JP2004524816A - PUMPCn組成物とその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(発明の分野)
本発明は、一般的に、新規なDNAの同定及び単離、及びここで「PRO23203」ポリペプチドと称される新規なポリペプチド、Protein Upregulated in Metastatic Prostate Cancer(転移性前立腺癌において上方制御されるタンパク質)(PUMPCn)の組換え生産に関する。
【0002】
(発明の背景)
膜結合タンパク質及びレセプターは、多細胞生物の、特に、形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、転移、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び/又は直近の環境から受け取られる情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ、そして解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞の増殖及び分化を制御するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に制御される。そのプロセスを触媒する酵素であるプロテインチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用することができる。具体例には、線維芽細胞増殖因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド間相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。また、膜結合タンパク質は、関連するレセプター/リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。
新規な天然のレセプター又は膜結合タンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプター又は膜結合タンパク質のコード配列を同定するために、哺乳動物の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。
【0003】
男性にとって、前立腺癌は肺癌に次いで2番目に最も致死率の高い癌である。前立腺癌の発症の増加は、世界的に見て最も高いものの一つであると考えられている。実際、6人に1人は浸潤性の前立腺癌を発症する。進行段階において、前立腺癌は骨に転移するが、一度転移すると、前立腺癌は通常不治の病となる。現在、前立腺特異的抗原(PSA)は、スクリーニング、診断、及び前立腺癌をモニターするのに最も広く用いられる腫瘍マーカーである。しかしながら、スクリーニングのためのツールとしてのPSAの広範な使用は、PSAが良性と悪性の前立腺疾患を正確に識別することができないため、問題となっている。
癌の段階に依存して、前立腺及び膀胱癌の治療は、以下に示す治療の一又は組合わせを含む:癌性組織の外科的除去、放射線療法、化学療法、前立腺癌の場合はアンドロゲン剥脱(例えば、ホルモン療法)。ホルモン療法が行われる多くの患者は、アンドロゲン非依存性の疾患に進行する。現在、外科的又は放射線療法後、再発性の疾患を発症させる前立腺癌患者の20−40%、又は癌が診断の時点で転移している患者にとって、有効な治療が存在しない。化学療法は、特に高齢の患者に対してその毒性の副作用を示す。特にアンドロゲン剥脱に難治性の疾患にとって、新規の形態の治療法を開発することは、前立腺癌の処置において緊急性を要することである。
【0004】
抗体ベースの治療は、種々の癌において非常に有効であることが実証されている。例えば、HERCEPTIN(登録商標)及びRITUXAN(登録商標)(共にGenentech, S. San Francisco)は、各々、乳癌及び非ホドキンリンパ腫を治療するのに有効に使用されてきた。
本発明は、従来の治療法の限界を打ち破り、以下の詳細な説明から明らかとなる付加的な利点を提供する既存の方法に代わる癌の治療法に関する。
我々は、ここにおいて、PRO23203ポリペプチドと称される新規ポリペプチドPUMPCnの同定及び性質決定について記載する。PUMPCnの断片は既に記述されており、WO98/37093, WO98/37418, WO99/61469, WO99/62941, WO00/04149, WO01/25272, U.S.6,048,970, WO99/62941及びWO01/40276を参照のこと。
(発明の概要)
【0005】
cDNAクローン(ここにではDNA185171−2994と称される)がPUMPCnとして同定され、これは本出願において「PRO23203」と称される新規ポリペプチドをコードする。
一実施態様では、本発明は、PRO23203ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
一側面では、単離された核酸分子は、(a)図2(配列番号:2)の、約1から約454番目のアミノ酸残基を含む配列を有するPRO23203ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は(b)(a)のヌクレオチド配列の相補鎖に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
他の側面では、単離された核酸分子は、(a)図2(配列番号:2)を含む、約1から約454番目のアミノ酸残基の配列を有するPRO23203をコードするヌクレオチド配列、又は(b)(a)のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【0006】
他の側面では、単離された核酸分子は、(a)図1(配列番号:1)の、約188から約1549番目を含むヌクレオチドの配列を有するDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む。
さらに他の側面では、単離された核酸分子は、(a)図1(配列番号:1)の、約188から約1549番目を含むヌクレオチドの配列、又は(b)(a)のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【0007】
さらなる側面では、本発明は、(a)ATCC寄託番号PTA−2513(DNA185171−2994)として2000年9月26日付けでATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAによりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA 分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様においては、単離された核酸分子は、(a)ATCC寄託番号PTA−2513(DNA185171−2994)として2000年9月26日付けでATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAによりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は(b)(a)のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【0008】
他の側面では、本発明は、(a)ATCC寄託番号PTA−2513(DNA185171−2994)として2000年9月26日付けでATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAの全長ポリペプチドコード化配列、又は(b)(a)のヌクレオチド配列の相補鎖に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。好ましい実施態様においては、単離された核酸分子は、(a)ATCC寄託番号PTA−2513(DNA185171−2994)として2000年9月26日付けでATCCに寄託されたDNAの全長ポリペプチドコード化配列、又は(b)(a)のヌクレオチド配列の相補鎖を含む。
【0009】
他の側面では、本発明は、図2(配列番号:2)の1から約454含むアミノ酸をコードする核酸配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、下記に定義される活性なPRO23203ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で行われる。
さらに他の側面では、本発明は、図1(配列番号:1)の約ヌクレオチド188から約1549の間を含む核酸配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、下記に定義される活性なPRO23203ポリペプチドをコードする単離された核酸分子関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で行われる。
さらなる側面では、本発明は、少なくとも約1204ヌクレオチドを有し、(a)図2(配列番号:2)の約1から454を含むアミノ酸残基の配列を有するPRO23203ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖と緊縮性の条件下でテストDNA分子をハイブリダイズさせることにより、また、テストDNA分子が(a)又は(b)と少なくとも約80%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有している場合には、テストDNAを単離することによって生産される単離された核酸分子に関する。
【0010】
本発明の他の側面は、膜貫通ドメイン欠損又は膜貫通ドメイン不活性のどちらかであるPRO23203ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそのようなコード化ヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列を含み、膜貫通ドメインが、図2(配列番号:2)の配列中、暫定的にアミノ酸位置約210からアミノ酸位置約230にかけて同定される、単離された核酸分子を提供する。
この点において、本発明の他の側面は、(a)図2(配列番号:2)のアミノ酸1からXをコードし、Xが図2(配列番号:2)の205から214の任意のアミノ酸であるDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖と少なくとも約80%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に対する。特別の側面において、単離された核酸分子は、(a)図2(配列番号:2)のアミノ酸1からXをコードし、Xが図2(配列番号:2)の205から214の任意のアミノ酸である、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖である核酸配列を含む。
【0011】
他の実施態様はPRO23203ポリペプチドコード化配列の断片に対するもので、それらは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして、場合によっては抗−PRO23203抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするPRO23203ポリペプチドのコード化断片としての用途が見いだされる。このような核酸断片は、通常は少なくとも約20ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約30ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約40ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約50ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約60ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約70ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約80ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約90ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約100ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約110ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約120ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約130ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約140ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約150ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約160ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約170ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約180ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約190ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約200ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約250ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約300ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約350ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約400ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約450ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約500ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約600ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約700ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約800ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約900ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約1000ヌクレオチド長であり、ここで「約」という語の内容は参照する長さのプラス又はマイナス10%のヌクレオチド配列長を指すことを意味する。好ましい実施態様において、ヌクレオチド配列断片は、図1(配列番号:1)に示されるヌクレオチド配列の任意のコード領域に由来する。PRO23203ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くの良く知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを用いてPRO23203ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の公知のヌクレオチド配列とを整列させ、いずれのPRO23203ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより、日常的な手法で同定してもよい。このようなPRO23203ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列は、全てここで考慮され、過度の実験を行わずに決定することができる。また、これらのヌクレオチド分子断片、好ましくは抗−PRO23203抗体に対する結合部位を含むPRO23203ポリペプチド断片によってコードされるPRO23203ポリペプチド断片も考慮される。
【0012】
他の実施態様において、本発明はPRO23203又はその変異体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。該ベクターは前述したように同定される単離された任意の核酸分子を含んでもよい。
また、このようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例としては、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌、又は酵母であってもよい。PRO23203ポリペプチドの製造方法がさらに提供されており、それは、宿主細胞をPRO23203の発現に適した条件下で培養し、細胞培地からPRO23203を回収することを含む。
他の実施態様において、本発明は前述したように同定される単離された任意の核酸配列によりコードされる単離されたPRO23203ポリペプチドを提供する。
特別な側面において、本発明は単離された天然配列のPRO23203ポリペプチドであって、ある実施態様においては、図2(配列番号:2)に示す約1から約454の残基を含むアミノ酸配列を包含するものを提供する。
【0013】
他の側面において、本発明は、図2(配列番号:2)の約1から454を含むアミノ酸残基の配列と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPRO23203ポリペプチドに関する。
【0014】
更なる側面において、本発明は、ATCC寄託番号PTA−2513(DNA185171−2994)として2000年9月26日付けでATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAによってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPRO23203ポリペプチドに関する。好ましい実施態様において、本発明は、ATCC寄託番号PTA−2513(DNA185171−2994)として2000年9月26日付けでATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAによってコードされるアミノ酸配列を含む。
【0015】
他の側面では、本発明は膜貫通ドメイン欠損又は膜貫通ドメイン不活性のどちらかである単離されたPRO23203ポリペプチドを提供する。同一のものを生産する方法もここに記載されており、それらの方法はPRO23203ポリペプチドの発現に適する条件下で適切なコード化配列核酸分子を含むベクターを包含する宿主細胞を培養し、細胞培養物からPRO23203ポリペプチドを回収することを含む。
従って、本発明の一つの側面は、図2(配列番号:2)の1からXであって、Xが図2(配列番号:2)の205から214の任意のアミノ酸であるアミノ酸と少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離された可溶性PRO23203ポリペプチドを示す。好ましい側面において、単離された可溶性PRO23203ポリペプチドは、図2(配列番号:2)の1からXであって、Xが図2(配列番号:2)の205から214の任意のアミノ酸であるアミノ酸を含む。
【0016】
さらに他の側面において、本発明は、図2(配列番号:2)の約1から454を含むアミノ酸残基の配列、又は生物学的に活性な又は抗−PRO23203抗体に対する結合部位を提供するのに十分なその断片を含み、その生物学的活性を有し、抗−PRO23203抗体に対する結合部位を提供するPRO23203ポリペプチド断片の同定が、当該技術分野において周知の技術を用いる常套手段によって達成される、単離されたPRO23203ポリペプチドに関する。好ましくは、PRO23203断片は天然PRO23203ポリペプチドの定性的生物学的活性を保持する。
またさらなる側面において、本発明は、(i)緊縮性の条件下において、(a)図2(配列番号:2)の約1から約454を含むアミノ酸残基の配列を有するPRO23203ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖とテストDNA分子をハイブリダイズすることによって、及びテストDNA分子が(a)又は(b)と少なくとも約80%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有している場合に、(ii)ポリペプチドの発現に適する条件下でテストDNAを含む宿主細胞を培養することにより、(iii)該細胞培養物からポリペプチドを回収することにより、生産されるポリペプチドを提供する。
【0017】
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したPRO23203ポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供し、前述したようにPRO23203ポリペプチドは任意のPRO23203ポリペプチド、その変異体又は断片を含んでもよい。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのFc領域に融合したPRO23203ポリペプチドを含む。
その他の実施態様では、本発明は、上記のPRO23203ポリペプチドに特異的に結合する後述の抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。本発明の一の側面において、抗−PUMPCn抗体は、配列番号:2のアミノ酸1−50の範囲内に存在するエピトープと結合し、或いは、エピトープはアミノ酸51−100、又はアミノ酸101−150、又は151−200、又は201−250、又は251−300の範囲内に存在する。また、本発明はPUMPCn(配列番号:2を参照)のアミノ酸25−213の範囲内に存在するエピトープを結合するモノクローナル抗体も提供する。特定の実施態様において、実施例13中に記載され、ATCC登録番号を有するmAbs3248から3256が提供される。
一実施態様において、本発明は生きた細胞上のPUMPCnと結合する抗体を提供する。他の実施態様において、本発明はPUMPCnの細胞外ドメインと結合する抗体を提供する。本発明はインビボにおいて哺乳類細胞上のPUMPCnと結合して内部移行する単離された抗−PUMPCn抗体を提供する。また、これらの抗体はインビボにおいてPUMPCnを発現する腫瘍細胞を標的することもできる。特別な実施態様において、抗−PUMPCn抗体は、前立腺癌、肺癌を含む癌細胞上のPUMPCnと結合し内部移行する。また、本発明のモノクローナル抗体のいずれかによって結合されるエピトープと同じエピトープとの結合に関し競合する抗体も提供される。他の実施態様において、インビボにおいてPUMPCnを発現する癌細胞の増殖を阻害し、又はインビボにおいて該細胞及び該細胞を含む腫瘍に対して細胞障害性である、単離された抗−PUMPCnモノクローナル抗体が提供される。
【0018】
また、本発明は細胞障害性薬剤又は増殖阻害剤と結合した抗−PUMPCn抗体も提供する。この抗体は内部移行性、及び/又は増殖阻害性抗体である。細胞障害性薬剤は毒素、抗生剤、放射性同位体又はヌクレオチド分解酵素であってもよい。好ましい実施態様において、毒素はメイタンシノイドであり、より好ましくは図6に示される構造を持つメイタンシノイドである。
前述の実施態様中の抗−PUMPCn抗体には、無傷(全長の)抗体並びに抗体断片が含まれる。本発明の抗体は哺乳動物又はバクテリアの細胞中で生産されるものを含む。
さらに他の実施態様において、本発明は以下に定義される天然PRO23203ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別の実施態様において、アゴニスト又はアンタゴニストは、抗−PRO23203抗体又は小分子である。
さらなる実施態様において、本発明は、PRO23203ポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法であって、PRO23203ポリペプチドを候補分子に接触させ、前記PRO23203ポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることを含んでなる方法に関する。好ましくは、PRO23203ポリペプチドは天然PRO23203ポリペプチドである。
またさらなる実施態様において、本発明はPRO23203ポリペプチド、又はここで記載されるPRO23203ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗−PRO23203抗体を担体と組合わせて含む組成物に関する。場合によっては、担体は薬学的に受容可能な坦体である。
本発明の他の実施態様は、PRO23203ポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗−PRO23203抗体に反応性の状態の治療に有効な医薬の調製のための、PRO23203ポリペプチド、ここで記載されるようなそのアゴニスト又はそのアンタゴニスト、又は抗−PRO23203抗体の使用に関する。
【0019】
さらに、本発明の別の側面は、PUMPCnを発現する癌細胞を殺す方法であって、前述の実施態様のいずれかの抗−PUMPCn抗体に癌細胞を接触させ、それにより癌細胞を殺すことを含む方法である。他の側面は、哺乳動物のPUMPCnを発現する癌を緩和し、治療する方法であって、該哺乳動物に対して本発明の抗−PUMPCn抗体の治療的有効量を投与することを含む方法である。前述の2つの方法の好ましい実施態様において、癌は前立腺、膀胱又は肺癌であり、より好ましくは前立腺癌及び特にアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞又は転移性前立腺癌である。これらの方法の好ましい実施態様において、抗−PUMPCn抗体はヒト又はヒト化抗体である。他の好ましい実施態様において、抗体は毒素や放射性同位体などの細胞障害性薬剤と結合する。好ましくは、図6に示される構造を有する「DM1」などのカリケアマイシン又はメイタンシノイドである。PUMPCnを発現する癌を緩和する方法は、哺乳動物が少なくとも一つの化学療法剤も受容する化学療法と併せて抗−PUMPCn抗体を投与することを予想する。特別の実施態様において、化学療法剤はパクリタキセル(TAXOL登録商標)又はドセタキセル、又はそれらの誘導体及び類似体などのタキサンである。
さらなる側面において、本発明は中に含まれる容器及び組成物を含む製造品であって、該組成物は前述の実施態様の抗−PUMPCn抗体を含み、該組成物がPUMPCn発現癌、特に前立腺癌を緩和し又は治療するために使用され得るものであることを示す添付文書をさらに含む製造品を提供する。
【0020】
(好適な実施態様の詳細な説明)
I.定義
ここで使用される際の「PRO23203ポリペプチド」、「PRO23203タンパク質」及び「PRO23203」という用語は、天然配列PRO23203及びPRO23203ポリペプチド変異体(ここで更に詳細に定義する)を含む。PRO23203ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源などの種々の供給源から単離してもよく、組換え及び/又は合成方法により調製してもよい。
「天然配列PRO23203」は、天然由来のPRO23203と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列PRO23203は、自然から単離することもできるし、組換え及び/又は合成手段により生産することもできる。「天然配列PRO23203」という用語には、特に、PRO23203の自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及び自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列PRO23203は、図2(配列番号:2)のアミノ酸1−454を含む成熟又は全長天然配列PRO23203である。また、図2(配列番号:2)に開示されるPRO23203ポリペプチドは、ここではアミノ酸位置1として示されるメチオニン残基から始まることが示されているが、図2(配列番号:2)中のアミノ酸位置1の上流又は下流のいずれかに位置する他のメチオニン残基がPRO23203ポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられ得ることは考えられることであり、またあり得ることである。
【0021】
PRO23203ポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ECD」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないPRO23203ポリペプチドの形態を意味する。通常、PRO23203ポリペプチドECDは、それらの膜貫通及び/又は細胞質ドメインを約1 %未満、好ましくはそのようなドメインを約0.5 %未満しか持たない。本発明のPRO23203ポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのタイプを同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約5アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、本発明の一実施態様においては、PRO232203ポリペプチドの細胞外ドメインはアミノ酸1からXを含み、Xは図2(配列番号:2)のアミノ酸205から214の任意のアミノ酸である。
【0022】
「PRO23203変異体ポリペプチド」は、(a)図2(配列番号:2)に示される、PRO23203ポリペプチドの残基1から454、(b)Xが図2(配列番号:2)のアミノ酸205から214の任意のアミノ酸である、図2(配列番号:2)の1からX、又は(c)図2(配列番号:2)に示されるアミノ酸配列の他の特異的誘導断片のアミノ酸配列と少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する以下で定義される活性なPRO23203ポリペプチドを意味する。このようなPRO23203変異体ポリペプチドは、例えば、図2(配列番号:2)のN−又は/及びC−末端並びに一又は複数の内部ドメインにおいて、1又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたPRO23203ポリペプチドが含まれる。通常、PRO23203変異体ポリペプチドは、(a)図2(配列番号:2)に示される、PRO23203ポリペプチドの残基1から454、(b)Xが図2(配列番号:2)のアミノ酸205から214の任意のアミノ酸である、図2(配列番号:2)の1からX、又は(c)図2(配列番号:2)に示されるアミノ酸配列の他の特異的誘導断片に、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有している。PRO23203変異体ポリペプチドは、天然PRO23203ポリペプチド配列を含まない。通常は、PRO23203変異体ポリペプチドは、少なくとも約10アミノ酸長、あるいは少なくとも約20アミノ酸長、あるいは少なくとも約30アミノ酸長、あるいは少なくとも約40アミノ酸長、あるいは少なくとも約50アミノ酸長、あるいは少なくとも約60アミノ酸長、あるいは少なくとも約70アミノ酸長、あるいは少なくとも約80アミノ酸長、あるいは少なくとも約90アミノ酸長、あるいは少なくとも約100アミノ酸長、あるいは少なくとも約150アミノ酸長、あるいは少なくとも約200アミノ酸長、あるいは少なくとも約300アミノ酸長、又はそれより長い。
【0023】
ここに同定されるPRO23203ポリペプチドに対する「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要ならば最大のパーセント配列同一性を得るためにギャップを導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えずに、PRO23203配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN、ALIGN−2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN−2プログラム用の完全なソースコードが下記の表1に提供されている配列比較プログラムALIGN−2を使用することによって得られる。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムはGenentech社によって作成され、下記の表1に示したソースコードは米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN−2プログラムはGenentech社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、表1に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN−2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標) V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定され変動しない。
【0024】
【0025】
ここでの目的に関しては、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。%アミノ酸配列同一性の計算の例として、表2A−Bは、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「PRO」と称されるアミノ酸配列に対する%アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【0026】
表2A−DはALIGN−2配列比較コンピュータープログラムを用いて%アミノ酸配列同一性(表2A−B)及び%核酸配列同一性(表2C−D)を決定するための以下に記載の方法を用いるために、仮想的な例示を示すが、ここで「PRO」は対象の仮想的なPRO23203ポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較タンパク質」は対象の「PRO」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「PRO−DNA」は対象の仮想的なPRO23203コード化核酸配列を示し、「比較DNA」は対象の「PRO−DNA」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を示し、「X」、「Y」及び「Z」は各々異なる仮想的アミノ酸残基を示し、「N」、「L」及び「V」は各々異なる仮想的ヌクレオチドを示す。
【0027】
【0028】
【0029】
特に断らない限りは、ここでの全ての%アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN−2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI−BLAST2(Altschulら, Nucleic Acids Res. 25: 3389−3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI−BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。NCBI−BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe−値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。
アミノ酸配列比較にNCBI−BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムNCBI−BLAST2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【0030】
「PRO23203変異体ポリヌクレオチド」又は「PRO23203変異体核酸配列」とは、下記に定義されるような活性なPRO23203ポリペプチドをコードし、(a)図2(配列番号:2)に示される、PRO23203ポリペプチドの残基1から454をコードする核酸配列、(b)Xが図2(配列番号:2)のアミノ酸205から214の任意のアミノ酸である、図2(配列番号:2)のアミノ酸1からXをコードする核酸配列、又は(c)図2(配列番号:2)に示されるアミノ酸配列の他の特異的誘導断片をコードする核酸配列のいずれかと少なくとも約80%の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、PRO23203変異体ポリヌクレオチドは、(a)図2(配列番号:2)に示される、PRO23203ポリペプチドの残基1から454をコードする核酸配列、(b)Xが図2(配列番号:2)のアミノ酸205から214の任意のアミノ酸である、図2(配列番号:2)のアミノ酸1からXをコードする核酸配列、又は(c)図2(配列番号:2)に示されるアミノ酸配列の他の特異的誘導断片をコードする核酸配列のいずれかと少なくとも約80%の核酸配列同一性、好ましくはあるいは少なくとも約81%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有している。PRO23203ポリヌクレオチド変異体は、天然PRO23203ヌクレオチド配列を含まない。
【0031】
通常は、PRO23203変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約30ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約60ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約90ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約120ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約150ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約180ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約210ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約240ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約270ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約300ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約450ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約600ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約900ヌクレオチド長、又はそれより長い。
ここで同定されるPRO23203ポリペプチドコード化核酸配列に対する「パーセント(%)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要ならば最大のパーセント配列同一性を得るためにギャップを導入し、PRO23203ポリペプチドコード化核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN、ALIGN−2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、%核酸配列同一性値は、後述するように配列比較コンピュータープログラムALIGN−2を用いることにより得られ、ALIGN−2プログラムの完全なソースコードは表1に提供されている。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表1に示したソースコードは米国著作権事務所,ワシントン D.C.,20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN−2プログラムはジェネンテク社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の表1に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN−2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、特にデジタルUNIX(登録商標) V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定され変動しない。
【0032】
ここでの目的に関しては、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Dと、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムALIGN−2のC及びDのアラインメントによって等しく一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ZはDの全ヌクレオチド数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。%核酸配列同一性の計算の例として、表2C−Dは、「比較DNA」と称される核酸配列の「PRO−DNA」と称される核酸配列に対する%核酸配列同一性の計算方法を示す。
【0033】
【0034】
【0035】
特に断らない限りは、ここでの全ての%核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに示したようにALIGN−2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI−BLAST2(Altschulら, Nucleic Acids Res. 25: 3389−3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI−BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。NCBI−BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe−値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。
核酸配列比較にNCBI−BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(あるいは、与えられた核酸配列Dと、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムNCBI−BLAST2のC及びDのアラインメントによって等しく一致したスコアの核酸残基の数であり、ZはDの全核酸残基数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【0036】
他の実施態様では、PRO23203変異体ポリヌクレオチドは、活性PRO23203ポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、図2(配列番号:2)に示される完全長PRO23203ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子である。PRO23203変異体ポリペプチドは、PRO23203変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは天然に付随する全ての構成成分から遊離されている。その自然環境の夾雑成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(1)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(2)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS−PAGEによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、PRO23203の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも1つの精製工程により調製される。
【0037】
「単離された」PRO23203ポリペプチドコード化核酸分子は、同定され、PRO23203をコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも1つの夾雑核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は天然に付随する全ての構成成分から遊離されている。単離されたPRO23203コード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するPRO23203コード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたPRO23203ポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるPRO23203を通常発現する細胞に含まれるPRO23203コード化核酸分子を含む。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なDNA配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【0038】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み枠が一致していることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限酵素部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【0039】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗−PRO23203モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗−PRO23203抗体組成物、一本鎖抗−PRO23203抗体、及び抗−PRO23203抗体の断片を包含している(下記参照)。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
ここで、モノクローナル抗体は、「キメラ」抗体を含み、それは、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す場合には、その抗体の断片である(米国特許第4,816,567号;Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851−6855 (1984))。ここで対象であるキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、旧世界ザル、サルなど)から誘導した可変ドメイン抗原結合配列、及びヒト定常領域配列を含んでなる「霊長類化」抗体が含まれる。
「無傷の」抗体は、抗原結合部位並びにCL及び少なくとも重鎖定常ドメイン、CH1、CH2、及びCH3を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそのアミノ酸配列変異体である。好ましくは、無傷抗体は一又は複数のエフェクター機能を持つ。
ここで使用される場合、「内部移行する」抗−PUMPCn抗体とは、哺乳動物細胞上の−PUMPCn(すなわち細胞表面−PUMPCn)への結合時に細胞によって取り込まれる(すなわち入る)もののことである。もちろん、内部移行抗体には、抗体断片、ヒト又はヒト化抗体及び抗体コンジュゲートが含まれる。治療用途においてはインビボにおける内部移行が考慮される。内部移行した抗体分子の数は−PUMPCn−発現細胞、特に−PUMPCn−発現癌細胞を死滅させるのに十分な、又は適切な数である。抗体又は抗体コンジュゲートの効能に応じて、ある例においては、細胞への単一の抗体分子の取込みが、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、ある毒素は高い殺傷効能を有しており、抗体に結合した一分子の毒素の内部移行で、腫瘍細胞を死滅させるのに十分である。
【0040】
哺乳動物細胞においてPUMPCnへの結合時に抗−PUMPCn抗体が内部移行したか否かは、種々のアッセイにより決定することができる。例えば、インビボにおける内部移行を試験するために、試験抗体を標識し、所定の細胞表面にPUMPCnが発現していることが知られている動物に導入する。抗体は、例えば放射標識、又は蛍光もしくは金粒子で標識することができる。このアッセイに適した動物には、ヒトPUMPCn発現腫瘍移植片又は異種移植片を含むNCRヌードマウス、又はヒトPUMPCnで形質移入した細胞が導入されたマウス、又はヒトPUMPCn導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウス等の哺乳動物が含まれる。適切なコントロールには、試験抗体を受容していない、又は関連のない抗体を受容した動物、及び目的の細胞において他の抗原に対する抗体を受容した動物が含まれ、ここでその抗体は抗原への結合時に内部移行することが知られているものである(例えば、ヒト乳房腫瘍株化細胞MCF−7に発現したHer2に結合するHERCEPTIN)。抗体は、例えば静脈注射により動物に投与することができる。適切な間隔をあけて、動物の組織切片は公知の方法を使用するか、又は以下の実施例に記載されているようにして調製することができ、光学顕微鏡又は電子顕微鏡により、内部移行度合い、並びに細胞内の内部移行した抗体の位置が分析される。インビトロにおける内部移行に対しては、細胞を、培養培地に添加された適切な抗体の存在又は不在下で組織培養皿にてインキュベートし、所定の時点で顕微鏡分析するためにプロセシングする。細胞内の内部移行した標識化抗体の存在は、顕微鏡、又は放射標識された抗体が使用されるならばオートラジオグラフィーにより、直接可視化することができる。あるいは、定量的生化学アッセイにおいては、PUMPCn−発現細胞を含有する細胞の個体群を、放射標識された試験抗体とインビトロ又はインビボで接触させ、細胞(インビボにおいて接触させたならば、次に適当な時間の後に細胞を単離する)をプロテアーゼで処理するか、又は酸洗浄にかけて、細胞表面上の内部移行していない抗体を除去する。細胞を粉砕し、プロテアーゼ耐性の量、各バッチの細胞に関連する1分当たりの放射性カウント(cpm)を、シンチレーションカウンターにホモジェネートを通して測定する。放射標識された抗体の既知の特定の活性に基づき、細胞当たりの内部移行した抗体分子の数は、粉砕した細胞のシンチレーションカウントから推定することができる。例えば培養皿又はフラスコの細胞培養培地に細胞を添加し、抗体に細胞が均一にさらされるように培地と抗体をよく混合することにより、好ましくは溶液形態で、細胞は抗体とインビトロで「接触させる」。培地に添加する代わりに、細胞を、所望の時間、テスト用チューブに入ったPBS等の等張液において抗体と接触させることもできる。インビボにおいては、患者に投与する場合、以下に記載する投与方法等の、試験抗体を投与するための任意の適切な方法により、細胞は抗体と接触させる。
【0041】
インビボにおいて、抗体がPUMPCnを発現する細胞に結合してより速く内部移行するほど、標的PUMPCn発現細胞に対するより速い所望の殺傷又は増殖阻害効果が、例えば、細胞障害性免疫複合体によって達成され得る。好ましくは、抗−PUMPCn抗体の内部移行のキネティクスは、PUMPCn発現標的細胞の早急な殺傷に対して有利に働くようなものである。従って、抗−PUMPCn抗体が速い内部移行率、好ましくは、インビボにおける抗体の投与から24時間以内、より好ましくは12時間以内であることが望ましい。
試験抗体が、本発明の抗−PUMPCn抗体によって結合されるエピトープと同一のものとの結合に関し、競合し得るかどうか決定するために、クロスブロッキングアッセイ、例えば、競合エライザアッセイが実施される。典型的な競合エライザアッセイにおいて、マイクロタイタープレートの壁面上にコートされたPUMPCn又は関連するその断片は、候補の競合する抗体の存在下又は非存在下でプレインキュベートされ、次いで、本発明のビオチン標識化抗−PUMPCn抗体が添加される。ウェル中のPUMPCn抗原に結合した標識化抗−PUMPCn抗体の量は、アビジン−ペルオキシダーゼ結合体及び適当な基質を用いて測定される。抗体は、放射活性又は傾向標識又はその他の検出可能で測定可能な標識と共に標識化される。抗原と結合した標識化抗−PUMPCn抗体の量は、同じエピトープとの結合に関して競合する候補競合抗体(試験抗体)の能力と間接的に相関するであろう、つまり、同一のエピトープに対する試験抗体のアフィニティーが強い程、標識化抗体は抗原でコートしたウェルにほとんど結合しなくなるであろう。候補競合抗体の非存在下(但し、既知の非競合抗体の存在下でもよい)で、並行して行われるコントロールと比較して、候補抗体が少なくとも20%、好ましくは20−50%、さらにより好ましくは、少なくとも50%でPUMPCn抗体の結合をブロックすることが可能ならば、抗体と競合する候補は、実質的に同じエピトープに結合するか、又は本発明抗−PUMPCn抗体と同一のエピトープとの結合に関し競合する抗体であると考えられる。本アッセイの変法が実施されて、同一の定量値を得ることが理解されるであろう。
【0042】
「PUMPCnを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体」又は「増殖阻害」抗体は、PUMPCnを発現又は過剰発現する癌細胞と結合し、その測定可能な程の増殖阻害を引き起こすものである。好ましい増殖阻害抗−PUMPCn抗体は、典型的には、試験された抗体で処理されていない腫瘍細胞であるコントロールであって、適切なコントロールと比較して、20%より多く、好ましくは約20%から約50%、そしてさらに好ましくは50%よりも多く(例えば、約50%から約100%)でPUMPCn発現腫瘍細胞の増殖を阻害する(例えば、前立腺癌細胞)。増殖阻害は、細胞培養で約0.1から30μg/ml又は約0.5 nMから200 nMの抗体濃度で測定することができ、抗体への腫瘍細胞の曝露の後、増殖阻害を1−10日で確かめる。約1μg/kgから約100 mg/kg体重の抗−PUMPCn抗体の投与が、最初の抗体の投与から約5日から3ヶ月内、好ましくは約5から30日内に腫瘍の大きさ又は腫瘍細胞増殖に減少を引き起こす場合、この抗体はインビボにおいて増殖阻害的である。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)(例えば扁平上皮細胞癌)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃(gastric)又は腹部(stomach)癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、肝癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、大腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)又は腎(renal)癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、多発性骨髄腫及びB−細胞リンパ腫、脳、並びに頭部及び頸部の癌、及び関連した転移が含まれる。
【0043】
「PUMPCn発現細胞」は、細胞の表面に内因性又は形質移入されたPUMPCnを発現する。「PUMPCn発現癌」は、細胞表面上に存在するPUMPCnタンパク質を有する細胞を含む癌である。「PUMPCn発現癌」は、その細胞の表面上に十分なレベルのPUMPCnを生産し、抗−PUMPCn抗体はそれへ結合することができ、癌に関して治療的効果を有する。PUMPCnを「過剰発現」する癌は、同じ組織型の非癌性細胞と比較して、その細胞表面に顕著により高いレベルのPUMPCnを有するものである。そのような過剰発現は、遺伝子増幅又は増大した転写又は翻訳によって生じ得る。PUMPCn過剰発現は、診断又は予後アッセイにおいて、細胞の表面上に存在するPUMPCnタンパク質の増大したレベルを評価することによって確かめ得る(例えば、免疫組織化学アッセイを介して;FACS分析など)。あるいは、又は付加的に、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション;(FISH;1998年10月に公開のWO98/45479を参照せよ)、サザン ブロッティング、ノーザン ブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術、例えばリアルタイム定量PCR(RT−PCR)を介して、細胞のPUMPCnコード化核酸又はmRNAのレベルを測定してもよい。また、例えば、抗体ベースアッセイを用いて、血清のような生物学的体液中に流れている抗原を測定することによって、PUMPCn過剰発現を研究してもよい(同じく、例えば、1990年6月12日に公開の米国特許第4,933,294号;1991年4月18日に公開のWO91/05264;1995年3月28日に公開の米国特許第5,401,638号;Siasら., J. Immunol. Methods 132: 73−80(1990)を参照せよ)。上記のアッセイは別として、種々のインビボアッセイは、当業者にとって入手可能である。例えば、患者の体の中にある細胞を、例えば、放射活性アイソトープのような検出可能な標識で場合によって標識した抗体に曝してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば、放射活性の外部スキャンニングによって、又は以前に抗体へ曝した患者から取り出した生検を分析することによって評価することができる。PUMPCn発現癌には、前立腺及び肺癌が含まれる。
【0044】
「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治療上の処置及び予防的療法又は防護的療法の双方を称し、その目的は、標的である病的症状又は疾患を防ぐか又は衰え(小さく)させることである。治療を必要とするものには、疾患に罹りやすいものと同時に疾患にすでに罹っているもの、又は疾患が予防されるべきものを含む。本発明の方法に従って抗−PUMPCn抗体の治療量を投与された後に、患者が次の一つ又は複数のものについて観察可能な及び/又は測定可能な減少又は消失を示したならば、被検体又は哺乳動物は、PUMPCn発現癌に関して成功裏に「治療された」ことになる:PSAレベルの減少、癌細胞の数の減少、又は癌細胞の消失;腫瘍の大きさの減少;軟部組織及び骨への癌の広がりを含む、末梢器官への癌細胞の浸潤の阻害(すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止);腫瘍転移の阻害(すなわち、ある程度の減速及び好ましくは停止);腫瘍増殖のある程度の阻害;及び/又は特定の癌に関連している一つ又は複数の症状のある程度の緩和;疾病率及び死亡率の減少、及び生命問題の質の改善。ある程度、抗−PUMPCn抗体は、生存癌細胞の成長を防ぐ及び/又は死滅させることができ、それは、細胞増殖抑制及び/又は細胞障害性であり得る。これらの兆候又は症状の低減は、また、患者が感じることができる。
疾患において功を奏する治療及び改善を評価するための上述したパラメータは、医師によく知られている常套的な手段により、容易に測定可能である。癌治療における効能は、例えば病状の進行時間(TTP)の評価、及び/又は応答速度(RR)の決定により測定され得る。前立腺癌に対して、治療の進行は、通常、血清PSA(前立腺特異的抗原)レベルを測定することによる常套的な方法で評価することができ;血中のPSAレベルが高くなればなる程、癌が広がっている。PSAを検出するための市販のアッセイ、例えばHybitech Tandem−E及びTandem−R PSAアッセイキット、Yang ProsCheck polyclonal assay(Yang Labs, Bellevue, WA)、Abbott Imx(Abbott Labs, Abbott Park, IL)等を利用できる。転移はステージングテスト及び骨のスキャニングにより測定可能で、骨への広がりを測定するためには、カルシウムレベル及び他の酵素を試験する。またCTスキャンを実施して、領域内の骨盤及びリンパ節への広がりを探査することができる。胸部X線及び公知の方法による肝臓酵素レベルの測定が、肺及び肝臓へのそれぞれの転移を探査するために使用される。疾患のモニタリングのための他の常套的な方法には、経直腸的超音波検査(TRUS)及び経直腸的針バイオプシー(TRNB)が含まれる。
【0045】
「治療的有効量」という用語は、患者又は哺乳動物の疾患又は疾病を「治療」するのに効果的な抗体又は薬剤の量を意味する。癌の場合には、治療的有効量の薬剤により、癌細胞の数が減少し;腫瘍の大きさが小さくなり;末梢器官における癌細胞浸潤が阻害され(すなわち、ある程度の遅延化、好ましくは停止);腫瘍の転移が阻害され(すなわち、ある程度の遅延化、好ましくは停止);ある程度、腫瘍増殖が阻害され;及び/又は癌に関連した一又は複数の徴候がある程度緩和される。上述の「治療する」の定義を参照。薬剤が癌細胞の増殖を防止し、及び/又は存在する癌細胞を死滅させるならば、それは細胞増殖抑制性及び/又は細胞障害性であり得る。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞、特にPUMPCn発現癌細胞の増殖を、インビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、増殖阻害剤は、S期でPUMPCnを過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(S期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばG1停止又はM期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なM期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン、及びトポイソメラーゼII阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。また、G1停止させるこれらの薬剤は、S期停止にも波及し、例えば、DNAアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、5−フルオロウラシル、及びara−Cである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特にp13に見出すことができる。タキサン(パクリタキセル及びドセタキセル)は、ともにイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Rhone−Poulenc Rorer)は、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol−Myers Squibb)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
【0046】
ハイブリダイゼーション反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性DNAの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリダイゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【0047】
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.015 Mの塩化ナトリウム/0.0015 Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの;(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において50%(v/v)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの;又は(3)42℃における50%ホルムアミド、5xSSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5xデンハード液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、及び10%のデキストラン硫酸と、42℃における0.2xSSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び55℃での50%ホルムアミド、次いで55℃におけるEDTAを含む0.1xSSCからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
【0048】
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度及び%SDS)の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハード液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中の37℃での終夜インキュベーション、次いで1xSSC中37−50℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを理解するであろう。
ここで使用される「過剰発現」という用語は、癌細胞のような細胞の遺伝子及び/又はそのコード化タンパク質の過剰発現を意味する。タンパク質を「過剰発現」する癌細胞とは、同じ組織型の非癌細胞と比較して、顕著により高いレベルのそのタンパク質を有する癌細胞である。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したPRO23203ポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは融合されるポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなりユニークである。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8〜約50のアミノ酸残基(好ましくは約10〜約20のアミノ酸残基)を有する。
【0049】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG−1、IgG−2、IgG−3又はIgG−4サブタイプ、IgA(IgA−1及びIgA−2を含む)、IgE、IgD又はIgMなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
ここでの目的に対する「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生PRO23203の生物学的及び/又は免疫学的活性を保持するPRO23203の形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生PRO23203によって生ずる(阻害性又は刺激性の)生物学的機能であって、天然又は天然発生PRO23203が有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生PRO23203が有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。好ましい生物学的活性には、例えば、前立腺組織由来の細胞の増殖及び分化が含まれる。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PRO23203ポリペプチドの生物学的活性を部分的に又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PRO23203ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然PRO23203ポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。PRO23203ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、PRO23203ポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニスト分子と接触させ、PRO23203ポリペプチドに通常は関連している1つ又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
「慢性」投与とは、初期の治療効果(活性)を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ事実上、周期的になされる処理である。
1つ又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時(同時期)及び任意の順序での連続した投与を含む。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「有効量」という用語は、特定の目的の達成をもたらすPROポリペプチド及び/又はアゴニスト/アンタゴニストの濃度又は量のことである。PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの「有効量」は経験的に決定することができる。さらに「治療有効量」は、定められた治療効果の達成に有効なPROポリペプチド及び/又はアゴニスト/アンタゴニストの濃度又は量のことである。
この量もまた経験的に決定することができる。
【0050】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤;ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類;ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類;アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類;クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード;ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン;アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアミシン、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)などの抗生物質;メトトレキセート及び5−フルオロウラシル(5−FU)のような抗代謝物質;デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体;フルダラビン(fludarabine)、6−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体;アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、6−アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)、5−FUのようなピリミジン類似体;カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類;アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤;フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher);アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン(amsacrine);ベストラブシル(bestrabucil);ビサントレン(bisantrene);エダトラキセート(edatraxate);デフォファミン(defofamine);デメコルシン(demecolcine);ジアジコン(diaziquone);エルフォルニチン(elfornithine);酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate);エトグルシド(etoglucid);硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダミン(lonidamine);ミトグアゾン(mitoguazone);ミトキサントロン;モピダモール(mopidamol);ニトラクリン(nitracrine);ペントスタチン;フェナメット(phenamet);ピラルビシン;ポドフィリン酸(podophyllinic acid);2−エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標);ラゾキサン(razoxane);シゾフィラン;スピロゲルマニウム(spirogermanium);テニュアゾン酸(tenuazonic acid);トリアジコン(triaziquone);2,2’,2’’−トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン(mannomustine);ミトブロニトール;ミトラクトール(mitolactol);ピポブロマン(pipobroman);ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(「Ara−C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキサン、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol−Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Rhone−Poulenc Rorer, Antony, France);クロランブシル;ゲンシタビン(gemcitabine);6−チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体;ビンブラスチン;プラチナ;エトポシド(VP−16);イフォスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン(navelbine);ノバントロン(novantrone);テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;キセローダ(xeloda);イバンドロナート(ibandronate);CPT−11;トポイソメラーゼインヒビターRFS2000;ジフルオロメチロールニチン(DMFO);レチノイン酸;エスペラミシン;カペシタビン(capecitabine);並びに上述したものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、4(5)−イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、4−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(Fareston)を含む抗エストロゲン;及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン;並びに上記のものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【0051】
ここで用いられる「細胞障害性薬剤」という用語は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び/又は細胞の破壊を引き起こす物質のことをいう。この用語は放射活性アイソトープ(例えばAt211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 及びLuの放射性アイソトープ)、化学療法剤、及び小分子毒素又はその断片及び/又は変異体を含む、細菌性、真菌性、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素のようなものを含むことが意図されている。
ここで用いられる「担体」は、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性pH緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー;アスコルビン酸を含む酸化防止剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン;グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール;ナトリウム等の塩形成対イオン;及び/又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール(PEG)、及びPLURONICS(商品名)を含む。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFv断片;ダイアボディ(diabodies);直鎖状抗体(Zapataら, Protein Eng. 8(10): 1057−1062 [1995]);一本鎖抗体分子;及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。ペプシン処理はF(ab’)2断片を生じ、それは2つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した1本の重鎖と1本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各可変ドメインの3つのCDRが相互作用してVH−VL二量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、6つのCDRが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つのCDRのみを含んでなるFvの半分)でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【0052】
また、Fab断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)も含む。Fab断片は、抗体ヒンジ領域からの1つ又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりFab’断片と相違する。ここで、Fab’−SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つFab’を表す。F(ab’)2抗体断片は、最初はFab’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらの幾つかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及びIgA2に分類される。
【0053】
「一本鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Fvポリペプチドは、sFvが抗原結合にとって望ましい構造の形成を可能にする、VH及びVLドメイン間のポリペプチドリンカーを更に含む。sFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer−Verlag, New York, pp. 269−315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖(VH−VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第404,097号;WO93/11161;及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444−6448 (1993)により十分に記載されている。
【0054】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び/又は回収されたものである。その自然環境の夾雑成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(1)ローリー法で測定した場合95%を越える抗体、最も好ましくは99重量%を越えるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS−PAGEによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程により調製される。
特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに「特異的に結合する」又は「特異的である」抗体は、他のポリペプチド又はポリペプチドエピトープとは実質的に結合せずに、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープへ結合するものである。
【0055】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、「標識」抗体が生成されるように、抗体に直接又は間接的に抱合している検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自体検出可能でもよく(例えば、放射性標識又は蛍光標識)、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス(例えば、孔制御ガラス)、多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。ある実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ;その他では精製カラム(例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム)とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物(PRO23203ポリペプチド又はその抗体など)の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「マイクロアレイ」は、特異的に並べられた配列中のDNAプローブを持つ基質として定義され、組織サンプル由来の標識化核酸とハイブリダイズするもの、又は特異的に並べられた配列中の個々の組織を持つ基質として定義され、標識化核酸プローブとハイブリダイズするものである。
「小分子」とは、ここで、約500ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
ある患者において、前立腺癌はアンドロゲン除去(例えば、ホルモン治療など)によって治療される。患者の前立腺癌がホルモン療法に耐性となる場合、癌は「アンドロゲン非依存性前立腺癌」として定義される。
【0056】
II. 本発明の組成物と方法
A.完全長PRO23203ポリペプチド
本発明は、本出願でPRO23203と(又はUNQ6507とも)呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、PRO23203ポリペプチドをコードするcDNAが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるPRO番号が与えられるが、UNQ番号は全ての与えられたDNA及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、DNA185171−2994によってコードされるタンパク質並びに上記のPRO23203の定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「PRO23203」と称する。
下記の実施例に開示するように、ここでDNA185171−2994と称されるcDNAクローンがATCCに寄託されている。該クローンの正確なヌクレオチド配列は、当業者によって当該分野の常套的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技術を用いて決定できる。ここに記載したPRO23203ポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【0057】
B.PRO23203変異体
ここに記載した完全長天然配列PRO23203ポリペプチドに加えて、PRO23203変異体も調製できると考えられる。PRO23203変異体は、PRO23203DNAに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び/又は所望のPRO23203ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がPRO23203の翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然完全長配列PRO23203又はここに記載したPRO23203の種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列PRO23203と比較してPRO23203のアミノ酸配列が変化するPRO23203をコードする1つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも1つのアミノ酸のPRO23203の1つ又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、PRO23203の配列を相同な既知のタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、1つのアミノ酸の類似した構造及び/又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては1から5のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、全長又は成熟天然配列によって示される活性に関し、得られた変異体を試験することにより決定される。
【0058】
PRO23203ポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、完全長天然タンパク質と比較した際に、N−末端又はC−末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。ある種の断片は、PRO23203ポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
PRO23203断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でDNAを消化して所望の断片を単離することによるPRO23203断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、所望のポリペプチド断片をコードするDNA断片を単離し増幅することを含む。DNA断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、PCRの5’及び3’プライマーで用いられる。好ましくは、PRO23203ポリペプチド断片は、図2(配列番号:2)に示した天然PRO23203ポリペプチドと少なくとも1つの生物学的及び/又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換との見だしにて表3に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表3に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【0059】
【0060】
PRO23203ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、(a)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(b)標的部位の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の嵩の維持に対する効果が有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
【0061】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、より好ましくは残された(非保存)部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発などの当該技術分野において公知の方法を用いて実施することができる。部位特異的突然変異誘発[Carterら, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)]、カセット突然変異誘発[Wellsら, Gene, 34: 315 (1985)]、制限的選択突然変異誘発[Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)]又は他の既知の技術をクローニングしたDNAに実施してPRO23203変異体DNAを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って1つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である[Cunningham及びWells, Science, 244: 1081−1085 (1989)]。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い[Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)]。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【0062】
C.PRO23203の修飾
PRO23203の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の1つの型は、PRO23203ポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、PRO23203の選択された側鎖又はN又はC末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばPRO23203を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗−PRO23203抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、1,1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4−アジドサリチル酸とのエステル、3,3’−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−N−マレイミド−1,8−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−3−[(p−アジドフェニル)−ジチオ]プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79−86 (1983)]、N末端アミンのアセチル化、及び任意のC末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれるPRO23203ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列PRO23203に見られる1又は複数の炭水化物部分の欠失(存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び/又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる)、及び/又は天然配列PRO23203に存在しない1又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
【0063】
PRO23203ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、1又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列PRO23203(O−結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされてもよい。PRO23203アミノ酸配列は、場合によっては、DNAレベルでの変化、特に、PRO23203ポリペプチドをコードするDNAを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
PRO23203ポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259−306 (1981)に記載されている。
PRO23203ポリペプチド上に存在する糖鎖部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddinら, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdgeら, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
PRO23203の共有結合的修飾の他の型は、PRO23203ポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のPRO23203は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したPRO23203を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
【0064】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとPRO23203との融合を含む。エピトープタグは、一般的にはPRO23203のアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなPRO23203のエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってPRO23203を容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン(ポリ−his)又はポリ−ヒスチジン−グリシン(poly−his−gly)タグ;flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5[Fieldら, Mol. Cell. Biol., 8:2159−2165 (1988)];c−mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体[Evanら, Molecular and Cellular Biology, 5:3610−3616(1985)];及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体[Paborskyら, Protein Engineering, 3(6):547−553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、Flagペプチド[Hoppら, BioTechnology, 6:1204−1210(1988)];KT3エピトープペプチド[Martinら, Science, 255:192−194 (1992)];α−チューブリンエピトープペプチド[Skinnerら, J. Biol. Chem., 266:15163−15166 (1991)];及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ[Lutz−Freyermuthら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393−6397(1990)]を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はPRO23203の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態(「イムノアドヘシン」とも呼ばれる)については、そのような融合体はIgG分子のFc領域であり得る。免疫グロブリン融合体は、好ましくは免疫グロブリン分子内の少なくとも1つの可変領域に換えてPRO23203ポリペプチドの可溶化(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化)形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、IgG1分子のヒンジ、CH2及びCH3、又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。免疫グロブリン融合体の生産については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【0065】
D.PRO23203の調製
以下の説明は、主として、PRO23203核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりPRO23203を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてPRO23203を調製することができると考えられる。例えば、PRO23203配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい[例えば、Stewartら, Solid−Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969);Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149−2154 (1963)参照]。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(フォスター シティー, カリフォルニア)を用いて、製造者の指示により実施してもよい。PRO23203の種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて完全長PRO23203を生産してもよい。
1.PRO23203をコードするDNAの単離
PRO23203をコードするDNAは、PRO23203 mRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリーから得ることができる。従って、ヒトPRO23203DNAは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリーから簡便に得ることができる。またPRO23203−コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(PRO23203に対する抗体又は少なくとも約20−80塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。PRO23203をコードする遺伝子を単離する他の方法はPCR法を使用するものである[Sambrookら,上掲;Dieffenbachら, PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]。
【0066】
下記の実施例には、cDNAライブラリーのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のDNAとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、32P標識されたATPのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookらに示されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の限定された領域内又は全長に渡っての(アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの)配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されていないmRNAの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookらに記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して選択されたcDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【0067】
2.宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したPRO23203生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された従来の栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrookら, 上掲に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質移入の方法、例えば、CaCl2、CaPO4、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者にとって公知のものである。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらに記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315(1983)及び1989年6月29日公開のWO89/05859に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。そのような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456−457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞との細菌プロトプラスト融合、又はポリブレン、ポリオルニチンなどのポリカチオンなどを使用してもよい。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527−537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348−352 (1988)を参照のこと。
【0068】
ここに記載のベクターにDNAをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公的に利用可能であり、例えば、大腸菌K12株MM294(ATCC31,446);大腸菌X1776(ATCC31,537);大腸菌株W3110(ATCC27,325)及びK5772(ATCC53,635)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌などの腸内細菌科、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日発行のDD266,710に記載されたバチルス・リチェニフォルミス41P)、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスを含む。これらの例は限定ではなく例示である。株W3110は、組換えDNA生産物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株W3110は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌W3110株1A2;完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌W3110株9E4;完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15(argF−lac)169 degP ompT kanrを有する大腸菌W3110株27C7(ATCC 55,244);完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF−lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanrを有する大腸菌W3110株37D6;非カナマイシン耐性degP欠失変異を持つ37D6株である大腸菌W3110株40B4;及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばPCR又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【0069】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、PRO23203コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行の欧州特許第139,383号);クルベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)(米国特許第4,943,529号; Fleerら, Bio/Technology, 9: 968−975 (1991))、例えばクルベロミセスラクチス(K. lactis)(MW98−8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら, J. Bacteriol.154(2): 737−742 [1983])、クルベロミセス・フラギリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、クルベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、クルベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、クルベロミセス・ワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、クルベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Bergら, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、クルベロミセス・サーモトレランス(K. thermotolerans)及びクルベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus);ヤロウィア(yarrowia)(欧州特許第402,226号);ピチア・パストリス(Pichia pastoris)(欧州特許第183,070号; Sreekrishnaら, J. Basic Microbiol, 28: 265−278 [1988]);カンジダ;トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)(欧州特許第244,234号);アカパンカビ(Caseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259−5263 [1979]);シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日発行の欧州特許第394,538号);及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日発行の国際公開91/00357);及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルスニダランス(Balanceら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284−289 [1983]; Tilburnら, Gene, 26: 205−221 [1983]; Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470−1474 [1984])及びアスペルギルスニガー(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475−479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで増殖可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【0070】
グリコシル化PRO23203の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエS2及びスポドプテラSf9等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)及びCOS細胞を含む。より詳細な例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS−7,ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243−251 (1980))ヒト肺細胞 (W138,ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2,HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562,ATCC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【0071】
3.複製可能なベクターの選択及び使用
PRO23203をコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、1つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、1つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の1つ又は複数を含む適当なベクターの構築には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
【0072】
PRO23203は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるPRO23203−コード化DNAの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(サッカロミセス(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行の欧州特許第362179号)、又は1990年11月15日に公開されたWO90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【0073】
発現及びクローニングベクターは共に1つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリのD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【0074】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、DHFRあるいはチミジンキナーゼのようにPRO23203−コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaubらにより Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるCHO株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である[Stinchcombら, Nature, 282:39(1979);Kingsmanら, Gene, 7:141(1979);Tschemperら, Gene, 10:157(1980)]。trp1遺伝子は、例えば、ATCC番号44076あるいはPEP4−1のようなトリプトファン内で増殖する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]。
発現及びクローニングベクターは、通常、PRO23203−コード化核酸配列に作用可能に結合し、mRNA合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系[Changら, Nature, 275:615 (1978); Goeddelら, Nature, 281:544 (1979)]、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776]、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター[deBoerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21−25 (1983)]を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたPRO23203をコードするDNAと作用可能に結合したシャイン−ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【0075】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、3−ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzeman ら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]又は他の糖分解酵素[Hess ら, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);Holland, Biochemistry, 17:4900(1978)]、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、3−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、増殖条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第73,657号に更に記載されている。
【0076】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのPRO23203転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物によるPRO23203をコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、PRO23203コード化配列の5’又は3’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5’位に位置している。
【0077】
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの通常は5’、時には3’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、PRO23203をコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのPRO23203の合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620−625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40−46 (1979);欧州特許第117,060号;及び欧州特許第117,058号に記載されている。
【0078】
4.遺伝子増幅/発現の検出
遺伝子の増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201−5205 (1980)]、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA−RNAハイブリッド二本鎖又はDNA−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列PRO23203ポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はPRO23203 DNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【0079】
5.ポリペプチドの精製
PRO23203の形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン−X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。PRO23203の発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
PRO23203を、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される:イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS−PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG−75を用いるゲル濾過;IgGのような夾雑物を除くプロテインAセファロースカラム;及びPRO23203のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182(1990);Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer−Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選択される精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のPRO23203の性質に依存する。
【0080】
E.PRO23203の用途
PRO23203をコードするヌクレオチド配列(又はそれらの補体)は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスRNA及びDNAの生成において種々の用途を有している。また、PRO23203核酸も、ここに記載される組換え技術によるPRO23203ポリペプチドの調製に有用である。
【0081】
完全長天然配列PRO23203遺伝子(配列番号:1)又はその一部は、完全長PRO23203 cDNAの単離又は図1に開示した天然PRO23203配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他のcDNA(例えば、PRO23203の自然発生変異体又は他の種からのPRO23203をコードするもの)の単離のためのcDNAライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして使用できる(配列番号:1)。場合によっては、プローブの長さは約20〜約50塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも部分的には、配列番号:1のヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列PRO23203のプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から決定され得る。例えば、スクリーニング法は、PRO23203遺伝子のコード化領域を周知のDNA配列を用いて単離して約40塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、32P又は35S等の放射性ヌクレオチド、又はアビジン/ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のPRO23203遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトcDNA、ゲノムDNA又はmRNAのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブリッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリダイゼーション技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【0082】
本出願で開示する任意のEST配列は、プローブと同様に、ここに記載した方法で用いることができる。
PRO23203核酸の他の有用な断片は、標的PRO23203 mRNA(センス)又はPRO23203 DNA(アンチセンス)配列に結合できる一本鎖核酸配列(RNA又はDNAのいずれか)を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、PRO23203 DNAのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約14ヌクレオチド、好ましくは約14から30ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするcDNA配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを制御する能力は、例えば、Stein及びCohen(Cancer Res. 48: 2659: 1988)及び van der Krolら,(BioTechniques 6: 958, 1988)に記載されている。
【0083】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の中途での停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PRO23203タンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格(又は他の糖結合、WO91/06629に記載のもの等)を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが(即ち、酵素分解に耐えうるが)、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、WO90/10048に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ−(L−リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等のインターカレート剤、アルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
【0084】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、CaPO4−媒介DNA形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン−バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスM−MuLVから誘導されるもの、N2(M−MuLVから誘導されたレトロウイルス)、又はDCT5A、DCT5B及びDCT5Cと命名されたダブルコピーベクター(WO90/13641参照)を含む。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO91/04753に記載されているように、リガンド結合分子との結合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、増殖因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の結合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
【0085】
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO90/10448に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
また、プローブは、PCR技術に用いて、密接に関連したPRO23203コード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、PRO23203をコードするヌクレオチド配列は、そのPRO23203をコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリダイゼーションスクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
PRO23203のコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合(例えば、PRO23203がレセプターである場合)、PRO23203は、結合相互作用に関与している他のタンパク質又は分子を同定するためのアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター/リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターPRO23203は関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然PRO23203又はPRO23203のレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーのハイスループットスクリーニングにも使用可能なアッセイを含み、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【0086】
また、PRO23203又はその修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物のいずれかを産生することに使用でき、また、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたDNAである。一実施形態では、PRO23203をコードするcDNAは、PRO23203をコードするDNAを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用するゲノム配列及び確立された技術に基づいて、PRO23203をコードするゲノムDNAをクローン化するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は、当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのPRO23203導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたPRO23203コード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はPRO23203をコードするDNAの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療上の処置の可能性が示される。
【0087】
あるいは、PRO23203の非ヒト相同体は、動物の胚幹細胞に導入されたPRO23203をコードする変更ゲノムDNAと、PRO23203をコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、欠損した又は変更されたPRO23203コード化遺伝子を有するPRO23203「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、PRO23203をコードするcDNAは、確立された技術に従い、PRO23203をコードするゲノムDNAのクローニングに使用できる。PRO23203をコードするゲノムDNAの一部は、組込みをモニターするために使用可能な選択マーカーをコード遺伝子のような他の遺伝子によって欠失させたり、置換させることが可能である。典型的には、ベクターは無変化のフランキングDNA(5’と3’末端の両方)を数キロベース含む[例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと]。ベクターは胚幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたDNAが内在性DNAと相同的に組換えられた細胞が選択された[例えば、Liら, Cell, 69:915(1992)参照]。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する[例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113−152参照のこと]。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物を作り出す。胚細胞に相同的に組換えられたDNAを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたDNAを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、PRO23203ポリペプチドの欠乏によるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【0088】
また、PRO23203ポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、1回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なDNA又はmRNAの1回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスRNA及びDNAは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている(Zamecnikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143−4146 [1986])。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【0089】
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス(典型的にはレトロウイルス)ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質−リポソーム媒介形質移入である(Dzauら, Trends in Biotechnology 11, 205−210(1993))。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴う細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び/又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Wuら, J. Biol. Chem. 262, 4429−4432 (1987); 及びWagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410−3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Andersonら, Science 256, 808−813 (1992)を参照のこと。
【0090】
ここに記載したPRO23203ポリペプチドをタンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよい。
ここに記載したPRO23203ポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は、染色体の同定に有用である。この点において、実際の配列データに基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定が必要である。本発明の各PRO23203核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また、本発明のPRO23203ポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のPRO23203ポリペプチドは、同じ型の正常組織に比較して疾患性組織において、一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。PRO23203核酸分子には、PCR、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
【0091】
ここに記載したPRO23203ポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のPRO23203ポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、これにより、このPRO23203生成物は薬学的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed., [1980])、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液;アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子量(残基数10個未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性重合体;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸;グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール;ナトリウム等の塩形成対イオン;及び/又はTWEEN(商品名)、PLURONICS(商品名)又はPEG等の非イオン性界面活性剤を含む。
【0092】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での局所投与などの注射又は注入、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できる指針を提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42−96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【0093】
PRO23203ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり1日に約10 ng/kgから100 mg/kgまで、好ましくは約1μg/kg/日から10 mg/kg/日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている;例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。
PRO23203ポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でPRO23203ポリペプチドの持続放出が望まれる場合、PRO23203ポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン(rhGH)、インターフェロン−(rhIFN−)、インターロイキン−2、及びMN rgp120で成功裏に実施されている。Johnsonら, Nat. Med., 2: 795−799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221−1223 (1993); Horaら, Bio/Technology, 8: 755−758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p.439−462; WO97/03692, WO96/40072, WO96/07399;及び米国特許第5,654,010号。
【0094】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ−乳酸−グリコール酸(PLGA)コポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。PLGAの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1−41。
本発明は、PRO23203ポリペプチドに類似する(アゴニスト)又はPRO23203ポリペプチドの効果を阻害する(アンタゴニスト)ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるPRO23203ポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリーのハイスループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるPRO23203ポリペプチドと、これら2つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
【0095】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるPRO23203ポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をPRO23203ポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるPRO23203ポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【0096】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のPRO23203ポリペプチドに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られている方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィーカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789−5793 (1991)]に開示されているように、Fields及び共同研究者ら[Fields及びSong, Nature(London) 340, 245−246 (1989); Chienら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578−9582 (1991)]に記載された酵母ベースの遺伝子系を用いることによってモニターすることができる。酵母GAL4などの多くの転写活性化剤は、2つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はDNA結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。前出の文献に記載された酵母発現系(一般に「2−ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用し、並びに2つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がGAL4のDNA結合ドメインに融合し、他方では候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。GAL1−lacZリポーター遺伝子のGAL4活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したGAL4活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する色素生産性基質で検出される。2−ハイブリッド技術を用いた2つの特定なタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKER(商品名))は、Clontechから商業的に入手可能である。また、この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこれら相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定へ拡大適用することができる。
【0097】
ここで同定されたPRO23203ポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる:通常、反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、これら2つの生成物の相互作用及び結合が可能な条件下及び時間に渡って含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第3の反応混合物に添加してポジティブコントロールを提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合(複合体形成)は上記のようにモニターされる。試験化合物を含有する反応混合物ではなく、コントロール反応における複合体の形成は、試験化合物が、遺伝子産物であるPRO23203ポリペプチドとその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
【0098】
アンタゴニストをアッセイするためには、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともにPRO23203ポリペプチドを細胞へ添加してもよく、PRO23203ポリペプチド存在下における対象活性を阻害する化合物の能力は、化合物がPRO23203ポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、PRO23203ポリペプチドと膜結合PRO23203ポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを有する潜在的アンタゴニストを競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることによって、アンタゴニストを検出してもよい。放射活性などでPRO23203ポリペプチドを標識することが可能であり、潜在的アンタゴニストの有効性を判断するためにレセプターに結合したPRO23203ポリペプチド分子の数を利用することができる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びFACSソートによって同定できる。Coliganら, Current Protocols in Immun., 1(2): 第5章(1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化RNAがPRO23203ポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このRNAから生成されたcDNAライブラリーがプールに分配され、COS細胞又はPRO23203ポリペプチドに対して反応性ではない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで増殖させた形質移入細胞を、標識したPRO23203ポリペプチドで暴露する。このPRO23203ポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の封入を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【0099】
レセプター同定の代替的方法として、標識PRO23203ポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料をPAGEで分離し、X線フィルムへ暴露する。レセプターを含む標識複合体を切り出し、ペプチド断片へ分解し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するcDNAライブラリーをスクリーニングする縮重オリゴヌクレオチドプローブの一組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他のアッセイでは、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識PRO23203ポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとPRO23203ポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限定しないが、ポリ−及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗−イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってPRO23203ポリペプチドの作用を競合的に阻害するPRO23203ポリペプチドの変異形態であってもよい。
【0100】
他の潜在的なPRO23203ポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスRNA又はDNA構築物であり、例えば、アンチセンスRNA又はDNA分子は、標的mRNAにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりmRNAの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスDNA又はRNAを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリヌクレオチドのDNA又はRNAへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟PRO23203ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5’コード化部分は、約10から40塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドの設計に使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され(トリプルへリックス−Leeら, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooneyら, Science, 241: 456 (1988); Dervanら, Science, 251: 1360 (1991)参照)、それによりPRO23203ポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリッド形成してmRNA分子のPRO23203ポリペプチドへの翻訳を阻止する(アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988))。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスRNA又はDNAをインビボで発現させて、PRO23203ポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスDNAが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−10から+10位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【0101】
潜在的アンタゴニストは、PRO23203ポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりPRO23203ポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチジル有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒できる酵素的RNA分子である。リボザイムは、相補的標的RNAへの配列特異的ハイブリッド形成、次いで内ヌクレオチド結合分解性切断により作用する。潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、上掲のRossi, Current Biology 4:469−471 (1994)及びPCT公報番号、WO97/33551(1997年9月18日公開)を参照。
【0102】
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンの相当量の伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、PCT公報番号、WO97/33551、上掲を参照。
これらの小分子は、上記で検討したスクリーニングアッセイの1つ又は複数の任意のものにより及び/又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
PRO23203ポリペプチド、それらのコード化核酸、及び抗−PRO23203抗体に関する潜在的な使用は、前立腺組織由来の腫瘍の検出及び/又は治療におけるものである。
【0103】
F.抗−PRO23203抗体
本発明は、さらに抗−PRO23203抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。
また、本発明の抗−PUMPCn抗体は、種々の非治療的な適用をも有する。前立腺癌をスクリーニングし、診断するためのツールとしてのPSAの使用は、議論の余地があるという事実に鑑み、本発明の抗−PUMPCn抗体は、PUMPCn発現癌の診断及び進行度の判断(例えば、放射線画像診断において)に関し有用である。また、この抗体は、細胞からPUMPCnの精製又は免疫沈降、エライザ又はウェスタンブロットなどのインビトロにおけるPUMPCnの検出及び定量、他の細胞の精製におけるステップとして混合された細胞の集団からPUMPCnを発現する細胞を殺傷し、除去するためにも有用である。
本発明の抗−PUMPCn抗体は哺乳動物におけるPUMPCn発現癌を治療し、又は一又複数の癌の症状を緩和するために有用である。前記癌には、例えば前立腺癌転移などの転移性癌が含まれる。該抗体は、哺乳動物細胞中でPUMPCnを発現する癌細胞の少なくとも一部に結合することが可能で、好ましくはHAMA応答を誘起しないか又は最小限に抑えるものである。好ましい実施態様においては、抗体は、細胞上のPUMPCnと結合して、インビトロ又はインビボにおいて、PUMPCnを発現する腫瘍細胞を破壊又は殺傷し、そのような腫瘍細胞の増殖を阻害する。そのような抗体には、そのままの形態の抗−PUMPCn抗体(特定の薬剤を結合していない)が含まれる。細胞障害性又は細胞増殖阻害性を持つそのままの形態の抗体は、腫瘍細胞破壊において、抗体をさらに有効にする細胞障害性剤と共に利用することができる。抗−PUMPCn抗体に対して、細胞障害性は、後述するような免疫コンジュゲートを形成するために細胞障害性剤を抗体に結合させることにより与えられる。細胞障害性剤又は増殖阻害剤は、好ましくは小分子である。カリケアマイシン又はメイタンシノイド及びそれらの類似体又は誘導体が好ましい。
【0104】
本発明は、本発明の抗−PUMPCn抗体及び担体を含んで成る組成物を提供する。癌の治療目的のために、そのような治療を必要としている患者に対し該組成物を投与することができ、該組成物は、免疫コンジュゲート又はそのままの形態で存在する一又は複数の抗−PUMPCn抗体を含み得る。さらなる実施態様において、該組成物は化学療法剤を含む細胞障害性又は増殖阻害剤などの他の治療剤と組合わせてこれらの抗体を含み得る。また、本発明は、本発明の抗−PUMPCn抗体及び担体を含んでなる製剤も提供する。一実施態様において、製剤は薬学的に受容可能な坦体を含む治療剤である。
【0105】
1.ポリクローナル抗体
抗−PRO23203抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫剤、及び所望するのであればアジュバントを、1つ又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫剤及び/又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫剤は、PRO23203ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL−TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【0106】
2.モノクローナル抗体
あるいは、抗−PRO23203抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫剤により免疫化することで、免疫剤に特異的に結合する抗体を生成するか或いは生成可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫剤は、典型的には対象とするPRO23203ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBLs」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59−103]。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【0107】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51−63]。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、PRO23203に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【0108】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる[Goding, 上掲]。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びRPMI−1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【0109】
また、モノクローナル抗体は、組換えDNA法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、DNAは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、DNAは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより[米国特許第4,816,567号;Morrisonら, 上掲]、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【0110】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにFc領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
また、一価抗体の調製にはインビトロ法が適している。抗体の消化による、その断片、特にFab断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【0111】
3.ヒト及びヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒトのソースから導入される一又は複数のアミノ酸残基を有する。こららの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と称され、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的にWinter及びその共同研究者[Jones等, Nature, 321:522−525 (1986);Riechmann等, Nature, 322:323−327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534−1536 (1988)]の方法に従い、齧歯類のCDR又はCDR配列で対応するヒト抗体の配列と置換することにより実施することができる。従って、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号)実質的にヒト可変ドメインそのものが対応する非ヒト種由来の配列で置換されているわけではない。実際には、ヒト化抗体は、典型的に幾つかのCDR残基及びおそらく幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【0112】
本発明の抗−PRO23203抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばFv、Fab、Fab’、F(抗体’)2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの全てを実質的に含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる[Jonesら, Nature, 321:522−525 (1986); Riechmannら, Nature, 332:323−329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593−596 (1992)]。
【0113】
抗体がヒトの治療用途を意図している場合、抗原性及びHAMA反応(ヒト抗−マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトVドメイン配列を同定し、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(FR)として受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993);Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992);Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
さらに、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが考慮される。この目標を達成するべく、ある方法に従って、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定上の三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、FR残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗−PUMPCn抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体は、免疫コンジュゲートを生成するために1つ又は複数の細胞障害剤(類)と結合していてもよい抗体断片、例えばFabであってもよい。また、ヒト化抗体は無傷抗体、例えば無傷IgG1抗体であってもよい。
【0114】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリー[Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991);Marksら, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Coleら及びBoernerらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる[Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1):86−95(1991) ]。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,661,016号、及び次の科学文献:Marksら, Bio/Technology 10, 779−783 (1992); Lonbergら, Nature 368 856−859 (1994); Morrison, Nature 368, 812−13 (1994); Fishwildら, Nature Biotechnology 14, 845−51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65−93 (1995)に記載されている。また、ヒト抗体は、インビトロで活性化されたB細胞によっても生産される(米国特許第5,567,610号及び5,229,275を参照のこと)。
【0115】
4.二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合においては、結合特異性の一方はPRO23203に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく[Milstein及びCuello, Nature, 305:537−539 (1983)]。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO93/08829、及びTrauneckerら, EMBO J.,10:3655−3659 (1991)に開示されている。
【0116】
所望の結合特異性(抗体−抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするDNA、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
WO96/27011に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのCH3領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の界面からの1つ又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【0117】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してF(ab’)2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたFab’断片はついでチオニトロベンゾエート(TNB)誘導体に転換される。次に、Fab’−TNB誘導体の一つをメルカプトエチルアミンでの還元によりFab’−チオールに再転換し、他のFab’−TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からFab’断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら, J. Exp. Med., 175:217−225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体F(ab’)2分子の製造を記述している。各Fab’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトT細胞及びErbB2レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【0118】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547−1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444−6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには短かすぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)を結合してなる。従って、一つの断片のVH及びVLドメインは他の断片の相補的VL及びVHドメインと強制的に対形成させられ、2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【0119】
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたPRO23203ポリペプチドの2つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗−PRO23203ポリペプチドのアームは、特定のPRO23203ポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、T細胞レセプター分子(例えばCD2、CD3、CD28、又はB7)等の白血球上のトリガー分子又はFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)等のIgG(FcγR)に対するFcレセプターに結合するアームと組合わせてもよい。また、二重特異性抗体は特定のPRO23203ポリペプチドを発現する細胞に細胞障害性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はPRO23203結合アーム及び細胞障害性薬又は放射性キレート化剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、又はTETAと結合するアームを有する。対象となる他の二重特異性抗体はPRO23203ポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子(TF)に結合する。
【0120】
5.多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早く内部移行(及び/又は異化)されうる。本発明の抗体は、3又はそれ以上の抗原結合部位を有する多価抗体(IgMクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと3又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはFc領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はFc領域と、Fc領域のアミノ末端に3又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は3ないし8、好ましくは4の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも1つのポリペプチド鎖(好ましくは2つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は2又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はVD1−(X1)n−VD2−(X2)n−Fcを有し、ここでVD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、FcはFc領域のポリペプチド鎖の一つであり、X1及びX2はアミノ酸又はポリペプチドを表し、nは0又は1である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は:VH−CH1−フレキシブルリンカー−VH−CH1−Fc領域鎖;又はVH−CH1−VH−CH1−Fc領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも2つ(好ましくは4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約2〜約8の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはCLドメインをさらに有する。
【0121】
6.ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、2つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため[米国特許第4,676,980号]及びHIV感染の治療のために[WO91/00360;WO92/200373;EP03089]提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−4−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されたものが含まれる。
【0122】
7.エフェクター機能の加工
本発明の抗体を、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるためにエフェクター機能について改変することが望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び/又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞障害性(ADCC)を有する可能性がある。Caronら, J. Exp. Med. 176: 1191−1195 (1992)及びShopes, J. Immunol. 148: 2918−2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolffら, Cancer Research 53: 2560−2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、2つのFc領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びADCC能力を向上させることもできる。Stevensonら, Anti−Cancer Drug Design 3: 219−230 (1989)参照。
【0123】
8.免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学治療薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞障害性薬、あるいは放射性同位体(即ち、放射性コンジュゲート)と抱合している抗体を含む免疫複合体に関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬を上述した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン(modeccin)A鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP−S)、ツルレイシインヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、212Bi、131I、131In、90Y及び186Reが含まれる。
【0124】
抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートHCL等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス−アジド化合物(ビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス−ジアゾニウム誘導体(ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン2,6−ジイソシアネート等)、及びビス−活性フッ素化合物(1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン−14−標識1−イソチオシアナトベンジル−3−メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX−DTPA)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)に抱合されてもよく、抗体−レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞障害性薬(例えば、放射性ヌクレオチド等)に抱合された「リガンド」(アビジン等)を投与する。
【0125】
メイタンシン及びメイタンシノイド
好ましい一実施態様では、本発明の抗−PUMPCn抗体(全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第3,896,111号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びC−3メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第4,151,042号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号;同4,248,870号;同4,256,746号;同4,260,608号;同4,265,814号;同4,294,757号;同4,307,016号;同4,308,268号;同4,308,269号;同4,309,428号;同4,313,946号;同4,315,929号;同4,317,821号;同4,322,348号;同4,331,598号;同4,361,650号;同4,364,866号;同4,424,219号;同4,450,254号;同4,362,663号;及び同4,371,533号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【0126】
抗−PUMPCn抗体−メイタンシノイドコンジュゲート(免疫コンジュゲート)
抗−PUMPCn抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗−PUMPCn抗体を化学的に結合させることにより調製される。1分子の毒素/抗体であっても、無傷の抗体の使用において細胞障害性を高めることが予想されているが、抗体分子当たり、平均3−4のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5,208,020号、及び他の特許、及び上述した非特許文献に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第5,208,020号又は欧州特許第0425235B1号、及びChariら, Cancer Research, 52:127−131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【0127】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシラート、イミノチオラン(IT)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートHCL)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス−ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン−2,6−ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合のために提供されるN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)(Carlsson等, Biochem. J. 173:723−737[1978])及びN−スクシンイミジル−4−(2−ピリジルチオ)ペンタオエート(SPP)が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステルリンカーを形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するC−3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC−14位、ヒドロキシル基で修飾されたC−15位、及びヒドロキシル基を有するC−20位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のC−3位で形成される。
【0128】
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗−PUMPCn抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ−ピコモルの濃度で二重鎖DNAの破壊を引き起こすことができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5,712,374号、同5,714,586号、同5,739,116号、同5,767,285号、同5,770,701号、同5,770,710号、同5,773,001号、同5,877,296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ1 I、α2 I、α3 I、N−アセチル−γ1 I、PSAG及びθI 1(Hinmanら, Cancer Research, 53:3336−3342(1993)、Lodeら. Cancer Research, 58:2925−2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは双方とも、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性内部移行によるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【0129】
他の細胞障害剤
本発明の抗−PUMPCn抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び5−フルオロウラシル、米国特許第5,053,394号、同5,770,710号に記載されており、集合的にLL−E33288複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5,877,296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン(modeccin)A鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP−S)、ツルレイシインヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開のWO93/21232号を参照のこと。
さらに本発明では、抗体と核分解活性(nucleolytic activity)を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ;DNアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートが考慮される。
【0130】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性原子をコンジュゲートした抗−PUMPCn抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例として、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばtc99m又はI123、又は核磁気共鳴(NMR)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素−123、ヨウ素−131、インジウム−111、フッ素−19、炭素−13、窒素−15、酸素−17、ガドリニウム、マグネシウム又は鉄を含有し得る。
放射−又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素−19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばtc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム−90はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Frakerら(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49−57)は、ヨウ素−123の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【0131】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシラート、イミノチオラン(IT)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートHCL)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス−ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン−2,6−ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素−14標識1−イソチオシアナトベンジル−3−メチルジエチレン−トリアミン五酢酸(MX−DTPA)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。WO94/11026号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチターゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chariら, Cancer Research, 52:127−131(1992);米国特許第5,208,020号)。
別法として、抗−PUMPCn抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。DNAの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの2つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体−レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いてキレート剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【0132】
抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ADEPT)
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、WO81/01145号を参照)を活性な抗ガン剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることにより、ADEPTにおいて使用することができる。例えばWO88/07378及びUS4,975,278を参照されたい。
ADEPTに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ;スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ;非毒性5−フルオロシトシンを抗ガン剤5−フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ;プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンB及びL)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの;D−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なD−アラニルカルボキシペプチダーゼ;炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ;βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ;及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンVアミダーゼ又はペニシリンGアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457−458(1987)を参照)。抗体−アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗−PUMPCn抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えDNA技術を使用して作成することができる(Neubergerら, Nature 312:604−608(1984))。
【0133】
9.免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985);Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG−誘導ホスファチジルエタノールアミン(PEG−PE)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のFab’断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286−288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【0134】
10.抗体の製薬組成物
ここで同定されるPRO23203ポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
PRO23203ポリペプチドが細胞内にあり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、取り込める抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのために使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び/又は組換えDNA技術によって生成できる。例えば、Marascoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889−7893 (1993)参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に1つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害性薬、サイトカイン、化学療法剤又は増殖阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【0135】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Science, 上掲に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリルアクチド(米国特許第3,773,919号)、L−グルタミン酸及びγ−エチル−L−グルタメート、非分解性エチレン−酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)(乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球)などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−D−(−)−3−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を100日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは37℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間S−S結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【0136】
G.抗−PRO23203抗体の用途
本発明の抗−PRO23203抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗−PRO23203抗体は、PRO23203の診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147−158]等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、3H、14C、32P、35S又は125I等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunterら, Nature 144:945 (1962);Davidら, Biochemistry, 13: 1014 (1974);Painら, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981);及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。
【0137】
また、抗−PRO23203抗体は、組換え細胞培養又は天然供給源からのPRO23203のアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、PRO23203に対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を精製するPRO23203を含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したPRO23203以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、PRO23203を抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
PRO23203ポリペプチド、そのためのコード化核酸、及び抗−PRO23203抗体に関する潜在的な用途は、前立腺組織由来の腫瘍の検出及び/又は治療にある。
【0138】
抗−PUMPCn抗体による治療
本発明によると、細胞表面上のPUMPCnに結合する抗−PUMPCn抗体は、アンドロゲン非依存性前立腺癌又はアンドロゲン依存性前立腺癌及び関連する転移などのPUMPCn発現癌細胞を治療するために用いられる。抗−アンドロゲン治療に反応を示さない場合、患者はアンドロゲン非依存性前立腺癌であると診断され、アンドロゲン依存性前立腺癌であると診断される患者は、抗−アンドロゲン治療に対して反応性を有する。通常、そのような癌はPUMPCn発現細胞を含むため、抗−PUMPCn抗体がそれに結合できるようになる。かかる癌はPUMPCn分子の過剰発現によって特徴付けられるが、本出願は、さらにPUMPCn過剰発現癌であるとみなされない癌の治療方法も提供する。
現在のところ癌の段階に依存して、前立腺癌の治療に、以下の治療剤の一又は組合わせが含まれる:癌性組織を除去するための手術、放射線治療、アンドロゲン除去(例えば、ホルモン治療)、及び化学療法。抗−PUMPCn抗体は、化学療法の毒性及び副作用に対してあまり耐性でない高齢の患者、放射線治療が有用性に限界を持つ転移性疾患、及びアンドロゲン除去治療に対して耐性である前立腺癌への対応に関し、特に望ましいものである。本発明の腫瘍標的及び内部移行性抗−PUMPCn抗体は、疾患の初期診断又は再発の間におけるPUMPCn発現癌を緩和するのに有用である。治療上の適用に関し、抗−PUMPCn抗体は単独で、又は、例えばホルモン、抗血管形成剤、又は放射標識化合物、又は手術、凍結療法、及び/又は、特に前立腺癌について、また特に細胞の減少が達成できない場合には、放射線療法と組合わせて使用することができる。抗−PUMPCn抗体治療は、従来の治療の他の形態と併せて、継続的に従来の治療の前又は後に行われてもよい。タキソテール(登録商標)(ドセタキセル)、タキソール(登録商標)(パリクタキセル)、エストラムスチン(estramustine)及びミトキサントロンなどの化学療法薬は、転移性及びホルモン不応性の前立腺癌を治療するために、特に危険の少ない患者において使用される。癌、特に、アンドロゲン非依存性及び/又は転移性前立腺癌を治療し緩和するための本発明の本方法において、前記の化学療法剤の一又は複数による治療と併せて、癌患者は抗−PUMPCn抗体を投与される。特に、パリクタキセル及び修飾された誘導体(例えば、EP0600517を参照のこと)との組合わせ治療が考慮される。抗−PUMPCn抗体は、化学療法剤における治療上効果的な投与量で投与されるであろう。他の実施態様において、抗−PUMPCn抗体は、パクリタキセルなどの化学療法剤の活性及び効果を増強するために、化学療法と併せて投与される。米医薬品便覧(Physicians’ Desk Reference)(PDR)には、種々の癌の治療において使用されているこれらの薬剤の投与量が開示されている。前述の治療上有効な化学療法剤の用法及び投与量は、治療される特定の癌、疾患の程度及び当該技術分野の医師にとって知られている他の因子に依存し、医師によって決定することが可能である。
【0139】
特定の一実施態様において、細胞障害性剤がコンジュゲートされた抗−PUMPCn抗体を含む免疫コンジュゲートが患者に投与される。好ましくは、PUMPCnタンパク質に結合した免疫コンジュゲートは、細胞によって内部移行され、その結果、結合した癌細胞の殺傷において免疫コンジュゲートの治療的効果を増大させる。好ましい実施態様において、細胞障害性剤は、癌細胞中の核酸を標的し又は妨害する。かかる細胞障害性剤の例は、上述されており、メイタンシノイド、カリケアミシン、リボヌクレアーゼ及びDNAエンドヌクレアーゼを包含する。
抗体−PUMPCn抗体又は免疫コンジュゲートは、例えば、ボーラスのような静脈投与、又は一定期間の継続的注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、くも膜下腔内、口腔内、局所的、又は吸入経路などの既知の方法に従ってヒト患者に対して投与される。抗体の静脈内又は皮下投与が好ましい。
他の治療計画を抗−PUMPCn抗体の投与と組合せてもよい。組合せ投与には、別々の調製物又は単一の医薬製剤を使用する同時投与、及び好ましくは両方(又は全ての)活性剤が同時にその生物学的活性を働かせる時間がある、いずれかの順での連続投与が含まれる。このような組合せ治療により、結果として相乗的治療効果が生じることが好ましい。
また、特定のガンに関連した他の腫瘍抗原に対する抗体の投与と共に、抗−PUMPCn抗体又は抗体類の投与を組合せることが望ましい。
【0140】
他の実施態様では、本発明の抗体治療方法は、異なる化学療法剤の混合物の同時投与を含む、抗−PUMPCn抗体(又は抗体類)と一又は複数の化学療法剤又は増殖阻害剤との組合せ投与を含む。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者の注意書きに従い使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service M.C.Perry編, Williams &Wilkins, Baltimore, MD(1992)に記載されている。
抗体は、抗ホルモン化合物、例えばタモキシフェン等の抗−エストロゲン化合物、例えば;抗プロゲステロン、例えばオナプリストン(onapristone)(欧州特許616812号を参照);又は抗アンドロゲン、例えばフルタミドを、このような分子に対して既知の用量で組合せてもよい。治療される癌がアンドロゲン非依存性癌である場合、患者は予め抗アンドロゲン治療を受け、癌がアンドロゲン非依存性になった後、抗−PUMPCn抗体(及び場合によってはここに記載した他の薬剤)を患者に投与してもよい。
【0141】
疾患の予防又は治療のための投与量及び方式は、公知の基準に従い、医師により選択されるであろう。抗体の適切な用量は、治療される疾患の種類、疾患の重症度及び過程、抗体を防止目的で投与するのか治療目的で投与するのか、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体の応答性、手当てをする医師の裁量に依存するであろう。抗体は一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。好ましくは、抗体は静脈注入又は皮下注射により投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入のいずれであれ、体重当たり約1μg/kgないし50 mg/kg(例えば0.1−15 mg/kg/用量)の抗体が患者への最初の投与量の候補である。投薬計画は、約4 mg/kg、続いて1週間に約2 mg/kgの抗−PUMPCn抗体の維持用量で投与することを含む。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。上述した因子に応じて、典型的な一日の投与量は約1μg/kgから100 mg/kgあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、疾患の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。この治療の進行状態は、医師又は他の当業者に公知の基準をベースにした通常の方法やアッセイで容易にモニターされる。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
米国優先権主張番号60/235,451は、その全体出典明示によりここに取り込む。本明細書中で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【0142】
(実施例)
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ATCC登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【0143】
実施例1
ヒトPRO23203をコードするcDNAクローンの単離
発現配列タッグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標),Incyte Pharmaceutical,パロアルト,カリフォルニア)を検索し、GEPISによってEST配列を同定した。遺伝子発現プロファイリング インシリコ(GEPIS)は、新規治療標的に関する対象の遺伝子の性質決定を行うバイオインフォーマティック手法である。GEPISは、大量のEST配列及びライブラリー情報を上手く利用し、遺伝子発現プロファイルを確定する。GEPISは、遺伝子の発現レベルがESTデータベースにおける発生数と比例相関するとの前提に基づいており、Incyte社 ESTの関連データベースとGenentech社の知的財産情報を、厳密で統計学的に有意な方法で統合することにより作動する。GEPISは極めて特別な分析又は広範なスクリーニング課題のいずれかを実施するように設定することができるが、本実施例においては、新規腫瘍抗原を同定し、クロス確認するために使用される。初期スクリーニングのために、GEPISはライブラリーから配列に移行するのに使用される。Incyte社の全データーベースは、そのライブラリー情報に基づく配列をクラスター化するために使用された。乳房、大腸、肺及び前立腺は、特定された標的組織である。この初期のクラスター中に見出される配列は、その後、ドメインを含む分泌及び膜貫通に関してスクリーニングされた。残りの配列は、その後、新規性に関しスクリーニングされ、個々の配列が同定された。その後、最後のステップにおいて、各個々の配列についてGEPISスクリーニングが行われ、この時期は配列からライブラリーに移行し、その結果、オリジナルの標的組織における発現プロファイルを実証する(図3)。このタイプのスクリーニングバイオインフォーマティクスを使用して、DNA182753が同定され、この配列を用いて設計されたPCRプライマーは、全長クローンに関し、ライブラリーをスクリーニングするのに使用された。
【0144】
cDNAライブラリーの構築のためのRNAはヒト前立腺組織から単離した。ヒトPRO23203をコードするcDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリーは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmesら, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)に、特有のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
上述のEST配列に基づくオリゴヌクレオチド配列は、その後:1)目的の配列を含むcDNAライブラリーをPCRにより同定するため、及び2)PRO23203の全コード化配列のクローンを単離するためのプローブの使用のために合成された。順方向及び逆方向のPCRプライマーは、通常、20から30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば、長さ約100−1000のPCR産物を生じさせるように設計される。プローブ配列は、典型的には、40−55bpである。全長クローンのための幾つかのライブラリーをスクリーニングするために、Ausuberl等, Current Protocols in Molecular Biology, 上掲に従いPCRプライマー対を用いて、ライブラリー由来のDNAがPCR増幅によってスクリーニングされた。ポジティブなライブラリーは、その後、プローブ及びプライマー対の一つを使用して、目的の遺伝子をコードするクローンを単離するために使用された。
【0145】
用いられたオリゴヌクレオチドプローブは以下の通りである:
順方向PCRプライマー 5’−GATATTTGTTTCTCAACATGGCTTATCAGCAGG−3’ (配列番号:3)
逆方向PCRプライマー 5’−TCTCTGACCTTCTCATCGGTAAGCAGAGG−3’ (配列番号:4)ハイブリダイゼーションプローブ
5’−TCTTTTGCAGCTTTGCAGATACCCAGACTGAGCTGGAACTGGA−3’ (配列番号:5)
ヌクレオチド位置188−190に見かけの翻訳開始部位及びヌクレオチド位置1550−1552に翻訳停止シグナルを持つ一つのオープンリーディングフレームを含んだ全長クローンが同定された(図1、配列番号:1)。予想されるポリペプチド前駆体は、454アミノ酸長で、およそ52008ダルトンの計算上の分子量を有し、約8.83のpIが見積もられた。図2(配列番号:2)に示される全長PRO23203配列は、種々の重要なポリペプチドドメインの存在を証明し、すぐ下に示されるようなこれらの重要なポリペプチドドメインに対して与えられる位置は、上述のごとく、おおよそのものである。
シグナルペプチド:無し
膜貫通ドメイン:
210−230
256−278
302−321
360−382
391−412
430−450
N−グリコシル化部位:256−259
cAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位:29−32
チロシンキナーゼリン酸化部位:416−424
N−ミリストイル部位.
8−13
24−29
34−39
193−198
274−279
ECD及びICDは、おそらく上記予想されるTMsを表すアミノ酸の外に存在するのであろう。
クローンDNA185171−2994はATCCに2000年9月26日に寄託されており、ATCC寄託番号PTA−2513が付与されている。
図2(配列番号:2)に示される全長配列のALIGN−2配列アライメント分析を用いたタンパク質データーベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析は、PRO23203アミノ酸配列と以下の配列:AK001691_1との間における配列同一性を証明した。
【0146】
実施例2
ハイブリダーゼーションプローブとしてのPRO23203の使用
以下の方法は、ハイブリダイゼーションプローブとしてのPRO23203コード化ヌクレオチド配列の使用について記述する。
全長又は成熟PRO23203のコード化配列を含むDNAは、ヒト組織cDNAライブラリー又はヒト組織ゲノムライブラリー中において相同なDNA(天然に生じるPRO23203変異体をコードするものなど)に関しスクリーニングするためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリーDNAを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄は、以下の高い緊縮性の条件下にて実施される。放射性標識化PRO23203由来のプローブのフィルターに対するハイブリダイゼーションは、50% ホルムアミド, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.1% ピロリン酸ナトリウム, 50mM リン酸ナトリウム, pH 6.8, 2x デンハード溶液及び10% 硫酸デキストランの溶液中、42℃で20時間実施される。フィルターの洗浄は0.1x SSC及び0.1% SDSの水溶液中にて42℃で実施される。
全長天然配列PRO23203をコードするDNAと望ましい配列同一性を有するDNAは、その後、当該技術分野において標準的な技術を用いて同定された。
【0147】
実施例3
大腸菌におけるPRO23203の発現
この実施例は、大腸菌中における組み換え発現によるPRO23203の非グリコシル化型の調製を例証する。
PRO23203コード化DNA配列は選択されたPCRプライマーを利用して最初に増幅される。このプライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。様々な発現ベクターを使用することができる。適したベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含むpBR322(大腸菌由来;Bolivarら, Gene, 2:95 (1997)を参照のこと)がある。ベクターは制限酵素によって消化され、脱リン酸化される。次いで、PCR増幅配列がベクターにライゲーションされる。ベクターは好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、ポリhisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、ポリhisリーダー、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、PRO23203コード領域、ラムダ転写集結因子及びargU遺伝子をコードする配列を含む。
【0148】
次いで、Sambrookら, 上記に記載されている方法を用いて選択された大腸菌株を形質転換するために、このライゲーション混合物を利用した。形質転換体をLBプレート上でのその増殖能力によって同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、それを制限酵素分析及びDNA配列決定によって確認することができる。
選択されたクローンを、抗生物質が補填されたLBブロスのような液体培地で一晩かけて増殖させることができる。この一晩の培養を、引き続きより大きなスケールでの培養を播種するために使用してもよい。細胞を所望の光学密度になるまで増殖させると、その間に発現プロモーターが作用し始める。
更に数時間、細胞を培養した後に、遠心分離によって細胞を収集することが可能である。遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶化でき、次いで、この溶解したPRO23203タンパク質を、タンパク質の堅固な結合を可能にする条件下において金属キレート化カラムを用いて精製すること可能である。
【0149】
以下の手法を用いて、ポリ−Hisタグ形態でPRO23203を大腸菌で発現させてもよい。PRO23203をコードするDNAを選択したPCRプライマーを用いて最初に増幅した。このプライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いで、PCR増幅されたポリ−Hisタグ配列を発現ベクターへ結合させ、これを株52(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq))に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体を、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するLB中で、30ECで振盪しながら3−5のO.D.600に達するまで増殖させた。ついで培養液をCRAP培地(3.57gの(NH4)2SO4、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのKCl、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのSheffield hycase SF、並びに110mMのMPOS、pH7.3、0.55%(w/v)のグルコース及び7mMのMgSO4の混合で調製)中にて50−100倍希釈し、30℃で振盪によって約20−30時間増殖させた。SDS−PAGEにより発現を確認するために試料を取り出し、細胞がペレットとなるようにバルク培地を遠心分離した。精製及びリフォールディングまで、細胞ペレットを凍結させた。
【0150】
0.5から1Lの発酵(6−10gペレット)からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量(w/v)で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を4℃で終夜撹拌した。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸によりブロックされた変性タンパク質が生じる。溶液をBeckman Ultracentifuge中で40,000rpmで30分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー(6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4)の3−5容量で希釈し、透明にするために0.22ミクロンフィルターを通して濾過する。透明抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni−NTA金属キレートカラムに充填した。カラムを50mMのイミダゾール(Calbiochem, Utrol grade)を含む更なるバッファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もった。
【0151】
試料を20mMのトリス、pH8.6、0.3MのNaCl、2.5Mの尿素、5mMのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのEDTAからなる新たに調製した再生バッファー中で徐々に希釈することによって、タンパク質を再生させた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50 ̄100マイクログラム/mlとなるように選択した。リフォールディング溶液を4℃で12−36時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はTFAを採取濃度0.4%(約3のpH)で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2−10%で添加した。再生したタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%TFAの移動バッファーと10 ̄80%のアセトニトリル勾配での溶離を行うことでクロマトグラフにかけた。A280吸収を持つ画分のアリコートをSDSポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質形態は、これらの形態が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の再生したPRO23203ポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine(Pharmacia)樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのHepes、pH6.8に調製した。
【0152】
実施例4
哺乳動物細胞におけるPRO23203の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のPRO23203の調製を例証する。
発現ベクターとしてベクターpRK5(1989年3月15日公開のEP307,247参照)を用いた。場合によっては、PRO23203 DNAを選択した制限酵素を持つpRK5に結合させ、上記のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてPRO23203 DNAを挿入させる。得られたベクターは、pRK5−PRO23203と呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は293細胞でもよい。ヒト293細胞(ATCC CCL 1573)は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び/又は抗生物質を添加したDMEMなどの培地中で組織培養プレートにおいて増殖させて集密化した。約10μgのpRK5−PRO23203DNAを約1μgのVA RNA遺伝子コード化DNA[Thimmappayaら, Cell, 31:543 (1982))]と混合し、500μlの1mM トリス−HCl、0.1mM EDTA、0.227M CaCl2に溶解させた。この混合物に、500μlの50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCl、1.5mM NaPO4を一滴づつ添加し、25℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、293細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。培地を吸引し、2mlのPBS中20%グリセロールを30秒間添加した。293細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートした。
【0153】
形質移入の約24時間後、培地を除去し、培地(のみ)又は200μCi/ml35S−システイン及び200μCi/ml35S−メチオニンを含む培地で置換した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%SDSゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、PRO23203ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し(無血清培地で)、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
これに換わる技術において、PRO23203は、Somparyracら, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて293細胞に一過的に導入される。293細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで増殖させ、700μgのpRK5−PRO23203 DNAを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、PBSで洗浄した。DNA−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約4日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたPRO23203を含む試料を濃縮し、透析及び/又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、PRO23203をCHO細胞で発現させることができる。pRK5−PRO23203は、CaPO4又はDEAE−デキストランなどの公知の試薬を用いてCHO細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地(のみ)又は35S−メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。PRO23203ポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたPRO23203を含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
【0154】
また、エピトープタグPRO23203は、宿主CHO細胞において発現させてもよい。PRO23203はpRK5ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、PCRを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ−hisタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ−hisタグPRO23203挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのDHFR等の選択マーカーを含むSV40誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、CHO細胞をSV40誘導ベクターで(上記のように)形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ−hisタグPRO23203を含む培地は、次いで濃縮し、Ni2+−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。 またPRO23203は、一過性発現法によりCHO及び/又はCOS細胞で、他の安定な発現方法によりCHO細胞で発現させてもよい。
CHO細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード配列(例えば、細胞外ドメイン)がIgG1のヒンジ、CH2及びCH2ドメインを含む定常領域配列に融合したIgG作成物(イムノアドヘシン)、又はポリ−Hisタグ形態として発現された。
【0155】
PCR増幅に続いて、対応するDNAを、Ausubelら, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてCHO発現ベクターにサブクローニングした。CHO発現ベクターは、対象とするDNAの5’及び3’に適合する制限部位を有し、cDNAの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Lucasら, Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774−1779 (1996)に記載されたようにCHO細胞での発現を用い、対象とするcDNA及びジヒドロフォレートレダクターゼ(DHFR)の発現の制御にSV40初期プロモーター/エンハンサーを用いる。DHFR発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドDNAの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Qiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)(Boehringer Mannheim)約1千万のCHO細胞に導入する。細胞は、上記のLucas等に記載されているように増殖させた。約3x107細胞を、下記のような更なる増殖及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
【0156】
プラスミドDNAを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで5分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地(0.2μm濾過PS20、5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を添加)中に懸濁させた。次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mLスピナーに分ける。1−2日後、細胞を150mLの選択培地を満たした250mLスピナーに移し、37℃でインキュベートする。さらに2−3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3x105細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なCHO培地を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行された米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1.2x106細胞/mLで播種した。0日目に、細胞数とpHを測定した。1日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。2日目に、スピナーをサンプルし、温度を33℃に変え、30mLの500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤(例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion)をとった。生産を通して、pHは7.2近傍に調節し維持した。10日後、又は生存率が70%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに充填した。
【0157】
ポリ−Hisタグ作成物について、タンパク質はNi−NTAカラム(Qiagen)を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes,pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi−NTAカラムへ4−5ml/分の流速によって4℃でポンプ供給した。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトール, pH6.8を含む貯蔵バッファー中で25mlのG25 Superfine(Pharmacia)を用いて脱塩し、−80℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン(Fc含有)作成物を、以下の通りに条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー,pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)へポンプ注入した。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275μLの1Mトリスバッファー,pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はSDSポリアクリルアミドゲルとエドマン(Edman)分解によるN−末端アミノ酸配列決定により評価した。
【0158】
実施例5
酵母菌でのPRO23203の発現
以下の方法は、酵母菌中でのPRO23203の組換え発現を記載する。
第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのPRO23203の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。PRO23203をコードするDNA及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してPRO23203の細胞内発現を指示する。分泌のために、PRO23203をコードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーターをコードするDNA、天然PRO23203シグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌α因子又はインベルターゼ分泌シグナル/リーダー配列、及び(必要ならば)PRO23203の発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株ANTIBODY110酵母菌株は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリクロロ酢酸での沈降及びSDS−PAGEによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えPRO23203は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。PRO23203を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【0159】
実施例6
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのPRO23203の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるPRO23203の組換え発現を記載する。
PRO23203コードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ−hisタグ及び免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域など)を含む。pVL1393(Novagen)などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、PRO23203又はPRO23203コード配列の所定部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、5’及び3’領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。5’プライマーは、隣接する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスDNA(Pharmingen)を、Spodoptera frugiperda(「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)中にリポフェクチン(GIBCO−BRLから市販)を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4−5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O’Reilleyら, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
【0160】
次に、発現されたポリ−hisタグPRO23203は、例えばNi2+−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出物は、Rupertら, Nature, 362:175−179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えSf9細胞から調製した。簡単には、Sf9細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー(25mLのHepes, pH7.9;12.5mMのMgCl2;0.1mM EDTA;10%グリセロール;0.1%のNP−40;0.4MのKCl)中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を充填バッファー(50mMリン酸塩、300mMのNaCl、10%グリセロール、pH7.8)で50倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過した。Ni2+−NTAアガロースカラム(Qiagenから市販)を5mLの総容積で調製し、25 mLの水で洗浄し、25 mLの充填バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5 mLでカラムに充填した。カラムを、分画回収が始まる点であるA280のベースラインまで充填バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー(50mMリン酸塩;300mMのNaCl、10%グリセロール、pH6.0)で洗浄した。A280のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開した。1mLの分画を回収し、SDS−PAGE及び銀染色又はアルカリホスファターゼ(Qiagen)に複合したNi2+−NTAでのウェスタンブロットで分析した。溶離したHis10−タグPRO23203を含む画分をプールして充填バッファーで透析した。
あるいは、IgGタグ(又はFcタグ)PRO23203の精製は、例えば、プロテインA又はプロテインGカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【0161】
実施例7
PRO23203に結合する抗体の調製
この実施例は、PRO23203に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上記のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製PRO23203、PRO23203を含む融合タンパク質、細胞表面に組換えPRO23203を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1−100マイクログラムで注入したPRO23203免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をMPL−TDMアジュバント(Ribi Immunochemical Research, ハミルトン, モンタナ)に乳化し、動物の後フットパッドに注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗PRO23203抗体の検出のためのエライザアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【0162】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ(陽性)」な動物に、PRO23203静脈内注射の最後の注入をすることができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細胞を(35%ポリエチレングリコールを用いて)、ATCCから番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU.1等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、PRO23203に対する反応性についてのエライザでスクリーニングされる。PRO23203に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ(陽性)」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗PRO23203モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで増殖させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインA又はプロテインGへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【0163】
実施例8
特異的抗体を用いたPRO23203ポリペプチドの精製
天然又は組換えPRO23203ポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、pro−PRO23203ポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はpre−PRO23203ポリペプチドは、対象とするPRO23203ポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗PRO23203ポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインA(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインAでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、CnBr−活性化セファロース(商品名)(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
【0164】
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のPRO23203ポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるPRO23203ポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、界面活性剤の添加又はこの分野で公知の方法により分画遠心法を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により得られる。あるいは、シグナル配列を含む可溶化PRO23203ポリペプチドは、細胞が増殖する培地中に有用な量で分泌される。
可溶化PRO23203ポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはPRO23203ポリペプチドの好ましい吸着を可能ならしめる条件下(例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー)で洗浄される。次いで、カラムは、抗体/PRO23203ポリペプチド結合を分解する条件下(例えば、約2−3といった低pH、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)で溶離され、PRO23203ポリペプチドが回収される。
【0165】
実施例9
薬物スクリーニング
本発明は、PRO23203ポリペプチド又はその結合断片を種々の薬物スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングにとって特に有用である。そのような試験に用いられるPRO23203ポリペプチド又は断片は、溶液中に遊離した状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、或いは細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの1つの方法では、PRO23203ポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイによってスクリーニングされる。生存可能又は固定化形態のいずれかによって、このような細胞は標準的な結合アッセイで使用できる。例えば、PRO23203ポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるPRO23203ポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの間の複合体形成における減少を試験することもできる。
従って、本発明は、PRO23203ポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、当該分野で良く知られている手法により、その試薬をPRO23203ポリペプチド又は断片に接触させ、(I)試薬とPRO23203ポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ii)PRO23203ポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、PRO23203ポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、遊離なPRO23203ポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、遊離又は未複合の標識の量が、特定の試薬がPRO23203ポリペプチドに結合する又はPRO23203ポリペプチド/細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【0166】
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についてのハイスループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に公開されたWO84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。PRO23203ポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はPRO23203ポリペプチドと反応して洗浄される。結合したPRO23203ポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したPRO23203ポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、PRO23203ポリペプチドに結合可能な中和抗体がPRO23203ポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、PRO23203ポリペプチドで、1つ又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【0167】
実施例10
合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド(例えば、PRO23203ポリペプチド)又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、PRO23203ポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでPRO23203ポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬物の創作に使用できる(参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19−21 (1991))。
1つの方法において、PRO23203ポリペプチド、又はPRO23203ポリペプチド−インヒビター複合体の三次元構造が、x−線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には2つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、PRO23203ポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、PRO23203ポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似PRO23203ポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796−7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthaudaら,J. Biochem., 113: 742−746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【0168】
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体(抗−ids)を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗−idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗−idは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明によって、X線結晶学などの分析実験を実施するために十分な量のPRO23203ポリペプチドが入手可能である。さらに、ここに提供したPRO23203ポリペプチドアミノ酸配列の知識は、X線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダンスを提供する。
【0169】
実施例11
Taqman(商標登録)分析によるPUMPCnの発現
最初の研究として、正常並びに腫瘍組織及び細胞から調製されたヒトcDNAライブラリー[図4]中でのPUMPCnの発現は、Taqman(商標登録)により分析された。各cDNAライブラリーの50ナノグラムが使用された。PUMPCnの3’末端に対する以下のプライマーがTaqman分析に使用された。
順方向プライマー(19mer):GCCAGCCGGC AGGTTTATA(配列番号:6)
逆方向プライマー(19mer):ATTCAACTGG CGGGCAAGT(配列番号:7)
プローブ(26mer):TGCAGCAACA ATATTCAAGC GCGACA(配列番号:8)
TaqMan(登録商標)反応は、Taq DNA ポリメラーゼ酵素の5’エキソヌクレアーゼ活性を実時間でモニターするために用いる、蛍光PCRをベースにした技術である。2つのオリゴヌクレオチドプライマーは、PCR反応の特有なアンプリコンを生産するために使用される。3つ目のオリゴヌクレオチドは、又はプローブは、2つのPCRプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計される。該プローブはTaq DNA ポリメラーゼ酵素では伸長させることができず、レポーター蛍光色素と消光蛍光色素で標識化される。プローブ上で2つの蛍光色素が近接して存在すると、任意のレーザーによって誘起されたレポーター蛍光色素からの発光は消光蛍光色素によって消光される。増幅反応の間、Taq DNA ポリメラーゼ酵素は、テンプレート依存的にプローブを切断する。生じたプローブ断片は、溶液中で解離し、放出されたレポーター蛍光色素からのシグナルは、第二のフルオロフォアーの消光効果を受けなくなる。レポーター色素の一分子は、合成された新規分子の各々から解放され、消光されないレポーター色素の検出は、データの解釈の基礎を提供する。TaqMan(登録商標)の結果はデルタ(Δ)Ct単位で報告した。TaqMan(登録商標)アッセイデータは、最初にCt、又は閾値サイクルとして表された。これは、レポーターのシグナルが蛍光のバックグラウンドレベル以上に蓄積するサイクルとして定義される。ΔCt値は、癌を正常なヒトのものと比較する場合に、開始時のコピーの相対的数の定量値として使用される。1単位は1PCRサイクル又は正常に対して約2倍の増幅に相当し、2単位は4倍、3単位は8倍増幅等々に相当する。
β−アクチンの発現に対して基準化されたTaqMan(登録商標)の結果は、図4及び図5に示す。図4において、他の組織におけるPUMPCnの発現は、正常前立腺(1.0の値を示す前立腺)における発現と対比して示される。図4において、PUMPCnは、大腸並びに肺腫瘍及び肝臓腫瘍においても検出される発現と共に、前立腺において高度に発現される。図5は、図4に示される非前立腺cDNAライブラリーのサブセット中の正常組織に対する腫瘍組織のPUMPCnの発現倍率を示す。PUMPCnは肺、食道及び肺腫瘍において過剰発現されることが認められる。
Taqman分析の結果の検討に従い、より明確な検討を提供するために、インサイツハイブリダイゼーションが種々の正常及び癌性組織に対して実施された。ここで見られる発現パターンは、後述の実施例12に記載されるインサイツハイブリダイゼーション分析結果と一致した。
【0170】
実施例12
インサイツハイブリダイゼーションによるPUMPCnの発現
インサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定及び局在化、特定mRNA合成及び染色体マッピングにおける追跡に有用である。インサイツハイブリダイゼーションは、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169−176 (1994)のプロトコールの最適な変法に従って、PCRにより生成されたα−33Pリボプローブを用いて実施された。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼK(20g/ml)で15分間37℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツでハイブリダイゼーションを行った。α−33P UTP−アンチセンスリボプローブを、いずれかの末端にT3及びT7RNAポリメラーゼプロモーターを有するように設計されたPCR産物から生成し、55℃で終夜ハイブリダイゼーションする。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬して4週間露出する。
【0171】
リボプローブ合成
6.0μl(125mCi)の(Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol)をスピード真空乾燥させた。乾燥α−33P UTPを含む各チューブに以下の成分を添加した:2.0mlの5x転写バッファー;1.0μlのDTT(100mM);2.0μlのNTP混合物(2.5mM: 10μ; 10mMのGTP, CTP & ATP+10μlのH2O);1.0μlのUTP(50μM);1.0μlのRnasin;1.0μlのDNAテンプレート(1μg);1.0μlのH2O
チューブを37℃で1時間インキュベートし、1.0μlのRQ1DNaseを添加し、次いで37℃で15分間インキュベートした。90μlのTE(10mM Tris pH7.6/1mMのEDTA pH8.0)を添加し、混合物をDE81紙にピペットした。残りの溶液をMicrocon−50(商品名)限外濾過ユニットに添加し、プログラム10を用いてスピンさせた(6分間)。濾過ユニットを第2のチューブ上に逆に装着し、プログラム2を用いてスピンさせた(3分間)。最終回収スピンの後、100μlのTEを添加した。1μlの最終生成物をDE81紙にピペットし6mlのBiofluor II(商品名)中、Beckman LS5000 TDシンチレーションカウンターでカウントした。
プローブをTBE/尿素ゲル上で泳動させた。1−3μlのプローブ又は5μlのRNA MrkIIIを3μlの泳動用バッファーに添加した。加熱ブロック上で95℃に3分間加熱した後、プローブを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を添加し、180−250ボルトで45分間泳動した。ゲルをsaranラップ中にラップし、−70℃のフリーザー内で増感スクリーンと共にXARフィルムに1時間から終夜露出した。
【0172】
ハイブリダイゼーション
凍結切片の前処理。 スライドをフリーザーから取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で5分間解凍した。トレイを55℃のインキュベータに5分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において4%パラホルムアルデヒド中で5分間固定し、0.5xSSCで5分間室温で洗浄した(25ml 20xSSC + 975ml SQ H2O)。0.5μg/mlのプロテイナーゼ中、37℃で10分間の脱タンパクの後(250mlの予備加熱したRNase不含RNAseバッファー中の10mg/mlストック12.5μl)、切片を0.5 x SSCで10分間室温で洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタノール中、各2分間脱水した。
パラフィン包埋切片の前処理。スライドを脱パラフィンし、SQ H2O中に配置し、2 x SSCで室温において各々5分間2回リンスした。切片を20μg/mlのプロテイナーゼK(250mlのRNase無しRNaseバッファー中10mg/mlを500μl;37℃、15分間)−ヒト胎児又は8 xプロテイナーゼK(250mlのRNaseバッファー中100μl、37℃、30分間)−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く0.5 x SSCでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
【0173】
プレハイブリダイゼーション。 スライドをBoxバッファー(4 x SSC、50%ホルムアミド)−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を50μlのハイブリダイゼーションバッファー(10%硫酸デキストラン、50%ホルムアミド、2X SSC)で被覆し、42℃で1−4時間インキュベートした。
ハイブリダイゼーション。 スライド当たり1.0 x 106cpmのプローブ及び1.0μlのtRNA(50 mg/mlストック)を95℃で3分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48μlのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。ボルテックスの後、50μlの33P混合物をスライド上のプレハイブリッド50μlに添加した。スライドを55℃で終夜インキュベートした。
洗浄。 洗浄は、2 x SSC、EDTAで2 x 10分間、室温で実施し(400mlの20 x SSC+16 mlの0.25M EDTA、Vf=4L)、次いでRNaseA処理を37℃で30分間行った(250ml RNaseバッファー中10mg/mlを500μl=20μg/ml)。スライドを2 x 10分間、EDTAで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り:55℃で2時間、0.1 x SSC、EDTA(20mlの20xSSC+16mlのEDTA、Vf=4L)。
【0174】
ヒト及びチンプについての研究が、PUMPCnの3’セグメントに対するプローブを用いて実施された。PCRプライマーは、(33P)放射活性標識した一本鎖相補的リボプローブのインビトロにおける転写のためのテンプレートとして役立ち得る遺伝子部分を増幅するために設計された。センス(コントロール用)リボプローブは、正方向PCRプライマーの5’末端に付加されたT7プロモーターのための27ヌクレオチド配列を認識する、T7 RNAポリメラーゼを用いる転写によって生成される。アンチセンス(実験用)リボプローブは、逆方向PCRプライマー5’末端に付加されたT3プロモーターのための27ヌクレオチド配列を認識する、T3RNAポリメラーゼを用いる転写によって生成される。第一研究[ISH2000−121]PUMPCnプローブは、DNA185171−2994[配列番号1]のヌクレオチド1149−1503をカバーするように設計された。
正方向プライマー(配列番号9):
5’ GGATTCTAAT ACGACTCACT ATAGGGCCTG CTTACCGATC AGAAGGTC 3’
逆方向プライマー(配列番号10):
5’ CTATGAAATT AACCCTCACT AAAGGGAGGC AAAACAAGAG CAAGAACA 3’
プローブ配列は:
5’ CTGCTTACCGATGAGAAGGTCAGAGAGATATTTGTTTCTCAACATGGCTTATCAGCAGGTTCATGCAAATATTGAAAACTCTTGGAATGAGGAAGAAGTTTGGAGAATTGAAATGTATATCTCCTTTGGCATAATGAGCCTTGGCTTACTTTCCCTCCTGGCAGTCACTTCTATCCCTTCAGTGAGCAATGCTTTAAACTGGAGAGAATTCAGTTTTATTCAGTCTACACTTGGATATGTCGCTCTGCTCATAAGTACTTTCCATGTTTTAATTTATGGATGGAAACGAGCTTTTGAGGAAGAGTACTACAGATTTTATACACCACCAAACTTTGTTCTT GCTCTTGTTTTGCC−3’(配列番号11)
【0175】
ヒトに関する研究はPUMPCnの5’部分に対するプローブを用いて繰り返された。このプローブは該遺伝子の3’部分に対するプローブと同じ結果を与えた。この2番目の研究において用いられるプローブはDNA185171[配列番号1]のヌクレオチド14−566をカバーするように設計された。
正方向プライマー(配列番号12):
5’ GGATTCTAAT ACGACTCACT ATAGGGCATG GAACAGTATA TGGAAAGC 3’
逆方向プライマー(配列番号13):
5’ CTATGAAATT AACCCTCACT AAAGGGACTG GGTACTGGTT TATCCTC
プローブ配列は:5’ ATGGAACAGTATATGGAAAGCTCCCAAGAAAGTGAAGAGAGGAAATTGGAAAATTGTGAGTGGACCTTCTGATACTGCTCCTCCTTGCGTGGAAAAGGGGAAAGAACTGCATGCATATTATTCAGCGTCCTATATTCAAAGGATATTCTTGGTGATCTTGGAAGTGTCCGTATCATGGAATCAATCTCTATGATGGGAAGCCCTAAGAGCCTTAGTGAAACTTGTTTACCTAATGGCATAAATGGTATCAAAGATGCAAGGAAGGTCACTGTAGGTGTGATTGGAAGTGGAGATTTTGCCAAATCCTTGACCATTCGACTTATTAGATGCGGCTATCATGTGGTCATAGGAAGTAGAAATCCTAAGTTTGCTTCTGAATTTTTTCCTCATGTGGTAGATGTCACTCATCATGAAGATGCTCTCACAAAAACAAATATAATATTTGTTGCTATACACAGAGAACATTATACCTCCCTGTGGGACCTGAGACATCTGCTTGTGGGTAAAATCCTGATTGATGTGAGCAATAACATGAGGATAAACCAGTACCCAG−3’(配列番号14)
【0176】
結果
一連の良性の前立腺、原発性前立腺癌、及び転移性前立腺癌を含む組織パネル中;及び種々の部位由来の腫瘍アレイ中で、DNA185171−2994の高い発現が認められる。ハイブリダイゼーションシグナルは、肺、大腸、膀胱、前立腺及び子宮内膜において見られる。種々の部位由来の正常組織のアレイ中で、ハイブリダイゼーションシグナルは前立腺線及び卵巣において認められる。全ての組織は同時にハイブリダイズされ;強度にはバラツキがあるものの、前立腺組織中でのシグナルは一貫しており、しばしば比較的非常に高かったことを付言しておく。
表4に、組織パネル中の相対的シグナル強度としてのPUMPCn発現をまとめてある。一連の良性前立腺、原発性前立腺癌、及び転移性前立腺癌を含む組織パネル中で、DNA185171−2994の高い発現が認められた。ハイブリダイゼーションシグナルは、正常前立腺中で認められた。前立腺組織のアレイ中で、最も高いシグナル強度はしばしば転移性腫瘍と関連づけられた。我々は、DNA185171−2994及び前立腺組織でのみ高度に発現されることが既に示されているコントロール分子を定量した。発現レベルは、33P標識ハイブリダイゼーションプローブのホスホイメージャー分析によって分析された。組織アレイの各エレメント由来のDNA185171−2994シグナルは、同じエレメント由来のコントロールシグナルで割った。DNA185171−2994/コントロールの比率は、原発性癌の集団と比較して転移性癌の集団では3倍高かった。従って、DNA185171−2994は、転移性腫瘍に対し、特に魅力的な標的となるだろう。
【0177】
【0178】
実施例13
PUMPCnに対するモノクローナル抗体
細胞株及びトランスフェクション−293細胞はヒト不死化胎児性腎臓細胞株(ATCC照会番号CRL1573であり、PC−3はヒト前立腺癌細胞株(ATCC照会番号CRL1435)、そしてSV−T2はマウス胎児性線維芽細胞株である。生育条件はATCCのガイドラインに従った。全ての細胞株に対し、1μg DNA又は3μg DNAがEffectene(Qiagen)を用いて6−ウェル又は10 cmディッシュの中にそれぞれトランスフェクトされた。細胞はトランスフェクション後48時間で回収又は固定された。
cDNAコンストラクト−アミノ酸1−454を含む全長PUMPCn(DNA#185171)は、SV40#185171由来のブラント化されたXbaI/PstI断片として、mycエピトープを含むpCDNA3(Invitrogen)の修飾されたもののEcoRVサイトにサブクローニングされた。アミノ酸1−194を含んだMyc 5’側PUMPCn及びアミノ酸193−454を含んだMyc 3’側PUMPCnは、BamHIで切断されたpCDNA3 myc全長PUMPCnに由来し、各々、BamHIによって切断されたpCDNA3 mycにサブクローニングされるか又は元のベクター中へ再環状化した。全長gD PUMPCnのコンストラクトは、そのアミノ末端にgDエピトープタグを有しアミノ酸1−454をコードし、XhoI/XbaIで切断したgD vec806中へpCDNA3 mycの全長PUMPCn由来のSal/XbaI断片(mycタグを除去したもの)をサブクローニングすることによって誘導された。タグ化されない全長PUMPCnは、CMVプロモーターの制御下で、pCDNA3.1−(Invitorogen)のXhoI/ NotI部位へpCDNA3 myc全長PUMPCn SalI/NotI断片(mycタグを除去したもの)をサブクローニングすることによって構築された。全てのコンストラクトは、ABIシークエンサーを用いたDNA配列決定により確認された。
【0179】
抗体及び免疫学的手法−メスのBalb/cマウスを、met, Lysで始まりtrp, argで終止するアミノ酸25−213に相当するN末端断片[図2;配列番号2を参照のこと]で免疫した。マウスは、フットパッドの静脈内にインジェクトした。モノクローナルAbsは、免疫用ペプチドに対するエライザによってスクリーニングされた。エライザでポジティブだったクローンは、更にウェスタンブロット分析及び免疫組織化学(IHC)によって更にテストした。
LnCAPヒト前立腺癌細胞のフレッシュに凍結された切片、そしてホルマリン固定、パラフィン包埋された切片は、IHCにより調べられた。以前実施されたインサイツハイブリダイゼーションにおいて、LnCAP細胞がPUMPCn mRNAの高いレベルを呈することを示したが、同等のレベルが前立腺癌種の組織切片で検出された。一次抗体として抗−PUMPCnモノクローナルを用いたアビジン−ビオチン/ペルオキシダーゼ複合体法により、IHCが実施された。
mycエピトープに対するモノクローナル抗体はInvitrogenから購入した;gDエピトープに対するモノクローナル抗体は、5B6 mAb(Gnenentech)である。ウェスタン分析に対して、あらかじめ成形されたゲル(Novex)を説明書に従って使用してSDS−ゲル電気泳動を行うことにより、およそ50μgの全可溶性タンパク質又は全細胞溶解物を分離し、PVDF膜にブロットした。可溶性タンパク質溶解物はトランスフェクトされた細胞を5倍容のTriton X−100バッファー[20mM tris−HCl, pH8.0, 1% Triton X−100, 137mM NaCl, 10%グリセロール, 1mM EGTA, 1.5mM MgCl2, 1mM dithiothreitol(DTT), 1mM バナジン酸ナトリウム, 50mM NaF, 1mM Pefabloc, 各10μg/mlのアプロチニン, ペプスタチン及びロイペプチン]中に溶解させ、14,000 rpmで10分間遠心することにより沈殿を除いた。全細胞溶解物は1XSDSサンプルバッファーに直接溶解させることにより調製した。ウェスタンブロッティングにおいて、抗体は最終濃度2μg/mlで使用し、ECLシステム(Amersham)を用いて増感させた。固定された全細胞中のタグ化PUMPCnの免疫蛍光検出は、カバーグラス上で生育させ、4%パラホルムアルデヒドで固定し、各エピトープタグに対するマウスモノクローナル抗体を用いて染色された293又はPC−3細胞に対して実施された。該細胞は、FITC又はTexas Red標識二次抗体(Jackson Labs)のいずれかにより視覚化され、核の検出のためにDAPIで同時染色した。
【0180】
293及びPC−3細胞は6ウェルディッシュ中のカバースリップ上にプレーティングされ、Effecteneを用いてmycでタグ化された全長PUMPCn、myc PUMPCn 5’, myc PUMPCn 3’, 及びgD PUMPCnでトランスフェクトされた。トランスフェクト後24時間で、培地を交換し更に24時間インキュベートした。細胞は、4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で10分間固定し、PBSで4回洗浄し、使用するまでホイル中、4℃にて保存した。カバースリップは抗−myc又は抗−gD反応活性に対し染色し、FITC結合ロバ抗−マウス抗体を用いて視覚化した。
293, PC−3及びSV−T2細胞が、Effecteneを用いてmycでタグ化された全長PUMPCn、myc PUMPCn 5’, myc PUMPCn 3’, 及びgD PUMPCnでトランスフェクトされた。トランスフェクト後24時間で、培地を交換し更に24時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞は、上述のように溶解し、エピトープタグ化PUMPCnの発現に関し解析された。
PUMPCn(アミノ酸25−213)のN末端断片に対して調製されたモノクローナル抗体は、初めに免疫原として使用された組換体PUMPCnとの結合についてテストされ、次に、以下の細胞株:293、SW480、Colo205、HPAC、SW780、LuCAP及びHPAFII、から調製された基準化された細胞溶解物中の内在性PUMPCnの存在についてテストされた。
結果
N末端断片アミノ酸25−213に対して調製されたモノクローナル抗体は以下のものである:
【0181】
IHCによってテストされたクローン(ハイブリドーマ細胞株)は、3248 (2H6.2.1), 3249 (3A9.2.1), 3250 (3B4.2.1), 3251 (3H9.1.1), 3252 (5D11.1.1), 3253 (5F12.1.1), 3254 (5G9.1.1), 3255 (6B4.1.1), 3256 (7B6.2.1)であった。IHCは、MAb 3248, 3249, 3251, 3253 及び3255によるフレッシュに凍結された切片中のLnCAP細胞原形質膜に関連した中程度から強い免疫反応性を示した。ホルマリン固定、パラフィン包埋されたLuCAP細胞切片中で、MAbs3248及び3249は原形質膜に特異的に局在したポジティブな免疫反応性を示した。この膜局在化は、配列分析による予想した膜貫通構造と整合し、アクセス可能な治療標的としてのPUMPCnの妥当性を支持する。ここで記述されるモノクローナル抗体は、組織切片中のPUMPCnの局在及び発現レベルを示すために使用され得る。
上記実施例中の結果から、DNA185171−2994に対する抗体及びハイブリダイゼーションプローブは、PUMPCnを発現する腫瘍中のDNA185171−2994を検出するために有用である。そのまま又は細胞障害性剤と結合した抗体は、癌の治療において有用であるが、この癌は細胞表面上にPUMPCnを発現させ、特に前立腺癌である。他の場合において、転移性腫瘍が前立腺組織由来である場合、DNA185171−2994に対する抗体及びハイブリダイゼーションプローブは、検出において有用である。さらなる場合において、DNA185171−2994に対する抗体は、その後身体の他の部位へ転移する前立腺由来の腫瘍の治療において有用であろう。
【0182】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, 10801 ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア20110−2209米国(ATCC)へ寄託した:
【0183】
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から30年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、何れが最初に来ようとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886OG638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死滅もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、天然配列PRO23203をコードするヌクレオチド配列(ヌクレオチド188−1549)を含むcDNAのヌクレオチド配列(配列番号:1)を示し、該ヌクレオチド配列(配列番号:1)は、ここで「DNA185171−2994」として表されるクローンである。また、開始及び停止コドンのそれぞれの位置が、太文字及び下線で示されている。
【図2】図2は、配列番号:1のコード化配列に由来する天然配列PRO23203ポリペプチドのアミノ酸(配列番号:2)を示す。
【図3】図3は、DNA185171−2994[実施例1に記載]に関するGEPISの結果を示す。組織のタイプは図の端に示されている。相対的存在量はY軸にプロットされ、有意aな発現があるかどうか決定される。X軸は組織からヒットする状態、腫瘍(TUM)、その他(OTH)、非腫瘍組織(NON)、転移性(MET)、炎症性の(INF)をリスト化してある。
【図4a】図4aは、実施例11に記載されているように、幾つかのヒトcDNAライブラリー中の正常前立腺に関するPUMPCnの発現を示す。
【図4b】図4bは、実施例11に記載されているように、幾つかのヒトcDNAライブラリー中の正常前立腺に関するPUMPCnの発現を示す。
【図5】図5は、実施例11に記載されているように、ヒトcDNAライブラリー中の腫瘍と正常組織間のPUMPCn遺伝子の発現倍率差を示す。
【図6】図6は、「DM1」で示されるメイタンシノイドの構造を示す。
Claims (62)
- (a)図2(配列番号:2)の約1から約454のアミノ酸残基の配列を含むPRO23203ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖と少なくとも約80%の配列同一性を有するDNAを含む単離された核酸分子。
- 図1(配列番号:1)のヌクレオチド位置約188から1549の配列を含む請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 図1(配列番号:1)のヌクレオチド配列を含む請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 図2(配列番号:2)の約約1から約454のアミノ酸残基の配列をコードするヌクレオチド配列を含む請求項1に記載の単離された核酸分子。
- (a)ATCC寄託番号PTA−2513(DNA185171−2994)として2000年9月26日付けでATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAによりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖と少なくとも約80%の配列同一性を有するDNAを含む単離された核酸分子。
- ATCC寄託番号PTA−2513(DNA185171−2994)として2000年9月26日付けでATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAによりコードされるものと同じ成熟ポリペプチドをコードするDNAを含む請求項5に記載の単離された核酸分子。
- (a)ATCC寄託番号PTA−2513(DNA185171−2994)として2000年9月26日付けでATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAの全長ポリペプチドコード化配列、又は(b)(a)のコード化配列の相補鎖と少なくとも約80%の配列同一性を有するDNAを含む単離された核酸分子。
- ATCC寄託番号PTA−2513(DNA185171−2994)として2000年9月26日付けでATCCに寄託されたヒトタンパク質cDNAの全長ポリペプチドコード化配列を含む請求項7に記載の単離された核酸分子。
- 図2(配列番号:2)のアミノ酸1から約454をコードする核酸配列の相補鎖とハイブリダイズするDNAを含むPRO23203ポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
- 図2(配列番号:2)のアミノ酸1から約454をコードする核酸が、図1(配列番号:1)のヌクレオチド188から約1549を含む請求項9に記載の単離された核酸分子。
- ハイブリダイゼーションが緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で起こる請求項9に記載の単離された核酸分子。
- 少なくとも約1204ヌクレオチドを含み、(a)図2(配列番号:2)のアミノ酸残基1から約454の配列を含むPRO23203ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖と緊縮性のハイブリダイゼーション条件下でテストDNA分子をハイブリダイズし、試験DNA分子を単離することによって生産される単離された核酸分子。
- (a)又は(b)と少なくとも約80%の配列同一性を持つ請求項12に記載の単離された核酸分子。
- 請求項1の核酸分子を含むベクター。
- 前記核酸分子が、ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識されるコントロール配列と作用可能に結合する請求項14に記載のベクター。
- 登録番号PTA−2513(DNA185171−2994)としてATCCに寄託された核酸分子。
- 請求項14に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 前記細胞がCHO細胞である請求項17に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が大腸菌である請求項17に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が酵母細胞である請求項17に記載の宿主細胞。
- 前記PRO23203ポリペプチドの発現に適する条件下で請求項17に記載の宿主細胞を培養し、細胞培養物から前記PRO23203ポリペプチドを回収することを含む、PRO23203ポリペプチドを生産する工程。
- 図2(配列番号:2)のアミノ酸残基約1から約454のアミノ酸残基の配列と少なくとも約80%の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む単離されたPRO23203ポリペプチド。
- 図2(配列番号:2)のアミノ酸残基1から約454を含む請求項22に記載の単離されたPRO23203ポリペプチド。
- ATCC寄託番号PTA−2513(DNA185171−2994)として2000年9月26日付けでATCCに寄託されたベクターのcDNAインサートによってコードされるポリペプチドと少なくとも約80%配列同一性を有する単離されたPRO23203ポリペプチド。
- ATCC寄託番号PTA−2513(DNA185171−2994)として2000年9月26日付けでATCCに寄託されたベクターのcDNAインサートによってコードされる請求項24に記載の単離されたPRO23203ポリペプチド。
- 図2(配列番号:2)のアミノ酸残基1から約454の配列、又は抗−PRO23203抗体の結合部位を提供するのに十分であるその断片を含む単離されたPRO23203ポリペプチド。
- (i)テストDNA分子を(a)図2(配列番号:2)のアミノ酸残基1から約454の配列を含むPRO23203ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖と緊縮性の条件下でハイブリダイズさせ、(ii)前記ポリペプチドの発現に適する条件下で前記テストDNA分子を含む宿主細胞を培養し、(iii)細胞培養物から前記ポリペプチドを回収することにより生産される単離されたポリペプチド。
- (a)又は(b)と前記テストDNAが少なくとも約80%の配列同一性を持つ請求項27に記載の単離されたポリペプチド。
- 異種のアミノ酸配列と融合したPRO23203ポリペプチドを含むキメラ分子。
- 前記異種のアミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項29に記載のキメラ分子。
- 前記異種のアミノ酸配列がイムノグロブリンFc領域である請求項29に記載のキメラ分子。
- PRO23203ポリペプチドと特異的に結合する抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項32に記載の抗体。
- 前記抗体がヒト化抗体である請求項32に記載の抗体。
- 前記抗体が抗体断片である請求項32に記載の抗体。
- 前記抗体が細胞障害性剤と連結される請求項32に記載の抗体。
- 前記抗体が標識と連結される請求項32に記載の抗体。
- PRO23203ポリペプチドに対するアゴニスト。
- PRO23203ポリペプチドに対するアンタゴニスト。
- (a)PRO23203ポリペプチド、(b)PRO23203ポリペプチドに対するアゴニスト、(c)PROポリペプチドに対するアンタゴニスト、又は(d)薬学的に受容可能な坦体と混合した抗−PRO23203抗体を含む組成物。
- (a)Xが図2(配列番号:2)の205から214の任意のアミノ酸である、図2(配列番号:2)の1からXのアミノ酸をコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖と少なくとも約80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
- (a)Xが図2(配列番号:2)の205から214の任意のアミノ酸である、図2(配列番号:2)の1からXのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列、又は(b)(a)のヌクレオチド配列の相補鎖を含む請求項39に記載の単離された核酸。
- (a)Xが図2(配列番号:2)の205から214の任意のアミノ酸である、図2(配列番号:2)の残基約1からXのアミノ酸配列と比較して、少なくとも約80%ポジティブであるとスコア化するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は(b)(a)のヌクレオチド配列の相補鎖を含む単離された核酸。
- Xが図2(配列番号:2)の205から214の任意のアミノ酸である、図2(配列番号:2)のアミノ酸1からXと少なくとも約80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離された可溶性PRO23203ポリペプチド。
- Xが図2(配列番号:2)の205から214の任意のアミノ酸である、図2(配列番号:2)のアミノ酸1からXを含む請求項42に記載の単離された可溶性PRO23203ポリペプチド。
- Xが図2(配列番号:2)の205から214の任意のアミノ酸である、図2(配列番号:2)のアミノ酸1からXのアミノ酸配列と比較して、少なくとも約80%ポジティブであるとスコア化するアミノ酸配列を含む単離された可溶性PRO23203ポリペプチド。
- 抗−PRO23203抗体の治療上有効量を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の前立腺癌を治療する方法。
- 前記前立腺癌がアンドロゲン非依存性前立腺癌である請求項47に記載の方法。
- 前記癌が前立腺由来で身体の他の部位へ転移する、請求項47に記載の方法。
- 前記抗体が抗体断片である請求項47に記載の方法。
- 前記抗体断片がFab断片である請求項47に記載の方法。
- 前記抗体が細胞障害性剤と結合していない請求項47に記載の方法。
- 前記抗体断片が細胞障害性剤と結合していない請求項50に記載の方法。
- 前記抗体が細胞障害性剤と結合している請求項47に記載の方法。
- さらに前記哺乳動物に化学療法剤を投与することを含む請求項47に記載の方法。
- 容器、及びその中に収容される組成物を含む製造品であって、該組成物が抗−PRO23203抗体を含み、さらに前立腺癌を治療するのに該組成物を使用できることを表示する添付文書を含んでなる製造品。
- 前記前立腺癌がアンドロゲン非依存性前立腺癌である請求項56に記載の製造品。
- 前記添付文書が化学療法剤で患者を治療することをさらに表示する請求項56に記載の製造品。
- 哺乳動物の前立腺癌の存在を診断する方法であって、前記方法が前記哺乳動物の組織を抗−PRO23203抗体と接触させ、前記組織の構成成分に対する前記抗体の結合を検出することを含んでなり、前記組織の構成成分に対する前記抗体の結合が前記哺乳動物における前立腺癌の存在を示す方法。
- 前記接触がエキソビボで実施される請求項59に記載の方法。
- 容器、及びその中に収容される組成物を含む製造品であって、該組成物が抗−PRO23203抗体を含み、さらに前立腺癌の診断に該組成物を使用できることを表示する添付文書を含んでなる製造品。
- 哺乳動物の前立腺癌の存在を診断する方法であって、前記方法が診断用マイクロアレイをDNA185171−2994プローブと接触させ、正常組織と比較した場合、前立腺癌組織中での前記DNA185171−2994プローブのハイブリダイゼーションを検出及び定量し、DNA185171−2994が過剰発現しているかどうか決定することを含む方法。
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