JP2004323336A - 蛋白質結晶観察装置 - Google Patents

Abstract

【課題】蛋白質結晶検出のための観察作業を効率よく高い信頼性で行うことができる蛋白質結晶観察装置を提供することを目的とする。
【解決手段】結晶化プレート６に保持された蛋白質溶液中の蛋白質結晶を観察する蛋白質結晶観察装置において、設定温度に温度調節された恒温室２内に、結晶化プレート６を収容するストレージ部５と、結晶化プレート６がセットされる観察ステージ９ｂを有し結晶化プレート６内の蛋白質溶液を観察して画像データに撮り込む観察部９と、結晶化プレート６をストレージ部５と観察ステージ９ｂとの間で搬送する搬送部７を配置する。これにより、経時的な観察作業において結晶化プレート６を恒温室外に取り出すことなく観察作業を行うことができ、蛋白質結晶検出のための観察作業を効率よく高い信頼性で行うことができる。
【選択図】 図２

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、結晶化容器に保持された蛋白質溶液中の蛋白質結晶を観察する蛋白質結晶観察装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年遺伝子情報を医療などの分野に有効に利用するための取り組みが活発化しており、その基礎技術として遺伝子を構成する蛋白質の構造を解析する努力が行われている。この蛋白質の構造解析は、蛋白質を構成するアミノ酸が３次元の線状に連なった立体構造を特定するものであり、Ｘ線結晶構造解析などの方法によって行われる。
【０００３】
このような蛋白質の構造解析を行うためには、まず解析対象の蛋白質を結晶化することが求められ、この蛋白質結晶化の方法として蒸気拡散法が知られている。この方法では、結晶化対象の蛋白質を含む蛋白質溶液から蒸発する溶媒成分を同一容器内に収容された結晶化溶液によって吸収させることにより、蛋白質溶液を過飽和状態に保って結晶を徐々に生成させる。従来より、この蒸気拡散法を用いて蛋白質の結晶化を行うための専用の容器や装置が提案されている（例えば特許文献１，２参照）。
【０００４】
しかしながら、現状では結晶化を促進させるための結晶生育条件を理論的に特定することができず、各種の条件を変えながら多数の試験を系統的に実行した結果から最良の条件を求めるスクリーニングの手法を用いざるを得ない。このため、従来より対象となる蛋白質溶液を各種の結晶生育条件、すなわち前述の結晶化溶液の種類・濃度や生育温度を変化させた幾通りもの条件下で、試験を反復実行する必要があった。
【０００５】
このような試験は、蛋白質溶液および結晶化溶液を収容した結晶化用のマイクロプレートなどの結晶化容器を特定温度に設定された恒温室内に保管し、結晶化の有無や進行度合いを時間経過に伴って観察することによって行われていた。そして蛋白質結晶検出のための観察作業は従来は専ら人手に依存しており、試験担当者が恒温室から結晶化容器を取り出して顕微鏡視野内で蛋白質溶液を目視観察することによって、結晶化の進行状況をデータ化し記録する作業を行っていた。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００２−２３３７０２号公報
【特許文献２】
特開２００２−１７９５００号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ところがこのような観察作業は、本来多大の手間と時間を要する煩瑣な作業であり、実験担当者に過大の作業負荷を強いるとともに、恒温室から結晶化プレートを観察の都度取り出すことに起因して、次のような課題があった。まず、恒温室から常温雰囲気中に取り出した結晶化プレートは大気中の水分によって結露し易く、この結露によって顕微鏡観察時の明瞭な視野が妨げられ、観察を不正確なものとしていた。この結露による問題は、レーザ光を照射し、その拡散状況で結晶化の判断をするような場合にも生じてしまう。
【０００８】
また結晶化プレートを恒温室から取り出すと、結晶化プレートの温度が変化し当初設定された結晶生育条件が正しく守られない。そしてこのような条件変動が反復して発生すると、結晶化条件を見い出すための試験結果そのものの信頼度を損なうこととなる。このように、従来の蛋白質結晶観察においては、観察作業を効率よく高い信頼性で行うことが困難であるという問題点があった。
【０００９】
そこで本発明は、蛋白質結晶検出のための観察作業を効率よく高い信頼性で行うことができる蛋白質結晶観察装置を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の蛋白質結晶観察装置は、結晶化容器に保持された蛋白質溶液中の蛋白質結晶を観察する蛋白質結晶観察装置であって、恒温室と、この恒温室内の温度を制御する温調手段と、複数の前記結晶化容器を収容するストレージ部と、観察対象の結晶化容器がセットされる観察ステージと、前記観察ステージにセットされた結晶化容器の蛋白質溶液を観察して画像データに撮り込むカメラと、結晶化容器を前記ストレージ部と前記観察ステージとの間で搬送する搬送手段とを備え、前記ストレージ部、観察ステージ、カメラおよび搬送手段を前記恒温室内に配置した。
【００１１】
請求項２記載の蛋白質結晶観察装置は、結晶化容器に保持された蛋白質溶液から蛋白質結晶を検出する蛋白質結晶観察装置であって、恒温室と、この恒温室内の温度を制御する温調手段と、複数の前記結晶化容器を収容するストレージ部と、前記結晶化容器の蛋白質溶液内で生成した蛋白質の結晶を検出する蛋白質結晶検出手段と、結晶化容器を前記ストレージ部と前記蛋白質結晶検出手段との間で搬送する搬送手段とを備え、前記ストレージ部、前記蛋白質結晶検出手段および前記搬送手段を前記恒温室内に配置した。
【００１２】
請求項３記載の蛋白質結晶観察装置は、請求項２記載の蛋白質結晶観察装置であって、前記蛋白質結晶検出手段が、観察対象の結晶化容器がセットされる観察ステージと、前記観察ステージにセットされた結晶化容器の蛋白質溶液を観察してその画像データを撮り込むカメラと、前記画像データを処理して蛋白質溶液内の結晶を検出する画像処理部を備えた。
【００１３】
請求項４記載の蛋白質結晶観察装置は、請求項２記載の蛋白質結晶観察装置であって、前記蛋白質結晶検出手段が、結晶化容器の蛋白質溶液に光線を照射する照射手段と、照射された光線の拡散状況を検出して蛋白質溶液内の結晶の生成状態を判断する結晶化判断部を備えた。
【００１４】
本発明によれば、複数の結晶化容器を収容するストレージ部と、観察対象の結晶化容器がセットされる観察ステージと、観察ステージにセットされた結晶化容器の蛋白質溶液を観察して画像データに撮り込むカメラと、結晶化容器をストレージと前記観察ステージとの間で搬送する搬送手段とを恒温室内に配置することにより、経時的な観察作業において結晶化容器を恒温室外に取り出すことなく観察作業を行うことができ、蛋白質結晶検出のための観察作業を効率よく高い信頼性で行うことができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
次に本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。図１は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の斜視図、図２は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の透視斜視図、図３は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の断面図、図４は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置に使用される結晶化プレートの斜視図、図５，図７は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置に使用される結晶化プレートの部分断面図、図６は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の観察部の部分断面図、図８は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の制御系の構成を示すブロック図、図９は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の蛋白質結晶検出処理機能を示す機能ブロック図、図１０は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置における観察動作のフロー図、図１１は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法を示すフロー図，図１２は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置に使用される結晶化プレートの部分断面図、図１３は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における観察画像を示す図、図１４は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における微分画像を示す図，図１５は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における微分画像（マスク処理）を示す図，図１６は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における細線化画像を示す図，図１７は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における微分画像（ノイズ除去）を示す図、図１８は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における二値化画像を示す図、図１９は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法におけるノイズ認識処理の説明図、図２０は本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の制御系の構成を示すブロック図である。
【００１６】
まず図１、図２，図３を参照して、蛋白質結晶観察装置の全体構造を説明する。蛋白質結晶観察装置１は、蒸気拡散法により蛋白質溶液内で生成した蛋白質結晶を検出するための観察に使用される専用の観察装置である。
【００１７】
図１、図２において、蛋白質結晶観察装置１は、箱形状の恒温室２内にストレージ部５、搬送ユニット７および観察部９を配置した構成となっている。恒温室２は内部雰囲気を設定温度に保持する温調機能を備えており、図１に示すように、恒温室２の前面には、内部アクセス用の扉３ａ、前面からの操作・点検用の小扉３ｂおよび内部点検用の窓２ｂ、表示部と操作・入力部とが一体となった制御パネル４が配設されている。そして、恒温室２の側面には観察対象を内部へ搬入するための搬入口２ａが設けられている。搬入口２ａは、搬入口開閉機構（図示省略）によって開閉自在となっている。
【００１８】
次に図２，図３を参照して、恒温室２の内部構造を説明する。恒温室２の内部には、奥側壁面に沿って縦型棚形状のストレージ部５が配置されている。ストレージ部５は棚状に仕切られた複数の収納部５ａを備えており、収納部５ａには結晶化用のマイクロプレート６（以下、単に「結晶化プレート６」と略記する）が１つだけ収納される。すなわちストレージ部５は、複数の結晶化プレート６を収容する。結晶化プレート６は、蛋白質溶液中の蛋白質を結晶化させるために用いられる結晶化容器である。
【００１９】
ストレージ部５の前面には搬送ユニット７が配置されている。搬送ユニット７は、Ｘテーブル７Ｘ、Ｙテーブル７Ｙ、Ｚテーブル７Ｚ、回転ヘッド７Ｒ、プレート保持ヘッド８を備えている。Ｘテーブル７Ｘは、床面に水平姿勢でＸ方向（ストレージ部５に平行な方向）に配設されており、Ｘテーブル７Ｘに立設されたＺテーブル７Ｚには、Ｙテーブル７Ｙが水平姿勢で装着されている。Ｙテーブル７Ｙには回転ヘッド７Ｒが装着されており、回転ヘッド７Ｒの回転軸にはプレート保持ヘッド８が装着されている。Ｘテーブル７Ｘ、Ｙテーブル７Ｙ、Ｚテーブル７Ｚを駆動することにより、プレート保持ヘッド８はストレージ部５の前面でＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動する。また、回転ヘッド７Ｒを駆動することにより、保持ヘッド８の水平方向の向きを変更することができる。
【００２０】
そしてこのＸＹＺ方向の移動により、プレート保持ヘッド８は搬入口２ａから搬入される結晶化プレート６をアーム８ａによって挟んで保持し、ストレージ部５の指定された収納部５ａに収納する。収納部５ａで所定時間保持された結晶化プレート６は、プレート保持ヘッド８によって保持され、観察部９まで搬送される。搬送ユニット７は、結晶化プレート６をストレージ部５と観察ステージ９ｂとの間で搬送する搬送手段となっている。
【００２１】
観察部９は基台９ａ上に立設されたフレーム９ｃに、観察ステージ９ｂを水平姿勢で装着し、観察ステージ９ｂの上方にカメラ１０を配置した構成となっている。観察ステージ９ｂにはプレート保持ヘッド８によって搬送された結晶化プレート６が載置され、セットされる。観察ステージ９ｂに備えられたＸＹＺ移動機構を駆動することにより、結晶化プレート６はＸ，Ｙ，Ｚ方向に移動する。そしてカメラ１０は、観察ステージ９ｂにセットされた結晶化プレート６の蛋白質画像を観察して画像データに撮り込む。
【００２２】
図４，図５を参照して、結晶化プレート６について説明する。図４に示すように、結晶化プレート６には複数のウェル６ａが格子状に形成されている。ウェル６ａは、円形の凹部の中心に円柱状の液保持部６ｂが設けられたいわゆるカルデラ状の液体収納用の凹部であり、ウェル６ａ内には、結晶化の対象となる試料、すなわち結晶化対象の蛋白質を含んだ蛋白質溶液１３と、結晶化に用いられる結晶化溶液１２とが分注される。
【００２３】
図５はこれらの試料を収容した１つのウェル６ａの断面を示している。ウェル６ａ内では、液保持部６ｂの頂部に設けられたポケット内に液滴状の蛋白質溶液１３が載置状態で保持されており、液保持部６ｂを囲むリング状の貯液部６ｃには、結晶化溶液１２が貯溜されている。ウェル６ａは、結晶化の対象となる蛋白質溶液を載置状態で下方から保持する液保持部６ｂと結晶化溶液１２を貯溜する貯液部６ｃとを有する溶液収容部となっている。後述するように結晶化の開始に際しては、液保持部６ｂに保持された蛋白質溶液１３に所定量の結晶化溶液１２を貯液部６ｃから取り出して分注して混合した後、各ウェル６ａ上面に密封用のシール部材１４が貼着される（図４参照）。
【００２４】
この状態の結晶化プレート６を所定の温度雰囲気下で保管することにより、蛋白質溶液１３中の溶媒成分を蒸発させ、これにより蛋白質溶液１３の蛋白質濃度を過飽和状態にまで高めて蛋白質結晶を生成する。このとき、蛋白質溶液１３から蒸発する溶媒と結晶化溶液１２に吸収される蒸気とが平衡状態を保ちながら蛋白質溶液１３からの溶媒の蒸発が緩やかに進行することにより、安定した結晶生成が行われる。
【００２５】
観察部９はこのような結晶生成過程の結晶化プレート６を観察することにより、各ウェル６ａにおける蛋白質結晶の有無や結晶化の度合いを検出する。すなわち、図６に示すように、観察ステージ９ｂにセットされた結晶化プレート６をカメラ１０の下方に移動させ、観察対象のウェル６ａ内の液保持部６ｂをカメラ１０の撮像光軸に位置合わせする。そして下方の照明装置１１から照明光を照射した状態で、カメラ１０によって結晶化プレート６を撮像することにより、結晶化プレート６に保持された蛋白質溶液の観察画像が撮り込まれる（図１３参照）。
【００２６】
なお、図４，図５は、結晶生成過程において蛋白質溶液１３を載置状態で下方から支持するシッティングドロップ法を用いた蒸気拡散法において用いられる結晶化プレート６の例を示しているが、これ以外にも、図７に示すようなウェル形状の結晶化プレート６０を使用してもよい。この結晶化プレート６０は、蛋白質溶液１３の液滴を垂下状態で保持するハンギングドロップ法において用いられる。
【００２７】
この例では、ウェル６０Ａは結晶化溶液１２を貯溜する貯液部を有するのみで液保持部は形成されておらず、結晶化対象の蛋白質溶液１３の液滴（所定量の結晶化溶液１２が混合されたもの）は、ウェル６０Ａを閉塞するガラス板１４Ａの裏面に垂下状態で保持される。すなわち蛋白質溶液１３が滴下されたガラス板１４Ａを反転して、結晶化溶液１２が分注されたウェル６０Ａを塞ぐように貼着してウェル６０Ａを密封する。
【００２８】
次に、図８を参照して、蛋白質結晶観察装置の制御系の構成を説明する。図８において、蛋白質結晶観察装置１は通信インターフェイス１７を備えており、通信インターフェイス１７はＬＡＮシステム１６を介して蛋白質結晶観察装置１内部の制御処理を行う処理部２０と上位制御部であるホストコンピュータ１５との制御信号の授受を行う。
【００２９】
処理部２０は、データ記憶部２１に記憶された各種データに基づいて、プログラム記憶部２２に記憶された各種処理プログラムを実行することにより、後述する各種動作および処理機能を実現する。ここでは、プログラム記憶部２２には、結晶検出プログラム２２ａ、観察動作プログラム２２ｂが記憶されており、これらのプログラムを実行することにより、後述する蛋白質溶液の観察動作および蛋白質溶液中の蛋白質結晶検出処理が行われる。本実施の形態では、結晶検出プログラム２２ａを実行する処理部２０がカメラ１０で撮り込んだ蛋白質溶液の画像データを処理して蛋白質溶液内の結晶を検出する画像処理部を構成し、カメラ１０および結晶検出プログラム２２ａを実行する処理部２０が蛋白質結晶検出手段を構成している。
【００３０】
データ記憶部２１は、処理画像記憶部２１ａ、観察画像記憶部２１ｂ、結晶化情報記憶部２１ｃを備えており、処理画像記憶部２１ａは、蛋白質結晶検出処理において各種の処理が行われた後の処理画像を記憶する。観察画像記憶部２１ｂは、カメラ１０によって撮り込まれた蛋白質溶液１３の観察画像を記憶する（図１３参照）。
【００３１】
後述する蛋白質結晶検出処理においては、観察画像記憶部２１ｂに記憶された観察画像が処理対象となる。結晶化情報記憶部２１ｃは、結晶化情報、すなわち蛋白質結晶検出処理において結晶化が検出された観察画像の画像データや、観察画像が取得されたプレート・ウェルを特定する情報および当該プレートを観察した観察時刻などの情報を記憶する。
【００３２】
また処理部２０には、表示処理部２３、操作・入力処理部２４、カメラ１０、照明装置５、観察ステージ９ｂ、搬入口開閉機構２５，搬送ユニット７および温調ユニット２６が接続されている。温調ユニット２６は、ホストコンピュータ１５から処理部２０を経由して送られる温度指令に従って恒温室２の温度調整を行う。これにより、恒温室２内部の温度が設定温度に保たれる。
【００３３】
搬送ユニット７は、処理部２０からの制御信号に従って、恒温室２内における結晶化プレート６の搬送、すなわち恒温室２に設けられた搬入口２ａを介して搬入される結晶化プレート６をストレージ部５の所定の収納部５ａに収納する動作や、収納部５ａから結晶化プレート６を取り出して観察部９へセットする動作などの搬送動作を行う。搬入口開閉機構２５は、処理部２０からの制御信号に従って搬入口２ａの開閉を行う。
【００３４】
また処理部２０が観察ステージ９ｂ、照明装置１１、カメラ１０を制御することにより、観察ステージ９ｂに保持された結晶化プレート６の移動、照明装置１１による結晶化プレート６の照明、カメラ１０による蛋白質溶液の画像の撮り込みが実行される。表示処理部２３は、カメラ１０によって撮り込まれた観察画像や各種の処理画像を表示するほか、データ入力時の案内画像などを制御パネル４の表示部に表示させる処理を行う。操作・入力処理部２４は、制御パネル４などの入力装置を操作することにより、処理部２０に対して操作指令やデータ入力を行う。
【００３５】
次に図９の機能ブロック図を参照して、蛋白質結晶検出処理機能について説明する。図９において、微分処理部３０は、観察画像記憶部２１ｂに記憶されている観察画像（図１３参照）、すなわちカメラ１０によって撮り込まれた蛋白質溶液の画像を微分処理することにより、輝度変化の大きさを示す輝度変化情報から成る微分画像を生成する（図１４参照）。ここで輝度変化情報とは、観察画像を構成する各画素における輝度の変化率を数値（輝度変化値）で示すものである。
【００３６】
観察画像中では、背景領域や照明光が透過した部分など観察対象が存在しない領域では輝度変化は小さく、検出対象の蛋白質結晶の輪郭に該当する部分では輝度変化は大きい。したがって上述の微分画像においては、画像に撮り込まれた観察対象物の輪郭が輝度変化の大きい部分として抽出される。
【００３７】
但し、この微分画像においては、検出目標である蛋白質結晶のみにならず、蛋白質溶液内に存在する結晶以外の沈殿物などの固形異物や、ウェル６ａ内の液保持部６ｂの形状や液滴の輪郭なども同様に輝度変化の大きい部分として抽出されるため、これらの検出目標以外の輝度変化の大きい部分をノイズとして除去するノイズ除去処理（後述）が行われる。
【００３８】
微分画像記憶部３１は、微分処理部３０で生成された微分画像を記憶する。二値化処理部３２は、微分画像記憶部３１の微分画像を特徴部抽出用の閾値で二値化することにより、輝度変化情報のうち大きな輝度変化を示す輝度変化情報を特徴部分として残した二値化画像を得る（図１５参照）。そして二値化画像記憶部３３は、二値化処理部３２で得られた二値化画像を記憶する。結晶化判定部３４は、二値化画像記憶部３３に記憶された二値化画像の特徴部分より、蛋白質結晶の有無を判断する。
【００３９】
ここで、二値化処理部３２による二値化処理の対象となる微分画像には、以下に説明するマスク処理、ノイズ除去処理が実行される。そして除去の対象となるノイズを認識することを目的として、ノイズ除去処理に先立ってノイズ抽出用の二値化処理および細線化処理が実行される。
【００４０】
まずマスク処理について説明する。マスク情報記憶部３６は、マスク情報、すなわち観察画像内において蛋白質溶液を保持する結晶化容器である結晶化プレート６の形状（液保持部６ｂの形状）に由来して微分画像に現れる輝度変化情報、すなわち本来観察対象とする蛋白質溶液の観察画像中に含まれるノイズのうち、容器である結晶化プレート６の形状に由来して現れる容器ノイズを微分画像から除去するためのマスク情報（ここでは、液保持部６ｂに設けられたポケットの径寸法）を記憶する。マスク処理部３５は、マスク情報記憶部３６に記憶されたマスク情報に基づき、微分画像から容器ノイズを除去するマスク処理を行う。これにより、容器ノイズが除去された微分画像が得られる（図１５参照）。
【００４１】
次にノイズ除去処理について説明する。ここで行われるノイズ除去処理は、上述のマスク処理では除去できないノイズ、例えば液保持部６ｂ頂部のポケット内に現れる蛋白質溶液の液滴の輪郭など、予め教示することができないノイズを対象としたものである。このため、ここでは微分画像中の情報からどの部分がノイズであるかをノイズ認識処理部３８によって認識し、このノイズ認識結果に基づきノイズ除去処理部３７が微分画像中のノイズ除去を行う。これにより、ノイズが除去された微分画像が得られる（図１７参照）。
【００４２】
ここでは、ノイズ認識の手法として、微分画像を細線化した細線化画像中の線の形状的特徴に基づき、これらの線が蛋白質結晶を示す図形の輪郭などの形状を示す形状線であるか、もしくは液滴の輪郭など明らかに蛋白質結晶を示す図形とは異なる線であるかを識別するようにしている。
【００４３】
すなわちここに示すノイズ認識においては、まず二値化処理部３９により、微分画像記憶部３１に記憶された微分画像をノイズ抽出用の閾値で二値化処理する。そして細線化処理部４０は、二値化処理された二値化画像を細線化処理する。すなわち、二値化画像中の各線要素を１画素幅の細い線に置き換える。これにより、微分画像中の輝度変化が大きい部分を示す範囲が細線化された複数の線から成る細線化画像が生成される（図１６参照）。
【００４４】
したがって、二値化処理部３９および細線化処理部４０は、微分画像をノイズ抽出用の閾値で二値化した後細線化処理することにより複数の線から成る細線化画像を得る細線化画像生成部を構成する。そして細線化画像記憶部４１は、細線化画像生成部で生成された細線化画像を記憶する。
【００４５】
ノイズ認識処理部３８は、細線化画像記憶部４１の細線化画像に含まれる複数の線の形状を個々に認識することにより、ノイズとみなす線を検出する。ノイズ除去処理部３７は、微分画像記憶部３１に記憶された微分画像から、ノイズ認識処理部３８でノイズとみなされて検出された線に該当する輝度変化情報を微分画像記憶部３１の微分画像より除去する。
【００４６】
ここで、ノイズ認識処理部３８がノイズとみなす線を検出するに際しては、後述するように複数のアルゴリズムを用いている。すなわち、線の長さおよび分岐数を求め、長さが所定値を超え且つ分岐数が少ない線をノイズとみなす第１のアルゴリズム、線の長さおよび直線性を認識し、長さが所定値を超え且つ直線性が高い線をノイズとみなす第２のアルゴリズム、さらには線の長さおよび当該線の近似直線に対する分散度合いを求め、長さが所定値を超え且つ分散度合いが小さい線をノイズとみなす第３のアルゴリズムの３つを必要に応じて使い分け、または併用するようにしている。
【００４７】
なお、マスク処理部３５による容器ノイズ除去処理、ノイズ除去処理部３７によるノイズ除去処理においては、上記例では微分画像記憶部３１に記憶された微分画像を処理対象として実行する例を示しているが、二値化画像記憶部３３に記憶された二値化画像を対象としてマスク処理部３５による容器ノイズ除去処理、ノイズ除去処理部３７によるノイズ除去処理を実行するように構成してもよい。
【００４８】
この蛋白質結晶観察装置は上記のように構成されており、次に蛋白質結晶を検出するための観察動作について、図１０をのフローを参照して説明する。この観察動作は、処理部２０が観察動作プログラム２２ｂを実行することにより行われ、観察動作開始に際しては、上流側装置から搬入口２ａを介して搬入された結晶化プレート６は、収納部５ａに収容・保管されている。
【００４９】
まず図１０において、指定された結晶化プレート６を搬送ユニット７によって取り出して観察ステージ９ｃへ移動する（ＳＴ１）。そして先頭のウェル６ａをカメラ１０の直下の観察位置に位置決めする（ＳＴ２）。この後、照明装置１１を点灯して、カメラ１０によって画像取り込みを実行する（ＳＴ３）。そしてこの後、後述する蛋白質結晶検出処理が実行される（ＳＴ４）。
【００５０】
このウェルを対象とした蛋白質結晶検出処理が終了したならば、次のウェルの有無を判断する（ＳＴ５）。ここで次のウェルがある場合には、次のウェルを観察位置に位置決めし（ＳＴ６）、（ＳＴ３）に戻って同様の処理を反復実行する。そして（ＳＴ５）にて次のウェル無しと判断されたならば、処理が完了した結晶化プレート６を収納部５ａに返却する。そしてホストコンピュータ１５に観察動作終了を通知して、観察動作実行処理を終了する。
【００５１】
上述の観察動作において、結晶化プレート６を恒温室２から外部に持ち出すことなく全ての動作を行うことが可能となっており、観察の都度結晶化プレートを持ち出す方式と比較して、結晶化プレートの温度条件が変化することによる結晶育成条件のばらつきを排除してスクリーニング精度を向上させることができるとともに、結晶化プレートを冷却状態から室温に曝す際に生じる結露による観察視野の曇りが発生せず良好な観察結果を得ることが可能であり、蛋白質結晶検出のための観察作業を効率よく高い信頼性で行うことができる。
【００５２】
次に、（ＳＴ３）において撮り込まれた観察画像および（ＳＴ４）にて実行される蛋白質結晶検出処理について説明する。まず観察対象の蛋白質溶液１３の経時変化について、図１２を参照して説明する。前述のように結晶化生成の開始に際しては、ウェル６ａの液保持部６ｂには、所定割合の結晶化溶液１２が加えられた蛋白質溶液１３の液滴が載置される（図５参照）。図１２（ａ）は、結晶化生成の初期における液保持部６ｂの断面を示しており、この段階では蛋白質溶液１３の液滴は液保持部６ｂのポケットをほぼ満たした状態にあり、液滴内部には未だ蛋白質結晶が見られない。
【００５３】
ここで結晶生育条件、すなわち結晶化溶液１２の組成・濃度や保管温度が望ましい条件に適っている場合には、蛋白質溶液１３内では時間の経過とともに結晶化が進行する。図１２（ｂ）は、結晶化がある程度進行した状態における液保持部６ｂの断面を示している。この状態では、蛋白質溶液１３中の溶媒成分が徐々に蒸発することにより、液保持部６ｂのポケット内で液滴が縮小するにつれて液滴の輪郭（矢印Ｂで示す）が、図１２（ａ）の状態よりもポケット内部側に移動している。そして液滴の縮小によって露呈したポケット底面には、液滴内に含まれていた蛋白質が結晶化した蛋白質結晶１３ａが残留している。さらに液滴内部においても結晶化が進行し、蛋白質結晶１３ａが生成されている。
【００５４】
図１３は、図１２（ｂ）に示す状態における観察画像を示しており、液保持部６ｂのポケット内で溶媒の蒸発がある程度進行し体積が縮小した状態の液滴を上方から撮り込んだ画像が含まれている。この観察画像中では、図１３に示すように、低輝度の背景画像（密ハッチング部で示す）中に、液保持部６ｂの頂部を示す環状部分Ａ（疎ハッチング部で示す）が比較的高い輝度で現れている。
【００５５】
そしてこの環状部分Ａの内側のポケット内には、蛋白質溶液１３の液滴が輝度が部分によって異なる画像として現れている。ここで、環状部分Ａの内側で液滴が存在しない部分は下方からの照明光（図１２（ｂ）参照）が透過することによって高輝度部分となっており、蛋白質溶液１３の液滴の輪郭Ｂはこの高輝度部分とのコントラストによって観察画像中で明瞭に現れている。また環状部分Ａの内周に沿って、部分的に線状の高輝度部分Ｃが現れている。
【００５６】
そして検出対象の蛋白質結晶１３ａは、環状部分Ａの内側の領域に存在している。すなわち、蛋白質溶液１３の液滴内部に存在する蛋白質結晶１３ａのうち、カメラ１０による合焦レベルｆ（図１２（ｂ）参照）の近傍に存在する蛋白質結晶１３ａは、図１３の観察画像中で合焦度が高く明瞭に現れ、合焦レベルｆから外れた位置にある蛋白質結晶１３ａは合焦度が低くぼやけた輪郭で現れる。またポケットの表面に残置された形で存在する液滴外の蛋白質結晶１３ａも同様に、合焦度が低くぼやけた輪郭で現れる。さらにこれ以外にも、観察画像中には結晶化に至らなかった沈殿物などの固形異物が存在する。
【００５７】
蛋白質結晶の検出において、観察画像中に現れるこれらの図形を目視観察によって正確に識別することは困難であり、検出対象の蛋白質結晶を高い信頼度で効率よく検出することができないため、本実施の形態に示す蛋白質結晶検出方法では、プログラム記憶部２２に記憶された結晶検出プログラム２２ａを処理部２０が実行することにより、観察画像に対して図１１のフローに示す蛋白質結晶検出処理を行い、蛋白質結晶の識別を自動的に行わせるようにしている。
【００５８】
まず、観察画像に対して微分処理を行う（ＳＴ１１）。すなわち、予め観察画像記憶部２１ｂに記憶された蛋白質溶液の観察画像を微分処理することにより、輝度変化の大きさを示す輝度変化情報からなる微分画像を生成する（微分処理工程）。これにより、図１４に示すように、図１３の観察画像中に現れている蛋白質結晶１３ａの外形を示す形状線や、液滴の輪郭Ｂ、環状部分Ａの内周の高輝度部分Ｃなど、輝度変化が大きい部分が高輝度で現れる。なお、微分画像は本来各画素が輝度変化値に応じた明るさで現れる多値画像であるが、図１４では図示の便宜のため白黒２値画像で表している。
【００５９】
次いで、この微分画像に対して、マスク処理を行う（ＳＴ１２）。ここでは、蛋白質溶液１３を保持している結晶化プレート６の液保持部６ｂに由来する輝度変化情報を微分画像から除去する（容器ノイズ除去工程）。容器ノイズ除去は、結晶化プレート６の液保持部６ｂの形状として予め教示されているマスク情報に基づいて、蛋白質溶液１３が保持されている可能性のない所定領域の輝度変化情報を除去することにより行われる。
【００６０】
ここでは、図１４に示す微分画像中の輝度変化情報のうち、蛋白質溶液１３が保持されている範囲以外に存在する輝度変化が大きい部分、すなわち図１３に示す環状部分Ａの内周部を含んでこれらよりも外側の領域に現れる輝度変化が大きい部分をノイズとして除去する。これにより、図１５に示すように、蛋白質結晶が存在する可能性がある領域のみを含んだ微分画像（マスク処理）が得られる。
【００６１】
このようにしてマスク処理が行われた微分画像をノイズ抽出用の閾値で二値化処理し、さらに細線化処理を行う（ＳＴ１３）。図１６は、この細線化処理によって得られた細線化画像を示しており、微分画像中の高輝度部分、すなわちタンパク質結晶１３ａの形状線や液滴の輪郭などは、いずれも幅が１画素の線に置き換えられている。そしてこのようにして作成された細線化画像に基づいて、ノイズ抽出を行う。すなわち、細線化画像に含まれるノイズを認識する（ＳＴ１４）。
【００６２】
ここで、ノイズ認識方法の例を図１９を参照して説明する。図１９に示す例はいずれも、上述の輪郭Ｂに該当する線など、ある程度の連続した長さを有ししかも蛋白質結晶の特徴的形状に合致しないものをノイズとみなして検出するものである。ここでは、細線化画像中の複数の線をまとまりごとにラベリングし、個々のラベルのうち、線の長さが所定値を超えるラベルについて以下に説明するアルゴリズムでノイズに該当するか否かを認識するようにしている。この場合、細線化処理された画像を対象としてラベリングを行っていることから、ラベル面積そのものが各ラベルにおける線の長さを示している。
【００６３】
図１９（ａ）はこのノイズ認識の第１のアルゴリズムを示している。まず、線の長さが所定値を超えるラベルについて、ラベルを構成する線が分岐する分岐点を求め、求められた分岐点の数に基づいてノイズであるか否かを判定する。例えば図１９（ａ）の（イ）に示すラベルＬ１の例では、線ｎの長さは所定値以上であるものの、分岐点Ｐが多いことからノイズとはみなされない。
【００６４】
これに対し（ロ）に示すラベルＬ２の例では、線ｎの長さは所定値以上であり、しかも分岐点Ｐが１つしかなく、「分岐数が少ない」と判断する判定値を超えていないことからノイズとみなされる。すなわち第１のアルゴリズムの例では、ノイズ認識工程において、線の長さおよび分岐数を求め、長さが所定値を超え且つ分岐数が少ない線をノイズとみなすようにしている。なお、分岐点の数に基づいてノイズであるか否かを判断する別の方法として、線の長さを分岐数で割った値が所定の長さを超えていなければ分岐数が少ない線と判断するようにしてもよい。
【００６５】
図１９（ｂ）は第２のアルゴリズムを示している。ここでは、線の長さが所定値を超えるラベルについて、ラベルを構成する線の直線性を判定することによってノイズであるか否かを判定する。例えば図１９（ｂ）に示すラベルＬ３において、ラベルを構成する線ｎの探索を行い、探索起点ＰＳから探索を開始した線ｎが、探索終点ＰＥにおいて予め規定された探索許容幅Ｖの範囲内に収まっている場合に直線性が高いと判断し、この線ｎをノイズと判定する。すなわち第２のアルゴリズムの例では、ノイズ認識工程において、線の長さおよび直線性を認識し、長さが所定値を超え且つ直線性が高い線をノイズとみなすようにしている。
【００６６】
さらに図１９（ｃ）は第３のアルゴリズムを示している。ここでは、ラベルを構成する複数の線の近似直線に対する分散度合いを求めることによってノイズであるか否かを判定する。例えば図１９（ｃ）の（イ）に示すラベルＬ４において、ラベルを構成する複数の線ｎ全体を近似する近似直線ＡＮを求める。そしてこの近所直線ＡＮを挟む所定枠Ｍ内において、線ｎの近似直線ＡＮに対する分散度合いを求める。この場合には、複数の線ｎが錯綜して状態にあることから分散度合いは大きく、ノイズとはみなされない。
【００６７】
これに対し、（ロ）に示すラベルＬ５の例では、線ｎは近似直線ＡＮにほぼ沿っており近似直線ＡＮに対する分散度合いが小さいことからノイズとみなされる。すなわち第３のアルゴリズムの例では、ノイズ認識工程において、線の長さおよび当該線の近似直線に対する分散度合いを求め、長さが所定値を超え且つ分散度合いが小さい線をノイズとみなすようにしている。
【００６８】
そしてこのようにしてノイズが認識されたならば、ノイズとみなされて検出された線を二値化処理された微分画像から除去するノイズ除去処理を行う（ＳＴ１５）。すなわち、（ＳＴ１３）、（ＳＴ１４）、（ＳＴ１５）においては、微分画像をノイズ抽出用の閾値で二値化した後細線化処理することにより、複数の線からなる細線化画像を得る（細線化画像生成工程）。
【００６９】
そして生成された細線化画像に含まれる複数の線の形状を個々に認識することにより、ノイズとみなす線を検出し（ノイズ認識工程）、ノイズ認識工程で検出したノイズとした線に該当する輝度変化情報を微分画像より除去する（ノイズ除去工程）。図１７は、このようにしてノイズが除去された微分画像（ノイズ除去）を示している。
【００７０】
この後、蛋白質結晶に該当する可能性が高い特徴部分の抽出を行う。まず、微分画像（ノイズ除去）を特徴部分抽出用の閾値で二値化処理する（ＳＴ１６）。すなわち、微分画像を特徴部抽出用の閾値で二値化することにより、大きな輝度変化を示す輝度変化情報を特徴部分として残した二値化画像を得る（二値化処理工程）。ここで用いられる閾値は、前述のノイズ抽出用の閾値よりも高い値に設定される。
【００７１】
また、二値化処理工程においては、特徴部分についてラベリングを行い、面積が所定値よりも大きいラベルのみを残してその他を消去する処理を行う。これにより、蛋白質結晶である可能性が少ない小さな特徴部分がノイズとみなされて除去される。図１８は、このようにして得られた二値化画像を示しており、この画像中には、蛋白質結晶である可能性が高い特徴部分のみが現れている。そして得られた二値化画像記憶部３３に記憶される。
【００７２】
なお、前述の容器ノイズ除去工程、ノイズ除去工程を、二値化画像記憶部３３に記憶された二値化画像を対象として行うようにしてもよい。この場合には、二値化画像中に残された特徴部分のうち、ノイズとみなされた検出された線に該当するものを二値化画像から除去する。
【００７３】
この後、得られた二値化画像を対象として結晶化判定を行う（ＳＴ１７）。例えば、二値化画像中の特徴部分が少ない場合には、結晶化が進行している可能性無しと判断し、特徴部分が多い場合には、結晶化が進行している可能性ありと判断する。特徴部分の多い少ないは、特徴部分に相当する面積の合計を所定値と比較することによって決定される。すなわちここでは、二値化画像の特徴部分より蛋白質結晶の有無を判断する（結晶化判定工程）。
【００７４】
そしてここで結晶化の可能性がなしと判定されたならば、処理を終了する。また（ＳＴ１８）にて結晶化の可能性ありと判定されたならば、当該処理において対象とした観察画像が得られた結晶化プレート６を示す結晶化プレート情報、ウェル情報、観察画像、観察時刻などの結晶化情報を結晶化情報記憶部２１ｃに記憶し（ＳＴ１９）、当該観察画像を対象とした蛋白質検出処理を終了する。
【００７５】
上記説明したように、本実施の形態に示す蛋白質結晶検出においては、蛋白質溶液の画像を微分処理することにより、検出対象の蛋白質結晶の輪郭に相当する部分を輝度変化が大きい部分としてとしてまず抽出する。そしてこの輝度変化が大きい部分を特徴部抽出用の閾値で切り分けることにより、大きな輝度変化を示す部分を特徴部分として残した二値化画像を求める。そして蛋白質結晶の有無の判断を、この二値化画像の特徴部分より行うようにしている。これにより、個人的な熟練度の相違による結晶検出作業の効率や検出結果の信頼性のばらつきを排除することができ、蛋白質結晶の検出を効率よく高い信頼性で行うことができる。
【００７６】
なお上記実施の形態では、二値化画像の特徴部分にノイズを含まないようにマスク処理部３５やノイズ除去処理部３７で処理を行っているが、容器の形状や照明の条件等によりノイズを殆ど含まない観察画像が得られる場合には、マスク処理部３５やノイズ除去処理部３７での処理を省略することができる。
【００７７】
なお、上記実施の形態では、カメラ１０および結晶検出プログラム２２ａを実行する処理部２０で蛋白質結晶検出手段を構成する例を示したが、蛋白質結晶検出手段としては、特開平６−１１６０９８号公報に開示されているように、結晶化溶液の蛋白質溶液にレーザ光等の光線を照射する照射手段と、照射された光線の拡散状況を検出して蛋白質溶液内の結晶の生成状態を判断する結晶化判断部を備えたものでもよい。
【００７８】
また上記実施の形態では、結晶検出処理機能および結晶化情報記憶機能を蛋白質結晶観察装置１に含ませた例（図８参照）を示したが、図２０に示すような構成を採用してもよい。この例では、結晶検出処理機能および結晶化情報記憶機能は、蛋白質結晶観察装置１Ａではなく、ホストコンピュータ１５Ａが備えている。
【００７９】
すなわち、図８に示す観察画像記憶部２１ｂ、結晶検出プログラム２２ａ、処理画像記憶部２１ａ、結晶化情報記憶部２１ｃの各機能はホストコンピュータ１５Ａの機能の一部となっており、結晶検出プログラム２２ａを実行するホストコンピュータ１５Ａがカメラ１０で撮り込んだ蛋白質溶液の画像データを処理して蛋白質溶液内の結晶を検出する画像処理部を構成する。
【００８０】
そして蛋白質結晶観察装置１Ａのデータ記憶部２１Ａからは処理画像記憶部２１ａ、結晶化情報記憶部２１ｃの機能が除外されており、プログラム記憶部２２Ａから結晶検出プログラム２２ａが除外されている。このような構成を採用することにより、恒温室２を備えた蛋白質結晶観察装置１Ａから離れた遠隔場所で結晶検出処理のみを分離して実行し、必要な結晶化情報を取得して蓄積することが可能となる。
【００８１】
【発明の効果】
本発明によれば、複数の結晶化容器を収容するストレージ部と、観察対象の結晶化容器がセットされる観察ステージと、観察ステージにセットされた結晶化容器の蛋白質溶液を観察して画像データに取り込むカメラと、結晶化容器をストレージ部と観察ステージとの間で搬送する搬送手段とを恒温室内に配置したので、経時的な観察作業において結晶化容器を恒温室外に取り出すことなく観察作業を行うことができ、蛋白質結晶検出のための観察作業を効率よく高い信頼性で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の斜視図
【図２】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の透視斜視図
【図３】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の断面図
【図４】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置に使用される結晶化プレートの斜視図
【図５】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置に使用される結晶化プレートの部分断面図
【図６】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の観察部の部分断面図
【図７】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置に使用される結晶化プレートの部分断面図
【図８】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の制御系の構成を示すブロック図
【図９】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の処理機能を示す機能ブロック図
【図１０】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置における観察動作のフロー図
【図１１】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法を示すフロー図
【図１２】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置に使用される結晶化プレートの部分断面図
【図１３】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における観察画像を示す図
【図１４】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における微分画像を示す図
【図１５】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における微分画像（マスク処理）を示す図
【図１６】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における細線化画像を示す図
【図１７】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における微分画像（ノイズ除去）を示す図
【図１８】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法における二値化画像を示す図
【図１９】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶検出方法におけるノイズ認識処理の説明図
【図２０】本発明の一実施の形態の蛋白質結晶観察装置の制御系の構成を示すブロック図
【符号の説明】
２ 恒温室
５ ストレージ部
６ 結晶化プレート
６ａ ウェル
６ｂ 液保持部
６ｃ 貯液部
７ 搬送ユニット
８ プレート保持ヘッド
９ 観察部
９ｂ 観察ステージ
１０ カメラ
１２ 結晶化溶液
１３ 蛋白質溶液
１３ａ 蛋白質結晶
２０ 処理部
２１ａ 処理画像記憶部
２１ｂ 観察画像記憶部
２１ｃ 結晶化情報記憶部
２２ａ 結晶検出プログラム
２２ｂ 観察動作プログラム
３０ 微分処理部
３１ 微分画像記憶部
３２ 二値化処理部（特徴部分抽出）
３３ 二値化画像記憶部
３４ 結晶化判定部
３５ マスク処理部
３７ ノイズ除去処理部
３８ ノイズ認識処理部
３９ 二値化処理部（ノイズ抽出）
４０ 細線化処理部

Claims (4)

1. 結晶化容器に保持された蛋白質溶液中の蛋白質結晶を観察する蛋白質結晶観察装置であって、恒温室と、この恒温室内の温度を制御する温調手段と、複数の前記結晶化容器を収容するストレージ部と、観察対象の結晶化容器がセットされる観察ステージと、前記観察ステージにセットされた結晶化容器の蛋白質溶液を観察してその画像データを撮り込むカメラと、結晶化容器を前記ストレージ部と前記観察ステージとの間で搬送する搬送手段とを備え、前記ストレージ部、観察ステージ、カメラおよび搬送手段を前記恒温室内に配置したことを特徴とする蛋白質結晶観察装置。
2. 結晶化容器に保持された蛋白質溶液から蛋白質結晶を検出する蛋白質結晶観察装置であって、恒温室と、この恒温室内の温度を制御する温調手段と、複数の前記結晶化容器を収容するストレージ部と、前記結晶化容器の蛋白質溶液内で生成した蛋白質の結晶を検出する蛋白質結晶検出手段と、結晶化容器を前記ストレージ部と前記蛋白質結晶検出手段との間で搬送する搬送手段とを備え、前記ストレージ部、前記蛋白質結晶検出手段および前記搬送手段を前記恒温室内に配置したことを特徴とする蛋白質結晶観察装置。
3. 前記蛋白質結晶検出手段が、観察対象の結晶化容器がセットされる観察ステージと、前記観察ステージにセットされた結晶化容器の蛋白質溶液を観察してその画像データを撮り込むカメラと、前記画像データを処理して蛋白質溶液内の結晶を検出する画像処理部を備えたことを特徴とする請求項２記載の蛋白質結晶観察装置。
4. 前記蛋白質結晶検出手段が、結晶化容器の蛋白質溶液に光線を照射する照射手段と、照射された光線の拡散状況を検出して蛋白質溶液内の結晶の生成状態を判断する結晶化判断部を備えたことを特徴とする請求項２記載の蛋白質結晶観察装置。

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