JP2004535204A - 遺伝子発現の標的化阻害のための合成二本鎖オリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、少なくとも部分的に二本鎖であり、少なくとも1つの3′末端に2′5′−結合オリゴヌクレオチド残基を有する新規のオリゴヌクレオチド誘導体、および、遺伝子発現の特異的阻害に関するそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
合成核酸を用いて遺伝子発現を阻害することがますます重要になりつつある。これら合成核酸(オリゴヌクレオチド)の典型的な代表例としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、DNA酵素および外部ガイド配列(EGS)がある。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ワトソン−クリック塩基対を介して相補メッセンジャーリボ核酸(mRNA)に結合し、その対応するタンパク質への翻訳を阻害する短い一本鎖核酸誘導体のことである。ほとんどの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞性リボヌクレアーゼH(RNアーゼH)によりサポートされるメカニズムに従った作用を示し、多数の研究でこれに関する証拠が示されている。全ての細胞に存在するRNアーゼHは、二本鎖DNAおよびRNAを認識し、1つのホスホジエステル結合、またはほとんどの場合において2以上のホスホジエステル結合を加水分解することにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的なmRNAを切断する。RNアーゼHの活性化が起こるようにオリゴヌクレオチドを改変する方法が知られており、例えば、Uhlmann(2000)Curr.Opin.Drug Discov.Dev.3,203-213に説明されている。合成リボザイムは、その配列中にこのヌクレアーゼ活性を有する。最も一般的なタイプのリボザイムは、「ハンマーヘッド型」リボザイムであり、これは、天然に存在するリボザイムから誘導されたコンセンサス配列GAAACがRNアーゼ部分を形成し、フランキング配列がアンチセンスオリゴヌクレオチド部分を形成する。しかしながら、天然に存在するリボザイムモチーフから誘導されていないが、インビトロでの選択で発見されたDNA酵素が、同様に作用する。EGSは、細胞性RNアーゼPを活性化し、適切なフランキング配列を介して標的mRNAに結合し、特異的mRNA分解を誘導する合成RNA類似体である。上述した全てのオリゴヌクレオチド誘導体は、RNA結合部分が一本鎖であり、標的mRNAとの相互作用により配列特異的な方法で遺伝子発現を阻害するように用いられる。
【0003】
また、転写因子の結合領域を模倣した「デコイ」(decoy)オリゴマーを用いて特定のタンパク質と相互作用することによって遺伝子発現を阻害することも可能である。デコイ物質を用いた処理により、配列特異的な方法で特定のタンパク質、特に転写因子を妨害し、それにより転写活性化を妨げることが可能になる。
【0004】
最後に、DNAレベルで作用するオリゴヌクレオチド誘導体がある。このオリゴヌクレオチド誘導体としては、三重鎖形成オリゴヌクレオチド(アンチジーンオリゴヌクレオチド)が挙げられる。「アンチジーンオリゴヌクレオチド」は、フーグスティーン型塩基対を介してDNA二重らせんの主溝(large groove)で結合して三重らせんを形成し、それにより遺伝子転写の配列特異的阻害を起こす。細胞内で作用するオリゴヌクレオチド誘導体の他のグループであるキメラプラストは、特異的遺伝子の補正に用いられる。
【0005】
合成オリゴヌクレオチドを用いる遺伝子発現の阻害に関する共通の問題は、有効な配列を同定するために、標的核酸の様々な領域に対する相当数のオリゴヌクレオチドを常に分析する必要があることである。その上、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば、非効率的または不完全にしか遺伝子発現を阻害できない。その上、配列非特異的な副作用が観察されており、これは、約5塩基の長さの比較的短い部分配列でもRNアーゼHを活性化するという事実により引き起こされるのかもしれない。これは例えば、「Woolf et al.(1992).Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.89.7305-7309」で示される。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドとタンパク質との相互作用により生じる副作用も存在する。
【0006】
近年、遺伝子発現の抑制に二本鎖RNAを使用することが説明されている。二本鎖RNA(dsRNA)とは、特定の細胞および生物においてRNA干渉(RNAi)として知られるプロセスに従ったmRNAの配列特異的分解を誘導するシグナルである。RNAi現象は、多数の異なる生物、例えば、C.elegans、ハエ、菌類、植物およびマウス胚などで観察されている。RNAiは、植物で発見された転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)と非常に類似しているか、または同一であると考えられている。500塩基対(bp)を超過する長さのdsRNA(そのセンス鎖配列は阻害しようとする標的mRNAと同一である)を単に注射することにより、対応するDNA配列を有する標的遺伝子の発現を特異的に阻害することができる。これは、非相同遺伝子の発現を損なわず、標的遺伝子の塩基配列は改変されない。RNAiは、dsRNAがまず比較的小さい断片に分解され、続いてその断片が標的mRNAの配列特異的分解に用いられると推測される転写後プロセスである。二本鎖ヌクレアーゼ活性に加えて、ATP依存性ヘリカーゼ活性も議論されている。しかしながら、このプロセスの詳細なメカニズムはわかっていない。植物における研究によれば、約25個のヌクレオチド長の小さいdsRNA断片がRNAiの「活性種」を代表しており、この断片が標的RNAの配列特異的な認識を細胞性リボヌクレアーゼに移すことが示されている。
【0007】
dsRNAにより遺伝子発現を抑制する効率は、前記dsRNAの断片長が減少するほど徹底的に低下する。従って、400〜540bpのdsRNAは非常に効果的に遺伝子発現を阻害するが、一方で、200〜300bpのdsRNAはそれほど効率的ではなく、50〜100bpのdsRNAは少しも効果がないことが見出された。ごく最近、結局のところ、長さが26〜81bpの小さいdsRNA断片がRNAi様プロセスを生じさせることができることが見出された。しかしながら、観察された阻害は、長いdsRNA断片の場合よりも実質的に弱いようである。717bpのdsRNAにより生じる阻害が、長さが200bp未満のdsRNAによる阻害よりも非常に顕著であった。26bpのdsRNAの活性は、81bpのdsRNAよりも約250倍低かった。その上、異なる27bpのdsRNAが全く不活性であったことから、阻害は配列依存性であった。
【0008】
Elbashir et al.Nature(2001)411,494によれば、21個のヌクレオチドを含む二本鎖RNAによる細胞培養中での遺伝子発現阻害が説明されている。対応するdsRNA分子は、両方の鎖の3′末端に、ウラシルまたはチミン塩基のいずれかを有する2つの3′5′−結合ヌクレオチドのオーバーハングを有する。著者等はまた、2′5′−オリゴアデニレート活性化リボヌクレアーゼプロセスにより、標的RNAの内因性の配列非特異的分解が生じることを特筆している。しかしながら、阻害がうまくいくかどうかは用いられる細胞系に強く依存するという明らかな不利益がある。
【0009】
これまでに、主に長さが100bpを超えるdsRNAを用いて遺伝子発現を効率的に阻害していた。この比較的長いdsRNAは、対応するDNAからの適切な転写系を介したインビトロまたはインビボ転写によってのみ利用可能である。長いdsRNAを用いるRNAiのその他の制限は、C.elegans、ゼブラフィッシュ、植物、特定のタイプの菌類、ショウジョウバエ、マウスの卵母細胞および胚のような特定の生物でのみdsRNAによる配列特異的阻害が可能であり、一方で、ほとんどの動物細胞は、dsRNAで処理するとアポトーシスを起こすということである。長いdsRNAでも、配列相同性が70〜90%である場合は遺伝子発現を阻害する。この理由のために、高い配列相同性を有する遺伝子ファミリーの場合、複数の完全に相同ではない遺伝子の発現を同時に阻害することにより、表現型の誤訳(misinterpretation)を起こすことが可能である。
【0010】
dsRNA、例えばdsRNAウイルスを用いた細胞の処理は、一般的に、アポトーシスプロセス、または、2′5′−オリゴアデニレート−シンターゼ活性の誘導によるmRNAの配列非特異的分解を生じさせる。感染した細胞は、ウイルスのdsRNAに反応して、異常な2′5′−ホスホジエステル−インターヌクレオシド結合を有する三量体または四量体アデニレート(2′5′−A)を合成する。2′5′−Aは、その5′末端で細胞性キナーゼによりリン酸化され、続いてRNアーゼLと呼ばれるヌクレアーゼを活性化する。また、2′5′−Aを化学合成し、細胞に導入することもできる(Torrence et al.(1994)Curr.Med.Chem1,176-191)。しかしながら、合成2′5′−Aは、それらが5′−リン酸または5′−三リン酸型に変換された場合にのみRNアーゼLを活性化する。続いて、5′−p−2′5′−A(pは、リン酸、二リン酸または三リン酸)により活性化されたRNアーゼLは、配列非特異的な方法で細胞の全てのRNAを分解する。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドと5′−p−2′5′−A残基との結合体により、遺伝子発現を配列特異的に阻害することが可能であることが示された。しかしながら、この目的に関して、2′5′−A残基の5′末端は、オリゴヌクレオチドに結合するのではなく、リン酸または三リン酸として存在することが必須である(Torrence et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U. S. A.90,1300-4)。その上、標的RNAが認識するオリゴヌクレオチド部分(アンチセンス部分)は、一本鎖形態でなければならない。上述した理由のために、結果として遊離の5′−リン酸または三リン酸機能を有さない2′5′−A残基をそれらの3′末端に有するオリゴヌクレオチドは、これまで、遺伝子発現の阻害剤として説明されていない。一本鎖の5′−リン酸化5′−p−2′5′−Aアンチセンスオリゴヌクレオチド結合体による遺伝子発現の阻害は、アンチセンス原理のバリエーションであり、それゆえに、アンチセンス−オリゴヌクレオチドアプローチの制限にもさらされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
近年、新しい遺伝子の機能研究(機能ゲノミクス)のためのツールとして、オリゴヌクレオチドがますます用いられつつある。未知の機能を有するタンパク質をコードする新しい遺伝子の遺伝子発現を配列特異的に阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの使用は、一般的に、配列が異なる多種多様なオリゴヌクレオチドを分析しなければならないためにより困難になり、これは、特にハイスループットプロセスにおいて不利である。
【0012】
それゆえに、本発明の目的は、通常の方法および薬剤の上述の制限を回避する、顕著に改善された遺伝子発現の阻害が可能な新規の化学修飾されたオリゴヌクレオチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明によれば、この目的は、少なくとも部分的に二本鎖であり、少なくとも1つの3′末端に2′5′−結合オリゴヌクレオチド残基を有する新規のオリゴヌクレオチド誘導体によって達成される。新規のオリゴヌクレオチド誘導体の配列は、1つの鎖において、RNA配列(その翻訳が阻害され得る)に相補的であり、他方の鎖において、阻害され得るRNAに対応する。従って、RNA二本鎖は、遺伝子(その発現が阻害され得る)の塩基配列に対応し、ここで、デオキシリボヌクレオチドが対応するリボヌクレオチドで置換され、チミジンがウリジンで置換される。
【0014】
従って、本発明は、式Iで示される二本鎖核酸誘導体を提供する。
【化1】
式中、NおよびN′は、少なくとも部分的に互いに相補的な天然に存在する、または天然に存在しないヌクレオチドであり、少なくとも1つのヌクレオチド鎖(N)xまたは(N′)yは、標的遺伝子またはそれに対応するRNAに対して相補的または部分的に相補的であり、
xおよびyは、互いに独立して、10〜100、好ましくは15〜45、特に好ましくは16〜25であり、
nは、0〜20、好ましくは2〜10、特に好ましくは3〜6であり、
mは、0〜20、好ましくは2〜10、特に好ましくは3〜6であり、
pは、0〜20、好ましくは0〜5であり、
WおよびZは、3′5′または2′5′インターヌクレオシド結合を介して結合した天然に存在する、または天然に存在しないヌクレオチドであり、
Liは、2つのヌクレオチド鎖を共有結合させるリンカーであり、
少なくとも2つの残基ZまたはWは、2′5′インターヌクレオシド結合を介して結合され、一本鎖形態で存在し、mおよびnは同時に0ではない。
【0015】
好ましくは、相同標的RNAが以下の配列パターンである式Iで示されるオリゴヌクレオチドである:
5′−(U)v−(N)z−(U)w
5′−(U)v−(N)z−UX
5′−UX−(N)z−UX、および、
5′−(U)v−(N)z
式中、vおよびwは、互いに独立して、2〜20、好ましくは2〜10、特に好ましくは2〜6であり、
zは15〜25、好ましくは16〜23、特に好ましくは19〜21であり、
Uはウリジンであり、NはA、G、CまたはUであり、XはA、GまたはCであり、好ましくはAである。
【0016】
発現が阻害され得る遺伝子が、例えば、以下のDNA配列:
5′−TTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTG(配列番号1)
または、以下のRNA配列:
5′−UUUUGAAGCGAAGGUUGUGGAUCUG(配列番号2)
を含む場合、標的RNAは、以下の配列パターン:
5′−(U)v−(N)z−UX
(式中、vは4であり、zは19であり、XはGである)を有する。
【0017】
その上、好ましくは、1またはそれ以上のホスホジエステル結合が、例えばホスホロチオエート結合またはN3′,P5′−ホスホロアミデート結合で置換された式Iで示されるオリゴヌクレオチドである。特に好ましくは、1またはそれ以上のホスホジエステル結合がホスホロチオエート残基で置換された式Iで示されるオリゴヌクレオチドである。特に、いくつかのピリミジンヌクレオチドが配列中で互いに連続する場合、ホスホロチオエート残基は、好ましくは、3′末端、5′末端ならびに内部ピリミジンヌクレオチドCおよびUに導入される。ホスホロチオエート残基は、上部または下部の鎖に、好ましくは両方の鎖に導入することができる。
【0018】
本発明の特定の実施形態は、遺伝子発現を抑制するための、2またはそれ以上の式Iで示されるオリゴヌクレオチド誘導体の混合物の使用を含む。この場合におけるオリゴヌクレオチド誘導体は、RNAの異なる領域に対して、または、異なる遺伝子のRNAに対して向けられていてもよい。
【0019】
驚くべきことに、少なくとも1つの末端に2′5′−結合オリゴアデニレート残基を有する部分的に二本鎖の核酸が、3′5′−結合ヌクレオチドのみを含む二本鎖RNAよりもかなり強く遺伝子発現を阻害することが見出された。また、2′5′−結合オリゴアデニレート残基を有する二本鎖RNA断片は、2′5′−結合オリゴアデニレート残基を有する対応する一本鎖よりも活性であった。通常は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびセンスオリゴヌクレオチドは互いの作用を相殺するので、これは驚くべきことである。その他の驚くべきことは、2′5′−結合オリゴアデニレート残基は、その活性を示すために、5′−リン酸または5′−三リン酸残基を有する遊離末端を有さなくてもよいことである。また、2′5′−結合オリゴアデニレート残基が、5′機能を介して3′5′−結合RNAに直接結合できることは全く驚きである。驚くべきことに、コーディング鎖中の2′5′−A残基は、2′5′−A残基が非コーディング鎖中に存在する間は二本鎖の活性に対して非常にわずかなプラス効果しか有さなかった。驚くべきことに、下部の鎖に4〜6塩基のオーバーハングした末端を有する二本鎖RNAは、2つのオーバーハングした塩基しか有さないものよりずっと活性である。一般的に、活性な配列を得るために複数の配列(例えば10〜100)を分析しなければならないアンチセンスオリゴヌクレオチドとは対照的に、驚くべきことに、全ての分析された式Iで示される二本鎖オリゴヌクレオチドは、それらが対応する遺伝子配列に相同である場合、阻害活性であった。驚くべきことに、2′5′−結合オリゴヌクレオチドとの内因性の非特異性は、ともに観察されなかった。これまでに、二本鎖RNAを介した2′5′−活性阻害は常に、非特異的、すなわち配列非依存性な効果と関連づけられてきた(Bass,Nature(2001)411,428)。
【0020】
塩基対を形成しない2つの2′5′−(A)4−オリゴヌクレオチドの混合物は、二本鎖分子よりも効果が低い。その上、式Iで示される化合物は、それらの配列が標的RNAに完全に相同ではない場合、効果が低いか、または効果がない。
【0021】
驚くべきことに、本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ヒトの初期細胞において阻害の配列特異的な効果も有していた。我々が知る限り、ヒトの初期細胞中の二本鎖オリゴヌクレオチドによる遺伝子発現の阻害は、これまで観察されていない。これに関して、二本鎖RNAの1つの鎖のみがオーバーハングした末端を有していなければならないということは、同様に意外であった。
【0022】
本発明に係る式Iで示されるオリゴヌクレオチドは、わずかな量の異常な2′5′−オリゴアデニレートシンターゼしか発現しない細胞、または2′5′−オリゴアデニレートシンターゼを全く発現しない細胞において遺伝子発現を抑制することに用いることもできる。21個のヌクレオチドを有する記載されたdsRNA分子は(Elbashir et al.Nature(2001)411,494)、このような特性を有さない。
【0023】
その上また、2′5′−オリゴアデニレートシンターゼの欠陥または異常を有する患者を治療するために式Iで示されるオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。例えばCFS(慢性疲労症候群)の患者を治療することもできる。
【0024】
特定の標的の遺伝子発現を抑制するのに用いられる二本鎖核酸の配列は、対応する遺伝子配列に基づき選択される。前記遺伝子の配列は、配列解析により、または、遺伝子データベースから得られる。本明細書で説明され得る例は、二本鎖核酸によるルシフェラーゼ(ホタル)の阻害である。この遺伝子の登録番号はU47298である。ホタルルシフェラーゼのコーディング領域は、1653個のヌクレオチドを含む。以下の4つの領域を、二本鎖核酸による阻害に関する標的配列として特に選択することができる。
【0025】
【化2】
【0026】
従って、これら領域に対応する二本鎖RNAは以下の配列を有する。
【化3】
【0027】
それらから得られた本発明に係る二本鎖核酸は、例えば、以下に列挙された配列を有し、少なくとも1つの鎖において、2またはそれ以上のヌクレオチド(本明細書においては小文字で示される)が、2′5′インターヌクレオシド結合を介して結合されることを特徴とする。オーバーハングした末端は、標的RNAに相補的でなくてもよい。数字はRNA上の領域を示し,upは、上部の(コーディング)鎖を意味し、loは、下部の(非コーディング)鎖を意味する。好ましくは、2′5′−結合アデニレート残基である。式Iにおいてpが0の場合、2つの鎖は、水素結合を介してのみ共に結合される。
【0028】
【化4】
【0029】
しかしながら、該オリゴヌクレオチドはまた、例えば、下部の鎖に6個のオーバーハングしたヌクレオチドを有してもよく、これらは部分的または完全に2′5′−結合である。
【0030】
【化5】
【0031】
二本鎖オリゴヌクレオチドの鎖の構造の例を以下に示す:
【化6】
【0032】
生物活性を試験するために、以下のオリゴヌクレオチドを調製し、必要に応じて二本鎖にハイブリダイズさせ、分析混合物におけるルシフェラーゼ活性の阻害について試験することができる。
【0033】
【化7】
【0034】
他の種の細胞、特にヒトの初期細胞において本発明のオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を抑制することに用いることもできることを示すために、本発明の化合物を、例えば、ヒト遺伝子またはそれに対応するRNAに対して向けることができ、ヒト細胞(HUVEC、ヒト臍帯静脈内皮細胞)で分析することができる。これに関して、遺伝子データベースからのEdg−1のDNA(登録番号M31210)を、例えば、対応する二本鎖RNAに転写することができ、以下の2つの領域(175および725)を、適切なオリゴヌクレオチドを合成するために選択することができる。
【0035】
Edg−1RNA:
【化8】
【0036】
対応するオリゴヌクレオチドの可能な構造の例を以下に示す:
【化9】
【0037】
数字はEdg−1のRNA上の領域を示し、upは、上部の(コーディング)鎖を意味し、loは、下部の(非コーディング)鎖を意味する。ミスマッチコントロールは、完全に対になった二本鎖を形成するが、5個のヌクレオチドがedg−1のRNAとは異なる(ミスマッチとして下線で示した)。FITCは、市販の蛍光マーカーである。
【0038】
その上、改善されたヌクレアーゼ安定性と増加した阻害活性を有し、上記のedg−1配列から誘導されたedg−1に対して向けられた以下のオリゴヌクレオチドが調製された。
【0039】
【化10】
【0040】
本発明の他の実施形態は、2′5′−結合のオーバーハングした残基を1つの鎖、好ましくは非コーディング鎖のみに有し、2つの鎖が1またはそれ以上の共有結合で共に結合された二本鎖オリゴヌクレオチドを用いる。この共有結合の可能な例は、(Li)p型のリンカーである。
【化11】
【0041】
例えば、2つの核酸鎖は、複数のヌクレオチド残基、好ましくは4〜5個のヌクレオチド残基を介して共に結合することができる(LiはN、好ましくはチミジンであり、pは4〜20、好ましくは4または5である)。
【化12】
【0042】
塩基が失われた(abasic)リンカーの場合において、分子は、例えば、以下の式を有する:
【化13】
【0043】
しかしながら、2つの鎖はまた、非ヌクレオチド残基を介して共に結合されてもよい。適切な非ヌクレオチドリンカーの例としては、1またはそれ以上のオリゴエチレングリコールリン酸残基、好ましくはトリ−およびヘキサエチレングリコールリン酸残基が挙げられる。その他のリンカーの例としては、アルカンジオールリン酸、好ましくはプロパン−1,3−ジオールリン酸、ブタン−1,4−ジオールリン酸、および、ドデシル−1,12−ジオールリン酸が挙げられる。さらなるリンカーの例としては、一般的に、3′−O、5′−O−で結合した塩基が失われた(abasic)1′,2′−ジデオキシリボースユニットが挙げられる。合成に必要なリンカー試薬は、大抵は市販されている(例えば、スペーサー9、スペーサー18、スペーサーC3、スペーサーC12、dスペーサー(塩基が失われた)、Glen Research,Sterling,VAより)。リンカーはまた、例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドの細胞の摂取を増す、生物学的利用能を増す、ヌクレアーゼ安定性を増す、または、生物活性を増すことができる官能基を取り込むことも可能である。その上、例えば蛍光マーカーまたはビオチンマーカーを標識するための基をリンカーに取り込ませることも可能である。
【0044】
2つの鎖を結合させるためのリンカーのその他の例としては、ジスルフィド架橋(−S−S−)またはピロチオリン酸架橋(−(O3)−P−S−S−P(O3)−)が挙げられる。
あるいは、親油性もしくはイオンの相互作用を介して、または、水素結合を介して、非共有結合により二本鎖を共に結合させることができる。
【0045】
ルシフェラーゼ発現の阻害の特異性は、標的RNAに完全に相同ではなく、例えば2または4個の塩基のミスマッチを有する二本鎖コントロールオリゴヌクレオチドに基づき調べられた。その他のコントロールオリゴヌクレオチドは、オーバーハングした末端に応じて変化させる。
【0046】
【化14】
【0047】
例えば、ホスホロチオエート(星印)または2′O−メチルリボヌクレオチド(下線)のいずれかの改変を上部もしくは下部の鎖または両方の鎖に有する以下のオリゴヌクレオチドが調製された。
【化15】
【0048】
本発明に係る式Iで示される核酸誘導体は、オリゴヌクレオチドから合成される。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドアデノシンホスフェート、グアノシンホスフェート、イノシンホスフェート、シチジンホスフェート、ウリジンホスフェート、および、チミジンホスフェートから完全に合成することができる。好ましくは、リボヌクレオチドから合成されたオリゴヌクレオチド、「オリゴリボヌクレオチド」である。本発明の他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、1またはそれ以上の修飾、例えば化学修飾を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、複数の同一および/または異なる修飾を有してもよい。
【0049】
化学修飾の例は当業者既知であり、例えば、以下で説明されている:E.Uhlmann and A.Peyman,Chemical Reviews 90(1990)543 and“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques,S.Agrawal,Ed,Humana Press,Totowa,USA 1993,J.Hunziker and C.Leumann‘Nucleic Acid Analogs:Synthesis and Properties’in Modern Synthetic Methods(Ed.Beat Ernst and C.Leumann)Verlag Helvetica Chimica Acata,Basle,p.331−417,RP lyer et al.Curr Opin Mol Therap(1999)1:344−358;S.Verma and F.Eckstein,Annu Rev Biochem(1998)67:99−134;JW Engels and E.Uhlmann:Chemistry of oligonucleotides.In:Pharmaceutical aspects of oligonucleotides.Couvreur P,Malvy C(Eds),Taylor & Francis,London,(2000):35−78。
【0050】
オリゴヌクレオチドの化学修飾としては、例えば、以下が挙げられる:
a)例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、NR1R1′ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、(C1〜C21)−O−アルキルホスフェート、[(C6〜C12)アリール−(C1〜C21)−O−アルキル]ホスフェート、(C1〜C8)アルキルホスホネートおよび/または(C6〜C12)アリールホスホネート架橋で、リン酸ジエステル架橋を、完全または部分的に置換すること、ここで、
R1およびR1′は、互いに独立して、水素、(C1〜C18)アルキル、(C6〜C20)アリール、(C6〜C14)アリール−(C1〜C8)アルキル、好ましくは水素、(C1〜C8)アルキルおよび/またはメトキシエチル、特に好ましくは水素、(C1〜C4)アルキルおよび/またはメトキシエチルであり、または、
R1およびR1′は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、5〜6員環複素環(O、S、Nからなる群より選択された他のヘテロ原子をさらに含んでもよい)を形成する;
【0051】
b)完全または部分的に3′−および/または5′−リン酸ジエステル架橋を「デホスホ」架橋(例えば、Uhlmann,E.And Peyman,A.In“Methods in Molecular Biology”,Vol.20,“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”,S.Agrawal,Ed.,Humana Press,Totowa 1993,Chapter16,355ffで説明された)、例えば、ホルムアセタール、3′−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム,メチレンジメチルヒドラゾ,ジメチレンスルホンおよび/またはシリル基で置換すること;
【0052】
c)部分的に糖リン酸主鎖を、例えば「モルホリノ」オリゴマーで置換すること(例えば、E.P.Stirchak et al.,Nucleic Acids Res.17(1989)6129、および、J.Summerton and D.Weller,Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.7(1997)187−195 で説明された)、および/または、ポリアミド核酸(「PNAs」)で置換すること(例えば、P.E.Nielsen et al.,Bioconj.Chem.5(1994)3 で説明された)、および/または、ホスホモノエステル核酸(「PHONAs」)で置換すること(例えば、Peyman et al.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35(1996)2632−2638 で説明された);
【0053】
d)例えば、β−D−2′−デオキシリボース、α−D−2′−デオキシリボース、L−2′−デオキシリボース、2′−F−2′−デオキシリボース、2′−F−2′−デオキシアラビノフラノース、2′−O−(C1〜C6)アルキルリボース、2′−O−(C2〜C6)アルケニルリボース、2′−[O−(C1〜C6)アルキル−O−(C1〜C6)アルキル]リボース、2′−NH2−2′−デオキシリボース、β−D−キシロフラノース、β−D−アラビノフラノース、α−アラビノフラノース、2,4−ジデオキシ−β−D−エリスロヘキソピラノース、立体構造的に制限された糖類似体(例えばLNAなど)(Locked Nucleic Acids;Singh et al.,Chem.Commun.4(1998)455;Singh et al.Chem.Commun.12(1998)1247)、および、炭素環(例えば、Froehler,J.Am.Chem.Soc.114(1992)8320 で説明された)、および/または、開鎖した糖類似体(例えば、Vandendriessche et al.,Tetrahedron 49(1993)7223 で説明された)、および/または、ビシクロ糖類似体(例えば、M.Tarkov et al.,Helv.Chim.Acta 76(1993)481
で説明された)で、部分的にβ−D−リボース単位を置換すること。2′−修飾オリゴヌクレオチド類似体は、Manoharan,Biochim.Biophys.Acta(1999)117 で詳細に説明さ
れ、立体構造的に制限されたオリゴヌクレオチド類似体は、Herdewijn,Biochim.Biopyhs.Acta(1999)167 で詳細に説明される;
【0054】
e)天然ヌクレオシド塩基を修飾し、それぞれ完全または部分的に、例えば、5−(ヒドロキシメチル)ウラシル、5−アミノウラシル、プソイドウラシル、プソイドイソシトシン、ジヒドロウラシル、5−(C1〜C6)アルキルウラシル、5−(C2〜C6)−アルケニルウラシル、5−(C2〜C6)アルキニルウラシル、5−(C1〜C6)アルキルシトシン、5−(C2〜C6)アルケニル−シトシン、5−(C2〜C6)アルキニルシトシン、5−フルオロウラシル、5−フルオロシトシン、5−クロロウラシル、5−クロロシトシン、5−ブロモウラシル、5−ブロモシトシン、または、7−デアザ−7−置換プリンで置換すること。
【0055】
複素環式の塩基修飾は、例えば、Herdewijn,Antisense & Nucl.Acid Drug Dev.(2000)297に説明される。
その上、オリゴヌクレオチドの化学修飾は、オリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドの特性(例えばヌクレアーゼ安定性、標的配列に対する親和性、薬物動態学)に有利な影響を与える、および/または、改変オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションの際に結合および/または架橋により前記標的配列に作用する1またはそれ以上の分子と結合することを含む(オリゴヌクレオチド結合体)。それらの例としては、ポリリジン、インターカレーター(例えばピレン、アクリジン、フェナジン、フェナントリジン)、蛍光性化合物(例えばフルオレセイン)、クロスリンカー(例えばソラレン、アジドプロフラビン)、親油性分子(例えば(C12〜C20)アルキル)、脂質(例えば1,2−ジヘキサデシル−rac−グリセロール)、ステロイド(例えばコレステロールまたはテストステロン)、ビタミン(例えばビタミンE)、ポリ−またはオリゴエチレングリコール、(C12〜C18)アルキルリン酸ジエステル、および/または、−O−CH2−CH(OH)−O−(C12〜C18)アルキルとの結合体である。このような分子は、5′および/または3′末端で、および/または、配列内で、例えば核酸塩基で結合させることができる。当業者既知のオリゴヌクレオチド結合体の例は、Manoharan(2001)Conjugated Oligonucleotides in Antisense technology.In:Crooke(Editor)Antisense technology.Marcel Dekker.New York 中で説明される。
【0056】
化学修飾の特定の実施形態は、オリゴヌクレオチドと、a)親油性分子、例えば(C12〜C20)アルキル、b)ステロイド、例えばコレステロールおよび/またはテストステロン、c)ポリ−および/またはオリゴエチレングリコール、d)ビタミンE,e)インターカレーター、例えばピレン、f)(C14〜C18)アルキルリン酸ジエステル、および/または、g)−O−CH2−CH(OH)−O−(C12〜C16)アルキルとの結合に関す
る。
【0057】
化学修飾の他の特定の実施形態は、アリールエステル結合体として、例えばFDA結合体としてHMR99/L045で説明されたオリゴヌクレオチドの誘導体化に関し、該誘導体化は、前記オリゴヌクレオチドの細胞の摂取に有用である。
【0058】
前記オリゴヌクレオチド誘導体を調製する方法は当業者既知であり、例えば、Uhlmann,E.& Peyman,A.,Chem.Rev.90(1990)543、および/または、M.Manoharan in“Antisense Research and Applications”,Crooke and Lebleu,Eds.,CRC Press,Boca Raton,1993,chapter17,p.303ff、および/またはEP−A0552766に説明される。二本鎖は、例えば、前記2つの一本鎖の溶液を加熱し、続いて希釈緩衝液中で冷却することにより2つの一本鎖をハイブリダイゼーションさせて調製することができる。原則として、遺伝子合成に関して説明された方法を二本鎖調製に用いることができる(Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments(Editors:Gassen and Lang)Verlag Chemie,Weinheim(1982))。
【0059】
本発明のさらに特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、その3′および/または5′末端で、3′−3′および/または5′−5′転位を有していてもよい。このタイプの化学修飾は当業者既知であり、例えば、M.Koga et al.,J.Org.Chem.56(1991)3757 に説明される。
【0060】
2′5′でオーバーハングした残基は、例えば、アデノシン、3′−デオキシアデノシン(コルディセピン)、イノシン、8−ブロモアデノシン、8−メチルアデノシン、およびその他の8−置換アデノシン誘導体を含み得る。リボース残基はまた、3′−O−メチルアデノシンとして誘導体化することができる。2′5′−オーバーハング部分におけるインターヌクレオシド結合は、好ましくはホスホジエステル結合、および、ホスホロチオエート結合である。2′5′−アデニレートの一般的な誘導体、ならびに、それらの合成およびRNアーゼL活性化は、文献(Player et al.(1998)Pharmacol.Ther.78,55)に説明される。
【0061】
さらに本発明は、オリゴヌクレオチドを調製する方法を提供する。説明されたオリゴヌクレオチドを様々な既知の化学法を用いて調製することができ、例えば、Eckstein,F.(1991)“Oligonucleotides and Analogues,A Practical Approach”,IRL Press,Oxford に説明されたように調製することができる。必要に応じて1またはそれ以上の酵素的な工程を含む方法でオリゴヌクレオチドを調製することもできる。
【0062】
その上、本発明は、特定の標的遺伝子の発現を調節するため、および、完全にまたは部分的に抑制するため、例えば、完全にまたは部分的に翻訳を抑制するための、オリゴヌクレオチドの使用を提供する。その上、本発明は、わずかな量の異常な2′5′−オリゴアデニレートシンターゼしか有さない細胞、または、2′5′−オリゴアデニレートシンターゼを全く有さない細胞において、発現を調節するため、および、完全にまたは部分的に抑制するための、前記オリゴヌクレオチドの使用に関する。
【0063】
その上、本発明は、医薬としての前記オリゴヌクレオチドの使用、または、医薬製造のための前記オリゴヌクレオチドの使用を提供する。特に、特定の遺伝子の発現または過剰発現を伴う病気の予防および/または治療に適した医薬において前記オリゴヌクレオチドを使用することが可能である。
【0064】
本発明は、特定の遺伝子が原因であるか、または特定の遺伝子が過剰発現することにより関与する病気の治療のための、前記オリゴヌクレオチドまたは前記オリゴヌクレオチドを含む医薬の使用をさらに提供する。
【0065】
本発明の医薬は、例えば、ウイルス例えば、CMV、HIV、HSV−1、HSV−2、肝炎B、肝炎Cウイルス、またはパピローマウイルスにより引き起こされる疾患の治療のための治療に用いることができる。本発明の医薬は、例えばポリオウイルス、VSVまたはインフルエンザウイルスのようなRNAウイルスの治療、また特に、例えばレオウイルスのような二本鎖RNAウイルスの治療に特に適している。
【0066】
本発明の医薬はまた、例えばガン治療に適している。この場合において、例えば、ガンの発達または成長の原因となる標的に対して向けられたオリゴヌクレオチド配列を用いることが可能である。このような標的の例としては、以下が挙げられる:
1)核の腫瘍性タンパク質、例えば、c−myc、N−myc、c−myb、c−fos、c−fos/jun、PCNA、p120など、
2)細胞質/膜結合型腫瘍性タンパク質、例えば、EJ−ras、c−Ha−ras、N−ras、rrg、bcl−2、cdc−2、c−raf−1、c−mos、c−src、c−abl、c−etsなど、
3)細胞性受容体、例えば、EGF受容体、Her−2、c−erbA、VEGF受容体(KDR−1)、レチノイド受容体、タンパク質キナーゼ調節サブユニット、c−fms、Tie−2、c−raf−1キナーゼ,PKC−α、タンパク質キナーゼA(R1α)など、
4)サイトカイン、成長因子、細胞外基質、例えば、CSF−1、IL−6、IL−1a、IL−1b、IL−2、IL−4、IL−6、IL−8、bFGF、VEGF、ミエロブラスチン(myeloblastin)、フィブロネクチンなど、
5)腫瘍抑制遺伝子の阻害剤、例えばMDM−2など。
【0067】
本発明の医薬は、例えば、インテグリンまたは細胞−細胞付着受容体により、例えばVLA−4、VLA−2、ICAM、VCAMまたはELAMにより影響を受ける疾患の治療にさらに適している。
【0068】
本発明の医薬はまた、例えば再狭窄の予防に適している。この点について、例えば、増殖または遊走を引き起こす標的に対して向けられたオリゴヌクレオチド配列を用いることが可能である。このような標的の例としては、以下が挙げられる:
1)核のトランスアクチベータータンパク質およびサイクリン、例えば、c−myc、c−myb、c−fos、c−fos/jun、サイクリンおよびcdc2キナーゼなど、
2)マイトジェンまたは成長因子、例えば、PDGF、bFGF、VEGF、EGF、HB−EGFおよびTGF−βなど、
3)細胞性受容体、例えば、bFGF受容体、EGF受容体、および、PDGF受容体など。
【0069】
本発明は、さらに、アデノシンA1受容体、アデノシンA3受容体、ブラジキニン受容体またはIL−13の発現を適切なオリゴヌクレオチドを用いて阻害することによる喘息の治療のためのオリゴヌクレオチドに関する。
【0070】
本発明はまた、例えば、β1−アドレナリン受容体またはEDGファミリーからのタンパク質(例えばEdg−1など)の発現を阻害することにより、例えば心疾患を治療するためのオリゴヌクレオチドに関する。
本発明はまた、例えばPTP−1Bの発現を阻害することにより、例えば糖尿病を治療するためのオリゴヌクレオチドに関する。
【0071】
該医薬は、例えば、経口的に投与可能な医薬品の形態で、例えば、錠剤、コーティング錠剤、ハードもしくはソフトゼラチンカプセル、溶液、乳濁液または懸濁液の形態で用いることができる。これらはまた、例えば坐剤の形態で直腸に投与することができ、または、例えば注射液の形態で非経口的に投与することができる。医薬品は、治療上不活性な有機および無機キャリアー中に前記化合物を加工することにより製造することができる。錠剤、コーティング錠剤およびハードゼラチンカプセルのためのこのようなキャリアーの例としては、ラクトース、コーンスターチまたはそれらの誘導体、タルクおよびステアリン酸またはそれらの塩がある。溶液の調製に適したキャリアーは、水、ポリオール、スクロース、転化糖およびグルコースである。注射液に適したキャリアーは、水、アルコール、ポリオール、グリセロールおよび植物油である。坐剤に適したキャリアーは、植物油および硬化油、ワックス、油脂および半固体ポリオールである。該医薬品はまた、保存剤、溶媒,安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、香味剤、浸透圧を調製するための塩、緩衝剤、コーティング剤、抗酸化剤、および、必要に応じて、その他の治療上活性な物質を含んでもよい。
【0072】
好ましい投与形態は、局所投与であり、例えば、カテーテルを用いた、または、吸入、注射もしくは注入による局所投与、および経口投与である。注射については、オリゴヌクレオチド誘導体は、溶液中に、好ましくは生理学的に許容できる緩衝液(例えば、ハンクス液またはリンガー液)中に処方される。しかしながら、オリゴヌクレオチドを固形状に処方して、使用前に溶解または懸濁してもよい。全身投与に好ましい投与量は、約0.01mg/kg〜約50mg/kg体重・1日である。
その上本発明は、オリゴヌクレオチドおよび/または生理学的に許容されるそれらの塩、加えて製薬上適切なキャリアーおよび/または添加剤を含む医薬品に関する。
【0073】
オリゴヌクレオチドおよび/または生理学的に許容されるそれらの塩は、そのものを医薬として、互いを含む混合物で、または、局所的、経皮、非経口または経腸の適用が可能であり、活性成分として活性な用量の少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、それに加えて一般的な製薬上適切なキャリアーおよび添加剤を含む医薬品の形態で、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトに投与することができる。製剤は、通常、約0.1〜90質量%の治療上活性な化合物を含む。例えば、乾癬または白斑のような皮膚疾患の治療に関しては、例えば軟膏、ローションもしくはチンキ、乳濁液、または懸濁液の形態での局所適用が好ましい。
【0074】
該医薬品は、製薬上不活性な無機および/または有機キャリアーを用いて、それ自体既知の方法で製造される(例えばRemingtons Pharmaceutical Sciences,Mack Publ.Co.,Easton,PA.)。丸剤、錠剤、コーティング錠剤およびハードゼラチンカプセルの製造に関しては、例えばラクトース、コーンスターチおよび/またはそれらの誘導体、タルク、ステアリン酸および/またはそれらの塩などが用いることができる。ソフトゼラチンカプセルおよび/または坐剤のためのキャリアーの例は、油脂、ワックス、半固体および液体ポリオール、天然油および/または硬化油などである。液剤および/またはシロップ調製に適したキャリアーの例は、水、スクロース、転化糖、グルコース、ポリオールなどである。注射液の調製に適したキャリアーは、水、アルコール、グリセロール、ポリオール、植物油などである。マイクロカプセル、インプラントおよび/またはロッドに適したキャリアーは、グリコール酸と乳酸との混合ポリマーである。当業者既知のリポソーム製剤(N.Weiner,Drug Develop Ind Pharm 15(1989)1523;“Liposome Dermatics,Springer Verlag 1992)、例えばHVJリポソーム(Hayashi,Gene Therapy 3(1996)878)もまた適切である。皮膚への投与もまた、例えばイオノフォア法および/または電気穿孔法を用いて可能である。加えて、リポフェクチン、およびその他のキャリアーシステム,例えば遺伝子治療で用いられるキャリアーシステムを用いることができる。特に適切なシステムは、優れた効率でオリゴヌクレオチドを真核細胞に導入するのに用いることができるシステムである。
【0075】
活性物質およびキャリアーに加えて、医薬品はまた、添加剤、例えば、充填剤、増量剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、保存剤、甘味料、着色剤、香味剤、または芳香剤、増粘剤、希釈剤、緩衝物質、さらに、溶媒および/または可溶化剤および/または持続性を達成するための物質、さらに、浸透圧を調製するための塩、コーティング剤および/または抗酸化剤を含ませることができる。これらはまた、2またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドおよび/またはそれらの生理学的に許容される塩も含ませることができ、さらにその上、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドに加えて、1またはそれ以上のその他の治療上活性な物質を含ませることができる。
【0076】
用量は広い範囲で変えることができ、個々のケースにおいて、個々の状況に応じて調節するべきである。
【実施例】
【0077】
1.式Iで示されるオリゴヌクレオチドの合成
a)3′aaaaaUGUCUACGUGUAUAGCUCCAC(小文字で示された塩基は2′5′インターヌクレオシド結合を有する)
ABI394DNAまたは Expediteシンセサイザー(Applied Biosystems,Weiterstadt,Germany)で合成を行った。製造元が推奨する合成サイクルを用いたが、ただしリボヌクレオシド−2′−O−ホスホロアミデートに関しては、縮合工程を2倍行い(カップリング時間はそれぞれ400秒であった)、ヨウ素酸化工程の長さを30秒に増やした。用いられた固相は、糖の2′または3′位で5′−O−ジメトキシトリチル−N−6−ベンゾイルアデノシン(NSS−6101−10A,Chemgenes,Waltham,MA)を結合させた1000Åに調整された多孔質ガラス(CPG)支持体である。トリクロロ酢酸で開裂させて5′−O−ジメトキシトリチル基を除去した後、5′−O−ジメトキシトリチル−N−6−ベンゾイル−3′−O−tert−ブチルジメチルシリルアデノシン−2′−O−ホスホロアミデート(ANP−5681,Chemgenes)で4回縮合することにより、2′5′−結合オリゴヌクレオチド部分を合成した。これに続いて、対応する5′−O−ジメトキシトリチル−2′−O−tert−ブチルジメチルシリルヌクレオシド−3′−O−ホスホロアミデート(ANP−5671〜ANP−5680,Chemgenes)で繰り返し縮合することにより、3′5′−結合オリゴヌクレオチド部分を合成した。支持体からオリゴマーを分離し、リン酸基およびアミノ保護基を脱保護するために、CPG支持体を、750μlの濃アンモニア/エタノール(3:1、v:v)で30℃で24時間振盪しながらインキュベートした。上清を支持体から分離し、次に、支持体を150μlの濃アンモニア/エタノール(3:1、v:v)で2回以上洗浄した。合わせた上清を減圧下で濃縮し、シリル保護基を除去するために、残留物を1200μlのトリエチルアミン×3HF(非常に毒性)中で振盪しながら30℃で24時間インキュベートした。これに続いて、700μlのn−ブタノールを加え、ドライアイス上で30分間混合物を冷却し、遠心分離した。ペレットをブタノールで2回以上洗浄した。加えて、塩化ナトリウム沈殿を、次に行った。ゲル電気泳動において1161 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 8256.0,実測値 8256.8)。
【0078】
b)3′aaaaAUAUUACUUGCACUUAACGAG
実施例1のa)と同様にして合成を行い、5′−O−ジメトキシトリチル−N−6−ベンゾイル−3′−O−tert−ブチルジメチルシリルアデノシン−2′−O−ホスホロアミデート(ANP−5681,Chemgenes)で3回縮合することにより2′5′−結合オリゴヌクレオチド部分を合成した。ゲル電気泳動において112 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 7958.9,実測値 7958.6)。
【0079】
c)3′aaaaCCAUUUCAACAAGGUAAAAAA
実施例1のb)と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において117 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 8012.0,実測値 8011.8)。
【0080】
d)3′aaaaCUUCGCUUCCAACACCUAGAC
実施例1のb)と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において117 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 7868.8,実測値 7868.6)。
【0081】
e)3′aaaaaaCUUCGCUUCCAACACCUAGAC
実施例1のa)と同様にして合成を行い、5′−O−ジメトキシトリチル−N−6−ベンゾイル−3′−O−tert−ブチルジメチルシリルアデノシン−2′−O−ホスホロアミデート(ANP−5681,Chemgenes)で5回縮合することにより2′5′−結合オリゴヌクレオチド部分を合成した。ゲル電気泳動において112 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 8527.2,実測値 8527.5)。
【0082】
f)3′teg−AACUUCGCUUCCAACACCUAGAC(ここでtegは、トリエチレングリコールリン酸残基である)
実施例1のa)と同様にして、トリエチレングリコールスクシネート誘導体化CGP支持体を用い、5′−O−ジメトキシトリチル−N−6−ベンゾイル−3′−O−tert−ブチルジメチルシリルアデノシン−2′−O−ホスホロアミデート(ANP−5681,Chemgenes)と縮合することにより、配列に従って2′5′−結合オリゴヌクレオチド部分を調製して合成を行った。3′−末端アデノシンの2′位にトリエチレングリコールリン酸残基を含む83 OD(260)の粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 7422.5,実測値 7422.6)。
【0083】
g)5′GAAGCGAAGGUUGUGGAUCUGaaaa
実施例1のb)と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において108 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 8149.0,実測値 8148.9)。
【0084】
h)5′−GGUAAAGUUGUUCCAUUUUUUaaaa
実施例1のb)と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において112 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 7930.7,実測値 7930.7)。
【0085】
i)5′−GAAGCGAAGGUUGUGGAUCUG
3′5′−インターヌクレオチド結合を導入したことを除いては、実施例1のa)と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において82 OD(260)の唯一の主要なバン
ドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 6832.2,実測値 6831.8)。
【0086】
j)3′aaaaC*U*U*CGC*U*UC*CAA*CAC*C*UAGA*G
実施例1のb)と同様にして合成を行った。特定の酸化工程においてヨード液ではなくBeaucage試薬(RN−1535,Chemgenes,Waltham,MA)を用いることによって、ホスホロチオエート残基を導入した。ゲル電気泳動において112 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 8029.4,実測値 8031.2)。
【0087】
k)3′−a*a*aa−C*U*U*CGC*U*UC*CAA*CAC*C*UAGA*C
実施例1のj)と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において128 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 8061.6,実測値 8062.8)。
【0088】
l)3′−A*U*ua−C*U*U*CGC*U*UC*CAA*CAC*C*UAGA*C(uとaとの間に唯一の2′5′−インターヌクレオチド結合を含む)
実施例1のk)と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において96 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 8015.5,実測値 8017.8)。
【0089】
m)3′aaaa−CUUCGCUUCCAACACCUAGAC(小文字で示された塩基は2′5′−インターヌクレオシド結合を有し、下線で示されたヌクレオチドは2′−O−メチルリボヌクレオシドである)
実施例1のa)と同様にして合成を行った。下線で示されたヌクレオチドの場合は、5′−O−ジメトキシトリチル−2′−O−メチル−リボヌクレオシド−3′−O−ホスホロアミデート(ANP−5751〜ANP−5758,Chemgenes)を縮合した。ゲル電気泳動において99 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 8163.4.6,実測値 8165.1)。
【0090】
n)3′a*a*aa−C*U*U*CGC*U*UC*CAA*CAC*C*UAGA*C
実施例1のm)と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において127 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 8356.1.実測値 8357.2)。
【0091】
o)3′−aaaaUAGUAGGACCUCUUGUAGAAA(edg−1−175_lo)
実施例1のb)と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において134 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 8037.9,実測値 8038.9)。
【0092】
p)3′−aaaaGGUUCCGGUCGGCGUCGAGAC(edg−1−725_lo)
実施例1のb)と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において134 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 8075.9,実測値 8076.9)。
【0093】
q)3′−aaaaGGUGCCUGUCUGCGGCGACAC(edg−1−mm_lo)
実施例1のb)と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において109 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 8035.9,実測値 8037.0)。
【0094】
r)5′AUCAUCCUGGAGAACAUCUUU(edg−1−175−up)
3′5′−インターヌクレオチド結合を導入したことを除いては、実施例1のa)と同様にして合成を行った。用いられた固相は、糖の2′または3′位に5′−O−ジメトキシトリチルウリジン(NSS−6104−10U,Chemgenes,Waltham,MA)を結合させた1000Åに調整された多孔質ガラス(CPG)支持体であった。ゲル電気泳動において110 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 6618.0,実測値 6618.5)。
【0095】
s)5′AUCAUCCUGGAGAACAUCUUU−FITC(edg−1−175_up−FITC)
3′5′−インターヌクレオチド結合を導入したことを除いては、実施例1のa)と同様にして合成を行った。用いられた固相は、保護されたフルオレセイン誘導体(NSS−97505−A1CL,Chemgenes,Waltham,MA)を含む500Åに調整された多孔質ガラス(CPG)支持体であった。ゲル電気泳動において79 OD(260)の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をHPLCおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー(ネガティブモード)でさらに特徴付けた(計算値 7428.7,実測値 7432.3)。
【0096】
2.SL−3細胞におけるルシフェラーゼ発現の阻害
生物活性に関して試験するために、以下のオリゴヌクレオチドを、必要に応じてハイブリダイズにより二本鎖にして調製し、以下の分析混合物中でルシフェラーゼ活性の阻害に関して試験した。
【0097】
【化16】
【0098】
分析混合物1、2、5、6、12および13は、二本鎖形態ではないRNAを含む。その一方で、分析混合物3、4、7、8、9、10および11の中のオリゴヌクレオチドは、二本鎖として対をなしている。二本鎖7、9および11は、両方の鎖において、オーバーハングした2′5′−結合オリゴヌクレオチド残基を有する。オリゴリボヌクレオチドluc−1108_loは、その3′末端に2つだけオーバーハングした2′5′−結合ヌクレオチドおよびトリエチレングリコールリン酸残基(teg)を含む。分析混合物8および10の二本鎖は、2′5′−結合オーバーハングを有する鎖を1つだけ有する。
【0099】
トランスフェクション:実験の前の日に、2×106細胞/mlを6ウェルプレートにプレーティングした。希釈緩衝液中で2つの鎖を熱し、その後それらを冷却することによりオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ二本鎖を得て、100μlのSF 900II SFM(SF−900無血清昆虫用培地II;Gibco BRL 10902−096)で処理した。トランスフェクションのために、10μlのリポフェクチン(1mg/ml;Gibco BRL)を100μlのSF 900II SFMと混合し、室温で15分間インキュベートした。これに続いて、リポフェクチンミックスと核酸とを共にピペッティングし、室温で15〜45分間インキュベートした。その間に、細胞を、3mlの無血清培地と800μlのSF 900II SFMとで洗浄し、核酸/リポフェクチン混合物を連続的に細胞に加え、続いて、25℃で一晩インキュベートした。次の日、1mlの培地および血清(Gibco BRL 10122−166;最終濃度2%)を加える。
【0100】
デュアル−ルシフェラーゼレポーター(DLR;プロメガE1960)アッセイシステム:
【化17】
【0101】
プロメガ社のDLRアッセイは、1つのサンプルから、異なる核酸配列を有するホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を逐次的に測定することができる。測定しようとする式Iで示されるオリゴヌクレオチドは、ホタルルシフェラーゼに対して向けられた。従って、ウミシイタケルシフェラーゼ活性ではなくホタルルシフェラーゼ活性だけが阻害されるはずである。従って、阻害作用に加えて、特異性も試験され得る。
【0102】
ウェルプレート中での細胞の受動的な溶解を、初めに培地を除去し、PBS(リン酸緩衝食塩水(Gibco BRL 14200−067))で細胞を洗浄することにより行った。培地を吸引により完全に除去し、続いて、PLB(受動的な溶解緩衝液、水で1:5に希釈;500μlのPLB(1×)が6ウェルプレートの1つのウェルに導入された)をそれに加えた。これに続いて、室温で振盪しながら15分間インキュベートした。
【0103】
10mlのルシフェラーゼ分析緩衝液II(LAB1 II)にルシフェラーゼ分析基質(LAS)を再懸濁することにより、ルシフェラーゼ分析試薬II(LAR II)を調製した。
Stop&GIo試薬の調製は、乾燥Stop&Glo基質を含むボトルに200μlのStop&Glo基質(溶液)を加え、ボルテクサーを用いて10秒間溶液を混合することによりなされた。1×Stop&Glo溶液を作製するために、20μlの50×Stop&Glo基質と、1mlのStop&Glo緩衝液を合わせる。これは、10回の分析に十分である。
【0104】
DLR−アッセイ:100μlのLAR IIを20μlの細胞溶解物と共にウェルに導入し、2〜3秒間上下にピペッティングすることにより混合した。ホタルルシフェラーゼ活性のルミノメトリック(luminometric)測定の後、100μlのStop&Glo試薬を加え、溶液を混合し、続いて、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。Fluoroskan Ascent FL ルミノメーター(Thermo Labsystems,Frankfurt,Germany)を用いて発光を測定した。
【0105】
【表1】
【0106】
二本鎖オリゴヌクレオチド(3、4、7〜10)は、対応する一本鎖分子(1、2、5、6、12および13)に比べて実質的に相当な程度ホタルルシフェラーゼ活性を阻害した(ただし、下部の鎖に2つだけオーバーハングしたヌクレオチドを有する二本鎖(分析混合物11)を除く)。上部の鎖におけるオーバーハングした2′5′−(A)4残基は、下部の鎖に2′5′−(A)4残基を有する限り、二本鎖の活性において、全く効果を有しないか、または非常にわずかな陽性の効果しか有しなかった(3vs.4、および、7vs.8を参照)。下部の鎖における2′5′−(A)4残基は、2′5′−(A)2残基と比べて、顕著に改善された二本鎖の作用を引き起こした(7および8vs.11).5)を参照)。非相補的な塩基のために二本鎖を形成できなかった2つの一本鎖2′5′−(A)4オリゴヌクレオチドの混合物(12および13)は、相補的な塩基とオーバーハングした2′5′−アデニレート残基とを有する二本鎖よりもかなり活性が低かった。
【0107】
同様に、式Iで示される以下の改変オリゴヌクレオチドを分析混合物14〜18中で分析した。
【化18】
【0108】
【表2】
【0109】
下部の鎖における特定の位置へのホスホロチオエート残基の導入(分析混合物14)、または、下部および上部の鎖における特定の位置へのホスホロチオエート残基の導入(分析混合物16)は、本発明のオリゴヌクレオチドの顕著に改善された作用が得られたが、一方で、下部の鎖全体または上部の鎖全体における2′−O−メチル残基の導入(分析混合物15および17)は、活性の強い減少が起こった。驚くべきことに、分析混合物16の小さいオリゴヌクレオチドが、ホタルルシフェラーゼの発現を、非常に長い二本鎖RNA(約1100bp)と同等に阻害した。一本鎖(分析混合物18)も同様に不活性であった。
【0110】
3.ヒト初期臍帯細胞(HUVEC)におけるedq−1発現の阻害
本発明のオリゴヌクレオチドがヒトの初期細胞において遺伝子発現を抑制することに用いることができることを示すために、前記オリゴヌクレオチドはまた、ヒト遺伝子または対応するRNAに対して向け、ヒト細胞(HUVEC、ヒト臍帯静脈内皮細胞)で試験された。
適切なオリゴヌクレオチドを合成した。
【0111】
【化19】
【0112】
分析混合物14〜16の二本鎖オリゴヌクレオチドは、1つの鎖(非コーディング)のみに2′5′−結合オーバーハングした残基を有する。この特徴はまた、本発明の特定の実施形態である。
【0113】
細胞(HUVEC)および細胞摂取の検出
トランスフェクション:実際のトランスフェクションの24時間前に、初期HUVEC(Jafee et al.,1973,J.Clin.Invest52,pp.2745 に従って単離された第二世代)を密度2.5×105細胞/ウェルでラットのコラーゲン−I(Biocoat,#354400,Becton Dickinson)で被覆した6ウェルプレートにプレーティングした。特定のオリゴヌクレオチドの等モル量の鎖とそれと対の鎖(それぞれの場合、滅菌ろ過したPBS(pH7.4,Gibco BRL #14200−067)中の1mM)を混合し、95℃で5分間インキュベートし、続いて室温まで冷却し、4℃で5分間インキュベートすることによりハイブリダイズさせた。トランスフェクションのために、6μlのリポフェクチン(1mg/ml;Gibco BRL,#18292−011)を200μlの血清非含有Opti−MEM1培地(Gibco BRL,31985−047)と混合し、室温で15分間インキュベートした。パラレル反応において、10μM(→最終濃度0.1μM)または100μM(→最終濃度1μM)のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド溶液(PBS中、pH7.4)を無血清Opti−MEM1培地で1:10の割合に希釈し、同量のプレインキュベートしたリポフェクチン溶液と混合した。室温で15分間インキュベートした後、前記混合物の量を無血清Opti−MEM1培地で2mlに増やし、回収された細胞をPBSで1回洗浄し、続いて、前記混合物を、37℃で、5%CO2および湿度95%で4時間インキュベートした。その後、回収された細胞を再びPBSで洗浄し、続いて、血清含有EGM培地(CellSystems,#CC−3024+EGMサプリメント#CC−3124)で被覆し、さらに24または48時間インキュベートした。蛍光標識したオリゴヌクレオチドを用いた摂取の研究の場合において、細胞を4時間インキュベートし、次に、5%パラホルムアルデヒド(PBS中、pH7.4)で固定し、倒立蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert135M)で、その200倍の倍率で冷却したCCDカメラ(ORCA−1,Bfi optilas)を用いて、FITCフィルターを通して励起させて(励起:490nm,放出:510nm)直接撮影し、AQM2000ソフトウェア(Kinetic Imaging)で処理した。
【0114】
ウェスタンブロット分析:回収された細胞をPBSで1回洗浄することにより、細胞を溶解させ、続いて、200μl/ウェルの2×Laemmli緩衝液(Bio-Rad #161−0737)でそれを被覆した。室温で5分間インキュベートした後、セルスクレーパー(Becton Dickinson,#3085)を用いて細胞溶解物を回収し、断続的な12%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE,Laemmli et al.,1970,Bio-Rad-Criterion-System #345−0014)の前に、95℃で5分間加熱し、45μlのこの溶液を各スロットに適用した。ゲルを1×トリス/グリシン/SDS緩衝液(Bio-Rad #161−0732)で泳動した。免疫ブロットのために、Bio-Rad クライテリオンウェスタンブロット装置(#170−4070)で、1×トリス/グリシン緩衝液(Bio-Rad #161−0732,+10%メタノール)中で、ゲルをニトロセルロース(NC)メンブレン(Amersham #RPN2020D)にトランスファーした。次に、5%粉乳(“Blotto”,Bio-Rad #170−6404)および0.1%Tween20(Bio-Rad #170−6531)を含む1×TBS緩衝液(Bio-Rad #170−6435)を用いて、NCメンブレンを室温で1時間飽和させた。Blotto 非含有TBS−Tween(TBST)緩衝液でメンブレンを3回洗浄した後、TBST-Blotto での1:50希釈液中の抗hEDG−1一次抗体(EDG−1特異的ペプチド配列CKAHRSSVSDYVNYDで免疫化し、KLHとカップリングし、上述のペプチド配列に対する親和性で精製することによって得られたポリクローナルウサギ血清)で、メンブレンを4℃で一晩インキュベートした。TBSTで3回洗浄した後、二次抗体(アルカリホスファターゼをカップリングした抗ウサギ、Dianova #111−055−045)をTBST-Blottoでの1:2000希釈液で室温で1時間インキュベートした。さらなる洗浄工程の後(上記参照)、ECF(「増強された化学蛍光」)検出反応(Amersham #RPN5785)を行い、ポリエチレンのラップ(clingfilm)で被覆したNCメンブレンを1mlのECF基質(Amersham Pharmacia #RPN5785)で室温で5分間インキュベートし、続いて、Fluor-Imager 595 スキャナー(Amersham Pharmacia)を用いて検出した。ImageQuantソフトウェア(Amersham Pharmacia)を用いてシグナルを定量し、NCメンブレンを1回脱色し(Alpha Diagnostic Kit #90100)、上述の方法に従ってβ−チューブリン特異的一次抗体(親和性で精製されたウサギ抗体、Santa Cruz #sc−9104)をインキュベートした後得られたβ−チューブリンシグナルに標準化した。
【0115】
【表3】
【0116】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドで初期HUVEC細胞を処理することにより、Edg−1発現の用量依存性の阻害が生じた。分析混合物14および15においてedg−1特異的オリゴヌクレオチドで処理した後、チューブリンレベルではなくedg−1タンパク質レベルだけが減少したことから、阻害は、標的遺伝子特異的であることが証明された。また、分析混合物14および15のedg−1相同オリゴヌクレオチドのみがedg−1発現を阻害したが、一方で、5個のヌクレオチドがedg−1配列とは異なる分析混合物16の二本鎖核酸はedg−1発現を阻害しなかったことから、阻害は、用いられたオリゴヌクレオチドに関して配列特異的であることが証明された。
我々は、これがヒトの初期細胞における二本鎖RNAによる遺伝子発現の配列特異的阻害を説明した最初の実験であると考える。
【0117】
HUVEC細胞における細胞の摂取を分析混合物17の蛍光標識された二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて調べた。分析混合物17を4時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡を用いて良好な細胞の摂取が検出された。摂取された二本鎖オリゴヌクレオチドは、主に細胞質に存在していたが、その一方で、一本鎖FITC標識オリゴヌクレオチドは、同じ条件下で主に核で見出された。
【0118】
4.ホスホロチオエート改変オリゴマーを用いたヒト初期臍帯細胞(HUVEC)におけるEdg−1発現の阻害
ヒト細胞(HUVEC、ヒト臍帯静脈内皮細胞)におけるEdg−1の遺伝子発現を阻害するために、実施例3で説明したように特定の位置をホスホロチオエートで改変したオリゴリボヌクレオチド類似体を初期のヒト細胞に用いた。
【0119】
【化20】
【0120】
分析混合物18〜20の二本鎖オリゴリボヌクレオチドは、1つの鎖(非コーディング)のみに、2′5′−結合オーバーハングした残基を有する(特定のインターヌクレオチド結合のみがホスホロチオエートで改変された)。この特徴は、同様に本発明の特定の実施形態である。
【0121】
【表4】
【0122】
この実験は、供与量をより多様に変化させて繰り返された。
【表5】
【0123】
本発明の化学修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドで初期HUVEC細胞を処理することにより、edg−1発現の用量依存性の阻害が生じた。edg−1特異的オリゴヌクレオチドで処理した後、分析混合物18および19において、チューブリンレベルではなくEdg−1タンパク質レベルだけが減少したことから、前記阻害は標的遺伝子特異的であることが証明された。また、分析混合物18および19のedg−1相同オリゴヌクレオチドだけがedg−1発現を阻害したが、その一方で、5個のヌクレオチドがedg−1配列とは異なる分析混合物20の二本鎖核酸はedg−1発現を阻害しなかったことから、阻害は、用いられたオリゴヌクレオチドに関して配列特異的であることが証明された。
Claims (36)
- 式I:
xおよびyは、互いに独立して、10〜100であり、
nは、独立して、0〜20であり、
mは、独立して、0〜20であり、
pは、独立して、0〜10であり、
WおよびZは、3′5′または2′5′インターヌクレオシド結合を介して結合した天然に存在する、または天然に存在しないヌクレオチドであり、
Liは、2つのヌクレオチド鎖を共有結合させるリンカーであり、
少なくとも2つの残基ZまたはWは、2′5′インターヌクレオシド結合を介して結合され、一本鎖形態で存在し、そしてmおよびnは同時に0ではない)
で示されるオリゴヌクレオチド。 - xおよびyが互いに独立して15〜45である、請求項1に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- xおよびyが互いに独立して16〜25である、請求項2に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- nが2〜10である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- nが3〜6である、請求項4に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- mが0〜10である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- mが0〜6である、請求項6に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- mが0である、請求項7に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- xとyとが等しく、そしてnが4〜6である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- pが0〜5である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- pが0である、請求項10に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- 相同標的RNAが、以下の配列パターン:
5′−(U)v−(N)z−(U)w
5′−(U)v−(N)z−UX
5′−UX−(N)z−UX、および、
5′−(U)v−(N)z
(式中、vは独立して2〜20であり、wは独立して2〜20であり、zは独立して15〜25であり、Uはウリジンであり、NはA、G、CまたはUであり、XはA、GまたはCである)
のいずれか1つを有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。 - vが2〜10である、請求項12に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- vが2〜6である、請求項12または13に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- wが2〜10である、請求項12〜14のいずれか一項に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- wが2〜6である、請求項15に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- zが16〜23である、請求項12〜16のいずれか一項に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- zが19〜21である、請求項17に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- Zがアデノシンまたは3′−デオキシアデノシンである、請求項1〜18のいずれか一項に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- 1またはそれ以上の天然ホスホジエステル結合が、ヌクレアーゼ分解に対して安定な非天然のインターヌクレオチド結合で置換された、請求項1〜19のいずれか一項に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- 1またはそれ以上の天然ホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合で置換された、請求項1〜20のいずれか一項に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- 複数の天然ホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合で置換され、この改変は末端および内部ピリミジンヌクレオチドに位置する、請求項1〜21のいずれか一項に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- LiがヌクレオチドNである、請求項1〜22のいずれか一項に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- Liが非ヌクレオチドリンカーである、請求項1〜23のいずれか一項に記載の式Iで示されるオリゴヌクレオチド。
- 初めに適切な標的遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドを調製し、このオリゴヌクレオチドを細胞に導入し、この細胞をインキュベートし、次に、コントロール細胞中の対応するmRNAまたは対応する遺伝子産物の量を比較測定することにより、標的遺伝子の遺伝子発現の阻害を測定する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の1またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを用いて細胞での標的遺伝子の遺伝子発現を抑制する方法。
- 2′5′−オリゴアデニレートシンターゼが、コントロール細胞に比べて低く発現されるか、または不完全である、請求項25に記載の、細胞での標的遺伝子の遺伝子発現を抑制する方法。
- 請求項1〜24のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、ならびに、添加剤および/またはキャリアー、ならびに、必要に応じて、医薬を製造または処方するための賦形剤を含む医薬。
- 腫瘍治療における、請求項27に記載の医薬の使用。
- 感染症の治療または予防における、請求項27に記載の医薬の使用。
- ウイルス性疾患の治療または予防における、請求項27に記載の医薬の使用。
- 炎症または喘息の治療における、請求項27に記載の医薬の使用。
- 心臓血管性疾患または代謝性疾患の治療における、請求項27に記載の医薬の使用。
- 新規の治療用標的遺伝子を同定または確認するための、請求項1〜24のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 作物保護研究において、新規の標的遺伝子を同定または確認するための、請求項1〜14のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 初めに、オリゴヌクレオチドを溶液中または固相で、連続カップリングまたはブロックでのカップリングにより調製し、必要に応じてハイブリダイズして二本鎖を得て、調製後に単離および精製する、請求項1〜24のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを調製する方法。
- 請求項35に記載のオリゴヌクレオチド誘導体を調製し、必要に応じてさらなる添加剤および/またはキャリアー、ならびに、必要に応じて賦形剤と混合する、医薬を製造する方法。
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