JP2005106671A - 生化学解析用ユニットを用いた反応方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】 フロースルーエリアの全面に均等に反応溶液を流す。
【解決手段】 生化学解析用ユニット１０のスポット領域にプローブと点着し、フロースルーエリア４１を形成する。生化学解析用ユニット１０を反応容器２２のチャンバー５３にセットする。ターゲットを含む反応溶液２５を調製する。反応溶液２５をチャンバー５３の注入口２６から注入する。反応溶液２５がフロースルーエリア４１を通る際の圧力損失を８０ｋＰａとなるように送液流量などの調整を行う。圧力損失を大きくすることにより、反応溶液２５は、下部チャンバー５２ａ内で均等に拡がった後にフロースルーエリア４１を流れるため、流速分布の低減を図ることができる。
【選択図】 図６

Description

本発明は、ＤＮＡの塩基配列などの解析用の生化学解析用ユニットを用いた反応方法に関するものである。
生体由来物質、例えばＤＮＡの塩基配列などの生化学解析を行うために、生化学解析用ユニットが使用される。生化学解析用ユニットは、基板に微細な貫通孔を複数形成し、これら各貫通孔内に多孔質材料等の吸着性物質を押し込むことで、複数の吸着性領域（以下、スポット領域と称する）を形成したものである。この生化学解析用ユニットを使用した生化学解析方法は、生化学解析用ユニットの複数のスポット領域に、試薬となる特異的結合物質（以下、プローブと称する）を点着して固定化するスポッティング工程と、スポット領域に検体となる特異的結合物質（以下、ターゲットと称する）を浸透させて特異的結合（プローブとターゲットとの結合）を生じさせる反応工程と、生化学解析用ユニットから各スポット領域の特異的結合反応の結果を示す生化学解析用データを読み取るデータ読み取り工程と、読み取られた解析用データをパーソナルコンピュータなどで解析するデータ解析工程とを含む（例えば、特許文献１参照。）。
プローブは、ターゲットの発現領域を調べるための試薬となるものであるから、分子構造、例えば塩基配列や組成などが既知のものが使用される。プローブとしては、例えば、生体由来物質であるホルモン類，腫瘍マーカー，酵素，抗体，抗原，アブザイム，レセプタ，その他のタンパク質，リガンド，核酸，ｃＤＮＡ，ＤＮＡ，ｍＲＮＡなどを生体から抽出，単離して採取されたものや、この採取後に化学的処理が施されたものである。
塩基配列を調べる場合には、スポッティング工程において、生化学解析用ユニットの各スポット領域に、異なる種類のプローブが固定化される。そして、反応工程において、ターゲットを溶媒に溶解した溶液（以下、特異的結合反応溶液と称する）を各スポット領域に浸透させることで、ターゲットと、このターゲットと相補的な関係にあるプローブとを特異的結合させる。特異的結合が生じたことを検出するために、特異的結合反応溶液には、例えば、標識物質が付与される。この標識物質としては、例えば、放射線を放出する放射性物質が使用される。特異的結合を生じさせた後に、生化学解析用ユニットは洗浄されて、特異的結合が生じたスポット領域以外の部分に付着した特異的結合反応溶液が取り除かれる。
特異的結合が生じたスポット領域には、標識物質が残留するので、データ読み取り工程では、この標識物質からの放射線に基づいて特異的結合の有無を検出する。データ読み取り装置としては、例えばスキャナが使用されるが、光学情報を読み取る撮像デバイスでは、放射線を直接読み取ることはできない。そこで、標識物質として放射性物質を使用する場合には、特異的結合が生じたスポット領域の放射線エネルギーを蓄積し、これを光学情報に変換する蓄積性蛍光体シートが使用される。蓄積性蛍光体シートには、放射線により露光される輝尽性蛍光体を含む領域（以下、輝尽性蛍光体領域と称する）が形成されている。この輝尽性蛍光体領域と、生化学解析用ユニットの各スポット領域とを重ね合わせると、特異的結合が生じたスポット領域では、標識物質からの放射線によって輝尽性蛍光体領域が露光される。この露光済みの輝尽性蛍光体領域に励起光を照射すると、該領域が発光するので、この光をスキャナで検出することにより生化学解析用データが読み取られる。
ところで、特異的結合反応を生じさせる方式としては、従来は、振盪方式によって行われるのが一般的であった。振盪方式とは、特異的結合反応溶液と、プローブを固定化済みの生化学解析用ユニットとを反応容器に入れて振盪台上で反応容器をシェイクすることにより、反応容器内のターゲットを流動させて前記吸着性領域に浸透させる方式である。ところで、この振盪方式は、実験者が手で反応溶液を入れ替えするため、以下のような問題があった。第１に、前記反応溶液を複数のスポット領域に均等に浸透させることが難しいことである。第２に、スポット領域へ浸透する圧力（しみこみ圧力）が低いため反応速度が遅いことである。そのため、反応結果が出るまでの時間は、短い場合でも１０時間以上かかり、長いときには数日かかってしまうこともある。第３に、実験者が異なる場合はもちろん、同じ実験者であっても複数回の実験を行う場合には、反応容器への特異的結合反応溶液の出し入れ温度を均一にすることが難しく、実験条件にバラツキが生じ、実験の再現性に問題がある。
そこで、最近では振盪方式に変えて、ピストンやポンプなどの機械的な動力を用いて反応容器内の反応溶液を流動させることにより、反応溶液をスポット領域の一方の側から他方の側へ通過させるフロースルー方式が使用されるようになってきている（例えば、特許文献２参照。）。
フロースルー方式に用いられる反応容器は、生化学解析用ユニットに収容するとともに、特異的結合反応溶液が流し込まれる反応室（以下、チャンバーと称する）を備えている。チャンバーには、特異的結合反応溶液が注入される注入口と、スポット領域を通過した該反応溶液を排出する排出口とが設けられている。注入口及び排出口は、前記複数のスポット領域が配列されたフロースルーエリアの中央部と対向する位置に配置される。特異的結合反応溶液は、ポンプやピストンなどの機械的な動力により加圧されてチャンバーへ流し込まれる。このように特異的結合反応溶液は、加圧されて流し込まれるので、スポット領域へ浸透する圧力が上昇し、反応速度を高めることができる。また、機械的な動力により一定圧がかかって流動されるから、実験条件にバラツキが生じることもない。
また、チャンバーの壁面は、流入口及び排出口から、生化学解析用ユニットの両端に向かうにつれて該ユニットに接近するようにテーパが形成されている。こうすることで、注入口から流し込まれた特異的結合反応溶液が、フロースルーエリアの全面に均等に流れるようにしている。
特開２００２−３５５２０３６号公報 ＷＯ０１／４５８４３号公報
しかしながら、チャンバーの小型化に伴いテーパの形成が困難となると共にコスト高を招いていた。また、複数種類の特異的結合反応溶液や洗浄液を用いて多段階の反応を行う場合がある。このときには各液の物性などが変わり、テーパの形態によってはフロースルーエリアの全面に均等に流すことが困難な場合がある。
本発明は、フロースルーエリアの全面に反応溶液，洗浄液を均等に流す生化学解析用ユニットを用いた反応方法を提供することを目的とする。さらに、多段階反応を行う際に各反応溶液，洗浄液に応じて最適な反応方法を提供することも目的とする。
本発明の生化学解析用ユニットを用いた反応方法は、試薬となるプローブが固定化され、検体となるターゲットを含む溶液が流動可能な複数のスポット領域が配列されたフロースルーエリアを備えた生化学解析用ユニットを、前記溶液が注入されるチャンバーに収容し、注入された前記溶液を前記スポット領域を通過するように流動させて前記プローブと前記ターゲットとを選択的に特異的結合反応させる生化学解析用ユニットを用いた反応方法において、前記溶液が前記フロースルーエリアを通過する際の圧力損失を１ｋＰａ以上１ＭＰａ以下とする。
前記フロースルーエリアを通過する前記溶液の流速を０．１ｍｍ／ｓ以上２０ｍｍ／ｓ以下とすることが好ましい。前記フロースルーエリアに備えられているメンブレンの空隙率が、５５％以上９０％以下のものを用いることが好ましい。前記メンブレンの平均孔径が、０．１μｍ以上１０μｍ以下のものを用いることが好ましい。前記溶液を前記チャンバーに注入する際の温度を２５℃以上８０℃以下とすることが好ましい。
前記チャンバーの溶液注入口と前記生化学解析用ユニットとの高さを０．０２ｍｍ以上２０ｍｍ以下とすることが好ましい。前記チャンバー内の前記溶液の平均温度を２５℃以上８０℃以下とすることが好ましい。
なお、本発明において、試薬となるプローブと反応溶液中の検体となるターゲットを選択的に特異的結合させる反応としては、リガンド・レセプタ反応，抗原・抗体反応，ハイブリダイゼーション反応などを含んでいる。
本発明の生化学解析用ユニットを用いた化学反応によれば、試薬となるプローブが固定化され、検体となるターゲットを含む溶液が流動可能な複数のスポット領域が配列されたフロースルーエリアを備えた生化学解析用ユニットを、前記溶液が注入されるチャンバーに収容し、注入された前記溶液を前記スポット領域を通過するように流動させて前記プローブと前記ターゲットとを選択的に特異的結合反応させる生化学解析用ユニットを用いた反応方法において、前記溶液が前記フロースルーエリアを通過する際の圧力損失を１ｋＰａ以上１ＭＰａ以下とするから、前記溶液が前記フロースルーエリアの全面に渡り流速分布が５％以下に流すことが可能となる。これにより、各スポット領域の反応を略均等に行うことが可能となり、良好な解析用データを得ることができる。
圧力損失を１ｋＰａ以上１ＭＰａ以下とするために
（１）前記フロースルーエリアを通過する前記溶液の流速を０．１ｍｍ／ｓ以上２０ｍｍ／ｓ以下、
（２）前記フロースルーエリアに備えられているメンブレンの空隙率を５５％以上９０％以下、
（３）前記メンブレンの平均孔径が、０．１μｍ以上１０μｍ以下、
（４）前記溶液を前記チャンバーに注入する際の温度を２５℃以上８０℃以下、
（５）前記チャンバーの溶液注入口と前記生化学解析用ユニットとの高さを０．０２ｍｍ以上２０ｍｍ以下、
（６）前記チャンバー内の前記溶液の平均温度を２５℃以上８０℃以下、
の各条件を適宜最適なものとすることで調整可能である。そのため、チャンバーに特別な加工を施すことなく前記フロースルーエリアに略均等に前記溶液を流すことが可能となる。なお、本発明は、テーパ状の形態を有するチャンバーを備える反応容器を用いることも可能である。
図１に示すように、生化学解析用ユニット１０を使用した生化学解析方法は、スポッティング工程と，反応工程と、洗浄工程と、データ読み取り工程と、データ解析工程とを含む。生化学解析用ユニット１０は、基板１１に微細な貫通孔１２をマトリックス状に複数形成し、各貫通孔１２に吸着性物質であるメンブレン１３を圧入して複数のスポット領域１４を形成したものであり、フロースルータイプのものである。
スポッティング工程では、スポッターを用いて、生化学解析用ユニット１０の各スポット領域１４に異なる種類のプローブを含む溶液（以下、プローブ溶液と称する）を各々点着させる。スポッターは、プローブ溶液を点着するスポットピン１６を備えている。スポットピン１６の先端には、割溝が形成されている。このスポットピン１６により、ウェルプレート上に分注された複数種類のプローブ溶液を吸い上げ、吸い上げられたプローブ溶液を各スポット領域１４に点着する。この後、各スポット領域１４に紫外線などを照射することによりプローブが各スポット領域１４に固定される。
反応工程では、リアクタ２１を用いてプローブと検体となるターゲットとを反応させる。リアクタ２１は、反応容器２２と循環パイプ２３とポンプ２４とを備える。反応容器２２は、生化学解析用ユニット１０を収容するとともに特異的結合反応溶液２５が注入される。なお、本実施形態においては、標識物質として化学反応によって発光する化学発光物質を用いて説明するが、標識物質はそれに限定されるものではない。
特異的結合反応溶液２５は、反応溶液調製装置によって作製される。反応溶液調製装置は、標識物質が付与されたターゲットを溶媒に溶かし込み特異的結合反応溶液を調製する。調製された特異的結合反応溶液は、リアクタ２１に備えられているタンク（図示しない）に収容される。
反応容器２２には、特異的結合反応溶液２５を注入する注入口２６と、生化学解析用ユニット１０を通過した特異的結合反応溶液２５を排出する排出口２７とが設けられている。生化学解析用ユニット１０は、一方の面（図上、下面）が注入口２６と対向し、他方の面（図上、上面）が排出口２７と対向するように取り付けられている。反応容器２２に注入された特異的結合反応溶液２５は、各スポット領域１４に浸透するが、この浸透しているときに、ターゲットと相補的なプローブを有するスポット領域１４では、ターゲットとプローブとが特異的結合反応を生じる。各スポット領域１４を通過した特異的結合反応溶液２５は、排出口２７から反応容器２２外へ排出される。
注入口２６と排出口２７とは、循環パイプ２３に接続されており、反応容器２２から排出された特異的結合反応溶液２５は、ポンプ２４により循環パイプ２３を介して再び注入口２６から反応容器２２内に送液される。また、特異的結合反応溶液や洗浄液を反応容器２２に注入したり、これらを排出する際には、注入口２６及び排出口２７には、液導入管または液排出管（いずれも図示しない）が接続されている。注入口２６及び排出口２７には、これら液導入管，液排出管，循環パイプ２３が切替え可能に接続されている。
反応工程の後、洗浄工程において、生化学解析用ユニット１０が洗浄されて、特異的結合反応を生じたスポット領域以外の部分から特異的結合反応溶液が取り除かれる。洗浄工程では、リアクタ２１を用いて特異的結合反応溶液の代わりに、洗浄液を流動させることにより洗浄が行われる。洗浄液を流動させて洗浄を行うので、生化学解析用ユニット１０に付着している特異的結合しない特異的結合反応溶液を効率的に除去することが可能となり洗浄効率が向上する。
この洗浄効果をさらに向上させるためには、反応工程を実行する前に、生化学解析用ユニット１０にいわゆるブロッキング剤を浸透させておくことがより好ましい。これにより、洗浄工程において、特異的結合反応しない特異的結合反応溶液がより除去しやすくなり洗浄効果がより向上する。ブロッキング剤の生化学解析用ユニット１０への浸透についても、洗浄液と同様にリアクタ２１を用いて行うことが好ましい。洗浄液やブロッキング剤についても特異的結合反応溶液と同様に機械的動力を用いて流動させることで、異なる実験間での洗浄効率などを均一にすることができるので、より正確で、かつ再現性，定量性に優れた解析用データを得ることができる。
洗浄工程を経た後に、生化学解析用ユニット１０は、データ読み取り工程に送られる。データ読み取り工程では、スキャナ３１によって生化学解析用ユニット１０から生化学解析用データが光電的に読み取られる。スキャナ３１は、標識物質から発光される光を受光して光電変換するＣＣＤイメージセンサ３２を備えている。ＣＣＤイメージセンサ３２の受光面前方には、標識物質が発光する光をＣＣＤイメージセンサ３２の受光素子へ導くライトガイド３３が設けられる。ライトガイド３３は、各スポット領域１４の数に対応した複数本の光ファイバーから構成され、各光ファイバーの一端が前記受光面に、他端がスポット領域１４にそれぞれ対向するように配置される。特異的結合反応が生じたスポット領域では、標識物質が残留しているので光が発光する。しかしながら、特異的結合反応が生じていないスポット領域には標識物質が存在しないため光が発光しない。ＣＣＤイメージセンサ３２によって、こうした各スポット領域１４の特異的結合反応の結果を示す画像データが取得される。データ解析工程では、この画像データを生化学解析用データとして解析する。
図２ないし図４は、本発明に用いられる生化学解析用ユニット１０の製造方法及びその一実施形態を示す説明図である。基板１１の材質としては、光の散乱を防止するために、光を減衰させる材質が好ましく、金属，セラミックス，プラスチックなどが使用される。光の散乱を防止する趣旨は、あるスポット領域で発せられた光が基板壁を透過して、隣接するスポット領域に到達することにより、発光していないスポット領域から光があたかも光が発せられているかのように見えてしまうという誤認識を防止することにある。光を減衰させる効率が高い材質を使用することで、誤認識が防止され信頼性の高い解析用データが得られる。光の減衰率（スポット領域から発せられる光強度の低下率）は、あるスポット領域から発せられる光強度が、隣接するスポット領域においては、１／５以下になることが好ましく、１／１０以下になることがより好ましい。
図２に示すように、基板１１の厚みＴは、５０μｍ〜１０００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは１００μｍ〜５００μｍの範囲である。金属としては、銅，銀，金，亜鉛，鉛，アルミニウム，チタン，錫，クロム，鉄，ニッケル，コバルト，タンタルなどを用いることができる。また、ステンレス鋼や黄銅などの合金も用いることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。また、セラミックスとしては、アルミナ，ジルコニアなどがあげられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
前記プラスチックとしては、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン，ポリプロピレンなど）、ポリスチレン、アクリル樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレートなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル，ポリ塩化ビニリデンなど）、含フッ素ポリマー類（例えば、ポリフッ化ビニリデン，ポリテトラフルオロエチレンなど）、含塩素フッ素ポリマー（例えば、ポリクロロトリフルオロエチレンなど）、ポリカーボネート、ポリエステル（例えば、ポリエチレンナフタレート，ポリエチレンテレフタレートなど）、ポリアミド（例えば、ナイロン−６，ナイロン−６６など）、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ケイ素樹脂（例えば、ポリジフェニルシロキサンなど）、フェノール樹脂（例えば、ノボラックなど）、エポキシ樹脂、ポリウレタン、セルロース類（例えば、酢酸セルロース，ニトロセルロースなど）などが挙げられる。または、コポリマー（例えば、ブタジエン−スチレン共重合体など）、さらには前記プラスチックをブレンドしたものも挙げられるが、それらに限定されるものではない。
プラスチックを基板材料に用いると、貫通孔の形成が容易となり好ましいが、光の減衰が生じ難い場合もある。そこで、光をより一層減衰させるために、プラスチックに金属酸化物粒子やガラス繊維などの粒子を充填して、これらをプラスチック内部に分散させることが好ましい。金属酸化物粒子としては、二酸化ケイ素，アルミナ，二酸化チタン，酸化鉄，酸化銅などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
貫通孔１２の形成方法は、パンチング法，放電パルス法，食刻技術法（フォトリソグラフィー法），電解エッチング法，エキシマレーザー及びＹＡＧレーザーなどのレーザーを基板に照射する方法などがあるがこれらに限定されるものではない。これら各形成方法は、基板の材料などに応じて適宜選択される。
貫通孔１２の密度を高めるために、貫通孔の開口部の面積は、５ｍｍ2 未満であることが好ましく、より好ましくは１ｍｍ2 未満であり、０．３ｍｍ2 未満がより好ましく、０．０１ｍｍ2 未満がさらに好ましい。そして、最も好ましくは０．００１ｍｍ2 以上である。また、貫通孔１２の孔形状を略円形とした場合には、その直径Ｄが、２００μｍ〜３００μｍであることが好ましい。
貫通孔１２の配列ピッチ（隣接する２つの孔の中心から中心までの距離）Ｐは、５０μｍ〜３００μｍの範囲が好ましく、隣接する２つの貫通孔１２の端部から端部までの距離Ｌは、１０μｍ〜１５００μｍの範囲とすることが好ましい。また、貫通孔１２の密度は、１０個／ｃｍ2 以上が好ましく、１００個／ｃｍ2 以上がより好ましく、さらに好ましくは５００個／ｃｍ2 以上、さらに最も好ましくは１０００個／ｃｍ2 以上１００００個／ｃｍ2 以下の範囲である。
図３は、生化学解析用ユニット１０の製造手順を示す。基板１１に貫通孔１２を形成する。その後に基板１１の洗浄効果を高めるために表面処理を行うことが好ましい。基板１１の材料に金属，合金（例えば、ステンレス鋼など）を用いた際には、コロナ放電，プラズマ放電または陽極酸化法などの少なくともいずれかの方法により表面処理を行う。表面処理によって基板１１には、表面処理層が形成される。表面処理層は、カルボニル基，カルボキシル基などの極性基が形成されており親水性である金属酸化膜の層となる。
表面処理が施された後に、基板１１のメンブレン１３が圧入される面に接着剤を塗布することが好ましい。接着剤を塗布する方法は、特に限定されるものではないが、ロール塗布，ワイヤーバー塗布，ディップ塗布，ブレード塗布，エアナイフ塗布などにより行うことができる。接着剤には、スチレンブタジエンゴム，アクリロニトリルブタジエンゴムがなどが好ましく用いられるが、これらに限定されるものではない。なお、余剰の接着剤は、ブレードにより掻き落としたり、レーザー光の照射により熱分解させて除去する方法などにより行うことが、後の工程で不純物の発生を防止するために好ましい。なお、本発明に用いられる生化学解析用ユニットを作製する際に、基板の表面処理，接着剤の塗布工程は省略することもできる。
接着剤が塗布された後に、メンブレン１３が圧入される。メンブレン１３には、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく用いられる。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して用いることもできる。本発明において用いられるメンブレン１３は、多孔質材料（有機材料，無機材料，有機／無機材料）、繊維材料（有機材料，無機材料）のいずれでも良く、それらを混合して用いても良い。メンブレン１３の厚さは特に限定されるものではないが、１００μｍ〜２００μｍ（０．１０ｍｍ〜０．２０ｍｍ）の範囲のものを用いることが好ましい。また、体積空隙率Ｃが、５５％〜９０％の範囲のものを用いることが好ましく、空隙を構成する微細孔の平均孔径は０．１μｍ〜１０μｍの範囲にあるものを用いることが好ましい。体積空隙率Ｃは、吸着性材料の見掛け体積に対する無数の孔の体積和の百分率で示される。
有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、ポリマーを用いることが好ましい。ポリマーとしては、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース，再生セルロース，セルロースアセテート，酢酸セルロース，酪酸酢酸セルロースなど）、脂肪族ポリアミド類（例えば、ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン４，１０など）、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン，ポリプロピレンなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル，ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素樹脂類（例えば、ポリフッ化ビニリデン，ポリテトラフルオライドなど）、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体（例えば、アルギン酸，アルギン酸カルシウム，アルギン酸／ポリリシンポリイオンコンプレックスなど）、コラーゲンなどが挙げられる。また、これらポリマーの共重合体や複合体（混合体）を用いることもできる。なお、本発明においては、多孔質としたナイロンを用いることが吸水性の点から好ましい。
無機多孔質材料も特に限定されるものではないが、好ましくは金属（例えば、白金，金，鉄，銀，ニッケル，アルミニウムなど）、金属などの酸化物（例えば、アルミナ，シリカ，チタニア，ゼオライトなど）、金属塩（例えば、ヒドロキシアパタイト，硫酸カルシウムなど）及びこれらの複合体などが挙げられる。また、活性炭などの炭素多孔質材料も好ましく用いられる。
また、有機繊維材料，無機繊維材料も特に限定されるものではない。例えば、前記セルロース誘導体類，脂肪族ポリアミド類などの有機繊維材料や、ガラス繊維，金属繊維などの無機繊維材料を用いることができる。また、メンブレン１３の強度を高めるため、多孔質材料を溶解する溶媒に不溶な繊維材料を混合させても良い。
図４は、メンブレン１３の圧入方法の一実施形態を示す。基板１１とメンブレン１３とを重ね合わせて上下からプレス板３６，３７によりプレスする。なお、メンブレン１３に有機多孔質材料及び／または有機繊維材料を用いているときには、プレス板３６を加熱して、基板１１の温度を上昇させる。これによりメンブレン１３が軟化して押込みが容易となる。また、プレス板の代わりにローラを用いても良い。このように貫通孔１２にメンブレン１３が押し込まれることによりスポット領域１４が形成される。
図５は、本発明に用いられる生化学解析用ユニット１０の平面図である。複数のスポット領域１４が配列されたフロースルーエリア４１は略矩形をしており、フロースルーエリア４１内の各スポット領域１４は、所定の数ごとに輪郭が略矩形のブロック４２を１単位として規則的に区画されている。基板１１のサイズは、例えば、縦が７０ｍｍで横が９０ｍｍである。各ブロック４２のサイズは、例えば約４ｍｍ四方である。これらのブロック４２は、マトリックス状に配列されており、その数は、例えば、縦が１２個で横が１６個である。これらブロック４２のサイズ及び数、各スポット領域１４のサイズ及び配列ピッチなどのフロースルーエリア４１の形態は図示したものに限定されるものではない。また、生化学解析用ユニット１０の四方の隅には反応容器取付用孔４４が形成されている。なお、図５では各スポット領域１４はブロック４２単位で区画しているが、この区画で配列する形態に限定されず、例えばフロースルーエリア４１全域に渡って、各スポット領域１４を同じピッチで配列しても良い。
図６は、生化学解析用ユニット１０が収納されている反応容器２２の断面図である。反応容器２２は、上半部５１と下半部５２とからなる。上半部５１と下半部５２とには、それぞれ上ハウジング５１ａと下ハウジング５２ａとが形成されており、これらを組み合わせることで、チャンバー５３が構成される。各ハウジング５１ａ，５２ａの周辺には、生化学解析用ユニット１０を挟み込んで保持する保持部５６ａ，５６ｂが形成されている。チャンバー５３には、生化学解析用ユニット１０が収納されると共に特異的結合反応溶液２５が注入されている。また、チャンバー５３内の特異的結合反応溶液２５の温度調節を行うためにヒータ５４が取り付けられていることが好ましい。特異的結合反応溶液２５の温度調節を行うことで、せん断粘性率の調整を行ったり、反応時間の調整を行ったりすることが可能となる。
注入口２６及び排出口２７は、下ハウジング５２ａ、上ハウジング５１ａの中央部付近に設けられており、それらは、生化学解析用ユニット１０を取り付けたときにフロースルーエリア４１の中央部と対向するように配置されている。また、注入口２６から生化学解析用ユニット１０までの高さＨは、０．０２ｍｍ以上２０ｍｍ以下とすることが好ましく、より好ましくは０．２ｍｍ以上２ｍｍ以下とすることである。
上記構成のものを用いて間接標識法による反応方法の手順を示す。まず、抗原を含む反応溶液をチャンバーに注入してプローブと特異的結合反応させる。これにより、特異的結合反応を生じたスポット領域においては、抗原が残留する。この後、反応溶液を洗浄液で洗浄し、前記抗原と特異的結合する酵素標識抗体を含む抗体溶液をチャンバーに注入して、抗原抗体反応させる。抗原が残留したスポット領域においては、抗原と結合する酵素標識抗体が残留する。抗体洗浄液で抗体洗浄を行うと、抗原と結合した酵素標識抗体以外の抗体溶液が取り除かれる。この後、酵素標識抗体と、標識物質となる化学発光基質とを化学発光反応させる。標識物質としては、例えば、ＣＤＰ−ｓｔａｒ（登録商標）などの化学発光基質が使用される。酵素標識抗体は、化学発光基質を分解する。この分解により化学発光基質が発光する。
前記各溶液が、フロースルーエリアを通過する際に生じる圧力損失（Ｐａ）とフロースルーエリア全面に渡る流速分布（％）との関係を示すグラフを図７に示す。本発明においては、データ読み取り工程での信号のバラツキが±２０％以内とするために流速分布の許容値は５％以下とすることが好ましい。この場合に、図７から圧力損失が８００Ｐａ以上であれば良いことが分かり、より好ましくは１ｋＰａ以上とすることである。フロースルーエリア４１を通過する液の圧力損失を高めることで、注入口２６から注入される液（例えば、反応溶液，特異的結合反応溶液，洗浄液など）がフロースルーエリア４１の全面に拡がった後に該エリア４１を通過する。そのため、圧力損失は高いほど流速分布の低下（すなわち、流速が均一になる）が生じるために好ましい。しかしながら、圧力損失を高め過ぎると、リアクタ２１の全ての部材の耐圧性を高めたり、ポンプの送液能力を向上させたりする必要が生じてコスト高の原因となる。そこで、圧力損失値の上限は１ＭＰａとすることが本発明において好ましい。
抗原抗体反応を行う生化学解析用ユニットを用いた反応方法を例として本発明をより詳細に説明するが、本発明はこの実施形態に限定されるものではない。スポッティング工程において、生化学解析用ユニット１０の各スポット領域１４に異なる種類のプローブを点着して固定化する。なお、スポット領域１４に充填されているメンブレン１３の平均孔径は、０．１μｍ以上１０μｍ以下のものが好ましく用いられ、例えば０．４５μｍのものを用いる例が挙げられる。反応工程では、まずこの生化学解析用ユニット１０を反応容器２２にセットする。そして、注入口２６及び排出口２７に液導入管を接続して、タンク（図示しない）からチャンバー５３内に特異的結合反応溶液２５を注入する。チャンバー５３を特異的結合反応溶液２５で満たしエアー抜きを行った後に液導入管を循環パイプ２３に切り替えて注入口２６及び排出口２７を循環パイプ２３に切り替えて、注入口２６及び排出口２７に循環パイプ２３を接続する。なお、注入口２６と生化学解析用ユニット１０との高さＨは、２ｍｍとなるように配置されている。
特異的結合反応溶液（ハイブリダイゼーション反応溶液）２５には、リン酸バッファを用いる。なお、このハイブリダイゼーション反応溶液は、特異的結合を進行させるためにｐＨ（水素イオン指数）が略一定に保持される緩衝液であることがより好ましい。ハイブリダイゼーション反応溶液２５の液温を６８℃とし、チャンバー５３へ注入する。チャンバー５３は、ヒータ５４により６８℃に温度調整されている。ハイブリダイゼーション反応溶液の６８℃におけるせん断粘性率は、０．７３ｍＰａ・ｓであり、表面張力は、３１．５ｍＮ／ｍである。フロースルーエリア４１を通過するハイブリダイゼーション反応溶液の流速は１．７７ｍｍ／ｓであり、圧力損失は、約８０ｋＰａとなる。
ハイブリダイゼーション反応を行った後に、ハイブリダイゼーション洗浄工程を行う。ハイブリダイゼーション洗浄液をポンプ２４を用いてチャンバー５３に注入する。このときにチャンバー５３の温度は、６８℃に調整する。次に、ブロッキング工程を行う。ポンプ２４を用いてブロッキング剤をチャンバー５３に注入させる。このときにチャンバー５３の温度は、３７℃に調整する。
次に、抗原抗体反応工程を行う。抗原抗体反応溶液をポンプ２４を用いてチャンバー５３に注入する。このときにチャンバー５３の温度は、３７℃に調整する。さらに、抗体洗浄工程を行う。ポンプ２４を用いて抗体洗浄液をチャンバー５３に注入する。このときにチャンバー５３の温度は、３７℃に調整する。さらに、化学発光反応工程を行う。化学発光反応溶液をポンプ２４でチャンバー５３に注入する。このときにチャンバー５３の温度は、３７℃に調整する。
前記各工程でフロースルーエリア４１を通過する各液の圧力損失を約１０ｋＰａ〜８０ｋＰａとしているので、各スポット領域で均一に反応，洗浄が行われ良好な解析用データを得ることができる。
生化学解析用ユニットを使用した生化学解析方法の全体工程を示すフローチャートである。 生化学解析用ユニットの断面図である。 生化学解析用ユニットの製造手順を示す説明図である。 生化学解析用ユニットを製造する方法を説明するための図である。 生化学解析用ユニットの平面図である。 反応容器の断面図である。 フロースルーエリアの圧力損失と流速分布との関係を説明するグラフである。
符号の説明
１０ 生化学解析用ユニット
１４ スポット領域
２１ リアクタ
２５ 反応溶液
４１ フロースルーエリア

Claims (7)

  1. 試薬となるプローブが固定化され、検体となるターゲットを含む溶液が流動可能な複数のスポット領域が配列されたフロースルーエリアを備えた生化学解析用ユニットを、前記溶液が注入されるチャンバーに収容し、
    注入された前記溶液を前記スポット領域を通過するように流動させて前記プローブと前記ターゲットとを選択的に特異的結合反応させる生化学解析用ユニットを用いた反応方法において、
    前記溶液が前記フロースルーエリアを通過する際の圧力損失を１ｋＰａ以上１ＭＰａ以下とすることを特徴とする生化学解析用ユニットを用いた反応方法。
  2. 前記フロースルーエリアを通過する前記溶液の流速を０．１ｍｍ／ｓ以上２０ｍｍ／ｓ以下とすることを特徴とする請求項１記載の生化学解析用ユニットを用いた反応方法。
  3. 前記フロースルーエリアに備えられているメンブレンの空隙率が、５５％以上９０％以下のものを用いることを特徴とする請求項１または２記載の生化学解析用ユニットを用いた反応方法。
  4. 前記メンブレンの平均孔径が、０．１μｍ以上１０μｍ以下のものを用いることを特徴とする請求項３記載の生化学解析用ユニットを用いた反応方法。
  5. 前記溶液を前記チャンバーに注入する際の温度を２５℃以上８０℃以下とすることを特徴とする請求項１ないし４いずれか１つ記載の生化学解析用ユニットを用いた反応方法。
  6. 前記チャンバーの溶液注入口と前記生化学解析用ユニットとの高さを０．０２ｍｍ以上２０ｍｍ以下とすることを特徴とする請求項１ないし５いずれか１つ記載の生化学解析用ユニットを用いた反応方法。
  7. 前記チャンバー内の前記溶液の平均温度を２５℃以上８０℃以下とすることを特徴とする請求項１ないし６いずれか１つ記載の生化学解析用ユニットを用いた反応方法。
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