JPH03156370A

JPH03156370A - 免疫測定方法および装置

Info

Publication number: JPH03156370A
Application number: JP29501589A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Takahashi; 智高橋; Kazunobu Okano; 和宣岡野; Kenji Yasuda; 健二保田; Daizo Tokinaga; 時永　大三; Kazunari Imai; 一成今井
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1989-11-15
Filing date: 1989-11-15
Publication date: 1991-07-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】【産業上の利用分野】

本発明は２粒子を用いた免疫測定方法およびその装置に
関するものである。

【従来の技術】

粒子を使用した免疫測定方法として、表面に抗体を結合
させたラテックス粒子と抗原とを反応させ、抗原抗体反
応によって生成する粒子の凝集状態を吸光度または散乱
光強度により測定して抗原濃度を測定する方法が知られ
ている（検査と技術。１６、６０７（１９８８）、ぶんせき、利、　６０５（
１９８７）など）。しかし、粒子の凝集状態は分布を持ち、−様ではないた
め、反応液全体の平均値を測定するこれらの方法では、
抗原濃度の算出に精度的な問題があり、極低濃度の抗原
量の定量などが困難であった。そこで、反応液をフローセルに導いて、セル内を流れる
粒子の散乱光または蛍光強度を測定する方法が開発され
た（日本臨床検査自動化学会会誌１１、２２６（１９８
６）、特開昭６２−８１５６７、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１８．３３（１９７７））　、
この方法によれば、個々の凝集塊の大きさを計測するこ
とができることから、抗原濃度の算出精度を向上させる
ことができる。また、蛍光粒子を用いて抗原抗体反応を
起こさせ、その凝集像を画像処理することにより凝集状
態を解析し抗原濃度を算定する方法もある（特開昭６４
−３５３７３）　。上記従来方法は、ホモジニアス系でラテックス粒子表面
の抗体（または抗原）と抗Ｈ（または抗体）とが反応し
て凝集をおこすことを利用している。そのため、抗原過
剰量域で抗原抗体反応が抑制される現象、いわゆるプロ
ゾーン現象が避けられない。また、試料中に共存する散
乱体や、色素等の吸収体・蛍光体の影響を完全に除去す
ることは困難である。さらに、抗原と抗体とが１対１に
結合するとは限らないため、凝集塊の数を計数する従来
方式では特に極低濃度領域での計数値の誤差が発生しや
すいという問題がある。プロゾーン現象や共存物質の影響を受けないためには、
ヘテロジニアス系の反応方式が有効であり、特開昭５６
−１５１３５７のような方法がある。しかし、この方法
では簡便性・多項目測定が可能になるが、高感度化に対
する配慮が成されていない。

【発明が解決しようとする課Ｍ】

本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解決し１粒子
を利用した高感度な免疫測定方法およびその装置を提供
することにある。

【課題を解決するための手段】

上記目的は、測定抗原（または測定抗体）に対する抗体
（または抗原）を固定化した反応容器と、測定抗原（ま
たは測定抗体）に対する抗体（または抗原）を結合させ
た粒子を使用し、反応容器に固定化された抗体（または
抗原）と測定抗原（または測定抗体）と粒子に固定化さ
れた抗体（または抗原）とを抗原抗体反応により結合さ
せることによって粒子を反応容器に捕捉し、この捕捉し
た粒子数を計数することにより達成できる。また粒子に結合した抗体（または抗原）に対す１覧り抗体を結合した別の粒子を加えて１反応容器に捕捉し
た粒子を核にした凝集塊をつくり、その凝集塊の数を計
数することによっても達成できる。反応容器中の粒子または凝集塊の数を計数するには１粒
子または凝集塊の像を画像に゛より捕らえてそれらの数
を計数する方法、粒子または凝集塊による散乱光強度か
ら算定する方法、粒子または凝集塊の結合した反応容器
の透過光強度から算定する方法がある。画像により１粒子または凝集塊の数を計数するには、顕
微鏡、画像入力装置（ＴＶカメラ等）。及び画像処理装置を使用し、画像入力装置からの像を画
像処理して粒子または凝集塊の数を計数することによっ
て達成できる。またこの際、個々の粒子または凝集塊の
大きさを計測し、目的の大きさの粒子または凝集塊の数
のみを計数する処理を行うことによって、ゴミ等の不純
物による計数誤差のない粒子または凝集塊の計数ができ
る。計数される粒子としては、ポリスチレン、アク度の材質
の粒子が適当である。比重が１〜、４程度の粒子のとき
、反応が効果的に行われる。またその粒径は、３μｍ以
下、特に０．１〜１μｍの範囲が適当である。この粒子
の表面に抗体（または抗原）を結合させるには、通常知
られている物理吸着、化学結合などが利用できる。なお、Ｊ：、述のような抗原と抗体との組合せの他に、
特異的に結合する物質１例えばホルモンとレセプター、
糖とレクチンなどの組合せでも同様の反応を行わせるこ
とができる。本発明によりヒトα−フェトプロティン（ＡＦＰ）、癌
胎児性抗原（ＣＥＡ）、フェリチン、風疹抗体、エイズ
ウィルス抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）な
ど種々の抗原、抗体、ホルモンなどが測定できる。（作用］反応容器に固定化した抗体（または抗原）と測定抗原（
または測定抗体）と粒子に固定化した抗、体（または抗
原）とを抗原抗体反応により結合させ、この結合した粒
子の数を計数することにより、極低濃度の測定抗原（ま
たは測定抗体）に対しては抗原（または抗体）１個に対
して１個の粒子が結合し、高感度に抗原（または抗体）
量を定量することができる。また、高濃度の測定抗原（
または測定抗体）に対してもプロゾーン現象が生じない
、また、試料中に共存する不純物や、色素等の吸収体・
蛍光体の影響を除去でき、高感度・高精度に測定抗原（
または測定抗体）を定量することができる。

【実施例１以下１本発明の実施例を、ＡＦＰを測定抗原の例として
説明する。実施例１固定化抗体の調製：マイクロプレートを反応容器とし、内面にＡＦＰに対す
る抗体を固定化する。平底のマイクロプレートの各ウェ
ルに濃度１０μｇ　／　ｍ　Ｑの抗ヒトα−フェトプロ
ティン抗体（抗ヒトＡＦＰ抗体）溶液５０μＱを注入し
、２時間反応させて抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化する。粒子標識抗体の調製：０．７６μｍ径の表面にカルボキシル基を有するアクリ
ル系粒子を標識物として使用する。粒子の表面にカルボ
ジイミド法により抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化する（固定
化量：０．７６ｍｇ／ｇ）。各種濃度のヒトＡＦＰを含む試料血清５０μＱを抗ヒト
ＡＦＰ抗体を固定化した反応容器に注入して、２時間反
応させ、測定抗原を反応容器に捕捉する。その後、０．
５％ＢＳＡを含むりん階緩衝液（０，５％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ）で洗浄し、反応しなかった抗原などを除去する１次
に、粒子濃度が０．１％になるように調製した粒子標識
抗体溶液１００μＱを注入し、５時間静置して反応させ
。反応容器に捕捉したヒトＡＦＰに粒子標識抗体を結合さ
せる０次に、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで静かに洗浄し、
余分の粒子標識抗体を除去する。なお１粒子標識抗体溶液の粒子濃度は、０．０１％から
１％が適当である。比重のやや小さいポリスチレン粒子
を使用した場合は、その粒子濃度は、０．０５％から５
％が適当である。その他の粒子についても、粒子濃度は
粒子の比重の大きさや粒径等によって決定される。第１図に平底のマイクロプレートの各ウェルに捕捉した
粒子数を計数する装置の概略図を示す。装置は（倒立型の）顕微１ｌｔ１とＴＶカメラ２と画像
処理袋′Ｉ１３、さらにモニターテレビ４と出力装置５
とで構成される０粒子の捕捉されたマイクロプレートの
各ウェル６を顕微鏡１のステージに載せ、ウェル６内の
粒子７の顕微鏡像をＴＶカメラ２で写しとる。顕微鏡像
は通常の透過像の他に位相差・微分干渉像等が使用でき
る０本実施例では、位相差像により観察した。ＴＶカメ
ラ２からの出力を画像処理袋！！３で処理する。まず、
像を８ビツトにディジタル化して画像メモリに蓄積する
。この操作を６４フレ一ム行ない、像のＳ／Ｎを良くする
。得られた画像データから粒子数を計数する。この際、
ゴミ等による計数誤差を防ぐために。各粒子の大きさを計測して１粒径が０．６μｍから０．
９μｍの粒子のみを計数した０粒径の範囲は、使用した
粒子のバラツキ、及び顕微鏡焦点位置と粒子の存在位置
とのずれ等を考慮して決定した。本方法により得たヒトＡＦＰ濃度に対する捕捉粒子数の
関係図を第２図に示す。この図を検量線として未知の血
清試料中のヒトＡＦＰ濃度が定量できる。実施例２粒子径が０．１μｍｎ度の粒子を使用した場合、光学顕
微鏡でその粒子を識別することが困難となる。そこで実
施例１で述べた方法の後、捕捉した粒子の回りに別の粒
子を凝集させて、見掛けの粒子径を大きくすることを試
みた。固定化抗体の調製：実施例１と同様の操作により、平底のマイクロプレート
の各ウェルに抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化する。粒子標識抗体の調製：０．２μｍ径のアクリル系粒子に抗ヒトＡＦＰ抗体（ウ
サギ）を固定化する。凝集用粒子標識抗体の調製：０．２μｍ径のアクリル系粒子に抗つサギＩｇＧ抗体（
マウス）を固定化する。まず実施例１と同様に、各種濃度のヒトＡＦＰを含む試
料血清５０μΩを抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化した反応容
器に注入して、２時間反応させ、測定抗原を反応容器に
捕捉する。その後、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄し１
反応しなかった抗原などを除去する０次に、粒子濃度が
０．１％になるように調製した粒子標識抗体溶液１００
μＱを注入し、３時間静置して反応させ、反応容器に捕
捉したヒトＡＦＰに粒子標識抗体を結合させる。０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで静かに洗浄した後、０゜１％
に調゛製した凝集用粒子標識抗体溶液１００μＱを加え
て３時間静置し、先に捕捉した粒子を核にした凝集塊を
形成させる。０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで静かに洗浄し、
実施例１と同様な方法で、第１図の装置を使用して、ウ
ェル６中の凝集塊７′の数を計数した。凝集塊の径が０
．３μｍから０゜８μｍの粒子のみを計数したところ、
第２図と同様な傾向の検量線を得ることができた。実施例３粒子径が０．１μｍ径度の粒子を使用した場合、その粒
子を光学顕微鏡で識別するために蛍光性の粒子を使用も
有効である。固定化抗体の調製：実施例１と同様の操作により、平底のマイクロプレート
の各ウェルに抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化する。粒子標識抗体の調製：０．１μｍ径の蛍光性のポリスチレン粒子に抗ヒトＡＦ
Ｐ抗体を固定化する。各種濃度のヒトＡＦＰを含む試料血清５０μＱを抗ヒト
ＡＦＰ抗体を固定化した反応容器に注入して、２時間反
応させ、？＋定抗原を反応容器に捕捉する。その後、０
．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄する６次に１粒子濃度が１
％になるように調製した粒子標識抗体溶液１００μＱを
注入し、３時間静置して反応させる。０．５％ＢＳＡ−
ＰＢＳで静かに洗浄する。粒子の計数方法は、第１図において（倒立型の）顕微鏡
１の代りに（倒立型の）蛍光顕微ｆＩｔ１″を使用する
０粒子の捕捉されたマイクロプレートの各ウェル６を蛍
光顕微鏡１″のステージに載せ、ウェル６内の粒子７の
蛍光像をＴＶカメラ２で写しとる。ＴＶカメラ２からの
出力を画像処理装置３で処理する。Ｓ／Ｎを良くするた
め蛍光像は１２８フレームを積算した。粒子数の計数方法には、蛍光像から直接粒子を識別して
計数する方法、画像中の蛍光強度の総和とあらかじめ求
めていた１粒子あたりの平均蛍光強度から粒子数を換算
する方法等がある。後者の方法は簡単であるが計数誤差
が大きくなるため、前者の方法で粒子数を計数した０本
方法により、ヒトＡＦＰ濃度に対する捕捉粒子数の関係
図を測定した結果、第２図と同様な傾向の結果を得るこ
とができた。本方法で、蛍光を出させるための励起光源として、蛍光
顕微鏡付属の水銀ランプの代りに高輝度のレーザーを使
えばより計測しやすくなる。また。実施例２のような凝集塊を形成させて計測する方法も有
効である。実施例４まず実施例１と同様に反応容器に抗原濃度に応じた粒子
を捕捉する。各種濃度のヒトＡＦＰを含む試料血清５０
μＱを抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化した反応容器に注入し
て、２時間反応させ、測定抗原を反応容器に捕捉する。その後、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄し、反応しなか
った抗原などを除去する０次に、粒子濃度が０．１％に
なるように調製した粒子標識抗体溶液１００μＱを注入
し、３時間静置して反応させ、反応容器に捕捉したヒト
ＡＦＰに粒子標識抗体を結合させる。０゜５％ＢＳＡ−
ＰＢＳで静かに洗浄した後、粒子数を算定する。粒子による散乱光強度から粒子数を算定した。第３図にその装置の概略図を示す、光源としてＨｅ−Ｎ
ｅレーザー装Ｗ８を使用した。波長６３２゜８ｎｍのＨ
ｅ−Ｎｅレーザー光９を反応容器であるマイクロプレー
トのウェル６部に照射する。ウェル６内の粒子７により
散乱された光１１をレンズ１３で集光し、光検出器１４
で検出した。なお。ウェル６を透過して直進する光成分１０は光トラップ１
２により光検出器１４に入らないようにした。さらに、
Ｈｅ−Ｎｅレーザー光９の強度変化の影響を除去するた
めにビームスプリッタ−１５と光検出器１６でＨｅ−Ｎ
ｅレーザー光９の強度をモニタして、光検出器１４で検
出した強度を補正した。補正の処理はコンピューター１
７により行った。本方法により得たヒトＡＦＰ濃度に対する捕捉粒子数か
らの散乱光強度の関係図を第４図に示す。この図を検量線として未知の血清試料中のヒトＡＦＰ濃
度が定量できる。実施例５まず実施例１と同様に反応容器に抗原濃度に応じた粒子
を捕捉する。各種濃度のヒトＡＦＰを含む試料血清５０
μＱを抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化した反応容器に注入し
て、２時間反応させ、測定抗原を反応容器に捕捉する。その後、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄し１反応しなか
った抗原などを除去する６次に、粒子濃度が０．１％に
なるように調製した粒子標識抗体溶液１００μＱを注入
し、３時間静置して反応させ、反応容器に捕捉したヒト
ＡＦＰに粒子標識抗体を結合させる。０゜５％ＢＳＡ−
ＰＢＳで静かに洗浄した後、粒子数を算定する。反応容器の透過光強度の変化から結合した粒子数を算定
した。第５図にその装置の概略図を示す。光源として発光ダイオード１８を使用した。発光ダイオ
ード光１９をレンズ２０で平行光とし、反応容器である
マイクロプレートのウェル６部に照射する。透過光２１
のみを効率良く検出するため、発光ダイオード光束に等
しい口径を有するスリット２２、レンズ２３．ピンホー
ル２４を通し、光検出器１４で検出した。さらに、発光
ダイオード光１９の強度変化の影響を除去するためにビ
ームスプリッタ−１５と光検出器１６で発光ダイオード
光１９の強度をモニタして、光検出器１４で検出した強
度を補正した。補正の処理はコンピューター１７により
行った。本方法により得たヒトＡＦＰ濃度と、粒子数の結合した
反応容器の透過光強度の関係図を第６図に示す、この図
を検量線として未知の血清試料中のヒトＡＦＰ濃度が定
量できる。実施例１から実施例５を通して１本実施例では、抗原過
剰領域で抗原抗体反応が抑制される現象。いわゆるプロゾーン現象が生じないため、高濃度の抗原
濃度域での定量も可能である。【発明の効果】本発明によれば、抗原抗体反応により、測定抗原量に対
して一定比率の粒子を反応容器に捕捉することができ、
また試料中に含まれる光散乱体等の影響を受けないため
、高感度に抗原濃度を定量できる効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例の画像処理による装置構成の
概略図、第２図はヒトＡＦＰの濃度と反応容器に捕捉さ
れた粒子数との関係を示した測定例の図、第３図は本発
明の一実施例の散乱光強度の計測による装置構成の概略
図、第４図はヒトＡＦＰの濃度と反応容器に捕捉された
粒子からの散乱光強度の関係を示した測定例の図、第５
図は本発明の一実施例の透過光強度の計測による装置構
成の概略図、第６図はヒトＡＦＰの濃度と粒子を捕捉し
た反応容器の透過光強度の関係を示した測定例の図であ
る。ｌ・・・（倒立型）顕微鏡、１′・・・（倒立型）蛍光
顕微鏡、２・・・ＴＶカメラ、３・・・画像処理装置、
４・・・モニターテレビ、５・・・出力装置、６・・・
反応容器（マイクロプレートのウェル）、７・・・粒子
、７′・・・凝集塊、８・・・Ｈｅ−Ｎｅレーザー装置
、９・・・Ｈｅ−Ｎｅレーザー光、ｌＯ・・・透過光、
　１１・・・散乱光。１２・・・光トラップ、１３・・・レンズ、１４・・・
光検出器、１５・・・ビームスプリッタ−、１６・・・
光検出器、１７・・・コンピュータ、１８・・・発光ダ
イオード、１９・・・発光ダイオード光、２０・・・レ
ンズ、２１・・・透過光、２２・・・スリット、２３・
・・レンズ、２４・・・ピンホール第３図第４図ヒトＡＦＰＷ度（ｎｇ１０＋Ｑ）第２図０．０００７０．００７　　０．０７　　　０．７ヒトＡＦＰｆｆｉ度（ｎｇ／ｍ　Ｑ　）第５図第６図０．０７０．７　　　７　　　　７０ヒトＡＦＰ５度（ｎｇ／ｍ　Ｑ　）

Claims

【特許請求の範囲】１、測定抗原（または測定抗体）に対する抗体（または
抗原）を固定化した反応容器と、測定抗原（または測定
抗体）に対する抗体（または抗原）を結合させた粒子を
使用し、抗原抗体反応により、粒子を反応容器に捕捉し
、この粒子数を計数する免疫測定方法。２、測定抗原（または測定抗体）に対する抗体（または
抗原）を固定化した反応容器と、測定抗原（または測定
抗体）に対する抗体（または抗原）を結合させた粒子を
使用し、抗原抗体反応により、粒子を反応容器に捕捉し
、さらに粒子に結合した抗体（または抗原）に対する抗
体を結合した別の粒子を加えて、反応容器に捕捉した粒
子を核にした凝集塊を形成し、その凝集塊の数を計数す
る免疫測定方法。３、粒子の径が３μｍ以下であることを特徴とする特許
請求の範囲第１項または第２項記載の免疫測定方法。４、反応容器に捕捉した粒子または凝集塊を画像により
識別し、その数を計数することを特徴とする特許請求の
範囲第１項または第２項記載の免疫測定方法。５、反応容器に捕捉した粒子または凝集塊による散乱光
強度から粒子数または凝集塊数を算定することを特徴と
する特許請求の範囲第１項または第２項記載の免疫測定
方法。６、粒子または凝集塊の結合した反応容器の透過光強度
から粒子数または凝集塊数を算定することを特徴とする
特許請求の範囲第１項または第２項記載の免疫測定方法
。７、画像入力装置と、画像入力装置からの像を画像処理
して粒子または凝集塊を識別し、その数を計数する装置
とからなる免疫測定装置。８、個々の粒子または凝集塊の大きさを計測し、目的の
大きさの粒子または凝集塊の数のみを計数する処理を行
うことを特徴とする特許請求の範囲７項記載の免疫免疫
測定装置。