JP2004506431A5 - - Google Patents

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を分析するための蛍光プローブシステムであって、
前記核酸の座位に対してほぼ相補的な配列、および、塩基アナログである前記プローブのヌクレオチドに付着する蛍光ラベルを含む単一ラベルポリヌクレオチドから事実上成る標的核酸を分析するための蛍光プローブシステムであって、
前記単一ラベルポリヌクレオチドの前記核酸の座位へのハイブリダイゼーション時に、前記蛍光ラベルは、標的核酸の一残基の近くに配され、前記蛍光ラベルの蛍光強度が増加することを特徴とする蛍光プローブシステム。
【請求項２】
前記塩基アナログは、５−ニトロインドール、４−ニトロインドール、６−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−イオド−シチジン、イノシン、および、ヌブラリン・デオキシヌクレオシド類から成るグループから選ばれることを特徴とする請求項１のプローブシステム。
【請求項３】
前記標的核酸は、一つの相補的位置にＣ残基を有することを特徴とする請求項１のプローブシステム。
【請求項４】
標的核酸を分析するためのプローブであって、
前記標的核酸の座位に対してほぼ相補的な配列を有する単一ラベルオリゴヌクレオチド、および、前記オリゴヌクレオチドの塩基アナログである内部残基に結合する蛍光ラベルから事実上成る蛍光検出体を含む標的核酸を分析し、
前記プローブのオリゴヌクレオチド配列は、同プローブの前記標的核酸の座位へのハイブリダイゼーション時に、前記蛍光ラベルからの蛍光発光量が、プローブの標的核酸に対するハイブリダイゼーションによって変化するように選択されることを特徴とするプローブ。
【請求項５】
生物サンプルにおける標的核酸の有無を確定するための方法であって、
単一ラベルオリゴヌクレオチド・プローブをサンプルと混合する工程であって、
前記プローブは、前記標的核酸の座位とほぼ相補的なオリゴヌクレオチド配列と、前記オリゴヌクレオチド配列のＧ残基と結合する蛍光ラベルとを有し、
前記蛍光ラベルはハイブリダイゼーション依存性蛍光発光を呈するものであって、その蛍光発光においては、前記オリゴヌクレオチド・プローブが前記標的核酸とハイブリダイズすると、蛍光ラベルとＧ残基との相互作用を変化させ、それによってラベルからの蛍光発光が増加することになることを特徴とする工程と；
生物サンプルを照射する工程と；
ハイブリダイゼーション依存性蛍光発光をサンプル温度の関数としてモニターする工程と；
を含む方法。
【請求項６】
前記Ｇ残基が前記オリゴヌクレオチド配列の末端残基を含むことを特徴とする請求項５の方法。
【請求項７】
前記標的核酸の座位が、前記Ｇ残基に対する相補位置にＣ残基を有することを特徴とする請求項６の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチド配列の前記標的核酸に対するハイブリダイゼーションによって、突き出し部が前記標的核酸の前記Ｃ残基に隣接して形成されることを特徴とする請求項７の方法。
【請求項９】
ポジション−１、＋１および＋２にＧ以外の残基が配されることを特徴とする請求項８の方法。
【請求項１０】
前記標的核酸のポジション−１と＋１にグアニン残基が存在しないことを特徴とする、請求項６の方法。
【請求項１１】
前記プローブとサンプルは、ｐＨ＞８．０の液の中で混合されることを特徴とする、請求項５の方法。
【請求項１２】
前記溶液は、約２００ ｍＭのトリス濃度を有することを特徴とする、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記蛍光ラベルは、フルオレセン、フルオレセン誘導体、および、フルオレセン−シアニン接合体から成るグループから選ばれ、かつ、陽イオン濃度が約５０−２００ ｍＭであることを特徴とする、請求項１１の方法。
【請求項１４】
前記溶液は、トリス＋、トリシン＋、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、および、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロペンジオールから成るグループから選ばれるバッファーをさらに含むことを特徴とする、請求項１１の方法。
【請求項１５】
前記ハイブリダイゼーション依存性蛍光発光が非対称ＰＣＲ実行時においてモニターされていることを特徴とする、請求項５の方法。
【請求項１６】
約４５ＰＣＲサイクルが実行され、かつ、一対のＰＣＲプライマーが１：４比で与えられることを特徴とする、請求項１５の方法。
【請求項１７】
約６０ＰＣＲサイクルが実行され、かつ、一対のＰＣＲプライマーが１：８比で与えられることを特徴とする、請求項１５の方法。
【請求項１８】
生物サンプルにおける標的核酸の有無を確定するための方法であって、
前記生物サンプルを、前記標的核酸の選択された分節を増幅するように構成される一対のプライマー、および、単一ラベルオリゴヌクレオチド・プローブから事実上成る蛍光検出体と混合する工程であって、
前記単一ラベルプローブは、前記標的核酸の選択された分節の座位に対して相補的な配列、及び、蛍光ラベルを有するオリゴヌクレオチドを含み、そこでプローブが前記座位にハイブリダイズすると、ハイブリダイゼーション依存性蛍光ラベルの発光が生じる工程と；
ポリメラーゼを添加し、複数の増幅サイクルを通じて前記核酸配列の前記選択された分節を増幅する工程と；
前記生物サンプルを照射する工程と；
前記ハイブリダイゼーション依存性蛍光発光をモニターする工程と；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記プローブが前記標的核酸から解離する際に、−ｄＦ／ｄＴ最大値を確定する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記蛍光ラベルが、前記オリゴヌクレオチド・プローブの塩基と結合し、かつ、前記塩基が、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール、および、３−ニトロピロール・デオキシヌクレオシド類から成るグループから選ばれることを特徴とする、請求項１８の方法。
【請求項２１】
前記蛍光ラベルが、前記オリゴヌクレトチド・プローブの塩基と結合し、かつ、前記塩基が、イノシン、５−イオド−シチジン、および、ネブラリン・デオキシヌクレオシド類から成るグループから選ばれる請求項１８の方法であって、
グアニン以外の残基が、標的核酸上においてラベル位置に対してポジション＋１に配されることを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記蛍光ラベルはグアニン残基に付着し、かつ、前記モニター工程は、前記プローブが前記標的核酸にハイブリダイズする際に生じる、蛍光ラベルからの蛍光発光の増加をモニターすることを含むことを特徴とする、請求項１８の方法。
【請求項２３】
前記蛍光ラベルが、シアニン染料およびＬＣＲｅｄ ７０５から成るグループから選ばれることを特徴とする、請求項１８の方法。
【請求項２４】
前記蛍光検出体が表面に固定化されており、前記混合工程が、サンプルを前記表面に接触させることを含むことを特徴とする、請求項１８の方法。
【請求項２５】
請求項１８の方法であって、
第２の単一ラベルオリゴヌクレオチド・プローブから事実上成る第２の蛍光検出実体を提供する工程であって、
前記第２の単一ラベルオリゴヌクレオチド・プローブは、前記標的核酸の第２の選択された分節に対してほぼ相補的であり、かつ、その配列の末端に結合される第２の蛍光ラベルを有する第２のオリゴヌクレオチド配列を含み、
第２の蛍光ラベルは、第１のプローブの蛍光発光とは異なる波長の、ハイブリダイゼーション依存性蛍光発光を呈し、第２のオリゴヌクレオチド・プローブの第２選択分節に対するハイブリダイゼーションは、第２のラベルからの蛍光発光に変化をもたらし、かつ、この蛍光シグナル変化は、第１の蛍光検出体の蛍光発光とは独立している工程と；
第２のプローブの前記ハイブリダイゼーション依存性蛍光発光をモニターする工程と；
をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
生物サンプルにおける標的核酸の有無を確定するための方法であって、
前記生物サンプルを、単一ラベルオリゴヌクレオチド・プローブから事実上成る蛍光検出体と混合する工程であって、
前記単一ラベルプローブは、前記標的核酸の一つの座位に対して相補的な配列、および、その５‘末端ヌクレオチドに蛍光ラベルを付着させ、かつ、ハイブリダイゼーション依存性発光を示すオリゴヌクレオチドとを含み、前記プローブの前記座位に対するハイブリダイゼーションは前記蛍光ラベルからの蛍光発光を増加させる工程と；
前記生物サンプルとプローブを、第２のオリゴヌクレオチドとポリメラーゼと混合する工程であって、
プローブと第２のオリゴヌクレオチドは増幅において一対のプライマーとして作動する工程と；
前記標的核酸を増幅する工程と；
前記生物サンプルを照明する工程と；
ハイブリダイゼーション依存性蛍光発光をモニターする工程と；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記５’末端ヌクレオチドはＡまたはＴ残基であることを特徴とする、請求項２６の方法。
【請求項２８】
核酸配列を含む生物サンプル分析用キットであって、
ａ．オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドに蛍光ラベルを結合させた単一ラベルオリゴヌクレオチド・プローブから事実上成る蛍光検出体であって、
前記末端ヌクレオチドは塩基アナログであり、前記プローブは、前記分節の一本鎖座位にハイブリダイズすると、プローブの座位に対するハイブリダイゼーションによって前記蛍光ラベルの蛍光強度が増加するように構成されている蛍光検出体と、
ｂ．前記核酸配列増幅用成分と、
を含むキット。
【請求項２９】
前記成分は、前記核酸配列の一分節を増幅するように構成される一対のオリゴヌクレオチド・ペア、および、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする、請求項２８のキット。
【請求項３０】
請求項２８のキットであって、
第２の一本鎖部位を含む、前記核酸配列の第２分節を増幅するように構成される第２プライマー・ペアと；
第２の蛍光ラベルに結合する第２のオリゴヌクレオチドを有する第２の単一ラベルオリゴヌクレオチド・プローブから事実上成る第２の蛍光検出体であって、
前記第２のプローブは、前記第２の座位にハイブリダイズすると、この第２のプローブの標的核酸に対するハイブリダイゼーションによって第２の蛍光ラベルの蛍光強度が増加または減少するように構成されていることを特徴とする第２の蛍光検出体と；
をさらに含むキット。
【請求項３１】
ヌクレオチドが内部ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載のプローブシステム。
【請求項３２】
ヌクレオチドが末端ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載のプローブシステム。