JP2003520963A - リポタンパク質のアッセイ方法 - Google Patents

リポタンパク質のアッセイ方法

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Abstract

(57)【要約】 多数の異なる標的分子タイプのうちの特定の１つの試料溶液中の同一性および／または濃度または相対的濃度を決定するためのアッセイ方法であって、ｉ）そのまたは各々の標的分子タイプに結合し、そのように結合する場合、適当な励起下にて蛍光するプローブ物質を該試料に添加し、ｉｉ）試料に対して時間分解蛍光測定を行ない；次いで、ｉｉｉ）該時間分解蛍光測定から得られた時間減衰データの分析から該決定を行う工程を含むことを特徴とする該方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、多数の異なる標的分子タイプのうちの特定の１つの試料溶液中の同
一性、および／または濃度または相対的濃度を決定するためのアッセイ方法に関
する。
【０００２】 特に、専らではないが、本発明は、蛋白質混合物中の特定のリポタンパク質の
同一性を決定するための、および血漿または血清のごとき蛋白質混合物中の異な
るクラスのリポタンパク質を区別するためのアッセイに関する。
【０００３】 脂質、コレステロールおよびトリグリセリドの担体であるリポタンパク質は、
血漿または血清の主成分中にある（簡潔には、後記では、「血漿」なる用語を用
いるが、「血漿」への引用は、血漿または血清への引用として解釈されるべきで
ある）。血漿中に見出されたリポタンパク質は、３つの主要分類：高密度リポ蛋
白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）および超低密度リポ蛋白質（ＶＬ
ＤＬ）に分類される。血漿中リポタンパク質濃度とアテローム性動脈硬化症（す
なわち、心血管疾患発生）の危険性との間に強い関連性があることはよく知られ
ている。また、異なるクラスのリポタンパク質が各々、アテローム性動脈硬化症
において異なる役割を果たすことも知られている。例えば、ＨＤＬは抗アテロー
ム発生物質とみなされるが、ＬＤＬは高度のアテローム発生物質である（そのコ
レステロールはアテローム性動脈硬化症発生と緊密に関連して運搬する）ことが
知られている。ＶＬＤＬは、わずかにアテローム発生物質であり、女性において
より重要であると考えられている。
【０００４】 血漿は様々な蛋白質の複合混合物であり、分離し、次いで異なるクラスのリポ
タンパク質の濃度を直接的に測定する方法は知られているが、かかる方法は複雑
でかつ高価である。従って、臨床検査室において広く用いられるリポタンパク質
アッセイの通常の方法は間接的方法であり、ここに、重要なＬＤＬ濃度は、 Fridedewaldの式： （ＣＨ−ＬＤＬ）＝ＣＨ−（ＣＨ−ＨＤＬ）−ＴＧ／５ ［式中、ＣＨは総コレステロール濃度、（ＣＨ−ＬＤＬ）はコレステロールＬＤ
Ｌ濃度であり、（ＣＨ−ＨＤＬ）はＨＤＬ濃度であって、ＴＧは（遊離グリセロ
ールを含めた）トリグリセリド濃度である］ を用いて、総コレステロール濃度、トリグリセリド濃度およびＨＤＬ濃度の測定
値から計算される。
【０００５】 ＨＤＬ、ＣＨおよびＴＧ濃度は、ＬＤＬ濃度の計算前に測定しなければならず
、ＨＤＬ、ＣＨおよびＴＧ濃度の測定におけるいずれの誤差もＬＤＬ濃度の計算
において形成されると認められるであろう。加えて、ＴＧ濃度の通常の測定は、
トリグリセリドおよび遊離グリセロールの濃度間を区別せず、それは変動し、Ｌ
ＤＬ濃度の計算にさらなる誤差を誘導し得る。かくして、ＬＤＬ濃度の計算は、
特に高トリグリセリドレベルにて非常に大きくなり得る誤差を含む。かかる誤差
は、例えば、広範囲に用いられる（ダイエット、薬剤等のごとき）ＬＤＬ低下処
置の進行をモニタリングすることにおける特別な問題であり、ここに、トリグリ
セリドレベルは劇的に変化し得るが、ＬＤＬ濃度における（典型的には、数パー
セントのオーダーの）比較的小さな減少を正確にモニターすることが必要である
。
【０００６】 前記の通常のアッセイ手法のさらなる欠点は、総ＣＨおよびＴＧアッセイが全
血漿試料に行う簡単な手法を含むが、ＨＤＬ濃度の測定は、予備的分離プロセス
を必要とし、ここに、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ成分は（ＬＤＬ＋ＶＤＬを凝固させ
、それらを遠心によって除去することによって）除去される。
【０００７】 前記の方法のさらにさらなる欠点は、それがＶＬＤＬ濃度の測定を提供せず、
従って、例えば、酵素学的に推定された血漿中トリグリセリドおよび遊離グリセ
ロール含量に基づきＶＬＤＬ濃度を計算することによりいくらかの異なる方法ま
たはプロセスから決定しなければならないことである。
【０００８】 主としてＬＤＬ＋ＶＬＤＬの合計である血漿の総リポタンパク質濃度をアッセ
イするための別法の方法は、２つのロシア特許第ＳＵ１４５７３８６号および第
ＳＵ１４７６３８４号に開示されている。これらは、蛍光プローブとして、特定
の有機発光団、４−ジメチルアミノ−４’−ジフルオロメチル−スルホニル−ベ
ンジリデン−アセトフェノン（ＤＭＳＢＡ）の使用に関する。Ｋ−３７と識別さ
れる該プローブの式は、後記に与えられる：
【０００９】
【化１】
【００１０】 該プローブＫ−３７は、水中にて発光しないが、血漿のごとき蛋白質水溶液中
では高度に発光する。特に、蛍光強度は、血漿のリポタンパク質含量に高度に依
存し、かくして、Ｋ−３７をプローブとして用いて、リポタンパク質濃度と、存
在できる他の蛋白質の濃度を区別できる。
【００１１】 ロシア特許第ＳＵ１４５７３８６号は、Ｋ−３７を合成する方法を記載し、ロ
シア特許第ＳＵ１４７６３８４号は、（標準試料の測定された蛍光および既知濃
度に参照して）血漿試料およびＫ−３７の混合物の定常状態蛍光の測定値から総
ＣＨおよびＴＧ含量を計算する方法を記載している。アッセイされるべき血液試
料は、緩衝液（ｐＨ７.４、１０ｍＮトリスＨＣｌおよび２ｍＮ ＥＤＴＡを含有
）を用いて希釈し、次いで、遠心して、赤血球および他の形成された成分を除去
する。次いで、少量（１０μｌ）のＫ−３７の１ｍＮ標準溶液を１ｍｌの上澄み
溶液に添加し、得られた蛍光強度を、各々、４４０ｎｍおよび５５０ｎｍの励起
波長および観察波長にて、蛍光分光光度計を用いて測定する。式は、アッセイさ
れるべき試料の測定された蛍光、および既知希釈の既知のＣＨおよびＴＧ濃度で
、血漿の標準試料中のＫ−３７の測定された蛍光からＣＨおよびＴＧの全濃度を
計算するために開示されている。５０倍ないし５００倍希釈にてアッセイされる
べき多数の異なる希釈の試料についてのプロセスの繰返しについての結果は、Ｃ
ＨおよびＴＧの総濃度の測定が、血液希釈に大きく独立することを確立する。
【００１２】 かくして、蛍光プローブとしてのＫ−３７の使用は、非常に少ない血漿試料だ
けが必要とされるので、非常に敏感なアッセイ手法を提供し、それは、タンパク
質成分の分離を必要とせずに行うために比較的簡単である。次いで、このように
測定されたＣＨおよびＴＧの濃度は、計算された結果を正常値と比較することに
よって高脂血症の直接的な指標として用いることができる。
【００１３】 前記方法の１つの欠点は、それが異なる分類のリポタンパク質間を区別せず、
かくして、例えば、それを用いてＬＤＬ濃度における小さな変化をモニターでき
ないことである。
【００１４】 前記の欠点を除去または緩和することが本発明の目的である。
【００１５】 本発明により、多数の異なる標的分子タイプのうちの特定の１つの試料溶液中
の同一性および／または濃度または相対的濃度を決定するためのアッセイ方法で
あって、 ｉ）そのまたは各々の標的分子タイプに結合し、そのように結合する場合、適
当な励起下にて蛍光するプローブ物質を該試料に添加し、 ｉｉ）試料に対して時間分解蛍光測定を行ない；次いで、 ｉｉｉ）該時間分解蛍光測定から得られた時間減衰データの分析から該決定を
行う工程を含むことを特徴とする該方法が提供される。
【００１６】 本発明は、標的分子タイプの範囲の各々のものに結合する単一プローブが蛍光
減衰寿命に参照して、該試料溶液中に存在する特定の標的分子タイプの同一性お
よび／または濃度（または相対的濃度）に対して情報を与えることができるとい
う認識に基づいている。
【００１７】 好ましくは、該標的分子タイプの各々につき時間の関数として異なる特徴的蛍
光強度の減衰を有するように該プローブ物質を選択する。
【００１８】 本発明は、例えば、典型的には、電子時間窓を開けさせて、サブナノ秒および
ナノ秒時間スケールでの時間における２点間の蛍光寿命事象を受容する時間ゲー
ト（time-gated）測定系から区別されるごとき真の蛍光寿命測定を含む。時間ゲ
ート測定方法それ自体は、寿命を直接的には測定しない。本発明に用いることが
できる公知の蛍光寿命測定方法の例は、パルス一致（pulse coincidence）、位
相推移（phase shift）または位相変調の方法（後者の２つは、いずれも単一ま
たは複数の周波励起による）である。
【００１９】 時間分解蛍光測定から得られたデータの分析は、多数の方法にて行うことがで
きた。好ましい方法は、減衰時間を表すパラメーターを同定することであり、そ
れは、うまく、該時間分解蛍光測定データに関して行われた多重指数関数分析（
multi-exponential analysis）の結果として誘導された指数時間定数であり得る
。
【００２０】 単一成分試料溶液、すなわち、プローブ物質が結合する標的分子タイプの範囲
のうちの１つだけを含有する試料において、存在する特定の標的分子タイプを、
時間分解蛍光測定データから直ちに同定できる。この同定は、いずれのさらなる
測定も必要とすることなくなされ得る。
【００２１】 該試料溶液が２以上の該標的分子タイプを含有する場合、本発明を用いて、存
在する全標的分子タイプの画分として特に選択されたものの濃度を決定できる。
再度、さらなる測定はこの情報を得るのに必要ではない。
【００２２】 本発明は、血清または血漿のごとき蛋白質混合物中に存在する特定のクラスの
リポタンパク質の濃度を決定するのに特に適当である。この場合には、プローブ
物質は、好ましくは、前記のＫ−３７である。
【００２３】 本発明の操作の例は、今や、添付図面を参照して記載され、ここに： 図１は、後記の実施例２に関して引用されたプロットであり；および 図２および３は、後記の実施例３に関して引用されたプロットである。
【００２４】 前記のごとく、本発明は、リポタンパク質の脂質に結合し、適当な放射波長に
て励起される場合に蛍光する蛍光プローブ（Ｋ−３７）を用いる時間分解蛍光測
定に基づいている。時間分解蛍光測定の基本原理はよく知られており、特定の波
長にて（または特定の範囲の波長にわたって）周期的な短いパルスの放射で試料
を発光させ、次いで、各パルスに続く時間にわたって蛍光強度における減衰を測
定することを含む。後記の実験において、シンクロトロン源を用いて、試料を励
起し、次いで、単一光子計数法を用いて、時間減衰データを誘導した。Munro I.
H., （１９８０）、「蛍光寿命測定法用および時間分解分光法用の変調された
源としてのシンクロトロン放射」；Synchrotron Radiation Research 編, Winic
k H, Doniachs, Plenum Press New Yorkの第８章；Munro I. H., Schwenter N（
１９８３）「シンクロトロン放射を用いる時間分解分光法に関して」Nuclear In
struments and Methods, ２０８, ８１９；およびO'Connor, D. V. Philips Hil
lips, D（１９８４） Time-Correlated Single-Photon-Counting、Academic Pre
ss. London。しかしながら、蛍光寿命の測定に適当ないずれの手法も用いること
ができると理解されるであろう。
【００２５】 実施例１：単一成分溶液中のリポタンパク質の区別およびリポタンパク質タイ
プの同定。
【００２６】 ヒト血清リポ蛋白質のＶＬＤＬおよびＬＤＬはよく確立された慣用的な方法を
用いて、超遠心分離のプロセスによって供与体血清から得た。次いで、各試料の
各々の水溶液を調製し、各リポタンパク質は、ｐＨ７.３の０.１４Ｍ ＮａＣｌ
、０.０１Ｍトリス−ＨＣｌ中のｌｇ／Ｌの濃度を有する。次いで、プローブＫ
−３７を各試料溶液に攪拌下にて、ゆっくり添加した。
【００２７】 次いで、各試料を４４０ｍｎの励起波長にて、Daresbury Laboratry（Daresbu
ry, Warrington, Cheshire, England）のシンクロトロン源を用いて、本発明に
従って時間分解蛍光測定に付した。次いで、単光子計数法を用いて、５５０ｎｍ
の検出波長に対してエネルギーにおいて等価な光子の時間分解減衰データを集め
た。次いで、該結果の多重指数分析を非線形最小二乗法を用いて行ない、振幅を
減少させる一連の指数関数、すなわち：
【００２８】
【数１】
【００２９】 ［式中、Ａ１、Ａ２・・・Ａｎは振幅であって、τ１、τ２・・・τｎは例示的
減衰時間定数である］として強度減衰の時間依存性を表した。
【００３０】 前記の数学的分析は、ＶＬＤＬ溶液につきτ１＝３.１ナノ秒およびＬＤＬ溶
液につきτ１＝４.１ナノ秒を明らかとする。これらの数値計算における誤差は
、０.２ナノ秒のオーダーにすぎないが、２つの数値間の差は明確に大きい。従
って、ＬＤＬまたはＶＬＤＬのいずれかを含有するいずれの特定の単一成分溶液
についてのτ１の測定値も、リポタンパク質が存在することを明らかとするであ
ろう。換言すれば、Ｋ−３７プローブを用いる本発明による時間分解蛍光測定法
の実行は、ＶＬＤＬおよびＬＤＬを区別し、τ１の測定値は、各々の溶液中のＶ
ＬＤＬまたはＬＤＬの同定用のパラメーターとして推定できる。
【００３１】 本実施例は、リポタンパク質の時間分解蛍光減衰がリポタンパク質の密度に高
度に依存することを示す。ＬＤＬおよびＶＬＤＬ溶液だけを用いたが、本実施例
は、ＨＤＬのごとき他のリポタンパク質のクラスで繰返して、それらの特定の特
徴的減衰時間定数を確立できる。
【００３２】 実施例２：リポタンパク質混合物（血清）中のＶＬＤＬ画分の決定。 異なるリポタンパク質がＫ−３７を用いて測定されるごとき異なる蛍光減衰時
間定数を有するならば、本実施例は、リポタンパク質混合物の時間分解蛍光減衰
の測定を用いて、その混合物中に存在する異なるリポタンパク質の相対的濃度に
関する直接的な情報を与える方法を示す。
【００３３】 １０個の血清試料をコレステロール（ＣＨ）およびトリグリセリド（ＴＧ）含
量における広範囲の変動を有するように選択された異なる供与体から得て、次い
で、脂質濃度の決定を臨床自動分析器における日常的な酵素分析を用いて各試料
の一部分に行った。かかる手法は慣用的である。これは、各試料の３つの数値、
すなわち、総ＣＨ濃度、総ＴＧ濃度、ＨＤＬコレステロール（ＣＨ−ＨＤＬ）濃
度を与えた。生化学的に測定された数値を後記の表１に与える。
【００３４】
【表１】
【００３５】 該ＣＨおよびＴＧのレベルは、各々、６２３ｍｇ／ｄＬおよび８６７ｍｇ／ｄ
Ｌの非常に高値まで全試料にわたって非常に広範囲に変動することが、表１から
分かるであろう。さらに、ＣＨ：ＴＧ比は、０.２３−対−４.０、すなわち、１
７倍変動する。これらの変動の範囲には、典型的なヨーロッパ人集団において見
出されると期待できる数値の９８％を超えて含まれる。
【００３６】 次いで、時間分解減衰測定を、実施例１に関連して前記のごとく、該試料を調
製して、蛍光測定を行い、各試料に行った。減衰時間τ１の測定値を以下の表２
に与える。
【００３７】
【表２】
【００３８】、 ヒト血清中トリグリセリドが主としてＶＬＤＬから生じ、総ＣＨが全てのリポ
タンパク質から生じ、ＶＬＤＬコレステロール濃度がＶＬＤＬトリグリセリド濃
度の約０.２であることはよく知られているので、ＶＬＤＬ：総リポタンパク質
濃度の比は以下の式によって表すことができる： (ＣＨ−ＶＬＤＬ+総ＴＧ)/(総ＣＨ+総ＴＧ)=１.２(総ＴＧ)/(総ＣＨ+総ＴＧ)
【００３９】 生化学的に決定されたデータへの参照により測定された減衰時間の分析は、混
合物のτ１がその混合物内に存在するリポタンパク質の相対的濃度に密接に関連
することを確立する。該試料の総リポタンパク質濃度のＶＬＤＬ画分と、測定さ
れた時間定数τ１との間の密接な相関性は、以下の蛍光パラメーターＦ１： Ｆ１＝２.０−（６.２／τ１） を用いて示すことができる。 （表２に与えられた測定値τ１から計算された）蛍光パラメーターＦ１に対する
（前記のごときおよび表１の生化学的に誘導されたデータを用いて計算された）
ＶＬＤＬ画分のプロットを図１として示す。これは、その２つの間に非常に強固
な線形相関が存在することを示す。線形相関係数は、ｒ＝−０.９８である（す
なわち、１に非常に近い）。
【００４０】 かくして、前記の確立されたτ１およびＶＬＤＬ画分の間の相関性を知れば、
いずれの血清試料の総コレステロール含量のＶＬＤＬ画分も、単一測定、すなわ
ち、時間定数τ１に基づいて本発明を用いて誘導できる。血清コレステロール成
分の他の測定および先の分離は必要とされない。
【００４１】 前記の実施例が、τ１およびＶＬＤＬ画分の間の関係を確立するが、同様の関
係は、ＶＤＬおよびＨＤＬを含めた他のリポタンパク質のτ１および画分濃度の
間で確立できる。
【００４２】 実施例３：血清中のＬＤＬ濃度の決定： 総リポタンパク質濃度に対するいずれの特定のクラスのリポタンパク質の画分
濃度も、（前記の実施例２によって確立されたごとき）τ１から見出すことがで
きるので、絶対濃度は、総ＣＨ＋ＴＧ濃度の別々の測定から計算できることに続
く。
【００４３】 本明細書の導入部分に言及されるごとく、血清中のＬＤＬ濃度を正確に測定で
きることは非常に重要である。本実施例は、本発明を用いて、ＬＤＬ濃度の測定
を非常に単純化できる方法を説明する。
【００４４】 表１の生化学的データおよび表２の関連した時間減衰測定を用いて、図２は、
後記の蛍光パラメーターＦ２： Ｆ２＝（ＣＨ＋ＴＧ）×［１.８−（５.６／τ１）］ に対するＬＤＬコレステロール（ＣＨ−ＬＤＬ）のプロットである。
【００４５】 図２は、蛍光パラメーターＦ２（かくして、τ１）およびＬＤＬ濃度との間に
、用いられた試料によって示された非常に広範囲の濃度にわたり非常に密接な相
関性が存在することを示す。線形相関係数は、ｒ＝０.９６である。かくして、
本発明は、血清中のＬＤＬ濃度を決定する方法を提供し、わずか２つの測定値、
すなわち、τ１、およびよく知られ相対的に単純な臨床的手法を用いて容易に得
ることができる総ＣＨ＋ＴＧを必要とする。従って、本発明によるＬＤＬ決定は
、先行技術のものより、行うのに非常に単純でかつ直接的である。
【００４６】 パラメーターＦ２およびＶＤＬ濃度間の相関性は、パラメーターＦ２の計算に
おける生化学的に誘導されたデータ、すなわち、ＣＨ＋ＴＧの使用に起因し得な
いことに注目すべきであろう。数値ＣＨ＋ＴＧは、事実、他方に対して一方をプ
ロットする図３に示されるごときＣＨ−ＬＤＬ濃度と何ら相関性を有しない。図
３の場合において、線形相関係数は、ゼロに非常に接近している（ｒ＝０.０６
）。
【００４７】 本方法から得られた結果は、有意な確率的誤差（randum error）を示さない。
さらに、いずれの小さな誤差も特性において系統的であり、試料が取られた特定
の患者等に依存し、従って、その小さな誤差は、その患者に対する全てのテスト
において存在し、かくして、例えば、経時的なＬＤＬレベルにおける小さな変化
を正確にモニターする能力に対して効果を有さないであろうと推定できる。
【００４８】 本明細書の導入部分に言及されたごとく、Ｋ−３７の蛍光強度は、血清の希釈
の程度に依存しないようであり、かくして、本発明は大きな感度を有し、患者等
から採取されるべきほんの少量の試料を必要とする。加えて、得られた結果は一
貫し、長期の治療サイクルにわたる変化を測定するのに特に重要である再現性が
ある。
【００４９】 時間分解蛍光データの獲得は単一工程操作であり、血清中リポタンパク質の先
の分離を必要としないことが認められるであろう。加えて、蛍光寿命結果は、プ
ローブＫ−３７の添加の１分間以内に得ることができる。
【００５０】 本発明を行い、血清および血漿以外の蛋白質混合物のリポタンパク質含量を同
定できることが認められるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、実施例２に関して引用されたプロットであり、蛍光パラメーターＦ１
とＶＬＤＬ画分との非常に強固な線形相関を示す。
【図２】 図２は、実施例３に関して引用されたプロットであり、蛍光パラメーターＦ２
とＬＤＬ濃度との相関性を示す。
【図３】 図３は、実施例３に関して引用されたプロットであり、ＣＨ＋ＴＧ濃度とＣＨ
−ＬＤＬ濃度とが相関性を有しないことを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年７月２９日（２００２．７．２９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 により表されることを特徴とする請求項１ないし１２のいずれか１記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｇ０１Ｎ 33/533 Ｇ０１Ｎ 33/533 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ゲナディ・エフゲニーエビッチ・ドブレツ ォフ ロシア119828モスクワ、リサーチ・インス ティテュート・フォー・フィジカル・ケミ カル・メディシン (72)発明者 タチアナ・イワノーブナ・シレジシュチコ ワ ロシア、モスクワ、レベデフ・フィジカ ル・インスティテュート (72)発明者 ニコライ・コンスタンティノビッチ・クレ ク ロシア119828モスクワ、リサーチ・インス ティテュート・フォー・フィジカル・ケミ カル・メディシン (72)発明者 デイビッド・クラーク イギリス、ダブリューエイ４・４エイデ ィ、ウォーリントン、デアーズベリー・ラ ボラトリー (72)発明者 ギャレス・ジョーンズ イギリス、ダブリューエイ４・４エイデ ィ、ウォーリントン、デアーズベリー・ラ ボラトリー (72)発明者 ミハイル・ニコラエビッチ・ヤキメンコ ロシア、モスクワ、レベデフ・フィジカ ル・インスティテュート (72)発明者 ボリス・モルドゥホビッチ・クラソビツキ ー ウクライナ310001ハリコフ、インスティテ ュート・オブ・シングルクリスタルズ Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 DA02 EA01 FA03 GA25 GB18 GB28 KA02 KA05 KA08 NA01 2G045 AA13 AA25 CA25 CA26 DA62 FB13 GC15 2G054 AA07 CA21 CE02 EA01

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 多数の異なる標的分子タイプのうちの特定の１つの試料溶液
    中の同一性および／または濃度または相対的濃度を決定するためのアッセイ方法
    であって、 ｉ）そのまたは各々の標的分子タイプに結合し、そのように結合する場合、適
    当な励起下にて蛍光するプローブ物質を該試料に添加し、 ｉｉ） 試料に対して時間分解蛍光測定を行ない；次いで、 ｉｉｉ）該時間分解蛍光測定から得られた時間減衰データの分析から該決定を
    行う工程を含むことを特徴とする該方法。
  2. 【請求項２】 該標的分子タイプの各々につき時間の関数として異なる特徴
    的蛍光強度の減衰を有するように該プローブ物質を選択することを特徴とする請
    求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 工程（ｉｉｉ）の該決定が、減衰速度を表す時間分解強度減
    衰パラメーターからなされることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 工程（ｉｉｉ）の該分析が、減衰時間定数を決定するための
    時間分解蛍光測定データの多重指数関数分析を含み、該決定が該時間定数の関数
    としてなされることを特徴とする請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 該多重指数関数分析が、振幅を減少させる一連の指数関数と
    して時間分解蛍光減衰を表わし、該時間定数が指数関数の最も重要な時間定数で
    あることを特徴とする請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 該試料が、２以上の該標的分子タイプの混合物を含有し、工
    程（ｉｉｉ）の該決定が、該試料中に存在する全標的分子タイプの総濃度に対す
    る第１の標的分子タイプの濃度を決定することを含むことを特徴とする請求項１
    ないし５のいずれか１記載の方法。
  7. 【請求項７】 該試料が、２以上の該標的分子タイプの混合物を含有し、工
    程（ｉｉｉ）の該決定が、該時間分解減衰測定データおよび試料中に存在する全
    標的分子タイプの総濃度の別々の測定値の組合せから第１の標的分子タイプの濃
    度を決定することを含むことを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１記載の
    方法。
  8. 【請求項８】 該試料が、該標的分子タイプのうちの１つだけを含有し、工
    程（ｉｉｉ）の該決定が時間分解蛍光測定データに対する参照によって、存在す
    る該タイプの標的分子を同定することを特徴とする請求項１ないし５のいずれか
    １記載の方法。
  9. 【請求項９】 該標的分子タイプが、異なるタイプの蛋白質であることを特
    徴とする請求項１ないし８のいずれか１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 該標的分子タイプが、異なる密度のリポタンパク質である
    ことを特徴とする請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 該リポタンパク質が、ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬであ
    ることを特徴とする請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 該試料が、血清または血漿から得られることを特徴とする
    請求項９ないし１１のいずれか１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 全標的分子タイプの総濃度の該別々の測定値が生化学的に
    得られることを特徴とする請求項７に従属する場合の請求項９ないし１２のいず
    れか１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 該プローブ物質が、（本明細書に記載された）Ｋ−３７で
    あることを特徴とする請求項１ないし１３のいずれか１記載の方法。
  15. 【請求項１５】 実質的に本明細書に記載される血清または血漿中に存在す
    るリポタンパク質間を区別することを特徴とする方法。
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