CN116783277A - 从细胞培养装置进行图像分析和非侵入性数据收集 - Google Patents

从细胞培养装置进行图像分析和非侵入性数据收集 Download PDF

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Abstract

一种培养箱系统，被配置成照射至少一个或更多个细胞培养室装置并使它们围绕各自的预定轴线旋转，每个细胞培养室装置包括被配置成容纳细胞培养基的外壳、以及至少一个被配置成允许检查细胞培养基的至少一部分的观察区域，所述培养箱系统还包括至少一个照射装置和至少一个监测装置，所述至少一个监测装置被配置成提供被所述至少一个照射装置中的至少一个用电磁辐射信号照射的被照射的细胞培养基或被照射的细胞培养室的至少一部分的一个或更多个监测信号，所述电磁辐射信号优选是宽或窄波长谱的非相干或相干紫外、可见、红外和/或近红外光，并且其中所述培养箱系统还包括一个或更多个处理单元或与这些处理单元连接，所述处理单元被配置成从所述一个或更多个监测信号中提取和/或导出数据，所述数据代表细胞培养室装置本身和/或其中发生的细胞活动的一个或更多个方面。

Description

从细胞培养装置进行图像分析和非侵入性数据收集
技术领域
本发明总体上涉及从细胞培养室装置(在本文中又称为生物反应器)的图像中提取和/或导出数据，以实时或接近实时地解释至少一些数据并且没有由操作者引入的偏差，并使用其中一些数据来调整对细胞环境进行调节的培养箱系统的操作等，其中每个细胞培养室装置包括外壳(在本文中又称为细胞室)，该外壳被配置成包含细胞培养基(通常也包含细胞)。
背景技术
在使用通常具有基本上平坦的细胞支撑表面等的较传统的细胞培养室装置来培养细胞和组织时，原代细胞和活体组织往往会去分化并失去其正常的结构组织和体内功能。这方面的一个例子是细胞从组织块迁移到平坦的支撑表面上(即，所谓的“融化冰淇淋效应”)。去分化的细胞所表达的生化特性通常与完好生物体组织中的相应成熟细胞所正常表达的生化特性不同。此外，与完好生物体中的相应细胞相比，某些细胞通常已经丧失了它们的专门功能。当在平坦的表面上培养癌细胞时，癌细胞甚至比在生物体中生长得更快。这样，癌细胞被阻止表达更接近正常的表型，因此不是体内癌症的良好模型。
对此进行改进的是，用于培养细胞(无论是单个细胞类型还是多个细胞类型)或组织的某些细胞培养室装置或生物反应器通常或甚至优选采用在全向正常重力(又称为模拟微重力)条件(即，由回转器诱发的条件)下的操作，因为这样能够在培养物中保持许多类型的细胞的分化状态。此外，这种方法能够促进许多不同细胞系中的体内样结构和功能的恢复(或再分化)。这是重要的，因为目前进行的大部分细胞培养工作都采用细胞系。原代细胞或干细胞(无论是天然的还是以任何方式诱导的)的快速培养领域也是如此：它们都保留或获得某种程度的体内样结构和功能。
这种模拟微重力可以通过连续旋转包含细胞培养物的隔室(一维、二维或三维)来诱发，从而防止细胞粘附在隔室壁上。严格地说，旋转无限地增大重力(向心加速度)，但是，由于重力是从四面八方施加的，因此净重力效应接近于零。适当的旋转促进细胞在流体环境中的相互粘附，同时作用于培养物的剪切力最小。对于特定的细胞/组织类型，可以根据需要通过改变细胞培养室装置的旋转速度来引入剪切力(参见Kraus等人，2020,doi:10.1016/j.mvr.2020.104107)。由此，细胞聚集成三维群落，通常称为集落、聚集体、球团、器官样体、原组织或伪组织(在本公开中统称为球团)。由于切除的组织块会受到类似的影响，因此它们也包括在通用术语“球团”中。
至少对于某些培养箱来说，在培养箱中使用多个细胞培养室装置或生物反应器(例如包含不同类型和/或大小/状态的细胞)，这些细胞培养室装置或生物反应器通常都位于同一个可封闭的开放空间或腔体中。即使设有内部照射，在培养箱中使用也会降低每个细胞培养室装置的内容物的可见性，往往需要用户随着时间的推移重复地打开和关闭培养箱，并且可选地取出细胞培养室装置，以进行更仔细的人工检查和处理。重复地打开和关闭培养箱至少会提高污染的风险，并且至少会暂时破坏培养箱的受控内部环境。更具体地说，将细胞培养室装置从培养箱移至无菌工作台或成像显微镜等处可能会使细胞暴露于非常低的二氧化碳水平(大气中的二氧化碳是大约0.04％)，很高的氧气水平(大约21％)、环境温度(在实验室中可能在22℃左右)、过多光线和正常重力(1G)。
从培养箱中取出细胞培养室装置以进行检查通常会导致细胞培养室周围和内部的二氧化碳分压和温度降低。二氧化碳分压的降低会导致生长培养基的pH变得更碱性，而这会影响细胞代谢。温度的突然变化(仅变化几度，且仅持续几分钟)已被证明会诱导遗传信息表达的变化，并导致所谓的“热休克”(热应激)或“冷休克”反应的合成。由温度变化诱导的多种“分子伴侣”蛋白质参与帮助蛋白质以正确的构象折叠或错误折叠蛋白质的蛋白酶体降解。但是这种反应的影响远远不仅限于这几种蛋白质(例如参见Richter等人，2010doi:10.1016/j.molcel.2010.10.006)。例如，在某些已知类型的培养箱中，已经证明，在打开培养室的门仅大约30秒后，就需要大约6分钟来重新建立适当的温度和二氧化碳水平。
从培养箱中取出细胞培养室装置以进行检查通常还会导致细胞集落或球团沉入底部。在这种情况下，他们通常会经历气体交换减少(氧分压的局部降低和二氧化碳分压的升高)，营养水平下降和代谢废物的积累，这可能导致细胞因坏死而死亡。
因此，从培养箱中取出细胞培养室装置以进行检查通常会导致氧分压降低。氧及其自由基(包括超氧阴离子自由基(O2 ·-)、单线态氧(1O2)、羟基(·OH)和过羟基自由基(HO2·)，统称为“活性氧物质”(ROS))是高反应性的，并且能够破坏大多数生物分子。这种氧化损害被认为与许多过程有关，包括致癌作用、肿瘤发生和衰老。在所述装置被放回培养箱系统时，随着氧气的返回，细胞培养室装置中的细胞会经历破坏性ROS的激增。
从培养箱中取出细胞培养室装置以进行检查还会导致细胞或球团所经受的重力和剪切力的变化，这两者还会影响遗传信息的表达(参见Penthó等人，2019doi：10.1016/j.ceca.2019.03.007和Marin等人，2013doi:10.1016/j.freeradbiomed.2013.05.034)。
在打开或进入培养箱时(例如为了进行检查)，细胞培养室装置和它们的外壳暴露在光线下，这对某些类型的细胞和球团可能是有害的。
最后，从培养箱中取出细胞培养室装置以进行检查和处理还会使其暴露于更高的微生物(例如病毒、细菌、真菌)感染或甚至污染(例如支原体或其它细胞类型)的风险。
随着球团的生长，它们变得更大，因此至少对于某些用途来说需要调节细胞培养室装置的旋转速率以保持最佳条件，在该条件下，球团相对于细胞培养室装置保持在基本上“静止的轨道”中，因为这促进气体和营养物的交换，提高球团的均匀性，并且将剪切力降低到最小。这对于某些细胞类型来说是优选条件，因为球团的剪切应力被最大限度地减小，碰撞的次数以及球团之间或球团与细胞培养室壁之间的“冲击力”也被降低。但是，在任何情况下，能够在若干场合清楚地检查细胞培养室装置中的球团是非常有益的，例如查看是否应该进行速度调整、以及可能调整到什么程度。该任务通常是通过打开培养箱的外门来执行的，根据培养箱的构造，这可能会影响内部环境。但是，这种速度调整必须在培养的早期每天进行多次，然后在培养的数周或数月中重复进行，并且修正的程度是主观的，取决于用户和用户检查培养物的频率。因此，需要改善球团的可视化，以将球团保持在不断优化的生长条件下：这会提高球团的均匀性，消除主观偏差的可能性。球团的均匀性的提高导致更标准的代谢性能，例如，这使得在进行昂贵的临床试验或类似试验之前能够对细胞培养物的候选药物预后进行更可靠的体外预测性毒理学评价，即，这导致进行动物或临床试验之前的更可靠的“过滤”。
除此之外，可以从球团或它们的生长培养基或甚至细胞培养室本身获得大量附加数据和信息，所有这些数据和信息都能够促进或加速用户的工作，而不会干扰培养，因此不会使培养暴露于温度变化、气体分压、重力的影响、尤其是感染的风险。
对于其它用途，不需要或者可能也不应该将所述球团保持在静止轨道上，而是应允许其不同的行为，例如允许相对于细胞培养室壁翻滚，位于细胞培养室的底部或底部附近，或在向心加速度的作用下保持在细胞培养室壁上，等等。在这些情况下，最大限度地减小剪切力是不需要的，并且可能不利于细胞模拟体内性能。
因此，提供一种便于检查内部培养物的培养箱是有益的，并且这还能减少打开和关闭培养箱的需要。在球团改变它们的尺寸时，应用旋转速度修正也是有益的。通过追踪各个球团，能够计算出它们在培养基中的下降速率。该信息可用于优化细胞培养室的旋转速度。
因此，提供一种便于以非侵入性方式(例如即时地)从细胞培养物中收集附加数据和/或信息的培养箱是有益的。如果该数据/信息能够用于修改或设置或控制培养箱本身的操作，或者向用户提供以其它方式要花很长时间收集、难以收集或实际上不可能收集的数据，那么这是进一步的益处。
因此，对于上述所有情况，培养箱的自动化和反馈调节会通过进一步减少主观用户干预而导致操作的进一步标准化和提高所获得的数据的质量。从经济角度来看，还能够降低操作培养箱的成本。
因此，提供一种至少在一定程度上解决一个或更多个上述缺点的培养箱是有利的。尤其是，提供一种能够以减少打开和关闭的要求的方式处理或解释收集的数据的培养箱系统是更有利的。更有利的是提供一种能够进行数据处理的培养箱，该培养箱允许操作者以快速和及时的方式做出决定，并且能够提供表明实验没有以预期的方式进行或实验已经结束(例如如果在治疗之后球团中的细胞死亡)的提前指示，从而释放设备以用于另一个实验。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种至少在一定程度上克服了一个或更多个上述缺点的培养箱系统。本发明的另一个目的是提供一种支持更好地观察任何包含的细胞培养室装置和/或它们各自的外壳的内容物(即，其中包含的细胞培养基)的培养箱系统。另一个目的是提供一种被配置成使得能够以电子方式处理所获得的数据(例如获得的图像)以从中提取和/或导出(进一步的)数据的培养箱系统。第四个目的(至少在一些实施例中)是提供一种培养箱系统，在超过与细胞生长相关的预定阈值时，该系统能够向用户或另一个装置或系统发出警报。最后，一个目的(至少在一些目的中)是提供一种能够使用一些从图像中提取或导出的数据来修改其自身的功能的培养箱系统。
根据第一方面，这些目的中的一个或更多个至少在一定程度上是通过被配置成接收预定数量(至少一个或更多个)的细胞培养室装置的培养箱系统来实现的。所述细胞培养室装置的预定数量例如可以是1、2、3、4、5、6或更多。所述培养箱系统还被配置成接收预定数量(至少一个或更多个)的细胞培养室装置，使这些细胞培养室装置围绕各自的预定轴线旋转(例如或优选单独地旋转)，并照射这些细胞培养室装置，每个细胞培养室装置包括外壳，该外壳被被配置成包含细胞培养基，其中所述细胞培养室装置包括至少一个被配置成允许观察外壳的至少一部分内容物的观察端或部分，其中所述培养箱系统还包括至少一个照射装置和至少一个监测装置，所述至少一个监测装置被配置成检测、监测或记录至少一个被照射的接收的细胞培养室装置，其中所述至少一个监测装置可以是成像或视觉系统或装置，并且所述监测信号包括电磁辐射，优选是宽波长光谱或窄波长光谱的非相干或相干紫外、可见、红外和/或近红外光，并且其中所述培养箱系统被配置成捕获所述细胞培养室装置的一个或更多个图像和/或其它类型的监测信号，并且其中所述培养箱系统还包括一个或更多个被配置成从至少一个、一些或所有图像和/或其它类型的监测信号中提取和/或导出数据的处理单元。在至少一些实施例中或在至少一些优选实施例中，所述细胞培养室装置围绕其旋转(或能够围绕其旋转)的每个相应的预定轴线是水平或基本上水平的轴线。
在一些实施例中，所述培养箱系统是如申请人的名称为“用于接收多个细胞培养室装置的培养箱”的第PCT/EP2021/067777号共同未决的PCT专利申请的一个或更多个实施例中所述的培养箱，该申请通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，所述细胞培养室装置是如申请人的名称为“用于细胞和组织生长的细胞培养室装置”的第PCT/EP2021/064742号共同未决的PCT专利申请的一个或更多个实施例中所述的细胞培养室装置，该申请通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，所述培养箱系统
-包括壳体以及细胞培养室装置，所述壳体包括培养室，该培养室被配置成在被培养箱接收时至少容纳细胞培养室装置的相应部分，
-被配置成(至少)围绕所接收的细胞培养室装置的预定旋转轴线(例如是或优选是水平轴线)旋转所接收的细胞培养室装置，
-包括至少一个照射装置，该照射装置与培养箱对准或集成在一起，并被配置成从至少一侧和可能从更多侧至少短时间照射一个细胞培养室装置的至少一部分，
-包括至少一个监测装置，该监测装置与培养箱对准或集成在一起，并被配置成在被培养箱接收时在监测信号通过至少一个细胞培养室装置的外壳的至少一部分、从该部分反射或通过该部分传播后记录和/或检测该监测信号，
-包括可选地从视频序列中捕获一个或更多个单图像的元件，例如通过使用帧抓取器(可以是基于硬件或软件的，并且可以是或不是培养箱系统的一个组成部分)捕获，和/或
-被配置成向一个或更多个图像处理装置提供所获得的图像，例如，在使用期间运行一个或更多个图像处理程序，该图像处理程序可以是或不是培养箱系统的一个组成部分。
在一些实施例中，本文中公开的细胞培养室装置(在本文又称为生物反应器)包括外壳(或细胞室)，该外壳被配置成包含典型的含水细胞培养基并且通常包含细胞。所述外壳由第一端、第二端以及至少一个连接第一端和第二端的连接壁(例如周壁)限定。所述第一端可以称为照射端或部分，或者称为主要或前照射端或部分。所述第一端例如也可以被称为观察端或观看部分，或者被称为主观察端或部分。所述第一端或其一部分或窗口是基本上透明的。所述第二端和/或连接壁或其相应部分或窗口是基本上透明的或基本上半透明的。所述第一端或其一部分或窗口被配置成与所述第二端或其一部分或窗口和/或与所述连接壁或其一部分或窗口通过光学方式或以其它方式(例如，相对于诸如声音或声波等其它电磁辐射或机械波)对准，从而光或其它监测信号可以透过或由第二端或其一部分或窗口和/或透过或由连接壁或其一部分或窗口传播到外壳中，透过所述细胞培养基的至少一部分传送或传播，并透过第一端或其一部分或窗口从外壳传播出来，例如传播到细胞培养室装置外。所述第一端(或其部分或窗口)不需要通过彼此相对或正对而与第二端(或其部分或窗口)光学对准，即使这提供一种非常便利的方式。例如，至少在一些时间内可以使用适当的基于光学或其它的基于电磁辐射或基于声音/声波等的系统或一个或更多个适当的装置或部件(例如反射镜、平面镜、透镜、棱镜、声音或光导等)对准相应的端部(或部分/窗口)。
细胞培养室装置还可以包括一个或更多个基准和/或识别标记，例如识别标志、条形码、参考点等。至少一些基准和/或识别标记优选是机器可读的。所述细胞培养室装置还可以构造有其它特征，例如轴向、径向或周向的入口(例如用于更换培养基，收集样品，注射化合物等)、气体交换膜(用于例如氧气、二氧化碳的交换)和通气口、加湿装置、标记或指示符。原则上说，所述细胞培养室装置可以具有任何适当的规则或不规则形状(同时支持如本文所述的旋转)，但是如果形状较简单，那么对于制造目的是优选的。如果这些附加部件至少在尽可能短的时间内或者优选在任何时间内都至少部分地或者总体上不妨碍对外壳的照射或者检查，那么这显然是有益的。此外，这些附加部件对外壳的照射或检查造成的干扰很小或者优选不造成任何干扰是有益的。
因此，说明了一种培养箱，该培养箱至少在部分时间内提供穿过包含在细胞培养室装置的外壳中的任何细胞培养基和细胞的至少一部分传播的无阻碍的光或其它监测信号传播路径。它还能够提供背面照射或从“后面”发射另一种监测信号，即，透过第二端和/或连接壁(例如朝向第二端)照射的光或发射的另一种监测信号，从而极大地增强从另一侧/相对侧(即，经由第一端)进行的目视检查(手动或自动)。例如，这对于检查布置在培养箱等之中的多个细胞培养室装置特别有用。如果细胞培养装置的第二端是透明的，那么还可以从外壳的两端(即，两侧)进行目视检查或其它检查(例如不同于光的声音或电磁辐射)、该检查可以是手动(在光的情况下)的和/或自动的(在光或其它电磁辐射或使用适当的传感器检查的声音或声波的情况下)。在一些实施例中，所述细胞培养室装置的所有部分都是透明的。
此外，这样的细胞培养室装置特别适合与如第一方面所述以及如本文所公开的培养箱结合使用，因为透明的第一端允许通过如本文所公开的一个或更多个监测装置提高其内容物的检测和/或记录质量。如上文所述，如第一方面所述以及如本文所公开的，一个或更多个这样的细胞培养室装置可以安装在适当配置的培养箱中。
在一些实施例中，所述细胞培养室装置的第二端或其部分或窗口是基本上透明的(而不是基本上半透明的)，并且所述细胞培养室装置还包括或连接至培养箱的光扩散器(又称为光学扩散器)，该光扩散器被配置成接收光并向细胞培养室装置的第二端或其部分或窗口提供基本上均匀的光，从而在外壳中包含细胞培养基的情况下提供基本上均匀的照射。所述光扩散器位于光源(天然和/或人工光源)之间的光传播路径中，并且在外壳/第二端或其部分或窗口之前。以这种方式对细胞培养基进行基本上均匀的照射很容易实现增强的目视(手动或自动)监测，从而在外壳仍在培养箱中时对其内容物进行目视评估。
对于第二端或其部分或窗口基本上半透明(而不是基本上透明)的替代实施例，该半透明端或部分或窗口会有效地作为光扩散器，从而消除对这种附加部件的需求。对于第二端或其部分或窗口基本上半透明(而不是基本上透明)的另外的替代实施例，光扩散器仍然存在，从而有效地提供双散射器(一个是通过其半透明端或部分或窗口提供的，另一个是通过光扩散器提供的)，该双散射器能够产生更均匀的光分布(以一些光能但通常不是大量光能为代价)。
因此，所述培养箱包括一个或更多个光源(或照射源)，该光源被配置成至少照射细胞培养室装置的相应部分，例如照射任何接收的细胞培养室装置的相应外壳的至少一部分。在另外的实施例中，所述一个或更多个光源(或照射源)被配置成分别至少照射由培养箱接收的一个或更多个细胞培养室装置的外壳的第一端或其部分或窗口。在另一些实施例中，所述一个或更多个光源布置在门或盖中，所述门或盖在被培养箱接收时面对所述一个或更多个细胞培养室装置。因此，提供了外壳的(主要的)“前面”照射，其中“前面”照射被认为是源自培养箱的开口朝向细胞培养室装置(在被接收时)的照射。
在一些实施例中，所述至少一个旋转驱动单元的至少一个相应驱动单元(例如一个、一些或全部)包括一个或更多个光源或照射源，该光源或照射源被配置成至少照射细胞培养室装置的相应部分，例如照射任何接收的细胞培养室装置的相应外壳的至少一部分。在另外的实施例中，所述一个或更多个光源或照射源被配置成分别至少照射由相应的驱动单元接收的一个或更多个细胞培养室装置的外壳的第二端或其部分或窗口。
在一些替代实施例中，所述至少一个旋转驱动单元的至少一个相应的驱动单元(例如一个、一些或全部)包括中空旋转轴，该中空旋转轴包括光导或其它灯光或照射装置，该装置被配置成在被驱动单元接收时至少照射细胞培养室装置或其外壳的相应部分。
因此，提供了外壳的(主要)“背面”照射，其中“背面”照射被认为是源自培养箱开口的对面并朝向细胞培养室装置(在被接收时)的照射。
在一些实施例中，所述至少一个驱动单元(或至少提供背面照射的驱动单元)包括布置在所接收的细胞培养室装置附近的腔体，其中该腔体包括一个或更多个光源或照射源。这提供了具有背面照射的非常紧凑的驱动单元。
在一些实施例中，所述一个或更多个光源或照射源被布置成偏离外壳或细胞培养室装置的中心轴线或旋转轴线，这能够提供通向外壳以及由此通向其内容物的简单/较简单的通路。
培养箱的实施例可以包括前照射灯和后照射灯或照射光源的混合，从而提高任何获得的监测信号的质量。或者，实施例可以仅包括一个或更多个后照射灯或照射光源，或者仅包括一个或更多个前照射灯或照射光源。
至少在一些实施例中，所述光是自然光或人工光或者它们的组合，典型地或优选地是波长为大约400至大约700纳米或至少在其子范围在的可见光。或者，所述光例如可以是分别具有大约700纳米至大约1毫米或大约900纳米至大约2500纳米波长的红外光或近红外光。作为另一种替代方案，所述监测信号是波长不同于可见光或光的电磁辐射，例如具有大约10至400纳米的波长的紫外光。(基本上)透明和(基本上)半透明指端部或壁(或其相应部分或窗口)相对于将与细胞培养室装置结合使用的光或其它监测信号的类型是足够(基本上)透明和/或足够(基本上)半透明的。在特定的实施例中，可以通过使用滤光器或衍射光栅来选择特定的波长，或者所述光可以像在激光器中一样是相干的。
在另一个替代实施例中，所述扩散器不是光扩散器，而是相对于其它类型的监测信号的扩散器，例如声学扩散器或用于除了光之外的电磁辐射的扩散器。
在一些替代实施例中，除了背面照射或从“后面”发出的另一种监测信号之外，或者作为背面照射或从“后面”发出的另一种监测信号的替代，所述细胞培养室装置被配置用于前面照射(或从前面施加其它类型的监测信号)。
在一些实施例中，所述第二端和/或所述至少一个连接壁中的至少一个包括一个或更多个集成光源。
在一些实施例中，所述第二端和/或所述至少一个连接壁中的至少一个是或者包括荧光发光元件。
在一些替代实施例中，除了背面照射或前面照射或者从“后面”或“侧面”发射的另一种监测信号之外，或者作为该照射或监测信号的替代，所述细胞培养室装置被配置用于侧面照射(或者从侧面施加其它类型的监测信号)。
在一些这样的替代实施例中，扩散器(若存在)可以由适当的反射镜(例如抛物面反射镜)代替。
所述至少一个照射装置原则上(至少在一些实施例中)可以位于培养箱外，而不是与培养箱集成，此时，所述培养箱包括许多与细胞培养室装置(在被培养箱接收时)对准的透明窗口等，从而允许照射装置在适当布置时照射任何接收的细胞培养室装置的内容物。细胞培养室装置的照射可以来自与监测装置相同的一侧(前面照射)，并且在这种配置中会主要依赖于到达监测装置的反射光或再发射光。细胞培养室装置的照射可以来自与监测装置相反的一侧(背面照射)，并且在这种配置中会依赖于透射照射、轮廓照射、相位差照射或到达监测装置的再发射光。细胞培养室装置的侧面照射会导致上述两种效果的结合。
根据第一方面，通过这种方式，很容易实现监测(和/或其它记录和/或检测)，其中所述监测例如可以是本地的或甚至是远程的，这将在本文中进一步公开。所述监测信号例如可以是电磁(通常是紫外光、可见光、红外光和/或近红外光)信号，并且所述监测装置例如可以是摄像头、CCD、光电倍增器、无线电接收器等，该装置被配置成提供任何包含的细胞培养室装置的外壳的内容物的数据或视频馈送信号或视频捕获信号(例如周期性的)、静止图像等。或者，所述监测信号是另一种信号，例如如本文所公开的信号。
所述至少一个监测装置原则上(在一些实施例中)可以位于培养箱外，而不是与培养箱集成在一起，此时，所述培养箱包括许多与细胞培养室装置(在被培养箱接收时)对准的透明窗口等，从而允许所述监测装置在适当布置时记录和/或检测任何接收的细胞培养室装置的内容物。
在一些实施例中，所述培养箱包括可打开和可关闭的门或盖(或其它入口元件)，并且所述培养室包括至少一个培养室壁，所述至少一个培养室壁和所述门或盖(或其它元件)在关闭时至少部分地限定培养室。在一些实施例中，所述至少一个培养室壁和所述门或盖(或其它入口元件)在关闭时完全限定培养室。在一些实施例中，所述培养室仅包括单个培养室壁。
在另外一些实施例中，所述门或盖的第一侧或内侧(即，在所述门、盖等关闭时面向培养室的一侧)包括至少一个监测装置，其中所述至少一个监测装置面向内布置，使得至少一个接收的细胞培养室装置的外壳在所述至少一个监测装置中的至少一个的记录和/或检测视场内，即，任何接收的细胞培养室装置的外壳在所述至少一个监测装置的视场内。
在一些实施例中(具有多个监测装置)，所述监测装置例如以基本上圆形或其它规则图案等距地布置在培养箱的门、盖等之中。
在一些实施例中，所述培养箱包括预定数量的监测装置，即，能够被培养箱接收的每个细胞培养室装置设有一个监测装置，或者换句话说是一对一的关系。在另外一些实施例中，每个监测装置被布置成使得监测装置的记录和/或检测视场的中心轴线至少基本上与所接收的细胞培养室装置的相应外壳的中心轴线对准。通过这种方式，一个监测装置专用于记录和/或检测一个特定细胞培养室装置的监测信号，这通常会增强相应监测信号的质量和/或还增强特定培养室装置(尤其是任何包含的细胞培养室装置的内容物)的记录和/或检测(例如观察)。此外，还确保(或至少极大地促进)监测装置和细胞培养室装置正确对准(在X、Y和Z维度上)，考虑到在这种设置中它们之间的距离通常很短，这尤其重要。或者，一个监测装置专用于记录和/或检测多个特定细胞培养室装置的监测信号，从而减少所需的监测装置的数量。例如，在监测装置不便宜或者在从不同的细胞培养室装置收集的图像需要非常高的可比性时，这是有利的。在这种情况下，可以使用可控的透镜、棱镜、平面镜或其它光导装置将分别穿过所述细胞培养室装置的光导引至监测装置，使得在任何特定的时间进入监测装置的光是仅穿过或来自一个细胞培养室装置的光。在其它实施例中，光可以穿过不止一个细胞培养室装置，使得在任何特定的时间进入监测装置的光是穿过或来自不止一个细胞培养室装置的光。这是需要基准或使用相位差的情况的常见设置。
此外，所述监测装置很容易实现细胞培养室内容物的详细备档，例如以独立的图片或视频序列的形式记录。
所使用的照射可以具有较低的强度和/或较低的波长，这两个特点都能够减少对细胞的任何潜在损害。在使用监测装置检查或记录细胞培养室装置的内容物时，可以选择性地开启照射，并在之后关断，这会减少暴露于光的时间。此外，用户能够更快地对多个细胞培养室装置的内容物进行检查、记录等，从而也减轻了光暴露的程度。
此外，与透过玻璃板等手工地观察培养箱相比(即使培养箱中有照明)，所述监测装置很容易实现增强的观察(例如放大/变焦、红外、转换波长等)。
或者，使用其它的(一个或更多个)监测信号源来代替被配置成向相应的外壳中发射另一种类型的监测信号的光源(例如透过第二端或其一部分或窗口)，其中所述至少一个监测装置被配置成捕获透过第一端或其部分或窗口传播到外壳外的另一种类型的监测信号的至少一部分。这种其它类型的监测装置例如可以被配置成记录声音或声波(例如超声波)或者记录具有与可见光的波长不同的波长的电磁辐射(例如X射线、紫外线或红外线)。
在用于照射细胞培养室装置并随后捕获该装置的图像的所有或至少一些实施例中，光可以被导引通过一个或更多个在操纵光时常用的可控构造(例如透镜、散射器、滤光器、光导装置、棱镜、平面镜等)。这些构造中的一些或全部构造可以独立地交换，以至少在某种程度上增强所获得的图像，并且由此提高“信噪比”。在操纵具有不同于可见光的波长的电磁辐射时，其它构造也可用于类似目的。
在所示的实施例中，一个光源提供背面照射，而两个(仅是示例；可以是一个或不同于两个的其它数量)光源提供细胞培养室装置和细胞培养室的前面照射，这使监测装置能够简单地观察外壳的内容物。
所述光源例如可以是LED光源或任何其它适当的光源。
在驱动单元包括多个光源的一些实施例中，这些光源可以是相同类型或不同类型的(例如发射不同的波长)。在另外一些实施例中，所述驱动单元包括至少两种不同类型的多个光源，其中所述至少两种不同类型可以选自紫外光、可见光、近红外光和红外光。
在另外一些实施例中，所述光可以具有受限的波长，并且可以是相干的(例如像激光器中的情况一样)或者可选地不是相干的，以便提高信噪比。
在另外的实施例中，所述照射可以是在时间上受限的，即，是脉冲、闪烁型的，或甚至是单个脉冲或闪光，以便减少“背景”照射，并且由此提高信噪比。脉冲可以是可变长度的几秒或几分之一秒，对于某些应用(例如时间分辨荧光)，可能低至毫秒时间间隔。某些发光化合物不稳定，在光照下会分解。如上文所述的脉冲照射由此能够延长这些发光化合物的可用寿命，并且脉冲的长度可以由监测装置确定，以获得适当的曝光。
在一些实施例中，所述培养箱系统包括布置在从所述一个或更多个光源到或朝向所接收的细胞培养室装置的外壳的光传播路径中的光扩散器。在另外一些实施例中，所述光扩散器在传播路径中布置在邻近或至少靠近所接收的细胞培养室装置(例如邻近或靠近外壳的第二端)的位置。所述光扩散器例如可以布置在驱动单元的腔体中。所述光扩散器向外壳提供更均匀的照射，因此能够提高背面照射的质量，从而提高监测装置的监测信号的质量。
在一些实施例中，所述培养箱系统包括滤光器，该滤光器至少在某种程度上允许特定波长的光通过并阻挡其它波长的光，该滤光器布置在从所述一个或更多个光源到或朝向接收的细胞培养室装置的外壳的光传播路径中。在另外一些实施例中，所述滤光器被在传播路径中布置在邻近或至少靠近接收的细胞培养室装置的位置。所述滤光器例如可以布置在驱动单元的腔体中。所述滤光器可以从外壳提供更有选择性的照射，因此能够提高“图像信噪比”，由此增强监测装置的监测信号。
在一些实施例中，所述培养箱系统包括滤光器，该滤光器至少在某种程度上允许特定波长的光通过并阻挡其它波长的光，该滤光器布置在从细胞培养室装置到或朝向监测装置的光传播路径中。在另外一些实施例中，所述滤光器被在传播路径中布置在邻近或至少靠近监测装置的位置。所述滤光器例如可以布置在驱动单元的腔体中，或者直接布置在监测装置或接收器的前面。所述滤光器可以从外壳提供更有选择性的照射，因此能够提高“图像信噪比”，由此增强监测装置的监测信号。
在一些实施例中，在照射源与其配准位置之间的任何位置使用扩散器和滤光器或滤光器组的组合，以获得高图像信噪比，从而增强监测装置的监测信号。这种扩散器和滤光器例如可以是可移除的或可更换的，以与细胞、传感器或监测装置的要求相匹配。
以这种方式观察和监测外壳的内容物显著减少反复打开和关闭培养箱的需要，这种重复打开和关闭会破坏其中的受控环境(例如关于温度、湿度、氧气、二氧化碳、模拟微重力、剪切应力等)。这又显著减少培养箱中的任何细胞培养室装置内的细胞扰动。
所述旋转驱动单元分别被配置成围绕一个、两个或三个相互基本上垂直的轴线旋转一个(或更多个)接收的细胞培养室装置。围绕两个或三个这样的轴线旋转的培养箱有时也被称为所谓的随机定位机。在一些实施例中，所述预定旋转轴线是接收的细胞培养室装置的预定中心轴线。在一些实施例中，接收的细胞培养室装置的中心轴线可以与接收的细胞培养室装置的外壳的中心轴线相同或重合，即，如果外壳在细胞培养室装置内居中布置的话(不总是需要这样)。或者，所述预定旋转轴线偏离外壳的中心轴线。
在一些实施例中，所述旋转驱动单元是回转器驱动单元。
在一些实施例中，所述培养室被配置成完全包含细胞培养室装置(在被培养箱接收时)。或者，所述培养室被配置成仅包含细胞培养室装置的一部分，尤其是相应外壳的至少一部分，例如全部。在一些实施例中，所述细胞培养室装置例如可以是灌注细胞培养室装置(可以长时间自我维持，例如最多大约14天或更长时间)，该灌注细胞培养室装置包括相应的新鲜培养基和废培养基储存器、驱动元件等，并且有利的是将某些部分或部件(例如新鲜培养基和废培养基储存器、驱动元件等)布置在培养室外部，从而降低污染的风险，并使清洁更容易。例如，请参考申请人的第PCT/EP2020/068632号共同未决的PCT专利申请，以了解灌注细胞培养室装置或生物反应器的例子。
在一些实施例中，所述培养箱和/或用户界面装置还被配置成对于至少一些(例如所有的)细胞培养室装置执行数据记录和/或备档，例如随着时间的推移收集和存储数据(例如温度、湿度水平、旋转速度)，并且包括平均值以及暂停(无旋转)的持续时间和次数等。例如，可以使用视频和/或静止图像以及来自图像处理的数据作为补充。数据记录或备档的数据例如可以存储(例如还存储)在云计算环境中。
所述监测信号例如可以是可见光信号，并且所述监测装置例如可以是被配置成提供任何包含的细胞培养室装置的视频馈送内容或视频捕获内容、(例如周期性的)静止图像等的监测装置等。或者，所述监测信号是不同的信号，例如在本文中公开的信号，并且所述监测装置适合于收集这种不同的信号。或者或另外，除了视频和图像之外，上述功能也可用于其它类型的监测信号，例如在本文中公开的监测信号。
根据第二个方面，这些目的中的一个或更多个至少在一定程度上是通过第一方面中的培养箱来实现的，该培养箱还包括：
-用于从视频中捕获独立图像或独立帧(优选以高分辨率捕获)的硬件或软件单元(“帧捕获器”)，
-一个或更多个处理单元(可以是或不是培养箱单元本身的一个组成部分)，其中的一个或更多个处理单元能够实时地(或近实时地)分析图像，
-处理器单元和一个或更多个能够协调正在执行的图像分析活动的算法，
-用于为每个细胞培养室装置收集源自图像的数据的记录系统、电子存储器和/或电子存储装置，以及
-一个或更多个被配置成与网络通信的信号发射器和接收器通信元件，
-能够向培养箱的操作者提供所述数据的元件。
可以通过捕获一个或更多个基准和/或识别标记或代码的图像或视频并进行适当的图像处理或其它数字处理来自动获得特定细胞培养室装置的标识。通过类似的方式，还可以通过捕获图像或视频来获得和呈现包含在细胞培养室装置的特定外壳中的气泡的存在。因此，在一些实施例中，所述外壳和/或细胞培养室装置还包括一个或更多个基准和/或识别标记，例如识别标志、条形码、参考点等。至少一些基准和/或识别标记优选是机器可读的。例如，这可以有利地与利用至少一个如本文所公开的监测装置(例如成像或视觉系统或装置)进行的监测结合使用。所述基准标记支持确定与如本文所公开的至少一个监测装置结合使用的细胞培养室装置(尤其是外壳)的取向。
优选地，识别标记对于包含它的特定细胞培养室装置是唯一的。在进一步的应用中，细胞培养室装置的图像分析会读取装置所特有的条形码，并确保细胞培养室装置以正确的速度旋转(不管该装置被置于培养箱系统的哪个轴上)。条形码的图像分析还会确保为该装置正确地收集和归档数据。
更具体地说，在至少一些实施例中，至少一个或一些细胞培养室装置分别还包括一个或更多个基准标记、条形码或类似标记，并且其中所述一个或更多个处理单元被配置成使用图像分析来识别这些标记，并且响应于此来识别相应的细胞培养室装置，并且其中所述培养箱系统被配置成控制相应细胞培养室装置的旋转位置和/或旋转速度，和/或监测相应细胞培养室装置的使用。
在一个特定实施例中，使用装置所特有的条形码，所述培养箱可以向用户发送警报，以警告细胞培养室装置本身接近其有效时间段的终点。可以通过多种方式实现所述警报，例如平板电脑上的弹出窗口、向计算机或智能手机发送的电子邮件或SMS、或向多个目标或人员(用户、共同用户、组长、安全人员等)发送的电子邮件或SMS。
在这个实施例的另一个特定应用中，所述图像处理能够提供旋转细胞培养室的明显静止的图像，以便于用户检查。更具体地说，在至少一些实施例中，所述一个或更多个处理单元被配置成通过反向旋转响应于旋转细胞培养室装置的每分钟转数或其它旋转速度值而确定的量来将旋转细胞培养室装置的视频或视频的一个或更多个图像保持在明显静止的位置。
在线馈送视频或图片很容易地实现对所包含的球团的状态的人工检查，例如它们的大小、它们的轨道、它们的下落速度等，例如，如果球团现在已经变得更大并由此更重，那么这可能提示用户需要改变(例如增加)旋转速度(提示增加旋转速度)。
在另外一些实施例中，所述培养箱还被配置成以非侵入的方式实时或近实时地进行图像分析。在需要强大的处理能力的某些情况下，图像分析任务可以与外部计算机或超级计算机共享。这种图像分析的目的是为用户提供关于细胞培养室中的培养物的附加数据，以便于和加速数据处理。
所述用户界面装置例如可以被配置用于第一培养箱和/或至少一个第二培养箱中的任何一个的在线监测。在一些实施例中，所述用户界面装置被配置成在用户界面中(例如在屏幕上)显示由培养箱经由其相应的监测装置(如果包括这种监测装置，例如本文所公开的监测装置)获得的一个或更多个每个培养箱的视频在线馈送或最新的独立图片或一系列图片。还可以获得每个特定细胞培养室装置的附加数据(例如当前的旋转速度、旋转方向、标识等)并将其传送至用户界面装置，例如与相应细胞培养室装置的视频或图像一起显示在装置上。除了细胞培养室装置所特有的数据之外，还可以获得并提供各个培养箱的数据，例如以下数据中的一种或更多种：当前温度、当前pH值、当前湿度、当前二氧化碳、氧气和/或氮气水平等。如果某一个或更多个参数在可接受的值的范围之外、高于或低于可接受的值等(例如如果测得的当前温度或二氧化碳水平超过给定的温度阈值或数值等)，那么所述培养箱系统例如还可以向用户界面装置(或另一个连接的外部计算装置)发送警报或警告。
图像分析还能够向用户提供关于培养物的pH、生物量(DNA蛋白质、细胞数量)、生长速率、细胞培养室中的球团或细胞团的大小和标准偏差(再现性)的非侵入性实时反馈。在一个特定实施例中，所述培养箱可以向用户发送警报，以警告培养物偏离预期的生长参数。这些警报可以通过多种方式实现，例如平板电脑上的弹出窗口、向计算机或智能手机发送的电子邮件或SMS、或向多个目标或人员(用户、共同用户、组长、安全人员等)发送的电子邮件或SMS。
图像分析还可用于确定图像中的水珠的面积，以便在加湿系统的水量不足时警告用户。
在另一个实施例中，光源(前面照射和背面照射)和监测装置的应用可以与细胞培养室上、培养基中以及细胞培养室中的细胞或球团上或细胞或球团中的传感器的存在相结合，从而以非侵入的方式向用户提供关于培养物或其中发生的生物过程的大量灵敏且精确的数据。图像分析能够为用户提供传感器输出数据的实时反馈(例如参见图7D的实施例)。
图像分析输出数据的不同方面的组合可用于对收集的数据进行归一化。来自不同细胞培养装置(可能在不同的培养箱中)的数据的组合可用于比较对照品和处理的样品。这种处理的数据也可以实时地提供给用户。
根据另外的方面和/或另外的实施例，提供一个或更多个处理单元(例如在本文中公开的培养箱系统和/或计算机的处理单元)，所述处理单元被配置成执行在本文中公开的一个或更多个图像分析方法或其步骤。在一些实施例中，所述培养箱和/或用户界面装置还被配置成对至少一些(例如所有的)细胞培养室装置执行数据记录和/或备档，例如收集和存储数据，例如旋转速度、生物量(DNA蛋白质、细胞数量)、生长速率、大小和标准偏差(再现性)、以及任何传感器输出，每次测量是随着时间进行的，并且例如包括平均值以及暂停(无旋转)的持续时间和次数等。例如，可以使用视频和/或静止图像以及来自图像分析的数据作为补充。数据记录或文档记录的数据例如可以存储(例如还存储)在云计算环境中。
在这个第二方面中，所述一个或更多个处理单元例如被配置成经由网络与至少一个外部计算装置通信，所述外部计算设备例如是用户界面装置、客户端和/或服务器计算机或装置、网络连接的存储装置和/或一个或更多个附加的培养箱中的一种或更多种。
在一些实施例中，监测装置的捕获或获得的视频和/或图片和/或其它监测信号可以由培养箱传送至外部计算装置，例如用于呈现(例如远程观看或远程在线观看)、存储和/或进一步的数字处理。这样的装置不仅可以存储原始数据(以及收集该数据的时间)，还可以存储处理后的数据以及使用该数据的时间等。
适当的处理能力和存储容量能够在当前的优质平板电脑中发现。如果需要更高的处理速度和/或存储容量，那么可以由计算机或超级计算机提供。
在这样的实施例中，可以使用图像分析算法从细胞培养室装置的一个或更多个图像中提取多种类型的数据。在一些情况下，图像分析能够支持对于操作者来说是繁重、费力或甚至实际上不可能的或者会对细胞培养装置中的细胞生长产生负面影响的数据收集。
在其它情况下，所述数据可用于自动解释或实现对生长进程和/或治疗效果的估计，并且这样能够收集客观的数据。因此，所述设备不仅能够呈现原始读出数据，还能够提供处理的数据(例如包括对这种数据的可靠性或再现性的估计)。图像分析例如可以应用于整个图像或其部分，例如包括细胞培养室的图像区域(即，球团所在的位置)。减小待分析的区域的会相应地提高图像分析速度并降低功耗。图像分析的以下说明可以应用于整个图像或者图像的被独立地使用或者以任何加权组合使用的三种不同颜色分量(红色、绿色和蓝色)。使用单色分量或衍生的单色或灰度图像也会提高图像分析速度。
可以对产生的图像进行处理以提供关于细胞培养室装置中的细胞的详细信息，而不会干扰它们的生长(即，以非侵入的方式)。与必须从培养箱中取出细胞培养室装置并对其进行人工检查的情况相比，这样允许更频繁地进行这种测量。更重要的是，图像分析能够实现为了进行测量而需要将细胞培养室装置从培养箱系统中取出这种细胞不能忍受的数据收集。例如，如果在细胞培养室中发生的反应较快，那么可以在短时间(几分钟或几小时)内逐秒地对这种图像进行处理，但是如果必须从培养箱系统中取出细胞培养室，那么这种观察实际上是不可能的。在其它情况下，如果需要，可以在更长的时间段(几天、几周或几个月)内按分钟处理这些图像。可以比较来自各种细胞培养室的数据，以实时或近实时地跟踪培养物或实验的发展，这进一步减少对操作者的干预的需求，并提高推断出结论的速度。
此外，图像分析可以为用户产生许多信号或数据/信息，这些信号或数据/信息指示实验的进展，最重要的是指示与预期的偏差。
存在与细胞生长相容因而可以包含在细胞培养装置中而不会显著影响这些细胞的活性的多种不同类型的传感器。它们可以用于进一步收集关于细胞培养物、其性能或对刺激或处理的反应的附加数据。可能需要以类似于可视图像的方式对获取的数据进行图像分析。
根据这个第二方面，图像分析算法的实施例从采集、增强、色彩空间转换和数字图像变换中的一个或更多个操作等过程开始。因此，例如，为了进行形态学图像分析，可能需要对这种图像进行预处理(平滑、锐化、聚焦、或对比度和亮度调节、以及图像噪声去除(例如具有与其周围的(八个或更多个)像素显著不同的值的单个或一组像素可以用八个或更多个像素的平均值来代替))，然后进行局部图像分割和对象识别。还可以通过采用机器学习(ML，即，能够访问数据并将其用于自身学习的计算机程序，无需明确编程)、深度学习(DL)或卷积神经网络(CNN)来改进图像分析中的许多过程，但这些处理需要相当强大的处理能力，并且比传统的图像分析慢。但是，在学习后，在执行特定任务时(例如划分图像中的视觉元素(例如从‘背景’中识别或界定对象，或者分离在视觉上重叠的对象)，将不同的元素分类到独立的组中等)，这些图像处理在某些情况下能够更快速或更高效。
图像分割可以是图像分析中的早期步骤，并且可以用于将图像分成组成部分(元素)。这些元素可以包括但不限于细胞培养室装置、细胞培养室外壳(例如，在一个特定的实施例中，由图像中的已知直径的很大、明亮且基本上圆形的元件限定)；条形码或类似物(例如由位于细胞培养室外部但是与细胞培养室相距已知距离并成已知角度的已知尺寸的矩形区域中的一系列明暗条、正方形或矩形限定)、处于已知位置(细胞培养室内部或外部)且具有已知尺寸和形状的基准标记、以及细胞培养室的已知尺寸和形状的前塞件。
在识别条形码之后，可以读取条形码，以明确地识别出精确的细胞培养室装置。如果将所述细胞培养室装置从一个驱动轴上移除并返回到不同的轴上(可能在不同的培养箱中，但通常在同一个培养箱组中(即，由同一个处理平板电脑或计算机控制)，那么软件可以继续以与在先前轴上所用的旋转速度的相同的旋转速度处理细胞培养室装置，并且可以继续将收集的数据归属于正确的细胞培养室装置(而不是不同的或新的细胞培养室装置)，并且进一步继续分析任何正在进行或动态的过程，而不会使数据流混乱。该功能的有利之处在于能抑制因将细胞培养装置重新定位在培养箱或培养箱组中的不同轴上而导致的操作员错误。
图像处理例如还能够停止任何不保持细胞培养室装置的轴。
在另外的具体实施例中，所述培养箱系统还可以跟踪特定细胞培养室装置已经使用了多长时间(通过记录开始日期和时间并对照使用的经过时间进行测量)，并向用户指示何时需要更换该装置(例如因气体交换膜(对于包括气体交换膜的实施例)或其它装置已经达到其功能或可用性的终点)。该功能是有用的，因为它能够确保细胞培养物被保持在一致的条件下。
在另外一些实施例中，在识别了条形码或基准标记之后，所述一个或更多个处理单元被配置成将细胞培养室装置停止在特定的取向，例如使其外周端口处于顶部。在停止后，细胞培养室装置中的球团会沉淀到底部。然后，用户例如可以将细胞培养室装置移动至无菌工作台或其它位置，但不改变装置的取向，从而例如可以在最大限度地减少对球团的干扰的同时更快速地更换生长培养基，或者便于球团的收集。
根据另一个实施例，所述图像数据被旋转，使得它在被显示时看起来是静止的。因此，对图像数据进行处理，使得每个图像或其部分(例如与细胞培养室装置对应的部分)向后旋转与在获取一个图像帧和下一个图像帧之间的时间内发生的向前旋转对应的量。例如，这可以通过定位条形码和/或基准标记并使其在待呈现的图像中的位置保持不变来进行。当球团相对于细胞培养室装置处于“静止轨道”时，这有助于观察各个球团，因为它们看起来在图像中保持大致静止，从而能够进行更近的检查。使球团实际上保持基本不动会允许长时间跟踪各个球团，并允许对各个球团中的生物过程进行动力学观察。
图像的整体旋转是一个众所周知的常规图像分析过程(是仿射变换的一个特例)。该过程例如还可以执行平移变换，以更好地定位旋转细胞培养室的图像(例如将细胞培养装置的图像置于屏幕的中心)。这种图像分析优选应发生在一帧与下一帧之间的时间内，以提供最平滑的视频馈送。“跳过”一个或更多个帧的处理会导致视频不太平滑，但会给图像分析留出更多时间。
在一些实施例中(根据第一方面和/或第二方面以及另一些方面)，从所述一个或更多个监测信号提取和/或导出的数据是或包括从所包含的细胞培养室装置获得或为所包含的细胞培养室装置获得的一个或更多个数字图像和/或数字视频，并且其中所述培养箱系统还被配置成通过对所述一个或更多个数字图像和/或数字视频或其部分进行图像分析来调节所包含的细胞培养室装置的旋转速度。在以下的改变旋转速度的实施例中，旋转方向是顺时针方向。对于逆时针旋转，需要相应地调整功能(或多或少地应该或者可以对下面提到的区域相对于相关图像的大致竖直的线进行镜像)。在另外一些实施例中，对包括或被分成第一区域(例如参见图5中的32)、第二区域(例如参见图5中的33)和第三区域(例如参见图5中的31)的图像进行图像分析，并且其中所述培养箱系统被配置成沿着顺时针方向围绕各自的预定轴线旋转所包含的细胞培养室装置，从而
-若第一区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标单独地或与增加的预定正公差值(x％)结合大于第二区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标，则降低所包含的细胞培养室装置的旋转速度；
-若第三区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标单独地或与增加的预定正公差值结合大于第一区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标，则提高所包含的细胞培养室装置的旋转速度；和/或
-对于任何其它情况，保持所包含的细胞培养室装置的旋转速度。
在一些实施例中，所述第二区域(例如参见图5中的33)是围绕细胞培养室的中心的基本上圆形的中央区域，所述第一区域(例如参见图5中的32)是与第二区域相邻(在“上面”和“侧面”)并部分地围绕第二区域的基本上外环形的部分，所述第三区域(例如参见图5中的31)是与第二区域相邻(在“下方”或“下面”)并部分地围绕第二区域的基本上外环形的部分。在至少一些实施例中，所述第一区域和所述第三区域完全外接并包围所述第二区域，并且所述第一区域具有比所述第三区域更大的范围或面积。
或者，对包括或被分成第四区域(例如参见图6中的37)、第五区域(例如参见图6中的36)、第六区域(例如参见图6中的34)和第七区域(例如参见图6中的35)的图像进行图像分析，并且其中所述培养箱系统被配置成沿着顺时针方向围绕各自的预定轴线旋转所包含的细胞培养室装置，从而
-若第四区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标加上第五区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标的结果本身或与预定的正公差值相加的和值小于第六区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标加上第七区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标的结果，则降低所包含的细胞培养室装置的旋转速度，
-若第五区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标加上第四区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标的结果大于第六区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标加上第七区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标的结果本身或与预定的正公差值相加的和值，则提高所包含的细胞培养室装置的旋转速度，和/或
-对于任何其它情况，保持所包含的细胞培养室装置的旋转速度。
在一些实施例中，所述第四区域(例如参见图6中的37)、所述第五区域(例如参见图6中的36)、所述第六区域(例如参见图6中的34)和所述第七区域(例如参见图6中的35)具有相同的尺寸，并且由在细胞培养室(图像)中间以大约90°的角度相交并以大于45°的角度与细胞培养室图像相交(线a--a)的两条线限定，其中第四区域(在图像中)基本上是“左上”区域，第五区域基本上是“左下”区域，第六区域基本上是“右上”区域，第七区域基本上是“右下”区域。所述两条相交线会根据旋转方向(顺时针或逆时针)相对于水平和竖直方向旋转一定的预定量。对于顺时针旋转，两条相交线会逆时针旋转较小的量(例如参见图6)。
在另外的实施例中，确定是提高旋转速度还是降低旋转速度是通过“仅”将第五区域的导出数据与第六区域的导出数据进行比较而不是将第四区域和第五区域的导出数据与第六区域和第七区域的导出数据进行比较来进行的。例如，这适用于(虽然更简单的)实际速度距正确速度“很远”的情况。对于实际速度“较接近”正确速度的情况，将第四区域和第五区域的导出数据与第六区域和第七区域的导出数据进行比较是优选的或者甚至是必要的。
在上文(和其它位置)所述的调节旋转速度的替代实施例中，导出并使用特定区域的平均像素强度值，而不是导出并使用特定区域的每单位面积的像素强度值的和。在另一些替代实施例中，可以使用确定或估计包含在细胞培养室的各种区域中的细胞集落、球团等的数量或质量的其它方式。本文中的区域通常又被称为区。
应说明的是，上述的两个改变或调节旋转速度的替代实施例(及其另一些变化形式/实施例)假设获得图像(最终具有或提供区域)所用的照射是基本上均匀的，或者至少在这种情况下效果最好。如果照射不够均匀，那么需要以公知的适当方式来调整，例如通过在比较/分析之前从区域的像素中减去(局部)背景像素强度值来进行。此外，上面给出的这些实施例的比较(“大于”和“小于”)也假设采用前面照射(球团、细胞群等看起来比它们的周围环境更亮)或者在这种情况下效果最好。如果使用背面照射(球团、细胞群等看起来比它们的周围环境暗)，那么在上面的比较中，“大于”应该替换为“小于”，“小于”应该替换为“大于”。或者，在执行比较之前，可以简单地将图像或区域数字转换成其自身的负版本(亮的区域变暗，或者相反)。此外，如果区域不是大致相同的大小，那么不需要对每单位面积的像素强度值(或任何其它使用的函数或指标)求和；在相反情况下(在区域大小基本上相似的情况下)，可以简单地将各个区域的像素强度值相加并直接进行比较。
对于采用背面照射而不是前面照射的实施例，可以根据以下规则进行比较。
在一些这样的(背面照射实施例)中，对包括或被分成第一区域(例如参见图5中的32)、第二区域(例如参见图5中的33)和第三区域(例如参见图5中的31)的图像进行图像分析，并且其中所述培养箱系统被配置成沿着顺时针方向围绕各自的预定轴线旋转所包含的细胞培养室装置，从而
-若第一区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标单独地或与增加的预定正公差值(x％)结合小于第二区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标，则降低所包含的细胞培养室装置的旋转速度；
-若第三区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标单独地或与增加的预定正公差值结合小于第一区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标，则提高所包含的细胞培养室装置的旋转速度；和/或
-对于任何其它情况，保持所包含的细胞培养室装置的旋转速度。
在一些这样的替代(背面照射)实施例中，对包括或被分成第四区域(例如参见图6中的37)、第五区域(例如参见图6中的36)、第六区域(例如参见图6中的34)和第七区域(例如参见图6中的35)的图像进行图像分析，并且其中所述培养箱系统被配置成沿着顺时针方向围绕各自的预定轴线旋转所包含的细胞培养室装置，从而
-若第四区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标加上第五区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标的结果本身或与预定的正公差值相加的和值大于第六区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标加上第七区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标的结果，则降低所包含的细胞培养室装置的旋转速度，
-若第五区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标加上第四区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标的结果小于第六区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标加上第七区域的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标的结果本身或与预定的正公差值相加的和值，则提高所包含的细胞培养室装置的旋转速度，和/或
-对于任何其它情况，保持所包含的细胞培养室装置的旋转速度。
在一些实施例中(根据第一方面和/或第二方面以及另一些方面)，所述培养箱系统包括至少两个轴或驱动单元，每个轴或驱动单元被配置成旋转分别连接或接收的细胞培养室装置的步骤，其中所述培养箱系统还被配置成识别在特定轴上或由特定驱动单元连接或接收的特定细胞培养室装置(例如使用图像分析和基准或如本文所公开的其它标记)，并将特定轴或特定驱动单元的旋转速度调节至与连接或接收的特定细胞培养室装置相关联的旋转速度。
在图像分析的另一个实施例中，附加的操作是识别细胞培养室外壳的图像内的元素，并且将处理区域限制为图像的一部分会提高处理速度。这可以使用被统称为分割的多种图像分析方法中的一种或更多种来完成(使用通用或局部的背景减除(其中背景例如可以通过“滚球技术”、局部最小值或最大值或自适应高斯阈值方法来限定)。在图像分析领域中有多种已知的分割方法，包括基于边缘的分割(“边缘检测”、“角部检测”、“斑点检测”算法)、形态学分割、基于图形的分割过滤、基于聚类的分割和概率分割。算法可能包含“公差”，也就是说，如果在元素周围没有检测到“边缘”，那么程序可以进行插值以构成元素边缘。
一旦在图像中识别出元素，就可以应用一组附加算法来锐化或平滑该元素，以确定其面积和体积(定义为积分光密度(IOD-元素内像素的总和减去元素周围的(局部)背景的总和)、最小和最大轴(不一定在笛卡尔X、Y和Z方向上)、平均直径、平滑度、周长、圆度、以及细胞培养室区域中相对于基准标记或前端口之一上的点或其它适当的点(例如图像的角部)的实际位置(笛卡尔X、Y和潜在的Z值(后者例如可以通过聚焦算法或类似方法确定))。
例如，可以对圆度较低、周长-面积比较大或最小轴与最大轴的差异较大的元素进行进一步分析，以尝试解析两个(或更多个)重叠球团的图像。例如，这可以通过收聚、沿着最小轴线进行划分、鞍形划分或分水岭技术或任何上述分割方法来完成。这些技术例如可以以不同的组合重复或使用，以解析复杂的元素。
根据这个实施例的一种进一步改进，一旦解析了元素，然后就可以根据上述参数的任何组合等将这些元素分组和分成子组。可以排除低于特定阈值的元素(例如图像噪声)。具有较大的尺寸-体积比(IOD)并且优先位于图像顶部的元素可能代表气泡，位于底部的元素可能代表细胞碎片，也可以将它们排除在进一步的分析之外。然后可以将剩余的元素分类到子组中，例如基于它们的平均直径来分类。在许多情况下，优选的球团培养物是球团大小和形状均一的培养物，因为预计这些球团对处理或其它加工的反应更一致。换句话说，球团培养物会包含具有相似的X、Y和Z尺寸、很高的圆度(球团性)、特定平均直径(这取决于培养物的龄期或用于引发球团的细胞数量)并在该值附近具有较小的标准偏差的元素(分类为球团)。相反，较差的球团培养物会具有基于具有较大的X、Y和Z尺寸的标准偏差、较低的圆度(球团度)和直径的元素的组，这些元素的X、Y和Z尺寸的标准偏差、圆度(球团度)和直径在该组的平均X-Y-Z偏差、圆度(球团度)和直径左右。有可能存在不止一个组，这样的附加组可能代表不能被图像分析算法解析的球团组，或者可能实际上是细胞培养室中的球团丛或两个不同的球团群。
连续图像的图像分析可以用于导出关于各个元素(例如球团)的轨迹数据。该信息例如可用在自动反馈回路中，以调节细胞培养室的旋转速度，使其符合用户要求。
例如，可以在位于细胞培养室内但位于图像中的所有元素之外的图像区域中提取有用的数据和信息(也可以在元素周围可能的边缘影响区以及细胞培养室和任何相关端口的边缘之外)。例如，可以向细胞培养基中添加诸如酚红、溴甲酚紫或品红等化合物，以指示培养基的pH值。因此，可以使用所有元素之外的图像区域的平均颜色来估计培养基的pH值(例如参见https://www.biotek.com/resources/application-notes/using-phenol-red-to-assess-ph-in-tissue-culture-media/)。例如，可以使用专用于有色化合物和所用的特定生长培养基的查找表(LUT)，这种LUT是随培养箱系统提供的，通过对由用户提供的样品进行测量而得出的，或者由用户输入的。
以酚红为例，细胞产生的废物会缓慢降低pH值，逐渐使溶液从红色(pH＝8.0)变成橙色(pH＝7.0)，然后变成黄色(pH＝6.0)(参见https://www.testallwater.co.uk/blog/post/what-is-phenol-red-in-swimming-pools/)。
例如，可以通过图像分析来随着时间监测培养基的颜色，并且定义值的变化是培养基需要更换的指示。可以将程序配置成向用户提醒这一点。
由死亡细胞或污染微生物的过度生长产生的废物会导致pH值更快地下降，也会导致指示剂颜色发生同样的变化。在颜色变化比通常看到的更快的情况下，可以将程序配置成向用户通知在细胞培养室中可能发生微生物污染或(意外的)细胞死亡。
图像分析还能够向用户提供关于培养物的pH、生物量(DNA蛋白质、细胞数量)、生长速率、细胞培养室中的球团或细胞团的大小和标准偏差(再现性)的非侵入性实时反馈。在一个特定实施例中，所述培养箱可以向用户发送警报，以警告培养物偏离预期的生长参数。这些警报可以通过多种方式实现，例如平板电脑上的弹出窗口、向计算机或智能手机发送的电子邮件或SMS、或向多个目标或人员(用户、共同用户、组长、安全人员等)发送的电子邮件或SMS。
在第三方面中，如果上述第二方面中的培养箱系统以及图像分析功能还包括以下特征，那么能够至少在一定程度上实现上述目标中的一个或更多个：
-实现图像分析的软件，该软件能够从细胞培养室装置的图像中提取数据，
-能够使用一些从图像导出的数据通过软件调节的机电部件来修改培养箱的操作以调节下列项目的元件或装置：所述装置的培养基的更换；或细胞培养室装置的旋转速度；或者可选地在预先指定的时间对所述装置照射以收集数据(包括传感器读数)，
-能够协调各种处理器活动的控制器，
-用于收集和记录至少一些对培养箱的操作的修改的记录系统，
-能够向培养箱的操作者提供所述数据的装置。
在这个第三方面中，所述培养箱系统及其成像和图像分析能力可用于调节培养箱系统本身的操作，以优化或调节培养条件。这至少在某种程度上会加速和方便用户的工作，最大限度地减少用户交互，并且能够提高所进行的分析的再现性。因此，在没有用户干预的情况下，对收集的图像进行分析能够以某种方式改变培养箱的性能，从而改善或适应所述培养物的培养条件。
在一个特定的实施例中，使用上面给出的使用图像分析来测量培养基颜色的例子，如果培养箱系统是“灌注”型的，即，能够自动更换至少一部分培养基，那么在培养基中检测到的颜色变化可以用于激活导致更换至少一部分培养基的机构。这会导致培养基被新鲜培养基稀释，并且细胞培养装置中的培养基的颜色由此变回期望的颜色。在达到所需的颜色时，就会停止更换培养基的机构。这种调节不需要通过培养基的颜色来调节，而是可以通过存在的任何其它传感器等来调节。
在另一个特定的实施例中，图像分析可以自动且不需要用户干预地调节细胞培养室装置的旋转速度，使得球团在“静止轨道”条件下生长，这种调节对于用户来说是难以实现的，因为这种调节可能需要每24小时进行多次，持续数天、数周或数月。有多种不同的算法可以用来实现这一点。关于使用哪种算法的决定可以由培养箱处理器本身响应于所论述的细胞培养室中的细胞或球团的图像分析即时地做出。
细胞培养室装置的旋转速度调节的这种改进会导致实验中和实验之间的再现性的进一步提高，并导致由用户有意或无意地引入的主观变化的减少。
根据这个实施例，通过图像分析获得的被分组为球团的元素的分布可以用于调节转动细胞培养室装置的旋转器的旋转速度。随着球团的培养，它们因细胞的增殖而变大。随着它们变大，相对于它们排出的水的体积，它们也会变重。如果细胞培养装置的旋转速度保持不变，那么球团会承受增大的剪切力和碰撞力，并且气体和营养物交换会减少，所有这些都可能对它们的生长有害。
实际上，为了防止正在生长的球团随着变大而沉入底部，需要提高旋转器的转速，以实现上面提到的“静止轨道”。例如，需要以大约4rpm旋转分散的单细胞的“幼培养物”。随着时间的推移，这些细胞会形成球团。在大约21天后，需要以大约18rpm的速度转动细胞培养室装置，而在大约42天后，速度需要为大约40rpm(实际速度会取决于细胞类型和所用的培养基)。图像分析的“输出”之一可用于调节驱动图像中的细胞培养室装置的电动机的rpm，直到球团处于静止轨道中。这种计算应不断重复(例如最初时每10-30分钟进行一次)，直到球团达到它们的静止轨道。此后，重复计算的频率应该越来越低。算法也可以允许提高重复频率(例如如果在球团处理后需要提高rpm的变化程度)。可以记录每一次rpm调节。
可以通过许多方法找到使球团到达其静止轨道的rpm，下面说明四个例子。在这些例子中，假定细胞培养装置沿顺时针方向旋转，图像的顶部与细胞培养室的物理顶部对应，不存在气泡，并且球团看起来比背景暗(即，它们受到背面照射)。下面提供的例子的共同之处在于，这些计算用于控制驱动图像的细胞培养室装置的电动机的转速(rpm)。图4提供了以不同速度运行的细胞培养室装置中的球团的分布(相同龄期并在相同的培养基中)的例子。
在第一个例子中，细胞培养室图像例如被分成区、部分、区域、片段等，如图5所示(所述区不一定必须具有相同的面积，并且可以是交叠的)。图中的区的实际数量、形状和尺寸仅仅是示例性的，并且在实际应用中可以与所示的不同。此外，这些区的位置会取决于旋转方向(顺时针或逆时针)。由于潜在的边缘效应(例如培养室边缘处的光学像差和反射)，可以将位于区30(非常靠近细胞培养室图像边缘的圆形区)中的所有像素位置值排除在进一步计算之外。可以按相同的方式排除其它元素(例如前端口(24))。然后计算区31和细胞培养室的其余部分(33+32)的平均像素强度(API)。如果区31的API小于区33+32的API，则表明球团主要存在于细胞培养室的底部，这表明rpm太低(图3中所示的情况为“非常慢”)(在这个例子中，球团吸收光，因此是暗的，因此对高(亮)背景值贡献低“像素值”)。这会导致电机的rpm提高。区31的实际位置会取决于实际转速和所用的培养基的粘度。在非常低的rpm速度下，区31会处于细胞培养室图像的底部，而在越来越高的速度下，区31会沿着旋转方向从底部逐渐移位。
在与上述算法互补的算法中，区32代表细胞培养室图像的外侧区域的环形区(在这种情况下包括区31)。如果区32+31的API小于剩余的区(33)，那么球团位于细胞培养室的外边缘处，这表明球团被向心加速度压出(如图3中的“非常快”所示)，即，rpm设置得太高，需要降低。
因此，这两个图像分析子程序的组合(其中一个在速度太低的情况下提高速度，另一个在速度太高的情况下降低速度)会改善rpm速度的调节，在这种调节中，球团会在细胞培养室内保持或多或少的均匀分布(如图3中的“正确”所示)。
其它区的组合可用于类似的“反馈调节”。这些组合可以是：区31可以是下半圆(图6中的区36+37)，而区32+33可以是上半圆(图6中的区34+35-半圆的实际位置需要沿旋转方向位移，使得分界线不是水平的，而是倾斜一定角度(该角度会取决于实际rpm和所用的培养基的粘度))。在这种情况下，下半圆(区36+37)的API小于上半圆(区34+55)的API会表明rpm太低。
另一个方案是将细胞培养室图像分成四个基本相等的区(图6，区34、35、36和37)，这四个区是被在细胞培养室图像的中间以大约90°的角度彼此相交并且以与竖直方向成大于45°的角度(线a--a)和细胞培养室图像相交的两条线分开的。若区36的API大于区34或者区37的API大于区35，则应提高rpm。如果存在气泡，那么可以界定这些区，以排除会存在气泡的区域(在细胞培养室的顶部，主要在区34中)。
其它计算方法能够达到相同的结果，但是上述方法的优点在于，通过计算各区的API，不需要调整面积的差异(例如因前端口图像元素(24)的存在所致)，也不需要将球团“识别”为特定的图像元素。
在第二个例子中，使用上述图像分析算法来识别球团，可以使用区内的每单位面积的球团的数量、面积或体积来代替API，以获得相同的结果。
在第三个例子中，可以按与细胞培养室装置相同的速度旋转四个虚拟区(如图5所示)。在这种情况下，正确的rpm速度应是四个区中的每一个中的API或球团的数量(或其它属性)保持最小变化时的速度。在理想速度下，球团相对于细胞培养室装置不移动，或移动较慢，因此各个区的API(或选定的其它属性)会保持不变。较慢的速度导致球团在细胞培养室装置中翻滚(在图3中被示为“太慢”)。因此，应降低rpm速度，直到刚好检测到翻滚运动，然后增大rpm速度，使其回到先前的值。
在可用于对rpm进行微调的第四个例子中，通过将图像位置的保持(如上文所述，使细胞培养室的图像以与细胞培养室向前旋转相同的速度向后旋转)与各个球团的跟踪相结合，所述算法可以测量所有球团行进的平均矢量距离(不考虑角度)，并提高rpm速度。如果这导致所述平均矢量距离的减小，那么所述算法可以进一步提高速度。但是，如果这导致所述平均矢量距离的增大，那么所述算法应降低rpm速度。
这种算法可以每次使用一个或更多个图像的平均值。它可以周期性地运行，所述周期可以由在算法的前一次运行期间进行的改变的程度确定。
所说明的与第一个例子类似的方法具有的优点是，需要执行的计算少得多，即，这能够更快地计算。这种方法可用于其中的球团具有高质量和均一性(如使用上述的一些参数所定义，例如平均直径的标准偏差(SD)、其X、Y的SD或者X和Y尺寸之间的差异或圆度的SD)的培养物。
当质量和均一性不是很高时，所说明的与第二、第三和第四个例子类似的方法会具有优点。使用这些方法，非球团的元素被排除在计算之外，从而改善了球团的rpm调节。
所说明的与第三或第四个例子类似的方法的优点是它们实现对rpm的微调。但是，它们需要强大的计算能力，因此只有在其它方法不够精确(在这种情况下定义为提供随着时间显著振荡的rpm)时才可以使用。
对于使细胞培养室装置沿着两个或三个相互垂直的方向旋转的随机定位装置(即，旋转器)，需要在这些计算中考虑到Z维度，以便调节rpm。
换句话说，有多种方法可以使用从图像分析得出的测量值来确定使用哪种子程序来调节细胞培养室装置的rpm。
在另一个实施例中，光源(前面照射和背面照射)和监测装置的应用可以与细胞培养室上、培养基中以及细胞培养室中的细胞或球团上或细胞或球团中的传感器的存在相结合，从而向用户提供关于培养物或其中发生的生物过程的大量灵敏且精确的数据。图像分析可以为用户提供传感器输出数据的实时反馈。
因此，在这个实施例的另一个应用中，通过图像分析被分组为球团的元素的面积可用于提供对球团中或整个细胞培养室装置中存在的DNA、RNA、蛋白质或细胞数量的估计，而无需将细胞培养室装置从培养箱系统中取出，也无需停止其旋转。这两种方法都用于保持球团的生长条件，从而最大限度地减少细胞的扰动。Fey和Wrzesinski、Wrzesinski等人和Fey等人在他们的出版物中说明了从培养箱中取出生物反应器，并将其固定地放置在摄像机系统下(因此对细胞的生长有负面影响)。然后，他们拍摄了培养物的照片，并在2012年(PMID 22454432)、2014年(PMID 25222612)和2020年(PMID 32905230-参见该出版物中的补充信息表1)使用查找表(LUT)将球团的平均“阴影面积”(在这些出版物中称为阴影面积，但在此仅定义为元素面积)转换为球团中存在的细胞的数量、DNA或蛋白质的数量。LUT的精确值取决于实际的细胞系和所用的生长条件，但是该原理对于任何细胞类型或生长条件都是相同的。知道了被分组为“球团”的每种元素的面积，可以非侵入性地推断出细胞培养室装置中的细胞总数或DNA或蛋白质的量。在本文中说明的方面中，进行这些测量时能够最大限度地减小细胞的扰动，这允许根据需要频繁地进行测量。
如果每隔一段时间重复这种测量，那么就能够随着时间跟踪细胞培养室中的细胞的增殖，从而将数据呈现给用户，同时最大限度地减少用户的交互或工作。
此外，然后可以自动地将生长曲线与先前的生长曲线进行比较，并且，若该曲线从“正常”生长曲线偏离预定的程度，则程序能够向用户发出通知消息。例如，这种信息也可以用在灌注型仪器中，以提高培养基更换的速率，使得生长种群不会缺乏特定的营养。
如果以任何方式对细胞培养室中的球团进行了处理(例如，使用化合物(例如药物、候选药物或“靶向”药物)或化合物的混合物(例如植物提取物)进行处理，改变生长培养基，或改变温度、pH，或者用电磁辐射照射细胞培养室(培养室对电磁辐射的波长是至少部分地透明的))，那么能够非侵入性地测量所述处理对球团增殖的影响。然后可以将这个“处理的”生长曲线与(先前的)对照“未处理的”生长曲线进行比较，如果该曲线偏离对照生长曲线，那么程序能够向用户发出通知消息。此外，可以以类似的方式观察向细胞培养室中添加特定类型的细胞或从细胞培养室中除去特定类型的细胞的效果。
根据另一个实施例，许多类型的传感器可以与在本文中说明的细胞培养室结合使用，以检测特定的问题。传感器还没有被内置到旋转器型细胞培养装置中(或与其结合使用)，这通常是因为没有充分或均一的进入、穿过或离开细胞培养室的光或电磁辐射路径。包含这样的传感器、电磁辐射(或其它)源和监测装置所提供的显著优点是，能够从细胞培养物中收集生物数据，而不会干扰提供给细胞的生长环境，从而允许频繁、重复和自动地进行这样的测量。电磁辐射的路径至少在电磁辐射源与监测装置之间应基本上是光学上无障碍的和均一的(除了可以包含在内以增强照射的均匀性的装置(例如散射器)以及传感器本身之外)。
理想情况下，这些传感器应是无毒的(由存在的浓度限定，不影响细胞的生长或不与细胞培养装置中的被研究的物质发生化学反应)。还可以将它们换成类似的传感器或测量不同化合物或属性的传感器。传感器不一定必须给出刻度读数，但是可以被构造成在达到某一条件时给出特定信号。该信号可能是旋转或氧化应激、pH或任何其它属性。当用特定波长的光或其它电磁辐射照射传感器时，或者当传感器产生(以不同波长发射或再辐射)特定波长的光或其它电磁辐射时，这种传感器的输出通常是最清晰的(具有最高的信噪比)。
在一些实施例中，尤其是在采用传感器的实施例中，可以选择LED或激光光源来提供特定波长的光，或者所采用的LED或激光器可以是可调的，以产生不同波长的光。可调谐激光器在商业上可以从许多来源获得。使用附加特征(例如滤光器、衍射光栅)来允许或阻挡特定波长是提高信噪比的可选方法。
一些传感器使用化合物(例如对pH值、氧分压或葡萄糖敏感的化合物)，该化合物被作为“点”或作为小贴片或垫的一部分施加到细胞培养室的内表面上(这种内表面还可以有利地包括被插入到端口中并与培养基接触的塞子的表面)。这种传感器的照射导致信号(通常是电磁信号)的产生，该信号可以被适当的接收器(例如监测装置或无线电接收器)捕获。这方面的一个例子是由PreSens(德国)生产的被称为Fibox 4trace的“非接触式”氧传感器设备(仪器)、以及光纤和氧传感器Spot SP-PSt6-NAU。PreSence还生产类似的pH和二氧化碳传感器。
有许多葡萄糖传感器可用于测量细胞培养室中的葡萄糖浓度。
球团中的细胞可以使用葡萄糖作为它们的能量来源之一(葡萄糖通常是主要能量来源)，因此，随着时间的推移，细胞的活性会导致培养基中的葡萄糖水平下降。如果培养箱系统是“灌注”型的(即，能够自动更换至少部分培养基)，那么与葡萄糖水平相关的数据可以用于激活更换至少部分培养基的机构，并且这样做会导致葡萄糖水平的提高。
在其它实施例中，其它类型的传感器可以是添加到生长培养基中的化合物，并且可以以类似的方式读取(例子有上述的酚红、溴甲酚紫和品红)。
在其它实施例中，其它类型的传感器可以是附着(或吸附)或吸收到细胞(外部或内部)的物质，或者是可溶于细胞或细胞部分的物质(例如可溶于膜或特定的膜)的物质。还有一些传感器是细胞的一部分(结合到脂质、蛋白质、核酸或细胞中的任何其它成分中)，并且可以按照与上述方式类似的方式读取。有许多这样的例子，包括(但不限于)荧光染料(例如荧光蛋白(例如Scott,2018doi:10.1038/s41598-017-18045-y或Bukhari 2019,doi:10.1016/j.tcb.2019.08.004)、标记抗体(可从许多公司获得，例如：Creative Biolabs、Nanostring、Antibodies Online和Genescript(后者提供荧光标记抗体的服务))；二元染料(例如Marti等人，2007doi:10.1016/j.tet.2006.08.109)、化学或荧光纳米传感器(例如Ahmad等人，2020doi.org/10.1038/s41598-020-57654-y以及Fu和Ma，2020doi.org/10.1039/D0NR02844D)或适体、或其它化合物。这些传感器可以按多种方式读取。这些方式包括化学发光、荧光、荧光共振能量转移(FRET，例如Berchner-Pfannschmidt等人，2008doi:10.1183/09031936.00013408)、生物发光共振能量转移(BRET)，或者通过使用有机薄膜晶体管(OTFT)(包括有机场效应晶体管(OFETs)和有机电化学晶体管(OECTs)读取)。El-Ansary和Faddah在2010年综述了一些用于诸如葡萄糖、谷胱甘肽、胆碱、NAD+乳酸盐、甘油三酯、尿素、蛋白质(例如IgG和C-反应蛋白)以及类固醇等化合物的纳米颗粒生化传感器(doi:10.2147/NSA.S8199)。
在所有的纳米传感器中，核苷酸(DNA、RNA、LNA等)适体的独特之处在于可以选择与特定分子(例如抗生素、CEA或ATP)或分子部分(例如表位或翻译后修饰)有选择性地结合的特定核苷酸序列。然后可以将纳米传感器序列“调整”(通过对序列进行较小的修饰)到该分子的特定浓度范围，并提供实时反馈。一些传感器是“双重”的，因为它们在同一个结构中发射两种“报告”荧光波长，其中一种是组成性活性的，另一种是兼性活性的(这种活性依赖于所研究的特定分子的浓度)。这种双系统的优点在于能够修正细胞中存在的传感器的实际量，因此能够提供一种在不同培养物之间进行读数归一化的方法，而不论结合了多少传感器。
因此，在另一个实施例中，传感器可用于提供在细胞中发生的或作为细胞活动的结果的物理、化学和生物过程的数据。根据传感器的性质，可以在操作者的“请求”下或在数秒、数分钟、数小时、数天或更长时间内以预编程的时间间隔(这种时间间隔可以是传感器允许的频率)对其进行“询查”，从而允许操作者以非侵入的方式跟踪细胞培养室内的动力学过程。从传感器输出得到的数据在某些情况下(如上文所述)可用于调节球团的生长环境，无论是调节新鲜培养基的供应、细胞培养室装置的旋转速率、传感器询查的频率、还是某些其它参数。
由于存在许多类型的传感器，并且它们可以彼此独立地工作并且能够吸收和发射不同波长的光，因此很有可能在任何时间在特定的细胞培养物中存在不止一种传感器的组合。例如，如果在两种不同类型的细胞中内置有两种不同的颜色传感器，那么就能够监测培养物中的细胞类型的比例。如果在同一个细胞中内置有两种不同的颜色传感器，那么它们可以用于跟踪两种不同的生化途径的活动(例如Bervoets Charlier，2019https://doi.org/10.1093/femsre/fuz001和Rosenthal等人，2018,DOI:https://doi.org/10.7554/eLife.33099)。
图像分析输出的不同方面的组合可用于对收集的数据进行归一化。来自不同细胞培养装置(每组中可能有一个或更多个装置，并且可能位于不同的培养箱中)的数据组合可用于比较对照样品和处理的样品。这种处理的数据也可以实时地提供给用户。
因此，根据另一个实施例，可以利用如上文所述地使用LUT和球团的阴影面积等计算的DNA、蛋白质或细胞的量(或任何其它传感器参数)对部分数据进行归一化。以这种方式对数据进行归一化允许从测量的传感器输出中排除细胞随着时间增殖等因素的影响。出于归一化目的的测量可以在传感器询查的同时(或之前或之后不久)进行，以产生最准确的数据。但是，如果细胞增殖缓慢(相对于正在研究的过程)而传感器询查很频繁或者是在较短时间内进行的，那么为所有传感器数据使用同一组归一化数据可能是可接受的。
在这个实施例的一个具体应用中，“标准”生长曲线的数据可以从至少一个但可能不止一个细胞培养室(作为“对照”培养室)获得，而处理的球团的数据可以从至少一个其它细胞培养室但可能不止一个与对照细胞培养室并行生长(在理想情况下同时且可能位于同一个培养箱单元内)的细胞培养室(作为“测试”培养室)获得。与目前以逐步方式或在不同仪器中进行实验时获得的再现性和实验精确度相比，这会达到更高的再现性和实验精确度。此外，可以自动地对比来自一组或更多组细胞培养室装置的数据，以跟踪至少一组的治疗效果(如上文所述)。因此，所述培养箱系统能够以非侵入的方式使用从图像分析获得的数据实现高级数据分析。
在一些实施例中，所述一个或更多个处理单元被配置成从所述一个或更多个监测信号中提取或导出数据，并基于提取或导出的数据的一个或更多个特征将其分类成不同的类别，其中这些预定类别中的至少一个与细胞或细胞集落对应，并提供关于随着时间推移的细胞增殖的数据。在另外一些实施例中，关于细胞增殖的信息对用户是可视化的。
根据另外的方面和/或另外的实施例，提供一个或更多个处理单元(例如在本文中公开的培养箱和/或计算机的处理单元)，所述处理单元被配置成执行在本文中公开的一个或更多个图像分析方法或其步骤。在一些实施例中，所述培养箱和/或用户界面装置还被配置成对至少一些(例如所有的)细胞培养室装置执行数据记录和/或备档，例如收集和存储数据，例如旋转速度、生物量(DNA蛋白质、细胞数量)、生长速率、大小和标准偏差(再现性)、以及任何传感器输出，每次测量是随着时间进行的，并且例如包括平均值以及暂停(无旋转)的持续时间和次数等。至少在某些情况下，记录对培养箱功能进行修改的数据及其执行时间、以及发送给用户的任何通知。例如，可以使用视频和/或静止图像以及来自图像分析的数据作为补充。数据记录或文档记录的数据例如可以存储(例如还存储)在云计算环境中。
用户界面装置例如可以被配置成对由培养箱的监测装置获得的信号进行在线监测，存储这些信号，进行图像分析和输出所进行的任何图像分析(例如如图7A-7D中的任何一个所示的一种或更多种)。
在一些实施例中，所述培养箱还被配置成经由网络接收由用户界面装置和/或其它的外部计算装置(例如客户端、服务器、主机等)获得的用户输入控制数据，并响应于至少一部分接收到的用户输入控制数据来改变或调整操作。
在另外一些实施例中，所述培养箱(例如主单元)被配置成接收进一步的用户输入控制数据，并且将其中的至少一部分传送至另一个培养箱(例如从单元)，其中所述另一个培养箱被配置成响应于至少一部分接收到的进一步的用户输入控制数据来改变或适应操作。
定义
在本文中使用的所有标题和副标题只是出于方便的目的，不应被认为以任何方式构成对本发明的限制。
术语“细胞培养”在本文中指将通过本领域已知的任何方法获得或最初培养的任何种类的细胞、细胞集落、组织样结构、组织活检、球团、类器官或类似样品保持在存活状态。
本文中的术语“细胞”指来自任何类型的活生物体(无论是古细菌、原核生物还是真核生物)的原代、永生或干细胞(包括多能干细胞或(通过任何方式)诱导的多能干细胞)或遗传修饰细胞，并且还包括病毒或需要活细胞复制的其它实体。
术语“图像处理”经常(但不总是)应用于操纵整个图像以获得增强图像(例如调整对比度或亮度或旋转图像)，而术语“图像分析”经常(但不总是)应用于从图像中提取有意义的信息(例如识别图像的部分、特征或元素，例如识别风景图像中的树)。这两个术语(图像处理和图像分析)在本文中主要是根据这些定义使用的，但是在本文中也可以互换使用。
术语“监测装置”指能够在培养箱系统运行期间的任何时间记录或检测关于细胞培养室或细胞培养基或其内容物的一个或更多个特征的任何装置。
“监测信号”是使用监测装置产生的任何信号，包括但不限于记录、可视化、视频、图像、频率、强度和光谱数据。在至少一些实施例中，所述监测信号包括或代表数字图像或数字视频。
除非另行声明，否则在本文中提供的任何和所有实例或示例性语言的使用仅仅是为了更好地示出本发明，并非构成对本发明的范围的限制。本说明书中的任何用语都不应被解读为表示对本发明的实践至关重要的任何未要求的要素。
本发明包括适用法律所允许的对所附权利要求中所述的主题的所有修改和等同内容。
附图说明
图1示出了用于三维(3D)培养细胞的生物反应器的一个实例的透视图。
图2示意性地示出了如本文所公开的培养箱系统(前面照射和后面照射)中的替代照射路径的一个示例性实施例的示意性透视侧视图。
图3示意性地示出了细胞培养室装置的第一(例如前面)平面视图图像。
图4示意性地示出了在细胞培养室的5种不同转速下相同大小的球团的分布。
图5示意性地示出了将细胞培养室的图像划分成区的一种方案，图像分析可以使用该方案来调节细胞培养室装置的旋转速度。
图6示意性地示出了将细胞培养室的图像划分成区的另一种方案，图像分析可以使用该方案来调节细胞培养室装置的旋转速度。
图7A-7D示意性地示出了实现在本文中说明的一些功能的相应示例性实施例的计算机程序流程图。
具体实施方式
图1示意性地示出了细胞培养室装置1的一个实例的透视图，其中示出了可以在这种装置中找到的一些元件。具体而言，附图标记2表示基本上透明的主观察端或部分。在这部分后面是细胞培养室3的外壳。附图标记4代表位于允许进入外壳中的周向端口中的塞子。附图标记5代表位于允许进入外壳中的前端口中的塞子。附图标记6是可以用作基准标记的细胞培养室装置的元件。在它的每一侧设有一个气体交换口7(具有入口和出口)。气体交换端口7的入口和出口限定或促成元件6，从而使其适合于基准标记。也可以使用条形码(例如图2中的8或图3中的23)等作为基准标记。
图2示意性地示出了在本文中公开的培养箱系统中的两个不同照射路径的一个示例性实施例的示意性透视侧视图。附图标记10和10’分别表示后照射光源和前照射光源，点划线分别表示形成的光路。附图标记1是在本文中公开的细胞培养室装置，而附图标记3是在其中培养细胞或细胞团的细胞培养室(外壳)。附图标记11表示监测装置。附图标记12、12’、13、13’、14和14’代表一个或更多个可选的滤光器或透镜，它们用于有选择性地包括或排除特定波长的光，或者将光导引至细胞培养室装置1和从细胞培养室装置1引导光。附图标记6是基准标记(例如或优选如图1所示)，附图标记8是条形码或类似/其它的标识符，这些标记或标识符在被置于包括多个这样的细胞培养室装置的培养箱系统中和/或跨多个培养箱系统布置时，可用于标识特定的细胞培养室装置。
图3示出了在图1中示意性地示出的细胞培养室装置1的第一(例如前面)平面图像20。由虚线21包围的区域是图像中的与细胞培养室3对应的部分。附图标记22和23分别是与基准标记6和条形码8对应的图像部分。附图标记24和25分别是与前端口和周向端口(以及塞子)对应的图像部分。附图标记21内的光点(例如26)是球团(在此是使用前面照射观察到的)。图3还示出了许多加湿元件(在区域21/细胞培养室3的圆周外部被视为球团，在此为水珠的形式)。在至少一些实施例中，所述加湿元件被配置成对与细胞培养室3接触的气体交换界面或外周气体渗透膜的至少一部分附近的空气或气体加湿。
图4示意性地示出了细胞培养装置外壳3中的细胞集落或球团的典型分布的五幅示例性图像，外壳3以从非常慢、太慢、正确、到太快和非常快的五种不同速度旋转。箭头表示旋转的速度和方向。应注意不同图像(图4A到4E)中的球团的不同分布。为了清楚起见，排除了许多细节(例如前端口)。
图5示意性地示出了细胞培养室的图像的区、面积、部分、片段等、以及不同区域的示例性实例，它们分别被标记为30、31、32和33，用于不同的实施例(例如，优选地如结合图7A-7D(尤其是图7C)所公开的实施例)的图像分析。在图中示例性地示出了这些区域的实际尺寸和分布，并且，可以使用许多其它组合和形状。箭头表示旋转方向。区30是一个较窄的区，在该区域中会出现潜在的边缘效应(例如培养室边缘处的光学像差和反射)，因此可以将其从图像分析排除。在调节细胞培养室装置的旋转速度的实施例的一个实例中(例如参见图7C的方案1)，当rpm低于最佳值时，使用区31和(32+33)进行图像分析，当rpm高于最佳值时，使用区(31+32)和33进行图像分析。区31在本文中也可被称为第三区域，区32在本文中可被称为第一区域，区33在本文中可被称为第二区域。
图6示意性地示出了细胞培养室以及不同区域的示例性实例的第一(例如前面)平面视图图像，这些区分别被标记为30、34、35、36和37，用于不同的实施例(例如，优选地如结合图7A-7D(尤其是图7C)所公开的实施例)的图像分析。箭头表示旋转方向。虚线(a--a和b--b)示出或限定了另一个调节细胞培养室装置的旋转速度的实施例(例如参见图7C的方案2)的细胞培养室图像的不同区、区域、部分、片段等。在这个实例中，将区(36+37)与区(34+35)进行比较，以调节rpm的速度。在一个替代实施例中，可以将36与34比较。a--a通常与b--b成直角。a--a偏离竖直方向(旋转方向)的程度通常取决于旋转速度、培养基的粘度和球团的尺寸。区34在本文中也可被称为第六区域，区35在本文中也可被称为第七区域，区36在本文中也可被称为第五区域，区37在本文中也可被称为第四区域。
图5和图6中所示的区涉及图像分析中的不同区域，而不涉及细胞培养室本身中的任何物理区域。换句话说，这些区可以被认为是用于划分细胞培养装置图像的不同区域的“切割模板”。这样，区模板不会(随着旋转的细胞培养室装置)旋转。特定的区模板取决于所使用的细胞培养室装置的具体物理设计(从被监测装置监测的前面/侧面看)。
图7A至7D示意性地示出了执行本文所述的图像处理和/或图像分析功能(包括调节细胞培养室装置的旋转速度和使用传感器提取更多信息)的各种实施例的计算机实现的程序或方法的流程图。待处理和/或分析的图像通常由本文中公开的一个或更多个监测装置获得或提供，例如一个或更多个成像或视觉系统或装置，例如一个或更多个摄像头、CCD等。根据所示的流程图，对于特定的细胞培养室装置(例如或优选在多个细胞培养室装置中)，当所论述的装置被安装在适当的培养箱系统或类似装置的轴上时，程序“开始”701，而当该装置被再次从轴上移除时，程序“停止”，或者程序以其它方式停止。下侧的“动作”框(图中浅灰色的底部区域)示出了计算机实现的程序的步骤可以修改培养箱系统本身的操作和/或向一个或更多个用户发送数据/信息或警报的位置。
计算机实现的程序的相关部分可以针对单个图像或来自视频序列的图像执行，而某些功能通常需要多个可能连续的图像。这些图像可以是“原始的”，或者是以某种方式处理过的，以提高处理速度(例如压缩的)。
所示的是一组可能的步骤的实例，并且它们可能不需要以所呈现的顺序出现。此外，并非所有步骤都需要出现，并且有些步骤可能需要重复。对于一些单独的步骤(例如背景修正或元素识别)，有多种已知的不同算法，并且这些算法中的许多可以用于执行期望的图像处理或图像分析任务。
根据任务的不同，可以从前面(与监测装置/摄像机相同的一侧)或后面照射(例如以便看到包含的球团的轮廓)。照射(尤其是用于使用传感器进行分析)可能需要在不同颜色和/或波长和/或滤光器之间切换(手动或自动)。
在至少一些实施例中，用户能够对某些操作进行预编程(例如每6小时或以另外的时间间隔收集图像)。一些操作通常具有默认的开始值，例如rpm(开始)可以是14.0rpm，并且用户通常可以改变这些默认值。
在至少一些实施例中，存在调节rpm的其它方式。例如，用户可以手动输入应该采用的rpm。或者或另外，流程图包括使用细胞或球团的位置或轨迹的一个或更多个步骤。这些步骤没有在流程图中示出。
在流程图中使用的缩写有：CC：细胞培养室装置；II：积分强度(图像的限定区域内的像素强度值(背景减除之前或之后)的总和)；rpm：每分钟转数；Y和N：对决策点(菱形框)的肯定和否定响应(在没有给出Y或N的情况下，假定该响应不会导致特定的动作)；虚线椭圆中的双字母(例如AA周围的虚线椭圆)示出了程序的部分连接至另一部分的位置。
图7A示意性地示出了实现在本文中说明的一些功能的相应示例性实施例的(部分)流程图。
计算机实现的程序或方法在步骤701开始，并进行到步骤702，在步骤702中，由如本文所公开的一个或更多个成像或视觉系统或装置获得或捕获至少一个图像。如上文所述，根据用途/实施例，可以获得单个图像、多个后续图像或视频序列。在步骤703中，存储所获得的图像/视频(或其一个或更多个代表性版本)，并且记录相关联的时间和日期(例如连同其它相关数据/信息)。关闭培养箱门会启动检查在哪个轴上存在哪个CC的子程序，但不一定导致图像的收集(702)和后续处理(703-706)(除了确定一个或更多个轴上是否存在CC)。
步骤703进行到步骤704，在步骤704中，至少在一些实施例中并且如图所示，执行一个或更多个图像特征的调整。在步骤703中存储原始图像之后，可以处理该图像以增强后续分析。这可以包括但不限于聚焦、降噪、平滑、调整亮度和对比度(可能以非线性方式进行)。接下来，执行步骤705，在该步骤中执行对准，其中在可选地进行到步骤707之前，图像对准(沿着X和Y维度滑动图像)或使图像在特定点(例如CC的旋转中心)居中，在步骤707中，将一个或更多个获得/捕获的图像(例如视频的图像)反向旋转，以与轴或CC的当前rpm相匹配(或相抵消)。通过这种方式，图像数据被旋转，使得图像数据的内容可以在其出现或静止时被显示或处理(虽然被按照当前rpm旋转)。因此，持续或间歇地对图像数据进行处理，使得每个图像或其部分(例如与细胞培养室装置对应的部分)被“向后”旋转与在获取一个图像帧和下一个图像帧之间的时间内发生的“向前”旋转对应的量。例如，这可以简单地通过获得表示所包含的CC(通常是已知的)的当前旋转rpm的数据或值并使用该数据或值调整图像/导出反向旋转来完成(尤其是在从步骤705前进到步骤707的情况下)。或者/另外，例如这可以通过定位条形码和/或基准标记并在反向旋转的图像中使其/它们的位置保持恒定或固定来进行(尤其是在从步骤715前进到步骤707的情况下；参见下文)。如上文所述，当球团相对于细胞培养室装置处于“静止轨道”时，这有助于观察各个球团，因为它们看起来在图像中保持大致静止，从而能够进行更近的检查。使球团实际上保持基本不动会允许长时间跟踪各个球团，并允许对各个球团中的生物过程进行动力学观察。
步骤705(与可选的步骤707)并行进行到步骤706，在步骤706中，存储和记录所获得的图像/视频的(通过步骤704和705)处理的版本(或其代表性版本)。
在执行了步骤706和707之后，执行步骤708，呈现处理的一个或多个图像或视频，(例如或优选地)允许缩放和/或其它典型的用户图像操纵可能性。所述呈现例如可以在培养箱上和/或在可以本地或远程存在的连接的用户设备上进行。
应理解，步骤702至708可以间歇地或者或多或少实时地循环。如果是实时的，那么只是间歇地记录和存储。这些步骤也主要涉及图像处理，如图7A所示。在一些替代实施例(未示出)中，步骤707也可以进行到步骤706而不是步骤708，从而除了直接获得的图像之外或作为直接获得的图像的代替，允许存储和记录反向旋转的图像(否则与CC一起旋转)。
步骤706还分支到步骤709，在步骤709中，检查或测试(例如特定的)CC是否存在(在相应的轴上或在培养箱中)。在“否”的情况下，所述方法进行到步骤710，在步骤710中记录(相应的)CC不存在，在步骤711中删除本应存储的图像/视频，在步骤712中停止轴(没有CC)，并且，在步骤713中，如果CC不存在是意外的，则触发警报或向一个或更多个用户和/或其它系统/装置发送警报。例如，确定这种情况(不存在CC)是否是意外的可以响应于培养箱的值或设置和/或用户指定的值或设置来执行。
若测试709的结果为“是”，则所述方法进行到步骤714以及如所示的主要涉及图像分析的后续步骤。在步骤714中，至少在一些实施例中，为背景修正执行适当的(总体的或局部的)阈值处理等。进行到步骤715，例如或者优选地对步骤706中的存储的处理过的图像执行(处理的图像/视频中的)一个或更多个基准和/或识别标记的识别(使用图像分析进行)。在步骤716中，读取或解释所述一个或更多个识别的基准和/或识别标记，以获得基准和/或识别标记所针对的CC的相关标识符等，从而能够确定存在哪个CC。在步骤717中，若确定CC(由识别和读取的基准和/或识别标记确定)应在新的/改变的位置上(即，在新的/改变的轴上)，则调整存在CC的轴的rpm设置，以适合识别的CC的适当rpm，并且根据需要停止先前的(最后记录的CC所在的轴)。这允许无缝地改变CC位置/轴位置，例如通过在检查或使用后将CC插回到培养箱中的不同的轴上来进行，即，通过识别CC并将它现在所在的任何轴的rpm调整为正确的值(先前与CC相关联的值)。
在步骤718中，记录所获得的CC标识符以及时间和数据。在步骤719中，计算或更新(所识别的CC的)CC使用时间(例如适应任何暂停、从培养箱移除等)。若使用时间超过预定值，则步骤720触发或发送警报。
在步骤721中，测试是否应停止轴(在其上固定有被识别的CC)。在“是”的情况下，步骤722(至少在一些实施例中)将轴旋转到预定取向(例如使用一个或更多个基准和/或识别标记)，并停止相应轴的旋转。在“否”的情况下，所述方法进行到图7B的步骤730，以进行附加的图像分析，如(图7B的)连接点723和750所示。
图7B示意性地示出了实现在本文中说明的一些功能的相应示例性实施例的(部分)流程图。
在步骤730中(从图7B的步骤721的“否”进行至此)，选择所论述的图像的一个或更多个部分，以进行(进一步的)图像分析。在步骤731中，在图像中识别CC。可以选择水珠或另一种保湿剂所在的CC的环形区域，并用于确定其中存在多少水。此外，还设有CC的圆形观察窗。在该观察窗区域内，识别所述CC的(圆形)前塞(例如参见图1的5或图3的24)，并且将图像分成塞子的内部区域(被塞子的边缘包围的图像的平坦清晰内部)和塞子的外部区域(即，圆形观察窗区域的剩余部分)(例如参见图3)。在塞子内可以布置传感器。如果是这种情况，那么在步骤732中询查传感器，如图7D所述。这可能需要预先确定颜色、波长、滤光器的组合，然后测量II。传感器可以位于塞子区域之外，如果是这种情况，那么步骤734会导致对传感器的类似询查。
在步骤736中，识别图像的元素，其中一些可以用于(通过至图7C的链接ZZ 749)调节CC的旋转速度。在步骤737中，使用众所周知的图像分析算法，通过边缘检测、阈值处理、过滤和分类来进一步识别元素。在元素重叠的情况下，可能需要通过形状、圆度和分水岭等特征对元素进行划分。然后确定每个元素的特征(包括位置、尺寸、面积、圆度、形状、光滑度，II)，并且使用这些特征中的一个或更多个将元素分类成组。然后可以将常用的统计工具应用于这些组(例如确定平均值、标准偏差等)。可以将这些组显示给用户，例如通过图像中的元素的颜色叠加或者通过图形或表格或其它方式740显示。可选地，用户可以与图像分析中使用的一些参数交互，以调整它们的功能741。参数的改变会导致图像元素的重新计算、重新识别和表示。
所识别的图像元素组之一可以与气泡(例如以高圆度、暗边缘和亮中心为特征(或者在负图像中相反))对应。如果检测到这些(在步骤738中)，则在步骤739中向用户发送警报。另一个图像元素组742可以与各个细胞(例如由尺寸表征)对应，而另一个组可以与细胞集落(“球团”或“类器官”)对应。在步骤744中，可以通过连接点743从位于细胞中或细胞上的传感器的特征或读数计算某些生物信息。这种生物信息可以是存在的细胞数量、DNA、RNA、蛋白质或其它生物标记物的含量。所有这些元素之外(但仍在CC观察窗内)的图像区域通常与细胞的生长培养基对应。这也可以包含诸如pH(例如酚红)等指标的传感器或指示器，因此图像处理可以确定细胞在其中生长的溶液的pH。用户可以为这些组、特征或特性747中的任何一个分配阈值或设定点，在该阈值或设定点处程序应该发出警报748。这个情况的一个例子可以是在图像分析计算出细胞总数(细胞+细胞集落)超过指示CC过剩的值时的情况。这可能会提示用户更频繁地拆分培养物或更换培养基。
在不同时间点收集的数据可以导致识别具有不同特征的组。例如，“细胞集落”组的平均面积可以随着时间增加745。这可以用于计算细胞的生长速率并将数据呈现给用户746。
图7C示意性地示出了自动控制特定轴上的细胞培养室装置的rpm的两种可能的方式或实施例。程序(或子程序)在措辞上指代前面的图，它将CC观察窗的图像划分为如图所示的区(分别如图5和图6中的例子所示)，并假定旋转方向是顺时针方向。为了减少“噪声”，在计算积分强度之前，可以对多个图像进行平均或以另一种适当的方式进行处理。通过增加公差值或因子x％(例如在步骤763、766、793和796-799中)，能够定义rpm可接受的速度范围。如果程序导致提高或降低rpm的动作(例如在步骤764、767、794和797中)，那么在预定时间长度(通常少于1小时，更通常大约为10分钟(取决于细胞集落的大小和细胞在其中生长的培养基的粘度)，以允许细胞集落的运动适应新的rpm速度)后，必须从步骤761或791重复图像分析。如果程序在步骤770或800得出rpm正常的结论，那么应在下一个预定时间点重复速度检查。“速度检查”应定期(例如或最好是用户可编程的)重复，例如在培养的前4天中每30分钟重复一次，之后每6小时重复一次。
上述两种方案都可以在被定义为三维球团或类器官的图像元素上执行(即，给出了除了图7C中所示的两种方案之外的另外两种方案)。在其它情况下，可以采用另一个特征(例如可以使用球团或类器官的积分面积)。例如，也可以使用从多个图像定义的球团或类器官的轨迹数据来调节旋转速度。
根据rpm控制方案1，在进行到步骤761之前，从连接点760处的其它位置(例如图7B的步骤743或749)启动所示的程序或子程序，在步骤761中，将获得的图像(例如平均的)划分为预定数量的区域(在此以三个区域为例)，这些区域与图5所示的区域对应，并被归一化为单位面积。在步骤762中，确定(图5的)所定义的区或区域31、32和33中的每一个内的积分强度(II)(像素强度值的总和(在减除背景之前或之后))。如果区或区域32(即，第一区域32)的II(例如加上某个公差值或表示为x％的因子)大于(假设前面照射或类似情况)区或区域33(即，第二区域33)的II(如在步骤763中测试的)，那么在步骤764中适当降低rpm，然后在步骤765中记录rpm的降低/将其作为记录变化。可以使用多种方式计算rpm速度的变化程度(其中一些方法比其它方法更适合不同的情况)。这些方式包括：用户定义的；rpm的默认百分比；从达到可接受的rpm所需的前一轮rpm速度变化中推导。rpm速度修改的连续重复通常会利用不断减小的步长，步长的大小例如取决于在32+x％和33之间或在36+37+x％和34+35之间的差异程度。
如果区或区域31(即，第三区域31)的每单位面积的II(例如加上某个公差值或表示为x％的因子)大于(假设前面照射或类似情况)区或区域32(即，第二区域32)的每单位面积的II(如在步骤766中测试的)，那么在步骤767中适当地提高rpm(以与针对降低rpm所说明的类似的方式)，然后在步骤768中记录rpm的提高/将其作为记录变化。
如果区或区域32(即，第一区域)的II等于区或区域33(即，第二区域)的II(可能在由公差值或因子+/-x％(如在步骤769中测试的)指示的某个阈值内)，那么在步骤770中判定当前rpm是没问题的或至少是足够的，并记录当前rpm以及这个指示。
根据rpm控制方案2，在进行到步骤791之前，从连接点790处的其它位置(例如图7B的步骤743或749)启动所示的程序或子程序，在步骤791中，将获得的图像(例如平均的)划分为预定数量的区域(在此以四个区域为例)，这些区域与图6所示的区域对应。在步骤792中，确定(图6的)所定义的区或区域34、35、36和36中的每一个内的积分强度(II)(像素强度值的总和(在减除背景之前或之后))。如果区或区域36和37(即，第四区域37和第五区域36)的II之和(例如加上某个公差值或表示为x％的因子)小于(假设前面照射或类似情况)区或区域34和35(即，第六区域34和第七区域35)的II之和(如在步骤793中测试的)，那么在步骤794中适当降低rpm(如上文所述)，然后在步骤795中记录rpm的降低/将其作为记录变化。
如果区或区域36和37(即，第四区域37和第五区域36)的II之和大于(假设前面照射或类似情况)区或区域34和35(即，第六区域34和第七区域35)的II之和(例如加上某个公差值或表示为x％的因子(如在步骤796中测试的))，那么在步骤797中适当提高rpm(如上文所述)，然后在步骤798中记录rpm的提高/将其作为记录变化。
如果区或区域36和37(即，第四区域37和第五区域36)的II之和等于区或区域34和35(即，第六区域34和第七区域35)的II之和(可能在由公差值或因子+/-x％(如在步骤799中测试的)指示的某个阈值内)，那么在步骤800中判定当前rpm是没问题的或至少是足够的，并记录当前rpm以及这个指示。
图7D示意性地示出了示例性传感器(例如或优选是如本文所公开的传感器)用于分析化学物质或在生物学上很重要的分子的用途。传感器的使用通常需要选择颜色、波长和/或位于细胞培养室装置周围或与其相连的滤光器的适当组合(例如参见图2中的12、12’、13、13’、14和14’)。传感器测量时间例如可以是用户可编程的，或者取决于其它测量(例如计算的球团的DNA或蛋白质含量)。为了减少“噪声”，在计算传感器输出之前，可以对多个图像进行平均。
根据所示的传感器分析的实施例，在进行到步骤901之前，从连接点900处的其它位置(例如图7B的步骤733、735或743)启动所示的程序或子程序。如果在细胞培养室装置(CC)、所包含的细胞和培养基中的一个或更多个中有一个或更多个用于化学物质或生物分子的传感器，那么步骤901进行到步骤902，在该步骤中读取一个或更多个传感器，以获得一种或更多种类型的传感器输出数据。在步骤905中记录至少一些获得的数据(和/或从中获得的处理或导出的数据)，并在步骤906中呈现。此外，若至少一个传感器输出达到相应的预定阈值，则步骤903触发或发送警报。另外，步骤904使用所获得的一个或更多个传感器输出中的至少一些(和/或从其获得的处理或导出的数据)来修改、启动、开始、或停止一个或更多个其它功能。
虽然在前文中示出了一些优选实施例，但是应强调的是，本发明不限于这些实施例，而是可以在所附权利要求限定的主题范围内以其它方式实施。
应强调的是，当在本说明书中使用时，术语“包括”及其语法变化形式指存在所声明的特征、元件、步骤或部件，但不排除存在或增加一个或多个其它特征、元件、步骤、部件、或者它们的组。
在列举多个特征的权利要求中，这些特征中的一些或全部可以由同一个特征、部件或项目来体现。在彼此不同的从属权利要求中所述的或在不同的实施例中说明的特定措施并非表明不能有利地使用这些措施的组合。
在权利要求中，放在括号中的任何附图标记都不应被理解为对权利要求的限制。词语“包括”不排除存在权利要求中未列出的元件或步骤。元件前面的词语“一”或“一个”不排除存在多个这样的元件。
在彼此不同的从属权利要求中所述的特定措施不表明不能有利地使用这些措施的组合。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，能够对所公开的本发明的各种实施例和/或其元素进行组合，而不会脱离权利要求所限定的本发明的范围。

Claims (19)

1.一种培养箱系统，被配置成照射至少一个或更多个细胞培养室装置并使它们围绕各自的预定轴线旋转，每个细胞培养室装置包括被配置成容纳细胞培养基的外壳、以及至少一个被配置成允许检查细胞培养基的至少一部分的观察区域，所述培养箱系统还包括至少一个照射装置和至少一个监测装置，所述至少一个监测装置被配置成提供被所述至少一个照射装置中的至少一个用电磁辐射信号照射的被照射的细胞培养基或被照射的细胞培养室的至少一部分的一个或更多个监测信号，所述电磁辐射信号优选是宽或窄波长谱的非相干或相干紫外、可见、红外和/或近红外光，并且其中所述培养箱系统还包括一个或更多个处理单元或与这些处理单元连接，所述处理单元被配置成从所述一个或更多个监测信号中提取和/或导出数据，所述数据代表细胞培养室装置本身和/或其中发生的细胞活动的一个或更多个方面。
2.如权利要求1所述的培养箱系统，其中所述一个或更多个监测信号中的至少一个包括视频信号或一个或更多个图像信号或数据。
3.如权利要求1或2所述的培养箱系统，其中至少一个或一些细胞培养室装置分别还包括一个或更多个基准标记、条形码或类似标记，并且其中所述一个或更多个处理单元被配置成使用图像分析来识别这些标记，并且响应于此来识别相应的细胞培养室装置，并且其中所述培养箱系统被配置成控制相应细胞培养室装置的旋转位置和/或旋转速度，和/或监测相应细胞培养室装置的使用。
4.如权利要求1-3所述的培养箱系统，其中所述一个或更多个处理单元被配置成通过使用基准标记或其它方式将旋转细胞培养室装置的视频或视频的一个或更多个图像保持在明显静止的位置。
5.如权利要求1-4中任一项所述的培养箱系统，其中所述一个或更多个处理单元被配置成通过反向旋转响应于旋转细胞培养室装置的每分钟转数或其它旋转速度值而确定的量来将旋转细胞培养室装置的视频或视频的一个或更多个图像保持在明显静止的位置。
6.如权利要求1-5所述的培养箱系统，其中所述一个或更多个处理单元被配置成从所述一个或更多个监测信号中提取或导出数据，并基于提取或导出的数据的一个或更多个特征将其分类成不同的类别，其中这些预定类别中的至少一个与细胞或细胞集落对应，并提供关于随着时间推移的细胞增殖的数据。
7.如权利要求6所述的培养箱系统，其中所述关于细胞增殖的信息对用户是可视化的。
8.如权利要求1-7所述的培养箱系统，其中所述培养箱系统还被配置成响应于所述一个或更多个监测信号的提取或导出数据来调节一个或更多个细胞培养室装置的旋转速度。
9.如权利要求1-8所述的培养箱系统，其中从所述一个或更多个监测信号提取和/或导出的数据是或包括从所包含的细胞培养室装置获得的或为所包含的细胞培养室装置获得的一个或更多个数字图像和/或数字视频，并且其中所述培养箱系统还被配置成通过对所述一个或更多个数字图像和/或数字视频或其部分进行图像分析来调节所包含的细胞培养室装置的旋转速度。
10.如权利要求9所述的培养箱系统，其中对包括或被划分为第一区域(32)、第二区域(33)和第三区域(31)的图像进行图像分析，并且其中所述培养箱系统被配置成沿着顺时针方向围绕各自的预定轴线旋转所包含的细胞培养室装置，从而
-若第一区域(32)的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标单独地或与增加的预定正公差值(x％)结合大于第二区域(33)的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标，则降低所包含的细胞培养室装置的旋转速度；
-若第三区域(31)的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标单独地或与增加的预定正公差值(x％)结合大于第一区域(32)的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标，则提高所包含的细胞培养室装置的旋转速度；和/或
-对于任何其它情况，保持所包含的细胞培养室装置的旋转速度。
11.如权利要求9所述的培养箱系统，其中对包括或被划分为第四区域(37)、第五区域(36)、第六区域(34)和第七区域(35)的图像进行图像分析，并且其中所述培养箱系统被配置成沿着顺时针方向围绕各自的预定轴线旋转所包含的细胞培养室装置，从而
-若第四区域(37)的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标加上第五区域(36)的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标的结果本身或与预定的正公差值(x％)相加的和值小于第六区域(34)的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标加上第七区域(35)的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标的结果，则降低所包含的细胞培养室装置的旋转速度，
-若第五区域(36)的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标加上第四区域(37)的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标的结果大于第六区域(34)的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标加上第七区域(35)的每单位面积的像素强度值之和或其它图像强度指标或类似指标的结果本身或与预定的正公差值(x％)相加的和值，则提高所包含的细胞培养室装置的旋转速度，和/或
-对于任何其它情况，保持所包含的细胞培养室装置的旋转速度。
12.如权利要求1-11所述的培养箱系统，其中所述培养箱系统包括至少两个轴或驱动单元，每个轴或驱动单元被配置成执行旋转分别连接或接收的细胞培养室装置的步骤，其中所述培养箱系统还被配置成识别在特定轴上或由特定驱动单元连接或接收的特定细胞培养室装置，并将特定轴或特定驱动单元的旋转速度调节至与连接或接收的特定细胞培养室装置相关联的旋转速度。
13.如权利要求1-12所述的培养箱系统，其中所述处理单元被配置成分析细胞培养室中的细胞或细胞集落元素的细胞培养基的一个或更多个监测信号，并估计存在的细胞数量或确定的生物分子的量。
14.如权利要求13所述的培养箱系统，其中所述生物分子是蛋白质、DNA、RNA或其它生物标记。
15.如权利要求1-14所述的培养箱系统，还包括至少一个结合到细胞培养室装置、细胞培养基和/或细胞之中的一种或更多种中的传感器，以提供化学或生物过程数据，并且其中所述传感器可能需要电磁辐射波长和滤光器的特定组合来提高信噪比。
16.如权利要求15所述的培养箱系统，其中所述传感器是pH指示器、荧光生物标记、或者化学或酶系统。
17.如前述权利要求中任一项所述的培养箱系统，其中所述一个或更多个处理单元被配置成通过从来自所述一个或更多个细胞培养室装置的一个或更多个监测信号中提取或导出数据来计算一个或更多个细胞培养室中的细胞培养过程的状态，其中所述培养箱系统还被配置成基于所计算的状态自动修改或调整培养箱的操作，和/或向用户发送警报，以警告所计算的状态，从而允许用户手动调整培养箱系统的操作。
18.如权利要求17所述的培养箱系统，其中所述向用户发送的警报在智能电话、平板电脑、计算机上或在SMS或其它电子消息中被可视化。
19.如前述权利要求中任一项所述的培养箱系统，其中每个相应的预定轴线是水平的或基本上水平的轴线。
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