111 may be, for example, an antibody modified so long as an agglutination reaction is caused by an antigen-antibody reaction.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the reactive particles 111 may include particles in which different antibodies are modified. Further, when an antibody is a detection target, the reactive particles 111 may be those in which an antigen is modified.
  • the reactive particles 111 form an immune aggregate 112 by an antigen-antibody reaction with the detection target substance 110 contained in the specimen.
  • a non-specific aggregate 113 may be included in the reaction solution. That is, the aggregate of reactive particles may include immune aggregate 112 and nonspecific aggregate 113.
  • the reaction liquid refers to a liquid containing a conductive reagent containing the reactive particles 111 and a specimen.
  • the particle size of the reactive particles 111 is desirably small enough to ignore the action of gravity settling within the measurement time and large enough to be measured by the resistance pulse method. That is, the particle diameter of the reactive particles 111 is 10 nm to 10 ⁇ m, preferably 50 nm to 1 ⁇ m.
  • the base material of the reactive particles 111 In order to suppress the influence of sedimentation, it is desirable to use a material close to the specific gravity of the reaction solution, such as polystyrene, as the base material of the reactive particles 111. Moreover, it is desirable that the particle size of the reactive particles 111 be as uniform as possible.
  • the pore 100 functions as a region for detecting reactive particles and aggregates thereof by the resistance pulse method.
  • the volume of the pores 100 is smaller than the volume 114 of the reaction liquid per reactive particle, and is preferably 1/10 or less thereof. As a result, the probability that a large number of reactive particles 111 and aggregates thereof simultaneously pass through the pores 100 can be reduced, and detection of a single particle can be ensured.
  • the diameter of the pore 100 needs to be large enough to allow the reactive particles 111 and aggregates to pass through. As long as these conditions are satisfied, the volume of the pores 100 can be reduced. Since the particle detection signal by the resistance pulse method is given by the ratio of the particle volume to the pore volume, reducing the pore volume facilitates particle detection.
  • the particle size of the reactive particles is about 100 nm to 500 nm
  • the particle concentration in the reaction solution is about 10 10 to 10 12 particles / mL.
  • the pore volume is preferably about 10 ⁇ 13 to 10 ⁇ 11 mL. This volume corresponds to the volume occupied by a cube having sides of about 0.46 ⁇ m to 2.2 ⁇ m. The pore length and measurement sensitivity will be described later.
  • the pores having the above minute volume can be produced by applying a lithography technique to a semiconductor or resin thin film.
  • a fine pore having a minute volume can be produced by irradiating the thin film with a focused ion beam or an electron beam.
  • a glass tube can be processed into a pipette shape to produce a pore having a minute volume.
  • the first electrode 121 and the second electrode 122 are arranged so as to face each other, and are provided so as to be in electrical contact with the liquid introduced into the first compartment 101 and the second compartment 102, respectively. ing.
  • the first electrode 121 and the second electrode 122 are connected to each other outside the first section 101 and the second section 102 by a conductive wire, and form a closed circuit.
  • the first electrode 121 and the second electrode 122 may be arranged in a ring shape around the pores.
  • the first electrode 121 and the second electrode 122 may be configured by inserting rod-shaped electrodes into the liquid introduction channel.
  • a voltage source 123 is provided on the circuit connecting the electrodes, and a voltage is applied between the first electrode and the second electrode.
  • the voltage source 123 is preferably a variable voltage source.
  • An ammeter 124 is connected to the circuit, and the current flowing through the circuit can be measured. An equivalent measurement can also be performed by connecting a resistance meter instead of the ammeter 124 and measuring a change in electrical resistance across the pore 100.
  • the reactive particles 111 When a voltage is applied to the voltage source 123, an electric field is induced in the vicinity of the pore 100, and an ionic current flowing through the pore 100 is generated.
  • the reactive particles 111 When the reactive particles 111 have a finite zeta potential, they are driven by electrophoresis and pass through the pores 100.
  • electrophoresis is the main driving force, the applied voltage has a polarity that causes the reactive particles 111 to be driven from the first section 101 to the second section 102.
  • the voltage of the second electrode 122 is made higher than the voltage of the first electrode 121, and conversely, when the reactive particles have a positive zeta potential, The voltage of the first electrode 121 is set higher than the voltage of the second electrode 122.
  • the driving force of the particles may be a pressure flow, not just electrophoresis.
  • a configuration in the case of using a pressure flow is shown in FIG. In FIG. 12, the pressure control unit 130 is connected to the second compartment 102, and a difference is given to the pressure inside each of the first compartment 101 and the second compartment 102.
  • the polarity of the voltage between the electrodes may be positive or negative.
  • the pressure control unit 130 for example, a liquid feed pump or a pneumatic syringe can be used. By using such a pressure control unit 130 to generate a pressure flow from the first compartment to the second compartment to drive the particles, more particles than when particles are driven only by electrophoresis Can be driven stably.
  • the same operation can be performed. Further, when the particle driving force due to pressure flow is larger than the particle driving force due to electrophoresis, the particle driving force due to electrophoresis may be opposite to the particle driving force due to pressure flow.
  • the pressure control can also be performed by making the first compartment and the second compartment an open system and giving a difference in the liquid level.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of the current value measured by the ammeter 124 in the embodiment shown in FIG.
  • a pulsed current change ⁇ I is observed in the current value.
  • the reactive particles 111 are formed of a non-conductive material, when these particles are present inside the pores 100, the electrical resistance inside the pores increases and is observed as a decrease in current value.
  • Pulse current variation caused by the passage of the reactive particles 111 and aggregates thereof is desirably converted normalized by the background current I 0 to the resistance pulse signal intensities [Delta] I / I 0. As a result, the influence of the modulation of the background current I 0 can be eliminated.
  • Resistance pulse signal intensity shows a positive correlation with the volume of particles that have passed through the pore 100. That is, the resistance pulse signal intensity derived from the immune aggregate 112 and the non-specific aggregate 113 is larger than that of the non-aggregated reactive particles 111.
  • a pulse signal detector 125 is connected to the ammeter 124, and a resistance pulse signal can be detected from the output of the ammeter 124.
  • the measurement operation by the ammeter 124 and the pulse signal detector 125 is performed over a preset time ⁇ t.
  • An arithmetic processing unit 126 is connected to the pulse signal detection unit 125, and the pulse signals detected by the pulse signal detection unit 125 are aggregated within a predetermined time to calculate the aggregation rate of the reactive particles.
  • the amount of the detection target substance in the sample can be calculated based on the above. Note that it is assumed that the arithmetic processing unit 126 can execute all arithmetic processing described later.
  • FIG. 11 is a graph showing the relationship between the pores and the resistance pulse signal intensity.
  • FIG. 11A is a schematic diagram showing the relationship among the pore length L, the pore diameter D, and the particle size d of the reactive particles.
  • the length characterizing the shape of the particle is the particle size d in the case of a monomer, and 2d, which is twice the particle size in the case of a dimer.
  • the length L of the pore is smaller than the characteristic length of the particle, the particle cannot be completely included in the electric field region induced in the vicinity of the pore. Therefore, not all of the particle volume can contribute to the resistance pulse signal, and the resistance pulse signal strength is reduced.
  • the resistance pulse signal intensity is calculated as the volume of the particle and the volume of the pore. Determined by the ratio of Therefore, the resistance pulse signal intensity decreases as the pore length L increases.
  • the signal intensity ratio S 2 / S 1 gradually approaches 2 which is the theoretical limit. Therefore, the overlap of the resistance pulse signal intensity distribution of the unaggregated reactive particles and the aggregates is reduced, and the accuracy of immunoassay can be improved.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing an example of a histogram recorded by detecting the resistance pulse signal intensity corresponding to the passage of particles from the current value measured by the ammeter 124 in the apparatus shown in FIG.
  • S k represents the signal intensity of an aggregate composed of k reactive particles.
  • the number of particles belonging to each signal intensity distribution can be counted.
  • the aggregation rate is calculated according to (Equation 1), where N k is the count number of aggregates composed of k reactive particles.
  • the aggregation rate is calculated according to (Equation 2).
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of the dependence of the aggregation rate A on the detection target substance concentration obtained with the reaction time constant in the measurement results shown in FIG. The aggregation rate calculated by the above operation correlates with the concentration of the detection target substance contained in the reaction solution and the reaction time.
  • a calibration curve indicated by a solid line can be obtained by measuring in advance standard samples containing substances to be detected having various known concentrations. By measuring a sample containing a detection target substance having an unknown concentration under the same reaction conditions, and comparing the obtained aggregation rate with a calibration curve, the concentration c of the detection target substance in the sample can be quantified.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram showing an example of a flow of a measurement process using the immunological measurement apparatus described above.
  • the immunological measurement process according to the present invention includes a step S1 for introducing a conductive liquid into the second compartment 102 of the measurement container 10 and a substance that generates an antigen-antibody reaction against the detection target substance.
  • Step S2 for introducing a reaction liquid obtained by mixing the conductive liquid containing the reactive particles 111 modified with the sample and the sample into the first section 101 of the measurement container 10, and a first step provided in the first section 101.
  • a voltage is applied to the first electrode 121 and the second electrode 122 provided in the second compartment 102 by using a power source 123, and the particles pass through the pores 101 from the first compartment 101 to the second compartment 102. Measurement was performed within a certain time, measuring step S3 for measuring particles that pass through pores 100 by measuring changes in current flowing through pores 100 or changes in electrical resistance across pores. Calculate particle agglomeration rate That includes a calculation step S4, the quantitative step S5 for quantifying the target substance in the specimen, the.
  • the calculation step S4 is performed after the measurement step S3 is performed has been described.
  • the aggregation rate is calculated in real time from the resistance pulse signal measured by the measurement unit 124 and the pulse signal detection unit 125. Then, the measurement step S3 and the calculation step S4 may be performed simultaneously.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing an example of a result of measuring the time change of the aggregation rate accompanying the aggregation reaction of the reactive particles using the immunological measurement apparatus of Example 1.
  • the time change of the aggregation rate can be measured.
  • the aggregation rate can be continuously measured many times, and the accuracy of immunoassay can be improved.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing an example of the result of fitting the change in aggregation rate with time in the function shown in FIG.
  • the time change A (t) of the aggregation rate can be fitted by, for example, a function represented by (Equation 3).
  • a (t) ⁇ c (1-e ⁇ kBt ) / (B ⁇ c (1-e ⁇ kBt )) + A 0
  • the analysis result of the sample including the detection target substance having an unknown concentration is analyzed by fitting, whereby the detection target substance concentration c in the sample is obtained as the fitting parameter.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram showing an example of the flow of the immunological measurement process shown in FIG.
  • FIG. 8 is a modification of the embodiment shown in FIG.
  • the measurement process and the calculation process at time ⁇ t are repeated as one set, but the measurement operation is performed over the total measurement time T, and the obtained measurement data is divided for each time ⁇ t, and each divided data The same result can be obtained even if the calculation operation of the aggregation rate is performed on.
  • FIG. 9 is a schematic diagram illustrating an example of a result of measuring a temporal change in the aggregation rate accompanying the aggregation reaction of the reactive particles.
  • the total measurement time T is shorter than the time constant of the aggregation reaction characterized by 1 / kB, which corresponds to the case where the initial process of the aggregation reaction is measured.
  • the time change A (t) of the aggregation rate is approximated by a function expressed by, for example, (Equation 4).
  • Equation 4 the initial process of the agglutination reaction can be fitted with a linear function of time, and the slope a is proportional to the concentration of the detection target substance.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing an example of the dependence of the inclination a obtained as a result of fitting on the detection target substance concentration in the example shown in FIG.
  • FIG. 16 shows a histogram of resistance pulse signal intensities of reactive particles and aggregates thereof due to antigen-antibody reaction.
  • the pore diameter D, the pore length L, and the reactive particle diameter d of the immunological measuring apparatus are 840 nm, 825 nm, and 290 nm, respectively, and the pore length L is twice the reactive particle d. It ’s bigger.
  • the volume of the pores is 4.6 ⁇ 10 ⁇ 16 L.
  • the initial concentration of the reactive particles in the reaction liquid is 6.1 ⁇ 10 ⁇ 11 mol / L, and the volume of the reaction liquid per reactive particle is 2.7 ⁇ 10 ⁇ 14 L. Accordingly, the volume of the pores is about 1/60 of the volume of the reaction liquid per reactive particle.
  • the driving force of the reactive particles is mainly due to the pressure flow, and a pressure flow is generated by raising the liquid level of the reaction liquid in the second section by 5 mm with respect to the liquid level of the reaction liquid in the first section. It was.
  • the signal intensity distribution due to the non-aggregates and the signal intensity distribution due to the aggregates were identified, and an aggregation rate of 0.11 was obtained by setting a threshold value.
  • FIG. 17 shows the results of measuring the change in aggregation rate with time under the initial concentration conditions of two types of reactive particles.
  • the initial concentration of reactive particles was 6.1 ⁇ 10 ⁇ 11 mol / L and 6.1 ⁇ 10 ⁇ 12 mol / L, respectively.
  • the aggregation rate increased with the passage of time, and was saturated near a certain aggregation rate.
  • the curve in FIG. 17 shows the result of fitting by the function shown in (Expression 3).
  • the concentration of the detection target substance in the reaction solution is 1.1 ⁇ 10 ⁇ 11 mol under any particle concentration condition. / L.
  • FIG. 14 is an explanatory diagram showing an example of the flow of the immunological measurement process of the present embodiment.
  • FIG. 14 shows the flow shown in FIG. 8 in which a measurement step and a calculation step are performed on the reagent itself containing reactive particles before the reaction liquid measurement step.
  • the step of introducing the conductive liquid into the second compartment 102 is first performed, but the first compartment 101 is reactive.
  • the step of introducing the reagent containing particles and the reaction liquid mixed with the reagent and the sample may be performed first, and the order of these two steps is not important.
  • the step S11 of introducing a conductive liquid into the second compartment 102 of the measurement container 10 is performed, and the substance that generates an antigen-antibody reaction is modified with respect to the detection target substance.
  • Step S12 of introducing the conductive liquid containing the reactive particles 111 into the first compartment 101 of the measurement container 10 is performed, and the first electrode 121 and the second electrode provided inside the first compartment 101 are implemented.
  • a voltage is applied to the second electrode 122 provided in the section 102 using the power source 123 to drive the particles from the first section 101 to the second section 102 so that the particles pass through the pores 101.
  • a non-specific aggregate 113 measured within a certain period of time is measured, and a measurement step S13 for measuring particles passing through the pore 100 by measuring a change in current flowing through the pore 100 or a change in electrical resistance across the pore 100 is performed.
  • Aggregation rate of The calculation step S14 to be calculated is performed, the step S15 for introducing the sample into the first section 101 of the measurement container 10 is performed, and the measurement step S16 for performing the same measurement as the measurement step described above after the sample introduction is performed.
  • the calculation step S17 for calculating the aggregation rate of the aggregate including the non-specific aggregate 113 and the immune aggregate 112 measured within a certain time is performed, and the measurement step 16 and the calculation step 17 are performed a predetermined number of times.
  • Step S18 is performed, and based on the obtained time-series data of the aggregation rate, a quantification step S19 is performed in which the amount of the detection target substance in the sample is quantified by fitting.
  • the reagent and the sample can be mixed inside the first partition 101 by injecting the sample into the reagent containing the reactive particles introduced into the first partition 101 in advance.
  • the measurement can be performed in the same manner as the measurement of the reaction liquid mixed in advance.
  • the mixing of the reagent and the sample can be performed by convection when the sample is injected, but may be mechanically performed using a stirrer or the like.
  • FIG. 13 is a schematic diagram showing an example of the result of measuring the non-specific aggregation of reactive particles and the change in aggregation rate with the aggregation reaction with the flow shown in FIG.
  • the measurement operation and the calculation operation of the aggregation rate are performed at a certain time ⁇ T with respect to the reagent introduced into the first section 101 in advance. . By performing this step, it is possible to calculate a non-specific aggregation rate that does not depend on the antigen-antibody reaction for each measurement.
  • Factors that cause non-specific aggregation vary from sample to sample, but only specific aggregation reactions can be obtained by calculating the non-specific aggregation rate for each sample and subtracting it from the total aggregation rate. Can be accurately measured, and the amount of the detection target substance in the sample can be accurately quantified.
  • FIG. 15 is a schematic view of an embodiment of an immunological measurement apparatus according to the present invention.
  • a temperature control unit 132 is provided for the pore 100, the first section 101, and the second section 102.
  • the temperature adjustment unit 132 may be provided so that at least the temperature inside the first section 101 can be controlled.
  • the reaction rate constant k described in the above-mentioned examples depends on the temperature, and generally increases as the temperature increases.
  • the reactivity is improved by heating the reaction solution introduced into the first compartment 101, and the sensitivity when quantifying the detection target substance is improved by obtaining a larger aggregation rate. Can do. Further, by keeping the temperature during measurement constant, a change in the reaction rate constant k during measurement can be suppressed, and the accuracy in quantifying the detection target substance can be improved.
  • this invention is not limited to the above-mentioned Example, Various modifications are included.
  • the above-described embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described.
  • a part of the configuration of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment, and the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.

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Abstract

検出対象物質に対して抗原抗体反応を発生する物質が修飾された反応性粒子を含み導電性を有する反応性粒子溶液と検体とが導入される第１の区画と、導電性を有する液体が導入される第２の区画と、前記反応性粒子溶液と前記検体を含む反応液に含まれる反応性粒子１個当たりの反応液の体積よりも小さな体積を有する、前記第１の区画と前記第２の区画を接続する細孔とを有する測定容器と、前記第１の区画の内部に設けられた第１の電極と、前記第２の区画の内部に設けられた第２の電極と、前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する電圧源と、前記第１の電極と前記第２の電極との間に流れる電流又は電気抵抗を測定する測定部と、前記測定部で測定された電流又は電気抵抗のパルス変化を検出するパルス信号検出部と、前記パルス信号検出部によって検出されたパルス信号を所定時間内で集計して前記反応性粒子の凝集率を算出し、前記凝集率に基づき前記検体中の検出対象物質量を算出する演算処理部を有することを特徴とする免疫学的測定装置。

Description

免疫学的測定装置及び免疫学的測定方法
　本発明は、免疫学的測定装置及び免疫学的測定方法に関する。
　本技術分野の背景技術として、特開２００５－２５７５３６公報（特許文献１）がある。この公報には、検体中に含まれる検出対象物質と特異的な抗原抗体反応を生じる試薬を用いて検出対象物質を定量する免疫学的測定法として、抗原抗体反応による微粒子の凝集を測定するラテックス凝集法が記載されている。
　そして、当該公報には、「測定対象である親和性物質と、この親和性物質との結合親和性を有する結合パートナーとの結合反応が、凝集反応によって測定される。結合パートナーは担体粒子に結合されており、結合反応によって担体粒子が凝集する。本発明は、電場を印加する前に反応液をインキュベートすることによって、凝集反応を増強する。また本発明は、電界中に置かれた反応液の温度や粘度の調整によって、凝集反応を増強する。本発明は、測定感度の向上に貢献する。」と記載されている。（要約参照）
特開２００５－２５７５３６公報
　特許文献１に記載の構成では、ラテックス凝集反応開始から一定時間後に凝集体を含む反応液を分取して希釈し、反応をほぼ停止させてから測定することで凝集率を算出するようにしている。このような希釈操作を行うのは、ラテックス凝集反応に好適な粒子濃度が、一般的な抵抗パルス測定装置に好適な粒子濃度と比較して大きいためである。
　凝集体をカウントすることにより凝集率を算出する免疫学的定量法においては、カウント数が有限であるために測定ごとに凝集率のばらつきが生じうる。したがって、測定精度を向上させるためには、同一の反応液に対して凝集率を複数回測定し、凝集率のばらつきの影響を排除する必要がある。しかしながら、特許文献１に記載の構成では希釈操作を伴うため、同一の反応液の凝集率を連続的に複数回測定することは困難である。また、希釈によって凝集体が乖離する恐れがあり、凝集率を正確に計測できない可能性がある。さらに、同一検体に対して複数回同様の測定を行う場合には、計測にかかる時間や反応液の希釈調整にかかる費用などのコストがかかるという課題がある。
　本発明は上記課題を考慮し、計測精度を向上し、計測にかかるコストを低減する免疫学的測定装置及び測定方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために、例えば特許請求の範囲に記載の構成を採用する。
　　本願は上記課題を解決する手段を複数含んでいるが、その一例を挙げるならば、検出対象物質に対して抗原抗体反応を発生する物質が修飾された反応性粒子を含み導電性を有する反応性粒子溶液と検体とが導入される第１の区画と、導電性を有する液体が導入される第２の区画と、前記反応性粒子溶液と前記検体を含む反応液に含まれる反応性粒子１個当たりの反応液の体積よりも小さな体積を有する、前記第１の区画と前記第２の区画を接続する細孔とを有する測定容器と、前記第１の区画の内部に設けられた第１の電極と、　前記第２の区画の内部に設けられた第２の電極と、前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する電圧源と、前記第１の電極と前記第２の電極との間に流れる電流又は電気抵抗を測定する測定部と、前記測定部で測定された電流又は電気抵抗のパルス変化を検出するパルス信号検出部と、前記パルス信号検出部によって検出されたパルス信号を所定時間内で集計して前記反応性粒子の凝集率を算出し、前記凝集率に基づき前記検体中の検出対象物質量を算出する演算処理部を有することを特徴とする。
　また、本発明による免疫学的測定方法は、測定容器が有する第２の区画に導電性液体を導入する工程と、検出対象物質に対して抗原抗体反応を発生する物質が修飾された反応性粒子を含む導電性液体と検体を混合した反応液を前記測定容器の第１の区画に導入する工程と、前記第１の区画と前記第２の区画をつなぐ細孔へ前記反応性粒子及びその凝集体を通過させるように操作し、前記第１の区画の内部に設けられた第１の電極と前記第２の区画に設けられた第２の電極を用いて前記細孔を流れる電流の変化あるいは前記細孔をまたぐ電気抵抗の変化を測定して前記細孔を通過する反応性粒子及びその凝集体を計測する計測工程と、所定時間内において計測された前記反応性粒子の凝集率を算出する算出工程と、得られた凝集率に基づき、前記検体中の検出対象物質を定量する定量工程と、を有する。
　本発明によれば、計測精度を向上し、計測にかかるコストを低減する免疫学的測定装置及び測定方法を提供することができる。
免疫学的測定装置の一実施例の模式図である。 電流値の測定結果を示す模式図である。 抵抗パルス信号強度分布を示す模式図である。 凝集率と検出対象物質濃度の関係を示す模式図である。 免疫学的測定プロセスを示す説明図である。 凝集率の時間変化を示す模式図である。 凝集率の時間変化に対する関数フィッティングを示す模式図である。 免疫学的測定プロセスを示す説明図である。 凝集率の時間変化に対する関数フィッティングを示す模式図である。 関数フィッティング結果と検出対象物質濃度の関係を示す模式図である。 免疫学的測定装置の一実施例における計算結果である。 免疫学的測定装置の一実施例の模式図である。 凝集率の時間変化を示す模式図である。 免疫学的測定プロセスを示す説明図である。 免疫学的測定装置の一実施例の模式図である。 抵抗パルス信号強度分布を示す実験結果である。 凝集率の時間変化を示す実験結果である。
　　以下、本発明の実施例について図面を用いて説明する。なお、以下に説明する実施例は一例であり、本発明の要旨を逸脱しない範囲で変形実施することが可能である。また、１つの例示的な態様と共に図示又は記述される特色を、他の態様の特色と組み合わせてもよい。各実施例の図面において既に説明した構成要素については同じ符号を付して対応関係を明確にしている。
　図１は、本発明による免疫学的測定装置の一実施例の模式図である。免疫学的測定装置１は、検出対象物質に対して抗原抗体反応を発生する物質で修飾された反応性粒子と検体とが導入される第１の区画１０１と、抵抗パルス法によって粒子の未凝集体及び凝集体を測定するための少なくとも１つの細孔と、細孔によって第１の区画と接続された第２の区画１０２と、を有する測定容器１０を備える。
　図１に示す測定容器１０は側断面図であり、第１の区画の内部及び第２の区画の内部には、それぞれ第１の電極１２１及び第２の電極１２２が設けられている。本実施例では、第１の電極１２１は第１の区画の側壁に配置され、第２の電極１２２は第１の電極１２１と対向するように第２の区画の側壁に配置されている。
　第１の区画１０１には、液体導入流路１０３が設けられており、その液体導入流路の終端部は開放されていてもよい。なお、図示してはいないが、第２の区画１０２にも液体を導入したり排出したりする流路が設けられていてもよい。
　第１の区画１０１には、検出対象物質に対して抗原抗体反応を発生する物質で修飾された反応性粒子１１１を含む導電性の試薬と検体が導入される。第２の区画１０２には、第１の区画１０１に導入されるのと同様の試薬が導入されてもよい。
　反応性粒子１１１には、例えば、抗体が修飾されており、抗原抗体反応によって凝集反応が生じるものであればよく、抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、反応性粒子１１１は異なる抗体が修飾された粒子が混在していてもよい。また、抗体を検出対象とする場合には、反応性粒子１１１は抗原が修飾されたものであってもよい。
　反応性粒子１１１は、検体中に含まれる検出対象物質１１０との抗原抗体反応によって免疫凝集体１１２を形成する。免疫凝集体１１２以外に、非特異的凝集体１１３が反応液中に含まれることがある。すなわち、反応性粒子の凝集体には、免疫凝集体１１２と非特異的凝集体１１３が含まれることがある。ここで、反応液とは反応性粒子１１１を含む導電性の試薬と検体を含む液体のことを指す。
　反応性粒子１１１の粒径は、測定時間内での重力沈降の作用が無視できる程度に小さく、また抵抗パルス法で測定可能な程度に大きいことが望ましい。すなわち、反応性粒子１１１の粒径は１０ｎｍ～１０μｍであり、好ましくは５０ｎｍ～１μｍの範囲である。
　沈降による影響を抑制するために、反応性粒子１１１の母材として反応液の比重と近い材質、例えばポリスチレンを用いることが望ましい。また、反応性粒子１１１の粒径は可能な限り均一であることが望ましい。
　細孔１００は、抵抗パルス法によって反応性粒子及びその凝集体を検出する領域として機能する。細孔１００の体積は、反応性粒子１個当たりの反応液の体積１１４よりも小さく、望ましくはその１／１０以下である。これによって、同時に多数の反応性粒子１１１及びその凝集体が細孔１００を通過する確率を低減し、単一粒子の検出を担保することができる。
　細孔１００の直径は、反応性粒子１１１及びその凝集体が通過可能な程度に大きい必要がある。これらの条件を満たす範囲で、細孔１００の体積を小さくすることができる。抵抗パルス法による粒子検出信号は、およそ粒子の体積と細孔の体積の比で与えられるため、細孔の体積を小さくすることは粒子の検出を容易にする。
　一般的に、ラテックス凝集法では、粒子の粒径が小さいほど、また反応液中の粒子の濃度が高いほど、粒子の反応性が向上し、高感度な測定を行う上で有利となる。典型的なラテックス凝集法においては、反応性粒子の粒径は１００ｎｍ～５００ｎｍ程度であり、反応液中の粒子濃度は１０１０～１０１２個／ｍＬ程度である。このような粒子濃度条件に対しては、細孔の体積を１０－１３～１０－１１ｍＬ程度とすることが好ましい。この体積は、一辺約０．４６μｍ～２．２μｍの立方体の占める体積に相当する。なお、細孔の長さと計測感度については、後述する。
　上記のような微小体積を有する細孔は、半導体や樹脂の薄膜に対してリソグラフィ技術を適用して作製することができる。あるいは、それらの薄膜に対して集束イオン線や電子線を照射することで微小体積を有する細孔を作製することもできる。また、ガラス管をピペット状に加工して微小体積を有する細孔を作製することもできる。
　第１の電極１２１及び第２の電極１２２は対向するように配置され、また、それぞれ第１の区画１０１及び第２の区画１０２に導入された液体に対して電気的に接触するように設けられている。第１の電極１２１と第２の電極１２２は第１の区画１０１及び第２の区画１０２の外部において導線で接続されており、閉回路を構成する。第１の電極１２１と第２の電極１２２は、細孔の周囲にリング状に配置されていてもよい。また、液体導入流路内に棒状の電極を挿入することで第１の電極１２１および第２の電極１２２を構成してもよい。
　電極をつなぐ回路上には電圧源１２３が備えられており、第１の電極と第２の電極との間に電圧を印加する。電圧源１２３は可変電圧源であることが好ましい。回路には電流計１２４が接続されており、回路を流れる電流を測定することができる。電流計１２４の代わりに抵抗計を接続し、細孔１００をまたぐ電気抵抗の変化を測定することによっても同等の測定を行うことが出来る。
　電圧源１２３に電圧を印加すると、細孔１００の近傍に電場が誘起されるとともに、細孔１００を流れるイオン電流が発生する。反応性粒子１１１は、有限のゼータ電位を有する場合には電気泳動によって駆動され、細孔１００を通過する。電気泳動が主たる駆動力である場合、印加電圧は、反応性粒子１１１が第１の区画１０１から第２の区画１０２へと駆動される極性とする。つまり、反応性粒子が負のゼータ電位を有する場合は、第２の電極１２２の電圧を第１の電極１２１の電圧よりも高くし、逆に反応性粒子が正のゼータ電位を有する場合は、第１の電極１２１の電圧を第２の電極１２２の電圧よりも高くする。
　粒子の駆動力は、電気泳動のみによらず、圧力流を用いてもよい。圧力流を用いる場合の構成を図１２に示す。図１２は、第２の区画１０２に圧力制御部１３０が接続されており、第１の区画１０１と第２の区画１０２のそれぞれの内部の圧力に差を与える。圧力流による粒子駆動力が電気泳動によるものよりも十分に大きい場合、電極間の電圧の極性は正負のいずれであってもよい。
　圧力制御部１３０として、例えば送液ポンプや空気圧シリンジを用いることができる。　このような圧力制御部１３０を用いて、第１の区画から第２の区画へと向かう圧力流を発生させて粒子を駆動することで、電気泳動のみによって粒子を駆動する場合よりも多くの粒子を安定的に駆動させることができる。
　圧力制御部１３０が第１の区画１０１に接続されていても、同様の操作を行うことが可能である。また、圧力流による粒子駆動力が電気泳動による粒子駆動力よりも大きい場合、電気泳動による粒子駆動力は圧力流による粒子駆動力と逆向きでもよい。
　なお、第１の区画と第２の区画を開放系とし、液面の高さに差を与えることによっても圧力制御を行うことができる。
　図２は、図１に示した実施例において電流計１２４で測定された電流値の一例を示す模式図である。反応性粒子１１１及びその凝集体１１２、１１３が細孔１００を通過すると、電流値にはパルス状の電流変化ΔＩが観測される。
　反応性粒子１１１は非導電性の材料で形成されるため、これらの粒子が細孔１００の内部に存在する場合には細孔内部の電気抵抗は上昇し、電流値の減少として観測される。
　反応性粒子１１１及びその凝集体の通過に伴うパルス状の電流変化量は、バックグラウンド電流Ｉ０で規格化して抵抗パルス信号強度ΔＩ／Ｉ０に変換されることが望ましい。これによって、バックグラウンド電流Ｉ０の変調による影響を除去することができる。
　抵抗パルス信号強度は、細孔１００を通過した粒子の体積と正の相関を示す。すなわち、免疫凝集体１１２や非特異的凝集体１１３に由来する抵抗パルス信号強度は、未凝集の反応性粒子１１１のそれよりも大きい。
　電流計１２４にはパルス信号検出部１２５が接続されており、電流計１２４の出力から抵抗パルス信号を検出することができる。電流計１２４及びパルス信号検出部１２５による計測操作は、あらかじめ設定された時間Δtにわたって行われる。
　また、パルス信号検出部１２５には演算処理部１２６が接続されており、パルス信号検出部１２５によって検出されたパルス信号を所定時間内で集計して反応性粒子の凝集率を算出し、凝集率に基づき検体中の検出対象物質量を算出することができる。なお、演算処理部１２６は後述するすべての演算処理を実行可能であるものとする。　
　図１１は、細孔と抵抗パルス信号強度の関係を示したグラフである。図１１（ａ）は、細孔の長さＬ、細孔の直径Ｄ、及び反応性粒子の粒径ｄの関係性を示した模式図である。また、図１１（ｂ）は、Ｄ＝８４０ｎｍ、ｄ＝２９０ｎｍの条件における、未凝集体（１量体）と２つの粒子からなる凝集体（２量体）の抵抗パルス信号強度Ｓ１、Ｓ２、及び信号強度比Ｓ２／Ｓ１を計算し、それらの細孔の長さＬに関する依存性を示したグラフである。
　粒子の形状を特徴付ける長さは、１量体の場合は粒径ｄであり、２量体の場合は粒径の２倍の２ｄである。細孔の長さＬが粒子の特徴長さより小さい場合には、細孔近傍に誘起された電場領域に粒子を完全に包含することができない。そのため、粒子体積の全てが抵抗パルス信号に寄与することができず、抵抗パルス信号強度は低下する。
　一方、細孔の長さＬが粒子の特徴長さよりも十分に大きい場合には、粒子は完全に細孔の電場領域内に包含され、抵抗パルス信号強度は粒子の体積と細孔の体積との比によって決定される。したがって、細孔の長さＬが増大するほど抵抗パルス信号強度は低下する。
　上記の理由から、細孔の長さＬが反応性粒子の粒径ｄの２倍以上であるとき、信号強度比Ｓ２／Ｓ１が理論限界である２に漸近する。したがって、反応性粒子の未凝集体と凝集体の抵抗パルス信号強度分布の重なりが減少し、免疫計測の精度を向上させることが可能となる。
　図３は、図１に示した装置における電流計１２４で測定された電流値から、粒子の通過に対応する抵抗パルス信号強度を検出して記録したヒストグラムの一例を示す模式図である。
　未凝集の反応性粒子１１１に由来する信号強度Ｓ１を中心とする分布と、２つの反応性粒子が凝集した２量体に由来する信号強度Ｓ２を中心とする分布が見られる。図３においては明示していないが、３つ以上の反応性粒子が凝集した凝集体の信号が含まれる場合も存在する。ここで、Ｓｋはｋ個の反応性粒子からなる凝集体の信号強度を表す。
　隣接する信号強度分布の間に適切な閾値を設けることで、各信号強度分布に属する粒子の個数をカウントすることができる。時間Δtにわたって集計された抵抗パルス信号のうち、ｋ個の反応性粒子からなる凝集体のカウント数をＮｋとすると、凝集率は（数１）にしたがって算出される。特に、３つ以上の反応性粒子が凝集した凝集体の割合が十分に小さいとき、凝集率は（数２）にしたがって算出される。

（数１）
　　Ａ＝１－Ｎ１／ΣＮｋ
　　Ａ：凝集率
　　Ｎｋ：ｋ個の反応性粒子からなる凝集体のカウント数

（数２）
　　Ａ＝Ｎ２／（Ｎ１＋Ｎ２）
　　Ａ：凝集率
　　Ｎｋ：ｋ個の反応性粒子からなる凝集体のカウント数

　図４は、図３で示した測定結果において、反応時間を一定として得られた凝集率Ａの検出対象物質濃度依存性の一例を示した模式図である。上記の操作によって算出された凝集率は、反応液中に含まれる検出対象物質の濃度と反応時間に相関する。
　様々な既知濃度の検出対象物質を含む標準検体をあらかじめ測定しておくことで、実線で示された検量線を取得することができる。未知濃度の検出対象物質を含む検体を同一反応条件下で測定し、得られた凝集率を検量線と比較することで、検体中の検出対象物質の濃度ｃを定量することができる。
　図５は、以上に説明した免疫学的測定装置を用いた測定プロセスのフローの一例を示す説明図である。図５に示すように、本発明による免疫学的測定プロセスは、測定容器１０の第２の区画１０２に導電性液体を導入する工程Ｓ１と、検出対象物質に対して抗原抗体反応を発生する物質が修飾された反応性粒子１１１を含む導電性液体と検体とを混合した反応液を測定容器１０の第１の区画１０１に導入する工程Ｓ２と、第１の区画１０１の内部に設けられた第１の電極１２１と第２の区画１０２に設けられた第２の電極１２２に電源１２３を用いて電圧を印加して、第１の区画１０１から第２の区画１０２へと粒子が細孔１０１を通過するように駆動し、細孔１００を流れる電流の変化あるいは細孔をまたぐ電気抵抗の変化を測定して細孔１００を通過する粒子を計測する計測工程Ｓ３と、ある時間内において計測された粒子の凝集率を算出する算出工程Ｓ４と、検体中の検出対象物質を定量する定量工程Ｓ５と、を有する。
　図５で示したフローでは、計測工程Ｓ３を実施した後に算出工程Ｓ４を実施する場合を説明したが、測定部１２４とパルス信号検出部１２５によって計測された抵抗パルス信号からリアルタイムに凝集率を算出し、計測工程Ｓ３と算出工程Ｓ４を同時に実施してもよい。
　図６は、実施例１の免疫学的測定装置を用いて、反応性粒子の凝集反応に伴う凝集率の時間変化を測定した結果の一例を示す模式図である。本実施例では、ある時間Δｔにおける反応性粒子及びその凝集体の計測工程と凝集率の算出工程を総計測時間Ｔにわたって複数回行うことで、凝集率の時間変化を測定することができるため、凝集率を連続的に多数回測定することが可能になり、免疫測定の精度を向上させることができる。
　図７は、図６で示した実施例において、凝集率の時間変化を関数でフィッティングした結果の一例を示す模式図である。凝集率の時間変化Ａ（ｔ）は、例えば（数３）で示す関数によってフィッティングすることができる。

（数３）
　　Ａ（ｔ）＝αｃ（１－ｅ－ｋＢｔ）／（Ｂ－αｃ（１－ｅ－ｋＢｔ））＋Ａ０
　　　Ａ（ｔ）：凝集率の時間変化
　　　Ｂ：初期粒子濃度
　　　ｔ：反応時間
　　　ｋ：反応速度定数
　　　α：反応効率
　　　ｃ：検出対象物質濃度
　　　Ａ０：非特異的凝集率
　
　初期粒子濃度Ｂと反応時間ｔの条件を固定して、既知濃度の検出対象物質を含む標準検体を測定することで、反応速度定数ｋ、反応効率α及び非特異的凝集率Ａ０をあらかじめ予測することができる。また、これらのパラメータは反応性粒子を含む試薬の性能を評価する指標として用いることもできる。
　上記のパラメータが既知の場合、未知濃度の検出対象物質を含む検体の測定結果に対してフィッティングによる解析を行うことで、フィッティングパラメータとして検体中の検出対象物質濃度ｃが得られる。
　従来技術においては、所定の反応時間が経過した後の反応液を希釈し、１つの検体に対して凝集率を１回算出していたため、カウント数のばらつきに由来する測定ごとの凝集率のばらつきの影響が大きいという課題があった。本発明では、上記の工程によって多数の測定時点における凝集率を理論曲線で一意にフィッティングすることで、測定された凝集率のばらつきによる影響を抑制し、検体中の検出対象物質の定量をより高精度に実施することが出来る。　
　図８は、図５で示した免疫学的測定プロセスのフローにおける一例を示す説明図である。図８は、図５に示した実施例を、計測工程及び算出工程を所定の回数実施することで凝集率の時間変化を測定するように変形し、さらにフィッティングによる検出対象物質の定量を追加したものである。本実施例では、時間Δｔにおける計測工程及び算出工程が一組として繰り返されるが、総計測時間Ｔにわたって計測操作を実施し、得られた計測データを時間Δｔごとに分割し、分割されたデータそれぞれに対して凝集率の算出操作を実施しても同様の結果が得られる。
　図９は、反応性粒子の凝集反応に伴う凝集率の時間変化を測定した結果の一例を示す模式図である。ここでは、総計測時間Ｔが１／ｋＢで特徴付けられる凝集反応の時定数よりも短く、凝集反応の初期過程を計測する場合に対応する。このような条件下では、凝集率の時間変化Ａ（ｔ）は、例えば（数４）で示す関数で近似される。（数４）によると、凝集反応の初期過程は時間の１次関数でフィッティングすることができ、その傾きａは検出対象物質濃度に比例する。

（数４）
　　Ａ（ｔ）＝ｋαｃｔ＋Ａ０＝ａｔ＋Ａ０
　　　Ａ（ｔ）：凝集率の時間変化
　　　ｔ：反応時間
　　　ｋ：反応速度定数
　　　α：反応効率
　　　ｃ：検出対象物質濃度
　　　Ａ０：非特異的凝集率
　　　ａ：１次関数の傾き

　図１０は、図９で示した例において、フィッティングの結果として得られた傾きａの検出対象物質濃度依存性の一例を示した模式図である。様々な既知濃度の検出対象物質を含む標準検体をあらかじめ測定しておくことで、実線で示された傾きａに関する検量線を取得することができる。
　未知濃度の検出対象物質を含む検体を同一反応条件下で測定し、得られた傾きａを検量線と比較することで、検体中の検出対象物質の濃度ｃを定量することができる。上記の工程によって、測定された凝集率のばらつきによる影響を抑制しつつ、より短い測定時間で検体中の検出対象物質の定量を実施することが出来る。　
　次に本実施例に記載の免疫学的装置及び測定方法を実施した具体的な実験データについて説明する。図１６は、抗原抗体反応による反応性粒子及びその凝集体の抵抗パルス信号強度のヒストグラムを示す。
　免疫学的測定装置の細孔の直径Ｄ、細孔の長さＬ、反応性粒子の粒径ｄはそれぞれ８４０ｎｍ、８２５ｎｍ、２９０ｎｍであり、細孔の長さＬは反応性粒子ｄの２倍より大きいものとしている。また、細孔の体積は４．６×１０－１６Ｌである。
　反応液中の反応性粒子の初期濃度は６．１×１０－１１ｍｏｌ／Ｌであり、反応性粒子１個当たりの反応液の体積は２．７×１０－１４Ｌである。したがって、細孔の体積は反応性粒子１個当たりの反応液の体積の約１／６０である。
　反応性粒子の駆動力は主に圧力流によるものであり、第１の区画における反応液の液面に対して第２の区画における反応液の液面を５ｍｍ高くすることで圧力流を発生させた。未凝集体による信号強度分布と凝集体による信号強度分布が識別されており、閾値を設定することで凝集率０．１１を得た。
　図１７は、２種類の反応性粒子の初期濃度条件について凝集率の時間変化を測定した結果である。反応性粒子の初期濃度はそれぞれ６．１×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ及び６．１×１０－１２ｍｏｌ／Ｌであった。いずれの粒子濃度条件においても、凝集率は時間の経過とともに上昇し、ある凝集率の付近で飽和した。
　図１７中の曲線は（数３）で示す関数によってフィッティングした結果を示しており、フィッティングの結果、いずれの粒子濃度条件においても反応液中の検出対象物質濃度は１．１×１０－１１ｍｏｌ／Ｌと定量された。
　本実施例は、実施例１で示した免疫学的測定装置を用いて行う他の測定方法の例である。図１４は、本実施例の免疫学的測定プロセスのフローの一例を示す説明図である。図１４は、図８に示したフローに対して、反応液の測定工程の前に、反応性粒子を含む試薬そのものに対する計測工程及び算出工程を実施したものである。
　なお、図５、図８及び図１４で示された実施例においては、いずれも第２の区画１０２に導電性液体を導入する工程を最初に行っているが、第１の区画１０１に反応性粒子を含む試薬及び試薬と検体と混合した反応液を導入する工程を最初に行ってもよく、これらの２つの工程の順序は重要ではない。
　本実施例の免疫学的測定プロセスのフローは、測定容器１０の第２の区画１０２に導電性液体を導入する工程Ｓ１１を実施し、検出対象物質に対して抗原抗体反応を発生する物質が修飾された反応性粒子１１１を含む導電性液体を測定容器１０の第１の区画１０１に導入する工程Ｓ１２を実施し、第１の区画１０１の内部に設けられた第１の電極１２１と第２の区画１０２に設けられた第２の電極１２２に電源１２３を用いて電圧を印加して、第１の区画１０１から第２の区画１０２へと粒子が細孔１０１を通過するように駆動し、細孔１００を流れる電流の変化あるいは細孔をまたぐ電気抵抗の変化を測定して細孔１００を通過する粒子を計測する計測工程Ｓ１３を実施し、ある時間内において計測された非特異的凝集体１１３の凝集率を算出する算出工程Ｓ１４を実施し、測定容器１０の第１の区画１０１に検体を導入する工程Ｓ１５を実施し、検体導入後に再び上記に記載の計測工程と同様の計測を行う計測工程Ｓ１６を実施し、ある時間内において計測された非特異的凝集体１１３及び免疫凝集体１１２を含む凝集体の凝集率を算出する算出工程Ｓ１７を実施し、計測工程１６及び算出工程１７を所定の複数回行う工程Ｓ１８を実施し、得られた凝集率の時系列データを基に、フィッティングにより検体中の検出対象物質量を定量する定量工程Ｓ１９を実施するものである。
　上記のフローにおいて、あらかじめ第１の区画１０１に導入された反応性粒子を含む試薬に対して検体を注入することで、第１の区画１０１の内部で試薬と検体の混合を行うことができるため、あらかじめ混合した反応液の測定と同様に測定を実施することができる。なお、試薬と検体の混合は、検体を注入する際の対流によって実施することができるが、攪拌子等を用いて機械的に実施してもよい。
　図１３は、図１４に示したフローにより、反応性粒子の非特異的凝集及び凝集反応に伴う凝集率の時間変化を測定した結果の一例を示す模式図である。本実施例では、反応性粒子を含む試薬と検体の混合操作を実施する前に、あらかじめ第１の区画１０１に導入された試薬に対してある時間ΔＴにおいて計測操作と凝集率の算出操作を行う。この工程を行うことにより、１回の測定ごとに抗原抗体反応によらない非特異的凝集率を算出することができる。
　非特異凝集を引き起こす因子（ｐＨ、塩濃度、夾雑物など）は検体ごとに異なるが、各検体について非特異的凝集率を算出して全凝集率から減算することで、特異的な凝集反応のみを正確に計測でき、検体中の検出対象物質量を正確に定量することができる。
　図１５は、本発明による免疫学的測定装置の一実施例の模式図である。本実施例では、細孔１００、第１の区画１０１及び第２の区画１０２に対して温度調節部１３２が設けられている。
　ただし、温度調節部１３２は、少なくとも第１の区画１０１の内部の温度が制御できるように設けられればよい。前述の実施例に記載の反応速度定数ｋは温度に依存し、一般的に温度が高いほど大きな値となる。
　上記の構成により、第１の区画１０１に導入された反応液を加温することにより反応性を向上させ、より大きな凝集率を得ることで、検出対象物質を定量する際の感度を向上させることができる。また、測定中の温度を一定に保つことで反応速度定数ｋの測定中の変化を抑制し、検出対象物質の定量における精度を向上させることができる。
　なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
１００　細孔
１０１　第１の区画
１０２　第２の区画
１０３　液体導入流路
１１０　検出対象物質
１１１　反応性粒子
１１２　免疫凝集体
１１３　非特異的凝集体
１１４　反応性粒子１個当たりの反応液の体積
１２１　第１の電極
１２２　第２の電極
１２３　電圧源
１２４　電流計
１２５　パルス信号検出部
１２６　演算処理部
１３０　圧力制御部

Claims (14)

  1. 　検出対象物質に対して抗原抗体反応を発生する物質が修飾された反応性粒子を含み導電性を有する反応性粒子溶液と検体とが導入される第１の区画と、導電性を有する液体が導入される第２の区画と、前記反応性粒子溶液と前記検体を含む反応液に含まれる反応性粒子１個当たりの反応液の体積よりも小さな体積を有する、前記第１の区画と前記第２の区画を接続する細孔とを有する測定容器と、
    　前記第１の区画の内部に設けられた第１の電極と、
    　前記第２の区画の内部に設けられた第２の電極と、
    　前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する電圧源と、
    　前記第１の電極と前記第２の電極との間に流れる電流又は電気抵抗を測定する測定部と、
    　前記測定部で測定された電流又は電気抵抗のパルス変化を検出するパルス信号検出部と、
    　前記パルス信号検出部によって検出されたパルス信号を所定時間内で集計して前記反応性粒子の凝集率を算出し、前記凝集率に基づき前記検体中の検出対象物質量を算出する演算処理部を有することを特徴とする免疫学的測定装置。
  2. 　前記演算処理部で、前記反応液に対して前記所定時間内で行う凝集率の算出を複数回行い、凝集率の時間変化に基づき前記検体中の検出対象物質量を算出することを特徴とする請求項１に記載の免疫学的測定装置。
  3. 　前記細孔の長さが前記反応性粒子の粒径の２倍以上であることを特徴とする請求項１に記載の免疫学的測定装置。
  4. 　前記第１の区画と前記第２の区画の圧力差を制御する圧力制御部を備えることを特徴とする請求項１に記載の免疫学的測定装置。
  5. 　前記第１の区画に対する検体注入部を備えることを特徴とする請求項１に記載の免疫学的測定装置。
  6. 　前記第１の区画に対する温度調節部を備えることを特徴とする請求項１に記載の免疫学的測定装置。
  7. 　測定容器が有する第２の区画に導電性液体を導入する工程と、
    　検出対象物質に対して抗原抗体反応を発生する物質が修飾された反応性粒子を含む導電性液体と検体を混合した反応液を前記測定容器の第１の区画に導入する工程と、
    　前記第１の区画と前記第２の区画をつなぐ細孔へ前記反応性粒子及びその凝集体を通過させるように操作し、前記第１の区画の内部に設けられた第１の電極と前記第２の区画に設けられた第２の電極を用いて前記細孔を流れる電流の変化あるいは前記細孔をまたぐ電気抵抗の変化を測定して前記細孔を通過する反応性粒子及びその凝集体を計測する計測工程と、
    　所定時間内において計測された前記反応性粒子の凝集率を算出する算出工程と、
    　得られた凝集率に基づき、前記検体中の検出対象物質を定量する定量工程と、を有する免疫学的測定方法。
  8. 　前記計測工程及び前記算出工程を、前記反応液に対して前記所定時間内で行う凝集率の算出を複数回行い、凝集率の時間変化に基づき前記検体中の検出対象物質量を算出することを特徴とする請求項７に記載の免疫学的測定方法。
  9. 　前記定量工程において、凝集率の時間変化を関数でフィッティングすることによって検出対象物質を定量する請求項８に記載の免疫学的測定方法。
  10. 　前記定量工程において、凝集率の時間変化を１次関数でフィッティングし、その１次関数の傾きから検出対象物質を定量する請求項９に記載の免疫学的測定方法。
  11. 　測定容器が有する第２の区画に導電性液体を導入する工程と、
    　検出対象物質に対して抗原抗体反応を発生する物質が修飾された反応性粒子を含み、導電性を有する反応性粒子溶液を前記測定容器の第１の区画に導入する工程と、
    　　前記第１の区画と前記第２の区画をつなぐ細孔へ前記反応性粒子及びその凝集体を通過させるように操作し、前記第１の区画の内部に設けられた第１の電極と前記第２の区画に設けられた第２の電極を用いて前記細孔を流れる電流の変化あるいは前記細孔をまたぐ電気抵抗の変化を測定して前記細孔を通過する反応性粒子及びその凝集体を計測する第１の計測工程と、
    　所定時間内において計測された前記反応性粒子の凝集率を算出する第１の算出工程と、
    　前記第１の区画に検体を導入する工程と、
    　検出対象物質に対して抗原抗体反応を発生する物質が修飾された反応性粒子を含む導電性液体と検体を混合した反応液に対して、前記第１の区画と前記第２の区画をつなぐ細孔へ前記反応性粒子及びその凝集体を通過させるように操作し、前記第１の区画の内部に設けられた第１の電極と前記第２の区画に設けられた第２の電極を用いて前記細孔を流れる電流の変化あるいは前記細孔をまたぐ電気抵抗の変化を測定して前記細孔を通過する反応性粒子及びその凝集体を計測する第２の計測工程と、
    　所定時間内において計測された前記反応性粒子の凝集率を算出する第２の算出工程と、
    　前記第１及び第２の算出工程で得られた凝集率に基づき、前記検体中の検出対象物質を定量する定量工程と、を有する免疫学的測定方法。
  12. 　前記第２の計測工程及び前記第２の算出工程を、前記反応液に対して前記所定時間内で行う凝集率の算出を複数回行い、凝集率の時間変化に基づき前記検体中の検出対象物質量を算出することを特徴とする請求項１１に記載の免疫学的測定方法。
  13. 　前記定量工程において、凝集率の時間変化を関数でフィッティングすることによって検出対象物質を定量する請求項１２に記載の免疫学的測定方法。
  14. 　前記定量工程において、凝集率の時間変化を１次関数でフィッティングし、その１次関数の傾きから検出対象物質を定量する請求項１３に記載の免疫学的測定方法。

    　
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