JP2004117341A - 免疫測定試薬用カゼイン - Google Patents

Abstract

　　【課題】　標識配位子の非特異反応を防止する効果に優れたカゼイン含有免疫測定用試薬を提供すること。
　　【解決手段】　分子量が９０万ダルトンより大きな画分であるカゼイン（ａ）の含有量（重量％）が、カゼイン（Ａ）の重量に基づいて１以下であることを特徴とする免疫測定試薬用カゼインを用いる。また、分子量が９０万ダルトンより大きな画分であるカゼイン（ａ）の含有量（重量％）がカゼイン（Ａ）の重量に基づいて１以下である（Ａ）を含有する免疫測定試薬を製造する方法であって、（Ａ）を含有する溶液を２０〜６０℃で加温処理した後、（ａ）を吸着除去する工程を含むことを特徴とする免疫測定試薬の製造方法を用いる。
　　【選択図】　なし

Description

　本発明は、免疫測定用試薬に関する。より詳しくは非特異反応を低減する免疫測定用試薬に関する。

　免疫測定用試薬においては、非特異的反応を防止するため種々の蛋白質、界面活性剤等を含有することが行われている。特にカゼインは非特異的反応の防止剤として有用であることが報告されている（例えば、特許文献１）。さらに、熱処理したカゼインや分解酵素で処理したカゼインを用いることも行われている（例えば、特許文献２及び３）。
特開平１−２１７２６６号公報 特開平６−１９４３６６号公報 特開平２−３６３５３号公報

　しかしながら、従来のカゼイン含有免疫測定用試薬では、標識配位子の非特異反応の防止効果が低い場合があった。さらに、経日的に非特異反応の防止効果が低減し、測定感度が著しく低下する場合があった。すなわち、本発明は、標識配位子の非特異反応を防止する効果に優れたカゼイン含有免疫測定用試薬を提供することを目的とする。

　本発明者は上記問題を解決するため鋭意検討した結果、特定のカゼインを用いることにより上記目的を達成することを見いだし、本発明に到達した。すなわち本発明の免疫測定試薬用カゼイン（Ａ）の特徴は、分子量が９０万ダルトンより大きな画分であるカゼイン（ａ）の含有量（重量％）が、カゼイン（Ａ）の重量に基づいて１以下である点を要旨とする。
　また、本発明の免疫測定試薬の製造方法の特徴は、分子量が９０万ダルトンより大きな画分であるカゼイン（ａ）の含有量（重量％）がカゼイン（Ａ）の重量に基づいて１以下である（Ａ）を含有する免疫測定試薬を製造する方法であって、（Ａ）を含有する溶液を２０〜６０℃で加温処理した後、（ａ）を吸着除去する工程を含む点を要旨とする。

　本発明の免疫測定試薬用カゼイン（Ａ）は、標識配位子の非特異反応（特に酵素標識配位子の非特異反応）を防止する効果が極めて高い。また、経日的に非特異反応の防止効果が低減しにくい。従って、本発明の免疫測定試薬用カゼイン（Ａ）を含有する免疫測定試薬は、高感度かつ安定性の極めて高い臨床検査を可能とする。
　また、本発明の免疫測定試薬の製造方法で製造された免疫測定試薬は、カゼイン（ａ）となり得るカゼイン（ａ）前駆体が除去されているため、経日的にカゼイン（ａ）が生成することはない。従って、本発明の製造方法は、標識配位子の非特異反応を防止する効果が極めて高く、また、経日的に非特異反応の防止効果が低減しにくい免疫測定試薬を簡便に製造することができる。

　カゼインの分子量は、化学大事典ＩＩ、共立出版（１９８９）、４０９頁によると約７万５千〜３７万５千ダルトンの範囲（超遠心法）であるが、実際にカゼインを用いて免疫測定用試薬を調製した場合、分子量９０万ダルトンより大きな画分であるカゼインが存在する。これは、カゼインの一部に高分子量化したカゼインが含まれていることや免疫測定用試薬中でカゼインの一部が高分子量化すること等が考えられる。また、カゼインは免疫測定用試薬中の他の成分と結合して高分子量化すること等も考えられる。これらの高分子量化したカゼインが、本発明における分子量が９０万ダルトンより大きな画分であるカゼイン（ａ）に該当する。そして、このカゼイン（ａ）の含有量（重量％）が一定量以上になると、標識配位子の非特異反応を防止する効果が低下するばかりでなく、非特異反応が顕著になる場合がある。

　すなわち、カゼイン（ａ）の含有量（重量％）は、カゼイン（Ａ）の重量に基づいて、１以下が好ましく、さらに好ましくは０．５以下、特に好ましくは０．１以下である。カゼイン（ａ）の含有量の定量は従来公知の方法で行うことができ、例えば、ゲルろ過ＨＰＬＣにより定量分析する場合、ゲルろ過ＨＰＬＣにより得られたカゼイン（Ａ）由来のピーク面積に対するカゼイン（ａ）由来のピーク面積の割合を求めることで算出できる。この際、カゼイン（Ａ）及びカゼイン（ａ）の分子量は適当な分子量マーカー、例えばＩｇＭ（分子量９０万ダルトン）、ＩｇＧ（分子量１５万ダルトン）、フェリチン（分子量４５万ダルトン）及びアルブミン（分子量５万ダルトン）等を同一条件で分析することで、検量線を作成し算出できる。特に、カゼイン（ａ）は分子量が９０万ダルトンより大きな画分であり、分子量９０万ダルトンのＩｇＭと比較することで容易に特定できる。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動等でも同様に定量できる。

　カゼイン（Ａ）の原料としては、哺乳動物の乳汁中に含まれるカゼインを酸添加法等の公知の方法で分離精製したもの等が使用できる。例えば、牛乳から分離精製したカゼインは各種食品・医療・工業的用途に汎用され、本発明においても好適である。カゼインは通常、等電点及び溶解性等の性状の異なる複数の画分、例えば、αs−カゼイン、β−カゼイン及びκ−カゼイン等を含んでいるが、本発明においてはこれらを分画してその一部を用いてもよいが、全ての画分を使用してもよい。また、これらのカゼインに水酸化ナトリウムを付加して製造されたカゼインナトリウム等も使用できる。これらのうち、コスト及び試薬調製時の溶解性等の観点から、全ての画分を含むカゼインナトリウムが好ましい。

　カゼイン（ａ）が上記の含有量を超えて含まれている場合、（ａ）を除去することが好ましい。この除去方法としては従来公知の方法を使用して行うことができ、例えば、カゼインを適当な溶媒に溶解した後、ゲルろ過カラム等により（ａ）を除去する方法等が適用できる。この他、吸着剤（珪藻土等）で（ａ）を吸着除去する方法等も適用できる。例えば、カゼイン（ａ）を含む溶液（免疫測定試薬調整後の溶液を含む）１リットルに対し、珪藻土（例えば、商品名セライトＮｏ．５４５，和光純薬工業より購入）１０ｇ〜２００ｇを加え、室温（１０〜２５℃）で５〜６０分攪拌した後、ろ過又は遠心分離により珪藻土を除くことにより、カゼイン（ａ）も吸着除去される。
　なお、この除去工程は、免疫測定試薬を調製する前、調整中、調整した後のいずれでも（ａ）を除くこともできるが、カゼイン（ａ）を除去したカゼインを用いても免疫測定試薬に調整する工程で、カゼイン（ａ）が生じる場合があるため、カゼイン（ａ）を除く工程は免疫測定試薬を調製する最終工程で行うことが好ましい。

　また、カゼインが、カゼイン（ａ）の含有量が上記の含有量以下であっても、カゼイン（Ａ）の保存中に、免疫測定試薬の調整工程に、又は免疫測定用試薬の保存中に、カゼイン（ａ）となるカゼイン（ａ）前駆体が含まれていることが多く、この場合、このカゼイン（ａ）前駆体をカゼイン（ａ）に変化させた後、（ａ）を除くことが好ましい。
　カゼイン（ａ）前駆体をカゼイン（ａ）に変化させる方法としては、カゼインを含有する溶液（免疫測定試薬調整後の溶液を含む）を一定温度下で一定期間放置する等が適用できる。一定温度（℃）としては、２０〜６０が好ましく、さらに好ましくは３０〜５０、特に好ましくは３５〜４５である。放置期間は、温度により異なり、３５〜４５℃の場合、１〜１４日が好ましく、さらに好ましくは２〜１０日、特に好ましくは３〜７日である。温度が低くなる程、長く放置することが好ましい。
このようにカゼイン（ａ）前駆体を除いた免疫測定試薬は、経日的にカゼイン（ａ）の発生は認められない。

　本発明のカゼイン（Ａ）は種々の用途の免疫測定試薬に適用でき、例えば、免疫反応用緩衝液等の反応用試薬、抗原又は抗体を含む保存用試薬、担体のブロッキング用試薬、検体の希釈用試薬、及びＢ／Ｆ分離に使用する洗浄用試薬等に適用できる。これらの試薬は複数の用途を兼ねることも可能である。これらの用途のうち、反応用試薬及び保存用試薬に好ましく適用され、さらに好ましくは反応用試薬と保存用試薬を兼ねる免疫測定試薬、すなわち保存用試薬をそのまま反応用試薬として用いる免疫測定試薬である。

　本発明の最も大きな目的は、非特異的反応の防止、特に標識配位子の非特異反応の防止効果の高い免疫測定試薬を提供することにあるが、カゼイン（ａ）は非特異反応性（吸着性）が高く、標識配位子と非特異的に結合（吸着）することで、標識配位子の非特異反応を誘発する。カゼイン（ａ）を除いたカゼイン（Ａ）は、標識配位子と非特異的に結合（吸着）せず、標識配位子が非特異的に反応する物資をブロッキングすることで、標識配位子の非特異反応を防止する効果が生じる。従って、特に好ましい用途としては、標識配位子を含む、保存用試薬をそのまま反応用試薬として用いる免疫測定試薬である。

　本発明において、標識配位子は配位子と標識物の結合体である。配位子は、測定対象物に選択的に結合する物質、又は測定対象物と同一の免疫反応性を示す物質である。測定対象物に選択的に結合する物質としては、測定対象物が抗原の場合、配位子は、抗原に対する抗体である。測定対象物が抗体の場合、配位子は、抗体が認識する抗原である。測定対象物が糖鎖の場合、配位子は、レクチンである。測定対象物がビオチンの場合、配位子は、アビジンである。測定対象物が遺伝子の場合、配位子は、相補的な遺伝子である。測定対象物及び配位子は、抗原及び抗体の場合と同様に、その一方を配位子として使用できる。また、測定対象物に特異的に結合する配位子と、配位子に特異的に結合する第２の配位子を組み合わせて配位子として用いることも可能である。

　抗体としては、次の抗原に対する抗体が使用でき、該抗原としては、薬剤、低分子ホルモン、癌マーカー、ウイルス、高分子ホルモン、サイトカイン、各種グロスファクター、並びに前記ウイルスの適当なＤＮＡ及びＲＮＡ等が含まれる。薬剤としては、テオフィリン、フェニトイン及びバルプロ酸等が挙げられる。低分子ホルモンとしては、サイロキシン、エストロゲン及びエストラジオール等が挙げられる。癌マーカーとしては、ＣＥＡ、ＡＦＰ及びＣＡ１９−９等が挙げられる。ウイルスとしては、ＨＩＶ、ＨＣＶ及びＨＢＶ等が挙げられる。高分子ホルモンとしては、甲状腺刺激ホルモン及びインシュリン等が挙げられる。サイトカインとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２及びＩＬ−６等が挙げられる。各種グロスファクターとしては、ＥＧＦ及びＰＤＧＦ等が挙げられる。これらの抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよく、さらに抗体の分解物であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂであってもよい。

　レクチンとしては、コンカナバリンＡ（コンカナバリンＡは、Ｃ−３,Ｃ−４又はＣ−６位の水酸基が未置換のα−Ｄ−Ｍａｎを２残基以上含む糖鎖に特異的に結合する。）、ドリコスマメレクチン（ドリコスマメレクチンは、Ｄ−ＧａｌＮＡｃに特異的に結合する。）、ダツラレクチン（ダツラレクチンは、キチンオリゴ糖及びＮ−アセチルラクトサミンに特異的に結合する。）、デイゴマメレクチン（デイゴマメレクチンは、Ｎ−アセチルラクトサミン構造を持つアスパラギン複合型糖鎖に特異的に結合する。）、及びフコースバインディングプロテイン（フコースバインディンダプロティンは、Ｇａｌなどの２位に結合したα−Ｌ−Ｆｕｃに特異的に結合する。）等が使用できる。

測定対象物と同一の免疫反応性を示す物質としては、測定物質と同一の物質、同一の免疫反応性を保持した測定物質の断片、測定対象物のアナログ等が使用される。

　標識物としては、アイソト−プ［125Ｉ等］、酵素［ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及びβガラクトシダーゼ等］、蛍光物質［ユーロピウム誘導体等］、及び発光物質［アクリジウム誘導体等］等の公知のものが使用できる。これらのうち、酵素及び発光物質が好ましく、さらに好ましくは酵素である。

　配位子と標識物の結合は従来公知の方法、例えば「続生化学実験講座５免疫生化学実験法」（日本生化学会編、東京化学同人、１９８６年発行）ｐ１０２〜１１２に記載の方法で実施することができる。標識物がアイソトープの場合、例えばクロラミンＴを酸化剤として用いて放射性ヨウ素を配位子のチロシン残基に導入できる。標識物が蛍光物質の場合、例えばフルオレセインイソチオシアネートを緩衝液中で配位子に反応させると、配位子のリシン残基に結合する。標識物が酵素の場合、例えば酵素の持つアミノ基と配位子の持つチオール基をＮ−スクシンイミジル６−マレイドヘキサノエートなどのニ架橋性試薬で結合することができる。標識物が発光物質の場合、例えばアクリジニウム誘導体−Ｉ（同人化学研究所社製）を緩衝液中で配位子に反応させると、配位子のアミノ基に発光化合物であるアクリジニウム誘導体を結合できる。

　本発明における免疫反応試薬の組成は、その使用目的により自由に設定できるが、例えば溶液状試薬の場合、通常、適当な緩衝液にカゼイン（Ａ）及びその他の成分を添加したものが用いられる。この場合、カゼイン（Ａ）の含有量は（ｇ／リットル）は、免疫測定試薬の２５℃における容積に基づいて、０．０１以上が好ましく、さらに好ましくは０．１以上、特に好ましくは０．５以上であり、また、３０以下が好ましく、さらに好ましくは２０以下、特に好ましくは１０以下である。緩衝液としては、例えばトリス・塩酸緩衝液、バルビタール緩衝液及びリン酸緩衝液等が挙げられ、試薬の使用目的により適宜選択できるが、通常はｐＨ５〜９の緩衝液が用いられる。標識配位子の濃度は種々の値をとりうるが、通常は試薬の単位容積（Ｌ）当たり、０．０１〜１００ｍｇの範囲である。

　その他の成分としては、カゼイン以外の蛋白、塩、界面活性剤等が使用される。カゼイン以外の蛋白としては、例えばアルブミン（牛血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、マウス血清アルブミン、オバルブミン、コナルブミン及びラクトアルブミン等）、抗体（正常ウサギＩｇＧ、正常マウスＩｇＧ等）、ゼラチン等が挙げられる。塩としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム及び臭化リチウム等が挙げられる。界面活性剤としては、例えばソルビタンラウリン酸モノエステルエチレンオキシド付加物［例えば、ツイーン２０及びツイーン４０（ＩＣＩアメリカ社）］等のノニオン界面活性剤等が挙げられる。

　本発明の免疫測定試薬は、試薬性状及び形状等に制限がなく、例えば、溶液状試薬、乾燥試薬（顆粒状及び微粉状等）、反応管や不溶性担体をカゼイン（Ａ）でコーティングした試薬等が挙げられる。これらのうち、溶液状試薬が最も好ましく、カゼイン（Ａ）を適当な緩衝液に溶解した組成等が用いられる。本発明における免疫測定試薬が乾燥試薬の場合、上記溶液状試薬を乾燥したものが用いられる。乾燥する方法としては、例えば凍結乾燥等が挙げられる。凍結乾燥は従来公知の方法が使用でき、例えば溶液状試薬を−２０℃で凍結後、０．５Ｔｏｒｒに減圧し乾燥を開始し、最終的には２０℃、０．１Ｔｏｒｒで水分量が初期溶液試薬の０．１重量％以下まで乾燥する。コーティングした試薬の場合、上記溶液状試薬に反応管、不溶性担体等を接触後、乾燥したもの等が用いられる。例えば、不溶性担体が試験管であれば、試験管に溶液状試薬を分注後、２〜１０℃で２４時間放置後、アスピレーターで液を除き、室温（２０〜３０℃）で風乾することで作成できる。なお、コーティングする場合、不溶性担体の単位表面積（ｃｍ2）あたり０．００６〜０．０３ｍｇのカゼイン（Ａ）を含むことが好ましい。

　以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜実施例１＞
　本実施例は、本発明の免疫測定試薬用カゼイン（Ａ）を酵素標識抗体含有免疫測定用試薬に適用した際、非特異的反応が低いことを示す例である。

１．カゼインの分画
　カゼインナトリウム塩（シグマアルドリッチ製、αｓ−、β−及びκ−を含む）５ｇをリン酸緩衝液（０．０２Ｍ，ｐＨ７．２）１００ｍＬに投入し、攪拌下９５℃に加熱、溶解した後、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、カゼイン溶液Ａとした。次いでこのカゼイン溶液Ａ　２０ｍＬをゲルろ過カラム（ファルマシア製、Superdex 200 prep grade 60/600）で１ｍＬ／分の流速［リン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）使用］で分画した。そして、同一条件でマウスＩｇＭを分画した結果から、マウスＩｇＭ以下の分子量の画分をカゼイン溶液Ｂとして分取した。また、マウスＩｇＭより大きな分子量の画分をカゼイン溶液Ｃとして分取した。また、カゼイン溶液Ｂを再度同様にゲルろ過カラムで分離しマウスＩｇＭ以下の分子量の画分をカゼイン溶液Ｄとして分取した。
　カゼイン溶液Ａ〜Ｄをゲルろ過ＨＰＬＣ（カラム:昭和電工製Shodex GS-620HQ）で分析した結果、カゼイン溶液中の９０万ダルトンより大きなカゼイン（ａ）の全カゼインに対する比（重量％）は次の通りであった。
　　カゼイン溶液Ａ：　３．２％
　　カゼイン溶液Ｂ：　０．３％
　　カゼイン溶液Ｃ：９２．４％
カゼイン溶液Ｄ：　０．１％

２．試薬の調製
１）抗β２−マイクログロブリンポリクローナル抗体結合ビーズの調製
　抗β２−マイクログロブリンポリクローナル抗体（ダコジャパン社製）をｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液に２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解した。直径３．２ｍｍのポリスチレンビーズ（イムノケミカル社製）１０００個をこの溶液２０ｍｌに加え、２〜１０℃で４８時間静置させて、ポリスチレンビーズに抗β２−マイクログロブリンポリクロナール抗体を物理吸着させた。その後、溶液をアスピレーターで吸引除去し、２０ｍＬの０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）でビーズを２回洗浄し、抗β２−マイクログロブリンポリクローナル抗体結合ビーズを調製した。この抗β２−マイクログロブリンポリクローナル抗体結合ビーズを再度５０ｍＬの０．１重量％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液に浸漬し、浸漬状態で冷蔵（２〜１０℃）保存した。

２）ペルオキシダーゼ標識抗β２−マイクログロブリンポリクローナル抗体の調製
　抗β２−マイクログロブリンポリクローナル抗体（ダコジャパン（株）製）及び西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡（株）製）を用い、文献［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２（１９８２）１４１３−１４２４］に記載の方法でペルオキシダーゼ標識抗β２−マイクログロブリンポリクローナル抗体を調製し、冷凍（−３０℃）保存した。

３）免疫測定（反応）用緩衝液の作成
　牛血清アルブミン（マイルス社製）１ｇ、塩化ナトリウム０．８５ｇ、アジ化ナトリウム０．０５ｇをリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）１００ｍＬに溶解し、免疫測定用緩衝液とした。使用まで冷蔵保存した。

４）酵素標識抗体液の作成
　上記で作成したカゼイン溶液Ａ〜Ｄ及びペルオキシダーゼ標識抗β２−マイクログロブリンポリクローナル抗体を用いて次の通り酵素標識抗体液を作成した。すなわち、リン酸緩衝液（１Ｍ、ｐＨ６．０）１０ｍＬにカゼインの重量が０．１ｇとなるようカゼイン溶液Ａ〜Ｄを添加し、さらにペルオキシダーゼ標識抗β２−マイクログロブリンポリクローナル抗体を蛋白量で１００μｇ添加した後、アジ化ナトリウム０．０５ｇ及び４−（メチルチオ）フェノール０．０５ｇを加え攪拌溶解後、脱イオン水で１００ｍＬとし、これを酵素標識抗体液とした。この時、カゼイン溶液Ａ〜Ｄを種々に組み合わせて用いることで、分子量９０万ダルトン（Ｄａ）より大きいカゼイン（ａ）の割合（重量％）が下表のようになるように標識抗体液を作成し、使用時まで冷蔵保存した。

５）過酸化水素水の調製
　２００μｌの３５重量％過酸化水素水を脱イオン水１リットルに溶解し、過酸化水素水とした。使用するまで冷蔵保存した。

６）基質液の調製
　ルミノール（東京化成製）０．１８ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇを０．１Ｍ（モル／Ｌ）、ｐＨ８．５のトリス／塩酸緩衝液１リットルに溶解した。使用するまで遮光、冷蔵保存した。

３．免疫反応操作
　１２×７５ｍｍ試験管中に、免疫測定用緩衝液３００μＬ、標準β２−マイクログロブリン溶液１０μＬ（濃度０，１５，２００ｎｇ／ｍＬ）｛三洋化成工業（株）製臨床検査薬「グラザイムβ2-Microglobulin-EIA TEST」中のものを使用した。｝及び抗β２−マイクログロブリンポリクロナール抗体結合ビーズ１個を加え、３７℃で、１０分反応させた。反応液をアスピレータで除去した後、生理食塩水２ｍＬを加てビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去した。さらに生理食塩水２ｍＬを加え同様に洗浄した。次に、酵素標識抗体液３００μＬを、洗浄後のビーズに加え３７℃、１０分反応させた。反応液をアスピレーターで除去し、生理食塩水２ｍＬを加えビーズを洗浄し、洗浄液をアスピレーターで除去した。さらに生理食塩水２ｍＬを加え同様に２回洗浄した。洗浄後のビーズについて、酵素活性の測定を行った。

４．酵素活性測定操作
　洗浄後のビーズが入った試験管（１２×７５ｍｍ）をアロカ社製ルミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホルダーにセットし、基質液２００μＬ及び過酸化水素水２００μＬを加え化学発光反応を開始した。発光反応開始４０秒後から１０秒間の発光量を計測し、酵素活性を示す発光量とした。β２−マイクログロブリンポリクローナル抗体結合ビーズ１個を投入し、３７℃で１０分間反応させた。生理食塩水５００マイクロリットルでビーズを３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗β２−マイクログロブリンポリクローナル抗体溶液１５０マイクロリットルを試験管に分注し、３７℃で１０分反応させた。生理食塩水５００マイクロリットルでビーズを３回洗浄した後、基質液、過酸化水素水の各１００マイクロリットルを試験管に添加し、添加後４０秒〜４５秒の発光量を光電子増倍管を用いたルミノメーター（アロカ社製、ＢＬＲ−２０１）で測定した。

５．測定結果
　酵素標識抗体液１〜９を用いて上述の測定操作にしたがって標準β２−マイクログロブリン溶液（濃度０，１５，２００ｎｇ／Ｌ）を測定した結果を表２に示した。なお、表２中括弧内の数値はＳ／Ｎ比すなわち発光量を標準０ｇ／ｍＬの発光量で除した値である。

　酵素標識抗体液１〜５は、酵素標識抗体液６〜９より明らかに０ｎｇ／ｍＬの発光量が低く、非特異反応が抑制されていることが判る。特に標準１５ｎｇ／ｍＬでのＳ／Ｎ比で比較すると、標識抗体液１〜５は、高感度な測定に必要なＳ／Ｎ比５０以上を達成している。また、１５ｎｇ／ｍＬ及び２００ｎｇ／ｍＬと０ｎｇ／ｍＬの発光量差はいずれもほぼ等しく、特異反応は同様のレベルであり、酵素標識抗体液１〜５が酵素標識抗体液６〜９より高感度な測定試薬であるといえる。

＜実施例２＞
　本実施例は、本発明の免疫測定用試薬用カゼイン（Ａ）を酵素標識抗体含有免疫測定用試薬に適用した際に、経時的に劣化した場合でも非特異的反応が低いことを示す例である。

１．酵素標識抗体液の劣化処理
　実施例１で作成した酵素標識抗体液１〜９を２５℃で１０日間放置し、加熱による劣化処理をおこなった。この酵素標識抗体液をそれぞれ１’〜９’とした。

２．酵素標識抗体液１’〜９’の性能確認
　酵素標識抗体液１’〜９’について、実施例１と同様に標準β２−マイクログロブリン溶液（濃度０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ）を測定した結果を表３に示した。また、劣化処理前の同測定結果及び劣化処理前後の差を併せて表３に示した。

　処理前後で０ｎｇ／ｍＬの発光量の差は、酵素標識抗体液１’〜５’では殆ど認められないのに対して酵素標識抗体液６’〜９’では発光量の増加が認められ、劣化により非特異的反応が増加したことが判る。すなわち、酵素標識抗体液１’〜３’は、経日的に非特異反応の防止効果が低減しにくいといえる。

＜実施例３＞
　本実施例は非特異的反応が上昇した免疫測定（反応）試薬から高分子カゼインを除くことで非特異的反応が抑制されることを示すものである。
１．酵素標識抗体液中の高分子カゼインの除去
　実施例２で作成した酵素標識抗体液９’を限外ろ過膜（東洋濾紙製、ウルトラフィルターＱ０５００）を用いて１／５０の容量に濃縮した。この溶液を実施例１のカゼインの分画と同様に、ゲルろ過カラム法により、９０万ダルトンより大きな分子量部分を除去した。分取した画分を限外ろ過膜でカゼイン濃度０．１重量％となるまで濃縮し、酵素標識抗体液１０とした。

２．酵素標識抗体液１０の性能確認
　酵素標識抗体１０について、実施例１と同様に標準β２−マイクログロブリン溶液（濃度０ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ）を測定した結果を表４に示した。また、酵素標識抗体液９’についての測定値を転記した。

　酵素標識抗体液９’では高かった０ｎｇ／ｍＬの発光量が酵素標識抗体液１０では低下し、高分子カゼインを除去することで非特異反応を低減できることが判る。

＜実施例４＞
　本実施例は本発明の免疫測定試薬用カゼイン（Ａ）が長期保存した後でもカゼインの高分子量化が起こらないことを示す例である。

１．酵素標識抗体液の保存
　実施例１及び実施例３で作成した酵素標識抗体液１〜９及び１０を冷蔵（２〜１０℃）で６ヶ月間保存した。

２．高分子量カゼインの分析
　保存後の酵素標識抗体液を限外ろ過膜（東洋濾紙製、ウルトラフィルターＱ０５００）を用いて１／１０の容量に濃縮した後、ゲルろ過ＨＰＬＣ（カラム:昭和電工製Shodex GS-620HQ）で分析し、カゼイン溶液中の９０万ダルトン（Ｄａ）より大きなカゼイン（ａ）の全カゼインに対する比（重量％）を求めた。結果を表５に示した。

　本発明による酵素標識抗体液１〜５及び１０では高分子量化したカゼインの割合は全カゼインに対して１重量％以下であり、作成時の割合をほぼ維持しているが、酵素標識抗体液６〜９ではその割合が増加していることが判った。

＜実施例５＞
　本実施例は珪藻土によって高分子量カゼインを除去する方法により調製した、インシュリン測定用免疫測定試薬の例である。

１．試薬の調製
１）抗インシュリンポリクローナル抗体結合ビーズの調製
　抗インシュリンポリクローナル抗体（ダコジャパン社製）を用いて実施例１記載の方法と同様にして抗インシュリンポリクローナル抗体結合ビーズを調製し、保存した。

２）ペルオキシダーゼ標識抗インシュリンポリクローナル抗体の調製
　抗インシュリンポリクローナル抗体（ダコジャパン社製）を用いて実施例１記載の方法と同様にペルオキシダーゼ標識抗インシュリンポリクローナル抗体を調製し、冷凍（−３０℃）保存した。

３）免疫反応用緩衝液の作成
　牛血清アルブミン（マイルス社製）１ｇ、塩化ナトリウム０．８５ｇ、アジ化ナトリウム０．０５ｇをリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．２）１００ｍＬに溶解し、免疫測定用緩衝液とした。使用まで冷蔵保存した。

４）酵素標識抗体液の作成
　リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．０）１００ｍＬにカゼインナトリウム塩（シグマアルドリッチ製）０．２ｇを加え、攪拌下９５℃に加熱、溶解した後、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過した。さらにペルオキシダーゼ標識抗インシュリンポリクローナル抗体を蛋白量で５００μｇ添加した後、アジ化ナトリウム０．０５ｇ及び４−（メチルチオ）フェノール０．０５ｇを加え攪拌溶解し、酵素標識抗体液を調製した。

５）酵素標識抗体液の加温処理及び珪藻土処理
　調製した酵素標識抗体液を４０℃で５日間保存し加温処理した（標識抗体液１１）。標識抗体液１１の１００ｍＬ当たり２０ｇの珪藻土（商品名：セライトＮｏ．５４５，和光純薬工業より購入）を投入し、室温（約２５℃）で１０分間攪拌した。攪拌後、ブフナー漏斗を用いて、濾紙（東洋濾紙製：５Ａ）でろ過し酵素標識抗体液１２を得た。

２.酵素標識抗体液中の高分子量カゼインの確認
　実施例１記載の方法と同様に、酵素標識抗体液１１及び酵素標識抗体液１２をゲルろ過ＨＰＬＣ（カラム:昭和電工製Shodex GS-620HQ）で分析した結果、溶液中の９０万ダルトンより大きなカゼイン（ａ）の全カゼインに対する比（重量％）は次の通りであった。
　　酵素標識抗体液１１：　８．４％
　　酵素標識抗体液１２：　０．６％

３．測定性能の試験
　実施例１記載の免疫反応操作及び酵素活性操作法に準じて、上記で作成した試薬を用いて標準インシュリン溶液（濃度０，２５，２５０μＩＵ／ｍＬ）を測定した。なお標準インシュリン溶液は三洋化成工業（株）製臨床検査薬「スフィアライトインシュリン用キャリブレーターセット」中の０，２５０μＩＵ／ｍＬ及びそれらから希釈調製した２５μＩＵ/ｍＬである。

４．測定結果
　酵素標識抗体液１１及び１２を用いて標準インシュリン溶液（濃度０，２５，２５０μＩＵ／ｍＬ）を測定した結果を表６に示した。なお、表６中括弧内の数値はＳ／Ｎ比すなわち発光量を標準０μＩＵ／ｍＬの発光量で除した値である。

　酵素標識抗体液１２は、酵素標識抗体液１１より明らかに０μＩＵ／ｍＬの発光量が低く、非特異反応が抑制されていることが判る。又、Ｓ／Ｎ比で比較すると、酵素標識抗体液１２は、酵素標識抗体液１１より高感度な測定が可能であることが明らかである。

　本発明のカゼイン（Ａ）は種々の用途の免疫測定試薬に適用でき、例えば、免疫反応用緩衝液等の反応用試薬、抗原又は抗体を含む保存用試薬、担体のブロッキング用試薬、検体の希釈用試薬、及びＢ／Ｆ分離に使用する洗浄用試薬等に適用できる。

Claims (5)

1. 分子量が９０万ダルトンより大きな画分であるカゼイン（ａ）の含有量（重量％）が、カゼイン（Ａ）の重量に基づいて１以下であることを特徴とする免疫測定試薬用カゼイン（Ａ）。
2. 請求項１に記載のカゼイン（Ａ）を含有してなる免疫測定試薬。
3. カゼイン（Ａ）の含有量（ｇ／リットル）が免疫測定試薬の２５℃における容積に基づいて０．０１以上３０以下である請求項２に記載の免疫測定試薬。
4. さらに標識配位子を含有してなる請求項２又は３に記載の免疫測定試薬。
5. 分子量が９０万ダルトンより大きな画分であるカゼイン（ａ）の含有量（重量％）がカゼイン（Ａ）の重量に基づいて１以下である（Ａ）を含有する免疫測定試薬を製造する方法であって、（Ａ）を含有する溶液を２０〜６０℃で加温処理した後、（ａ）を吸着除去する工程を含むことを特徴とする免疫測定試薬の製造方法。