JP2004361340A

JP2004361340A - 生化学解析用ユニット及びこれを用いたプローブとターゲットの反応方法

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Publication number: JP2004361340A
Application number: JP2003162582A
Authority: JP
Inventors: Katsuaki Muraishi; 勝明村石
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 2003-06-06
Filing date: 2003-06-06
Publication date: 2004-12-24

Abstract

【課題】信頼性の高い生化学解析用データを得る。
【解決手段】生化学解析用ユニット１０は、検体となるターゲットが通過可能なスポット領域が多数形成されたフロースルータイプのものである。各スポット領域には、試薬となるプローブが点着される。この生化学解析用ユニット１０は、反応容器２２にセットされる。反応容器２２には、ターゲットを含む反応溶液を注入する注入口２６が設けられている。チャンバー５３内に注入された反応溶液は、多数のスポット領域が配列されたフロースルーエリア４１を通過して、排出口２７から排出される。排出された反応溶液は、循環パイプを介して再び注入口２６に注入される。フロースルーエリア４１の周辺には、ターゲットを通過させるダミーエリア４３ｂが形成されている。このダミーエリア４３ｂに反応溶液が流れ込み、フロースルーエリア４１の周縁付近の流れの淀みが解消される。
【選択図】図４

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡの塩基配列などの解析に用いられる生化学解析用ユニット及びこの生化学解析用ユニットを用いたプローブとターゲットの反応方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体由来物質、例えばＤＮＡの塩基配列の解析などの生化学解析を行うために、生化学解析用ユニットが使用される。生化学解析用ユニットは、基板に微細な貫通孔を複数形成し、これら各貫通孔内に多孔質材料等の吸着性物質を押し込むことで、複数の吸着性領域（以下、スポット領域と称する）を形成したものである。この生化学解析用ユニットを使用した生化学解析方法は、生化学解析用ユニットの複数のスポット領域に、試薬となる特異的結合物質（以下、プローブと称する）を点着して固定化するスポッティング工程と、スポット領域に検体となる特異的結合物質（以下、ターゲットと称する）を浸透させて特異的結合（プローブとターゲットとの結合）を生じさせる反応工程と、生化学解析用ユニットから、各スポット領域の特異的結合反応の結果を示す生化学解析用データを読み取るデータ読み取り工程と、読み取られた解析用データをパーソナルコンピュータなどで解析するデータ解析工程とを含む（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
プローブは、ターゲットの発現情報を調べるための試薬となるものであるから、分子構造、例えば、塩基配列や組成などが既知のものが使用される。プローブとしては、例えば、生体由来物質であるホルモン類，腫瘍マーカー，酵素，抗体，抗原，アブザイム，レセプタ，その他のタンパク質，リガンド，核酸，ｃＤＮＡ，ＤＮＡ，ＲＮＡなどであり、ターゲットと特異的結合が可能な物質である。ターゲットは、分子構造が未知のものであり、生体由来物質であるホルモン類，腫瘍マーカー，酵素，抗体，抗原，アブザイム，レセプタ，その他のタンパク質，リガンド，核酸，ｃＤＮＡ，ＤＮＡ，ｍＲＮＡなどを生体から抽出，単離して採取されたものや、この採取後に化学的処理が施されたものである。
【０００４】
塩基配列を調べる場合には、スポッティング工程において、生化学解析用ユニットの各スポット領域に、異なる種類のプローブが固定化される。そして、反応工程において、ターゲットを溶媒に溶かした溶液（以下、特異的結合反応溶液と称する）を各スポット領域に浸透させることで、ターゲットと、このターゲットと相補的な関係にあるプローブとを特異的結合させる。特異的結合が生じたことを検出するために、特異的結合反応溶液には、例えば、標識物質が付与される。この標識物質としては、例えば、放射線を放出する放射性物質が使用される。特異的結合を生じさせた後、生化学解析用ユニットは、洗浄されて、特異的結合が生じたスポット領域以外の部分に付着した特異的結合反応溶液が取り除かれる。
【０００５】
特異的結合が生じたスポット領域には、標識物質が残留するので、データ読み取り工程では、この標識物質からの放射線に基づいて、特異的結合の有無を検出する。データ読み取り装置としては、例えば、スキャナが使用されるが、光学情報を読み取るＣＣＤなどの撮像デバイスでは、放射線を直接読み取ることはできない。そこで、標識物質として放射性物質を使用する場合には、特異的結合が生じたスポット領域の放射線エネルギーを蓄積し、これを光学情報に変換する蓄積性蛍光体シートが使用される。蓄積性蛍光体シートには、放射線により露光される輝尽性蛍光体を含む領域（以下、輝尽性蛍光体領域と称する）が形成されている。この輝尽性蛍光体領域と、生化学解析用ユニットの各スポット領域とを重ね合わせると、特異的結合が生じたスポット領域では、標識物質からの放射線によって輝尽生蛍光体領域が露光される。この露光済みの輝尽性蛍光体領域に励起光を照射すると、該領域が発光するので、この光をスキャナで検出することにより、生化学解析用データが読み取られる。
【０００６】
ところで、特異的結合反応を生じさせる方式としては、従来は、振盪方式によって行われるのが一般的であった。振盪方式とは、特異的結合反応溶液と、プローブを固定化済みの生化学解析用ユニットとを、反応容器に入れ、振盪台上で反応容器をシェイクすることにより、反応容器内のターゲットを流動させて前記吸着性領域に浸透させる方式である。ところが、この振盪方式は、実験者が手で反応溶液を入れ替えするため、以下のような問題があった。第１に、前記反応溶液を、複数のスポット領域に均等に浸透させることが難しく、第２に、スポット領域へ浸透する圧力（しみこむ圧力）が低いため反応速度が遅い。反応結果が出るまでの時間は、短い場合でも十時間以上かかり、長いときには数日かかってしまうこともある。第３に、実験者が異なる場合はもちろん、同じ実験者であっても複数回の実験を行う場合には、反応容器への特異的結合反応溶液の出し入れ温度を均一にすることは難しく、実験条件にバラツキが生じ、実験の再現性に問題がある。
【０００７】
そこで、最近では、振盪方式に変えて、ピストンやポンプなどの機械的な動力を用いて反応容器内の反応溶液を流動させることにより、反応溶液をスポット領域の一方の側から他方の側へ通過させるフロースルー方式が使用されるようになってきている（例えば、特許文献２参照）。
【０００８】
フロースルー方式に用いられる反応容器は、生化学解析用ユニットを収容するとともに、特異的結合反応溶液が流し込まれる反応室（以下、チャンバーという）を備えている。チャンバーには、特異的結合反応溶液が注入される注入口と、スポット領域を通過した該反応溶液を排出する排出口とが設けられている。注入口及び排出口は、前記複数のスポット領域が配列されたフロースルーエリアの中央部と対向する位置に配置される。特異的結合反応溶液は、ポンプやピストンなどの機械的な動力により加圧されてチャンバーへ流し込まれる。このように特異的結合反応溶液は加圧されて流し込まれるので、スポット領域へ浸透する圧力が上昇し、反応速度を高めることができる。また、機械的な動力により一定圧がかかって流動されるから、実験条件にバラツキが生じることもない。
【０００９】
また、チャンバーの壁面は、流入口及び排出口から、生化学解析用ユニットの両端に向かうにつれて該ユニットに接近するようにテーパが形成されている。こうすることで、注入口から流し込まれた特異的結合反応溶液が、フロースルーエリアの全面に均等に流れるようにしている。
【００１０】
【特許文献１】
特開２００２−３５５０３６号公報
【特許文献２】
ＷＯ０１／４５８４３号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述したようにチャンバーの壁面にテーパをつけても、フロースルーエリアの周縁付近では、特異的結合反応溶液の流れに淀みが生じてしまう。このため、フロースルーエリアの全域に均等に特異的結合反応溶液が流れず、フロースルーエリアの各領域における流れ分布にバラツキが生じてしまう。この流れ分布のバラツキは、データ読み取りの際の信号ムラを招く。すなわち、フロースルーエリアの周縁に位置するスポット領域では、特異的結合反応溶液の流れに淀みが生じるため、中央部に位置するスポット領域と比較して、データ読み取り時の信号レベルが低下してしまう。このため、信頼性の高い解析用データを得ることができないという問題が生じる。
【００１２】
本発明は、信頼性の高い解析用データが得られる生化学解析用ユニット及びこれを用いたプローブとターゲットの反応方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の生化学解析用ユニットは、基板に形成された複数の微細な貫通穴に吸着性物質を圧入した複数のスポット領域を形成し、このスポット領域に試薬となるプローブを固定化した後、検体となるターゲットを含む反応溶液を流動させてプローブとターゲットを選択的に特異的結合反応させるフロースルータイプの生化学解析用ユニットにおいて、前記複数のスポット領域が配列されたフロースルーエリアの周辺に、前記プローブが固定されていないダミーエリアを形成したことを特徴とする。
【００１４】
前記フロースルーエリアは、略矩形をしており、前記ダミーエリアは、フロースルーエリアの四隅に形成されることが好ましい。
【００１５】
本発明の生化学解析用ユニットを用いたプローブとターゲットの反応方法は、試薬となるプローブが固定化されるともに、検体となるターゲットを含む反応溶液が流動可能な複数のスポット領域を配列したフロースルーエリアを備えた生化学解析用ユニットを、前記反応溶液が注入される反応容器に収容し、注入された前記反応溶液を前記フロースルーエリアを通過するように流動させてプローブとターゲットを選択的に特異的結合反応させる生化学解析用ユニットを用いたプローブとターゲットの反応方法において、前記反応溶液を、前記フロースルーエリアの中央部付近と対向する位置に配置された注入口から流し込み、この反応溶液の一部を、前記フロースルーエリアの周辺に形成され、前記プローブが固定されていないダミーエリアへ流し込むことを特徴とする。
【００１６】
なお、本発明において、試薬となるプローブと反応溶液中の検体となるターゲットを選択的に特異的結合させる反応としては、リガンド・レセプタ会合反応，抗原・抗体反応，ハイブリダイゼーション反応等を含んでいる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
図１に示すように、生化学解析用ユニット１０を使用した生化学解析方法は、スポッティング工程と、反応工程と、洗浄工程と、データ読み取り工程と、データ解析工程とを含む。生化学解析用ユニット１０は、基板１１に、微細な貫通孔１２をマトリックス状に複数形成し、各貫通孔１２に吸着性物質であるメンブレン１３を圧入して複数のスポット領域１４を形成したものであり、フロースルータイプのものである。
【００１８】
スポッティング工程では、スポッターを用いて、生化学解析用ユニット１０の各スポット領域１４に、異なる種類のプローブを含む溶液（以下、プローブ溶液という）を各々点着される。スポッターは、プローブ溶液を点着するスポットピン１６を備えている。スポットピン１６の先端には、割溝が形成されている。このスポットピン１６により、ウエルプレート上に分注された複数種類のプローブ溶液を吸い上げ、吸い上げられたプローブ溶液を各スポット領域１４に点着する。この後、各スポット領域１４に紫外線などを照射することによりプローブがスポット領域１４に固定される。
【００１９】
反応工程では、リアクタ２１を用いて、プローブと、検体となるターゲットとを反応させる。リアクタ２１は、反応容器２２，循環パイプ２３，ポンプ２４とからなる。反応容器２２は、生化学解析用ユニット１０を収容するとともに、ターゲットと標識物質を含む特異的結合反応溶液が注入される。本例において、標識物質としては、化学反応によって発光する化学発光物質が使用される。
【００２０】
特異的結合反応溶液は、反応溶液調製装置によって作られる。反応溶液調製装置は、標識物質が付与されたターゲットを溶媒に溶かし込み特異的結合反応溶液を調製する。調製された特異的結合反応溶液は、リアクタ２１に取り付けられたタンク（図示せず）に収容される。
【００２１】
反応容器２２には、特異的結合反応溶液を注入する注入口２６と、生化学解析用ユニット１０を通過した特異的結合反応溶液を排出する排出口２７とが設けられている。生化学解析用ユニット１０は、一方の面（図上、下面）が注入口２６と対向し、他方の面（図上、上面）が排出口２７と対向するように取り付けられる。反応容器２２に注入された特異的結合反応溶液は、図中、下面側から各スポット領域１４に浸透して、各スポット領域１４を透過して、図中上面側へ流動する。注入された特異的結合反応溶液は、各スポット領域１４に浸透するが、この浸透時に、ターゲットと相補的なプローブを有するスポット領域では、ターゲットとプローブとが特異的結合反応を生じる。各スポット領域１４を透過した特異的結合反応溶液は、排出口２７から反応容器２２外へ排出される。
【００２２】
注入口２６と排出口２７とは、循環パイプ２３に接続されており、反応容器２２から排出された特異的結合反応溶液は、循環パイプ２３及びポンプ２４介して、再び注入口２６へ送られて反応容器２２に再び注入される。また、特異的結合反応溶液や洗浄液を反応容器２２に注入したり、これらを排出する際には、注入口２６及び排出口２７には、液導入管又は液排出管が接続される。注入口２６及び排出口２７には、これら液導入管，液排出管，循環パイプ２３が切替え可能に接続される。
【００２３】
この反応工程の後、洗浄工程において、生化学解析用ユニット１０が洗浄されて、特異的結合反応を生じたスポット領域以外の部分から特異的結合反応溶液が取り除かれる。洗浄工程では、リアクタ２１を用いて、特異的結合反応溶液の代わりに、洗浄液を流動させることにより、洗浄が行われる。このように、洗浄液を流動させて洗浄を行うので、生化学解析用ユニット１０に付着している特異的結合しない特異的結合反応溶液を、効率的に剥離して、除去することが可能となり、洗浄効率が向上する。
【００２４】
なお、この洗浄効果をさらに向上させるためには、反応工程を実行する前に、生化学解析用ユニット１０にいわゆるブロッキング剤を浸透させておくことが好ましい。こうすれば、洗浄工程において、特異的結合反応しない反応溶液がより剥離しやすくなり洗浄効果がより向上する。このブロッキング剤と生化学解析用ユニット１０との浸透についても、洗浄液と同様に、リアクタ２１を用いて行うことが好ましい。このように、洗浄液やブロッキング剤についても、特異的結合反応溶液と同様に、機械的な動力を用いて流動させることで、異なる実験間での洗浄効率等を均一にすることができるので、より正確で、かつ再現性，定量性に優れた解析用データを得ることができる。
【００２５】
この洗浄工程を経た後、生化学解析用ユニット１０は、データ読み取り工程に送られる。データ読み取り工程では、スキャナ３１によって、生化学解析用ユニット１０から、生化学解析用データが光電的に読み取られる。
【００２６】
スキャナ３１は、標識物質から発光される光を受光してこれを光電変換するＣＣＤイメージセンサ３２を備えている。ＣＣＤイメージセンサ３２の受光面前方には、標識物質が発光する光をＣＣＤイメージセンサ３２の受光素子へ導くライトガイド３３が設けられる。ライトガイド３３は、各スポット領域１４の数に対応した複数本の光ファイバーから構成され、各光ファイバーの一端が前記受光面に、他端がスポット領域にそれぞれ対向するように配置される。特異的結合反応が生じたスポット領域では、標識物質が残留するから、光が発光されるが、特異的結合反応が生じないスポット領域では、光が発光しない。ＣＣＤイメージセンサ３２によって、こうした各スポット領域１４の特異的結合反応の結果を示す画像データが取得される。データ解析工程では、この画像データを生化学解析用データとして解析する。
【００２７】
図２は、生化学解析用ユニット１０の製造方法を示す説明図である。基板１１の材質としては、光の散乱を防止するために、光を減衰させる材質が好ましく、金属、セラミック、プラスチックなどが使用される。光の散乱を防止する趣旨は、あるスポット領域で発せられた光が、基板壁を透過して、隣接するスポット領域に到達することにより、発光していないスポット領域から光があたかも光が発せられているかのように見えてしまうという誤認識を防止することにある。光を減衰させる効率が高い材質を使用することで、誤認識が防止され、信頼性の高い解析用データが得られる。光の減衰率（スポット領域から発せられる光強度の低下率）は、あるスポット領域から発せられる光強度が、隣接するスポット領域においては、１／５以下になることが好ましく、１／１０以下になることがより好ましい。
【００２８】
図２（Ａ）に示すように、基板１１の厚みＴは、５０〜１０００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは１００〜５００μｍの範囲である。金属としては、銅、銀、金、亜鉛、鉛、アルミニウム、チタン、錫、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、タンタルなどを用いることができる。または、ステンレス鋼や黄銅などの合金も用いることができるが、必ずしもこれらに限定されない。また、セラミックとしては、アルミナ、ジルコニア、等があげられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００２９】
前記プラスチックとしては、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレンやポリプロピレンなど）、ポリスチレン、アクリル樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレートなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、含フッ素ポリマー（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレンなど）、含塩素フッ素ポリマー（例えば、ポリクロロトリフルオロエチレンなど）、ポリカーボネート、ポリエステル（例えば、ポリエチレンナフタレートやポリエチレンテレフタレートなど）、ポリアミド（例えば、ナイロン−６やナイロン−６６など）、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ケイ素樹脂（例えば、ポリジフェニルシロキサンなど）、フェノール樹脂（例えば、ノボラックなど）、エポキシ樹脂、ポリウレタン、セルロース類（例えば、酢酸セルロースやニトロセルロースなど）などが挙げられる。または、コポリマー（例えば、ブタジエン−スチレン共重合体など）、さらには前記プラスチックをブレンドしたものも挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００３０】
プラスチックを基板材料に用いると貫通孔の形成が容易となり好ましいが、光の減衰が生じ難い場合もある。そこで、光をより一層減衰させるために、プラスチックに、金属酸化物粒子やガラス繊維などの粒子を充填して、これらをプラスチック内部に分散させることが好ましい。金属酸化物粒子としては、二酸化ケイ素、アルミナ、二酸化チタン、酸化鉄、酸化銅などがあげられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００３１】
貫通孔１２の形成方法は、パンチング法、放電パルス法、食刻技術法（フォトリソグラフィー法），電解エッチング法，エキシマレーザー及びＹＡＧレーザーなどのレーザーを基板に照射する方法などがあるがこれらに限定されるものではない。これら各形成方法は、基板の材料等に応じて適宜選択される。
【００３２】
貫通孔１２の密度を高めるために、貫通孔の開口部の面積は、５ｍｍ^２未満であることが好ましく、より好ましくは１ｍｍ^２未満であり、０．３ｍｍ^２未満がより好ましく、０．０１ｍｍ^２未満がさらに好ましい。そして、最も好ましくは０．００１ｍｍ^２以上である。また、貫通孔の孔形状を略円形とした場合には、その直径Ｄが、２００μｍ〜３００μｍであることが好ましい。
【００３３】
貫通孔１２の配列ピッチ（隣接する二つの孔の中心から中心までの距離）Ｐは、５０μｍ〜３０００μｍの範囲が好ましく、隣接する２つの貫通孔１２の端部から端部までの距離Ｌは、１０μｍ〜１５００μｍの範囲とすることが好ましい。また、貫通孔１２の密度は、１０個／ｃｍ^２以上が好ましく、１００個／ｃｍ^２以上がより好ましく、さらに好ましくは５００個／ｃｍ^２以上、さらに最も好ましくは１０００個／ｃｍ^２以上１００００個／ｃｍ^２以下の範囲である。
【００３４】
図２（Ｂ）は、生化学解析用ユニット１０の製造手順を示す。基板１１に貫通孔１２が形成された後、基板１１には、洗浄効果を高めるために、表面処理が施される。基板１１の材料に金属，合金（例えば、ステンレス鋼など）を用いた際には、コロナ放電，プラズマ放電または陽極酸化法などの少なくともいずれかの方法により表面処理が施される。この表面処理によって基板１１には、表面処理層が形成されるが、この表面処理層は、カルボニル基，カルボキシル基などの極性基が導入され、親水性である金属酸化膜の層となる。
【００３５】
表面処理が施された後、基板１１のメンブレン１３が圧入される面に接着剤が塗布される。なお、接着剤を塗工する方法は、特に限定されるものではないが、ロール塗布，ワイヤーバー塗布，ディップ塗布，ブレード塗布，エアナイフ塗布などにより行なうことができる。接着剤には、スチレンブタジエンゴム，アクリロニトリルブタジエンゴムが好ましく用いられるが、これらに限定されるものではない。なお、余剰の接着剤は、ブレードにより掻き落としたり、レーザー光の照射により熱分解させて除去する方法などにより行なうことが後の工程で不純物の発生を防止するために好ましい。なお、本発明において、基板の表面処理、接着剤の塗工の工程は省略することもできる。
【００３６】
接着剤が塗布された後、メンブレン１３が圧入される。メンブレン１３には、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して用いることもできる。本発明において用いられるメンブレン１３は、多孔質材料（有機，無機，有機／無機）、繊維材料（有機，無機）のいずれでもよく、それらを混合して用いても良い。メンブレン１３の厚さは特に限定されないが、１００μｍ〜２００μｍ（０．１０ｍｍ〜０．２０ｍｍ）の範囲のものを用いることが好ましい。また、体積空隙率Ｃが、１０％〜９０％の範囲のものを用いることが好ましく、空隙を構成する微細孔の平均孔径は０．１μｍ〜５０μｍの範囲にあるものを用いることが好ましい。体積空隙率Ｃは、吸着性材料の見掛け体積に対する無数の孔の体積和の百分率で示される。
【００３７】
有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、ポリマーを用いることが好ましい。ポリマーとしては、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロースなど）、脂肪族ポリアミド類（例えば、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン４，１０など）、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素樹脂類（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオライドなど）、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体（例えば、アルギン酸、アルギン酸カルシウム、アルギン酸／ポリリシンポリイオンコンプレックスなど）、コラーゲンなどがあげられ、これらポリマーの共重合体や複合体（混合体）も用いることができる。なお、本発明においては、多孔質としたナイロンを用いることが吸水性の点から好ましい。
【００３８】
無機多孔質材料も、特に限定されるものではないが、好ましくは、金属（例えば、白金、金、鉄、銀、ニッケル、アルミニウムなど）、金属等の酸化物（例えば、アルミナ、シリカ、チタニア、ゼオライトなど）、金属塩（例えば、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムなど）及びこれらの複合体などが挙げられる。また、活性炭などの炭素多孔質材料も好ましく用いられる。
【００３９】
また、有機繊維材料，無機繊維材料も特に限定されるものではない。例えば、前記セルロース誘導体類、脂肪族ポリアミド類などの有機繊維材料や、ガラス繊維、金属繊維などの無機繊維材料を用いることができる。また、メンブレン１３の強度を高めるため、多孔質材料を溶解する溶媒に不溶な繊維材料を混合させても良い。
【００４０】
図２（Ｃ）は、メンブレン１３の圧入方法を示す。基板１１とメンブレン１３とを重ね合わせて上下からプレス板３６，３７により間欠的にプレスする。なお、メンブレン１３に有機多孔質材料及び／または有機繊維材料を用いているときには、プレス板３６を加熱して、これを基板１１に浸透させることで基板１１の温度を上げる。これにより、メンブレン１３が軟化して押込みが容易となる。また、プレス板の代わりにローラを用いてもよい。こうして、貫通孔１２にメンブレン１３が押し込まれることによりスポット領域１４が形成される。
【００４１】
図３は、生化学解析用ユニット１０の平面図である。複数のスポット領域１４が配列されたフロースルーエリア４１は略矩形をしており、フロースルーエリア４１内の各スポット領域１４は、所定の数毎に、輪郭が略矩形のブロック単位で規則的に区画されている。基板１１のサイズは、例えば、縦が７０ｍｍで、横が９０ｍｍである。各ブロック４２のサイズは、例えば、約４ｍｍ四方である。これらのブロック４２は、マトリックス状に配列されており、その数は、例えば、縦が１２個で横が１６個である。これらブロックのサイズ及び数，各スポット領域１４のサイズ及び配列ピッチなどのフロースルーエリアの仕様は、スキャナの仕様と対応するように規定される。符号４４は、生化学解析用ユニット１０を反応容器２２に取り付ける際の位置決め穴である。なお、本例では、各スポット領域１４をブロック単位で区画しているが、こうした区画はしなくてもよく、例えば、フロースルーエリア４１全域に渡って、各スポット領域１４を同じピッチで配列してもよい。
【００４２】
フロースルーエリア４１の周辺には、ダミーエリア４３ａ，４３ｂが設けられている。ダミーエリア４３ａ，４３ｂは、特異的結合反応溶液が流動可能なエリアであるが、プローブが固定されないエリアである。ダミーエリア４３ａ，４３ｂは、基板１１に開口４５ａ，４５ｂを形成し、この開口４５ａ，４５ｂに、貫通孔１２と同様にメンブレン１３を圧入することにより形成される。開口４５ａは、フロースルーエリア４１の四隅に略Ｌ字型に形成される。開口４５ｂは、フロースルーエリア４１の各辺の近傍に略一文字型に形成される。
【００４３】
このダミーエリア４３ａ，４３ｂには、プローブは点着されないので、特異的結合反応は生じない。ダミーエリア４３ａ，４３ｂを設ける目的は、フロースルーエリア４１の周縁部での特異的結合反応溶液の流れの淀みをなくすためである。このダミーエリア４３ａ，４３ｂに特異的結合反応溶液の一部を流し込むことで、前記周縁部における淀みが解消するようにしている。しかし、開口４５ａ，４５ｂが形成されるだけでは、ダミーエリア４３ａ，４３ｂに前記反応溶液が流れすぎてしまい不都合が生じる場合があるので、ダミーエリア４３ａ，４３ｂへの流量を制限する抵抗体として、開口４５ａ，４５ｂにはメンブレン１３が圧入される。したがって、開口４５ａ，４５ｂに圧入される抵抗体は、メンブレン１３のような吸着性物質に限定されるものではなく、反応溶液の流量を制限できる物質であれば他の物質を使用してもよい。
【００４４】
図４は、反応容器２２の断面図であり、図５は、反応容器２２の分解斜視図である。反応容器２２は、上半部５１及び下半部５２とからなる。上半部５１及び下半部５２には、それぞれ略四角錐形の上ハウジング５１ａ及び下ハウジング５２ａが形成されており、これらを組み合わせることで、断面が略菱形のチャンバー５３が構成される。各ハウジング５１ａ，５２ｂの周辺には、生化学解析用ユニット１０を挟み込んで保持する保持部５１ｂ，５２ｂが形成されている。チャンバー５３には、生化学解析用ユニット１０を収容するとともに、特異的結合反応溶液が注入される。
【００４５】
下半部５２には、生化学解析用ユニット１０の各位置決め穴４４に挿入される位置決めピン５４が突設されている。符号５６ａ，５６ｂは、チャンバー５３を密閉するためのパッキンである。生化学解析用ユニット１０を反応容器２２に取り付ける際には、パッキン５６ｂ，生化学解析用ユニット１０，パッキン５６ａの順に下半部５２の位置決めピン５４に取り付けた後、上半部５１を被せる。この後、上半部５１及び下半部５２を固定する。これにより、生化学解析用ユニット１０が上半部５１及び下半部５２に挟持されて反応容器２２に固定される。また、上半部５１と下半部５２とをヒンジを介して接続して開閉自在にしてもよい。
【００４６】
注入口２６及び排出口２７は、上下の各ハウジング５１ａ，５２ａの頂点付近に設けられており、それらは、生化学解析用ユニット１０を取り付けた時に、フロースルーエリア４１の中央部と対向するように配置される。上下の各ハウジング５１ａ，５２ａは、略四角錐形に形成されているから、各ハウジング５１ａ，５２ａの壁面は、フロースルーエリア４１の端部に向かうにつれて該ユニット１０に接近する。このように、各ハウジング５１ａ，５２ａの壁面に傾斜をつけることで、注入口２６からチャンバー５３内に流入した特異的結合反応溶液をフロースルーエリア４１の端部側にスムーズに流し、それがフロースルーエリア４１の全域に均等に行き渡るようにしている。
【００４７】
さらに、フロースルーエリア４１の周辺に、ダミーエリア４３ａ，４３ｂを設けたことで、フロースルーエリア４１の端部付近における特異的結合反応溶液の流れの淀みが解消される。このため、従来と比較して、特異的結合反応溶液の端部側への流れがよりスムーズになり、フロースルーエリア４１の端部付近のスポット領域１４と、中央付近のスポット領域１４とにおいて、それぞれに浸透する圧力をほぼ均等にすることができる。
【００４８】
なお、各ハウジング５１ａ，５２ａの形状を、略四角錐形とした例で説明したが、生化学解析用ユニット１０の形状が、例えば、円板形状であれば、略円錐形となる。
【００４９】
以下、上記構成による作用を説明する。スポッティング工程において、生化学解析用ユニット１０の各スポット領域１４に、異なる種類のプローブを点着して固定化する。反応工程では、まず、この生化学解析用ユニット１０を、反応容器２２にセットする。そして、注入口２６及び排出口２７に液導入管を接続して、タンクからチャンバー５３内に特異的結合反応溶液を注入する。チャンバー５３を特異的結合反応溶液で満たしエアーを抜いた状態で、液導入管を循環パイプ２３に切り替えて、注入口２６及び排出口２７を循環パイプ２３に接続する。
【００５０】
ポンプ２４を駆動すると、特異的結合反応溶液は、加圧された状態でチャンバー５３に流入する。チャンバー５３に流入した特異的結合反応溶液は、フロースルーエリア４１の中央部に向かって流れるとともに、下ハウジング５２ａの壁面に沿って端部側へも流れる。端部側に流れた特異的結合反応溶液の一部は、ダミーエリア４３ａ，４３ｂに流入して、生化学解析用ユニット１０を通過して、上ハウジング５２ｂ内に進入する。これにより、フロースルーエリア４１の端部付近での流れの淀みが解消されて、フロースルーエリア４１の周縁のスポット領域１４においても、中央部とほぼ均等な浸透圧が得られる。
【００５１】
こうした特異的結合反応溶液の流動により、ターゲットと相補的な関係を有するプローブが固定化されたスポット領域１４においては、特異的結合反応が生じる。他方、ターゲットと相補的な関係に無いプローブが固定化されたスポット領域１４においては、特異的結合反応が生じない。
【００５２】
反応工程が終了すると、循環パイプ２３が液排出管に切り替えられて、注入口２６及び排出口２７に液排出管が接続され、反応容器２２から特異的結合反応溶液が排出される。その後、液排出管を液導入管に切り替えて反応容器２２に洗浄液を注入する。チャンバー５３を洗浄液で満たした状態で、液導入管から循環パイプ２３に切り替えられる。そして、ポンプ２４を駆動して、洗浄液を流動させて、生化学解析用ユニット１０を洗浄する。洗浄液を強制的に流動させるから、特異的結合反応が生じたスポット領域１４以外に付着した特異的結合反応溶液を効果的に剥離して、除去することができる。洗浄工程が終了すると、循環パイプ２３から液導入管に切り替えられて、チャンバー５３から洗浄液が排出される。こうした洗浄サイクルを何回か繰り返した後、反応容器２２から生化学解析用ユニット１０が取り外される。
【００５３】
反応容器２２から取り外された生化学解析用ユニット１０は、データ読み取り工程に送られる。データ読み取り工程では、標識物質である化学発光物質を発光させる。特異的結合反応が生じたスポット領域１４には化学発光物質が残留しているから、特異的結合反応が生じたスポット領域１４は発光し、特異的結合反応が生じないスポット領域１４は発光しない。この光の有無をスキャナによって検出することで、生化学解析用データが読み取られる。前記ダミーエリア４３ａ，４３ｂを設けたことで、フロースルーエリア４１の全域に渡って均等な流れ分布が得られるから、信号ムラのない信頼性の高い解析用データを得ることができる。データ解析工程では、前記生化学解析用データに基づいて、解析が行われる。
【００５４】
上記実施形態では、フロースルーエリアの四隅近傍に形成されるＬ字形のダミーエリアに加えて、各辺の近傍に一文字形のダミーエリアを設けた例で説明したが、図６に示す生化学解析用ユニット６１のように、一文字形のダミーエリアはなくてもよく、Ｌ字形のダミーエリア４３ａだけでもよい。フロースルーエリア４１が略矩形の場合には、四隅での淀みが特に大きいので、四隅にだけダミーエリアを設けても、十分な効果を期待できる。また、ダミーエリアは、Ｌ字形や一文字形でなくてもよく、他の形状でもよいし、そのサイズも適宜選択することができる。
【００５５】
図７の生化学解析用ユニット７１は、ダミーエリア７２（図上、ハッチングで示す）を、フロースルーエリア４１と同様に、複数のブロック７４から構成した例である。各ブロック７４は、貫通孔と同じ大きさ及び形状で形成された複数の開口７３から構成される。各開口７３には、前記抵抗体としてメンブレン１３が圧入される。各開口７３は、例えば、各スポット領域１４と同じ配列ピッチで配列される。各ブロック７４は、フロースルーエリア４１の周囲に配列される。ブロック７４と、フロースルーエリア４１の外周との距離は、各ブロック４２の間隔よりも長くしている。もちろん、ダミーエリアをブロックに区画しなくてもよいし、ダミーブロック７２の外周との距離を、各ブロック４２の間隔と同じにしてもよい。また、ブロック７４を構成する開口７３の数は、この例に限られず適宜選択される。
【００５６】
また、上記実施形態では、標識物質として、化学発光物質を使用した例で説明している。標識物質としては、蛍光物質や、従来技術において説明した放射性物質を使用してもよい。
【００５７】
また、標識方法としては、これら標識物質を直接ターゲットに付与し、特異的結合反応溶液に含ませて検出する直接検出標識法の他に、間接検出標識法を使用してもよい。間接検出標識法の一例としては、特異的結合反応溶液中に標識物質を含ませずに、プローブとターゲットとを反応させ、この後、スポット領域においてプローブと特異的結合反応を生じたターゲットに、標識物質が付与された特異的結合物質を結合させることでターゲットを標識させる方法がある。この間接検出標識法は、スポット領域に固定されたプローブと、標識物質が付与された特異的結合物質とによってターゲットを挟み込むようにすることから、サンドイッチ法と呼ばれる。
【００５８】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明は、試薬となるプローブが固定化されるともに、検体となるターゲットを含む反応溶液が流動可能な複数のスポット領域を配列したフロースルーエリアを備えた生化学解析用ユニットを、前記反応溶液が注入される反応容器に収容し、注入された前記反応溶液が前記フロースルーエリアを通過するように流動させてプローブとターゲットを選択的に特異的結合反応させる際に、前記反応溶液を、前記フロースルーエリアの中央部と対向する位置に配置された注入口から流し込み、この反応溶液の一部を、フロースルーエリアの周辺に形成され、前記プローブが固定されていないダミーエリアへ流し込むことで、フロースルーエリアの周縁に生じる流れの淀みを解消するようにしたから、信頼性の高い生化学解析用データを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】生化学解析用ユニットを使用した生化学解析方法の全体工程を示すフローチャートである。
【図２】生化学解析用ユニットの製造手順を示す説明図である。
【図３】生化学解析用ユニットの平面図である。
【図４】反応容器の断面図である。
【図５】反応容器の分解斜視図である。
【図６】生化学解析用ユニットの別の例を示す説明図である。
【図７】生化学解析用ユニットのさらに別の例を示す説明図である。
【符号の説明】
１０生化学解析用ユニット
１２貫通孔
１３メンブレン
１４スポット領域
２１リアクタ
２２反応容器
２３循環パイプ
４１フロースルーエリア
４２ブロック
４３ａ，４３ｂダミーエリア
５１上半部
５１ａ上ハウジング
５２下半部
５２ａ下ハウジング
５３チャンバー

Claims

基板に形成された複数の微細な貫通穴に吸着性物質を圧入した複数のスポット領域を形成し、このスポット領域に試薬となるプローブを固定化した後、検体となるターゲットを含む反応溶液を流動させてプローブとターゲットを選択的に特異的結合反応させるフロースルータイプの生化学解析用ユニットにおいて、
前記複数のスポット領域が配列されたフロースルーエリアの周辺に、前記プローブが固定されていないダミーエリアを形成したことを特徴とする生化学解析用ユニット。
前記フロースルーエリアは、略矩形をしており、前記ダミーエリアは、フロースルーエリアの四隅に形成されることを特徴とする請求項１記載の生化学解析用ユニット。
試薬となるプローブが固定化されるともに、検体となるターゲットを含む反応溶液が流動可能な複数のスポット領域を配列したフロースルーエリアを備えた生化学解析用ユニットを、前記反応溶液が注入される反応容器に収容し、注入された前記反応溶液を前記フロースルーエリアを通過するように流動させてプローブとターゲットを選択的に特異的結合反応させる生化学解析用ユニットを用いたプローブとターゲットの反応方法において、
前記反応溶液を、前記フロースルーエリアの中央部付近と対向する位置に配置された注入口から流し込み、この反応溶液の一部を、前記フロースルーエリアの周辺に形成され、前記プローブが固定されていないダミーエリアへ流し込むことを特徴とする生化学解析用ユニットを用いたプローブとターゲットの反応方法。