JP2003535578A5 - - Google Patents

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【特許請求の範囲】
【請求項１】 （ａ）第１の植物の細胞から誘導されるプロトプラストを、形質転換および制御が容易である第２の植物の細胞から誘導されるプロトプラストと融合して、第１のサイブリッドを形成することにより、第１の植物の細胞から第２の遺伝的に異なる植物の細胞にプラスチドを転移させ、
（ｂ）意図する核酸を前記プラスチド内に導入して、形質転換されたプラスチドを生成し、および
（ｃ）第１の植物と遺伝的に同一または互いに異なる第３の植物の細胞内に、前記形質転換されたプラスチドを含むサイブリッドを、前記第３の植物の前記細胞から誘導されたプロトプラストと融合させることにより、前記形質転換されたプラスチドを転移させること
を含んでなり、ここで第１、第２および第３の植物が双子葉植物であり、そして同じ科の構成員である、プラスチドを形質転換する方法。
【請求項２】 前記（ａ）のプラスチドが前記第２の植物のプラスチドと遺伝的に組み換えられて組み換えプラスチドを生成し、次いで核酸を組み換えプラスチド内に導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】 （ａ）第１の植物の細胞から誘導されるプロトプラストを、形質転換および制御が容易である第２の植物の細胞から誘導されるプロトプラストと融合して、第１のサイブリッドを形成することにより、第１の植物の細胞から第２の遺伝的に異なる植物の細胞にプラスチドを転移させ、
（ｂ）選択可能なマーカー遺伝子を含む意図する核酸を前記プラスチド内に導入して、形質転換されたプラスチドを生成し、
（ｃ）第１の植物と遺伝的に同一または互いに異なる第３の植物の細胞内に、前記形質転換されたプラスチドを含むサイブリッドを、前記第３の植物の前記細胞から誘導されたプロトプラストと融合させることにより、前記形質転換されたプラスチドを転移させ、および
（ｄ）選択可能なマーカー遺伝子を発現する（ｃ）の細胞からのプラスチド転移植物を再生すること
を含んでなり、ここで第１、第２および第３の植物が双子葉植物であり、そして同じ科の構成員であるプラスチド転移植物を生成する方法。
【請求項４】 （ａ）意図する核酸を、形質転換および制御が容易であるとして選択された第１の植物の細胞のプラスチドに導入して、形質転換されたプラスチドを生成し、および
（ｂ）前記第１および第２の植物の細胞から誘導されたプロトプラストと融合させることにより、形質転換されたプラスチドを、第１の植物と遺伝的に異なる第２の植物の細胞に転移すること
を含んでなる、第１および第２の植物が同じ科の構成員であるプラスチドを形質転換する方法。
【請求項５】 第１および第２の植物が同じ属の種である請求項４に記載の方法。
【請求項６】 選択可能なマーカー遺伝子を含む意図する核酸を、形質転換および制御が容易であるとして選択された第１の植物の細胞のプラスチド内に導入して、形質転換されたプラスチドを生成し、
前記第１および第２の植物の細胞から誘導されたプロトプラストと融合させることにより、形質転換されたプラスチドを、第１の植物と遺伝的に異なる第２の植物の細胞に転移させ、および
選択可能なマーカー遺伝子を発現する（ｂ）の細胞からのプラスチド転移植物を再生すること
を含んでなり、ここで第１および第２の植物が双子葉植物であり、そして同じ科の構成員であるプラスチド転移植物を調製する方法。
【請求項７】 請求項３の方法により生成されたプラスチド転移植物、またはその一部。
【請求項８】 プラスチドが同属である請求項７に記載のプラスチド転移植物。
【請求項９】 請求項７に記載のプラスチド転移植物から誘導される種子。
【請求項１０】 請求項６に記載の方法により生成されるプラスチド転移植物、またはその一部。
【請求項１１】 プラスチドが同属である請求項１０に記載のプラスチド転移植物。
【請求項１２】 請求項１０に記載のプラスチド転移植物から誘導される種子。
【請求項１３】 第１の植物の細胞またはプロトプラスト、あるいはその培養株であって、前記第１の植物の細胞またはプロトプラストは形質転換および制御が非常に容易であるとして選択された遺伝的に異なる第２の植物の細胞から得られるプラスチドを含み、前記プラスチドは意図するＤＮＡ分子で形質転換されており、前記プラスチドの前記第１の植物の細胞から前記第２の植物のへの転移が、該第１細胞から誘導されるプロトプラストと該第２細胞から誘導されるプロトプラストを融合して、サイブリッドを形成することにより、そして前記第１、第２および第３植物が双子葉植物であり、同じ科の構成員であることを特徴とする、第一植物の細胞またはプロトプラスト、あるいはその培養株。
【請求項１４】 タバコ属細胞である請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】 ナス属細胞である請求項１３に記載の細胞。
【請求項１６】 オリコフラグムス(Orychophragmus)細胞である請求項１３に記載の細胞。
【請求項１７】 レスケレラ(Lesquerella)細胞である請求項１３に記載の細胞。
【請求項１８】 アブラナ属細胞である請求項１３に記載の細胞。
【請求項１９】 前記プラスチドがポテトから得られる請求項１３に記載の細胞。
【請求項２０】 前記プラスチドがトマトから得られる請求項１３に記載の細胞。
【請求項２１】 前記プラスチドがナスから得られる請求項１３に記載の細胞。
【請求項２２】 前記プラスチドがクコ(Lycium)から得られる請求項１３に記載の細胞。
【請求項２３】 前記プラスチドがアブラナ属から得られる請求項１３に記載の細胞。

（背景技術）
プラスチドは、一つの形態または別の形態において全ての生きている植物細胞中に存在する密に関連するオルガネラの科である。全てのプラスチドは、特定の特徴を共有する。例えば、これらはそれ自体の小さなゲノムを有し、二重膜からなる外皮により包まれている。全てのプラスチドは、分裂細胞中に存在する比較的小さなオルガネラであるプロトプラスチドから発生する。プラスチドは、各分化細胞の要求により発生する。例えば、葉は暗所で育つと、プトロクロロフィルと呼ばれる黄色いクロロフィル前駆体を含むエチオプラストにプロトプラスチドが発展する。一方、葉が明所で成長すると、エチオプラストは、プロトクロロフィルをクロロフィルに転化することにより、さらにクロロプラストに発展する。クロロプラストは、植物が自身の有機養分を製造するプロセスである光合成の部位である。プラスチドの他の形態は、カロテノイド顔料を蓄積するクロロプラストである。これらのプラスチドは、多くの種の花弁および果実の黄−オレンジ−赤色着色の原因である。無色体は、基本的に拡張されたプロプラスチドである。これらは、緑色および光合成的にならない多くの表皮および内部組織において発生する。アミロプラストは、無色体の一般的形態である。これらは貯蔵組織中に澱粉を貯蔵し、幹、葉および根の特定に細胞において、重力への植物の反応の一部として機能する。全てのプラスチドはプラスチドゲノムの多くの複製を含み、大部分が細胞中に分割することができる。プラスチド群を失う高等植物の唯一の細胞は、特定の種の雄精細胞である。すなわち、トウモロコシのような植物のプラスチドは、母系的に遺伝される。すなわち、これらは、卵細胞のみからプラスチドを得る。Molecular Biology of the Cell、Garland Publishing(ニューヨーク)１９８３年、１１２０−１１２２頁に掲載のアルベルツ(Alberts)等による論文を参照。

高等植物のプラスチドゲノムは、葉細胞当たり２０００−５００００の複製として存在し得る１２０−１６５キロ塩基の環状二重鎖ＤＮＡ分子である。プラスチドゲノムは、幾つかの理由から、植物の核ゲノムと比較して、遺伝子操作の非常に魅力的な標的となった。プラスチド中のタンパクは非常に高い水準で発現され得るので、プラスチドの分子加工は本質的にバクテリアによる。また、高度の包み込みを達成することができ（花粉により媒介されない）、相同性組み換え機構により非相同ＤＮＡの組み込みが生じるので、ＤＮＡは植物の核ゲノム中にランダムに組み込まれる。一方、プラスチドゲノム中の組み込み位置は、特定の隣接配列により制御され得る。遺伝子沈黙化または所謂位置効果が無いので、発現の水準はより予想が可能である。発現の水準も、植物細胞当たりのＤＮＡ複製がより多いので、より高度である。クロロプラストは基本的にバクテリアであるので、変性のように要求されること無く、ゲノムＤＮＡよりも容易にバクテリア核酸を収容する。この利点は、バクテリアプロモーターのような関連する制御配列に同様に適用される。環境中への遺伝子の放出の危険性（「他殖」と呼ばれる）は、クロロプラストが花粉中に移動しないので、本質的に除去される。最後に、クロロプラストは、例えば澱粉、アミノ酸および脂肪である、最も重要な生合成経路の部位であるので、遺伝子を挿入し、特定の標的配列を必要とすることなく意図するオルガネラ中に機能させることが容易である。

（発明を実施するための最良の形態）
プラスチド転移植物を製造する困難さは、細胞水準での外因性核酸の導入のみに係わるのではない。むしろ、全般的な挑戦の特に問題のある観点は、プラスチド転移細胞の再生性の欠如であり、特に、相同プラスチド細胞が生成される程度の欠如である。Nature Biotech.、第１６巻、３３３頁−３３４頁（１９９８年）に掲載のビラング(Bilang)等の論文を参照されたい。「相同プラスチド」という語は、プラスチド中に野生型プラストーム（すなわち、プラスチドゲノム）を含まない細胞を意味する。すなわち、全てのプラスチドは、意図する核酸を含む。劣った再生性能以外に、相同プラスチド植物細胞の選択は非常に困難である。

本発明の１つの観点によれば、意図する核酸が非自生環境中のプラスチドに導入される、植物プラスチドの形質転換の方法が提供される。形質転換されたプラスチドは、起源植物または遺伝的に異なる植物の細胞中に戻される。「遺伝的に異なる」植物という用語は、ここでは、同じ種の突然変異体、異なる種、属および科を含む。「植物」という用語は、全ての高等植物、好ましくは開花植物を含む。同様に、個々の植物、例えば、ここで用いられる「ポテト」および「トマト」は、ポテトおよびトマトの全ての型、系統および変異種、等を含む。ここで用いられる「形質転換された」は、植物プラスチド内に意図する核酸を組み込む（例えば、タンパクをコードする）ことにより遺伝的に変性されたことを意味する。通常、核酸は、供与体植物（すなわち、プラスチドがそこから発生する植物）、受容体および／または究極受容体に外因性であるＤＮＡである。「外因性」というのは、核酸が、形質転換されるべき植物中で通常見つからないこと、または導入されるコピー群において通常見つからないことを意味する。好ましい態様において、核酸は供与体植物に外因性である。

タバコは、意図するプラスチドにとって好ましい受容体（すなわちクリップボード）である。一方ではタバコ核を組み合わせ、他方では他の経済的に重要なナス科種（ポテト、トマト、コショウ、ナス科、チョウセンアサガオ）のプラスチドを組み合わせる、一連の離れたサイブリッドが設計された。これらのサイブリッドを、次に、プラスチド形質転換性能について試験し、得られる形質転換プラスチドを次にその起源の核背景に戻し、このようにプラスチド転移植物を発生される。同じ手法がアブラナ植物科に適用されたが、これは本発明の広い応用性を示している。通常、本発明の方法で用い得る植物体は、以下のプロトコールを用いて選択することができる。受容体（すなわち「クリップボード」）植物用の候補は突然変異される。クロロフィルを合成しないプラスチドを含む突然変異種（「白色変異体」）が選択される。候補のプラスチド供与体から誘導されるプロトプラストは処理、例えば、放射線照射され、核が殺される。白色変異体から誘導されるプロトプラストは、候補供与体から誘導される処理されたプロトプラストと融合する。緑色コロニーおよび再生性サイブリッドまたは体性サイブリッドが選択される。緑色コロニーは、供与体から転移された機能プラスチドを含む。放射線照射により、唯一の可能な形質転換事象がプラスチドを含み核を含まないことが確保される。緑色コロニーの形成は、供与体植物および受容体植物が、少なくともプラスチドに関する限り、適合することを意味する。

一つの植物からもう一つの植物へのプラスチドの転移は、供与体および受容体細胞から、そして次に受容体細胞から誘導されるプロトプラストを、最終的な植物に融合させることにより最も容易に行うことができる。プラスチドの組み換えは、ランダムに起こるものであるが、そのような事象は、分子生物学において標準的な技術を利用して確認することができる。プラスチドの転移は、花粉が非自生核環境を提供する性的交雑により達成することができる。

意図する核酸の導入のための好ましい方法は、粒子銃（バイオリスティクス(biolistics)製）またはＰＥＧ−媒介遺伝子転移による。Methods Enzymol.、第２１７巻、５３６頁−５５６頁（１９９３年）に掲載のダニエル(Daniell)の論文；Plant Mol. Biol.、第１５巻、８０９頁−８１９頁（１９９０年）に掲載のイェ(Ye)等の論文；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第８７巻、８８頁−９２頁（１９９０年）に掲載のダニエル(Daniell)等の論文；Plant Cell Reports、第９巻、６１５頁−６１９頁（１９９１年）に掲載のダニエル(Daniell)等の論文、およびProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第９０巻、９１３頁−９１７頁（１９９３年）に掲載のスバブ(Svab)等の論文を参照されたい。核酸は、形質転換株の同定のためのマーカーを含む。選択スキームは、プラスチド１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子中の突然変異による又は加工されたバクテリアａａｄＡにより付与されるスペクチノマイシン抵抗（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第８７巻、８５２６頁−８５３０頁（１９９０年）掲載のスバブ(Svab)等の論文；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第９０巻、９１３頁−９１７頁（１９９３年）掲載のスバブ(Svab)およびマリガ(Maliga)の論文）および、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼの発現に基づくカナマイシンへの抵抗（Mol. Gen. Genet.、第２４１巻、４９頁−５６頁（１９９３年）記載のカレル(Carrer)等の論文）を含む。マーカー遺伝子は、例えば意図するタンパクをコードするＤＮＡに物理的に結合する必要はなく、別のベクターを介して送達される。BIO/TECHNOLOGY、第１３巻、７９１頁−７９４頁（１９９５年）カレル(Carrer)等の論文参照。核酸がプラスチドゲノム中に組み込まれることは好ましいが必須ではない。プラスチドゲノム内への意図する核酸の効率的かつ狙った組み込みを容易にするため、標的プラスチド中に存在するＤＮＡ配列を核酸に隣接させる。特定の配列は、実施例で例示する。国際特許公開ＷＯ００／２８０１４（「ナス科植物のプラスチド形質転換」）およびＷＯ００／３９３１３（「アブラナ属のプラスチド形質転換」）も参照のこと。

意図する核酸は広く変化し、植物中でのその発現が幾つかの観点から価値があるタンパクをコードする任意のＤＮＡを含む。本発明は、特に、非常に高水準の発現を必要とするプラスチド転移植物中での新しい特徴の発現に適している。本発明により生成されるプラスチド転移植物は、各細胞中にＤＮＡの数千の複製を含み、それにより遺伝子発現の非常に高い水準が得られる。ＤＮＡおよびタンパクは、作物保護、作物改良および、特定の化学物質、栄養補助食品および食品品質に係わる他の産物、例えば、変性された澱粉、油およびタンパク組成物の製造の広範囲に含まれ、合わさって、植物に意図する特徴を発現させるために、同等の遺伝子セットの発現および、すなわち、特別の形質転換系を必要とする。外因性遺伝子は、環境への反応、菌から自らを保護する性能、生体異物剤からの保護のような植物の入力要求を変化させる、または、合計収率、栄養的のバランスのとれたタンパクの生成、品質のより高い澱粉、油の高い品質および量、またはビタミン水準のような他の特徴を変化させるのに有用であり得る。遺伝子は、タンパク（例えば、ソマトトロピンのような成長ホルモン）、抗原および小分子のような薬剤の生成のような通常は奏さない機能を植物に奏させることもできる。例えば、文献は、昆虫および除草剤への抵抗ならびに細胞質的雄生殖不能を与える変換遺伝子でプラスチドを遺伝子的に加工したことを報告している。Bio/Technology、第１３巻、３６２頁−３６５頁（１９９５年）掲載のマクブライド(McBride)等の論文（「新規な」３−５％のｃｒｙＩＡＣタンパクを含むプラスチド転移植物タバコ葉）； Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第９６巻、１８４０頁−１８４５頁（１９９９年）掲載のコタ(Kota)等の論文、（昆虫抵抗を下げるために、クロロプラスト中でＢｔ Ｃｒｙ２Ａａ２タンパクを発現させる報告）、マクブライド(McBride)およびマリガ(Maliga)のＰＣＴ特許、ＷＯ９５／２４４９２；マクブライド(McBride)およびストーカー(Stalker)のＰＣＴ特許、ＷＯ９５／２４４９３；Nature/Biotechnology、第１６巻、３４５頁−３４８頁（１９９８年）掲載のダニエル(Daniell)等の論文、；ブラワーズ(Blowers)等のＰＣＴ特許、ＷＯ９９／０５２６５；マリガ(Maliga)のＰＣＴ特許、ＷＯ９５／２５７８７を参照されたい。

一旦、形質転換プラスチドが最終的な受容体植物の細胞内に転移またはその細胞内に形成されると、選択し得るマーカー遺伝子を発現する細胞からプラスチド転移植物が再生される。好ましい態様において、相同プラスチド細胞から植物が再生される。選択培地上での細胞分裂の繰り返し中における野生型プラストーム複製の選択的除去のような標準的技術に従って相同プラストミーを達成することができる。ＤＮＡの複製数（すなわち、導入された配列）は、相同プラストミーが達成されたかどうかを示すものである。前掲書（１９９８年）掲載のダニエル(Daniell)等の論文、Plant Physiol.、第１１９巻、１３３頁−１４１頁（１９９９年）掲載のカネフスキ(Kanevski)等の論文（同じ選択培地上で葉からの苗条(shoot)の再生の繰り返しサイクルにより、次に、抗生物質非含有ムラシゲ・スクーグ寒天上に苗条を根付かせることにより、相同プラスチドスペクチノマイシン抵抗植物を得る）を参照。一旦、相同プラスチド受容体細胞が得られると、形質転換プラスチドが、供与体植物の細胞に転移される。受容体の相同プラスチド性は、転移後の選択を容易にする。好ましくは、転移は、それぞれの細胞から誘導されたプロトプラストを融合することにより行われる。生殖性植物は、標準的技術に従ってプロトプラストから再生させることができる。根、苗条、葉および茎のような種々の植物部位を得、植物から種子を誘導することは、同様に、標準的手順を用いて達成される。

（実施例）
以下に記載の実験は、プラスチド形質転換に好ましい核背景を有する系の使用に基づく重要な作物種（ポテト、トマト、コショウ、チョウセンアサガオ、ナス科およびアブラナ科）のために良好なプラスチド形質転換の実施例を提供する。

プラストーマでコードしたクロロフィル欠損を有するサルピグロッシス・シヌアタＬ(Salpiglossis sinuata L)植物およびタバコ突然変異植物(Mol. Gen. Genet.、第２０９巻、１５９頁−１６３頁（１９８７年）に掲載のクシニル(Kushnir)等の論文）を、Theor. Appl. Genet.、第８８巻、５２５頁−５２９頁（１９９４年）に掲載のシドロフ(Sidorov)等の論文に記載されるように生体外で成長させた。葉肉(Mesophyll)プロトプラストを単離し、Monogr. Theor. Appl. Genet.、第８巻、１頁−２２０頁（１９８４年）に掲載のグレバ(Gleba)およびシトニク(Sytnik)の論文に記載される標準的プロトコールに従って融合させた。緑色組み換え体を再生し、緑色のタバコに見える苗木を選択した。幾つかの独立した光合成性系統を選択し、さらに分析した。サルメンバナプラスチドとタバコ核を組み合わせた組み換え体を、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンについての選択と組み合わせたＰＥＧ媒介遺伝子送達(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８７巻、８５２６頁−８５３０頁（１９９０年）に掲載のスバブ(Svab)等の論文）に基づき、公開されたプロトコール(Planta、第１９９巻、１９３頁−２０１頁（１９９６年）に掲載のクープ(Koop)、ステインムエラー(Steinmueller)、ワグナー(Wagner)、レッセラー(Roessler)、イーブル(Eibl)、サチャー(Sacherの論文)を用いて、プラスチド形質転換に付した。幾つかの独立した推定形質転換体を選択し、さらに試験した。生成した植物材料のうち、本当に安定しているプラスチド形質転換体を同定した。図２および３を参照のこと。次に、これらの植物からのメソフィルプロトプラストを単離し、サルメンバナ系統からの体細胞と融合させた。ｓｔｒ／ｓｐｍ抵抗クロロプラストを容易に同定したので、アルビノ突然変異体は必要無かった。プラスチド転移サルメンバナプラスチドを含むサルメンバナに見える植物である、多くの光合成性スペクチノマイシン／ストレプトマイシン抵抗再生体を得た（写真は示さない）。

実施例ＩＩ タバコプラスチドの形質転換 これらの実施例において、タバコの生体外成長正常植物、リコペルシコン・エスクレンタムＬ(Lycopersicon esculentum L)、およびソラナム・ニグラム(Solanum nigrum)のカナマイシンとハイグロマイシンに抵抗性の植物を用いた。用いた培地条件および融合プロトコールは、本質的に、Mol. Gen. Genet.、第２４１巻、７０７頁−７１８頁（１９９３年）に掲載のウォルターズ(Wolters)等の論文に記載されたものであった。リコペルシコン・エスクレンタムＬと放射線照射したソラナム・ニグラムとの融合により、クリップボード系統を生成した。生成した植物は花を有していたが、雄で生殖不能であった。生成された緑色再生剤は、最初は、リコペルシコン(Lycopersicon)クロロプラストと、両親からのハイブリッド核材料を含んでいた。形質転換と推定プラスチド転移選択は実施例Ｉに記載の通りである。安定したプラスチド転移植物を、正常トマト植物で受粉した。種子を得、形質転換したプラスチドを有するトマトに見える植物を成長させた。

実施例ＩＩＩ ナス(Solanum melongena)プラスチドの形質転換 プラストームでコードしたクロロフィル欠損（Mol. Gen. Genet.、第２０９巻、１５９頁−１６３頁（１９８７年）に掲載のクシニル(Kushnir)等の論文）を有するナス(Solanum melongena)植物およびタバコ突然変異体植物を、Theor. Appl. Genet.、第８８巻、５２５頁−５２９頁（１９９４年）に掲載のシドロフ(Sidorov)等の論文に記載されるように生体外で成長させた。メソフィルプロトプラストを単離し、Monogr. Theor. Appl. Genet.、第８巻、１頁−２２０頁（１９８４年）に掲載のグレバ(Gleba)およびシトニク(Sytnik)の論文中の標準的プロトコールに従って融合させた。緑色組み換え体を再生し、タバコに見える緑色苗木を選択した。さらなる分析のために幾つかの系統を単離し選択した。ナス属プラスチドおよびタバコ核を含む組み換え体を、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンについての選択と組み合わせたＰＥＧ媒介遺伝子送達(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８７巻、８５２６頁−８５３０頁（１９９０年）に掲載のスバブ(Svab)等の論文）に基づき、Planta、第１９９巻、１９３頁−２０１頁（１９９６年）に掲載のクープ(koop)等の論文に記載のプロトコールを用いて処理して、形質転換プラスチドを得た。幾つかの独立した推定形質転換体を選択し、さらに試験した。安定したプラスチド形質転換体を、図２および３に示すように植物材料から同定した。次に、これらの植物からのメソフィルプロトプラストを単離し、ナス属系統からの体細胞と融合した。クロロプラストはｓｔｒ／ｓｐｍ抵抗なので、アルビノ突然変異体は必要無かった。得られた多くの光合成性スペクチノマイシン／ストレプトマイシン抵抗再生体は、プラスチド転移ナス属プラスチドを含むナス属に見える植物であった（写真は示さない）。

実施例ＶＩＩ ブラシカ・ナプス(Brassica napus)プラスチドの形質転換 カノーラ，ブラシカ・ナプスＬ(Brassica napus L)正常植物、およびプラストームでコードしたクロロフィルを欠損するオリコフラグムス(Orychophragmus)またはレスケレラ突然変異植物を、前掲書（１９９８年）掲載のズブコ(Zubko)等の論文に記載されるように生体外で成長させた。メソフィルまたは子葉鞘プロトプラストを単離し、標準的プロトコールに従って融合した（Theor. Appl. Genet.、第８７巻、７９５頁−８０４頁（１９９４年）に掲載のファーレソン(Fahleson)等の論文）。緑色組み換え体を再生し、緑色オリコフラグムス(Orychophragmus)およびレスケレラに見える苗木を選択した。幾つかの独立した光合成性系統を選択し、さらに分析した。カノーラプラスチドとオリコフラグムス(Orychophragmus)またはレスケレラ核を組み合わせた組み換え体を、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンについての選択と組み合わせた粒子銃系遺伝子送達に基づいた公開されたプロトコールを用いるプラスチド形質転換に付した。幾つかの独立した推定形質転換体を選択し、さらに試験した。生成した材料のうち、真に安定したプラスチド形質転換体を同定した。次に、これらの植物からのメソフィルプロトプラストを単離し、カノーラ系統からの体細胞と融合した。得られた多くの光合成性ｓｔｒ／ｓｐｍ抵抗再生体は、プラスチド転移カノーラプラスチドを含む、カノーラに見える植物であった。

ｐＧｅｍ−Ｔ−ｅａｓｙベクター内へのフラグメントの直接クローニングを可能にする「Ａ−テーリング」を、ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙマニュアル（プロメガ製）に記載のようにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン製）を用いて行った。反応物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製し、製造者のプロトコールに従って、ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙベクターと一緒にライゲーション反応に用いた。ライゲーションの生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(キアゲン製)を用いて精製し、「Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ Ｓｕｒｅ」電子適合性細胞（ストラタジーン(Stratagene)製)）の電気穿孔媒介形質転換のために用いた。電気穿孔は、ペクラブ(Peqlab)（ドイツ国アーランゲン）電気パルス装置を用いるバクテリア電気穿孔（容量２５μＦ、Ｓｈｕｎｔ ２０１ ＯＨＭ、パルス５ｍ秒）用の標準的条件下に行った。バクテリアを、１０ｍＭのＩＰＴＧを１００μｌおよび２％−Ｘ−ｇａｌを１００μｌ含むアンピシリン（７５ｍｇ／Ｌ）ＬＢ−寒天プレート上に広げた。

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