JP2003530074A - Ｈｅｒ−２タンパク質に対する免疫反応性を増強するためのポリペプチドおよびポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫系を刺激するため、およびＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現と関連している悪性疾患を処置するための組成物が提供される。このような組成物としては、ＨＥＲ−２タンパク質の免疫原性エピトープならびにこのようなエピトープを含むキメラペプチドおよび多価ペプチドが挙げられる。本発明はまた、キメラペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。このような免疫原性組成物を含む薬学的組成物もまた提供される。ＨＥＲ−２タンパク質に対する免疫応答を刺激するための方法が提供される。乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌および肺癌を処置するための方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願の引用） 米国特許法１１９条（ｅ）項（１）に基づいて、本出願は、先願の米国仮特許
出願６０／１４６，８６９号（１９９９年８月３日出願）の優先権を主張する。

【０００２】 本出願に記載される研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｅからの助成金ＰＨＳ／ＮＩＨ Ｐ３０ ＣＡ−１６０５８およびＮＩＨ／
ＮＣＩ ＲＯ１ ＣＡ ８４３５６−０１Ａ１により少なくとも一部後援された
。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。

【０００３】 （背景） 現在、乳癌を処置する最も一般的な形態は、外科手術、化学的介入、および／
または放射線療法を含む。癌が規定された領域に限定されなければ、外科手術の
みでは、癌を排除することができない。従って、手術部位近辺にあり、手術から
逃れた癌細胞を破壊するために、術後、放射線処置がしばしば行われる。このよ
うな処置の副作用としては、皮膚過敏（ｓｋｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）ま
たはかゆみ、免疫系の妨害、ときおり吐き気、および稀に肺の影響を受けた部分
が繊維性になる放射線維症（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）が挙げら
れる。化学療法はまた、外科手術後に用いられ得る。化学療法は、癌細胞に毒性
の薬物を利用する。これは、完全には選択的系ではないので、正常細胞もまた影
響を受ける。ネガティブな副作用としては、悪心、疲労、食欲喪失、脱毛および
下痢が挙げられる。

【０００４】 現在の治療の欠点を鑑みて、乳癌を処置するためのさらなるアプローチを見出
す試みが行われてきた。１つのこのようなアプローチは、免疫療法である。免疫
療法的アプローチのための標的の１つは、ＨＥＲ−２タンパク質である。ＨＥＲ
−２タンパク質（ＨＥＲ−２癌遺伝子の産物）は、種々の癌において過剰発現さ
れている。インサイチュで腺管癌のうちの５０〜６０％、および全ての乳癌のう
ちの２０〜４０％、ならびに卵巣、前立腺、結腸および肺で生じる腺癌の実質的
な割合において見出される。ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現は、ヒトにおける
悪性形質転換に関する。ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現はまた、悪性疾患の攻
撃性と密接に関連し、これは、全ての侵襲性乳癌のうちの１／４において見出さ
れる。ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現は、乳癌および卵巣癌の両方において予
後があまりよくないことと相関する。

【０００５】 最近の研究において、ＨＥＲ−２の細胞外結合ドメイン（ＥＣＤ）に対する抗
体は、インビトロおよび動物モデルで腫瘍増殖に対する阻害効果を付与すること
を示した（Ｈｕｄｚｉａｋ，Ｒ．Ｍ.ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：１
１−６５−７２，１９８９；Ｔａｇｌｉａｂｕｅ，Ｅ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ ４７：９３３−７，１９９１；Ｄｒｅｂｉｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９１２９−３３，１９８６；Ｄｒ
ｅｂｉｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２：２７３−７，１９８８；Ｄｒｅ
ｂｉｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２：３８７−９４，１９８８およびＫ
ａｔｕｍａｔａ，Ｍ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：６４４−８．１９９５）。さら
に組換えヒト化抗ＨＥＲ−２モノクローナル抗体（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）の
転移性ＨＥＲ−２過剰発現乳癌を有する患者における第ＩＩ相および第ＩＩＩ相
の臨床試験は、単一の薬剤として１５％の全体応答割合を生じた。Ｔｒａｓｔｕ
ｚｕｍａｂはまた、細胞傷害性化学療法剤と組み合わせた場合に、生存性を改善
することが示された（Ｂｅｓｅｌｇａ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１
４：７３７−４４，１９９６；Ｐｅｇｒａｍ，Ｍ．Ｄ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎ
ｃｏｌ．１６：２６５９−７１，１９８８）。組換えＨＥＲ−２タンパク質、Ｈ
ＥＲ−２ ＥＣＤ、またはラットｎｅｕ（これは、ＨＥＲ−２のラットホモログ
である）のＥＣＤを標的とする多くのワクチンアプローチが評価されてきた。例
えば、ラットｎｅｕのＥＣＤを発現する組換えワクシニアウイルスで免疫したＮ
ＦＳ系統マウスは、ｎｅｕ形質転換ＮＩＨ ３Ｔ３細胞でのその後のチャレンジ
に対して防御性抗体応答を発生させた（Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６８５４−８，１９８７）。しか
し、ＢＤＩＸラットの同じ免疫原での免疫は、抗体応答も生じず、同系のｎｅｕ
発現Ｂ １０４神経芽腫細胞の増殖を阻害もしなかった。このことは、このスト
ラテジーがラットにおいて免疫応答を誘導するには不充分であったことを示唆す
る。ポリサッカリド−癌タンパク質複合体ワクチン（コレステリル基保有マンナ
ンおよびプルランと複合体化したＨＥＲ−２ ＥＣＤの１４７のアミノ末端アミ
ノ酸からなる）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＥＲ−２発現肉腫の拒絶を媒
介した細胞性免疫応答および体液性免疫応答を誘導した（Ｇｕ，Ｘ．Ｇ．ら，Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８：３３８５−９０，１９９８）。精製ラットｎｅｕ
ＥＣＤ（Ｅｓｓｅｒｍａｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｔｈｅｒ．４７：３３７−４２，１９９９）またはｎｅｕトランスフェ
クト同種異系マウス線維芽細胞（Ｃｅｆａｉ，Ｄ．，ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒ，８３：３９３−４００，１９９９）のいずれかで免疫することにより乳腺
腫瘍を発症させるようにしたラットｎｅｕトランスジェニックマウスにおいて、
部分的な防御が示された。

【０００６】 上記研究の結果にも拘わらず、ヒトにおいてＨＥＲ−２またはＨＥＲ−２ Ｅ
ＣＤ（ＨＥＲ−２が変異していない）「自己」抗原を標的化する細胞ベースまた
はタンパク質ベースのワクチンストラテジーを用いて、有効な免疫応答が生成さ
れ得るか否かは、未だに不確かなままである。従って、ＨＥＲ−２タンパク質の
過剰発現が関連している乳癌および他の悪性疾患を処置または予防するためのさ
らなる免疫療法的アプローチを行うことが望ましい。

【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、免疫系を刺激し、そしてＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現に関連す
る悪性疾患を処置するための新たな化合物および組成物を提供する。この化合物
は、ＨＥＲ−２タンパク質の免疫原性エピトープおよびこのようなエピトープを
含むキメラペプチドおよび多価ペプチドである。

【０００８】 第１の群の化合物は、本明細書中以降まとめて「ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトー
プ」とよばれる。ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープは、約１５〜約５０アミノ酸、
より好ましくは１７〜４０アミノ酸、最も好ましくは１８〜３５アミノ酸を含む
。好ましくは、ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープは、以下の群またはその機能的等
価物から選択される配列を含む：

【０００９】

【化５】 上記に列挙されたＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープおよびそれらの機能的等価物
は、ＨＥＲ−２タンパク質の細胞外ドメインと免疫反応性の抗体の生成を誘導す
る能力を有する。

【００１０】 本発明はまた、本発明のＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープまたはその機能的等価
物の少なくとも１つを含むキメラペプチド（本明細書中以降「キメラＨＥＲ−２
Ｂ細胞ペプチド」といわれる）を提供する。好ましくは、このキメラＨＥＲ−
２ Ｂ細胞ペプチドは、約３５〜約１５０アミノ酸長、より好ましくは約３５〜
約７０アミノ酸長である。このキメラＨＥＲ−２ Ｂ細胞ペプチドは、３つのユ
ニットを含む。第１のユニットは、ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープまたはその機能
的等価物を含む。第２のユニットは、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞エピトープ、好ま
しくは、乱交雑Ｔｈ細胞エピトープである。本明細書中で使用される場合、「乱
交雑」Ｔｈ細胞エピトープは、ＭＨＣ拘束の迂回を補助するサイトカインの放出
を促進するエピトープである。第２のユニットは、約１４〜約２２アミノ酸長、
より好ましくは約１５〜２１アミノ酸長、最も好ましくは１６アミノ酸長である
。好ましくは、このＴｈ細胞エピトープは、以下のアミノ酸配列のうちの１つを
有する：

【００１１】

【化６】 第３のユニットは、第１および第２のペプチドユニットを結合する。第３のユ
ニットは、アミノ酸、すなわち、好ましくは約２〜約１５アミノ酸長、より好ま
しくは約２〜約１０アミノ酸長、最も好ましくは約２〜約６アミノ酸長のペプチ
ドである。最も好ましいリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｅｕ（配列番号２０）を含む。

【００１２】 本発明はまた、複数の（すなわち、少なくとも２つの）本発明のＨＥＲ−２
Ｂ細胞エピトープまたはその機能的等価物およびＴｈ細胞エピトープを含む多価
ＨＥＲ−２ Ｂ細胞ペプチドを提供する。ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープおよび
Ｔｈ細胞エピトープは、コアβシート鋳型に結合されている。好ましくはこの鋳
型は、ロイシン残基とリジン残基とが交互になっている２つの鎖を含み、これら
は、リンカーにより結合される。このリンカーはアミノ酸であり、すなわち、好
ましくは約２〜約１５アミノ酸長、より好ましくは約２〜約１０アミノ酸長、最
も好ましくは約２〜約６アミノ酸長のペプチドである。最も好ましいリンカーは
、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（配列番号２０）を含む。

【００１３】 本発明はまた、キメラＨＥＲ−２ Ｂ細胞ペプチドまたは多価ＨＥＲ−２ Ｂ
細胞ペプチドおよび薬理学的に受容可能なキャリアを含む免疫原性組成物に関す
る。好ましいキャリアは、生分解性ミクロスフェアである。このような免疫原性
組成物は、ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現が関連している悪性疾患を処置また
は予防するために有用である。

【００１４】 本発明はまた、上記のＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つをコー
ドするポリヌクレオチドに関する。このようなポリヌクレオチドは、組換え技術
によりエピトープを生成するために有用である。本発明はまた、本発明のキメラ
ＨＥＲ−２ Ｂ細胞ペプチドをコードする配列を有する単離されたポリヌクレオ
チドに関する。このようなポリヌクレオチドは、キメラＨＥＲ−２ Ｂ細胞ペプ
チドを調製するために有用である。このようなポリヌクレオチドはまた、ＨＥＲ
−２タンパク質の過剰発現が関連している悪性疾患を処置または予防するための
免疫原性組成物（例えば、ＤＮＡワクチン）において有用である。好ましくは、
このような免疫原性組成物は、筋肉内に投与される。

【００１５】 本発明はまた、細胞傷害性（Ｔｃ）細胞を活性化し得るＨＥＲ−２エピトープ
（本明細書中以降「ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープ」といわれる）を提供する。
このＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープは、約８〜約１２アミノ酸、より好ましくは
９〜１１アミノ酸を含む。好ましくは、このＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープは、
以下の配列のうちの１つを含む：

【００１６】

【化７】 本願ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープはまた、上記に示されるＨＥＲ−２ ＣＴ
Ｌエピトープの機能的等価物であるペプチドを包含する。機能的等価物であるペ
プチドは、上記に示される配列の１つに少なくとも９０％同一である配列を有す
る。機能的に等価であるペプチドはまた、Ｔｃ細胞を活性化する能力を有する。

【００１７】 本発明はまた、キメラペプチドを提供し、これは、ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピト
ープまたはその機能的等価物を含むキメラＨＥＲ−２ ＣＴＬペプチドとして下
に言及される。キメラＨＥＲ−２ ＣＴＬペプチドは、３つのユニットを含む。
第１のユニットは、ＣＴＬエピトープを含む。第２のユニットは、好ましくは、
乱交雑（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｔヘルパー細胞エピトープである。第３のユ
ニットは、リンカーアミノ酸または第１ペプチドユニットおよび第２ペプチドユ
ニットを結合するペプチドユニットである。

【００１８】 本発明はまた、複数の、すなわち、本願ＨＥＲ ２ ＣＴＬエピトープの少な
くとも２つまたはその機能的等価物およびＴｈ細胞エピトープを含む多価ＨＥＲ
２ ＣＴＬペプチドを提供する。ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープおよびＴｈ細
胞エピトープは、コアβシートテンプレートに連結される。好ましくは、テンプ
レートが、ロイシン残基とリシン残基とが交互になっている２つの鎖を含み、こ
れは、リンカーにより連結される。

【００１９】 キメラＨＥＲ−２ ＣＴＬペプチドおよび多価ＨＥＲ−２ ＣＴＬペプチドは
、Ｔｃ細胞を活性化するために有用な免疫原である。このような活性化は、ＩＬ
−２レセプターおよび少ない範囲でＩＬ−２、の発現を開始するようＴｃ細胞を
誘導し、重要なサイトカインは、増殖およびエピトープを提示する標的細胞に対
するサイトカイン活性を保有する機能的細胞傷害性リンパ球への、活性化された
Ｔｃ細胞の分化に必要とされる。本発明はまた、キメラＨＥＲ−２ ＣＴＬペプ
チドまたは多価ＨＥＲ−２ ＣＴＬペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリア
を含む免疫原性組成物に関する。本発明はまた、このような動物に免疫原性組成
物を投与することによる、哺乳動物にＴｃ細胞を活性化する方法に関する。

【００２０】 本発明はまた、上記の１つ以上のＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープをコードする
単離されたポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドは、組換え技
術によりエピトープを産生するのに有用である。本発明はまた、キメラＨＥＲ−
２ ＣＴＬペプチドをコードする配列を有する単離されたポリヌクレオチドを含
む。このようなポリヌクレオチドは、キメラＣＴＬ細胞エピトープペプチドを調
製するために有用である。このようなポリヌクレオチドはまた、ＨＥＲ−２オン
コジーンが関連する悪性腫瘍を処置または予防するための免疫原性組成物（例え
ば、ＤＮＡワクチン）において有用である。

【００２１】 本発明はまた、多価のＢ／ＣＴＬペプチドに関し、これは、１つ以上のＴヘル
パー細胞エピトープに連結される１つ以上のＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープに連
結される、１つ以上のＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープを含む。このエピトープは
、コアβシートテンプレートに連結される。本発明はまた、多価のＢ／ＣＴＬペ
プチドをコードするポリヌクレオチドおよびこのようなポリヌクレオチドを含む
ＤＮＡベクターに関する。本発明はまた、Ｂ／ＣＴＬエピトープペプチドまたは
それをコードするポリヌクレオチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む免
疫原性組成物に関する。

【００２２】 本発明はまた、ＨＥＲ−２タンパク質に対する被験体における免疫応答を刺激
する方法に関する。このような方法は、被験体に対する本発明のキメラペプチド
または多価ペプチドを投与することを含む。このような方法は、ＨＥＲ−２タン
パク質の発現と関連する疾患状態に対する被験体の免疫の増強を生じる。

【００２３】 （発明の詳細な説明） 本発明は、ＨＥＲ−２タンパク質の免疫原性エピトープであるペプチドを提供
し、これは、以下でＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープおよびＨＥＲ−２ ＣＴＬエ
ピトープとして以下で言及される。

【００２４】 ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープは、ＨＥＲ−２タンパク質の細胞外ドメインと
免疫活性である抗体の産生を生じる体液反応を引き起こすことが可能である。Ｈ
ＥＲ−２タンパク質およびそのラットホモログｎｅｕは、長さが約１２５５個の
アミノ酸（ａａ）である１８５ｋｄの相対的分子量を有する膜貫通タンパク質で
ある。ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質は、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）
に４０％の相同性を有する、約６４５ ａａの細胞外結合ドメイン（ＥＣＤ）、
高い疎水性膜貫通アンカードメイン（ＴＭＤ）、およびＥＧＦＲに対して８０％
の相同性を有する約５８０ａａのカルボキシ末端の細胞質ドメイン（ＣＤ）を有
する。ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸配列およびこのようなアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列が、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１１７３０に示される
。

【００２５】 ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープは、配列の１つを有するペプチドを包含し、こ
れは、以下の表Ｉに示される「参照配列」として以下に言及する。この参照配列
は、抗原性の６つの相互関係を使用して、コンピューターで補助される分析を用
いて選択され、そしてスコアされた：（ａ）個々の配列の鎖の柔軟性および可動
性のプロフィールが、ＫａｒｐｌｕｓおよびＳｃｈｕｌｔｚ、Ｎａｔｕｒｗｉｓ
ｓ ７２：２１２−２１３、１９８５に従って算出された；（ｂ）水治療法プロ
フィールが、７つの残基範囲セッティング（ｒｅｓｉｄｕｅ ｓｐａｎ ｓｅｔ
ｔｉｎｇ）に対して作製され、そして最終的にＫｙｔｅ およびＤｏｏｌｉｔｔ
ｌｅ，Ｊ．Ｍｏｉ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２，１９８２の尺度を使用
して３つの残基範囲と共に洗練された；（ｃ）水治療法プロフィールはＨｏｐｐ
およびＷｏｏｄｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３
８２４−３８２８，１９８１のプログラムを使用して６残基のウィンドウに対し
て作製された；（ｄ）１．４Ａプローブを使用して水へのアミノ酸残基の曝露の
分析が、Ｒｏｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８３４−８３８，１９８５の溶媒
曝露アルゴリズムにより実行された；（ｅ）溶媒中へ接近そして突出するタンパ
ク質の部分を予測する突出指数が、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，ＥＭＢＯ Ｊ．５：４０
９−４１３，１９８６の方法により算出された；（ｆ）５つの残基配列が抗原性
である可能性は、Ｗｅｌｌｉｎｇ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ １８８：２１５−２１
８，１９８５の方法により決定された。基本的な前提は、予測に使用されるアル
ゴリズムが、タンパク質上の表面に曝露される領域に常に位置し、従って、多分
抗体結合に関与している。配列が、それらのそれぞれの指数値に基づいて１〜６
のスコアで与えられ、そしてランクされて：もっも高いランキング配列は、調べ
られた分析物（６／６）について最も高い個々のスコアを有し、そして連続的な
候補は、次に高いスコア（５／６）などを有した。最もよい、スコアしたエピト
ープは、２次構造の特性と関連することによりさらにランク付けされ、例えば、
両親媒性αへリックス配列またはβターンループ領域が、ランダムコイルフラグ
メントについて好まれる。ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．Ｒｅｌａｔ．Ｓｕｂｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：４５−１４８，１９７８に
よるコンピュータープログラムが、２次構造（αへリックス、βストランド／シ
ート、３ターン／ループ、ランダムコイル）およびへリックス両親媒性モーメン
トを予測するために使用された。静電気的イオン対およびへリックスセグメント
におけるへリックス双極子相互作用もまた、考えられる（例えば、疎水性／親水
性バランス）。好ましくは、親水性／疎水性バランスは、２／２〜４／１である
。

【００２６】 本明細書中に記載されるように、ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープはまた、以下
の表Ｉに示されるペプチドの機能的な等価物であるペプチドを含む。このような
機能的等価物が、対応する参照配列における１つ以上のアミノ酸が置換されるか
、または１つ以上のアミノ酸が対応する参照配列から欠失されるかまたは付加さ
れた、変更した配列を有する。例えば、システイン残基は、欠失されるかまたは
他のアミノ酸と置換され、復元において不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成
を防止し得る。必要に応じて、ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープが、グリコシル化
される。

【００２７】 非保存的アミノ酸置換を有することが可能であるが、システインを交換するた
めに行われる置換を除き、この置換は保存的アミノ酸置換であり、ここで、置換
されるアミノ酸は、参照配列において対応するアミノ酸と、類似の構造的または
化学的特性を有する。例として、保存的アミノ酸置換は、１つの脂肪族アミノ酸
または疎水性アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシ
ン）の、別のアミノ酸との置換；水酸基を含む１つのアミノ酸（例えば、セリン
およびスレオニン）の、別のアミノ酸との置換；１つの酸性残基（例えば、グル
タミン酸またはアスパラギン酸）の、別のアミノ酸との置換；アミドを含む１つ
の残基（例えば、アスパラギンおよびグルタミン）の、別の残基との置換；１つ
の芳香族残基（例えば、フェニルアラニンおよびチロシン）の、別の残基との置
換；１つの塩基性残基（例えば、リシン、アルギニンおよびヒスチジン）の、別
の残基との置換；および１つの小アミノ酸（例えば、アラニン、セリン、スレオ
ニン、メチオニン、およびグリシン）の、別の残基との置換、を含む。

【００２８】 好ましくは、欠失および付加は、上記で示される配列の１つの、アミノ末端、
カルボキシ末端、または両方に位置する。変更の結果として、ＨＥＲ２ Ｂ細胞
エピトープ等価物は、対応する参照配列に少なくとも７０％同一、好ましくは少
なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは、
少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。少なくとも９０％同一であ
る配列は、１つの変更しか有さない（すなわち、参照配列の１０個のアミノ酸あ
たり、欠失、付加または置換、の任意の組み合わせ）。百分率の同一性が、ＤＮ
Ａ ＳＴＡＲプログラムにおけるＭＥＧＡＬＩＧＮプロジェクトを使用して、参
照配列を有する改変体のアミノ酸配列を比較することにより、決定される。

【００２９】 対応する参照配列より長い機能的な等価物について、この機能的等価物は、参
照配列および野生型ＨＥＲ２タンパク質における参照配列に隣接する配列と少な
くとも９０％同一である配列を有する。

【００３０】 （表１．アミノ酸残基数によるランクの順に列挙した強化ヒトｐ１８５ ＨＥ
Ｒ−２予想Ｂ細胞エピトープ。アスパラギン（Ｎ）−結合グリコシル化部位は太
字で下線を付す）

【００３１】

【表１】 本発明はまた、「キメラＨＥＲ−２ Ｂ細胞ペプチド」として本明細書中以下
に言及されるキメラペプチドを提供する。これは、ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトー
プ、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞エピトープ、好ましくは、乱交雑Ｔｈ細胞エピトー
プおよびリンカーを含む。用いられる乱交雑Ｔｈ細胞エピトープに依存して、Ｈ
ＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープを、Ｔｈ細胞エピトープのアミノ末端またはカルボ
キシ末端のいずれかに連結する。Ｔｈ細胞エピトープの位置および選択は、Ｂ細
胞エピトープの構造特性（αヘリックスまたはβターンもしくは鎖のいずれか）
に依存する。適切なＴｈ細胞エピトープを選択する方法は、Ｋａｕｍａｙａら、
「ＤＥＮＯＶＯ」 ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＰＥＰＴＩＤＥ ＩＭＭＵ
ＮＯＧＥＮＩＣ ＡＮＤ ＡＮＴＩＧＥＮＩＣ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＮＴＳ Ａ
Ｓ ＰＯＴＥＮＴＩＡＬ ＶＡＣＣＩＮＥＳ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｄｅｓｉｇｎ
，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（１
９９４），１３３−１６４頁、これは本明細書中で参考として援用される。Ｂ細
胞エピトープキメラを含む種々の乱交雑Ｔ−ヘルパー細胞エピトープを惹起する
免疫応答の要旨は、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｄｒｅａｍ ｏ
ｒ Ｒｅａｌｉｔｙ」Ｋｕｍａｙａら、と題する総説において示され、そしてＰ
ＥＰＴＩＤＥＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ
，Ｌｔｄ．（１９９６）において公開されている。

【００３２】 キメラＨＥＲ−２ Ｂ細胞ペプチドは、ＨＥＲ−２タンパク質の細胞外ドメイ
ンと相互作用し、かつこれに結合する抗体の産生を誘導するための有用な免疫源
である。キメラＢペプチドはまた、患者の血清におけるＨＥＲ−２タンパク質に
対する抗体を検出するための研究用ツールとして有用である。本発明に従って、
キメラＢ細胞ペプチドＭＶＦ-ＨＥＲ-２（６２８-６４７）、ＨＥＲ-２（３７６
-３９５）-ＭＶＦ、およびＨＥＲ-２（４１０-４２９）-ＭＶＦが、ウサギにお
ける抗体応答を惹起し、そしてこのような抗体が、（ａ）ＨＥＲ−２タンパク質
を免疫沈降し、（ｂ）培養物中の細胞を過剰発現するＥＲ−２上のインタクトな
ＨＥＲ−２レセプターに結合し、そして（ｃ）インビトロでおよび異種移植マウ
スモデルで細胞を過剰発現するＨＥＲ−２の増殖を減少させることが測定されて
いる。トランスジェニックマウスのキメラペプチドＭＶＦ-ＨＥＲ-２（６２８-
６４７）での免疫は、このようなマウスにおける、コントロールマウスが腫瘍を
発症した時点の少なくとも９ヶ月後に腫瘍発症を遅らせることもまた測定されて
いる。

【００３３】 本発明は、ＨＥＲ−２タンパク質に対する細胞媒介応答を惹起する能力を有す
る、ＨＥＲ−２ＣＴＬエピトープを提供する。本明細書中で用いられる場合、用
語ＨＥＲ−２ＣＴＬエピトープとは、以下の表２に示される配列の１つを有する
ペプチド、またはその機能的等価物を含む。この機能的等価物は、以下の表２に
示される「参照配列」と呼ばれる、配列の１つに少なくとも８０％、好ましくは
少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。機能的等価物のＨＥＲ−２
タンパク質、またはＨＥＲ−２タンパク質の細胞外結合ドメインに対する細胞媒
介応答を惹起する能力は、対応する参照配列と同じか、またはこれよりも高い。

【００３４】

【表２】 本発明はまた、キメラＨＥＲ−２ＣＴＬペプチドとして本明細書中以下で言及
されるキメラペプチドを提供する。これは、上記のＨＥＲ−２ＣＴＬエピトープ
の１つ、またはその機能的等価物を含む。キメラＨＥＲ−２ ＣＴＬペプチドは
、３つの単位を含む。第１の単位は、キメラＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープまた
はその機能的等価物を含む。第２の単位は、乱交雑Ｔヘルパー細胞エピトープを
含む。この第２の単位は、好ましくは、約１４〜約２２、より好ましくは、約１
５〜２１、最も好ましくは、１６のアミノ酸の長さである。第３の単位は、第１
の単位と第２の単位とを結合するリンカーである。このリンカーは、アミノ酸で
あるか、または好ましくは約２〜約１５のアミノ酸、より好ましくは、約２〜約
１０のアミノ酸、最も好ましくは、約５〜約６のアミノ酸の長さであるペプチド
である。最も好ましいリンカーは、配列：Ｇｌｙ−Ｐｒｏ-Ｓｅｒ-Ｌｅｕ（配列
番号２０）を含む。

【００３５】 本発明はまた、複数のＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープを含む共リンカーキメラ
ペプチドを含む。複数のＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープは、１〜５のアミノ酸の
長さであるリンカーによりお互いに連結される。必要に応じて、このリンカーは
、タンパク質分解部位を含む。１つの実施形態では、このリンカーは隣接する塩
基性アミノ酸残基を含む。好ましくは、共リンカーキメラペプチドは、クラスＨ
ＬＡ−Ａ３由来のＨＥＲ−２ＣＴＬエピトープ、クラスＨＬＡ−Ｂ７由来のＨＥ
Ｒ−２ＣＴＬエピトープ、クラスＨＬＡ−Ａ２由来のＨＥＲ−２ＣＴＬエピトー
プ、およびクラスＨＬＡ−Ｂ２７由来のＨＥＲ−２ＣＴＬエピトープを含む。こ
の共リンカーキメラペプチドは、１４〜２２のアミノ酸の長さの乱交雑Ｔｈエピ
トープである第２の単位をさらに含む。この第２の単位は、リンカーにより第１
の単位のアミノ末端またはカルボキシ末端に連結される。

【００３６】 （Ａ．エピトープおよび共リンカーキメラペプチドの調製） ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープ、ＣＴＬエピトープ、キメラ、および多価ペプ
チドは、好ましくは、市販のペプチド合成機を用いて合成される。好ましくは、
Ｋａｕｍａｙａら、「ＤＥＮＯＶＯ」 ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＯＦ ＰＥＰ
ＴＩＤＥ ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＩＣ ＡＮＤ ＡＮＴＩＧＥＮＩＣ ＤＥＴＥＲ
ＭＩＮＡＮＴＳ ＡＳ ＰＯＴＥＮＴＩＡＬ ＶＡＣＣＩＮＥＳ，Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ，Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａ
ｃｔｉｖｉｔｙ（１９９４），１３３−１６４頁、これは本明細書中で参考とし
て援用されるに記載される化学法が用いられる。

【００３７】 ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープ、ＨＥＲ−２ＣＴＬエピトープ、およびキメラ
ペプチドはまた、無細胞翻訳系、ならびにエピトープおよびペプチドをコードす
るＤＮＡ構築物由来のＲＮＡ分子を用いて生成され得る。あるいは、エピトープ
またはキメラペプチドは、それぞれのエピトープまたはキメラペプチドをコード
するＤＮＡ配列を含む、発現ベクターを用いて宿主細胞をトランスフェクトする
ことにより作製され、次いで、宿主細胞においてポリヌクレオチドの発現を誘導
する。組換え産生について、エピトープ、キメラペプチド、またはその改変体を
コードする１つ以上の配列を含む組換え構築物は、カルシウムリン酸トランスフ
ェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクシ
ョン、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、形質導入、スクレイプレイディング（ｓｃｒａｐｅ
ｌａｄｉｎｇ）、ボリスティックイントロダクション（ｂｏｌｌｉｓｔｉｃ ｉ
ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、またはインフェクションのような、従来の方法によ
り宿主細胞へと導入される。

【００３８】 ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープ、ＣＴＲエピトープおよびキメラペプチドは、
適切な宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母、細菌、昆虫細胞または他の細胞
）中で、従来の技術を使用して適切なプロモーターの制御下で発現され得る。適
切な宿主には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃｏｓ細胞および２９３
ＨＥＫ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。適切な宿主菌株の形質転換お
よび適切な細胞密度への宿主菌株の増殖に続いて、細胞を遠心分離により採取し
、物理的または化学的手段により破壊し、そして得られた粗製の抽出物がエピト
ープまたはキメラペプチドのさらなる精製のために保持される。

【００３９】 形質転換された宿主細胞から組換えタンパク質を単離するための従来の手順（
例えば、細胞ペレットまたは細胞培養培地からの最初の抽出、続いて塩析、そし
て水性イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー工程、お
よび高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ならびにアフィニティークロマ
トグラフィーを含む１つ以上のクロマトグラフィー工程による単離）を使用して
組換えペプチドを単離し得る。グリコシル化エピトープおよびキメラペプチドを
作製するために、組換え技術を使用することが好ましい。同じものを含むグリコ
シル化エピトープおよびキメラペプチドを作製するために、哺乳動物細胞（例え
ば、Ｃｏｓ−７およびＨｅｐ−Ｇ２細胞）を組換え技術において使用するのが好
ましい。

【００４０】 上の表１および表２に示されるＨＥＲ−２ ＢエピトープおよびＨＥＲ−２
ＣＴＬエピトープの天然に存在する改変体がまた、例えば、ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を用いて適切なｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリ
ーをスクリーニングすることによって単離され得る。

【００４１】 （Ｂ．多価ＨＥＲ−２ Ｂ細胞ペプチド、多価ＣＴＬペプチド、および多価Ｂ
／ＣＴＬペプチドの調製） ＨＥＲ−２多価ペプチドを調製するための好ましい合成アプローチは、コンビ
ナトリアルＦｍｏｃ／ｔブチル、Ｆｍｏｃ／ベンジルおよびＢｏｃベンジルスト
ラテジーならびに第４レベルの差示的保護基（Ｎｐｙｓ）ストラテジーを利用す
る。このようなアプローチの詳細は、Ｌａｒｉｍｏｒｅら（１９９５）Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６９：６０７７−６０８９に示され、これは
本明細書中で参考として具体的に援用される。

【００４２】 （Ｃ．表１に示されるＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープの機能的等価体の同定） 上にしめされるＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープの機能的等価体は、一般的に、
エピトープの配列を改変し、次いで免疫応答（例えば、抗体の産生）を刺激する
能力についてアッセイすることによって同定され得る。例えば、このようなアッ
セイは、一般的に、改変されたポリペプチドおよび乱交雑Ｔｈ細胞エピトープを
含むキメラペプチドを調製し、キメラペプチドを試験動物に注射し、そして抗体
をアッセイすることによって実行され得る。このような抗体は、血清および腹水
を含む種々の体液において見出され得る。手短には、体液サンプルは、温血動物
（例えばヒト）から単離される。このため、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドに
特異的な抗体が存在するか否かを決定することが望ましい。体液を、免疫複合体
がポリペプチドとこのタンパク質に特異的な抗体との間に形成し得るのに十分な
条件および時間で、ＨＥＲ−２／ｎｅｕポリペプチドとともにインキュベートし
、次いで、好ましくは、ＥＬＩＳＡ技術を使用してアッセイする。このような技
術において、比色の変化を４９０ｎｍにて測定する。ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパ
ク質に対して１０，０００以上の力価を示す抗体の産生を誘導するエピトープが
好ましい。本明細書中で使用されるように、１０，０００の力価は、バックグラ
ウンドより上の０．２の吸収値を示す。

【００４３】 （Ｄ．表２に示されるＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープの機能的等価体を同定す
る方法） 表２に示されるＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープの機能的等価体を、配列を改変
し、次いで得られたポリペプチドを免疫応答（例えば、Ｔｃ細胞の活性化）を刺
激する能力についてアッセイすることによって同定する。ＣＴＬエピトープとの
最初に遭遇において、少数の免疫Ｔ細胞がリンホカインを分泌し、エフェクター
およびメモリーＴ細胞に増殖および分化する。一次免疫反応はインビボで生じる
が、インビトロで検出するのは難しい。メモリーＴ細胞による同じＨＥＲ−２抗
原（すなわち、ＣＴＬエピトープ）との後の遭遇は、より早くより強力な免疫応
答を導く。二次応答は、インビボまたはインビトロのいずれかで生じる。従って
、インビトロ応答は、増殖の程度、サイトカイン産生の程度、またはＨＥＲ−２
抗原に対して再曝露されるＴ細胞集団の細胞質溶解性活性の生成を測定すること
によって容易に評価される。Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって
達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度を測定することによっ
て検出され得る。増殖するように刺激されたＴ細胞は、ＤＮＡ合成の増加速度を
示す。ＤＮＡ合成の速度を測定するための代表的な方法は、例えば、トリチウム
化されたチミジン、新たに合成されたＤＮＡに組み込まれるヌクレオシド前駆体
を用いてＴ細胞をパルス標識することによる。トリチウム化されたチミジンの量
は、液体シンチレーション分光光度計を使用して決定され得る。Ｔ細胞増殖を検
出するための他の方法には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生、Ｃａ²⁺フ
ラックス、または色素取り込み（例えば、３−（４，５−ジメチルチアゾール−
２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）の増加を測定することが挙げ
られる。あるいは、リンホカイン（例えば、インターフェロン−γ）の合成が測
定され得るか、またはインタクトなＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に応答し得る
Ｔ細胞の相対的な数が定量化され得る。

【００４４】 （ポリヌクレオチド） 本発明はまた、Ｂ細胞エピトープ、ＣＴＬエピトープ、および本発明のキメラ
ペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリ
ヌクレオチドはまた、ストリンジェントな条件下、好ましくは高ストリンジェン
トな条件下で、ヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る配列を有するポリヌク
レオチドを含む。ハイブリダイゼーション条件は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍ
ｅｌ（１９８７）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ
１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されるように、核酸結合複合体、
またはプローブの融解温度^TMに基づく。本明細書中で使用される場合、用語「ス
トリンジェントな条件」は、約Ｔｍ−５（プローブの融解温度の５℃下）〜Ｔｍ
の約２０℃下の範囲内で生じる「ストリンジェンシー」である。本明細書中で使
用される場合、「高ストリンジェント」条件は、少なくとも０．２×ＳＳＣ緩衝
液および少なくとも６５℃を使用する。当該分野で認識されるように、ストリン
ジェンシー条件は、変化する多くの要因（例えば、プローブの長さおよび性質（
すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）；標的配列の長さおよび性質、ハイブリダイゼ
ーション溶液の塩および他の成分（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、
およびポリエチレングリコール）の濃度）によって達成され得る。これらの要因
の全ては、上記に列挙される条件と等価なストリンジェンシーの条件を生成する
ために変更され得る。

【００４５】 ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープ、ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープまたは本発明の
キメラペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドは、全体的または一部
に化学的方法、または好ましくは、当該分野で公知の組換え方法を使用して合成
され得る。ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープまたはＣＴＬエピトープをコードするポ
リヌクレオチドは、このようなポリヌクレオチドを含むクローンを同定するため
に、それぞれＨＥＲ−２タンパク質またはＣＴＬタンパク質に対して免疫特異的
な抗体を用いて、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングすることによって得られ得る。

【００４６】 このポリヌクレオチドは、ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープ、ＣＴＬエピトープま
たはキメラペプチドを産生するために有用である。例えば、多価キメラペプチド
をコードするＲＮＡ分子は、このようなポリペプチドを調製するための、細胞を
含まない翻訳系において使用される。あるいは、ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープ、
ＣＴＬエピトープまたはキメラペプチドをコードするＤＮＡ分子は、発現ベクタ
ー中に導入され、そして細胞を形質転換するために使用される。適切な発現ベク
ターとしては、例えば、染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列（例えば、Ｓ
Ｖ４０、細菌プラスミド、ファージＤＮＡの誘導体；酵母プラスミド、プラスミ
ドとファージＤＮＡとの組合わせ由来のベクター、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワ
クシニア、アデノウイルス、禽痘ウイルス、仮性狂犬病、バキュロウイルス、お
よびレトロウイルス））が挙げられる。ＤＮＡ配列は、従来の手順によって発現
ベクターに導入される。

【００４７】 従って、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド配列のうち１つ以上を含む
組換え構築物に関する。適切な構築物としては、例えば、ベクター（例えば、プ
ラスミド、ファージミド、またはウイルスベクター）が挙げられ、この中に、Ｈ
ＥＲ−２Ｂ細胞エピトープ、ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープまたはキメラペプチ
ドをコードする配列が挿入される。この発現ベクターにおいて、エピトープまた
はキメラペプチドをコードするＤＮＡ配列は、発現制御配列（すなわち、プロモ
ーター）に作動可能に連結され、これはｍＲＮＡ合成を指向する。このようなプ
ロモーターの代表例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージλＰＬプロモーター、および原核生物細胞ま
たは真核生物細胞あるいはウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが公知
の他のプロモーターが挙げられる。この発現ベクターはまた、好ましくは、翻訳
開始および転写ターミネーターのためのリボソーム結合部位を含む。好ましくは
、組換え発現ベクターはまた、形質転換された細胞（すなわち、異種ＤＮＡ配列
を発現する細胞）の選択を可能にするために、複製起源および選択マーカー（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子）を含む。ＨＥＲ−Ｂ細胞エピト
ープ、ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープまたはキメラペプチドをコードするポリヌ
クレオチド配列は、翻訳開始および終結配列を用いて、インフレームでベクター
に組み込まれる。好ましくは、このポリヌクレオチドは、ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピ
トープ、ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープ、またはキメラペプチドのアミノ末端に
作動可能に連結されたシグナル配列をさらにコードする。

【００４８】 ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープ、ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープまたはこのよう
なエピトープを含むキメラペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該分野
で周知の技術を使用して、組換えペプチドを発現するために使用され得る。この
ような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕ
ｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ＆Ｓｏｎｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹに記載される。ＨＥＲ−２Ｂ細胞エピトープ、ＨＥＲ−
２ ＣＴＬエピトープまたはこのようなエピトープを含むキメラペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドはまた、動物を免疫するために使用される。

【００４９】 （薬学的組成物） キメラＨＥＲ−２Ｂ細胞ペプチドおよび多価ＨＥＲ−２Ｂ細胞ペプチド、ＨＥ
Ｒ−２ＣＴＬペプチド、およびそれらをコードするＨＥＲ−２Ｂ／ＣＴＬペプチ
ドまたはポリヌクレオチドを含む薬学的組成物は、好ましくは、薬学的組成物（
例えば、免疫原性組成物またはワクチン）としての使用のために処方される。こ
のような組成物は、一般に、１つ以上のＨＥＲ−２キメラペプチドまたは多価ペ
プチド、または薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤と組み合わせ
てそれらをコードするポリヌクレオチドを含む。このようなキャリアは、使用さ
れる容量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。

【００５０】 エピトープに加えて、多価のペプチド、およびキメラペプチド（抗原として機
能する）またはそれをコードするポリヌクレオチド、他の成分（例えば、抗原送
達のためのビヒクルおよびタンパク質の免疫原性を改善するように設計された免
疫刺激物質）は、好ましくは、薬学的組成物に含まれる。抗原送達のためのビヒ
クルの例として、アルミニウム塩、油中水エマルジョン、生分解性油ビヒクル、
水中油エマルジョン、生分解性マイクロカプセル、およびリポソームが挙げられ
る。キメラペプチドを含むワクチンに対して、抗原送達のための好ましいビヒク
ルは、生分解性ミクロスフィアであり、これは、好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラ
クチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）から構成される。

【００５１】 当業者に公知の任意の適切なキャリアが本発明の薬学的組成物に使用され得る
場合、キャリアの型は、投与の形態および実質的放出が所望されるかどうかに依
存して変化する。非経口的投与（例えば、皮下注射）の場合、キャリアは、好ま
しくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を含み得
る。生分解性ミクロスフィア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）はまた、本発明の
薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。必要に応じて、薬学的組成
物は、アジュバントを含む。

【００５２】 ＨＥＲ−２キメラペプチドおよび多価ペプチドならびにそれらをコードするポ
リヌクレオチドは、被験体または細胞株において、体液性応答、好ましくは細胞
性免疫応答（例えば、抗原特異的細胞溶解性Ｔ細胞の発生）を改善または誘発す
るのに有用である。本明細書中で使用されるように、用語「被験体」は、任意の
温血動物、好ましくはヒトをいう。被験体は、癌（例えば、乳癌）に羅患されて
いてもよいし、または正常（すなわち、検出可能な疾患および感染を有しない）
であってもよい。薬学的組成物は、特に、乳癌の家族履歴を有するか、または乳
腫瘍が除去された女性を処置するのに有用である。

【００５３】 （処置の方法） 本発明はまた、ＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現に関連した癌を処置する方法
を提供する。「処置」は、腫瘍の増殖を阻害または遅延または抑制することを意
味する。このような癌として、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌および前立腺癌が挙
げられる。この方法は、本発明の１つ以上のキメラペプチドまたは多価ペプチド
を含む薬学的組成物を被験体に投与する工程を包含する。好ましい多価ペプチド
は、以下のエピトープの１つ以上を含むものである：ＨＥＲ−２（６２８−６４
７）、ＨＥＲ−２（３１６−３３９）、およびＨＥＲ−２（４８５−５０３）。
好ましくは、３週間おきの複数回の筋肉内注射が、薬学的組成物を投与するため
に使用される。

【００５４】 （実施例） 例示の方法は、以下に記載されるが、本明細書中に記載されるものと同様また
は等価の方法および材料は、本発明のペプチド、組成物および方法の実施または
試験に使用され得る。本明細書中で言及される全ての公報および他の引用文献は
、それらの全体を通して、参考として援用される。材料、方法、および実施例は
、例示するのみにすぎず、限定することを意図しない。

【００５５】 （ペプチド合成およびＨＰＬＣ精製） ペプチドは、以前に記載されるように合成した（Ｋａｕｍａｙａ １９９４）
。簡潔に言えば、ペプチドは、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ９６００
ペプチド合成機で、固体支持体として４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を使
用して合成した（置換０．５４ｍｍ／ｇ）。リンカーとして４−（ヒドロキシメ
チル）フェノキシ酢酸を使用するＦｍｏｃ／ｔ−ブチル合成法を使用した。最終
脱保護工程後、保護基およびペプチド樹脂結合を、９０％ＴＦＡ、５％アニソー
ル、３％チオアニソール、２％エタンジチオールで切断した。粗ペプチドを、３
２．５℃で、Ｖｙｄａｃ Ｃ４（１０ｍｍ×２５ｃｍ）カラムを使用するセミ分
取（ｓｅｍｉｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣによって精製した。緩衝液は、
Ｈ₂Ｏ中０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリル中０．１％ＴＦＡであった。ペプ
チドは、「乱交雑な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）」Ｔ細胞エピトープＭＶＦ２８
８−３０２（Ｋａｕｍａｙａ１９９４）：ＤＷ１ＭＶＦ（ＨＥＲ−２ ３７６−
３９５）、ＭＶＦＤＷ４（６２８−６４７）、ＤＷ５ＭＶＦ（１１５−１３６）
、ＤＷ６ＭＶＦ（４１０−４２９）を組み込む。

【００５６】 （ゲル濾過） ２０ｍｇ／ｍｌの酸性化ペプチド溶液（ＤＴＴ中０．１ｍｇ／ｍｌ）をＳｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム上に充填し、そして５ｍｌの画分を０．１Ｍ ＨＯ
Ａｃで溶出した。ペプチドサンプルを分光学的に２３５ｎｍで測定し、吸光度の
値を時間に対してプロットした。０．１を超える吸光度の値を有し、ＤＴＴの前
に溶出するサンプルをプールし、凍結乾燥した。この反応をＥｌｌｍａｎ試薬に
よる完了について、４１０ｎｍにて、モニターした。

【００５７】 （キャピラリーゾーン電気泳動） ＣＺＥを、ＩＢＭコンピューターとインターフェースしたＢｅｃｋｍａｎ Ｐ
／ＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ２１００で行った。サンプルを、１００ｍＭホウ酸化
ナトリウム中で、５０ｃｍキャピラリーを使用して、２０分間以上電圧分離した
（１５ｋＶ）。溶出物を２１４ｎｍでモニターした。

【００５８】 （円二色性および質量分析） 測定を、ＩＢＭコンピューターとインターフェースしたＪＡＳＣＯ Ｊ−５０
０分光偏光計で行った。機器を、アンモニウム−ｄ−１０−カンファースルホネ
ートの０．０６％（ｗ／ｖ）溶液中で較正した。ペプチド（水中のペプチドスト
ックの希釈により、６２．５〜２５０μＭ）ＣＤスペクトルを、０．１ｃｍ光路
長の円柱状石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ）中で周囲の温度で測定した。平均残
余楕円率（ｍｄｅｇ）を、関係［θ］＝１００θ／ｃｎｌを使用して計算し、こ
こで、θは楕円率であり、ｃはペプチド濃度（ｍＭ）であり、ｎはペプチド中の
アミノ酸の数であり、そしてｌは光路長（ｃｍ）である。高速原子衝撃（ｆａｓ
ｔ ａｔｏｍ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（ＦＡＢ）質量分析測定を、ｉｎｎｅ
ｇａｎＭａｔ−９００機器で行った。

【００５９】 （酢酸水銀） ペプチドを少量の水中に溶解し、１００ｍｇ／ｍｍのＳ−ｔＢｕ溶液（２〜１
０倍過剰）を加えた。ペプチドを真空下に置き、撹拌下、５５℃の水浴中で２−
メルカプトエタノールによって沈殿させた。湿らせたＣｅｌｉｔｅに通して濾過
した後、濾液をロータリーエバポレーターにかけ、水中０．１％ＴＦＡで酸性化
し、凍結乾燥した。

【００６０】 （生物学的手順） （免疫および動物） 雌性ニュージーランド白ウサギを、Ｍｏｈｉｃａｎ Ｖａｌｌｅｙ Ｒａｂｂ
ｉｔｒｙ（Ｌｏｕｄｅｎｖｉｌｌｅ，ＯＨ）から得た。ウサギを、皮下の複数の
箇所にて、ＣＦＡ中で乳化した１ｍｇのペプチドの全てを用いて免疫化した。後
のブースター注射（ＰＢＳ中の１ｍｇおよび５００μｇ）を最初の免疫化の３週
間後および６週間後に与えた。血清を回収し、３０分間、５６℃までの加熱によ
って補足的に不活性化した。血清アリコートを−５℃〜−１５℃で保存した。抗
体を硫酸アンモニウム沈殿によって精製した：飽和硫酸アンモニウム溶液（ＳＡ
Ｓ）のストック溶液を調製し、高圧滅菌し、そして４℃まで冷却した。抗体を、
冷却室中の撹拌下でＳＡＳを３５％ｖ／ｖまでゆっくり加えることによって沈殿
させた。サンプルを１４，０００×ｇで２０分間遠心分離し、この上清（ｓｕｐ
ｅｍａｔｅ）を−２０℃で保存した。ペレットを元の容量の半分で０．１Ｍ Ｐ
ＢＳで溶解した。次いで、画分をＳｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセット（Ｐｉｅ
ｒｃｅ）中に置き、２００容量を越えるｐＨ８、０．１５ＭのＮａＣｌの頻繁な
変化に対して透析した。この生理食塩水を数滴の０．１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ８に
した。ＩｇＧ濃度を、放射免疫拡散（ＲＩＤ）（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉ
ｔｅ，ＵＫ）によって決定した。モノクローナル抗体をＯｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅから購入した。

【００６１】 （直接ＥＬＩＳＡ） Ｕ字底のポリ塩化ビニルプラスチックアッセイプレート
を、１００μｌのＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの抗原で、４℃で一晩コートした。非特
異的結合部位を、２００μｌのＰＢＳ−１％ ＢＳＡで１時間ブロックし、そし
てプレートをＰＢＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１％ウマ血清を含む
、リン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄した。ＰＢＴ中１／５００のウサギ抗血清ま
たは１／５０のマウス抗血清を、抗原コートプレートに添加し、ＰＢＴ中１：２
に段階希釈し、そして２時間室温でインキュベートした。プレートの洗浄後、５
０μｌの１／５００ 西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．）結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧを、各
ウェルに添加した。過剰の抗体結合体を除去し、そして結合した抗体を、０．５
ｍｇ／ｍｌの２，２’−アミノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホ
ン酸）を発色団として含有する、２４ｍＭ クエン酸、５ｍＭ リン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ ５．２）中の０．１５％Ｈ₂Ｏ₂ ５０μｌを使用して検出した
。発色を１０分間進行させ、そして反応を、２５μｌの１％ドデシル硫酸ナトリ
ウムで停止した。吸光度を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７００ ＥＬＩＳＡリーダ
ーを使用して、４１０ｎｍで測定した。結果を、バックグラウンドを差し引いた
後の二連のウェルの平均吸光度として表す。

【００６２】 （細胞培養） 保存培養物を、５％ ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で維
持した。全ての培養培地、ＦＣＳおよび補助剤を、ＧＥＢＣＯ（Ｇｒａｎｄ Ｉ
ｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入した。ヒト乳腺癌細胞株ＳＫＢＲ−３およびＭＣＦ
−７を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
から得て、そして１０％ ＦＣＳおよびＬ−グルタミンを補充したＭｃＣｏｙ
５ＡまたはＤＭＥＭ中で継代培養した。Ｃａｖ−１を、１０％ ＦＣＳおよびＬ
−グルタミンを含む、ＲＰＭＩ １６４０中で維持した。Ｃａｖ−１は、冷凍保
存しそしてその後培養した、新鮮な結腸腫瘍検体から誘導し；これは、検出可能
なレベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現しない。ＳＫＢＲ３は、ＨＥＲ−２タンパ
ク質を過剰発現する乳房腫瘍細胞株であり、ＭＣＦ−７は、通常の濃度のこのタ
ンパク質を発現する。

【００６３】 （免疫沈降およびウエスタンブロッティング） ０日目に、１．０×１０⁷の
ＳＫＢＲ３細胞を、７５ｃｍ³細胞培養フラスコ中にプレートし、一晩接着させ
た。抗ペプチド抗体を、４時間添加した（１００μｇ／ｍｌ）。この反応を、培
地を吸引しそして直ぐに氷冷０．１Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を添加
することによって停止した。細胞をトリプシン処理し、冷却したハンクス平衡塩
類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄した。３ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄、１０μｇ／ｍｌのア
プロチニンおよびロイペプチンの各々を含有する、冷却した溶解緩衝液（１５０
ｍＭ ＮａＣｌ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８；１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ
ピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭ フッ化ナトリウム；１％ ＮＰ−４０、０
．１％ ＳＤＳ）を、１００μｌのＨＢＳＳ中に再懸濁した細胞に添加した。４
℃で２０分間の緩やかな回旋によって、溶解を達成した。遠心分離（１４，００
０×ｇ、２０分）して細胞細片を除去した後、溶解物を、３〜５μｇの抗体およ
び３０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）と共に一晩インキュベートした。ビーズを、遠心分離（１４，０
００×ｇ、３０秒）によってペレット化し、１ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄を含む溶解緩衝
液中で２回洗浄し、そしてＳＤＳサンプル緩衝液中で５分間煮沸した。

【００６４】 タンパク質を、７．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロー
スに転写し、そして抗体をプローブした。タンパク質の移動を、前染色した分子
量スタンダード（ＢｉｏＲａｄ）でモニターした。免疫反応性のバンドを、増強
化学ルミネセンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって、西洋ワサビペルオキシダーゼ
結合体化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンを使用して検出した。

【００６５】 （間接的結合アッセイ） ＳＫＢＲ３細胞またはＭＣＦ−７細胞を、Ｖ字底プ
レート（Ｌｉｎｂｒｏ、ＭｃＬｅａｎ ＶＡ）中、５，０００細胞／ウェルでプ
レーとした。細胞を、種々の濃度の抗体と共にインキュベートした。ハンクス平
衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した後、細胞を、フルオレセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）結合体化ヤギ抗ウサギ抗体またはヤギ抗マウス抗体と共に１時
間インキュベートし、そしてホルマリンで固定した。マウスモノクローナルＡｂ
（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｎｅｃｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、ポジテ
ィブコントロールとして用い、抗ＣＤ３ Ａｂを、ネガティブコントロールとし
て用いた。細胞を、４８８ｎｍでの励起のためのアルゴンレーザーおよびＦＩＴ
Ｃ蛍光に対する５２５ランのバンドパスフィルターを有するＣｏｕｌｔｅｒ Ｅ
ＬＩＴＥフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）によ
って分析し、５．０×１０³細胞を、各サンプルについて計数し、最終処理を行
った。細片、細胞クラスターおよび死細胞を、光散乱評価によってゲートアウト
し、その後、単一パラメーターのヒストグラムを作成した。

【００６６】 （細胞増殖に対するＡｂの効果） ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ７およびＣＡＶＩ細胞
を、０日目に、種々の濃度のＡｂと共に、Ｖ字底プレート中に５，０００細胞／
ウェルでプレートした。３日目に、［³Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）を細
胞にパルスし、この時、これらの細胞を、１時間、−２０℃のフリーザー中に配
置した。室温で解凍した後、細胞を、ＰＨＤ細胞回収機（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）で回収した。サンプルを、５ｍｌのＲｅａｄｙ Ｓａｆｅ
液体シンチレーション混液（Ｂｅｃｋｍａｎ）中でインキュベートし、放射活性
を、βカウンターで測定した。結果を、平均ＣＰＭ＋／−標準偏差（ＳＤ）とし
て表す。

【００６７】 （ＣＴＬアッセイ：インビトロ刺激） 鼡径部および大動脈周囲のリンパ節（
ＬＮ）を、免疫後７〜１０日で取り出す。次いで、１時間、１μＭの適切なＣＴ
Ｌペプチドを前パルスした１．５×１０⁵の照射（１０，０００ラド）Ｐ８１５
細胞と共に共培養することによって、ＬＮ細胞（４×１０⁶〜５×１０⁶）をイン
ビトロで刺激した。使用した培養培地は、ｃＤＭＥＭ（１０％ ＦＣＳを補充し
たＤＥＭＥ）である。上清は３０Ｕ／ｍｌ（最終）のＩＬ−２、２ｍＭ Ｌ−グ
ルタミン、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび５×１０⁵Ｍ ２−メルカプトエタノー
ルを含む。

【００６８】 インビトロ刺激７日後、ＣＴＬ活性を、標準的なクロム放出アッセイにおいて
試験する。Ｐ８１５細胞（１０⁶）を、適切なペプチド（１μＭ）の存在下また
は非存在下で、３７℃で１時間、１５０μＣｉのクロム酸ナトリウム［⁵¹Ｃｒ］
で標識し、そして３回洗浄した。標識した標的（２×１０³）を、Ｖ字底の９６
ウェルプレート中に２００μｌ容量で、予め決定した比の刺激したＬＮ細胞と共
に同時インキュベートした。３７℃で４時間のインキュベーション後、上清（１
００μｌ）を、γ計数のために回収する。特異的溶解％を、１００×［（実験で
の放出−自然放出）／（全体−自然放出）］として計算する（Ｖａｌｍｏｒｉら
、１９９４）。

【００６９】 （インビボでの抗体の効果） ＨＥＲ２細胞（３×１０⁶）を、２５０μＬ
ＰＢＳ中に懸濁し、氷上で２５０μｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ）と混合し、そしてマウスに皮下注射した。ポリクローナル抗
体を、２ｍｇ／マウスの全濃度で、９日目および１１日目にｉ．ｐ．注射した。
腫瘍体積を、カリパスで１週間に２回測定し、そして式（長さ×幅×高さ）によ
って計算した。

【００７０】 （実施例１−ペプチドＤＷＩ ＭＶＦ；ＨＥＲ−２（３７６−３９５）ＭＶＦ
） ＤＷ１と名付けたエピトープは、乱混雑なＴｈ細胞エピトープＭＶＦに連結し
た、ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸３７６〜２９１を含む。ＤＷ１は、わずか
にターン傾向を有する、α−ヘリックスであると予測される。

【００７１】 （合成）：２０アミノ酸のＨＥＲ−２配列を、４アミノ酸連結配列Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（配列番号２０）によってＭＶＦ２８８〜３０２のＮ末端
に連結させた。この得られたペプチドを、ＤＷ１ＭＶＦと名付け、これは、Ｎ末
端側でのＤＷ１の配置を示し、対して、ＭＶＦＤＷ１は、Ｃ末端側の配置を表す
。最初のアミノ酸を手動で連結し、そしてＫａｉｓｅｒニンヒドリン試験によっ
て完了をモニターした。その後のカップリングを、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓ
ｅａｒｃｈ ９６００ペプチド合成機上で行った。最後の脱保護後、ペプチドを
、試薬ＰＵで樹脂から切断した。このペプチドは、Ａｒｇ−２，２，５，７，８
−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ＰＭＣ）およびＨｉｓを含むので、
長い切断時間が必要である（ヒスチジンが存在する場合、黄色の切断溶液が観察
される）。

【００７２】 （精製および特徴付け）：ペプチドを回転エバポレート（ｒｏｔａｒｙ ｅｖ
ａｐｏｔａｔｅ）して、ＴＦＡを除去し、冷エーテルで沈殿させ、そして水／エ
ーテル抽出した。抽出はかなり容易であり、そしてゲル濾過し、凍結乾燥したペ
プチドのＨＰＬＣ分析により、２〜３の欠失ペプチドが示された。このペプチド
は、ＤＴＴの前に２つのピークとして溶出した。これらをプールし、そして分析
ＨＰＬＣに供した。

【００７３】 半調製（ｓｅｍｉｐｒｅｐ）精製ＤＷ１ＭＶＦの分析ＢＰＬＣにより、１つの
大きいピークを同定したが、ＣＺＥは、異なる電荷の３つの種を同定した。完全
なペプチドは、中性のｐＨで、６つの負に荷電した種および４つの正に荷電した
種を含む。質量分析の結果、大きいピークは、分子量４４７２の目的のエピトー
プであることが確認された。稀酢酸液中のペプチドのＣＤスペクトルは、わずか
なランダムコイルを示す。ＴＦＥ中では、構成は、わずかなαらせんに偏向し、
これは１９０〜１９５ｎｍの範囲で最大強度、そして２０８ｎｍおよび２２２ｎ
ｍで最小強度であった。ペプチドの螺旋構造［θ₂₂₂，−５，０００］を、１０
０％螺旋θ₂₂₂についてのポリスチレンの平均楕円率＝−３３，０００として、
Ｃｈｅｎの式を用いて算出した。

【００７４】 （実施例２−ペプチドＭＦＶＤＷ４；ＨＥＲ−２（６２８−６４７）ＭＶＦ） ＭＶＦＤＷ４は、ＨＥＲ−２タンパク質の６２８〜６４７のアミノ酸から伸長
するペプチドの変化した配列を含む。ネイティブ配列は、３つのシステイン残基
を含む。この残基のジスルフィド結合対は未知である。６３４位および６４２位
のシステインは、架橋を形成する能力を有するので、Ｃｙｓ６３０をＧｌｙで置
換した。システインのグリシン置換は、その位置でのＲ基の相対サイズを保存す
るための１つの方法である。リンカーに結合したＤＷ４（６２８〜６４７）ペプ
チドをまず作成することにより合成が進行し、次いで、ＮＷＦ（２８８〜３０２
）ヘルパーＴ細胞配列の付加によってＮ末端に配列が伸長する。これにより、Ｍ
ＶＦＤＷ４ペプチドを産生した。

【００７５】 ジスルフィド結合を生成するため、ｔＢｕｔ保護基を切断して、遊離のチオー
ル形態を得た。酢酸水銀／２−メルカプトエタノール手順によって、ジスルフィ
ド結合したマルチマーの生成を減じる。粗産物およびサンプルの分析ＨＰＬＣを
比較した。粗サンプルにおいて、２つの先鋭なピークの直後に広い不明瞭な肩が
続く。処理サンプルによって、最初のピーク（ｌｅａｄｉｎｇ ｐｅａｋ）およ
びより広がった第２のピークのサイズの減少が示された。正しい画分を、質量分
析によって後に同定した。この分析によってこのペプチドの分子量が４６１２と
確認された。

【００７６】 新しいピークの同定を行うため、過酸化水素またはジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）を粗サンプルに添加した。過酸化水素の添加は、酸化を生じた。

【００７７】 ２ＲＳＨ＋Ｈ₂Ｏ₂→Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ＋Ｈ₂Ｏ この反応により、１１．５分で溶出する単一の大きいピークが得られた。これ
は、粗サンプルの最初のピーク（ｌｅａｄｉｎｇ ｐｅａｋ）に対応する。ＤＴ
Ｔ処理は、以下の反応スキームによる還元を生じる。

【００７８】 Ｒ−ＣＨ₂−Ｓ−Ｓ−ＣＨ₂＋ＤＴＴ→Ｒ−ＣＨ₂−ＳＨ＋ＨＳ−ＣＨ₂−Ｒ ＤＴＴ処理産物のプロフィールは、出発物質に似ていた。これらのプロフィー
ルは、出発物質が還元ペプチドおよび酸化ペプチドの混合物であることを示す。
酢酸水銀処理により、還元種に適した濃度に偏向する。

【００７９】 （実施例３−ペプチドＤＷ５ＭＶＦ；ＨＥＲ−２（１１５〜１３６）ＭＶＦ） （合成）：ＭＶＦ２８８〜３０２および４残基アミノ酸リンカーを、上記実施
例１に記載のように、樹脂に連結し、この配列にＨＥＲ−２タンパク質の１１５
〜１３６のアミノ酸を続けた。これによりペプチドＤＷ５ＭＶＦを生成した。こ
の配列は、高い凝集能を有するβターンであると予測される。これは、二重カッ
プリング重要残基Ａｌｌ５、Ｖ１１６、Ｔ１２７、Ｖ１２９およびＳ１３３を必
要とした。

【００８０】 （精製および特徴付け）：ＤＷ５ＭＶＦを切断し、そしてエーテルおよび水で
抽出した。抽出は、ペプチド形態高密度ではかなり困難で、粘着性に凝集し、酢
酸の添加によってほとんど可溶にならなかった。粗サンプルの分析ＨＰＬＣによ
り、１つの顕著なピークがわずかな二重物であることが示された。半調製的ＨＰ
ＬＣを用いて、この二重物を分離した。凍結乾燥サンプルを、分析ＨＰＬＣ用に
、稀酢酸中で容易に溶解した。サンプルを飛行時間質量分析に供し、そして正確
な分子量４４３１を得た。ペプチドは、単一のピークとして１５．５分で溶出す
る。

【００８１】 （実施例４−ペプチドＤＷ６ＭＶＦ；ＨＥＲ−２（４１０−４２９）ＭＶＦ） ＨＥＲ−２の残基４１０〜４２９（ＤＷ６と名付けられた）は、ＤＷ１ＭＶＦ
と同じ領域由来の可能性のある免疫原性エピトープを示す。ＤＷ１ＭＶＦの成功
によって、初期のＦＡＣＳ実験では、本発明者らは、この領域に対してさらなる
抗体が惹起されることを望んだ。残基４１０〜４２９を、以前に記載のとおり、
ＭＶＦ／４−残基−リンカー配列へのＮ末端付加によって合成した。最終産物は
、ＤＷ６ＭＶＦであった。そのＣ末端で中度〜高度凝集能を有するβ−ターンで
あることが期待される。

【００８２】 （合成）：ＤＷ６配列は、ＦＭＯＣ化学を用いてＭＶＦ配列に連結したＣ末端
に結合された。コンピューターアルゴリズムは、高い凝集能を予想し、従って、
カップリング時間の延長および／または２倍のカップリングを用いて、凝集を最
小限にすることを試みた。

【００８３】 （精製および特徴付け）：ＴＦＡ切断によって、ＤＷ６ＭＶＦペプチドを得て
、これをエーテル／水抽出した。このワークアップは、高い程度の凝集によって
、困難であることをなお証明した。ＨＰＬＣによって示されるように、有意な濃
度の欠失ペプチドが存在した。半調製ＢＰＬＣで、大きいピークを分離し、これ
を１３〜１４．５分で溶出した。分析ＢＰＬＣにより、１７分で溶出する単一の
ピークが示された。半調製ＨＰＬＣおよび分析ＨＰＬＣに関する保持時間の差異
は、サンプル注入の時間の３分の違いによる。アミノ酸分析によって、それが目
的のペプチドと同一であることを確認した。誘導体化アミノ酸を、そのフェニル
チオヒダントイン誘導体として分析した（実測値（理論値））：Ａｓｐ（２．９
９（３））、Ｇｌｕ（４．３２（４））、Ｓｅｒ（４．７７（５））、Ｇｌｙ（
３．５３（４））、Ｈｉｓ（１．６２（２））、Ａｒｇ（１．０８（１））、Ｔ
ｈｒ（０．０２（０））、Ａｌａ（０．９７（１）、Ｐｒｏ（３．０２（３））
、Ｔｙｒ（０．９５（１））、Ｖａｌ（３．８６（４））、Ｍｅｔ（０．０９（
０））、Ｃｙｓ（０（０））、Ｉｌｅ（２．８７（３））、Ｌｅｕ（９．３４（
９））、Ｐｈｅ（０．９３（１））、Ｌｙｓ（２．２８（２））およびＴｒｐ（
０（０））。

【００８４】 （実施例５および６−ＤＷ２（３９１〜３９９）およびＤＷ３（３７６〜３９
９） ＤＷ２は、ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸３９１〜３９９を含む。ＤＷ３は
、ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸３７６〜３９９を含む。

【００８５】 （合成）：残基３９１〜３９４を樹脂に結合する。残基３７６〜３９０の付加
により、残りを用いて、合成を続けた。これにより、３７６〜３９９の最終ペプ
チド（ＤＷ３）を得た。

【００８６】 （精製および特徴付け）：半調製ＨＰＬＣにより、ＤＷ２から３つの主なピー
ク（１１分で溶出する）を分離した。ＤＷ３は、混合組成物の２つの主要なピー
クを得た。質量分析によって、ＤＷ２の１１分で溶出する画分は、１０５２の分
子量を有する正しいペプチドであることを確認した。ＤＷ３についてはさらなる
特徴付けは行わなかった。

【００８７】 （実施例１〜６のキメラペプチドの免疫原性） 上記実施例１〜６において記載されたように調製したキメラペプチドは、免疫
後３週程度の初期での高い抗体力価によって証明されるように、非常に高い免疫
原性である。ペプチド配列を認識し、そしてペプチド配列に結合する能力におつ
いて、毎週得た血清をアッセイした。ＤＷ５ＭＶＦは、抗体力価の定常的な上昇
を示した。ＤＷ５ＭＶＦについての力価は、一方のウサギでは、他方よりも高か
った。ウサギ１は、ペプチド免疫原に対する即時の強力な応答を示したが、ウサ
ギ２は、抗体力価の緩徐だが安定した上昇を示した。ＭＶＦＤＷ４は、最も即時
的かつ強力な応答を生じた。これらの際立って高い力価は、第３回目のブースト
後、４週間にわたって最大レベルのままであった。ペプチドＤＷ６ＭＶＦは、４
つの抗体の最低力価であったが、応答は安定しておりそしてウサギ間で比較可能
であった。ポリクローナルＩｇＧ血清は、ＭＶＦ Ｔ細胞配列と交差反応しなか
った。全ての結果は、非近交系で得ており、このことはウサギでの、このペプチ
ドの広い免疫原性を示す。

【００８８】 （ＨＥＲ−２に対するペプチド抗体の特異性） ＦＡＣＳおよび免疫沈降：フローサイトメトリー分析により、ＤＷ１ＭＶＦ抗
ペプチド抗体が、ＨＥＲ−２レセプターを直接標的化することを決定した（図
を参照のこと）。市販のマウスＭａｂ〜ＨＥＲ−２／ｎｅｕを、ＳＫＢＲ３細胞
におけるコントロールとして使用した。陰性コントロール血清は、レセプターに
対する結合を示なかったが、蛍光の増加が免疫血清を用いて見られた。ポリクロ
ーナル抗ペプチド血清の蛍光強度は、モノクローナル抗体に匹敵した。従って、
ポリクローナル血清は、モノクローナル抗体の特異性および親和性を模倣し得る
。

【００８９】 免疫血清を、Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔｓ 溶液で希釈し、
そして平均細胞蛍光を決定した。「三次＋３週」血液由来の血清は、１２１．４
の蛍光値を示し（１：３２０希釈）、一方ＭＡｂは１３２の値を示した。以下は
、様々な血清希釈における平均細胞蛍光値のリストである。

【００９０】 希釈 平均細胞蛍光（ＤＷＬＭＶＦ） コントロール ０．６４７ １：８０ ３９．３ １：１６０ ８３．５ １：３２０ １２１．４ １：６４０ ６９．４ １：１２８０ ３４．４ １：２５６０ １７．４ しかし、ペプチド抗体ＭＲＦＤＷ４、ＤＷ５ＭＶＦ、およびＤＷ６ＭＶＦは、
ＤＷ１ＭＶＦと同じ傾向強度を示さなかった。従って、免疫沈降法を、ＨＥＲ−
２に対する特異性を検証するために使用した。ＳＫＢＲ３細胞を、タンパク質Ａ
／Ｇ精製抗ペプチド抗体を用いて免疫沈降した。抗体は、ＨＥＲ−２反応性ｖ^,
であることが示された。同一のバンドは、Ｍａｂサンプルおよび抗ペプチド抗体
においてはっきり現れる。

【００９１】 （抗ペプチド抗体の生物学的効果の同定） （インビボにおける増殖） 一旦、ＨＥＲ−２に対する特異性を確認すると、次の工程は生物学的活性を決
定することであり、この場合、この活性は、ＨＥＲ−２過剰発現細胞と共にＭＡ
ｂをインキュベーションすることによって生成する腫瘍増殖の減少であった。抗
体または腫瘍細胞のインビトロ効果を、標準トリチウム化チミジン増殖アッセイ
によって決定した。抗体のＤＷ１ＭＶＦ、ＭＶＦＤＷ４、およびＤＷ５ＭＶＦは
、ＳＫＢＲ３細胞のインビトロにおける増殖を減少し得た。正常な量のレセプタ
ーを発現するＭＣＦ−７細胞は、この抗体によって阻害されなかった。逆に、市
販のチロシンリン酸化を減少させるモノクローナル抗体、およびインビトロにお
けるリン酸化もまた減少させるＤＷ６ＭＶＦは、ＳＫＢＲ３細胞における細胞増
殖を刺激した。これらの結果は、ポリクローナル抗体が、生物学的活性が認識さ
れたエピトープに依存するという点でモノクローナルのように挙動し得ることを
示す。さらに、阻害抗体は、正常な量のＨＥＲ−２（ＭＣＦ７）を発現する細胞
に対してごくわずかな効果を有したことに注目することは興味深い。これはまた
、いくつかのモノクローナルについても報告され、そして正常細胞の最小毒性が
所望される乳癌の治療のために有利である。

【００９２】 （インビボにおける増殖） ４つの抗ペプチド抗体のうちの３つは、たとえ異なる程度ではあっても、ヌー
ドマウスモデルにおける腫瘍増殖の抑制において成功した。全ての場合の腫瘍の
減少は、自己リン酸化の減少の結果ではなかった。この結果の要約は、いくつか
の抗体（ＭＶＦＤＷ４およびＤＷ５ＭＶＦ）は、最大腫瘍抑制のための宿主エフ
ェクター細胞を必要とし得ることを示唆する。腫瘍の進行対時間のプロットは、
抗体ＤＷ１ＭＶＦ、ＭＶＦＤＷ４およびＤＷ５ＭＶＦを用いて、腫瘍容積が減少
することを示す。ＤＷ６ＭＶＦは、増殖に対してほんのわずかな効果しか有さな
いようであった。

【００９３】 （細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープの同定） （ＣＴＬアッセイ） ペプチドＤＷ１ＭＶＦ（３７６−３９５）は、オーバーラップＴ細胞エピトー
プ３９１−３９９を有する。本発明者らは、ＨＥＲ−２ワクチンに組み込むため
のこのエピトープの有効性を試験することを所望した。結果は、特定のＣＴＬ応
答が、ＨＥＲ−２誘導性エピトープを生じ得ることを示した。ＨＥＲ−２ ３９
１−３９９で刺激された細胞毒性Ｔ細胞は、用量依存様式で、自己標的を特異的
に溶解し得た。しかし、２つのインビトロ再刺激物は、この結果を生じるために
必要であった。この研究において、ＩＬ−２を培養培地に添加した。Ｔヘルパー
および細胞毒性Ｔ細胞配列の両方を含むペプチドを用いる免疫は、結果を上げる
ことが予測される。

【００９４】 （ラットｎｅｕトランスジェニックマウスにおけるＭＶＦ−ＨＥＲ−２ペプチ
ド構築物の効果） ヒト乳癌細胞と同様の乳房腫瘍を発現するトランスフェニックマウスモデル（
Ｎ２０２と称される）（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｇｕｙ，Ｃ．Ｔ．ら、Ｐｒｏ，Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０５７８−８２，１９９２によって開
発された）を用いて、キメラペプチドの抗腫瘍効果をインビボで試験した。限局
性乳房腫瘍は、マウス乳房腫瘍ウイルスの３’長末端反復配列下のラットｎｅｕ
遺伝子の過剰発現に起因して、約２８週齢の雌性トランスフェニックマウスの少
なくとも５０％で生じた。ＨＥＲ−２ペプチド配列のうち３つ（３７６−３９５
、４１０−４２９、および６２８−６４７）は、ラットｎｅｕにおける類似性領
域に対して８０％より大きい相同性を有する。本発明者らは、初めに、２０％の
アミノ酸配列が相違している場合、ＨＥＲ−２ペプチドを生じる抗体が、ラット
ｎｅｕレセプターを認識し得るか否かを試験した。結果は、ＨＥＲ−２配列（１
１５−１３６）、（４１０−４２９）および（６２８−６４７）を用いて誘導さ
れた抗体は、ｎｅｕ遺伝子過剰発現ＤＨＦＲ−Ｃ８線維芽細胞株からラットｎｅ
ｕレセプターを免疫沈降し得ることを示した。

【００９５】 これらの結果に基づいて、雌のトランスジェニックマウスを、ＨＥＲ−２配列
１１５−１３６、４１０−４２９および６２８−６４７のＭＶＦ構築物ならびに
ＭＶＦ単独で別々に免疫した。ＭＶＦ ＨＥＲ−２（６２８−６４７）は、２度
目のブーストの２週間後に早くも、免疫原に対する５００００を超える高力価の
抗体応答を誘発し、この抗体力価は、３度目のブースト後２５００００を越えた
。ＭＶＦ ＨＥＲ ２（６２８−６４７）に対する抗体はまた、１００００を超
える力価で組換えＨＥＲ−２ ＥＣＤならびにインタクトなＨＥＲ−２および細
胞のラットｎｅｕレセプターと反応した。 トランスジェニックマウスは、ＨＥＲ−２免疫原、１１５−１３６ ＭＶＦおよ
び４１０−４２９ ＭＶＦに対する明らかな抗体応答をマウントしなかった。

【００９６】 ４８週齢まで、全てのトランスジェニックマウスをＭＶＦエマルジョンで免疫
し、ＨＥＲ−２（１１５−１３６）ＭＶＦおよびＨＥＲ−２（４１０−４２９）
ＭＶＦは、少なくとも１０ミリメートルの大きさの腫瘍を発生した。最も顕著に
は、腫瘍細胞増殖のインビトロ阻害に相関して、ＭＶＦ ＨＥＲ−２（６２８−
６４７）で免疫したトランスジェニックマウスの８３％（６匹中５匹）では、完
全に腫瘍がなかった。ＭＶＦ ＨＥＲ−２（６２８−６４７）でワクチン接種し
たマウスは、ＭＶＦエマルジョンで免疫したマウスと比較して、長い腫瘍のない
期間を顕著に示した（ｐ＝０．００２５）。他の群と比較してＭＶＦ ＨＥＲ−
２（６２８−６４７）で免疫したマウスにおいて腫瘍の徴候における遅延がある
ものの、これらが生じた後は腫瘍増殖の反応速度論における顕著な差異はなかっ
た。

【００９７】 （乳房腫瘍細胞株の抗体媒介細胞傷害性） 本発明者らは、ＭＶＦ ＨＥＲ−２（６２８−６４７）によって誘発されたト
ランスジェニックマウス血清において、ＩｇＧ１（５８％）およびＩｇＧ２（３
５％）が主要なアイソタイプであることを見出した。本発明者らは、末梢血の単
核細胞を集めＨＥＲ−２を過剰発現する乳房腫瘍細胞株を融解する能力をＡＤＣ
Ｃアッセイにおいて試験した。トランスジェニックマウスにおいてＨＥＲ−２（
６２８−６４７）によって誘発されたペプチド抗体は、異なる２つのヒト乳房腫
瘍細胞抗体（そのいくつかは変性タンパク質を認識する）の溶解を引き起こした
。

【００９８】 （実施例７：ＨＥＲ−２（２７−４５）） ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸２７−４５、Ｎ末端に麻疹ウイルス融合タン
パク質由来の乱交雑ヘルパーＴ細胞エピトープ（アミノ酸２８８−３０２）、お
よびＧＰＳＬリンカー（ＭＶＦＤＮ１）を含むキメラペプチドを、実施例１で上
述したような手順を使用して合成した。

【００９９】 （実施例８：ＨＥＲ−２（３１６−３３９）） ＨＥＲ−２タンパク質の改変した配列３１６−３３９、Ｎ末端に麻疹ウイルス
融合タンパク質由来の乱交雑（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ヘルパーＴ細胞エピト
ープ（アミノ酸２８８−３０２）、およびＧＰＳＬリンカー（ＭＶＦＤＮ２）を
含むキメラペプチドを、上記の実施例１で記載したような手順を使用して合成し
た。ＨＥＲ−２配列３１９−３３９は、３つのシステインを３３１位、３３４位
および３３８位に含む。分子モデル化ソフトウェア（Ｈｙｐｅｒｃｈｅｍ，Ｈｙ
ｐｅｒｃｕｂｅ Ｉｎｃ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、本発明
者らは、残基３３４および３３８が最も安定なシステイン−システイン結合対を
強く形成することを決定した。一方、合成中に、本発明者らは、システイン３３
１をアラニンに置換して２次構造形成および合成後凝集に対する干渉を防いだ。

【０１００】

【表３】 ＨＥＲ−２（３１６−３３９）エピトープを、破傷風トキソイドの配列５８０
−５８９および９４７−９６７（それぞれＴＴおよびＴＴ３と表される）ならび
に麻疹融合タンパク質の配列２８８−３０２（ＭＶＦと表される）を含むＴｈエ
ピトープに連結し、異なる３つのＨＥＲ−２ Ｂ細胞ペプチドを提供した。

【０１０１】 （実施例９：ＨＥＲ−２（４８５−５０３） ＨＥＲ−２タンパク質の改変した配列４９５−５０８、Ｎ末端に麻疹ウイルス
融合タンパク質由来の乱交雑ヘルパーＴ細胞エピトープ（アミノ酸２８８−３０
２）、およびＧＰＳＬリンカー（ＭＶＦＤＮ３）を含むキメラペプチドを、上記
の実施例１で記載したような手順を使用して合成した。ＨＥＲ−２配列４９５−
５０８は、７５０オングストローム²にわたる抗体の抗原結合部位の約１７−１
８残基の最適なＢ細胞エピトープより４残基短い。一方、抗原結合ポケットによ
り適合するようにこの配列を伸長するために、本発明者らは、抗原性エピトープ
を形成する確率について近接配列に割り当てられたスコアを調べた。配列４８５
−４９９は、Ｗｅｌｌｉｎｇの抗原性スケールで、ＨＥＲ−２細胞外ドメインに
おいて分析した全ての配列で最高のスコアを割り当てられた。このスケールは、
５残基配列が抗原性エピトープを形成する確率を示す。この配列はまた、規定さ
れたβターン（残基４８８−４９１）およびαヘリックス（残基４９１−４９５
）を保有する。従って、本発明者らは、当所示されたエピトープ４９５−５０８
を伸長して４８５−４９９を含んだ。さらに、本発明者らは、配列４９５−５０
８をＣ末端で５残基短縮して、ペプチドの凝集を導き得かつ精製および特徴付け
を困難にし得る５０４位の単一のシステインを除外した。システインに続く４残
基は、規定された二次構造のいずれをも形成しない。このエピトープを、Ｃ末端
で乱交雑Ｔヘルパー細胞エピトープＴＴと連結した（表４を参照のこと）。

【０１０２】

【表４】 （実施例１０：ＨＥＲ−２（６０５−６２２） ＨＥＲ−２タンパク質のアミノ酸６０５−６２２、Ｎ末端に麻疹ウイルス融合
タンパク質由来の乱交雑ヘルパーＴ細胞エピトープ（アミノ酸２８８−３０２）
、およびＧＰＳＬリンカー（ＭＶＦＤＮ４）を含むキメラペプチドを、実施例１
で上述したような手順を使用して合成した。

【０１０３】 （実施例７−１０のペプチドの免疫原性） 実施例７−１０のキメラＨＥＲ−２ペプチドは、免疫した対の繁殖後のウサギ
において可変性の抗体応答を誘発した。最も瞬時でかつ高力価の抗体を、ＭＶＦ
ＨＥＲ−２（３１６−３３９）によって誘発した。低い抗体応答を、他の３つ
のペプチド構築物に対してマウントした。抗体力価における相対的差異にもかか
わらず、キメラペプチドのそれぞれでの免疫に応答して産生した抗体は、フロー
サイトメトリーおよび免疫沈降の両方によってＨＥＲ−２レセプターを認識し得
た。

【０１０４】 繁殖後のウサギでの抗体産生におけるキメラペプチドの組合せの効果をまた、
決定した。これらの結果は、対の繁殖後のウサギにおける単一の免疫原としてか
またはこれらの組合せのいずれかで投与した場合に、Ｂ細胞エピトープ構築物Ｍ
ＷＦＮＤ２、ＭＷＦＮＤ３およびＭＷＦＤＷ４が５００００を超える高力価の抗
体応答を誘発したことを示した。これらのウサギを、まず個々のエピトープで免
疫し、そして４回目のブーストの２週間後に同一のウサギを、まず３つのエピト
ープの１つで、そして後に３つ全てのエピトープで交差免疫した。交差免疫に対
する抗体応答は、良好であるか、または単一の免疫原として投与した場合よりも
良好であった。

【０１０５】 （乳房腫瘍細胞株における実施例７−１０のキメラペプチドの抗増殖性効果） 高順位であるＨＥＲ−２ペプチド配列３１６−３３９およびＨＥＲ−２の４８
５−５０３に対して誘発された抗体は、２つのヒト乳房腫瘍細胞株（ＳＫＢＲ−
３およびＢＴ−４７４）の増殖を阻害した。ＭＶＦ ＨＥＲ−２（３１６−３３
９）抗体は、ＳＫＢＲ−３およびＢＴ−４７４の細胞株の増殖を、未処理または
アイソタイプ抗体で処理した細胞に比べて約３５％および１５％だけ阻害した。
ＭＶＦ ＨＥＲ−２（４８５−５０３）抗体は、ＳＫＢＲ−３細胞の増殖を２２
％およびＢＴ−４７４細胞の増殖を１１％だけ阻害した。ＨＥＲ−２ペプチド２
７−４５および６０５−６２２に対して惹起された抗体は、腫瘍細胞株の増殖に
対する極わずかな効果を有し、そしてアイソタイプコントロール抗体と同様にＢ
Ｔ−４７４細胞の増殖を増加することが示された。実施例７−１０のキメラペプ
チドに対して惹起されたどの抗体のいずれも、別のヒト乳房腫瘍細胞株ＭＣＦ−
７（ＨＥＲ−２の標準レベルだけ発現する）の増殖を阻害しなかった。

【０１０６】 乳房腫瘍細胞株ＳＫ−ＢＲ３の細胞をまた、種々のＨＥＲ−２ペプチド抗体の
混合物を用いて、それぞれ０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で処理した。複数の抗体での
処理によって、単一の抗体での阻害効果より優れたさらなる増殖阻害効果が生じ
た。異なる３つの増殖阻害ペプチド抗体の混合物は、未処理細胞に比べてＳＫ−
ＢＲ−３細胞の増殖を９０％を超えて防止した。乳房腫瘍細胞株ＢＴ４７４の細
胞をまた、種々のＨＥＲ−２ペプチド抗体の混合物を用いて、２６６μｇ／ｍｌ
、５２８μｇ／ｍｌおよび７９２μｇ／ｍｌの濃度で処理した。

【０１０７】 （実施例１１：ＭＶＦＤＷ４−ミクロスフェア） 実施例で上述したように調製されたＭＶＦＤＷ４を、下記のようにミクロスフ
ェア内にロードした。

【０１０８】 （ミクロスフェア調製） ミクロスフェアの調製を、Ｇｌａｓ−ｃｏｌ／Ｇ．Ｋ．Ｈｅｌｌｅｒ ＨＳＴ
１０Ｎ Ｓｔｉｒ−Ｔｅｓｔｅｒを用いて、制御された温度の被膜された（ｊａ
ｃｋｅｔｅｄ）ビーカー内で実施した。ミクロスフェア調製は、０．５８ｄＬ／
ｇの固有の粘度を有する７５／２５ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（
ＰＬＧＡ）を１２０ｍｇ／ｍｌで利用した。ペプチド／ポリマー溶液を、Ｓｐａ
ｎ８５（ソルビタントリオレート）を乳化剤として用いて、４０℃にて鉱油／綿
実油中で乳化した。７５０ｒｐｍで一時間攪拌後、油エマルジョン中の油（ｏｉ
ｌ−ｉｎ−ｏｉｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を、０．４５μｍ膜を通して濾過し、そ
して石油エーテルで数回洗浄した。このフィルターをコニカルチューブ内に置き
、液体窒素で凍結し、そして少なくとも３日間凍結乾燥した。ペプチドローディ
ングをアミノ酸分析によって決定した。

【０１０９】 ミクロスフェアの形態学、表面の特徴、およびサイズを、Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｅ
ｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ＸＬ−３０ ＦＥＧ走査型電子顕微鏡を使用して観察し
た。乾燥サンプルを、スパッターコートした炭素帯電性タブ化標本マウント（ピ
ンの直径３．２ｍｍ、台座の直径１２．７ｍｍ）上にて、アルゴン雰囲気下で１
１０秒間スプレーした。画像を、１０ｍｍの作動距離で、二次電子検出器および
５ｋＶの加速（ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ）電位を使用して得た。各々の調製物
について少なくとも１００粒子を、Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ
ＸＬ−３０ Ｆｉｅｌｄ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｇｕｎ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌ
ｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して得た電子顕微鏡写真より分けた
。

【０１１０】 酢酸エチルを使用してミクロスフェアからペプチドを抽出することにより、ペ
プチドローディングを決定した。ミクロスフェアを、過剰の酢酸エチル中に浸漬
し、そして強くボルテックスした。溶解しないポリマーおよび放出したペプチド
を、５分間の遠心分離によってスピンダウンした。上清を回収し、そしてこのプ
ロセスをさらに３回反復した。過剰の酢酸エチルを、蒸発して除いた。サンプル
を、２％酢酸中で再構成し、そして酢酸分析に供した。ペプチドを、６Ｎ ＨＣ
ｌで加水分解し、そして引き続き、アミノ酸をＷａｔｅｒｓ ＰｉｃｏＴａｇ
Ｓｙｓｔｅｍを使用してフェニルチオヒダントインとして誘導体化し、かつ分析
した。

【０１１１】 （ペプチド免疫） ＰＢＳ中１００μｇのペプチドおよび１００μｇのｎｏｒ ＭＤＰを、４：１
のスクアレン：アルラセル（Ａｒｌａｃｅｌ）中で乳化し、そして１ペプチド当
たり５匹のマウスの複数の部位に皮下注射する。３週間後、マウスを同一のプロ
トコルを使用してブーストする。２度目の免疫の２週間後、脾臓を外科的に回収
する。

【０１１２】 （ミクロスフェアカプセル化ペプチド免疫） ＭＶＦＤＷ４ペプチドおよびＮｏｒ−ＭＤＰアジュバントを、ミクロスフェア
中に個別にカプセル化した（５．２％ロード（ＭＶＦＤＷ４）および５％ロード
（Ｎｏｒ−ＭＤＰ））。１マウス当たり１００μｇのペプチドおよび１００μｇ
のＮｏｒ−ＭＤＰを含むミクロスフェアを、２００μｌの４：１のスクアレン：
アルラセルＡと混合し、そしてマウスに皮下注射した。

【０１１３】 （ＣＴＬ活性の検出） 最後の注射の２週間後、脾臓細胞を各マウスから取り出した。単一の細胞の懸
濁液を調製し、その一部をＥｌｉｓｐｏｔによるＩＮＦ−γ検出に、残りをクロ
ム放出アッセイに使用した。

【０１１４】 （ｉ）Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ ４日間のＥｌｉｓｐｏｔプロトコルを使用して、脾臓細胞のＩＮＦ−γ産生を
検出した。１日目、Ｅｌｉｓｐｏｔプレート（ＰｏｌｙＦｉｌｔｒｏｎｉｃｓ）
を、アジ化物（ａｚｉｄｅ）を含まない滅菌ＰＢＳで希釈した抗マウスＩＮＦ−
γ（クローンＲ４−６Ａ２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を４μｇ／ｍｌで用いてコ
ートした。次いで、プレートを湿潤チャンバー内で４℃で一晩インキュベートし
た。２日目、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、次いで、ＤＭＥＭ中１％のＢＳＡ
（添加物なし）をウェルあたり２００μｌで、室温にて１時間ブロックした。Ｂ
ＳＡを除去した後、１％ Ｌ−グルタミンを含むＨＬ−１培地（Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）中に回収した新鮮な脾臓細胞を、特定の濃度でウェル中に添加した
。次いで、湿潤インキュベーターにて３７℃で５％ ＣＯ₂にて、プレートを２
４時間インキュベートした。３日目、細胞を回収し、そしてプレートをＰＢＳで
１回洗浄した後、このプレートをさらに、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０（２０００
：１）で４回洗浄した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０／１％ ＢＳＡで２μｇ／ｍ
ｌに希釈したビオチン化抗ＩＮＦ−γ（クローンＸＭＧ １．２、Ｐｈａｒｍｉ
ｎｇｅｎ）を、ウェル当たり１００μｌでウェルに添加した。プレートを湿潤チ
ャンバーにて４℃で一晩インキュベートした。４日目、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２
０でプレートを４回洗浄した後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０／１％ ＢＳＡで１
：１０００に希釈したヤギ抗ビオチン／アルカリホスファターゼ結合物（Ｖｅｃ
ｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を、ウェル当たり１００μｌ添
加した。プレートを、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳで４回洗浄した。
ＢＣＩＰ／ＮＢＴアルカリホスファターゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ
Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を、室温でのインキュベ
ートのためにウェル当たり２００μｌ添加した。スポットがプレート上で可視化
したときに、反応を、流れる水道水でクエンチした。プレートを風乾しこのスポ
ットを読んだ。

【０１１５】 （ｉｉ）細胞傷害性溶解アッセイ 単一細胞懸濁液の同一のバッチより得た同系の脾臓細胞刺激因子を使用して、
インビトロでの再刺激を実施し、そしてｐ６３合成ペプチドで１時間パルスした
。反応させる（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）細胞：刺激する（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）
細胞（３：１）を２４ウェルプレート中で混合し、そして３７度で１週間インキ
ュベートし、次いで、これらの反応させる脾臓細胞を以下のＣＴＬアッセイにて
効果（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）細胞として使用した。標準クロム放出アッセイを使用
して、ＣＴＬアッセイを実施した。簡単には、ＳＶＢａｌｂ細胞（Ｈ−２^d）ま
たはＭＣＳ７細胞（Ｈ−２^b、コントロールとして）を１０μｇ／ｍｌのペプチ
ドｐ６３および５００μＣｉ／ｍｌの⁵¹Ｃｒ塩化クロム酸を伴うかまたは伴わな
いで、３７℃で１時間インキュベートすることによって、ペプチドでパルスした
標的を調製した。標識化標的細胞（ウェル当たり１０⁴細胞）および種々の数の
効果細胞を、９６ウェルプレートに最終容積０．２ｍｌにてプレートした。３７
℃で５時間後、５０μｌの上清を各ウェルから回収し、そして特異的溶解％を、
以下の式に従って決定した：［（試験したサンプルのｃｐｍ−自然発生⁵¹Ｃｒ放
出のｃｐｍ）／（最大⁵¹Ｃｒ放出のｃｐｍ−自然発生⁵¹Ｃｒ放出のｃｐｍ）］×
１００。

【０１１６】 （実施例１２） ＨＥＲ−２を、細胞外ドメインにのみ存在する７つの潜在部位にて広範囲にわ
たってグリコシル化する。本発明者らは、これらのＮ連結グリコシル化部位（Ａ
ｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｘ）を保有するＢ細胞エピトープを、分析に用いた
コンピューターによって同定した。安定に配列をコードするＢ細胞エピトープを
含む３つの構築物を、変異してグリコシル化を改善し、そしてこれらの野生型対
照物ＨＥＲ−２（１１５−１３６）；（１８２−２１６）；および（６３０−６
５０）ならびにＴヘルパー細胞エピトープを、バキュロウイルス哺乳動物シャト
ル発現ベクターにサブクローン化した。このベクターは、哺乳動物細胞への目的
の遺伝子の容易なバキュロウイルス媒介トランスフェクションを可能にするが、
効率よい発現およびエピトープのグリコシル化が可能な細胞において複製し得な
い。発現したキメラグリコシル化エピトープを、糖の型およびグリコシル化効率
についてキャピラリー電気泳動によって特徴付ける。効率よくグリコシル化した
エピトープで、ウサギを免疫し、そしてペプチド抗体を作成する。

【０１１７】 ここで、本発明は、十分に記載され、添付の特許請求の範囲の精神および範囲
を逸脱することなく多くの変化および改変がなされ得ることは、当業者には明白
である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、キメラＨＥＲ２−Ｂ細胞ペプチドの模式図である。

【図２】 図２は、多価ＨＥＲ２−２Ｂ／ＣＴＬペプチドの模式図である。

【図３】 図３は、キメラＨＥＲ−２ Ｂ細胞ペプチドＤＷ１ＭＶＦに対して惹起される
抗体の、ＨＥＲ−２過剰発現ＳＫＢ３細胞への結合を示す。ＤＷ１ＭＶＦに対し
て惹起される抗体は、市販のモノクローナル抗体に匹敵する親和性を有して、Ｈ
ＥＲ−２レセプターを特異的に結合した。ＳＫＢＲ３細胞が、抗体とインキュベ
ートされ、洗浄され、そしてＦＩＴＣ結合体化２次抗体が添加された。ホルマリ
ン中に固定された後、細胞が、励起のために４８８ｎｍでＣｏｕｌｔｅｒ ＥＬ
ＩＴＥフローサイトメトリーにより分析された。５．０×１０⁶個の細胞が、各
サンプルについて計測された。

【図４】 図４は、複数のキメラＨＥＲ−２ Ｂ細胞ペプチドを注射された非近交系のウ
サギにおける免疫原性を示す。

【図５】 図５は、ＨＥＲ−２過剰発現ＳＫ−ＢＲ−３ヒト乳癌細胞におけるヘルセプチ
ン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）および単一および複数の、ＨＥＲ−２ Ｂ細胞キメラ
ペプチドＭＶＦＤＮ１（ＨＥＲ−２（２７−４５））、ＭＶＦＤＮ２（ＨＥＲ−
２（３１６−３３７））、ＭＶＦＤＮ３（ＨＥＲ−２（４８５−５０３））およ
びＭＶＦＤＷ４（ＤＷ４）に対して生成されるペプチド抗体の抗増殖効果を示す
。結果は、全く同じ３つのサンプルの平均である。

【図６】 図６は、ＨＥＲ−２過剰発現ＢＴ４７４ヒト乳癌細胞におけるヘルセプチンＨ
ＥＲ−２ Ｂ細胞キメラペプチドＭＶＦＤＮ１（ＮＤ１）ＭＶＦＤＮ２（Ｎ２）
、ＭＶＦＤＮ３（Ｎ３）およびＭＶＦＤＷ４（ＤＷ４）に対して生成されるペプ
チド抗体の抗増殖効果を示す。結果は、全く同じ３つのサンプルの平均である。

【図７】 図７は、ＨＥＲ−２過剰発現ＢＴ４７４ヒト乳癌細胞における単一および複数
のＨＥＲ−２ Ｂ細胞キメラペプチドＭＶＦＤＮ２（Ｎ２）、ＭＶＦＤＮ３（Ｎ
３）およびＭＶＦＤＷ４（ＤＷ４）に対して生成されるペプチド抗体の増殖効果
を示す。結果は、全く同じ３つのサンプルの平均である。

【図８】 図８は、自発的な乳房腫瘍発症におけるＨＥＲ−２ Ｂ細胞ペプチドを用いた
予防接種の効果を示す。６個体のマウスの群が、約４週齢で、１００μｇのペプ
チド（およびスクアレンアルラセル（ａｒｌａｃｅｌ）Ａにおいて乳化されたア
ジュバントとしてのＭＤＰ）を接種され、そして４、８、１６、および２４週後
にブーストした。腫瘍が、長さ×幅²／２として算出された。腫瘍発症までの時
間が、個々の曲線の対数ランクの比較と共にＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析
を使用して分析された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 7/06 7/08 7/08 14/82 14/82 16/46 16/46 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 トライオッジ， ピアーレ エル． アメリカ合衆国 オハイオ 43201， コ ロンブス， ウエスト ７ティーエイチ アベニュー 360 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA61 CA02 HA17 4C076 AA17 BB16 CC06 DD34 EE20 FF68 GG45 4C085 AA03 BB11 DD86 EE01 FF24 GG04 4H045 AA11 AA30 BA15 BA17 BA18 BA41 CA41 DA75 DA86 EA28

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＨＥＲ−２タンパク質に対する免疫応答を刺激するための組
   成物であって、該組成物は、ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープを含み、該ＨＥＲ−
   ２ Ｂ細胞エピトープは、以下： 【化１】 からなる群より選択される配列を含む、組成物。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の組成物であって、該組成物は、キメラペプ
   チドであり、そして ａ）Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ；および ｂ）前記ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープを該Ｔｈエピトープに連結するための
   リンカー、 をさらに含む、組成物。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の組成物であって、前記ＨＥＲ−２ Ｂ細胞
   エピトープは、１５〜５０アミノ酸長であり、前記Ｔｈエピトープは、１４〜２
   ２アミノ酸長の乱交雑Ｔｈエピトープであり、前記リンカーは、１〜１５アミノ
   酸長である、組成物。
4. 【請求項４】 請求項２に記載の組成物であって、前記Ｔｈエピトープは、
   以下： 【化２】 からなる群より選択される配列を含む、組成物。
5. 【請求項５】 前記リンカーが配列ＧＰＳＬ（配列番号２０）を含む、請求
   項２に記載の組成物。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の組成物であって、該組成物が、多価ペプチ
   ドであり、そして２以上のＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープ、Ｔｈ細胞エピトープ
   、および鋳型を含み、該ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープおよび該Ｔｈ細胞エピト
   ープが該鋳型に結合している、組成物。
7. 【請求項７】 前記鋳型がコアβシートである、請求項６に記載の組成物。
8. 【請求項８】 前記コアβシートが、リンカーにより結合された、ロイシン
   残基とリジン残基とが交互になっている２つの鎖を含む、請求項７に記載の組成
   物。
9. 【請求項９】 ＨＥＲ−２タンパク質に対する免疫応答を刺激するための組
   成物であって、該組成物が、ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープを含み、該ＨＥＲ−
   ２ ＣＴＬエピトープが以下： 【化３】 からなる群より選択される配列を含む、組成物。
10. 【請求項１０】 配列番号９に記載の組成物であって、該組成物はキメラペ
    プチドであり、そして ａ）Ｔヘルパー（Ｔｈ）エピトープ；および ｂ）前記ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープを該Ｔｈエピトープに連結するための
    リンカー、 をさらに含む、組成物。
11. 【請求項１１】 請求項９に記載の組成物であって、該組成物は、クラスＨ
    ＬＡ−Ａ３由来のＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープ、クラスＨＬＡ−Ｂ７由来のＨ
    ＥＲ−２ ＣＴＬエピトープ、クラスＨＬＡ−Ａ２由来のＨＥＲ−２ ＣＴＬエ
    ピトープ、およびクラスＨＬＡ−Ｂ２７由来のＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープを
    含む、組成物。
12. 【請求項１２】 請求項９に記載の組成物であって、該組成物は、以下： （ａ）１〜６アミノ酸を含むリンカーにより互いに連結された４以上のＨＥＲ
    −２ ＣＴＬエピトープを含む第１のユニット、および （ｂ）１４〜２２アミノ酸長の乱交雑Ｔｈエピトープである第２のユニットで
    あって、該第２のユニットが、該第１のユニットのアミノ末端またはカルボキシ
    末端に該リンカーによって連結されている、第２のユニット、 を含む直鎖状ペプチドである、組成物。
13. 【請求項１３】 請求項１０に記載の組成物であって、前記Ｔｈエピトープ
    が以下： 【化４】 からなる群より選択される配列を含む、組成物。
14. 【請求項１４】 前記リンカーが配列ＧＰＳＬ（配列番号２０）を含む、請
    求項１０に記載の組成物。
15. 【請求項１５】 前記リンカーが、タンパク質分解性部位を含む、請求項１
    ２に記載の組成物。
16. 【請求項１６】 前記リンカーが２つの隣接した塩基性残基を含む、請求項
    １２に記載の組成物。
17. 【請求項１７】 前記組成物が、生分解性ミクロスフェアまたはナノスフェ
    アと会合している、請求項１２に記載の組成物。
18. 【請求項１８】 請求項９に記載の組成物であって、該組成物は、多価ペプ
    チドであり、そして２以上のＨＥＲ−２ ＣＴＬ細胞エピトープ、Ｔｈ細胞エピ
    トープ、および鋳型を含み、該ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープおよび該Ｔｈ細胞
    エピトープが該鋳型に結合されている、組成物。
19. 【請求項１９】 前記鋳型がコアβシートである、請求項１８に記載の組成
    物。
20. 【請求項２０】 前記コアβシートが、リンカーにより連結されたロイシン
    残基とリジン残基とが交互になっている２つの鎖を含む、請求項１９に記載の組
    成物。
21. 【請求項２１】 被験体における免疫応答を刺激する方法であって、該方法
    は、請求項１に記載の組成物、請求項９に記載の組成物、ならびに請求項１に記
    載の組成物および請求項９に記載の組成物を含むポリペプチドからなる群より選
    択される組成物を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
22. 【請求項２２】 請求項１８に記載の方法であって、前記組成物は、２以上
    のＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープ、Ｔｈ細胞エピトープおよび鋳型を含む多価ペ
    プチドであり、該ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープおよび該Ｔｈ細胞エピトープが
    該鋳型に結合されている、方法。
23. 【請求項２３】 請求項２０に記載の方法であって、前記組成物は、２以上
    のＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープ、Ｔｈ細胞エピトープ、および鋳型を含む多価
    ペプチドであり、該ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープおよび該Ｔｈ細胞エピトープ
    が該鋳型に結合されている、方法。
24. 【請求項２４】 請求項２０に記載の方法であって、前記組成物が、ＨＥＲ
    −２ Ｂ細胞エピトープ、ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープ、Ｔｈ細胞エピトープ
    、および鋳型を含む多価ペプチドであり、該ＨＥＲ−２ Ｂ細胞エピトープ、該
    ＨＥＲ−２ ＣＴＬエピトープおよび該Ｔｈ細胞エピトープが該鋳型に結合され
    ている、方法。
25. 【請求項２５】 被験体における癌を処置する方法であって、該方法は、薬
    学的組成物を該被験体に投与する工程を包含し、該薬学的組成物は、以下： 請求項１に記載の組成物または請求項９に記載の組成物；および 薬学的に受容可能なビヒクル、 を含む、方法。
26. 【請求項２６】 請求項２５に記載の方法であって、前記被験体がヒトであ
    り、そして乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、および結腸癌の癌のうちの１つを有
    するか、または上記の癌のうちの１つに対する素因を有する、方法。
27. 【請求項２７】 請求項２５に記載の方法であって、前記ビヒクルが、生分
    解性であり、そして薬学的に受容可能な油／水エマルジョンを含むエマルジョン
    、およびポリラクチド−ポリグリコール酸ポリマーを含む生分解性ミクロスフェ
    アまたはナノスフェアからなる群より選択される、方法。
28. 【請求項２８】 前記油がスクアレンまたはスクアランである、請求項２７
    に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記ミクロスフェアが、直径０．１〜５０ｎｍであり、ポ
    リ（Ｄ，ｌラクチド−コ−グリコリド）を含む、請求項２７に記載の方法。
30. 【請求項３０】 請求項２に記載のキメラペプチド、請求項１０に記載のキ
    メラペプチド、および請求項１２に記載のキメラペプチドからなる群より選択さ
    れるキメラペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。