JP2004331562A - Il−12遺伝子を含む遺伝子治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】IL−12遺伝子を効率的に標的細胞(特に、腫瘍細胞)に導入して、該遺伝子を発現させ、治療効果(特に、抗腫瘍効果)を上げる。
【解決手段】ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドを含む核酸運搬体と、IL−12遺伝子とを含むことを特徴とする遺伝子治療用組成物を調製して、この組成物を標的細胞にデリバリーして、そこでIL−12遺伝子を発現させ、IL−12を産生させ治療効果を上げる。
【選択図】 なし
【解決手段】ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドを含む核酸運搬体と、IL−12遺伝子とを含むことを特徴とする遺伝子治療用組成物を調製して、この組成物を標的細胞にデリバリーして、そこでIL−12遺伝子を発現させ、IL−12を産生させ治療効果を上げる。
【選択図】 なし
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子治療の分野に関する。さらに、詳しくは本発明は、IL−12遺伝子を含む遺伝子治療用組成物、特に癌の遺伝子治療用組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】
薬物治療において、薬物を目的とする細胞または細胞内組織に到達させるシステム(ドラックデリバリーシステム、DDS)が知られているが、遺伝子治療は、その最も有力な手段として注目を浴びて来ている。この遺伝子治療において、細胞内に遺伝子(薬物遺伝子)を導入する方法は、現在2つに大別されている。
【0003】
1つは、ウイルスベクターを用いる方法であり、もう1つは、非ウイルスベクター(特に、合成ポリアミノ酸等の人工的な核酸運搬体)を用いる方法である。前者のベクターとしては、感染効率(従って、薬物遺伝子の導入効率)のよいアデノウイルスが汎用されている。後者の核酸運搬体としては、合成ポリアミノ酸の他に、高分子化合物、リポゾームが知られている。このようなベクター(核酸運搬体)については、公知文献に詳しく、調製法、投与法等が記載されている(例えば、非特許文献1)。
【0004】
非ウイルスベクター系の核酸運搬体に見られる、数々の欠点を改良すべく、開発されたものにポリジアミノ酪酸からなるポリペプチド系の核酸運搬体がある(特許文献1)。しかし、この特定の核酸運搬体を実際の遺伝子治療に適用しようとした試みは、なされていなかった。
【0005】
インターロイキン12(IL−12)は、ナチュラルキラー(NK)細胞の活性作用を有するサイトカインの1つとして発見されたものであるが、その後、腫瘍細胞に対して特異的な細胞障害活性を有するT細胞(キラーT細胞)の増殖作用および活性作用を有することが判明し、さらにはキラーT細胞の活性化を促す作用を有するインターフェロンγ(IFNγ)の産生増強作用を有することが認められるに至り、癌治療に有用な物質として注目されている。
【0006】
しかしながら、IL−12を患者に直接投与した場合、発熱、食欲不振等を含む副作用を生じて、患者が治療に耐えられないという事実があり、IL−12を抗癌剤として使用できなかった(特許文献2)。
【0007】
【特許文献1】
国際公開第00/29031号パンフレット
【特許文献2】
特開平10−139670号公報
【非特許文献1】
村松正實、山本雅編,「新遺伝子工学ハンドブック」,改訂第3版,羊土社,2000年6月30日,p.126−134
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、IL−12の抗腫瘍作用が確認されているにもかかわらず、有効なドラックデリバリーシステムが確立されていなかった。そこで、本発明は、IL−12遺伝子を標的細胞に直接導入し、該遺伝子を効率的に発現させて、その細胞内でIL−12の活性作用を発揮させるための遺伝子治療用組成物を提供することを目的とする。さらに、特定的には、IL−12遺伝子を腫瘍細胞に直接導入し、腫瘍の増大を抑制するか、その消失を図るための、癌治療における遺伝子治療用組成物を提供することを目的とする。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題解決のため鋭意研究に努めた結果、薬物遺伝子であるIL−12遺伝子を運搬(デリバリー)するための核酸運搬体として、ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなる担体を用いて、遺伝子治療用組成物を調製し、これを用いれば、該遺伝子を標的細胞内(特に、腫瘍細胞)に効率良く、安全に導入でき、かつ導入した遺伝子を長期間にわたり発現させることを見いだし、本発明を完成した。
【0010】
すなわち、本発明は、ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドを含む核酸運搬体と、IL−12遺伝子とを含むことを特徴とする遺伝子治療用組成物を提供する。
【0011】
また、本発明は、ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドと、ポリエチレングリコールとのブロックコポリマーを含む核酸核酸運搬体と、IL−12遺伝子とを含むことを特徴とする遺伝子治療用組成物をも提供する。
【0012】
上記遺伝子治療用組成物において、好ましくはポリペプチドが、残基数20以上280以下のジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなる。
【0013】
また、上記遺伝子治療用組成物において、好ましくはポリペプチドが、20以上280以下の残基数を有し、ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩のモノマーの縮重合反応によって合成される。
【0014】
また、本発明は、ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドを含む核酸運搬体と、IL−12遺伝子発現ベクターとの複合体を含むことを特徴とする遺伝子治療用組成物を提供する。
【0015】
さらに、上記遺伝子治療用組成物において、好ましくは遺伝子治療が癌の治療に指向される。
【0016】
くわえて、本発明は、上記遺伝子治療用組成物を用いることを特徴とする、IL−12遺伝子を標的細胞内(特に、腫瘍細胞)に導入する方法をも提供する。
【0017】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態に即して詳細に説明する。
【0018】
本発明の遺伝子治療用組成物は、ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドを含む核酸運搬体と、IL−12遺伝子とを含む。なお、本明細書では、「IL−12遺伝子」という用語を、該遺伝子を含む発現ベクター(プラスミド)と同義で、用いることがある。さらに、「発現ベクター」および「発現プラスミド」なる用語は、交換可能的に用いる。
【0019】
薬物遺伝子であるIL−12遺伝子を標的細胞に運搬する核酸運搬体については、国際公開第00/29031号パンフレットに記載されているものと実質的に同一である。したがって、その本発明に係る核酸運搬体である、ジアミノ酪酸からなるポリペプチド(ポリジアミノ酪酸)は、下記の構造を有する。
【0020】
【化1】
(式中、nは自然数を表す。)
【0021】
また、本発明に係る核酸運搬体は、ジアミノ酪酸の薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドであってもよく、これは下記の構造で表される
【化2】
(式中、nは自然数を表す。)
【0022】
さらに、本発明に係る核酸運搬体は、前記の2つの構造体を任意の割合で含む構造体であってもよい。すなわち、任意の割合で、ジアミノ酪酸およびその薬学的に許容できる塩の形態が共存するものも含まれる。
【0023】
さらに、前記ジアミノ酪酸には、光学異性体であるD体およびL体が存在可能であるが、本発明に係る核酸運搬体は、D体若しくはL体、またはそれらの任意に混ざったポリペプチドをも含むものである。すなわち、ポリ−L−ジアミノ酪酸、ポリ−D−ジアミノ酪酸、およびポリ−DL−ジアミノ酪酸のいずれかを含んでなるポリペプチドであればよい。
【0024】
また、前記式中、nはポリペプチドを形成するモノマーであるジアミノ酪酸(またはその塩)基の数、すなわち残基数である。本発明に係る核酸運搬体の好ましい残基数は、少なくとも10残基以上である。さらに好ましくは、少なくとも20残基以上であり、最も好ましくは25残基以上である。また、本発明にかかる核酸運搬体の好ましい残基数は、280残基以下である。また、より好ましくは250残基以下である。残基数があまり多い場合は、合成が困難となり、また取り扱いが不便となる。またあまり残基数が少ないと核酸運搬体としては性能が不十分になる。このような範囲内で、残基数は、使用する薬物遺伝子により、また同時に使用され得る成分の性質等から、当業者であれば容易に、最適に選択することができる。
【0025】
ジアミノ酪酸塩としては、薬学的に許容できる塩であれば特に限定はないが、好ましくは、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸塩、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、マロン酸、フマル酸、リンゴ酸等の有機酸塩が挙げられ、この中でも特に酢酸塩が好ましい。
【0026】
なお、核酸運搬体のポリペプチドがポリジアミノ酪酸酢酸塩であるとすると、ジアミノ酪酸酢酸塩は分子量160であるため、上記の残基数を分子量で表わすことも可能である。
【0027】
本発明に係る核酸運搬体のさらにもう1つの態様としては、上で説明したジアミノ酪酸からなるポリペプチドに、くわえてポリエチレングリコールを結合させたブロックコポリマー構造を有するものが含まれ、これは下記の構造を有する。
【0028】
【化3】
(式中、nおよびmは自然数を表す。)
【0029】
また、前記ポリペプチドがカルボン酸基を1つ有することから、前記ブロックコポリマー構造を有するものには、以下のコポリマーも可能である。
【化4】
(式中、n、n’およびmは、いずれも自然数を表す。)
ここでエチレングリコールの分子量(または数m)については特に制限はないが、通常は200から25,000程度であることが好ましい。
【0030】
上で説明した構造を有する本発明に係る核酸運搬体の合成方法についても、特に制限はなく、通常公知である種々のポリペプチド合成方法が使用できる。特に好ましい合成方法については、国際公開第00/29031号パンフレットに詳しく記載されている。
【0031】
本発明に係る核酸運搬体と薬物遺伝子は、様々な比で複合体を形成し、本発明の遺伝子治療用組成物として調製できるが、遺伝子/核酸運搬体(重量(w)/重量(w))が、2/1から1/50の範囲であれば特に有効な治療効果を得ることができ、さらに好ましくは、遺伝子/核酸運搬体(w/w)が、1/1から1/30の範囲で混合されることによりさらに有効な効果を得ることができる。遺伝子/核酸運搬体(w/w)の比が、1/50以上で有れば、遺伝子との複合体に関与しない遊離した核酸運搬体の量が増え好ましくなく、2/1以下では、導入されるべき細胞の細胞表面との親和性が低下することによる遺伝子導入効率の低下が起こるため好ましくない。なお、ここで、「遺伝子」という用語を用いたが、これはDNAを意味し、より正確には、薬物遺伝子を導入した発現ベクター(プラスミド)等を意味する。
【0032】
本発明に係る薬物遺伝子であるIL−12遺伝子について、その起源は特に限定されるものではなく、例えば、ヒト、ウシ、ラットまたはマウス由来が挙げられる。
【0033】
また、薬物遺伝子中にはIL−12遺伝子のほか、該遺伝子を転写するためのプロモーターやエンハンサー、ポリAシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識、および/または選別のためのマーカー遺伝子、細胞のゲノムDNA配列内に効率良く遺伝子を挿入するためのウイルス由来の遺伝子配列、薬物として作用するIL−12を細胞外に分泌および/または細胞内の局所に滞留させるためのシグナル配列等、どのような配列要素が含まれていてもよい。
【0034】
さらに、本発明に係るIL−12遺伝子を含む薬物遺伝子は、組換え発現ベクターに組み込まれて、組換え発現ベクター/核酸運搬体の複合体として遺伝子治療用組成物に用いられ、標的組織または細胞に導入される。この目的で用いられる発現ベクターは、標的組織または細胞内でIL−12遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることはない。好適な例としては、pCAGGS(Gene 108, 193−200 (1991))、pBK−CMV、pcDNA3.1、およびpZeoSV(インビトロジェン社、ストラタジーン社)が挙げられる。
【0035】
本発明の遺伝子治療用組成物は、たとえば上記で説明したような治療用にデザインされたIL−12遺伝子発現ベクターと核酸運搬体を混合することで調製できる。より具体的に言えば、核酸運搬体とIL−12遺伝子発現ベクターを各々、水(滅菌水)、生理食塩水、等張化した緩衝液(PBS)等の適当な溶媒に溶解した後、混和し、10分から30分放置することで、後述の注射剤として調製することができる。この際、IL−12遺伝子発現ベクターと核酸運搬体との比は、限定されるわけではないが、前述のようにIL−12遺伝子発現ベクター1μgに対して約0.5〜50μg、好ましくは約1〜30μgの核酸運搬体を使用する。
【0036】
本発明の遺伝子治療用組成物の患者への導入方法としては、まず患者から標的細胞を体外に取り出し、IL−2遺伝子を導入した後に、再びその細胞を患者の体内に戻すという自家移植による遺伝子治療(ex vivo遺伝子治療)がある。しかしながら、本発明では、IL−12遺伝子を直接患者に投与し、標的細胞(特に、腫瘍細胞)において、IL−12を発現させる遺伝子治療(in vivo遺伝子治療)が望ましい。
【0037】
本発明の遺伝子治療用組成物の生体への投与の方法については特に制限はなく、標的細胞、組織、臓器等に応じた適当な投与経路を使用できる。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内に注射投与するか、病巣に直接局所投与できる。
【0038】
本発明の遺伝子治療用組成物の用量は、その使用方法、使用目的等により異なり、当業者は容易に適宜選択、最適化することが可能である。例えば、注射投与して用いる場合には、1日量約0.1μg/kg〜1000mg/kgを投与するのが好ましく、より好ましくは、1日量約1μg/kg〜100mg/kgである。
【0039】
本発明の遺伝子治療用組成物は、患者の組織、例えば、腎臓、脾臓、肺、気管支、心臓、肝臓、脳、神経、筋肉、骨髄、小腸、結腸、大腸、皮膚、血管内皮等に対して優れた治療効果を有する。特に、全身投与、例えば静脈投与した場合には、肝臓に特異的に取り込まれる。従って、特に肝臓に安全に、かつ効果的に薬物遺伝子を発現させることが可能となる。
【0040】
本発明の遺伝子治療用組成物は、通常用いられるスクリーニングパネルを用いて、薬理評価を行うことができるが、特に、対象疾患が癌である場合、次のような動物実験を使用する。腫瘍の形成が確認されたヌードマウスの腫瘍モデルに適切な用量の組成物を適当な投与回数、投与する。同時に、腫瘍径の変化を観察する。対照群として、IL−2遺伝子を含まない組成物を投与した群を用いる。本発明の遺伝子治療用組成物を投与した群と、対照群のそれぞれにおいて、腫瘍の形成を確認し、腫瘍サイズを測定する。投与群において、腫瘍の退縮が見られた場合、動物実験レベルで癌の治療ができたことを示す指標となる。
【0041】
【実施例】
以下の実施例において用いた核酸運搬体の合成は、K.Vogelerらの方法(Helv.Chim.Acta,43,270(1960))に準じて行った。
【0042】
以下、製造例、実施例および試験例においては、ポリ−ジアミノ酪酸(Poly(2,4−diaminobutyric acid)をPDBAと略す。また、PDBAには、可能な全ての光学異性体に基づくものをも含むものとする。さらに、ポリエチレングリコールとのブロックコポリマーを同様にPDBApeg(またはPDBA−PEG)と略す。
【0043】
(製造例1)核酸運搬体の合成
(I)Nγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸NCA(4N−Carbobenzoxy−DL−2,4−diaminobutyric acid N−carboxy−anhydrideの合成。
(I−1)Nγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸(4N−Carbobenzoxy−DL−2,4−Diaminobutyric acid)の合成:
DL−2,4−ジアミノ酪酸2塩酸塩(DL−2,4−Diamino−n−butyric acid Dihydrochloride)15g(シグマ社製)を水75mlに溶解し、これに塩基性炭酸銅11.7gを加えて放置後、煮沸還流した後、濾過した。濾液に炭酸水素ナトリウム16.6g,カルボベンゾキシクロリド(和光純薬社製)17.8mlを加えて攪拌し、生成物を沈殿として得た。得られた生成物を濾過し、アセトン、およびジエチルエーテルで洗浄した後乾燥し、15gのNγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸銅錯体(4N−Carbobenzoxy−DL−2,4−Diaminobutyric acid Copper Complex;以下Dba(Z)−Cuとする)を得た。
【0044】
上記得られた錯体の11gを、35%HCl9.3ml、水22ml、メタノール11mlの混合液に入れ、硫化水素(H2S)ガスの存在下で撹拌した。室温に静置後、過剰の硫化水素を除去した後、濾過により不溶物を除いた。濾液は減圧し水とメタノールを加えて冷却した。さらにメタノールを加えた後、ジエチルアミンを加えて溶液のpHを7に調整した。析出した結晶を濾過して分離し、ジエチルエーテルを用いて、ロート上で洗浄、および乾燥し、白色の結晶として4gの生成物を得た。さらに、前記濾液を濃縮して冷却することにより析出した結晶を濾過して分離し、ジエチルエーテルを用いてロート上洗浄、および乾燥し、白色結晶として1.5gの生成物を得た。これらを合わせて合計5.5g(原料アミノ酸から計算して収率31%)のNγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸を得た。
【0045】
(I−2)Nγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸NCA(4N−Carbobenzoxy−DL−2,4−diaminobutyric acid N−carboxy−anhydrideの合成:
上記で得られたNγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸5gをテトラヒドロフラン(THF)200mlに溶解し、そこにトリホスゲン(Triphosgene,Bis(tricholoromethyl)carbonate、アルドリッチ社製)4.5gを40mlのTHFに溶解したものを加え、さらに40℃で60分攪拌した。減圧で溶媒を除去した後、得られた粗生成物にヘキサンを加えて溶解した後、冷却した。さらに減圧で十分ヘキサンを除いた後、得られた粗生成物に酢酸エチルを加えて溶解し、不溶物を濾過して除いた。得られた濾液にヘキサンを加えて冷却することで生成物が白色結晶として沈殿した。析出した結晶を濾過して分離し、減圧にて乾燥した。また、前記濾液も減圧濃縮した後、同様に処理し生成物を結晶として得た。これら得られた結晶をジエチルエーテルから再結晶することにより、精製された標記生成物が2.7g(収率50%)得られた。
【0046】
(II) 重合反応
種々の残基数の核酸運搬体は、前記で得られたNγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸NCAを、種々の割合の開始剤を用いて縮重合させ、その後アミノ基の保護基を脱保護することにより得られた。
【0047】
ここで、本発明における残基数とは以下の式(Arieh Yaron等、Biochim.Biophys.Acta,69,397−399,1963)で算出したものを意味する(最後に0.9を掛ける理由は、保護基を除去する反応条件で、約10%分子量が低下することによる)。さらに、本発明における分子量は以下の式で表されるものを意味する。
【0048】
残基数=重合度(n)=[Nγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸NCA(10)の量(モル数)/開始剤の量(モル数)]×収率(%)/100×0.9
分子量=n(重合度)×残基量(酢酸塩として、DBA酢酸塩の残基量=160)
以下、表1、表2の合成例3(残基数49)ポリ−DL−ジアミノ酪酸(Poly(DL−2,4−diaminobutyric acid)酢酸塩の合成例を示したが、表1に示す他の条件を用いて同様に合成例1(残基数12)、2(残基数26)、4(残基数62),5(残基数170),6(残基数278),7(残基数348)のPDBAを得た。また、合成例3のポリジアミノ酪酸酢酸塩にポリエチレングリコール(PEG、分子量1000)を末端に結合させたポリジアミノ酪酸−PEGの合成条件も合成例8として、表1および表2に示した。
【0049】
(II−1) ポリ−Nγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸(Poly(4−N−Carbobenzoxy−DL−2,4−diaminobutyoric acid)の合成:
Nγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸NCA1g(3.6mmol)をアセトニトリル19mlに溶解した。開始剤としてブチルアミン4.38mg(0.06mmol)を加え、30℃で307時間静置した。得られたポリマーを濾過し、アセトニトリルで洗浄した。ソックスレー抽出器を用いてジエチルエーテルで抽出した後、減圧で乾燥してポリ−Nγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸0.77g(重合率91%)を得た。
【0050】
(II−2)ポリ−DL−ジアミノ酪酸(Poly(DL−2,4−diaminobutyric acid)酢酸塩の合成:
ポリNγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸0.5gをトリフルオロ酢酸2mlに溶解し、これに25%臭化水素酢酸溶液を加え振り混ぜた。静置した後、ジエチルエーテルを加え、上澄みエーテル相を傾斜で除去し、さらにジイソプロピルエーテルで同じ操作を行い、上澄みエーテル相を傾斜で除去した。得られた沈殿物を減圧で十分乾固した。得られた固体に酢酸ナトリウムと水を加えて得た混合液を、分子量1,000以下除去の透析チューブを用いて流水で透析を行った後、20,000Gで一時間遠心分離を行い、沈殿物を除去した。得られた溶液を凍結乾燥し、ポリ−DL−ジアミノ酪酸酢酸塩を0.34g(収率91%)得た。
【0051】
【表1】
【0052】
【表2】
【0053】
(製造例2) 標準プラスミド/ PDBA 複合体の調製
標的細胞への薬物遺伝子の導入効率を評価する目的で、2種類の標準プラスミドを用意した。1つは、GFP発現(ベクター)プラスミド(eGFP(THDE001、久光製薬株式会社))であり、もう1つは、ルシフェラーゼ発現プラスミド(Luc(THDF006)、久光製薬株式会社)であった。核酸運搬体としてのPDBAは、分子量8000のものを使用した。各プラスミドの溶液と、PDBA溶液とをそれぞれ所望濃度の2倍濃度で調製した。インビボまたはインビトロ試験約30分前にプラスミド溶液を撹拌しながらPDBA溶液を徐々に滴下してプラスミド/PDBA複合体溶液を調製した。溶媒はDMEM培地(シグマ社製)を使用した。具体的には、25μg/mlのプラスミド溶液を調製し、プラスミド濃度が12.5μg/mlであるプラスミド/PDBA複合体溶液を試験に供した。
【0054】
(実施例1) プラスミド/ PDBA 複合体の調製
IL−12遺伝子を含む発現プラスミドとして、マウスIL−12発現プラスミド(pCAGGS−mIL−12)を使用し、製造例2と同様にして、薬物遺伝子プラスミド/PDBA複合体溶液を調製した。なお、この発現プラスミドは、大阪大学大学院医学系研究科、宮崎純一教授から分与された。
【0055】
(試験例1) インビトロでの遺伝子導入
標準プラスミド/PDBA複合体を用いて、各種マウス腫瘍細胞に対する遺伝子導入の効率を評価した。この試験では、5種類のマウス腫瘍細胞株(マウスメラノーマ細胞株B16F10、マウス結腸癌細胞株Colon26、マウス肝癌細胞株Hepal−6、マウス腹水肝癌細胞株MH134およびマウス腹水肝癌細胞株MH129)を使用した。B16F10、Colon26、Hepal−6、MH134およびMH129細胞株は、東北大学加齢医学系研究科から分与された。また、Hepal−6細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC)から購入した。
【0056】
上記の試験腫瘍細胞(2x106)を回収し、PBSで2回洗浄した。遠心により、これらの細胞から細胞ペレットを調製した。様々な濃度の標準プラスミド単独溶液、或いは標準プラスミド/pDBA複合体溶液を調製し、細胞ペレットに200μl/106cellsとなるように、加えて、ペレットを溶解後、約1分間室温で放置した。Optimum medium(ギブコライフ テクノロジー社製)を2 ml/106cellsとなるように加えて、CO2インキュベーター中で3〜4時間(37℃、5%CO2)、インキュベートした。
【0057】
遠心後(1500r.p.m.、5分間)、各細胞を6穴プレート(2 ml/ウエル)または24穴プレート(1 ml/ウエル)に播き、インキュベーター中で48時間インキュベートした。
【0058】
プレートから細胞を回収して、回収した細胞懸濁液を1%パラホルムアルデヒドで固定して、フローサイトメーター(FACScan、ベクトンディキンソン社製)と蛍光顕微鏡により、10000個の細胞中で、eGFP(マーカー)遺伝子の導入された細胞をカウントし、その割合を算出した。例えば、試験細胞として、マウスメラノーマ細胞株B16F10を用いて、GFP発現プラスミドの導入効率を調べたとき、該プラスミド単独の場合(対照)、約0.3%であったが、該プラスミド/PDBA複合体の場合、約11%であった。フローサイトメーターで測定した結果を図1に示す。ここで(a)は、対照であるGFP発現プラスミド(図中、pDNAと表す)のみでの導入結果を示す図であり、(b)は、GFP発現プラスミド/PDBA複合体(図中、pDNA/PDBA複合体と表す)での導入結果を示す図である。また、各試験細胞に対して、得られた導入効率の算出値を表3に示す。
【0059】
【表3】
【0060】
表3の結果から、付着細胞(B16F10、Colon 26、Hepa1−6)に対しては、プラスミド/PDBA複合体による導入効率は、5〜15%であったが、浮遊細胞(MH134およびMH129)に対して、eGFP遺伝子(プラスミド)は導入されなかった。
【0061】
(試験例2) インビボでの遺伝子導入
雌性C57BL/6マウス(7〜8週齢)の腹部皮下に付着細胞であるB16F10細胞を2x105/0.1 mlPBSで移植した。7日後腫瘍径が約5mmになったところで、遺伝子導入を試みた。
【0062】
ルシフェラーゼ(Luc)発現プラスミドが100μg/ml、PDBAが300μg/mlとなるように、それぞれ溶液を調製し、PDBA溶液をプラスミド溶液に、よく攪拌しながら混和した。混和後、このLuc/PDBA複合体溶液を30分以内に、マウス皮下腫瘍周囲に0.25 ml/腫瘍で注入した。24時間後に、同様の操作で再度、Luc/PDBA複合体溶液を注入した。すなわち、Luc/PDBA複合体の投与量は、Luc/PDBA=12.5μg/37.5μgで2回投与したことになる。
【0063】
さらに24時間経過後(第1回目の遺伝子導入から48時間後)、腫瘍組織から蛋白を抽出して、ルシフェラーゼアッセイキット(東洋インキ製)およびルミノメーター(Lumit LB9501;バースオルド社製)を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【0064】
投与量(LucとPDBAの割合)を変化させて、数回同様な遺伝子導入試験を実施した。ルシフェラーゼ活性の測定結果については、図2に示す。細胞への遺伝子導入は、投与量に関わらず、安定的に起こっており、Luc/PDBA=25μg/75μgが至適条件と考えられた。
【0065】
(試験例3) マウスへのIL−12遺伝子導入
試験例2の結果から、pCAGGS−mIL−12/PDBA複合体として、25μg/75μgの投与量を採用して、試験例2で用いたマウスメラノーマ皮下腫瘍モデル(腫瘍接種後7日後)に対しての遺伝子治療試験を行った。治療群(n=6)には、pCAGGS−mIL−12/PDBA複合体(後記図中、PDBA−mpIL12と表す)を前記の投与量で投与し、対照群(n=6)には、それぞれ、PBS、pCAGGS−mIL−12(後記図中、mpIL12と表す)のみ、Luc/PDBA複合体(後記図中、PDBA−Lucと表す)を投与した。各群のマウスについて、腫瘍のサイズの経時変化を観察した。なお、腫瘍サイズは、最大径(A)、最小径(B)をそれぞれ測定し、AxB2/2で腫瘍容積を算出した。
【0066】
このようにして算出した腫瘍容積を腫瘍接種後の経過日数に対してプロットしたものが図3である。図3に示す結果から、治療群においては、対照群と比較して、有意に(p<0.05)に腫瘍の増大が抑制されたことが分かった。
【0067】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の遺伝子治療用組成物は、適当な残基数のジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドと、IL−12遺伝子とを含むことを特徴とし、比較的簡便に標的細胞(特に、腫瘍細胞)に該遺伝子を導入でき、かつ該細胞内で遺伝子発現を可能とするものである。したがって、遺伝子発現により産生されたIL−12が腫瘍細胞に作用し、抗腫瘍効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【図1】GFP発現プラスミド/PDBA複合体を用いる、B16F10メラノーマ細胞への遺伝子導入試験の結果(フローサイトメーターで測定)示す図である。(a)は、対照である、GFP発現プラスミド(PDNA)のみでの導入結果を示し、(b)は、GFP発現プラスミド/PDBA複合体での導入結果を示す。
【図2】B16F10メラノーママウス皮下腫瘍にLuc発現プラスミド/PDBA複合体(pDNA/PDBA)を各種注入して、発現したルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。
【図3】IL−12遺伝子発現プラスミド/PDBA複合体(PDBA−mIL12)を用いる、B16F10メラノーマ皮下腫瘍マウスモデルにおける、抗腫瘍試験の結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子治療の分野に関する。さらに、詳しくは本発明は、IL−12遺伝子を含む遺伝子治療用組成物、特に癌の遺伝子治療用組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】
薬物治療において、薬物を目的とする細胞または細胞内組織に到達させるシステム(ドラックデリバリーシステム、DDS)が知られているが、遺伝子治療は、その最も有力な手段として注目を浴びて来ている。この遺伝子治療において、細胞内に遺伝子(薬物遺伝子)を導入する方法は、現在2つに大別されている。
【0003】
1つは、ウイルスベクターを用いる方法であり、もう1つは、非ウイルスベクター(特に、合成ポリアミノ酸等の人工的な核酸運搬体)を用いる方法である。前者のベクターとしては、感染効率(従って、薬物遺伝子の導入効率)のよいアデノウイルスが汎用されている。後者の核酸運搬体としては、合成ポリアミノ酸の他に、高分子化合物、リポゾームが知られている。このようなベクター(核酸運搬体)については、公知文献に詳しく、調製法、投与法等が記載されている(例えば、非特許文献1)。
【0004】
非ウイルスベクター系の核酸運搬体に見られる、数々の欠点を改良すべく、開発されたものにポリジアミノ酪酸からなるポリペプチド系の核酸運搬体がある(特許文献1)。しかし、この特定の核酸運搬体を実際の遺伝子治療に適用しようとした試みは、なされていなかった。
【0005】
インターロイキン12(IL−12)は、ナチュラルキラー(NK)細胞の活性作用を有するサイトカインの1つとして発見されたものであるが、その後、腫瘍細胞に対して特異的な細胞障害活性を有するT細胞(キラーT細胞)の増殖作用および活性作用を有することが判明し、さらにはキラーT細胞の活性化を促す作用を有するインターフェロンγ(IFNγ)の産生増強作用を有することが認められるに至り、癌治療に有用な物質として注目されている。
【0006】
しかしながら、IL−12を患者に直接投与した場合、発熱、食欲不振等を含む副作用を生じて、患者が治療に耐えられないという事実があり、IL−12を抗癌剤として使用できなかった(特許文献2)。
【0007】
【特許文献1】
国際公開第00/29031号パンフレット
【特許文献2】
特開平10−139670号公報
【非特許文献1】
村松正實、山本雅編,「新遺伝子工学ハンドブック」,改訂第3版,羊土社,2000年6月30日,p.126−134
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、IL−12の抗腫瘍作用が確認されているにもかかわらず、有効なドラックデリバリーシステムが確立されていなかった。そこで、本発明は、IL−12遺伝子を標的細胞に直接導入し、該遺伝子を効率的に発現させて、その細胞内でIL−12の活性作用を発揮させるための遺伝子治療用組成物を提供することを目的とする。さらに、特定的には、IL−12遺伝子を腫瘍細胞に直接導入し、腫瘍の増大を抑制するか、その消失を図るための、癌治療における遺伝子治療用組成物を提供することを目的とする。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題解決のため鋭意研究に努めた結果、薬物遺伝子であるIL−12遺伝子を運搬(デリバリー)するための核酸運搬体として、ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなる担体を用いて、遺伝子治療用組成物を調製し、これを用いれば、該遺伝子を標的細胞内(特に、腫瘍細胞)に効率良く、安全に導入でき、かつ導入した遺伝子を長期間にわたり発現させることを見いだし、本発明を完成した。
【0010】
すなわち、本発明は、ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドを含む核酸運搬体と、IL−12遺伝子とを含むことを特徴とする遺伝子治療用組成物を提供する。
【0011】
また、本発明は、ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドと、ポリエチレングリコールとのブロックコポリマーを含む核酸核酸運搬体と、IL−12遺伝子とを含むことを特徴とする遺伝子治療用組成物をも提供する。
【0012】
上記遺伝子治療用組成物において、好ましくはポリペプチドが、残基数20以上280以下のジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなる。
【0013】
また、上記遺伝子治療用組成物において、好ましくはポリペプチドが、20以上280以下の残基数を有し、ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩のモノマーの縮重合反応によって合成される。
【0014】
また、本発明は、ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドを含む核酸運搬体と、IL−12遺伝子発現ベクターとの複合体を含むことを特徴とする遺伝子治療用組成物を提供する。
【0015】
さらに、上記遺伝子治療用組成物において、好ましくは遺伝子治療が癌の治療に指向される。
【0016】
くわえて、本発明は、上記遺伝子治療用組成物を用いることを特徴とする、IL−12遺伝子を標的細胞内(特に、腫瘍細胞)に導入する方法をも提供する。
【0017】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態に即して詳細に説明する。
【0018】
本発明の遺伝子治療用組成物は、ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドを含む核酸運搬体と、IL−12遺伝子とを含む。なお、本明細書では、「IL−12遺伝子」という用語を、該遺伝子を含む発現ベクター(プラスミド)と同義で、用いることがある。さらに、「発現ベクター」および「発現プラスミド」なる用語は、交換可能的に用いる。
【0019】
薬物遺伝子であるIL−12遺伝子を標的細胞に運搬する核酸運搬体については、国際公開第00/29031号パンフレットに記載されているものと実質的に同一である。したがって、その本発明に係る核酸運搬体である、ジアミノ酪酸からなるポリペプチド(ポリジアミノ酪酸)は、下記の構造を有する。
【0020】
【化1】
(式中、nは自然数を表す。)
【0021】
また、本発明に係る核酸運搬体は、ジアミノ酪酸の薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドであってもよく、これは下記の構造で表される
【化2】
(式中、nは自然数を表す。)
【0022】
さらに、本発明に係る核酸運搬体は、前記の2つの構造体を任意の割合で含む構造体であってもよい。すなわち、任意の割合で、ジアミノ酪酸およびその薬学的に許容できる塩の形態が共存するものも含まれる。
【0023】
さらに、前記ジアミノ酪酸には、光学異性体であるD体およびL体が存在可能であるが、本発明に係る核酸運搬体は、D体若しくはL体、またはそれらの任意に混ざったポリペプチドをも含むものである。すなわち、ポリ−L−ジアミノ酪酸、ポリ−D−ジアミノ酪酸、およびポリ−DL−ジアミノ酪酸のいずれかを含んでなるポリペプチドであればよい。
【0024】
また、前記式中、nはポリペプチドを形成するモノマーであるジアミノ酪酸(またはその塩)基の数、すなわち残基数である。本発明に係る核酸運搬体の好ましい残基数は、少なくとも10残基以上である。さらに好ましくは、少なくとも20残基以上であり、最も好ましくは25残基以上である。また、本発明にかかる核酸運搬体の好ましい残基数は、280残基以下である。また、より好ましくは250残基以下である。残基数があまり多い場合は、合成が困難となり、また取り扱いが不便となる。またあまり残基数が少ないと核酸運搬体としては性能が不十分になる。このような範囲内で、残基数は、使用する薬物遺伝子により、また同時に使用され得る成分の性質等から、当業者であれば容易に、最適に選択することができる。
【0025】
ジアミノ酪酸塩としては、薬学的に許容できる塩であれば特に限定はないが、好ましくは、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸塩、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、マロン酸、フマル酸、リンゴ酸等の有機酸塩が挙げられ、この中でも特に酢酸塩が好ましい。
【0026】
なお、核酸運搬体のポリペプチドがポリジアミノ酪酸酢酸塩であるとすると、ジアミノ酪酸酢酸塩は分子量160であるため、上記の残基数を分子量で表わすことも可能である。
【0027】
本発明に係る核酸運搬体のさらにもう1つの態様としては、上で説明したジアミノ酪酸からなるポリペプチドに、くわえてポリエチレングリコールを結合させたブロックコポリマー構造を有するものが含まれ、これは下記の構造を有する。
【0028】
【化3】
(式中、nおよびmは自然数を表す。)
【0029】
また、前記ポリペプチドがカルボン酸基を1つ有することから、前記ブロックコポリマー構造を有するものには、以下のコポリマーも可能である。
【化4】
(式中、n、n’およびmは、いずれも自然数を表す。)
ここでエチレングリコールの分子量(または数m)については特に制限はないが、通常は200から25,000程度であることが好ましい。
【0030】
上で説明した構造を有する本発明に係る核酸運搬体の合成方法についても、特に制限はなく、通常公知である種々のポリペプチド合成方法が使用できる。特に好ましい合成方法については、国際公開第00/29031号パンフレットに詳しく記載されている。
【0031】
本発明に係る核酸運搬体と薬物遺伝子は、様々な比で複合体を形成し、本発明の遺伝子治療用組成物として調製できるが、遺伝子/核酸運搬体(重量(w)/重量(w))が、2/1から1/50の範囲であれば特に有効な治療効果を得ることができ、さらに好ましくは、遺伝子/核酸運搬体(w/w)が、1/1から1/30の範囲で混合されることによりさらに有効な効果を得ることができる。遺伝子/核酸運搬体(w/w)の比が、1/50以上で有れば、遺伝子との複合体に関与しない遊離した核酸運搬体の量が増え好ましくなく、2/1以下では、導入されるべき細胞の細胞表面との親和性が低下することによる遺伝子導入効率の低下が起こるため好ましくない。なお、ここで、「遺伝子」という用語を用いたが、これはDNAを意味し、より正確には、薬物遺伝子を導入した発現ベクター(プラスミド)等を意味する。
【0032】
本発明に係る薬物遺伝子であるIL−12遺伝子について、その起源は特に限定されるものではなく、例えば、ヒト、ウシ、ラットまたはマウス由来が挙げられる。
【0033】
また、薬物遺伝子中にはIL−12遺伝子のほか、該遺伝子を転写するためのプロモーターやエンハンサー、ポリAシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識、および/または選別のためのマーカー遺伝子、細胞のゲノムDNA配列内に効率良く遺伝子を挿入するためのウイルス由来の遺伝子配列、薬物として作用するIL−12を細胞外に分泌および/または細胞内の局所に滞留させるためのシグナル配列等、どのような配列要素が含まれていてもよい。
【0034】
さらに、本発明に係るIL−12遺伝子を含む薬物遺伝子は、組換え発現ベクターに組み込まれて、組換え発現ベクター/核酸運搬体の複合体として遺伝子治療用組成物に用いられ、標的組織または細胞に導入される。この目的で用いられる発現ベクターは、標的組織または細胞内でIL−12遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることはない。好適な例としては、pCAGGS(Gene 108, 193−200 (1991))、pBK−CMV、pcDNA3.1、およびpZeoSV(インビトロジェン社、ストラタジーン社)が挙げられる。
【0035】
本発明の遺伝子治療用組成物は、たとえば上記で説明したような治療用にデザインされたIL−12遺伝子発現ベクターと核酸運搬体を混合することで調製できる。より具体的に言えば、核酸運搬体とIL−12遺伝子発現ベクターを各々、水(滅菌水)、生理食塩水、等張化した緩衝液(PBS)等の適当な溶媒に溶解した後、混和し、10分から30分放置することで、後述の注射剤として調製することができる。この際、IL−12遺伝子発現ベクターと核酸運搬体との比は、限定されるわけではないが、前述のようにIL−12遺伝子発現ベクター1μgに対して約0.5〜50μg、好ましくは約1〜30μgの核酸運搬体を使用する。
【0036】
本発明の遺伝子治療用組成物の患者への導入方法としては、まず患者から標的細胞を体外に取り出し、IL−2遺伝子を導入した後に、再びその細胞を患者の体内に戻すという自家移植による遺伝子治療(ex vivo遺伝子治療)がある。しかしながら、本発明では、IL−12遺伝子を直接患者に投与し、標的細胞(特に、腫瘍細胞)において、IL−12を発現させる遺伝子治療(in vivo遺伝子治療)が望ましい。
【0037】
本発明の遺伝子治療用組成物の生体への投与の方法については特に制限はなく、標的細胞、組織、臓器等に応じた適当な投与経路を使用できる。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内に注射投与するか、病巣に直接局所投与できる。
【0038】
本発明の遺伝子治療用組成物の用量は、その使用方法、使用目的等により異なり、当業者は容易に適宜選択、最適化することが可能である。例えば、注射投与して用いる場合には、1日量約0.1μg/kg〜1000mg/kgを投与するのが好ましく、より好ましくは、1日量約1μg/kg〜100mg/kgである。
【0039】
本発明の遺伝子治療用組成物は、患者の組織、例えば、腎臓、脾臓、肺、気管支、心臓、肝臓、脳、神経、筋肉、骨髄、小腸、結腸、大腸、皮膚、血管内皮等に対して優れた治療効果を有する。特に、全身投与、例えば静脈投与した場合には、肝臓に特異的に取り込まれる。従って、特に肝臓に安全に、かつ効果的に薬物遺伝子を発現させることが可能となる。
【0040】
本発明の遺伝子治療用組成物は、通常用いられるスクリーニングパネルを用いて、薬理評価を行うことができるが、特に、対象疾患が癌である場合、次のような動物実験を使用する。腫瘍の形成が確認されたヌードマウスの腫瘍モデルに適切な用量の組成物を適当な投与回数、投与する。同時に、腫瘍径の変化を観察する。対照群として、IL−2遺伝子を含まない組成物を投与した群を用いる。本発明の遺伝子治療用組成物を投与した群と、対照群のそれぞれにおいて、腫瘍の形成を確認し、腫瘍サイズを測定する。投与群において、腫瘍の退縮が見られた場合、動物実験レベルで癌の治療ができたことを示す指標となる。
【0041】
【実施例】
以下の実施例において用いた核酸運搬体の合成は、K.Vogelerらの方法(Helv.Chim.Acta,43,270(1960))に準じて行った。
【0042】
以下、製造例、実施例および試験例においては、ポリ−ジアミノ酪酸(Poly(2,4−diaminobutyric acid)をPDBAと略す。また、PDBAには、可能な全ての光学異性体に基づくものをも含むものとする。さらに、ポリエチレングリコールとのブロックコポリマーを同様にPDBApeg(またはPDBA−PEG)と略す。
【0043】
(製造例1)核酸運搬体の合成
(I)Nγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸NCA(4N−Carbobenzoxy−DL−2,4−diaminobutyric acid N−carboxy−anhydrideの合成。
(I−1)Nγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸(4N−Carbobenzoxy−DL−2,4−Diaminobutyric acid)の合成:
DL−2,4−ジアミノ酪酸2塩酸塩(DL−2,4−Diamino−n−butyric acid Dihydrochloride)15g(シグマ社製)を水75mlに溶解し、これに塩基性炭酸銅11.7gを加えて放置後、煮沸還流した後、濾過した。濾液に炭酸水素ナトリウム16.6g,カルボベンゾキシクロリド(和光純薬社製)17.8mlを加えて攪拌し、生成物を沈殿として得た。得られた生成物を濾過し、アセトン、およびジエチルエーテルで洗浄した後乾燥し、15gのNγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸銅錯体(4N−Carbobenzoxy−DL−2,4−Diaminobutyric acid Copper Complex;以下Dba(Z)−Cuとする)を得た。
【0044】
上記得られた錯体の11gを、35%HCl9.3ml、水22ml、メタノール11mlの混合液に入れ、硫化水素(H2S)ガスの存在下で撹拌した。室温に静置後、過剰の硫化水素を除去した後、濾過により不溶物を除いた。濾液は減圧し水とメタノールを加えて冷却した。さらにメタノールを加えた後、ジエチルアミンを加えて溶液のpHを7に調整した。析出した結晶を濾過して分離し、ジエチルエーテルを用いて、ロート上で洗浄、および乾燥し、白色の結晶として4gの生成物を得た。さらに、前記濾液を濃縮して冷却することにより析出した結晶を濾過して分離し、ジエチルエーテルを用いてロート上洗浄、および乾燥し、白色結晶として1.5gの生成物を得た。これらを合わせて合計5.5g(原料アミノ酸から計算して収率31%)のNγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸を得た。
【0045】
(I−2)Nγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸NCA(4N−Carbobenzoxy−DL−2,4−diaminobutyric acid N−carboxy−anhydrideの合成:
上記で得られたNγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸5gをテトラヒドロフラン(THF)200mlに溶解し、そこにトリホスゲン(Triphosgene,Bis(tricholoromethyl)carbonate、アルドリッチ社製)4.5gを40mlのTHFに溶解したものを加え、さらに40℃で60分攪拌した。減圧で溶媒を除去した後、得られた粗生成物にヘキサンを加えて溶解した後、冷却した。さらに減圧で十分ヘキサンを除いた後、得られた粗生成物に酢酸エチルを加えて溶解し、不溶物を濾過して除いた。得られた濾液にヘキサンを加えて冷却することで生成物が白色結晶として沈殿した。析出した結晶を濾過して分離し、減圧にて乾燥した。また、前記濾液も減圧濃縮した後、同様に処理し生成物を結晶として得た。これら得られた結晶をジエチルエーテルから再結晶することにより、精製された標記生成物が2.7g(収率50%)得られた。
【0046】
(II) 重合反応
種々の残基数の核酸運搬体は、前記で得られたNγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸NCAを、種々の割合の開始剤を用いて縮重合させ、その後アミノ基の保護基を脱保護することにより得られた。
【0047】
ここで、本発明における残基数とは以下の式(Arieh Yaron等、Biochim.Biophys.Acta,69,397−399,1963)で算出したものを意味する(最後に0.9を掛ける理由は、保護基を除去する反応条件で、約10%分子量が低下することによる)。さらに、本発明における分子量は以下の式で表されるものを意味する。
【0048】
残基数=重合度(n)=[Nγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸NCA(10)の量(モル数)/開始剤の量(モル数)]×収率(%)/100×0.9
分子量=n(重合度)×残基量(酢酸塩として、DBA酢酸塩の残基量=160)
以下、表1、表2の合成例3(残基数49)ポリ−DL−ジアミノ酪酸(Poly(DL−2,4−diaminobutyric acid)酢酸塩の合成例を示したが、表1に示す他の条件を用いて同様に合成例1(残基数12)、2(残基数26)、4(残基数62),5(残基数170),6(残基数278),7(残基数348)のPDBAを得た。また、合成例3のポリジアミノ酪酸酢酸塩にポリエチレングリコール(PEG、分子量1000)を末端に結合させたポリジアミノ酪酸−PEGの合成条件も合成例8として、表1および表2に示した。
【0049】
(II−1) ポリ−Nγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸(Poly(4−N−Carbobenzoxy−DL−2,4−diaminobutyoric acid)の合成:
Nγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸NCA1g(3.6mmol)をアセトニトリル19mlに溶解した。開始剤としてブチルアミン4.38mg(0.06mmol)を加え、30℃で307時間静置した。得られたポリマーを濾過し、アセトニトリルで洗浄した。ソックスレー抽出器を用いてジエチルエーテルで抽出した後、減圧で乾燥してポリ−Nγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸0.77g(重合率91%)を得た。
【0050】
(II−2)ポリ−DL−ジアミノ酪酸(Poly(DL−2,4−diaminobutyric acid)酢酸塩の合成:
ポリNγ−カルボベンゾキシ−DL−ジアミノ酪酸0.5gをトリフルオロ酢酸2mlに溶解し、これに25%臭化水素酢酸溶液を加え振り混ぜた。静置した後、ジエチルエーテルを加え、上澄みエーテル相を傾斜で除去し、さらにジイソプロピルエーテルで同じ操作を行い、上澄みエーテル相を傾斜で除去した。得られた沈殿物を減圧で十分乾固した。得られた固体に酢酸ナトリウムと水を加えて得た混合液を、分子量1,000以下除去の透析チューブを用いて流水で透析を行った後、20,000Gで一時間遠心分離を行い、沈殿物を除去した。得られた溶液を凍結乾燥し、ポリ−DL−ジアミノ酪酸酢酸塩を0.34g(収率91%)得た。
【0051】
【表1】
【0052】
【表2】
【0053】
(製造例2) 標準プラスミド/ PDBA 複合体の調製
標的細胞への薬物遺伝子の導入効率を評価する目的で、2種類の標準プラスミドを用意した。1つは、GFP発現(ベクター)プラスミド(eGFP(THDE001、久光製薬株式会社))であり、もう1つは、ルシフェラーゼ発現プラスミド(Luc(THDF006)、久光製薬株式会社)であった。核酸運搬体としてのPDBAは、分子量8000のものを使用した。各プラスミドの溶液と、PDBA溶液とをそれぞれ所望濃度の2倍濃度で調製した。インビボまたはインビトロ試験約30分前にプラスミド溶液を撹拌しながらPDBA溶液を徐々に滴下してプラスミド/PDBA複合体溶液を調製した。溶媒はDMEM培地(シグマ社製)を使用した。具体的には、25μg/mlのプラスミド溶液を調製し、プラスミド濃度が12.5μg/mlであるプラスミド/PDBA複合体溶液を試験に供した。
【0054】
(実施例1) プラスミド/ PDBA 複合体の調製
IL−12遺伝子を含む発現プラスミドとして、マウスIL−12発現プラスミド(pCAGGS−mIL−12)を使用し、製造例2と同様にして、薬物遺伝子プラスミド/PDBA複合体溶液を調製した。なお、この発現プラスミドは、大阪大学大学院医学系研究科、宮崎純一教授から分与された。
【0055】
(試験例1) インビトロでの遺伝子導入
標準プラスミド/PDBA複合体を用いて、各種マウス腫瘍細胞に対する遺伝子導入の効率を評価した。この試験では、5種類のマウス腫瘍細胞株(マウスメラノーマ細胞株B16F10、マウス結腸癌細胞株Colon26、マウス肝癌細胞株Hepal−6、マウス腹水肝癌細胞株MH134およびマウス腹水肝癌細胞株MH129)を使用した。B16F10、Colon26、Hepal−6、MH134およびMH129細胞株は、東北大学加齢医学系研究科から分与された。また、Hepal−6細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC)から購入した。
【0056】
上記の試験腫瘍細胞(2x106)を回収し、PBSで2回洗浄した。遠心により、これらの細胞から細胞ペレットを調製した。様々な濃度の標準プラスミド単独溶液、或いは標準プラスミド/pDBA複合体溶液を調製し、細胞ペレットに200μl/106cellsとなるように、加えて、ペレットを溶解後、約1分間室温で放置した。Optimum medium(ギブコライフ テクノロジー社製)を2 ml/106cellsとなるように加えて、CO2インキュベーター中で3〜4時間(37℃、5%CO2)、インキュベートした。
【0057】
遠心後(1500r.p.m.、5分間)、各細胞を6穴プレート(2 ml/ウエル)または24穴プレート(1 ml/ウエル)に播き、インキュベーター中で48時間インキュベートした。
【0058】
プレートから細胞を回収して、回収した細胞懸濁液を1%パラホルムアルデヒドで固定して、フローサイトメーター(FACScan、ベクトンディキンソン社製)と蛍光顕微鏡により、10000個の細胞中で、eGFP(マーカー)遺伝子の導入された細胞をカウントし、その割合を算出した。例えば、試験細胞として、マウスメラノーマ細胞株B16F10を用いて、GFP発現プラスミドの導入効率を調べたとき、該プラスミド単独の場合(対照)、約0.3%であったが、該プラスミド/PDBA複合体の場合、約11%であった。フローサイトメーターで測定した結果を図1に示す。ここで(a)は、対照であるGFP発現プラスミド(図中、pDNAと表す)のみでの導入結果を示す図であり、(b)は、GFP発現プラスミド/PDBA複合体(図中、pDNA/PDBA複合体と表す)での導入結果を示す図である。また、各試験細胞に対して、得られた導入効率の算出値を表3に示す。
【0059】
【表3】
【0060】
表3の結果から、付着細胞(B16F10、Colon 26、Hepa1−6)に対しては、プラスミド/PDBA複合体による導入効率は、5〜15%であったが、浮遊細胞(MH134およびMH129)に対して、eGFP遺伝子(プラスミド)は導入されなかった。
【0061】
(試験例2) インビボでの遺伝子導入
雌性C57BL/6マウス(7〜8週齢)の腹部皮下に付着細胞であるB16F10細胞を2x105/0.1 mlPBSで移植した。7日後腫瘍径が約5mmになったところで、遺伝子導入を試みた。
【0062】
ルシフェラーゼ(Luc)発現プラスミドが100μg/ml、PDBAが300μg/mlとなるように、それぞれ溶液を調製し、PDBA溶液をプラスミド溶液に、よく攪拌しながら混和した。混和後、このLuc/PDBA複合体溶液を30分以内に、マウス皮下腫瘍周囲に0.25 ml/腫瘍で注入した。24時間後に、同様の操作で再度、Luc/PDBA複合体溶液を注入した。すなわち、Luc/PDBA複合体の投与量は、Luc/PDBA=12.5μg/37.5μgで2回投与したことになる。
【0063】
さらに24時間経過後(第1回目の遺伝子導入から48時間後)、腫瘍組織から蛋白を抽出して、ルシフェラーゼアッセイキット(東洋インキ製)およびルミノメーター(Lumit LB9501;バースオルド社製)を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【0064】
投与量(LucとPDBAの割合)を変化させて、数回同様な遺伝子導入試験を実施した。ルシフェラーゼ活性の測定結果については、図2に示す。細胞への遺伝子導入は、投与量に関わらず、安定的に起こっており、Luc/PDBA=25μg/75μgが至適条件と考えられた。
【0065】
(試験例3) マウスへのIL−12遺伝子導入
試験例2の結果から、pCAGGS−mIL−12/PDBA複合体として、25μg/75μgの投与量を採用して、試験例2で用いたマウスメラノーマ皮下腫瘍モデル(腫瘍接種後7日後)に対しての遺伝子治療試験を行った。治療群(n=6)には、pCAGGS−mIL−12/PDBA複合体(後記図中、PDBA−mpIL12と表す)を前記の投与量で投与し、対照群(n=6)には、それぞれ、PBS、pCAGGS−mIL−12(後記図中、mpIL12と表す)のみ、Luc/PDBA複合体(後記図中、PDBA−Lucと表す)を投与した。各群のマウスについて、腫瘍のサイズの経時変化を観察した。なお、腫瘍サイズは、最大径(A)、最小径(B)をそれぞれ測定し、AxB2/2で腫瘍容積を算出した。
【0066】
このようにして算出した腫瘍容積を腫瘍接種後の経過日数に対してプロットしたものが図3である。図3に示す結果から、治療群においては、対照群と比較して、有意に(p<0.05)に腫瘍の増大が抑制されたことが分かった。
【0067】
【発明の効果】
以上説明したように本発明の遺伝子治療用組成物は、適当な残基数のジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドと、IL−12遺伝子とを含むことを特徴とし、比較的簡便に標的細胞(特に、腫瘍細胞)に該遺伝子を導入でき、かつ該細胞内で遺伝子発現を可能とするものである。したがって、遺伝子発現により産生されたIL−12が腫瘍細胞に作用し、抗腫瘍効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【図1】GFP発現プラスミド/PDBA複合体を用いる、B16F10メラノーマ細胞への遺伝子導入試験の結果(フローサイトメーターで測定)示す図である。(a)は、対照である、GFP発現プラスミド(PDNA)のみでの導入結果を示し、(b)は、GFP発現プラスミド/PDBA複合体での導入結果を示す。
【図2】B16F10メラノーママウス皮下腫瘍にLuc発現プラスミド/PDBA複合体(pDNA/PDBA)を各種注入して、発現したルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。
【図3】IL−12遺伝子発現プラスミド/PDBA複合体(PDBA−mIL12)を用いる、B16F10メラノーマ皮下腫瘍マウスモデルにおける、抗腫瘍試験の結果を示す図である。
Claims (5)
- ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドを含む核酸運搬体と、IL−12遺伝子とを含むことを特徴とする遺伝子治療用組成物。
- ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドと、ポリエチレングリコールとのブロックコポリマーを含む核酸運搬体と、IL−12遺伝子とを含むことを特徴とする遺伝子治療用組成物。
- 前記ポリペプチドが、残基数20以上280以下のジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなることを特徴とする請求項1または2に記載の遺伝子治療用組成物。
- 前記ポリペプチドが、20以上280以下の残基数を有し、ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩のモノマーの縮重合反応によって合成されることを特徴とする請求項1または2に記載の遺伝子治療用組成物。
- ジアミノ酪酸および/またはその薬学的に許容できる塩からなるポリペプチドを含む核酸運搬体と、IL−12遺伝子発現ベクターとの複合体を含むことを特徴とする遺伝子治療用組成物。
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