JP2003506098A - 細胞応答をリアルタイムで測定するための装置および方法 - Google Patents
細胞応答をリアルタイムで測定するための装置および方法Info
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Abstract
Description
よび薬理学的プロファイリングのための装置に関する。本発明はまた、細胞の活
性を調節する化合物の特性の迅速な評価のための装置に関する。調査される化合
物は、シグナル変換経路、細胞応答、細胞表面レセプター、イオンチャンネル、
非選択的細孔、二次メッセンジャー経路、下流シグナル変換経路、アポトーシス
、細胞ネクローシス、またはいずれか他の細胞応答の活性の調節に関与し得る。
本発明の装置および方法は、ウエスタン分析、ノーザン分析、一塩基多型(SN
P)の検出、酵素活性の検出または分子構築分析のような生化学的分析を行うの
に用いてもよい。
するイオンチャンネルに対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する
物質の能力および効力を検出、評価および特性化するための方法および装置に関
する。
らレセプターの機能は、細胞環境を「感じ取る」ことであり、その環境における
どんな変化に関しても入力シグナルを細胞に供給することである。真核生物にお
いて、かかる細胞環境は、隣接細胞から構成され、レセプターの機能は、細胞が
互いに直接的(パラクリン調節システム)または間接的(エンドクリン調節シス
テム)に連絡し合えるようにすることであり、それゆえ、組織、器官、または全
生物体の調和応答を達成する。原核細胞においては、表面に局在するレセプター
は、細胞外環境を検出する手段を提供する。
忌避物質を受け入れると、細胞が、これらの変化を適応させるよう特異的な様式
で応答するような方法で、表面局在性レセプターは、特異的な細胞間経路を通じ
て細胞外環境に関するこの情報を細胞に伝達する。外部シグナル分子の供給また
は細胞表面分子の活性が改変されると、細胞応答は、組織または器官の機能不調
を異常に引き起こすであろう。
レセプターは、特異的な群のリガンド分子とのみ相互作用することができる。例
えば、アドレナリン作用性レセプターは、アドレナリンおよびノルアドレナリン
と相互作用し、コリン作用性レセプターは、アセチルコリンと相互作用し、セロ
トニン作用性レセプターは、5−ヒドロキシトリプタミンと相互作用し、ドーパ
ミン作用性レセプターは、DOPAと相互作用する、といった具合である。種々
の組織由来の細胞は、特異的な群の組織レセプターを常に発現する。異なる型の
レセプターは、異なるシグナル変換経路に通じている。例えば、ニコチン性コリ
ン作用性レセプターは、アセチルコリン分子が結合すると、ナトリウムチャンネ
ルを直接活性化する(Claudio et al., 1987)。レセプターに連結したGタンパ
ク質は、二次メッセンジャー経路の酵素、例えば、cAMPまたはホスホイノシ
チドカスケードの続く活性化を伴うアデニル酸シクラーゼまたはホスホリパーゼ
Cを活性化する(Divecha and Itvine, 1995)。レセプターチロシンキナーゼは
、細胞分化および増殖へと導くMEK/MAPKキナーゼのカスケードを活性化
する(Marshall, 1995およびHerskowitz, 1995)。サイトカインレセプターは、
他の経路を順に調節することができるJAK/STATカスケードを活性化し、
今度はこのカスケードが他の経路を調節するとともに遺伝子転写を活性化するこ
とができる(Hill & Treisman, 1995)。
チャンネルを保有する。これらの分子構築物は、協働して、細胞内イオンホメオ
スタシスを維持する。これらのシステムの活性におけるいかなる変化も、イオン
の細胞内濃度を変動させ、結果として、細胞代謝応答を引き起こすであろう。
ジエントを維持するよう作用する。イオンポンプの例には、ナトリウムおよびカ
リウムイオンの膜内外グラジエントを維持するNa+/K+−ATPアーゼ、カル
シウムイオンの膜内外グラジエントを維持するCa2+−ATPアーゼ、およびプ
ロトンの膜内外グラジエントを維持するH+−ATPアーゼがある。
ーを使用して、他の一方のイオングラジエントを維持する。例えば、Na+/C
a2+−交換体は、内部に誘導されるナトリウムグラジエントの化学ポテンシャル
を使用して、それらの化学ポテンシャルに反してカルシウムイオンを押しだす。
オンが細胞膜を横切れるようにする。電位作動型およびリガンド作動型の2つの
主な型のイオンチャンネルがある。電位作動型チャンネルは、膜内外の電位が変
化すると、開口状態に活性化される。神経細胞軸索におけるナトリウムチャンネ
ルまたは神経筋接合部におけるL型カルシウムチャンネルは、この種のチャンネ
ルの例である。リガンド作動型チャンネルは、それらの分子の化学レセプター部
分とあるリガンドが結合すると、開口状態へと活性化される。リガンド作動型チ
ャンネルの古典的な例は、ニコチン性コリン作動型レセプターであり、それは同
時にナトリウムチャンネルである。
質に対するレセプターの親和性を放射性リガンド結合アッセイで測定する方法は
、最も一般的である。これらのアッセイでは、種々の濃度の関心ある化合物の存
在下、および非存在下で、基準の放射標識リガンド分子の特異的な結合を測定す
る。関心ある化合物と基準の放射標識リガンドの、特異的結合の特徴的抑制パラ
メータ、IC50は、この化合物に対するレセプターの親和性の尺度と考えられる
(Weiland & Molinoff, 1981およびSwillens et al., 1995)。マイクロチップ
センサーテクノロジーにおける最近の進歩により、リアルタイムで関心ある化合
物とレセプター分子の直接的相互作用を測定することが可能になった。この方法
により、その後の親和パラメータの計算を伴う、結合および解離速度定数の両方
を測定することができる(F-gerstam et al., 1992)。これらの方法は、非常に
正確で便利であるが、化合物のアゴニストおよびアンタゴニスト活性を区別する
ことはできない。
に基づくアッセイで測定され得る。Harpold & Brust, 1995に記載される方法で
は、レセプター遺伝子およびレポーター遺伝子構築物と同時トランスフェクトさ
れた細胞を用いて、アゴニストおよびアンタゴニスト潜在性薬学的化合物を同定
する手段を提供する。これらの方法は、遺伝子トランスフェクション法を用いて
非常に労力を用する操作を必要とし、非常に時間を浪費し、かつ人工的に修飾し
た細胞を使用するので不便である。また、特定の化合物のアゴニスト効果はトラ
ンスフェクトされたレセプターの刺激に関連することを証明するために、陽性お
よび陰性対照細胞システムを用いた幾つかの対照実験を同様に実施するべきであ
る。
法である。これらの従来技術の方法は、天然の細胞を使用し、生物学的に活性な
化合物に対する代謝性酸性化の速度のような天然の細胞応答を表示することに基
づいている。従来技術の欠点は、処理速度が遅く、各測定時点に約3分かかるこ
とである。従来技術のもう一つの欠点は、測定する微少流動チャンバの内表面上
に固定した細胞を使用することである。このことは、アゴニスト分子に結合する
と脱感作を受けるレセプターのために、別個のシリコンセンサーまたはカバーガ
ラスを、アゴニストまたはアンタゴニストの各濃度点で、それらに細胞を接着さ
せて、使用する必要性につながる。このことは、実験結果に大きなばらつきを生
じさせる。
カリウムの細胞内濃度における変化)とは異なり、イオン化カルシウムは、細菌
から特殊化ニューロンにおよぶ細胞の種々のシグナル変換経路における最も一般
的な要素として働く(Clapham, 1995)。カルシウムイオン、細胞外間隙および小
胞体を用いた細胞におけるシグナル変換経路を提供する2つの主要なプールが存
在する。シグナル変換のためのサイトゾルへのカルシウムの小バーストを導入す
るための幾つかのメカニズムが存在する。
クラス、すなわちGタンパク結合セルペンチンレセプター(GPCSR)および
レセプターチロシンキナーゼ(RTK)を顕著に有しており、それらは、細胞質
へのカルシウム移行を制御する。GPCSRおよびRTKレセプターはともに、
ホスホリパーゼCを活性化し、ホスファチジルイノシトールをイノシトール(1
,4,5)三リン酸(InsP3)およびジアシルグリセロールに変換する。I
nsP3は、細胞内二次メッセンジャーとして作用し、小胞体膜に広がる特殊化
レセプターを活性化する。このレセプターの活性化は、小胞体からのカルシウム
イオン放出を誘発する(Berridge, 1993)。カルシウムイオンはまた、特異的な
リガンドにより誘発される特殊化電位非依存性Ca2+選択的チャンネルを通って
、細胞外環境から興奮性および非興奮性細胞の細胞質に移行することができる。
非興奮性細胞では、形質細胞膜の過分極もまた、電位に沿って受動的膜内外拡散
を通じたカルシウムイオンの移行を高める。例えば、カリウムイオンチャンネル
の開口は、細胞内で膜電位をより負の値にし、かくして、形質膜を横切るCa2+ 移行を容易にする。興奮性細胞は、それらの形質膜上に電位依存性Ca2+チャン
ネルを含み、これらの電位依存性Ca2+チャンネルは、膜の脱分極により、短い
時間間隔で開き、外部媒質から細胞質へCa2+を流入させる。興奮性細胞の小胞
体膜ならびに形質膜は、InsP3レセプターおよびCa2+感受性リアノジンレ
セプター(RyR)を含有し、それらはそれぞれ膜レセプター誘発ホスホリパー
ゼC活性化、または脱分極誘発の外部媒質から細胞質へのCa2+移行の短期間の
群発により、細胞内ストアからCa2+を放出する。
よりCa2+動員を開始させる(Sternweis and Smrcka, 1992)が、チロシンキナ
ーゼレセプターは、続く細胞内Ca2+動員を伴ってホスホリパーゼCγを活性化
する(Berridge & Irvine,1989)ことは十分に確立されている。
セルペンチンレセプター、チロシンキナーゼ増殖物質レセプターならびに電位お
よびリガンド調節チャンネルが存在する。
a2+は、細胞周期に効果を及ぼし(Means, 1994)、特定の転写因子を活性化す
る(Sheng et al., 1991)。多数のレセプターおよびイオンチャンネルは、Ca 2+ シグナルを使用して、細胞運動、収縮、分泌、分裂等と同じくらい基本的な事
象を開始させる。
死を促進するシグナルでもあり得る。例えば、遊離のCa2+における持続的増加
は、プログラム細胞死、アポトーシスにおける分解過程を活性化し、DNAを切
断し、かつ細胞染色体を分解するヌクレアーゼを活性化し、エンドヌクレアーゼ
の直接刺激により、またはCa2+依存性プロテアーゼ、ホスファターゼおよびホ
スホリパーゼの活性化により間接的に、DNA消化を促進し、クロマチンの構造
的完全性の損傷を生じさせる(Nicotera et al., 1994)。
離カルシウムの細胞内濃度を、生存細胞にて直接測定することが可能となった。
したがって、細胞内カルシウム濃度における変化を表示する能力は、様々な疾患
を治療する際に種々の有用な化合物の効果をモニターする手段を提供し、その作
用は、膜レセプターおよびイオンチャンネルとの相互作用の結果であると考えら
れる。
アプローチの出現により、合成されたコンビナトリアルライブラリーにおける化
合物の薬理学的プロフィールおよび対応する効力の自動特性化を実施することが
可能な方法および装置が必要であることはますます明らかである。このことは、
コンビナトリアルライブラリーにおける多数の化合物の迅速なスクリーニング、
生物活性を有する化合物の同定、ならびに効力、親和性および選択性に関するそ
れらの化合物の特性化を可能にするであろう。
イオンチャンネルと特異的に相互作用し、それらの活性を調節する潜在的に薬理
学的に有効な化合物をスクリーニングし、かつ定量的特性化する方法を提供する
ことである。
化することのできる方法を提供することである。
別する方法を提供することである。
合物に感受性のあるレセプター、イオンチャンネルまたはイオンポンプの実体の
性質を測定する方法を提供することである。
プターパターンを特性化する方法を提供することである。
れぞれを実施することである。
現される細胞表面レセプターのパターンを測定することである。
効果を及ぼすことを確認することである。
おけるそのレセプターの活性を測定することである。
る。
ぞれを実現するための装置を提供することである。
な実施形態で扱われている。
フィールおよび対応する効力の自動特性化が可能な方法および対応する装置を提
供することにより、上記およびその他の必要性を扱っている。このことは、コン
ビナトリアルライブラリーにおける多数の化合物の迅速なスクリーニング、生物
活性を有する化合物の同定、ならびに効力、親和性および選択性に関する化合物
の特性化を可能にする。
明により検出および定量的に特性化され得る。好ましくは、これらの効果は、様
々な従来の手段(例えば、特異的な蛍光、発光または発色色素を用いて)により
測定することができる生存細胞のイオン化カルシウムの細胞内濃度、cAMPま
たはpH、膜電位ならびに他の生理学的および生化学的特徴における変化を含む
が、これらに限定されない。
する方法、それらの効力プロフィールを特性化する方法、細胞膜のレセプター発
現パターンを同定する方法(「レセプターフィンガープリント法」)、および化
合物の毒性プロフィールを測定する方法を含む。これらの方法では、細胞の定常
流が、化合物および標準物質の流れと混合される。単独の化合物および標準物質
と混合した化合物の効果は測定され、化合物の薬理学的プロファイリング、薬物
スクリーニング、および細胞レセプターパターン特性化のための手段を提供する
。
標準アゴニストおよびアンタゴニスト物質は、96ウェルプレートフォーマット
または48ウェルおよび24ウェルプレートフォーマットもしくは試験管アレイ
のような他の通常の二次元アレイで組織化される。本発明の別の好ましい実施形
態において、適切な細胞培養システムにおいて非接着細胞を増殖させることによ
り、自由に流動する細胞の懸濁液でそれらを増殖させる。
する天然の接着細胞を、増殖中に細胞が接着する市販のミクロスフェアビーズを
含む適切な細胞培養システムで増殖させる。
要とする天然の接着細胞を細胞培養フラスコで増殖させ、次に適切な剥離試薬で
フラスコの底から細胞を剥離する。
関心あるレセプター(例えばオーファンレセプター)を発現するためのコード遺
伝子で細胞をトランスフェクトすることができる。さらに、神経伝達物質、ホル
モン、毒素、レセプター活性化剤および抑制剤、イオンチャンネル、イオンポン
プ調節因子、刺激剤および/または物質を含むが、これらに限定されない、生物
学的に関係する活性を有する様々な化合物を用いてもよい。
細胞内カルシウム濃度測定用FURA−2AMまたは細胞内pH測定用BCEC
F−AM)と混合し、色素が細胞に浸透できるような適切な条件でインキュベー
トする。色素を充填した細胞を装置に供給する。装置において、細胞を試験され
るべき化合物の溶液と連続的に混合する。
である。特に、細胞または粒子は、試験化合物および標準化合物と自動的に混合
され得る。細胞または粒子は、検出器に自動的に送達され得る。検出器は、特定
の特徴に関して細胞を分析するか、所望の細胞効果を有する試験化合物を自動的
に同定するか、または試料における特定の分子の存在を自動的に同定する。幾つ
かの実施形態において、連結装置は、検出器に細胞または粒子を自動的に送達し
てもよい。校正溶液は、自動的に投入され得る。さらに、試験化合物または標準
化合物のグラジエントは、自動的に提供され得る。本方法の自動化は、既定の期
間において検定され得る試料数を増加させる。
て、試験混合物を作成する工程と、 (b)多数の細胞応答を同時に検出することができる検出ゾーンを通して、前
記試験混合物を誘導する工程と、 (c)前記試験混合物が前記検出ゾーンを通って流れているときに、前記懸濁
細胞における前記1つまたはそれ以上の試験化合物に対する多数の細胞応答を同
時に測定する工程 とを含む、細胞応答を引き起こす化合物を同定する方法である。
性応答の活性化または抑制、イオンチャンネルの活性化または抑制、非選択的細
孔の活性化または抑制、レセプターまたはチャンネルの下流点での二次メッセン
ジャー経路の活性化または抑制、アポトーシスの活性化または抑制、細胞ネクロ
ーシスの活性化または抑制、および細胞毒性からなる群から選択される細胞応答
を含む。
を示すシグナルを発生する1つまたはそれ以上の応答指示試薬と前記細胞を接触
させることにより測定される。例えば、前記応答指示試薬により発生するシグナ
ルは、蛍光であってもよい。
誘導する工程は、個々の細胞における前記細胞応答を検出することができる検出
ゾーンを通して、前記試験混合物を誘導することを含む。
誘導する工程は、フローサイトメーターを通して、前記試験混合物を誘導するこ
とを含む。
は、スラグ(slug)が前記検出ゾーンを通って流れているときに、前記懸濁細胞
における該多数の細胞応答を測定することを含む。
細胞を含む。
て、試験混合物を作成する工程と、 (b)個々の細胞における細胞応答を検出することができる検出ゾーンを通し
て、前記試験混合物を誘導する工程と、 (c)前記試験混合物が前記検出ゾーンを通って流れているときに、個々の懸
濁細胞における前記1つまたはそれ以上の試験化合物に対する1つまたはそれ以
上の細胞応答を測定する工程 とを含む、細胞応答を引き起こす化合物を同定する方法である。
レセプター媒介性応答の活性化または抑制、イオンチャンネルの活性化または抑
制、非選択的細孔の活性化または抑制、レセプターまたはチャンネルの下流点で
の二次メッセンジャー経路の活性化または抑制、アポトーシスの活性化または抑
制、細胞ネクローシスの活性化または抑制、および細胞毒性からなる群から選択
される。
特定の細胞応答を示すシグナルを発生する1つまたはそれ以上の応答指示試薬と
前記細胞を接触させることにより測定される。例えば、前記応答指示試薬により
発生する前記シグナルは、蛍光であってもよい。
誘導する工程は、フローサイトメーターを通して、前記試験混合物を誘導するこ
とを含む。
細胞を含む。
、スラグ(slug)が前記検出ゾーンを通って流れているときに、前記懸濁細胞に
おける前記多数の細胞応答を測定することを含む。
またはそれ以上の物質と混合して、試験混合物を作成する工程と、 検出ゾーンを通して、前記試験混合物を誘導する工程と、 前記1つまたはそれ以上の物質が前記検出ゾーンを通って流れているときに、
前記1つまたはそれ以上の物質が前記1つまたはそれ以上の分子に結合するかど
うかを測定する工程 とを含む、試料が1つまたはそれ以上の分子を含有するかどうかを測定する方法
である。
支持体に固定されている。例えば、多数の分子を結合することができる多数の物
質は、特有の同定できる固体支持体に固定されてもよい。前記測定工程は、個々
の固体支持体から、前記固体支持体上の前記物質が前記分子に結合したことを示
すシグナルを検出することを含んでもよい。
、核酸、ポリペプチド、酵素基質、およびレセプターからなる群から選択される
。
ペプチド、核酸、レセプターリガンド、酵素アゴニストおよび酵素アンタゴニス
トからなる群から選択される。
抗体を固体支持体に結合させる工程と、 装置を用いて、試料と固体支持体に結合した前記1つまたはそれ以上の抗体を
混合して、試験混合物を作成する工程と、 検出ゾーンを通して、前記試験混合物を誘導する工程と、 前記固体支持体が前記検出ゾーンを通って流れているときに、前記1つまたは
それ以上の抗体が前記1つまたはそれ以上のポリペプチドに結合されているかど
うかを測定する工程 とを含む、試料が1つまたはそれ以上のポリペプチドを含むかどうかを測定する
方法である。
多数の抗体は、特異的に同定できる固体支持体に固定されている。前記測定工程
は、個々の固体支持体から、前記抗体が前記分子に結合したことを示すシグナル
を検出することを含んでもよい。前記シグナルは、該分子に結合する検出可能な
ように標識した第二抗体により発生され得る。
合させる工程と、 装置を用いて、試料と前記固体支持体に結合した前記1つまたはそれ以上のプ
ローブを混合して試験混合物を作成する工程と、 検出ゾーンを通して、前記試験混合物を誘導する工程と、 前記固体支持体が前記検出ゾーンを通って流れているときに、前記1つまたは
それ以上のプローブが前記1つまたはそれ以上の核酸に結合されているかどうか
を測定する工程 とを含む、試料が1つまたはそれ以上の核酸を含むかどうかを測定する方法であ
る。
け可能な(addressable)固体支持体に固定されている。前記測定工程は、個々の
固体支持体から、前記プローブが前記核酸に結合したことを示すシグナルを検出
することを含んでもよい。前記シグナルは、前記核酸に結合する検出可能な核酸
プローブにより発生され得る。
すぐ隣に3’末端を有する1つまたはそれ以上の核酸プライマーを用いて、核酸
試料における伸長反応を行って、それにより、前記核酸プライマーに1つの塩基
を組み込む工程と、 固体支持体に前記伸長プライマーを結合させる工程と、 装置における検出ゾーンを通して、プライマーが結合した前記固体支持体を誘
導する工程と、 前記伸長反応で組み込まれた塩基の同一性を測定する工程 とを含む、試料が1つまたはそれ以上の一塩基多型を含むかどうかを測定する方
法である。
な固体支持体に固体される。前記測定工程は、個々の固体支持体からSNPにお
ける多型性塩基の同一性を示すシグナルを検出することを含む。前記シグナルは
、前記伸長反応で組み込まれた検出可能なように標識したヌクレオチドにより発
生され得る。
準化合物と前記細胞の懸濁液を混合して、標準混合液を作成する工程と、 (e)前記検出ゾーンを通して、前記標準混合物を誘導する工程と、 (f)前記1つまたはそれ以上の標準化合物に対する前記細胞の前記細胞応答
を測定する工程 とをさらに含む。
たはそれ以上の標準化合物および前記1つまたはそれ以上の試験化合物を前記細
胞と同時に混合してもよく、また前記測定工程は、前記既知の効果または前記既
知の効果の改変を検出する。前記1つまたはそれ以上の標準化合物は、前記細胞
応答のアンタゴニストである。前記1つまたはそれ以上の標準化合物は、前記細
胞応答のアゴニストである。前記細胞懸濁液は、1より多くの細胞型を含んでも
よい。検出ゾーンを通して、前記試験混合物を誘導する工程は、フローサイトメ
ーターを通して、該試験混合物を誘導することを含んでもよい。
胞懸濁液を混合して、試験混合物を作成する工程と、 (b)多数の細胞パラメータを同時に検出することができる検出ゾーンを通し
て、前記試験混合物を誘導する工程と、 (c)前記試験混合物が前記検出ゾーンを通って流れているときに、前記懸濁
細胞における多数の細胞パラメータを同時に測定する工程と、 (d)所望の表現型または細胞応答プロフィールを有する細胞を受容器に送達
する工程 とを含む、所望の表現型または細胞応答プロフィールを有する細胞を得る方法で
ある。
胞懸濁液を混合して、試験混合物を作成する工程と、 (b)個々の細胞における細胞応答を検出することができる検出ゾーンを通し
て、前記試験混合物を誘導する工程と、 (c)前記試験混合物が前記検出ゾーンを通って流れているときに、前記懸濁
細胞における多数の細胞パラメータを同時に測定する工程と、 (d)所望の表現型または細胞応答プロフィールを有する細胞を受容器に送達
する工程 とを含む、所望の表現型または細胞応答プロフィールを有する細胞を得る方法で
ある。
であって、前記試験基質供給源から受け取った試験基質と前記試験化合物供給源
から受け取った試験化合物を混合して、混合物を生成するように適合されている
混合チャンバと、 前記混合チャンバと液絡している検出器であって、前記混合物が前記検出器を
通過している間に、前記試験化合物および前記試験基質間の相互作用を検出する
ことができる検出器 とを含む装置である。
前記試料は、細胞応答を引き起こす能力を評価されるべき1つまたはそれ以上の
試験化合物、または分子の存在を評価すべき溶液を含む試料投入口であって、 細胞懸濁液または粒子を提供するための1つまたはそれ以上の細胞または粒子
投入口と、 試料を受け入れ、前記細胞または粒子投入口から細胞懸濁液または粒子を受け
入れ、前記細胞懸濁液または粒子と試料の各々を混合するための、前記試料投入
口に連結された混合ゾーンと、 多数のシグナルを同時に検出することができる検出器であって、混合ゾーンに
連結され、前記懸濁細胞における多数の細胞応答を同時に測定することができる
か、または多数の分子が前記試料に存在するかどうかを同時に測定することがで
きる検出器 とを含む装置である。
る単一細胞または単一粒子からシグナルを検出する。
である。
記検出器間に配置される連結器をさらに含む。前記連結器は、前記試料および前
記細胞懸濁液または粒子を含むスラグ(slug)を前記検出器に送達し得る。幾つ
かの実施形態において、前記連結器は、実質的に非希釈のスラグ(slug)を前記
検出器に送達する。
胞応答を有する細胞を受容器に送達する。
ラリーから特定の試験化合物を選択することができる自動ロボットサンプラーで
ある。前記装置は、試験化合物サンプラーの動作を制御するための、前記試料投
入口に連結された制御装置と、コンピューターにより実行されるソフトウェアプ
ログラムにしたがって、前記制御装置に指令シグナルを送信し、それにより前記
試験化合物ライブラリーから前記試料投入口による試験化合物の選択および回収
を制御するための、前記制御装置に連結されたコンピューターとをさらに含んで
もよい。前記装置は、前記試料投入口から前記混合ゾーンに移された前記試験化
合物の濃度レベルを調節するための、前記試料投入口に連結された投入口および
流出口を有するグラジエントポンプをさらに含んでもよく、前記試料投入口は、 前記特定の試験化合物を受け入れるための第1の取込みノズルと、 緩衝溶液を受け入れるための第2の取込みノズル とを含み、前記グラジエントポンプは、第1および第2の取込みノズルに連結さ
れ、それぞれ第1および第2の取込みノズルにより受け取られた試験化合物およ
び緩衝溶液の量を調節することにより、特定の濃度の前記試験化合物を受け入れ
、前記緩衝溶液は前記試験化合物の希釈剤であるような第1および第2の取り込
みノズルを含む試料投入口である。前記装置は、前記混合ゾーンに前記細胞また
は粒子投入口からの前記細胞の懸濁液または前記粒子をポンピングするための、
前記混合ゾーンの投入口に連結された第2のポンプをさらに含んでもよい。前記
装置は、前記混合ゾーンの流出口に連結された投入口および前記検出器と液絡し
ている流出口を有する反応展開ラインをさらに含んでもよく、前記反応展開ライ
ンは、前記混合ゾーンから受け取った混合物のための反応時間遅延を提供する。
前記装置は、 前記装置に負圧を提供するための、前記検出器の流出口に連結されたポンプと
、 前記試料投入口から前記混合ゾーンに移される前記試験化合物の濃度レベルを
調節するための、前記試料投入口に連結されたプロポーショニングバルブ とをさらに含んでもよく、試料投入口は、 前記特定の試験化合物を受け入れるための第1の取込みノズルと、 緩衝溶液を受け入れるための第2の取込みノズル とをさらに含み、前記プロポーショニングバルブはそれぞれ第1および第2の取
込みノズルにより受け取られた試験化合物および緩衝溶液の量を調節することに
より、特定の濃度の前記試験化合物を受け入れ、前記緩衝液は前記試験化合物の
希釈剤であるようなプロポーショニングバルブを含む装置である。
バをさらに含む。
応答における既知の効果または前記粒子との既知の相互作用を有する1つまたは
それ以上の標準化合物を提供するための、前記混合ゾーンに連結された標準化合
物サンプラーをさらに含み、前記混合ゾーンは、前記標準化合物サンプラーから
前記1つまたはそれ以上の標準化合物を受け入れ、前記懸濁細胞または粒子と前
記1つまたはそれ以上の標準化合物を混合し、前記検出器は、前記1つまたはそ
れ以上の標準化合物に対する前記懸濁細胞の細胞応答、または前記1つまたはそ
れ以上の標準化合物と前記粒子の間の相互作用を測定する。前記混合ゾーンは、
前記懸濁細胞または前記粒子と、前記試料および前記1つまたはそれ以上の標準
化合物を同時に混合することが可能であり、前記検出器は、前記懸濁細胞の前記
細胞応答における前記既知の効果もしくは前記既知の効果の改変、または前記標
準化合物と前記粒子の間の前記既知の相互作用もしくは前記標準化合物と前記粒
子の間の前記既知の相互作用の改変を検出する。前記標準化合物サンプラーは、
標準化合物のライブラリーから特定の標準化合物を選択することができる自動ロ
ボットサンプラーであってもよい。
を引き起こす能力を評価されるべき1つまたはそれ以上の試験化合物、または分
子の存在を評価されるべき溶液を含む投入口と、 細胞懸濁液または粒子を提供するための細胞または粒子投入口と、 前記試料を受け入れ、前記細胞または粒子投入口から前記細胞懸濁液または粒
子を受け入れ、前記細胞懸濁液または粒子と前記試料の各々を混合するための、
前記試料投入口に連結にした混合ゾーンと、 単一細胞または粒子から1つまたはそれ以上のシグナルを検出する検出器であ
って、前記混合ゾーンに連結され、前記懸濁細胞における1つまたはそれ以上の
細胞応答を測定することができるか、あるいは1つまたはそれ以上の分子が前記
試料中に存在するかどうかを測定することができる検出器 とを含む装置である。
記検出器間に配置された連結器をさらに含む。前記連結器は、前記試料および前
記細胞懸濁液または粒子を含むスラグ(slug)を、前記検出器に送達し得る。前
記連結器は、実質的に非希釈のスラグ(slug)を前記検出器に送達し得る。前記
装置は、前記混合ゾーンに溶液を投入するための投入システムをさらに含み得る
。前記検出器は、所望の表現型または細胞応答を有する細胞を受容器に送達し得
る。
引き起こす能力を評価されるべき1つまたはそれ以上の試験化合物または分子の
存在を評価されるべき溶液を含む投入口と、 細胞懸濁液または粒子を提供するための細胞または粒子投入口と、 前記試料を受け入れ、前記細胞もしくは粒子投入口から前記細胞懸濁液または
粒子を受け入れ、前記細胞懸濁液または粒子と前記試料の各々を混合するための
、前記試料投入口に連結した混合ゾーンと、 多数のシグナルを同時に検出することができる検出器であって、前記混合ゾー
ンに連結され、前記懸濁細胞における多数の細胞応答を同時に測定することがで
きるか、あるいは多数の分子が前記試料中に存在するかどうかを同時に測定する
ことができる検出器 とを含む装置である。
る単一細胞または単一粒子からシグナルを検出する。
である。
記検出器間に配置される連結器をさらに含む。前記連結器は、前記試料および前
記細胞懸濁液または粒子を含むスラグ(slug)を前記検出器に送達し得る。
投入するための投入システムをさらに含む。
胞応答を有する細胞を受容器に送達する。
応答における既知の効果または前記粒子との既知の相互作用を有する1つまたは
それ以上の標準化合物を提供するための、前記混合ゾーンに連結された標準化合
物サンプラーをさらに含み、前記混合ゾーンは、前記標準化合物サンプラーから
前記1つまたはそれ以上の標準化合物を受け入れ、前記懸濁細胞または粒子と前
記1つまたはそれ以上の標準化合物を混合し、前記検出器は、前記1つまたはそ
れ以上の標準化合物に対する前記懸濁細胞の細胞応答、または前記1つまたはそ
れ以上の標準化合物と前記粒子の間の相互作用を測定する。前記混合ゾーンは、
前記懸濁細胞または前記粒子と、前記試料および前記1つまたはそれ以上の標準
化合物を同時に混合することが可能であり、前記検出器は、前記懸濁細胞の前記
細胞応答における前記既知の効果もしくは既知の効果の改変、または前記標準化
合物と前記粒子の間の前記既知の相互作用もしくは前記標準化合物と前記粒子の
間の前記既知の相互作用の改変を検出する。
化合物の濃度レベルを自動的に調節するための、前記試料投入口に連結された第
1のグラジエント装置と、 前記標準化合物サンプラーから前記混合ゾーンに移される前記1つまたはそれ
以上の標準化合物の濃度レベルを自動的に調節するための、前記標準化合物サン
プラーに連結された第2のグラジエント装置 とをさらに含んでもよい。前記装置は、切換バルブの投入口にある前記第1およ
び第2のグラジエント装置に連結され、かつ前記切換バルブの流出口にある前記
混合ゾーンに連結され、前記1つもしくはそれ以上の試験化合物濃度または前記
1つもしくはそれ以上の標準化合物濃度あるいはその両方の流れを、前記1つも
しくはそれ以上の試験化合物および/または前記1つまたはそれ以上の標準化合
物が続いて前記細胞懸濁液あるいは前記粒子と混合される前記混合ゾーンに、選
択的に切り換えるための切換バルブをさらに含んでもよい。前記装置は、前記切
換バルブに連結された校正ユニットをさらに含んでもよく、前記切換バルブはま
た、前記校正ユニットにより提供される校正溶液の流れを、前記校正溶液が前記
細胞懸濁液または前記粒子と混合される前記混合ゾーンに、選択的に切り換える
。前記装置は、前記1つもしくはそれ以上の試験化合物か、前記1つもしくはそ
れ以上の標準化合物か、または前記校正溶液と混合された前記細胞懸濁液あるい
は前記粒子の混合物を受け入れ、前記懸濁細胞または粒子が前記1つもしくはそ
れ以上の試験化合物か、前記1つもしくはそれ以上の標準化合物か、または前記
校正溶液と反応するのに適切な時間が存在するような前記混合物の流路を提供す
るための、前記混合ゾーンの前記流出口に連結された反応展開ラインをさらに含
んでもよく、前記反応展開ラインは、前記反応展開ラインから前記混合物を受け
入れる前記検出器の前記投入口にさらに連結される。
の活性化または抑制、イオンチャンネルの活性化または抑制、非選択的細孔の活
性化または抑制、レセプターまたはチャンネルの下流点での二次メッセンジャー
経路の活性化または抑制、アポトーシスの活性化または抑制、細胞ネクローシス
の活性化または抑制、および細胞毒性からなる群から選択される細胞応答を含む
多数の細胞応答を同時に検出する。
ンプラー、前記切換バルブおよび前記連結器に連結されて、それらの動作を制御
するための制御装置と、 コンピューターにより実行されるソフトウェアプログラムに従って、前記制御
装置に指令シグナルを送信するための、前記制御装置に連結されたコンピュータ
ーであって、前記試料における細胞応答または分子の存在を示すシグナルを、前
記検出器に送信、および前記検出器から受信するために、前記検出器にもまた連
結されているコンピューター とをさらに含んでもよい。
ラリーから特定の試験化合物を選択することができる自動ロボットサンプラーで
ある。前記装置は、 試験化合物サンプラーの動作を制御するための、前記試料投入口に連結された
制御装置と、 コンピューターにより実行されるソフトウェアプログラムに従って、前記制御
装置に指令シグナルを送信し、それにより前記試験化合物ライブラリーからの前
記試料投入口による試験化合物の選択および回収を制御するための、前記制御装
置に連結されたコンピューター とをさらに含んでもよい。
濃度レベルを調節するための、前記試料投入口に連結された投入口および流出口
を有するグラジエントポンプをさらに含んでもよく、前記試料投入口は、 前記特定の試験化合物を受け入れるための第1の取込みノズルと、 緩衝溶液を受け入れるための第2の取込みノズル とを含み、前記グラジエントポンプは、第1および第2の取込みノズルに連結さ
れ、それぞれ第1および第2の取込みノズルにより受け取られた試験化合物およ
び緩衝溶液の量を調節することにより、特定の濃度の前記試験化合物を受け入れ
、前記緩衝溶液は前記試験化合物の希釈剤である。前記装置は、標準化合物試料
を前記混合ゾーンに提供するための標準化合物サンプラーをさらに含んでもよい
。
を選択することができる自動ロボットサンプラーであってもよい。前記装置は、
前記標準化合物サンプラーから前記混合ゾーンに提供される前記標準化合物の濃
度レベルを調節するための、前記標準化合物サンプラーに連結された、投入口お
よび流出口を有する第2のグラジエントポンプをさらに含んでもよく、前記標準
化合物サンプラーは、 前記特定の標準化合物を受け入れるための第3の取込みノズルと、 緩衝溶液を受け入れるための第4の取込みノズル とを含み、前記第2のグラジエントポンプは、第3および第4の取込みノズルに
連結され、それぞれ第3および第4の取込みノズルにより受け取られた標準化合
物および緩衝溶液の量を調節することにより、特定の濃度の前記標準化合物を受
け入れ、前記緩衝溶液は前記標準化合物の希釈剤である。前記装置は、前記第2
の混合ゾーンの流出口が、前記第1の混合ゾーンに提供されるように、特定の濃
度の特定の試験化合物および特定の標準化合物を受け取って混合するための、第
1および第2のグラジエントポンプの前記流出口に連結された第2の混合ゾーン
をさらに含んでもよい。前記装置は、 校正溶液を提供するための校正ユニットと、 前記第2の混合ゾーンからの化合物混合物または前記校正ユニットからの前記
校正溶液の流れ間で切り換えて、次にこの流れが前記細胞懸濁液または粒子と混
合され得る前記第1の混合ゾーンに流れを提供するための、前記第2の混合ゾー
ンに連結された第1の投入口、前記校正ユニットに連結された第2の投入口、お
よび前記第1の混合ゾーンに連結された流出口を有する切換バルブ とをさらに含んでもよい。前記校正ユニットは、 前記細胞懸濁液または粒子と混合されると、最大の細胞応答または分子との粒
子の最大の相互作用を提供する校正最大溶液と、 前記細胞懸濁液または粒子と混合されると、最小の細胞応答または分子との粒
子の最小の相互作用を提供する校正最小溶液と、 校正最大溶液または校正最小溶液の流れ間で切り換えるための、前記校正最大
溶液に連結された第1の投入口および前記校正最小溶液に連結された第2の投入
口を有する切り換えバルブと、 前記切り換えバルブからの前記校正最大または校正最小溶液を前記切換バルブ
にポンピングするための、前記切り換えバルブの流出口および前記切換バルブの
投入口に連結されたポンプ とを含んでもよい。前記装置は、前記細胞もしくは粒子投入口から前記細胞懸濁
液または前記粒子を前記第1の混合ゾーンにポンピングするための、前記第1の
混合ゾーンの投入口に連結された第2のポンプをさらに含んでもよい。前記装置
は、前記第1の混合ゾーンから受け取られた混合物のための流路および反応時間
遅延を提供し、前記検出器に前記混合物を提供するための、前記第1の混合ゾー
ンの流出口に連結された投入口、および前記検出器の投入口に連結された流出口
を有する反応展開ラインをさらに含んでもよい。前記装置は、 前記第1および第2のグラジエントポンプ、前記試料投入口、前記標準化合物
サンプラーおよよび前記切換バルブ、前記第1および第2の混合ゾーン、前記第
1および第2のポンプならびに前記切り換えバルブに前記連結器に連結されて、
それらの動作を制御するための制御装置と、 コンピューターにより実行されるソフトウェアプログラムに従って、前記制御
装置に指令シグナルを送信するための、前記制御装置に連結されたコンピュータ
ーであって、前記試料における細胞応答または分子の存在を示すシグナルを、前
記検出器に送信、および前記検出器から受信するために、前記検出器にもまた連
結されているコンピューター とをさらに含んでもよい。前記検出器は、レセプター媒介性応答の活性化または
抑制、イオンチャンネルの活性化または抑制、非選択的細孔の活性化または抑制
、レセプターまたはチャンネルの下流点での二次メッセンジャー経路の活性化ま
たは抑制、アポトーシスの活性化または抑制、細胞ネクローシスの活性化または
抑制、および細胞毒性からなる群から選択される細胞応答を含む多数の細胞応答
を検出し得る。
、 前記試料投入口から前記混合ゾーンに移される前記試験化合物の濃度レベルを
調節するための、前記試料投入口に連結されたプロポーショニングバルブ とをさらに含んでもよく、前記試料投入口は、 前記特定の試験化合物を受け入れるための第1の取込みノズルと、 緩衝溶液を受け入れるための第2の取込みノズル とをさらに含んでもよく、前記プロポーショニングバルブはそれぞれ第1および
第2の取込みノズルにより受け取られた試験化合物および緩衝溶液の量を調節す
ることにより、特定の濃度の前記試験化合物を受け入れ、前記緩衝液は前記試験
化合物の希釈剤である。前記装置は、 標準化合物ライブラリーから特定の標準化合物を選択することができる自動標
準化合物サンプラーであって、前記特定の標準化合物を受け入れるための第3の
取込みノズルおよび緩衝溶液を受け入れるための第4の取込みノズルを含む標準
化合物サンプラーと、 それぞれ前記第3および第4の取込みノズルにより受け取られる標準化合物お
よび緩衝溶液の量を調節することにより、特定の濃度の前記標準化合物を受け入
れるための、前記第3および第4の取込みノズルに連結された第2のプロポーシ
ョニングバルブ とをさらに含んでもよく、前記緩衝溶液は、前記標準化合物の希釈剤である。前
記装置は、 特定の濃度の前記試験化合物を受け入れ、前記混合ゾーンに前記試験化合物を
提供するための、前記第1のプロポーショニングバルブの流出口に連結された第
1のプライミングバルブと、 特定濃度の前記標準化合物を受け入れ、前記混合ゾーンに前記標準化合物を提
供するための、前記第2のプロポーショニングバルブの流出口に連結された第2
のプライミングバルブと とをさらに含んでもよい。前記装置は、 前記細胞懸濁液または粒子と混合されると、最大の細胞応答または粒子との最
大の相互作用を提供する校正最大溶液および前記細胞懸濁液と混合されると、最
小の細胞応答または粒子との最小の相互作用を提供する校正最小溶液とを含む校
正ユニットと、 前記校正最大溶液または校正最小溶液の流れ間で切り換えるための、前記校正
最大溶液に連結された第1の投入口および前記校正最小溶液に連結された第2の
投入口を有する第1の切り換えバルブと、 前記第1の切り換えバルブからの前記校正溶液または前記混合ゾーンからの混
合物の流れ間で切り換えるための、前記混合ゾーンの流出口に連結された第1の
投入口および前記第1の切り換えバルブの流出口に連結された第2の投入口を有
する第2の切り換えバルブと、 前記第2の切り換えバルブから混合物を受け入れるための、前記第2の切り換
えバルブの流出口に連結された第3のプライミングバルブと、 前記細胞懸濁液または粒子と、前記第3のプライミングバルブにより提供され
る混合物を混合するための、前記第3のプライミングバルブの流出口に連結され
た第2の混合ゾーンであって、前記細胞懸濁液または粒子投入口および前記検出
器は、第1の混合ゾーンの代わりに前記第2の混合ゾーンに連結される第2の混
合ゾーン とをさらに含んでもよい。前記装置は、前記第2の混合ゾーンから受け取られた
混合物が前記検出器に達する前に、この混合物に流路および反応時間遅延を提供
するための、前記第2の混合ゾーンの流出口に連結された投入口および前記検出
器の投入口に連結された流出口を有する反応展開ラインをさらに含んでもよい。
前記細胞または粒子投入口は、 細胞懸濁液または粒子リザーバと、 緩衝液リザーバと、 前記細胞懸濁液または前記粒子の濃度を調節するための、前記細胞懸濁液また
は前記粒子リザーバに連結された第1の投入口および前記緩衝液リザーバに連結
された第2の投入口を有する第3の切り換えバルブであって、前記緩衝液は細胞
懸濁液または粒子の希釈剤である第3の切り換えバルブと、 前記第3の切り換えバルブから前記細胞懸濁液または粒子混合物を受け入れ、
前記第2の混合ゾーンにこの混合物を提供するための、前記第3の切り換えバル
ブの流出口に連結された第4のプライミングバルブ とを含んでもよい。前記検出器は、レセプター媒介性応答の活性化または抑制、
イオンチャンネルの活性化または抑制、非選択的細孔の活性化または抑制、レセ
プターまたはチャンネルの下流点での二次メッセンジャー経路の活性化または抑
制、アポトーシスの活性化または抑制、細胞ネクローシスの活性化または抑制、
および細胞毒性からなる群から細胞応答を含む多数の細胞応答を検出し得る。前
記装置は、多数の細胞懸濁液リザーバをさらに含んでもよい。
を引き起こす能力を評価されるべき1つまたはそれ以上の試験化合物、または分
子の存在を評価されるべき溶液を含む、投入口と、 細胞懸濁液または粒子を提供するための細胞または粒子投入口と、 前記試料を受け入れ、前記細胞または粒子投入口から前記細胞懸濁液または粒
子を受け入れ、前記細胞懸濁液または粒子と前記試料の各々を混合するための、
前記試料投入口に連結にした混合ゾーンと、 単一細胞または粒子から1つまたはそれ以上のシグナルを検出する検出器であ
って、前記混合ゾーンに連結され、前記懸濁細胞における1つまたはそれ以上の
細胞応答を測定することができるか、あるいは1つまたはそれ以上の分子が前記
試料中に存在するかどうかを測定することができる検出器 とを含む装置である。
である。
胞応答を有する細胞を受容器に送達する。
配置される連結器をさらに含む。前記連結器は、前記試料および前記細胞懸濁液
または粒子を含むスラグ(slug)を前記検出器に送達し得る。前記連結器は、実
質的に非希釈のスラグ(slug)を前記検出器に送達し得る。
応答における既知の効果または前記粒子との既知の相互作用を有する1つまたは
それ以上の標準化合物の試料を提供するための、前記混合ゾーンに連結された標
準化合物サンプラーをさらに含み、前記混合ゾーンは、前記標準化合物サンプラ
ーから前記1つまたはそれ以上の標準化合物の試料を受け入れ、前記懸濁細胞ま
たは粒子と前記1つまたはそれ以上の標準化合物を混合し、前記検出器は、前記
1つまたはそれ以上の標準化合物に対する前記懸濁細胞の細胞応答、または前記
1つまたはそれ以上の標準化合物と前記粒子の間の相互作用を測定する。前記混
合ゾーンは、前記懸濁細胞または前記粒子と、前記1つまたはそれ以上の試験化
合物および前記1つまたはそれ以上の標準化合物を同時に混合することが可能で
あり、前記検出器は、前記懸濁細胞が前記細胞応答に及ぼす前記既知の効果もし
くは既知の効果の改変、または前記1つまたはそれ以上の標準化合物と前記粒子
の間の前記既知の相互作用もしくは前記1つまたはそれ以上の標準化合物と前記
粒子の間の前記既知の相互作用の改変を検出する。前記装置は、 前記試料投入口から前記混合ゾーンに移される前記1つまたはそれ以上の試験
化合物の濃度レベルを自動的に調節するための、前記試料投入口に連結された第
1のグラジエント装置と、 前記標準化合物サンプラーから前記混合ゾーンに移される前記1つまたはそれ
以上の標準化合物の濃度レベルを自動的に調節するための、前記標準化合物サン
プラーに連結された第2のグラジエント装置 とをさらに含んでもよい。前記装置は、切換バルブの投入口にある前記第1およ
び第2のグラジエント装置に連結され、かつ前記切換バルブの流出口にある前記
混合ゾーンに連結され、前記1つもしくはそれ以上の試験化合物濃度または前記
標準化合物濃度あるいは両方の流れを、前記1つもしくはそれ以上の化合物およ
び/または前記1つまたはそれ以上の標準化合物が続いて前記細胞懸濁液あるい
は前記粒子と混合される前記混合ゾーンに選択的に切り換えるための切換バルブ
をさらに含んでもよい。前記装置は、前記切換バルブに連結された校正ユニット
をさらに含んでもよく、前記切換バルブはまた、前記校正ユニットにより提供さ
れる校正溶液の流れを、前記校正溶液が前記細胞懸濁液または前記粒子と混合さ
れる前記混合ゾーンに選択的に切り換える。前記装置は、前記1つもしくはそれ
以上の試験化合物か、前記1つもしくはそれ以上の標準化合物か、または前記校
正溶液と混合された前記細胞懸濁液あるいは前記粒子の混合物を受け入れ、前記
懸濁細胞または粒子が前記1つもしくはそれ以上の試験化合物か、前記標準化合
物か、または前記校正溶液と反応するのに適切な時間が存在するような前記混合
物の流路を提供するための、前記混合ゾーンの前記流出口に連結された反応展開
ラインをさらに含んでもよく、前記反応展開ラインは、前記反応展開ラインから
前記混合物を受け入れる前記検出器の前記投入口にさらに連結される。前記検出
器は、レセプター媒介性応答の活性化または抑制、イオンチャンネルの活性化ま
たは抑制、非選択的細孔の活性化または抑制、レセプターまたはチャンネルの下
流点での二次メッセンジャー経路の活性化または抑制、アポトーシスの活性化ま
たは抑制、細胞ネクローシスの活性化または抑制、および細胞毒性からなる群か
ら選択される1つまたはそれ以上の細胞応答を検出し得る。前記装置は、 前記第1および第2のグラジエント装置、前記試料投入口、前記標準化合物サ
ンプラー、前記切換バルブおよび前記連結器に連結された、それらの動作を制御
するための制御装置と、 コンピューターにより実行されるソフトウェアプログラムに従って、前記制御
装置に指令シグナルを送信するための、前記制御装置に連結されたコンピュータ
ーであって、前記試料における細胞応答または分子の存在を示すシグナルを、前
記検出器に送信、および前記検出器から受信するために、該検出器にもまた連結
されているコンピューター とをさらに含んでもよい。
ラリーから特定の試験化合物を選択することができる自動ロボットサンプラーで
ある。前記装置は、 試験化合物サンプラーの動作を制御するための、前記試料投入口に連結された
制御装置と、 コンピューターにより実行されるソフトウェアプログラムに従って、前記制御
装置に指令シグナルを送信し、それにより前記試験化合物ライブラリーからの前
記試料投入口による試験化合物の選択および回収を制御するための、前記制御装
置に連結されたコンピューター とをさらに含んでもよい。前記装置は、前記試料投入口から前記混合ゾーンに移
された前記試験化合物の濃度レベルを調節するための、前記試料投入口に連結さ
れた投入口および流出口を有するグラジエントポンプをさらに含んでもよく、前
記試料投入口は、 前記特定の試験化合物を受け入れるための第1の取込みノズルと、 緩衝溶液を受け入れるための第2の取込みノズル とを含み、前記グラジエントポンプは、前記第1および第2の取込みノズルに連
結され、それぞれ前記第1および第2の取込みノズルにより受け取られた前記試
験化合物および緩衝溶液の量を調節することにより、特定の濃度の前記試験化合
物を受け入れ、前記緩衝溶液は前記試験化合物の希釈剤である。
、 前記試料投入口から前記混合ゾーンに移される前記試験化合物の濃度レベルを
調節するための、前記試料投入口に連結されたプロポーショニングバルブ とをさらに含んでもよく、前記試料投入口は、 前記特定の試験化合物を受け入れるための第1の取込みノズルと、 緩衝溶液を受け入れるための第2の取込みノズル とをさらに含み、前記プロポーショニングバルブはそれぞれ前記第1および第2
の取込みノズルにより受け取られた前記試験化合物および緩衝溶液の量を調節す
ることにより、特定の濃度の前記試験化合物を受け入れ、前記緩衝溶液は前記試
験化合物の希釈剤である。前記装置は、 標準化合物ライブラリーから特定の特定の標準化合物を選択することができる
自動標準化合物サンプラーであって、前記特定の標準化合物を受け入れるための
第3の取込みノズルおよび緩衝溶液を受け入れるための第4の取込みノズルを含
む自動標準化合物サンプラーと、 それぞれ前記第3および第4の取込みノズルにより受け取られる前記標準化合
物および緩衝溶液の量を調節することにより、特定の濃度の前記標準化合物を受
け入れるための、前記第3および第4の取込みノズルに連結された第2のプロポ
ーショニングバルブ とをさらに含んでもよく、前記緩衝溶液は、前記標準化合物の希釈剤である。前
記装置は、 特定の濃度の前記試験化合物を受け入れ、前記混合ゾーンに前記試験化合物を
提供するための、前記第1のプロポーショニングバルブの流出口に連結された第
1のプライミングバルブと、 特定濃度の前記標準化合物を受け入れ、前記混合ゾーンに前記標準化合物を提
供するための、前記第2のプロポーショニングバルブの流出口に連結された第2
のプライミングバルブと とをさらに含んでもよい。前記装置は、 前記細胞懸濁液または粒子と混合されると、最大の細胞応答または粒子との最
大の相互作用を提供する校正最大溶液および前記細胞懸濁液と混合されると、最
小の細胞応答または粒子との最小の相互作用を提供する校正最小溶液とを含む校
正ユニットと、 前記校正最大溶液または校正最小溶液の流れ間で切り換えるための、前記校正
最大溶液に連結された第1の投入口および前記校正最小溶液に連結された第2の
投入口を有する第1の切り換えバルブと、 前記第1の切り換えバルブからの前記校正溶液または前記混合ゾーンからの混
合物の間の流れを切り換えるための、前記混合ゾーンの流出口に連結された第1
の投入口および前記第1の切り換えバルブの流出口に連結された第2の投入口を
有する第2の切り換えバルブと、 前記第2の切り換えバルブから混合物を受け入れるための、前記第2の切り換
えバルブの流出口に連結された第3のプライミングバルブと、 前記細胞懸濁液または粒子と、前記第3のプライミングバルブにより提供され
る混合物を混合するための、前記第3のプライミングバルブの流出口に連結され
た第2の混合ゾーンであって、前記細胞または粒子投入口および前記第1の検出
器は、前記混合ゾーンの代わりに前記第2の混合ゾーンに連結される第2の混合
ゾーン とをさらに含んでもよい。前記装置は、前記第2の混合ゾーンから受け取られた
混合物が前記検出器に達する前に、この混合物の流路および反応時間遅延を提供
するための、前記第2の混合ゾーンの流出口に連結された投入口および前記検出
器の投入口に連結された流出口を有する反応展開ラインをさらに含んでもよい。
前記細胞または粒子投入口は、 細胞懸濁液または粒子リザーバと、 緩衝液リザーバと、 前記細胞懸濁液または前記粒子の濃度を調節するための、前記細胞懸濁液また
は前記粒子リザーバに連結された第1の投入口および前記緩衝液リザーバに連結
された第2の投入口を有する第3の切り換えバルブであって、前記緩衝液は前記
細胞懸濁液または粒子の希釈剤である第3の切り換えバルブと、 前記第3の切り換えバルブから前記細胞懸濁液または粒子混合物を受け入れ、
前記第2の混合ゾーンにこの混合物を提供するための、前記第3の切り換えバル
ブの流出口に連結された第4のプライミングバルブ とを含んでいてもよい。前記検出器は、レセプター媒介性応答の活性化または抑
制、イオンチャンネルの活性化または抑制、非選択的細孔の活性化または抑制、
レセプターまたはチャンネルの下流点での二次メッセンジャー経路の活性化また
は抑制、アポトーシスの活性化または抑制、細胞ネクローシスの活性化または抑
制、および細胞毒性からなる群から選択される細胞応答を含む多数の細胞応答を
検出し得る。前記装置は、多数の細胞懸濁液リザーバをさらに含んでもよい。
たは薬理学的効果のリアルタイムでの連続モニタリングおよび検出に必要なもの
を提供する。その最も簡便な実施形態において、本発明は、単一細胞懸濁液、一
連の細胞懸濁液(その各々は、試験されるべき一連の細胞型に含まれる単一細胞
型を含む)、1つより多くの細胞型を含む単一細胞懸濁液、または1つより多く
の細胞型を含む一連の細胞懸濁液を、既定濃度の少なくとも1つの潜在的に活性
な化合物と、好ましくは既定濃度の少なくとも2つの活性化合物と連続的に接触
させる方法および装置を包含する。さらに、細胞および活性化合物間の接触に応
答して生じる細胞内変化は、懸濁液が検出器を通過するときに、連続的に測定さ
れる。幾つかの実施形態においては、多数の細胞応答が同時に評価され得る。幾
つかの実施形態においては、単一細胞において1つまたはそれ以上の細胞応答が
評価される。
されるべき一連の粒子に含まれる粒子型を含む)、1より多くの型の粒子を含む
単一粒子調製物、または1つより多くの型の粒子を含む一連の粒子調製物を、粒
子との相互作用を試験されるべき既定の濃度の少なくとも1種の分子と連続的に
接触させる方法および装置を包含する。幾つかの実施形態において、粒子を既定
の濃度の少なくとも2種の分子と接触させる。次に、粒子と試験分子が検出器を
通過するときに、粒子と分子間の相互作用が連続的に測定される。幾つかの実施
形態において、多数の相互作用が同時に評価され得る。幾つかの実施形態におい
ては、粒子において1つまたはそれ以上の相互作用が評価される。
薬理学的効果、または個々の細胞レベルで、もしくは細胞の不均質な集団におけ
る各細胞型において測定されるべき細胞の生化学的特性のモニタリングを可能と
する。さらなる実施形態において、本発明は、各細胞もしくは細胞型の多数の特
徴の同時検査、または不均質もしくは混合細胞集団の検査を可能とする。
る活性に関する多数の候補化合物のスクリーニングにおいて非常に価値があるで
あろうと考えられる。それは、例えば、活性化合物のための合成もしくは天然物
ライブラリーのスクリーニング、または生化学的特性化において、特有の価値を
有する。
リーニングにおいて非常に価値があるであろうと考えられる。本発明は、ポリペ
プチド、レセプターリガンド、酵素基質、酵素もしくはレセプター活性のアゴニ
ストまたはアンタゴニスト、あるいは核酸のような多数の生物学的分子の存在に
関して、試料をスクリーニングするのに使用することができる。
べき細胞型もしくは粒子調製物、または試験されるべき一連の細胞型もしくは一
連の粒子の一部を含む細胞懸濁液を連続的に混合し、インキュベーション時間後
に、1つまたはそれ以上の細胞応答、分子および粒子間の1つまたはそれ以上の
相互作用、または、細胞もしくは少なくとも1つの検体の細胞内媒質における濃
度を測定する検出器により通過される。好ましい実施形態において、検出器は、
個々の細胞、細胞懸濁液における個々の細胞型、試料中の個々の粒子、試料中の
個々の粒子型、試料中の個々の成分または試料中の個々の型の成分を分析するこ
とができる装置を含む。幾つかの実施形態において、検出器は、多数の細胞応答
または粒子および分子間の多数の相互作用を同時に評価することができる。好ま
しくは、検出器は、個々の細胞、細胞懸濁液における個々の細胞型、試料中の個
々の粒子、試料中の個々の粒子型、試料中の個々の成分、もしくは試料中の個々
の型の成分の分析または特性化が可能なフローサイトメーター(FCM)である
。幾つかの実施形態においては、検出器は、所望の群のパラメータを示す細胞を
受容器に送達し、それにより望ましくない細胞と所望の細胞を分離することが可
能であってもよい。例えば、検出器は、蛍光標示式細胞分取器であってもよい。
あるいは、検出器は、Bio-Rad(Eugene, OR)またはZeiss(Germany)から入手可能
な画像システムのような顕微鏡システム画像システムを含んでもよい。ある実施
形態において、試験化合物および/または標準化合物の濃度を経時的に変化させ
、検出器からの出力により用量/応答曲線を生成する。
にあることが好ましい。制御装置は、過程の各工程の結果を連続的にモニターす
ることが可能であり、それらの結果に応答して試験パラダイムを自動的に改変す
る。
は、検出器と混合ゾーンを接続する管の長さを通してその混合物を通過させるこ
とにより好都合に制御することができる。1種または複数種の試験化合物と混合
した後、細胞懸濁液または粒子は、管を通して直接、フローサイトメーターのよ
うな検出器に送達されてもよい。あるいは、1種または複数種の試験化合物と混
合した後に、細胞懸濁液または粒子は、連結システムを介して、フローサイトメ
ーターのような検出器に送達されてもよい。
バおよび検出器間に配置されている。好ましくは、連結システムは、試料を検出
器に迅速に提供して、既定の期間に分析できる試料の数を最適にする。様々な連
結システムが、当業者に既知である。
験化合物混合物を含むスラグ(slug)を捕らえ、振動を最低限にした条件下で、
スラグ(slug)を検出器に送達する装置である。かかる装置は、これ以降プラグ
フロー連結器(PFC)と称する。好ましくは、スラグ(slug)は、混合チャン
バからの排出管から分離管へと分離され、フローサイトメーターのような検出器
に迅速に送達される。混合チャンバに接続した排出管からのスラグ(slug)の分
離は、ぜん動性ポンプ駆動型排出管の振動流体力学の効果を低減する助けとなり
、それによりデータの質が高まる。例えば、PFCは、正の気圧下で、試料を送
達してもよい。
試料スラグ(slug)の実質的に非希釈部分を選択する。混合点から管を通して通
過する間に、細胞および試験化合物が拡散し、細胞により接触される試験化合物
の希釈を生じる。したがって、この好ましい実施形態において、スラグ(slug)
の希釈部分は、分析されない。PFCのタイミングおよび他の活性は、システム
全体を制御するソフトウェア内に組み込まれているであろうソフトウェアの特殊
セクションにより制御されてもよい。
物発見のためのプラグフローサイトメトリー」、1999年6月10日に提出)
、それに対応するPCT出願(WO 00/20873として公表されている)
に記載されるPFCである。しかしながら、試料スラグ(slug)を提供するどん
な装置も用いることができることは理解されるであろう。
て、それゆえインキュベーション期間は、流量および管の長さにより決定される
であろう。連結システムが用いられる実施形態においては、インキュベーション
期間は、細胞懸濁液または粒子が混合チャンバから、連結システムを通って、検
出器へと通過するのにかかる時間の量により決定される。インキュベーション期
間は、特定の検体およびその結果として生じる反応時間に応じて、数オーダーの
規模で変化することができる。例えば、インキュベーション期間は、迅速なもし
くは短寿命の生理学的応答に関して、1秒または何分の1秒程度と少ない場合も
あり得るし、あるいは数分さらには何時間と長い場合もあり得る。
的組合せにより容易に検出できるいずれの検体であり得る。したがって、様々な
イオンまたは電解質濃度、比色変化、光学密度変化、蛍光、発光、pH、気体発
生等はすべて、本発明の方法および装置での使用に実に容易に適合する。
ましい実施形態である。例えば、カルシウムイオンは、Fura−2、Indo
−1、Fura RedまたはQuin−2のようなプローブにより検出可能で
あり、ナトリウムイオンはSBFLにより、プロトンイオンはBCECF、SN
AFL、DM−NERFにより、マグネシウムイオンはMag−Fura−2ま
たはMag−Fura−5により、塩化物イオンは、SPO、SPAまたはMO
AEにより検出可能である。これらの色素はすべて、例えばMolecular Probes,
Inc.(Oregon)から市販されている。
終混合点からの伝達時間のパラメータを化合物濃度と相関させることが望ましい
場合がある。かかる実施形態において、装置は、混合点および検出器間の校正ユ
ニットを含有して、種々の濃度の化合物により発生されるシグナルの量を測定し
てもよい。例えば、校正ユニットは、種々の濃度の蛍光物質により発生される蛍
光の量を測定し得る。PFTを含む実施形態において、校正ユニットを、PFC
のすぐ上流の混合点から排出管に挿入してもよい。
オード(LED)、ガラスキュベットおよび蛍光検出器を含んでもよい。ガラス
キュベットは、PFCのすぐ上流の混合点から排出ラインに挿入される。LED
は、キュベットに光を提供する。光ファイバーシステム微小蛍光測定器のような
感光装置をLED源に直角に整列させて、キュベットから蛍光発光を収集する。
混合装置の単一工程およびグラジエント作成システムを用いて、フルオレセイン
のような蛍光物質のプレグラジエントスラグ(slug)および溶液の濃度グラジエ
ントを作成する。蛍光物質のグラジエントが、キュベットを通って通過すると、
その蛍光サインは微小蛍光測定器により登録される。蛍光強度は、蛍光物質の濃
度の指標である。蛍光物質の濃度は、その通過時間にと相関関係にあり、混合装
置により作成されるグラジエントを「校正する」。
。図1Aおよび図1Bに示す実施形態は、試験されるべき化合物の試料を受け取
って、保持するための試験化合物サンプラー101、試験されるべき化合物と混
合されるべき標準物質溶液の試料(例えば、緩衝液および/または既知のアゴニ
ストもしくはアンタゴニスト)を受け取って、保持するための標準物質サンプラ
ー103、試験されるべき化合物の流量を制御するための、化合物サンプラー1
01に接続された濃度グラジエント装置105、標準物質溶液の流量を制御する
ための、標準物質サンプラー103に接続された濃度グラジエント装置107、
化合物/標準物質溶液混合物または校正溶液を受け取って、これらの溶液の一つ
を、試験されるべき1つもしくはそれ以上の細胞型か、試験されるべき一連の1
つもしくはそれ以上の細胞型の一部か、または試験されるべき1つまたはそれ以
上の型の粒子を有する細胞懸濁液と混合するための混合ゾーン112にそれらを
誘導するための切換バルブ111、少なくとも1つの細胞懸濁液または粒子リザ
ーバ113(および、一連の細胞型または粒子が検査され得る場合には、多数の
細胞懸濁液または粒子リザーバそれぞれが検査されるべき一連の細胞型の一つの
細胞懸濁液、または試験されるべき1つもしくはそれ以上の粒子型の調製物を含
有する多数の細胞懸濁液または粒子リザーバ)、校正溶液が既定の比率で細胞懸
濁液または粒子と混合され得るように切換バルブ111に校正溶液を供給するた
めの、校正ユニット117、化合物/標準物質溶液混合物もしくは校正溶液と混
合された細胞懸濁液または粒子を受け取って、この混合液を検出器119に移す
ための反応展開ラインユニット115、および細胞応答または粒子相互作用が検
出器119により検出および測定された後に、検出器119から混合物を受け取
って、排出するための排出路121から構成される。制御装置109は、試験化
合物サンプラー101、標準物質サンプラー103、グラジエント装置105お
よび107、ならびに切換バルブ111に連結される。制御装置は、ソフトウェ
アプログラム125に従ってシグナルを順に発生し、送信、および受信するコン
ピューター123から指令シグナルを受信することにより上記装置を制御する。
混合ゾーン112は、チャンバ、管、一連のバッフル、または混合が生じ得る任
意の他の構造を構成することができる。幾つかの実施形態において、コンピュー
ター123はまた、連結システム120の動作を制御してもよい。さらなる実施
形態において、コンピューター123は、目下の試料スラグ(slug)の分析が完
了した後にすぐに次の試料スラグ(slug)が検出器に送達され、それにより既定
の期間中に分析され得る試料の数を最適にするように、連結システム120を試
験化合物サンプラー101と同期させてもよい。さらなる実施形態において、コ
ンピューター123はまた、標準化合物サンプラー103の動作を制御してもよ
い。また、先述の装置の動作は、1つより多くのコンピューターにより制御され
てもよいことは理解されるであろう。
ント装置107、切換バルブ111、および校正ユニット117を含むが、実施
されている分析が、標準物質または校正溶液の使用を要さない場合、装置のこれ
らの態様は存在する必要がないということは理解されるであろう。同様に、実施
されている分析が、試験化合物の濃度グラジエントを要さないとき、装置は、試
験化合物サンプラー101に接続したグラジエント装置105を含む必要はない
。
手可能であり、より好ましい実施形態においては、静電ミキサー125−134
5(Bio Rad)である)にて細胞または粒子と混合された後、次にこの混合物が
より完全に混合され、その試薬が互いとより完全に反応するのに十分な時間を与
え得るように、それを反応展開ライン115に通して送る。検出器119は、反
応展開ラインユニット115に接続され、反応展開ライン115から細胞または
粒子/化合物/標準混合物を受け入れる。
れ化合物または標準物質溶液を含有するバイアルに配備され得るシッパーノズル
(sipper nozzle)を含む。これらのサンプラーは、当該技術分野でよく知られ
ており、市販され容易に入手可能な製品(例えば、A/S300 オートサンプ
ラー、カタログ#15006330、Scientific Measurement Systems, Inc.,
Colorado)である。複数の試料を取り扱うために、従来型自動またはロボット装
備(示していない)を用いて、装置に試料を供給してもよい。例えば48または
96ウェルプレートフォーマットに配置された種々の試料のバンクは、例えば、
かかる自動サンプリング装備により容易に供給され得る。
えば、GP40グラジエントポンプ(Dionex))である。作用モードに応じて、対
応する濃度グラジエント装置105および107は、別個の濃度もしくは連続グ
ラジエントの濃度の試験されるべき化合物または標準物質(アゴニストまたはア
ンタゴニスト)を、緩衝液で希釈することにより調製することができる。例えば
、標準物質の存在下で、化合物濃度に対する細胞応答または粒子相互作用の連続
曲線が望ましい場合、コンピューター123は、それぞれの化合物および既定の
一定濃度の標準物質溶液の連続グラジエントを切換バルブ111に供給するよう
な方法で、グラジエント装置105および107を制御するよう制御装置109
に指令するであろう。あるいは、化合物の存在下で、標準物質溶液濃度に対する
細胞応答または粒子相互作用の連続曲線が望ましい場合、コンピューター123
は、それぞれの標準物質溶液および既定の一定濃度の化合物の各々の連続グラジ
エントを切換バルブ111に供給するような方法で、グラジエント装置105お
よび107を制御するよう制御装置109に指令するであろう。
AXおよびMIN、を校正するのに必要とされる校正溶液を供給する。好ましい
実施形態において、この校正ユニットは、市販され容易に入手可能な装置(例え
ば、SV3−2切り換えバルブ(Bio-Rad))である切り換えバルブから構成され
る。切り換えバルブは、切換バルブ111への2つの校正溶液の供給を交互に行
う。切換バルブ111は、グラジエント装置105および107から、あるいは
、校正ユニット117からの流出を、細胞懸濁液または粒子リザーバ113から
の(または、検査されるべき一連の細胞型もしくは粒子調製物において、それぞ
れが1つもしくはそれ以上の細胞型、またはそれぞれが1つもしくはそれ以上の
粒子型を含有する粒子調製物を含有する多数の細胞懸濁液あるいは粒子リザーバ
113の1つからの)細胞流または粒子流と組み合わせ、反応展開ライン115
の1つに混合流を誘導する。切換バルブ111は、産業界では十分知られている
型のものであり、好ましい実施形態においては、General Valve Corp.により製
造される三方ミクロバルブ4−8−900である。細胞懸濁液または粒子リザー
バ113も、当該技術分野でよく知られている型のものであり、好ましい実施形
態においては、通常のガラスビーカーである。細胞または粒子は、簡単な低剪断
撹拌により装置に導入されるのを待って、懸濁液中に維持される。
られる管であり、それを通って、細胞懸濁液または粒子調製物、化合物および標
準物質溶液の上述の混合物は流れてもよい。例えば、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、またはポリテトラフルオロエチレン管を用いることができる。細胞または
粒子および他の試薬がくっつかないであろう配管が、特に好ましい。管の直径は
、選択可能である。約0.2mm〜約2mmの内径を有する細管は、非常に小さ
な試料サイズの使用が可能であるため、特に有利である。
混合するように、典型的に巻線配置で設定されている。混合物が配管に導入され
る前に十分混合されたとしても、らせんまたは巻線配置により、長い配管の長さ
をコンパクトな領域におさめることができる。これらの反応展開ライン115は
市販されており、ある実施形態においては、テフロン(登録商標)配管により作 成されてもよい。
含まれる1つまたはそれ以上の細胞型、1つまたはそれ以上の粒子型を含む粒子
調製物、または試験されるべき一連の粒子調製物に含まれる1つまたはそれ以上
の粒子型を含む粒子調製物を含有する細胞懸濁液と化合物/標準物質溶液との混
合物は、「反応懸濁液」とも称されるが、反応展開ライン115の長さにより決
められる時間遅延またはインキュベーション期間で検出器の流動光学セルまたは
他の検出ゾーンに入る。いったん反応懸濁液が検出器119に到達すると、検出
器119は、特定の濃度の試験化合物に対する細胞懸濁液応答または試料中の特
定分子の存在を測定することができる。
めに、カルシウム感受性色素、FURA2(そのスペクトル特性は、細胞内イオ
ン化カルシウムの濃度に依存する)からの蛍光シグナルを測定する。この測定を
行うために、検出器119は、流動光学キュベットを通過する反応懸濁液を、波
長340nmおよび380nmの光で交互に照射して、540nmでの蛍光強度
を測定する。それぞれ340nmおよび380nmで励起された際の540nm
で登録される蛍光強度の比(R)は、コンピューター123に送られる。コンピ
ューター123は、当該技術分野で十分知られる下記方程式: [Ca2+]=Kd(R・Rmin)/(Rmax・R)(If/Ib) (式中、Kdは、カルシウム/FURA2錯体の解離定数であり、RminおよびR max は、それぞれ校正溶液MINおよびMAXの存在下で得られる比であり、If およびIbは、それぞれ校正溶液MINおよびMAXの存在下で、380nmで
励起した際の540nmで測定される蛍光強度である) により細胞内イオン化カルシウムの濃度を計算する。
混合物を、1つまたはそれ以上の波長のレーザー光で照射する。照射および放射
波長は、測定されるべき特定の細胞応答または粒子相互作用に適切ないかなる波
長であってもよい。検出器は、細胞応答または粒子相互作用を検出するのに適し
たいかなる型のシグナルも検出でき、光に基づく検出に限定されないことは認識
されるであろう。
令する。コンピューター123はまた、コンピューター123内で実行されるソ
フトウェア125に従って、第1および第2のグラジエント装置105および1
07、切換バルブ111ならびに試験化合物サンプラー101および標準物質サ
ンプラー103を制御する制御装置に接続されているか、または制御装置109
の一部である。検出器119は、その供給源が何であっても、特定の所望のシグ
ナルを測定することが可能である。光学検出器119は、分光光度計、分光蛍光
計、またはルミノメーター(luminometer)であってもよく、それぞれが流動光学
セルを有する。これらの装置は、当該技術分野で十分知られており、市販されて
いる。例えば、本発明の装置のある実施形態では、AMINCO−Bowman
シリーズ2ルミネセンス分光蛍光計(Fa−256、Spectronic Instruments,
Inc.)を使用してもよい。検出器は、直接的イオン測定装置である場合、例えば
pHセンサーまたはイオン選択性電極を含むことができる。ナトリウム、カルシ
ウムおよびカリウム検出器は、かかる装置の例である。この型の検出器は市販さ
れている。
な連結システム120をさらに含む。連結システム120は、混合チャンバ11
2および検出器119間に配置されている。
る個々の細胞型、試料中の個々の粒子、試料中の個々の粒子型、試料中の個々の
成分、または試料中の成分の個々の型を分析することができる装置を含む。好ま
しくは、検出器は、各粒子または細胞由来の複数の特徴または特性を同時に分別
する能力を有する。例えば、ある実施形態において、検出器は、フローサイトメ
ーター(FCM)である。FCMは、Beckman-CoulterからのEpics El
iteまたはBecton-DickinsonからのFACSCaliburのようないかなる
現在または将来のシステムであってもよい。単一粒子/単一細胞、多重パラメー
タ特性は、不均質集団内の粒子または細胞のサブセット(subset)の分別を可能に
する。例えば、特定の1種または複数の試験化合物に応答する不均質細胞集団ま
たは混合細胞集団内からの細胞のサブセット(subset)は、この技法により集団全
体から分別されてもよい。あるいは、特定の特性を保有する不均質または混合集
団における粒子のサブセット(subset)を、その集団から分別してもよい。
性を測定する能力を有する。図2は、FCMの多重パラメータ容量を示し、FC
Mから得られる情報の流れを示す。
は個々の細胞型、粒子型、もしくは成分型のような試料を、検出器により検出可
能なシグナルを生じる物質に曝露する。シグナルは、蛍光性シグナルまたは非蛍
光性シグナルであってもよい。細胞または粒子試料が混合システムから送達され
た後に、それらはレーザーのような1つまたはそれ以上の検出物質により発信さ
れ、試料が評価されている1つまたはそれ以上のパラメータを保有する場合、そ
のパラメータの存在を示すシグナルが発生して処理され、従来の手順を用いて操
作されるか、または記憶され得るデータ出力を提供する。
て制御され得る。
試薬を供給する正圧システムは、ピストンポンプまたは他の適切なポンプを用い
て創出され得る。あるいは、負圧システムにより試薬を取り出すシステムは、ぜ
ん動性ポンプまたは他の適切なポンプにより創出される。負圧システムは、多数
の投入供給源が単一の下流ポンプによって駆動され得るため、最も簡単な実施形
態である。
示す。好ましい実施形態において、このシステムは、以下により詳細に説明する
ように、プログラマブル制御装置の制御下で、自動的に動作する。この実施形態
は、試験されるべき1つまたはそれ以上の化合物203および様々な濃度の化合
物203を提供するために化合物203と混合され得る緩衝液205を保持する
オートサンプラー201、それぞれ化合物および緩衝液を受け取って、混合ゾー
ン227への試験化合物203の濃度レベルおよび流れを制御するグラジエント
ポンプ211にそれを送達するための、取込みノズルまたは受口、207および
209、1つまたはそれ以上の標準物質(すなわち、アンタゴニスト215およ
び/またはアゴニスト217)および様々な濃度の標準物質を提供するために標
準物質215または217と混合され得る緩衝液219を保持するオートサンプ
ラー213、それぞれ標準物質および緩衝液を受け取って、混合ゾーン227へ
の標準物質溶液(アゴニストまたはアンタゴニスト)の濃度レベルおよび流れを
制御するグラジエントポンプ225にそれを提供するための、取込みノズルまた
は受口、221および223を含む。各グラジエントポンプ211および255
はそれぞれ、2つの投入管ラインおよび1つの排出管ラインを有利に有してもよ
く、排出管は、混合ゾーン227を通じて互いに接続されている。図3Aおよび
図3Bに示していない制御装置(図1Aおよび図1Bの109)は、遠隔シグナ
ルを供給して、ポンピングを開始/停止することにより、オートサンプラー20
1および213ならびにグラジエントポンプ211および225の動作を制御す
る。好ましい実施形態においては、グラジエントポンプは211および255は
、Dionexにより製造されるGP40グラジエントポンプであってもよい。
および任意にグラジエントポンプ225を通って流れる標準物質溶液を受け入れ
、化合物および標準物質をともに混合する。切り換えバルブ235は、最大応答
用校正溶液233または最小応答用校正溶液237の供給を交互に行う。切り換
えバルブ235は、好ましくは、2つの投入管(2つの異なる校正溶液233、
237の各々に1つの管)、およびポンプ231に接続された1つの排出管を含
む。切り換えバルブは235は、当該技術分野で十分知られており、SV−3切
り換えバルブ(Bio-Rad)により実施され得る。図3Aおよび図3Bに示していな
い制御装置(図1Aおよび1Bの109)は、切り換えバルブ235にシグナル
を送り、この切り換えバルブ235は、1つの校正溶液233または別の校正溶
液237を接続する取込み受け口を、ポンプ231の流入口に切り換える。流体
システムに校正溶液を供給するためのポンプ231も、図3Aおよび図3Bに示
してある。ポンプ231は、切り換えバルブ235から校正最大溶液233また
は校正最小溶液237を受け入れ、次に、受け取った校正溶液を切換バルブ22
9にポンピングする。ポンプ231の排出管は、切換バルブ229の投入口に接
続されている。ポンプ231は、当該技術分野で十分知られている標準的なピス
トンポンプが有利である。好ましい実施形態において、ポンプ231は、シリー
ズ1350ソフト−スタートポンプ(Bio-Rad)である。切換バルブ229は、混
合ゾーン239への化合物/標準混合物または校正溶液の1つの供給を交互に行
う。ポンプ241は、試験されるべき1つもしくはそれ以上の細胞型または1つ
またはそれ以上の粒子型を含有する細胞懸濁液あるいは粒子リザーバ243から
(または、それぞれが検査されるべき一連の細胞型もしくは粒子型に含まれる1
つもしくはそれ以上の細胞型または1つまたはそれ以上の粒子型を含有する、多
数の細胞懸濁液あるいは粒子リザーバ243の1つから)、細胞または粒子を混
合ゾーン239に供給する。ポンプ241は、投入管から、細胞懸濁液または粒
子リザーバ243からの細胞または粒子を受け入れ、排出管を通して受け取った
細胞または粒子を混合ゾーン239の1つの流入口にポンピングする。化合物/
標準物質溶液または校正溶液は、混合ゾーン239の別の流入口を通ってくる。
混合ゾーン227および239の両方は、当該技術分野で十分知られており、好
ましい実施形態においては、静電ミキサー、125−1345(Bio-Rad)により
実施されてもよい。ポンプ241は、当該技術分野で十分に知られている標準的
なピストンポンプであり得る。好ましい実施形態において、ポンプ241は、シ
リーズ1350ソフト−スタートポンプ(Bio-Rad)である。次に、細胞または粒
子および化合物/標準物質溶液、あるいは細胞および校正溶液の混合物は、混合
ゾーン239から反応展開ライン245に供給される。これらのラインの長さは
、流量とともに、インキュベーション期間(すなわち、細胞または粒子が化合物
/標準混合物または校正混合物と混合される時点から、検出器247に到達する
時点まで時間に経過する時間)を決定する。次に、検出器247は、化合物/標
準混合物もしくは校正溶液による細胞応答または粒子相互作用の量を測定する。
細胞応答または粒子相互作用が検出器247により測定された後に、混合物は排
出路249を介して検出器から排出される。
ような連結システム251を含む。連結システム251は、混合チャンバ239
および検出器247間に配置される。
3、アンタゴニスト215および/またはアゴニスト217、緩衝液219、取
込みノズルまたは受け口221および223、グラジエントポンプ225、ポン
プ231、切り換えバルブ235、校正溶液233および237、ならびに切換
バルブ229を含むが、実施されている分析が、標準化合物または校正溶液の使
用を要さない場合、装置のこれらの態様は存在する必要がないということは理解
されるであろう。同様に、実施されている分析が、試験化合物の濃度グラジエン
トを要さないとき、装置は、グラジエントポンプ211、緩衝液205または受
け口209を含む必要はないが、代わりに試験化合物を混合チャンバに送達する
ためのポンプを含んでもよい。
示す。図4Aおよび図4Bに示すように、1つの好ましい実施形態は、1つまた
はそれ以上の化合物(Ni)303および緩衝液305を保持するオートサンプ
ラー301であって、それぞれ化合物(Ni)303および緩衝液305を受け
入れるための、2つの取込みのノズルまたは受け口、307および309をさら
に含むオートサンプラー301、既定または特定の割合の緩衝液305での化合
物303の希釈溶液を調製し、この混合物をプライミングバルブ313に送達す
るためのプロポーショニングバルブ311、標準アンタゴニスト(Mj)317
アゴニスト(Lk)319および緩衝液305を保持するオートサンプラーで3
15あって、それぞれ標準物質および緩衝液を受け入れるための、2つの取込み
ノズル323および325をさらに含むオートサンプラー315、既定または特
定の割合の緩衝液305での標準物質317または319の希釈溶液を調製し、
この混合物をプライミングバルブ329に送達するためのプロポーショニングバ
ルブ327を含む。プロポーショニングバルブ311および327は、当該技術
分野で十分知られているいかなる型のものであってもよい。好ましい実施形態に
おいて、これらのバルブ311および327は、定比頻度モードで運転するシリ
ーズ4ミニチュアソレノイド型バルブ(4−8−900 General Valve Corp.
)である。同様に、プライミングバルブ313および329は、当該技術分野で
十分知られているいかなる「通常開放された」型のものであってもよく、好まし
い実施形態においては、General Valve Corp.により製造されるシリーズ4ミニ
チュアソレノイド型バルブ(4−39−900)である。
よびプライミングバルブ329から受け取った標準物質溶液を混合する。第1の
混合ゾーン331は、本明細書で論じる他の混合ゾーンと同様に、簡単な「Y」
コネクター、直径が配管の数倍であるチャンバ、一本の配管、サーペンタイン(s
erpentine)、バッフル付チャンバ、機械的回転ミキサー内蔵チャンバ、または任
意の他の適切な構造を構成することができる。典型的に、該方法は、非常に小量
の液体を包含するであろう(例えば、完全な濃度グラジエントランが0.3ml
程度と少ない試料で成し遂げられてもよい)。したがって、混合されるべき容量
は小さく、混合ゾーンは、小さな内容積および高い混合効率を有するべきである
。これらの型のミキサーは、当該技術分野で十分知られており、好ましい実施形
態においては、The Lee Companyにより製造されるビスコジェットマイクロ−ミ
キサー(#TCMA0120113T)により実施されてもよい。
液339の供給を交互に行う。切り換えバルブ335は、2つの異なる校正溶液
を受け入れるための2つの投入管および別の切り換えバルブ333に接続した1
つの排出管を含む。切り換えバルブ333は、2つの投入管(一方は、化合物/
標準物質溶液混合物を受け入れるためであり、他方は、校正溶液337または3
39の1つを受け入れるためである)を有することができる。切り換えバルブ3
33は、排出管を通して、プライミングバルブ341へ、化合物/標準混合物ま
たは校正溶液の1つの供給を交互に行い、次にこのプライミングバルブ314が
、混合ゾーン343に受け取った液体を送達する。第3の切り換えバルブ347
は、試験されるべき1つもしくはそれ以上の細胞型または1つもしくはそれ以上
の粒子型を含有する細胞懸濁液あるいは粒子リザーバ349からの(または、そ
れぞれが試験されるべき一連の細胞型もしくは粒子型に含まれる1つもしくはそ
れ以上の細胞型または1つもしくはそれ以上の粒子型を含有する、多数の細胞懸
濁液あるいは粒子リザーバの1つからの)細胞または粒子、あるいは緩衝溶液3
05の排出管346を通したプライミングバルブ345への供給を交互に行い、
次にこのプライミングバルブ345が、細胞もしくは粒子または緩衝液を混合ゾ
ーン343に送達し、それらはこの混合ゾーン343において、化合物/標準混
合物またはプライミングバルブ341から受け取った校正溶液の1つと混合され
る。切り換えバルブ333、335および347は、当該技術分野で十分知られ
ているいかなる型、例えばSV−3切り換えバルブ(BioRad)であってもよい。次
にこの混合物は、細胞または粒子が、化合物/標準混合物または校正溶液の1つ
と混合される時点から、混合物が検出器光学セル355に到達する時点までに経
過する時間を決定する反応展開ライン353に送られる。上記説明のように、反
応展開ライン353および検出器355は、当該技術分野で十分知られているい
かなる型であってもよい。
び混合物を、様々なバルブ(311、313、327、329、333、335
、341、345および347)、混合ゾーン(331および343)、反応展
開ライン353、検出器355を通して、最終的に排出路359へ流すのに要す
る必要圧力を有利に供給することができる。適切なぜん動性ポンプ357は、当
該産業界で十分知られており、好ましい実施形態においては、EP−1 Eco
no Pump(BioRad)により実施されてもよい。ポンプ、バルブ、検出器およ
びシステムの他の有効な構成要素は、以下により詳細に説明するように、好まし
くはプログラマブル制御装置の自動制御下にある。
のような連結システム361を含む。連結システム361は、混合チャンバ34
3および検出器355間に配置される。
液を供給する構成要素を含むが、実施されている分析が、標準化合物または校正
溶液の使用を要さない場合、装置のこれらの態様は存在する必要がないというこ
とは理解されるであろう。同様に、実施されている分析が、試験化合物の濃度グ
ラジエントを要さないとき、装置は、グラジエントを提供する構成要素を含む必
要はないが、代わりに試験化合物を混合チャンバに送達するためのポンプを含ん
でもよい。
ングモードおよび効力モードを有する。
の細胞応答または1つもしくはそれ以上の分子の存在を検出し得るアルゴリズム
を示す。まず、細胞もしくは粒子/化合物混合物または試料を検出器に提供する
(ステップ401)。次に、装置は、化合物が細胞と接触すると、いずれかの細
胞応答を誘発するかどうか、または試料が分子を含有するかどうかを測定する(
ステップ403)。化合物は分析され得るどんな細胞応答も引き起こさないか、
または試料は分析され得るどんな分子も含有しない(いいえ)、あるいはそれは
1つもしくはそれ以上の細胞応答を誘発するか、または1つもしくはそれ以上の
分子を含有する(はい)という、2つの可能性がある。細胞応答は、検出され得
る特定の1種または複数種の検体に関して、検出器からのシグナルをモニターす
ることにより測定される。同様に、試料中の1つまたはそれ以上の分子の存在は
、分析され得る特定の1種または複数種の分子が存在する場合、生成されるであ
ろうシグナルの存在に関して、検出器からのシグナルをモニターすることにより
測定される。制御システムはまず、校正して、ベースラインおよび最大応答を確
立し、それらの値間に収まる検出器からのいかなるシグナルも陽性応答であると
考えられる。
引き起こさない場合(いいえ)、細胞または粒子は、連続的かつ自動的に、化合
物およびアゴニスト溶液の既定のセットからの標準物質の混合物と接触させる(
ステップ407)。セット中の各溶液は、試験化合物の非存在下で、例えば、既
知の細胞レセプター、イオンポンプもしくはイオンチャンネル分子の刺激を介し
て、または既知の分子相互作用を介して、細胞応答を起こすか、または粒子に結
合する1つまたはそれ以上の成分を有する。次に、特定のアゴニストで通常に誘
発される細胞応答または粒子相互作用が特定の化合物により抑制されるかどうか
に関して測定する(ステップ411)。特定の標準アゴニストで誘発される細胞
応答または粒子相互作用が、化合物の存在下にて抑制されることを検出するまで
、または機械に利用できるすべてのアゴニストが試験されるまで、本装置は、化
合物との種々の標準アゴニスト物質の混合を繰り返し続けるであろう。ステップ
411において、特定のアゴニストで通常に誘発される細胞応答または粒子相互
作用が特定の化合物により抑制されることが測定される場合(はい)、その化合
物をレセプターRiのアンタゴニストとして類別する(ステップ415)。この
後、装置の性能を管理するソフトウェアによって指示される場合、計器は作用の
効力モードに切り替わる(ステップ417)。
、細胞応答または粒子相互作用を起こす場合(はい)、細胞または粒子は、化合
物およびアンタゴニスト溶液の既定のセットからの標準物質の連続混合物と自動
的に接触させる(ステップ405)。アンタゴニストセット中の各溶液は、例え
ば、既知の細胞レセプター、イオンポンプまたはイオンチャンネル分子の刺激を
介して、少なくとも1つの既知のアゴニストにより起こされる細胞応答または粒
子相互作用を阻止する1つまたはそれ以上の成分を含有する。次に、化合物で誘
発される細胞応答または粒子相互作用が特定の標準アンタゴニストの存在下で、
抑制されるかどうかに関して測定する(ステップ409)。化合物で誘発される
細胞応答または粒子相互作用が、特定の標準アンタゴニストの存在下にて抑制さ
れることを検出するまで、またはすべてのアンタゴニストが試験されるまで、本
装置は、化合物との種々の標準アンタゴニスト物質の混合を繰り返し続けるであ
ろう。ステップ409において、化合物で誘発される細胞応答または粒子相互作
用が特定のアンタゴニストにより抑制されることが測定される場合(はい)、そ
の化合物は、細胞もしくは粒子におけるレセプターRiまたは他の分子に対する
アンタゴニストとして特徴付けられる(ステップ413)。この後、装置の性能
を管理するソフトウェアによって指示される場合、計器は作用の効力モードに切
り替わる(ステップ417)。
セットを使用することにより、幾つかのレセプター型および亜型に対する化合物
を特異性および選択性についてスクリーニングすることが可能である。一連の細
胞型または粒子型が試験され得る際、多数の細胞型における化合物の活性または
多数の粒子型との相互作用を評価するために、試験されるべき一連の細胞型もし
くは粒子型に含まれる各細胞型または粒子型に関して、プロセスを繰り返すこと
ができる。
細胞内濃度の増加で示されるが、以下のレセプター亜型特異的アンタゴニスト:
BQ−123、BQ−788、BQ−153、BQ−485、BMS−1828
74 PD 151、242を用いてもよく、以下のレセプター亜型特異的アゴ
ニスト:エンドセリン−1、エンドセリン−2およびエンドセリン−3、サラフ
ォトキシン S6c、IRL 1620、BQ−3020を用いてもよい。
ンネル型特異的アゴニストおよびアンタゴニストのセットが存在する。例えば、
細胞内カルシウムチャンネルのアゴニストは、Ins(1,4,5)P3、リア
ノジン、カフェイン、ヘパリン、過塩素酸塩であり、それらのアンタゴニストは
、デカバナデート、ルテニウムレッドおよび高濃度のリアノジンである。
、実施されている分析が、標準化合物の使用を要さない場合、該ステップは存在
する必要がないということは理解されるであろう。代わりに、アルゴリズムは、
細胞が試験化合物に応答するかどうか、または試料が分子を含有するかどうかを
簡便に測定する。
リンティング(receptor fingerprinting)」として通常知られている細胞レセプ
ターパターンの特性化のために使用される。この実施形態によれば、試験される
べき細胞型または一連の細胞型は、アゴニスト溶液の既定のセットからの標準物
質に対してスクリーニングされる。セット中の各溶液は、既知の細胞レセプター
の刺激を介して、細胞応答を起こす1つまたはそれ以上の成分を有する。この方
法で、2つまたはそれ以上の細胞型におけるレセプター発現パターンが評価でき
る。1つまたはそれ以上の細胞型が特定のアゴニスト物質に応答すると、装置の
性能を管理するソフトウェアにより指示される場合、計器は作用の効力モードに
切り替わる。
す。効力モードにおける第1のステップは、特定の化合物がアゴニストまたはア
ンタゴニストとして類別されたかどうかを測定することである(ステップ501
)。次に、装置は、試験され得る標準物質または化合物の連続濃度グラジエント
を調製する。
細胞型または粒子相互作用のためのアゴニストとして類別された場合、装置は、
応答細胞における細胞応答または粒子相互作用の濃度依存性を測定し、記録する
であろう(ステップ503)。ステップ503中に、装置は、活性化合物に関す
る連続的実験活性化曲線を作成するであろう。これらの曲線から、例えば、EC 50 (細胞の最大刺激応答の50%を引き起こす活性化因子の有効濃度)に関して
化合物の効力を計算することができる(ステップ505)。この計算は、当該技
術分野で既知のよく知られている曲線の当てはめソフトウェアを用いて実施され
得る。好ましい実施形態において、このソフトウェアは、GraphPad, Incにより
製造されるグラフィックソフトウェアPRISMによって実施されてもよい。
細胞型または粒子相互作用のためのアンタゴニストであると測定される場合、装
置は、標準アゴニストの存在下での、これらの細胞型もしくは粒子型における細
胞応答または粒子相互作用抑制の濃度依存性を測定し、記録するであろう(ステ
ップ507)。ステップ507中に、装置は、標準アゴニスト物質の一定濃度で
得られるアンタゴニスト化合物の連続的実験抑制曲線を作成するであろう。これ
らの曲線から、例えば、IC50(最大抑制応答細胞の50%または粒子相互作用
の最大レベルの50%を引き起こす遮断剤の有効濃度)に関して、化合物の効力
を計算することができる(ステップ509)。IC50値の計算はまた、PRIS
Mソフトウェアパッケージを用いて、好ましい実施形態で実施され得る。
のアンタゴニストとである測定される場合、装置はまた、幾つかの濃度のアンタ
ゴニスト化合物の存在下での、標準アゴニスト物質に対するこれらの細胞型もし
くは粒子型における細胞応答または粒子相互作用の濃度依存性を測定し、記録す
るであろう(ステップ511)。ステップ511中に、装置は、種々の別個の濃
度のアンタゴニスト化合物で得られる標準アゴニスト物質に関する一連の連続的
実験活性化曲線を作成するであろう。次に、装置は、例えば、pA2値に関して
化合物の親和性および効力を計算し、アンタゴニストが競合的か、または非競合
的かを測定するであろう(ステップ513)。pA2値は、リガンド/レセプタ
ー錯体の結合定数の負の対数に比例し、レセプターに対するリガンドの親和性の
尺度であり、pA2値が高いほど、レセプターに対する化合物の親和性も高い。
実際的に、pA2値は、種々の濃度のアンタゴニスト化合物の存在下で、活性化
曲線のシフトから計算することができ、下記式: pA2・Log(R−1)・LogB (式中、Rは、別個の濃度(B)のアゴニスト化合物の存在下およびアンタゴニ
ストなしの両方で測定される標準アゴニスト物質の等効力濃度の比である) により与えられ得る。好ましい実施形態において、標準アゴニスト物質の等効力
濃度は、PRISMソフトウェア活性化曲線に見出すことができる。実験曲線の
上記セットを用いて、Cheng-Prusoff(Cheng & Prusoff, 1973)、Gaddum(Gaddum,
1957)またはSchild(Arunlakshana & Schild, 1959)分析に従った研究のもと、
化合物に関する効力および薬理学的プロフィールを評価することができる。
、スクリーニングモードおよび効力プロファイリングモード)の選択から操作モ
ードを選択するよう入力要求するとプロセスが始まる。目下好ましい最上レベル
のプロセスにおいて、第1の選択は、システムプライミングを実施することであ
る。図4Aおよび図4Bを参照すると、オペレーターは、プライミングプロセス
を開始する前に、緩衝液を充填したリザーバ305に流入口309、325およ
び351のノズルを、対応する校正溶液を充填したリザーバ337および339
にそれぞれ流入口336および338のノズルを、ならびに試験されるべき1つ
もしくはそれ以上の細胞型または1つもしくはそれ以上の粒子型を充填した細胞
懸濁液あるいは粒子リザーバ349の1つに流入口348のノズルを配置するよ
う入力要求される。
いシステムプライミングプロセスの連続フロー図を図7a〜図7dに示す。図7
aを参照すると、システムプライミングプログラムは、始動状態600から始ま
り状態602に入り、この状態602において、すべてのパラメータをそれらの
初期値に設定する。これらの初期パラメータとしては、ソフトウェア変数および
サブルーチンの内部初期化が挙げられるが、それらに限定されない。
2(図4Aおよび図4B)は、それらの対応する取込みノズル307および32
3を「ゼロ」位置に配置する(ステップ604)。その「ゼロ」位置にある各オ
ートサンプラーは、洗浄用緩衝液を充填したリザーバ305を含む。ステップ6
04中に、プロポーショニングバルブ311および327(図4Aおよび図4B
)、切り換えバルブ333、335および347(図4Aおよび図4B)および
プライミングバルブ313、329、341および345(図4Aおよび図4B
)に電力を供給する電源はスイッチが切られている。好ましい実施形態において
、プライミングバルブ313、329、341および345は、無電動状態(オ
フ)では通常開放されており、プロポーショニングバルブ311および327は
、無電動(オフ)状態では、それぞれ「通常開放されている」流入口309およ
び325とそれらの流出口312および328を接続し、また無電動(オフ)状
態では、切り換えバルブ335は、「通常開放されている」流入口336とその
共通流出口334を接続し、切り換えバルブ333は、「通常開放されている」
流入口332とその共通流出口342を接続し、切り換えバルブ347は、「通
常開放されている」流入口348とその共通流出口346を接続する。
6)、プライミングバルブ313および345をオンにする(ステップ608)
。電動状態では、プライミングバルブ313および345は閉じられる。このこ
とにより、配管325、プロポーショニングバルブ327の排出配管328、プ
ライミングバルブ329、混合ゾーン331、切り換えバルブ333の取込み配
管332および排出配管342、プライミングバルブ341、混合ゾーン343
、反応展開ライン353、検出器355、ポンプ357を通って、続いてドレー
ン容器359に緩衝液を流し込む。
アコード125を実行して、システムの様々なバルブ、チャンバ等を制御する制
御装置109に制御シグナルを提供する。この制御シグナルは、流体ラインを充
填する液体に十分な時間を提供するために遅延される(ステップ610)。次に
、プロポーショニングバルブ327をオンにする(ステップ612)。プロポー
ショニングバルブ327が電動状態にある間、オートサンプラー315の「ゼロ
」位置に位置する緩衝液は、配管323、プロポーショニングバルブ327の排
出配管328、プライミングバルブ329、混合ゾーン331、切り換えバルブ
333の取込み配管32および排出配管342、プライミングバルブ341、混
合ゾーン343、反応展開ライン353、検出器355、ポンプ357を通って
、続いてドレーン容器359に流れるであろう。
を充填するのに必要な時間を提供するために、再び制御シグナルを遅延させる(
ステップ613)。ステップ613の遅延後、制御シグナルは、プロポーショニ
ングバルブ327をそのオフ位置に設定し(ステップ614)、プライミングバ
ルブ313をオフにし(開放し)(ステップ616)、プライミングバルブ32
9をオンにする(閉じる)(ステップ618)であろう。このことにより、ライ
ンが緩衝液305で充填されるために必要とされる遅延(ステップ619)中に
、流体ライン309、312、332、342、プライミングバルブ341、混
合ゾーン343、反応展開ライン353、検出器355およびポンプ357が充
填されるであろう。
1は給電される(ステップ620)。この遅延期間中に、同じ流体ラインは、オ
ートサンプラー301の「ゼロ」位置に位置し、ノズル307を通ってくる緩衝
液を与えられる。
311(ステップ622)およびプライミングバルブ329(ステップ624)
両方を同時にオフにし、切り換えバルブ335および切り換えバルブ333の両
方をオンにする(ステップ626)。ステップ627中により決定される遅延中
に、流体の流れは、切り換えバルブ335の取込み配管338および排出配管3
34から切り換えバルブ333の取込み配管340および排出配管342を通っ
て、プライミングバルブ341、混合ゾーン343を通って、さらには反応展開
ライン353、検出器355、ポンプ357を通って、続いてドレーン容器35
9に誘導されるであろう。次に、制御シグナルは、切り換えバルブ355をオフ
にし(ステップ628)、これにより同じ流体ラインが取込み配管336から供
給を受ける。要される時間の長さは、関与する種々のラインの長さおよびシステ
ムを通る液体流量の関数であり、いかなる特定のシステムに関しても容易に決定
できる。
333をオフにし(ステップ630)、プライミングバルブ345をオフにし(
開放し)(ステップ632)、プライミングバルブ341をオンにする(閉じる
)(ステップ634)。これらの条件下で、液体の流れは、取込み配管348か
ら切り換えバルブ347の排出配管346へ、プライミングバルブ345、混合
ゾーン343、反応展開ライン353、検出器355、ポンプ357を通って、
続いてドレーン容器359に誘導されるであろう。上記液体の流れが生じるのに
要する時間は、ステップ635における遅延期間により提供される。この遅延後
に、制御シグナルは、ステップ637で提供される遅延期間中に、切り換えバル
ブ347をオンにし(ステップ636)、配管351からくる緩衝液350で同
じ流体ラインを充填させる。
ルブ341をオフにし(開放し)(ステップ638)、切り換えバルブ347を
オフにする(ステップ640)。次に、制御シグナルは、ポンプ357をオフに
する(ステップ642)。最終的には、プライミングプログラムは、システムプ
ライミングモードを終了し、流体システムのすべての構成要素は液体で充填され
る(ステップ643)。
ルブ345、341、313および329は、二方通常開放型のものである。切
り換えバルブ335、333および347は、1つの共通流出口ならびに通常開
放型および通常閉じ型の流入口をそれぞれ1つずつ有する三方型のものである。
プロポーショニングバルブ311および327もまた、切り換えバルブ335、
333および347と類似した三方型のものである。記号「−」および「+」は
、バルブのターンオフおよびターンオン状態を示す。プライミングモードが終了
した後のすべてのバルブの状態は、初期状態と同じである。
たは効力プロファイリングモードを開始するよう入力要求される。スクリーニン
グモードを選択する場合、オペレーターは、試験されるべき化合物セットにいく
つの化合物が入っているか(Nmax)、また標準物質のそれぞれのセットにいく
つのアンタゴニスト(Mmax)およびアゴニスト(Lmax)溶液が入っているかを
指定するよう入力要求される。効力ファイリングモードを選択する場合、オペレ
ーターは、セット中にあるどの化合物が測定されるべきかを指定するよう入力要
求される。
モードの連続フロー図を、図8a〜図8gに示す。
、この状態702ですべてのパラメータをそれらの初期値に設定する。これらの
初期パラメータとしては、ソフトウェア変数およびサブルーチンの内部初期化が
挙げられるが、それらに限定されない。
5(図4Aおよび図4B)は、取込みノズル307および323を、洗浄用緩衝
液リザーバ305により占有されるそれらの対応する「ゼロ」位置に配置し(ス
テップ704)、プロポーショニングバルブ311および327、切り換えバル
ブ333、335および347およびプライミングバルブ313、329、34
1および345をオフにする(ステップ706)。ターンオフ状態において、プ
ライミングバルブ313、329、341および345は、通常開放されており
、プロポーショニングバルブ311および327は、それぞれ対応する「通常開
放されている」流入口309および325とそれらの流出口312および328
を接続し、切り換えバルブ335は、「通常開放されている」流入口336と共
通流出口334を接続し、切り換えバルブ333は、「通常開放されている」流
入口332とその共通流出口342を接続し、切り換えバルブ347は、「通常
開放されている」流入口348とその共通流出口346を接続する。
このことにより、オートサンプラー301および315の両方の「ゼロ」位置に
あるリザーバから洗浄用緩衝液を流し込み、ノズル309および325、ならび
にプロポーショニングバルブ311および327それぞれの流出口312および
328、プライミングバルブ313および329、混合ゾーン331、切り換え
バルブ333の流入口332および流出口342、プライミングバルブ341、
混合ゾーン343、反応展開ライン353、検出器355、ポンプ357を通っ
て、続いてドレーン容器359に流し出す。混合ゾーン343において、この流
れは、取込み配管348および切り換えバルブ347の流出口346から、プラ
イミングバルブ345を通ってくる細胞懸濁液または粒子リザーバ349からの
試験されるべき1つもしくはそれ以上の細胞型または1つもしくはそれ以上の粒
子型を含有する細胞懸濁液あるいは粒子調製物と混合される。したがって、混合
ゾーン343を通過する流れ全体は、3つの流れの和、すなわちプロポーショニ
ングバルブ311および327からくるもの各々の1つおよび切り換えバルブ3
47からくる1つである。このステップ中に、両方のプロポーショニングバルブ
は、最終混合物が、細胞懸濁液または粒子調製物:洗浄用緩衝液が1:2の割合
で構成されるように、各オートサンプラーの「ゼロ」位置にあるリザーバから洗
浄用緩衝液305を供給する。
濁液あるいは粒子型(または、試験されるべき一連の細胞型もしくは粒子型の一
部)および洗浄用緩衝液305の混合物の流れが安定するのに必要である、ステ
ップ709で決定される遅延の後に、検出器355は、細胞または粒子単独によ
り生成される基底シグナル(BS)を記録する(ステップ710)。BSシグナ
ルは記録された後に、それは標準値として保存され(ステップ712)、コンピ
ューター123(図1Aおよび図1B)は、増分計数器Nをトリガする(ステッ
プ714)。
試験されるべき化合物303のセットをサンプリングするオートサンプラー30
1の流入口307のノズルの位置を決定する。次に、増分計数器の数量(Ni)
は、試験されるべき化合物の入力された最大数(Nmax)に対してチェックされ
る(ステップ716)。NiがNmaxを超えない場合、オートサンプラー301は
、化合物303のラックのNi位置にある化合物リザーバにノズル307を配置
する。次に、プロポーショニングバルブ311のスイッチをオンにして、その「
通常閉じた」流入口307を、共通流出口312に対して開放する(ステップ7
20)。ステップ720中に、混合ゾーン343およびその後の検出器355内
への混合流は、一部はプロポーショニングバルブ327のノズル325を通って
くる緩衝液305で、一部はプロポーショニングバルブ311のノズル307か
らくる試験されるべき化合物303で、一部は切り換えバルブ347の流出口3
46に対して「通常開放されている」取込み配管348からくる試験されるべき
1つもしくはそれ以上の細胞型または1つもしくはそれ以上の粒子型を含有する
細胞懸濁液あるいは粒子調製物で構成される。混合プロセスが安定するのに必要
である、ステップ721により提供される遅延後に、検出器355は、既定の化
合物(Ni)の存在下で、細胞または粒子が生じるシグナル(SNi)を記録する
(ステップ722)。SNiシグナルは登録された後に、その値は標準値として
保存される(ステップ723)。次に、SNiシグナルの値を参照基底シグナル
(BS)の値と比較する(ステップ724)。SNiシグナルがBSシグナルよ
り大きい場合は、コンピューター123(図1Aおよび図1B)は、対応する化
合物を「陽性」と「フラッグ(flag)」し(ステップ725)、それは化合物が
細胞シグナルを刺激するか、または粒子と相互作用することを意味するであろう
。SNiシグナルがBSより大きい場合、コンピューター123はアンタゴニス
トのセットを制御し、オートサンプラー315のノズル323を、ラック317
に位置するアンタゴニスト含有リザーバの上方に配置するための対応する座標を
計算する。SNiがBS未満である場合は、コンピューター123は、対応する
化合物を「陰性」と「フラッグ」するであろう(ステップ726)。この場合に
は、コンピューター123はアゴニストセットを制御し、オートサンプラー31
5のノズル323を、ラック319に位置するアゴニスト含有リザーバの上方に
配置するための対応する座標を計算する。
のループK−Oを通るであろう(ステップ730)。増分計数器(M)は、それ
がトリガされる毎に1つだけカウント数を増加し、かくして、ラック317上に
位置する標準アンタゴニストセットを供給するオートサンプラー315のノズル
323の次の位置を決定する。次に、コンピューター123は、増分計数器(M j )の数量が、オペレーターにより入力される試験されるべき標準物質の最大数
(Mmax)を超えるかどうかをチェックする(ステップ732)。
に対応するラック317上に位置する標準アンタゴニストリザーバにノズル32
3を配置するであろう(ステップ734)。次に、プロポーショニングバルブ3
27のスイッチをオンにして、その「通常閉じた」流入口323を流出口328
と接続する(ステップ736)。ステップ736の間、混合ゾーン343、反応
展開ライン353および検出器355を通過する混合流は、一部はプロポーショ
ニングバルブ327からくる標準アンタゴニスト、一部はプロポーショニングバ
ルブ311からくる試験されるべき化合物、および一部は切り換えバルブ347
からくる試験されるべき1つもしくはそれ以上の細胞型または1つもしくはそれ
以上の粒子型を含有する細胞懸濁液あるいは粒子調製物で構成される。
Mj)の存在下で、既定の化合物(Ni)より生じるシグナル(SNiMj)を登録
し、保存する(ステップ738)。次に、プロポーショニングバルブ311およ
び327両方をオフにする(ステップ740)。これにより、流入口307およ
び323を閉じ、流入口309および325を、対応する流出口312および3
28に対して開放する。次に、オートサンプラー315は、緩衝液リザーバ30
5により占有される「ゼロ」位置にノズル323を配置する。次に、プロポーシ
ョニングバルブ327を再びオンにして、その「通常閉じた」流入口323を流
出口328に開放し(ステップ744)、ノズル323の内容物を洗い流す(ス
テップ746)。次に、プロポーショニングバルブ327をオフにして、流入口
323を閉じ、「通常開放されている」流入口325を開放する。このプロセス
中に、オートサンプラー315のノズル325から流入する緩衝液で流体ライン
を洗浄する。
準アンタゴニストMjの両方の存在下で測定したシグナル(SNiMj)と、化合
物Ni単独存在下で測定したシグナル(SNi)を比較する(ステップ750)。
標準アンタゴニスト(Mj)の存在下のシグナルが、化合物Ni単独で発生するシ
グナルより小さい(SNiMj<SNi)場合、化合物Niおよび標準アンタゴニス
トMjの両方が「陽性」とフラッグされるであろう(ステップ751)。両方の
シグナルが互いに等しい場合、化合物Niは「陽性」とフラッグされ、標準アン
タゴニストMjは「陰性」とフラッグされる(ステップ752)。そのフラッグ
値を伴う化合物NiのID番号およびそのフラッグ値を伴う標準アンタゴニスト
MjのID番号を含むデータがフラッグされた後、そのデータはデータベースに
伝送される(ステップ753)。データが保存されると、プログラムはループバ
ックし、増分計数器Mをトリガして(ステップ730)、1つだけカウントを増
加させて、条件732を達成するまでステップ754を繰り返す。
物が既定セットにおけるすべての標準アンタゴニストに対して試験された際には
、プログラムは増分計数器Mの量をゼロにリセットし(ステップ755)、オー
トサンプラー301およびオートサンプラー315の両方は、それらそれぞれの
ノズル307および323を、洗浄用緩衝液305を有するリザーバが位置する
「ゼロ」位置に配置する(ステップ756)。次に、プロポーショニングバルブ
311および327の両方をオンにする(ステップ758)。このことにより、
「通常閉じている」流入口307および323を、対応する流出口312および
328に対して開放する。ステップ760により決定されるこの洗浄遅延期間中
に、ノズル312およびノズル328の両方の内容物を緩衝液305で洗い流す
。ステップ760が終了した後に、プロポーショニングバルブ311および32
7の両方をオフにする(ステップ762)。洗浄遅延期間(ステップ760)後
に、プログラムは、増分計数器Nにループバックして、コンピューター123(
図1Aおよび図1B)からシグナルStrをトリガすることにより、その量を1つ
だけ増分させる(ステップ714)。次に、計数器Nの数量Niを、試験される
べき化合物の最大数(Nmax)と比較する。NiがNmaxを超える場合、増分計数
器Nの量はゼロとなり(ステップ717)、スクリーニングモードは停止する(
ステップ719)。そうでない場合は、ステップ715が次の化合物を用いて繰
り返されるであろう。
「陰性」とフラッグされ(ステップ726)、増分計数器Lがトリガされる(ス
テップ764)。増分計数器Lは、トリガされる毎に1つだけ増加し(ステップ
764)、かくして、ラック319上に位置する標準アゴニストセットに関して
、オートサンプラー315のノズル323の次の位置を決定する。次に、増分計
数器Lの数量(Lk)を、使用されるべき標準アゴニストの最大数(Lmax)と比
較する(ステップ766)。
(Lk)に対応するラック319に位置する標準アゴニストリザーバにノズル3
23を配置する。次に、プロポーショニングバルブ327のスイッチをオンにし
て、その「通常閉じた」流入口323を流出口328に対して開放し、プロポー
ショニングバルブ311をオフにして、その流入口307を閉じ、流入口309
を流出口312に対して開放する(ステップ770)。ステップ770中に、混
合ゾーン343、反応展開ライン353および検出器355を通ってくる混合流
は、一部はプロポーショニングバルブ327の投入口323からくる標準アゴニ
スト319、一部はプロポーショニングバルブ311の投入口309からくる緩
衝液305、及び一部は切り換えバルブ347からくる試験されるべき1つもし
くはそれ以上の細胞型または1つもしくはそれ以上の粒子型を含有する細胞懸濁
液あるいは粒子調製物で構成される。
延期間後に、既定の標準アゴニストが生じるシグナル(SLk)を記録し、保存
する(ステップ774)。次に、プロポーショニングバルブ311をオンにして
、その「通常閉じている」流入口307を、流出口312に対して開放する(ス
テップ776)。ステップ778にて提供される、混合プロセスが安定するのに
必要な遅延期間後に、既定の化合物(Ni)の存在下で、既定の標準アゴニスト
(Lk)により刺激されるシグナル(SLkNi)が登録、保存される(ステップ
780)。
ルブ311および327両方をオフにして、それらそれぞれの「通常閉じている
」流入口307および323を閉じ、流入口309および325を、対応する流
出口312および328に対して開放する(ステップ782)。次に、オートサ
ンプラー315は、洗浄用緩衝液リザーバ305に対応する「ゼロ」位置に流入
口のノズル323を配置する(ステップ784)。次に、プロポーショニングバ
ルブ327をオンにする(ステップ785)。このことにより、その「通常閉じ
た」流入口323を流出口328に開放し、ノズル323の内容物を洗い流すの
に必要である、ステップ786により提供される幾らかの遅延後に、プロポーシ
ョニングバルブ327をオフにして(ステップ787)、2つのシグナルSLk
NiおよびSLkを比較する(ステップ788)。
ラッグされる(ステップ790)。両方のシグナルが互いに等しい場合、標準ア
ゴニストLkは「陰性」とフラッグされる(ステップ792)。そのフラッグ値
を伴う化合物NiのID番号およびそのフラッグ値を伴う標準アゴニストLkのI
D番号を含むデータがフラッグされた後、そのデータはデータベースに伝送され
る(ステップ794)。データが保存されると、プログラムは増分計数器Lをト
リガして(ステップ764)、1つだけカウントを増加させて、条件766を達
成するまでステップ796を繰り返す。
既定セットにおけるすべての標準アゴニストに対して試験された際には、増分計
数器Lの量はゼロにリセットされ(ステップ755)、オートサンプラー301
およびオートサンプラー315の両方は、それらそれぞれのノズル307および
323を、洗浄用緩衝液305を有するリザーバが位置する「ゼロ」位置に配置
する(ステップ756)。次に、システムはプロポーショニングバルブ311お
よびプロポーショニングバルブ327の両方をオンにして、「通常閉じている」
流入口307および323を、対応する流出口312および328に対してそれ
ぞれ開放する(ステップ758)。ステップ760により提供されるこの洗浄期
間中に、ノズル307およびノズル323の両方の内容物を緩衝液305で洗い
流す。次に、プロポーショニングバルブ311および327の両方をオフにして
(ステップ762)、増分計数器Nは、1つだけ増加される(ステップ714)
。次に、増分計数器Nの新たにトリガされた数量Niを、試験されるべき化合物
の最大数(Nmax)と比較する(ステップ716)。NiがNmaxを超える場合、
ステップ717において計数器Nはゼロに設定され、スクリーニングモードは停
止する(ステップ719)。そうでない場合は、全サイクルが次の化合物を用い
て繰り返されるであろう。
効力プロファイリングモードを選択するか、または新しい化合物セットを用いて
スクリーニングモードを繰り返すようコンピューターにより入力要求される。
給するステップを含むが、実施されている分析が、標準化合物または校正溶液の
使用を要さない場合、これらのステップは存在する必要がないということは理解
されるであろう。
リングモードの連続的フロー図を図9a〜9eに示す。
に入り、この状態802において、すべての増分計数器L、MおよびNをゼロに
設定し、かつすべてのパラメータをそれらの初期値に設定する。これらの初期パ
ラメータとしては、ハードウェアおよびソフトウェア変数およびサブルーチンの
内部初期化が挙げられるが、それらに限定されない。次に、増分計数器Nが開始
し(ステップ804)、その数量Niを、プログラムを始動する前にオペレータ
ーが入力した標準物質の最大数(Nmax)と比較する(ステップ806)。Niが
Nmaxを超える場合、増分計数器Nがゼロとなり(ステップ808)、プログラ
ムは停止する(ステップ810)。そうでなければ、プログラムはポンプ357
をオンにすることにより進行するであろう(ステップ816)。この時点で、ス
テップ802における初期パラメータセットアップに従って、オートサンプラー
301および315のノズル307および323はゼロ位置にあり、プロポーシ
ョニングバルブ311および327、プライミングバルブ313、329、34
1および345、ならびに切り換えバルブ335、333および347をオフに
する。ステップ816中に、混合ゾーン343、反応展開ライン353および検
出器335を通ってくる混合流は、一部はプロポーショニングバルブ311の投
入口309からくる緩衝液305で、一部はプロポーショニングバルブ327の
投入口325からくる緩衝液305で、および一部は切り換えバルブ347から
くる細胞懸濁液または粒子調製物で構成される。次に、切り換えバルブ333が
オンにされ(ステップ820)、「通常閉じた」流入口340を流出口342に
開放する。このプロセス中、最大応答を決定する校正最大溶液337は、切り換
えバルブ335の排出配管334に接続される配管336を通って、切り換えバ
ルブ333の流入口340を通って、プライミングバルブ341を通って、混合
ゾーン343中に流れ、そこでそれは、取込み管348および切り換えバルブ3
47の排出管346を通って、次にプライミングバルブ345を通って混合ゾー
ン343に流れてくる細胞懸濁液からの細胞または粒子調製物からの粒子と混合
される。次に、細胞または粒子校正最大混合物は、反応展開ライン353、次い
で検出器355に流れるであろう。次に、最大シグナルを測定、記録する(ステ
ップ824)。次に、切り換えバルブ335をオンにして(ステップ832)、
「通常閉じている」流入口338を流出口334に開放し、校正最小溶液339
を切り換えバルブ333、プライミングバルブ341を通って、混合ゾーン34
3に流し、そこでそれは、取込み管348および切り換えバルブ347の排出管
346を通って、次にプライミングバルブ345を通って混合ゾーン343に流
れてくる細胞懸濁液からの細胞または粒子調製物からの粒子と混合される。次に
、細胞または粒子/校正最小混合物は、反応展開ライン353、次いで検出器3
55に流れる。次に、最小応答シグナルを測定、記録する(ステップ836)。
次に、切り換えバルブ335および333の両方をオフにする(ステップ844
)。ステップ844中に、混合ゾーン343、反応展開ライン353および検出
器335を通ってくる混合流は、プロポーショニングバルブ311の投入口30
9からくる緩衝液305が1の割合で、プロポーショニングバルブ327の投入
口325からくる緩衝液が1の割合で、切り換えバルブ347からくる細胞懸濁
液または粒子調製物が1の割合で構成される。これは、流体ラインから校正溶液
の残存物を洗い流すために必要である。次に、化合物(Ni)の「フラッグ」値
をチェックする(ステップ812)。Ni化合物の「フラッグ」値が「陽性」の
場合、システムはステップ850に進み、そうでなければ、ステップ876に進
むであろう。Ni化合物の「フラッグ」値が「陽性」の場合、オートサンプラー
301は、ラック303上に位置するNi化合物に対応するリザーバにノズル3
07を配置するであろう(ステップ850)。次に、プロポーショニングバルブ
311をグラジエントモードで作動させる(ステップ852)。グラジエントモ
ードにおいて、プロポーショニングバルブ311は、流出口312においてNi
化合物の流れおよび緩衝液の流れの割合が時間で変化して、化合物濃度の不連続
な変化を生じるように、2つの流入口307および309からの流れを混合する
。濃度が時間で変化している間に、細胞懸濁液または粒子調製物から混合ゾーン
313に流れてくる細胞または粒子の新しい部分は、どの時間でも種々の濃度の
Ni化合物と反応するであろう。得られたシグナルの容量応答依存性を、ステッ
プ854で登録して、続いてステップ856においてNi化合物に関する活性化
パラメータを計算し、続いてデータベースにデータを保存する(ステップ858
)。
計数器Mの数量(Mj)を、オペレータにより入力される最大値(Mmax)と比較
する(ステップ861)。数値MjがMmaxを超えない場合、Mj標準物質の「フ
ラッグ」値をチェックする(ステップ862)。Mj標準物質の「フラッグ」値
が「陽性」でない場合、増分計数器(M)は1つだけ増加され(ステップ860
)、上記のように、ステップ860に続くステップが繰り返されるであろう。M j 標準物質の「フラッグ」値が「陽性」の場合、オートサンプラー315は、ラ
ック317上に位置するMj標準アンタゴニストに対応するリザーバにノズル3
23を配置する(ステップ864)。ノズル323を標準物質溶液に漬けた後に
、プロポーショニングバルブ311をオンにする(ステップ866)。プロポー
ショニングバルブ311をオンにすると、それは、ステップ850において浸さ
れているその「通常閉じている」流入口307を、化合物(Ni)に対応するリ
ザーバに開放し、その結果、Ni化合物は、流体システムを通って流れ、それが
、切り換えバルブ347の取込み配管348および排出配管、プライミングバル
ブ345を通って混合ゾーン343へ、さらに展開ライン353および検出器3
55に流れてくる細胞または粒子と混合されると、シグナルを発生する。次に、
プロポーショニングバルブ327を濃度グラジエントモードで作動させる(ステ
ップ868)。グラジエントモードにおいて、プロポーショニングバルブ327
は、Mj標準アンタゴニストの流れおよび緩衝液の流れの割合が時間で変化して
、標準アンタゴニスト濃度の不連続な変化を生じるように、2つの流入口323
および325から流出口328に流れてくる流れを混合する。濃度が時間で変化
している間に、細胞または粒子の新しい部分は、細胞懸濁液または粒子調製物か
ら混合ゾーン343に流れ、どんな既定の時間でも、一定濃度のNi化合物、お
よび時間により異なる濃度の標準アンタゴニストMjからなる混合物と反応する
。得られたNi化合物刺激シグナルのMj標準アンタゴニストMjによる用量応答
抑制を、ステップ870で登録して、続いてステップ872においてMj標準ア
ンタゴニストに関する抑制パラメータを計算し、データベースにデータを保存す
る(ステップ874)。
11および327の両方が閉じられ(ステップ871)、プログラムの流れはス
テップ860に戻り、増分計数器Mは1つだけ増加され、プログラムはステップ
861に戻り、MjをMmaxと比較する。
ものが測定されると、数値MjはMmaxより大きくなり、ステップ861における
決定プロセスはステップ804に戻り、増分計数器Nは1つだけその数値を相加
させる。次に、Niの値を、試験されるべき化合物の最大数Nmaxと比較する(ス
テップ806)。NiがNmaxを超える場合、増分計数器Nはゼロにリセットされ
(ステップ808)、プログラムは停止する(ステップ810)。複数の細胞懸
濁液または粒子調製物が評価されるべき場合には、試験されるべき一連の細胞懸
濁液もしくは粒子調製物における細胞懸濁液の各々または粒子調製物に関してこ
のプロセスを繰り返すことができる。
れる場合、ラック319に位置するアゴニストセットにおける標準物質(Lk)
をカウントする増分計数器Lが更新される(ステップ876)。次に、数値Lk
を、オペレータにより入力される標準アゴニストの最大数(Lmax)と比較する
(ステップ877)。
8に進み、Lk標準物質の「フラッグ」値をチェックするであろう。フラッグ値
が陽性でない場合、プログラムはステップ876に戻る。Lk標準物質のフラッ
グ値が陽性の場合、オートサンプラー301は、ラック303に位置するNi化
合物を含有する対応するリザーバにノズル307を配置し(ステップ880)、
オートサンプラー315は、ラック319に位置するLk標準アゴニストを含有
する対応するリザーバにノズル323を配置する(ステップ881)。
ステップ882)、次に、Lk標準アゴニストを用いたシグナルの用量応答刺激
を記録する(ステップ884)。グラジエントモードにおいて、プロポーショニ
ングバルブ327は、Lk標準アゴニストの流れおよび緩衝液の流れの割合が時
間で変化して、標準アゴニストの濃度グラジエントを生じるように、2つの流入
口323および325から流出口328に流れてくる流れを混合する。濃度が時
間で生じている間に、新しい細胞または粒子は、細胞懸濁液または粒子調製物か
ら、「通常開放されている」取込み配管348および切り換えバルブ347の流
出口346、「通常開放されている」プライミングバルブ345を通って混合ゾ
ーン343に流れ、不連続的に変化している標準物質濃度にて標準アゴニストL k と不連続的に反応する。Lk標準アゴニストによるシグナル刺激の用量依存性が
ひとたび登録される(ステップ884)と、活性化パラメータが計算され(ステ
ップ892)、続いてデータベースに保存される(ステップ894)。
は、グラジエントモードの終わりまでに到達した割合にあるか、またはさらなる
ステップで用いられるであろう一定濃度のLk標準アゴニストを確立する既定の
割合にある。次に、プロポーショニングバルブ311の濃度グラジエントモード
が作動される(ステップ886)。次に、Lk標準アゴニスト刺激シグナルのNi 化合物による用量応答抑制を記録し(ステップ888)、次いでステップ896
において抑制パラメータを計算する。続いてこのデータはデータベースに保存さ
れる(ステップ894)。濃度依存性の登録が終了すると、プロポーショニング
バルブ311および327の両方をオフにして(ステップ890)、それらの流
入口307および323を閉じて、「通常開放されている」流入口309および
325を開放する。このプロセス中に、オートサンプラー301および315の
ノズル309および325からくる緩衝液305を用いて、プロポーショニング
バルブ311および327の流出口312および328、プライミングバルブ3
13および329、混合ゾーン331、切り換えバルブ333の「通常開放され
ている」流入口332および流出口342、「通常開放されている」プライミン
グバルブ341、混合ゾーン343、展開ライン353および検出器355を通
して、流体ラインを洗浄する。次に、プログラムはステップ876に戻り、この
時点で標準アゴニストすべてがカウントされるまで上記サイクルを繰り返し、陽
性フラッグを有するものが測定され、増分計数器の数値LkはLmax値より大きく
なり、この時点でプログラムはステップ804に戻るであろう。
はNmax値より大きくなり、増分計数器Nはゼロにリセットされ(ステップ80
8)、プログラムは終了する(ステップ810)。
給するステップを含むが、実施されている分析が、標準化合物または校正溶液の
使用を要さない場合、これらのステップは存在する必要がないということは理解
されるであろう。
刺激に対する既定の細胞応答を提供する能力に関して選択され得る。多数のかか
る細胞が知られている。例えば、種々の型のレセプターにより誘発されるカルシ
ウムの動員における化合物の効果を測定するために、トロンビンレセプターに関
してジャーカットT細胞、血小板、臍静脈、内皮細胞またはチャイニーズハムス
ター肺線維芽細胞、AMPAレセプターに関して小脳プルキンエ細胞、皮質星状
膠細胞および皮質神経膠細胞、NMDAレセプターに関して海馬ニューロン、プ
リン作用性レセプターに関してP−12細胞、血小板由来成長因子レセプターに
関して稀突起膠細胞、神経ペプチドYレセプターならびにタンパク質−チロシン
キナーゼおよびタンパク質−チロシンホスファターゼレセプターに関してヒト神
経芽腫細胞および下垂体細胞、エンドセリンレセプターに関してヒト髄芽腫細胞
、TNFaレセプターに関して好中球、オピオイド、ブラジキニンおよびATP
に関してNG108−15細胞、プラスミノゲンレセプターに関して滑液線維芽
細胞、等を使用することが望ましい。細胞内イオン濃度を測定したい場合、例え
ば、その特定イオンの濃度に対する感受性を有する色素または他の検出可能な物
質で細胞をあらかじめインキュベートすることができる(カルシウムイオンの検
出のための細胞の調製を説明する実際に行っている例は、実施例1に記載してあ
る)。
ターンを測定したい場合には、特定の関心ある細胞を使用してもよく、次にCa 2+ 動員によりそれらの活性を発揮すると知られているアゴニストセットを用いて
、どんな型のレセプターがこれらの特定の細胞で発現するかをにより細胞を特性
化してもよい。このアゴニストセットは、アセチルコリン、アドレナリン、ノル
アドレナリン、5−ヒドロキシトリプタミン、DOPA、NMDA、AMPA、
アンギオテンシンII、ブラジキニン、ボンベシン、オピオイド、エントセリン
−1、神経ペプチドY、TNF、POGF、FGF等から構成されてもよい。
ァイリング操作を示す。
A亜型エンドセリンレセプターETARを天然に発現する。このレセプターは、
7つの膜貫通スパニングGタンパク質結合レセプターのファミリーに属し、その
特異的アゴニストである、21アミノ酸ペプチドのエンドセリン−1との結合時
に細胞の細胞質中のカルシウム代謝を活性化することが知られている。レセプタ
ーに対するアゴニストの親和性を特性化するために、慣用的方法は、いくつかの
濃度のアゴニストまたはアンタゴニストの存在下で細胞の生理学的応答を測定す
る(Sakamoto, et al., 1994)。
コモル濃度で測定)の濃度の一関数としての細胞内カルシウム動員(ナノメート
ル濃度で測定したCa2+)の活性化の測定値を示す。装置は、上記と同様の陰圧
コンピューター制御ユニットであった。この行程は、いくつかの濃度のETAR
特異的競合的アンタゴニストBQ−123(ナノモル濃度で示す)の存在下で実
施した。
理学計器で用いるために、TE−671細胞を調製した。増殖培地をデカントし
、細胞をダルベッコのリン酸塩緩衝化生理食塩水(DPBS)で2回洗浄し、2
0MのFURA−2AMを含有する新鮮なDPBSを補充すると、これは細胞質
中に容易に浸透し、そこで非特異的エステラーゼにより加水分解されて、FUR
A2を生成し、この色素はイオン化形態のカルシウムに感受性である。30分間
のインキュベーション後、細胞に等容量の新鮮なDPBSを補充し、さらに30
分間インキュベートした。ここで色素を負荷した細胞を0.05%トリプシン−
EDTA溶液でフラスコの底から引き離した。次に、0.1%ダイズトリプシン
阻害剤を含有するDPBSでその細胞を2回洗浄し、カルシウム無含有、マグネ
シウム無含有およびフェノールレッド無含有のダルベッコ変法イーグル培地(D
MEM)中に再懸濁した。
の校正後、プロポーショニングバルブ311により連続変動比率で、アゴニスト
試験化合物であるET−1溶液をDPBS緩衝液と混合し、プロポーショニング
バルブ311、混合ゾーン331、切り換えバルブ333およびプライミングバ
ルブ341を通って混合ゾーン343に向け、ここでTE−671細胞の懸濁液
と混合して、最終濃度の細胞4x105細胞/mlを提供する。同時に、標準ア
ンタゴニスト溶液としてのBQ−123を、ET−1溶液と1:1の比でプロポ
ーショニングバルブ327でDPBSとBQ−123を混合することにより調製
した既定濃度で、混合ゾーン331にも向ける。混合ゾーン343では、一定濃
度のBQ−123の混合流、および連続変動適時濃度のET−1を細胞と2:1
の比で混合する。これは、混合ゾーン343を、そして最終的には検出器355
を通過する流れの各構成成分に関して3倍の最終稀釈液を生じる。プロポーショ
ニングバルブ327を一次、二次および三次行程のためにプログラムして、最終
BQ−123濃度をそれぞれ0、10nMおよび40nMとした。プロポーショ
ニングバルブ311を予備プログラミングして、各行程におけるET−1の最終
濃度を0〜100pMとした。検出器315を通過するTE−671細胞中の細
胞内カルシウムイオン濃度の変化を、上記と同様に蛍光色素FURA−2を用い
てET−1濃度の一関数としてリアルタイムで測定した。
間隔が40秒であるよう、反応展開ラインの流量および長さを選択した。図10
における曲線を生成するための完全濃度グラジエント行程に要する時間は、本発
明を用いて5分であった。これに対比して、ETAR刺激の指標としてホスファ
チジルイノシトール代謝回転速度を用いる慣用的検定では、通常、反応曲線上の
2〜3の濃度点を得るだけで数時間を要し、図10に示したような完全曲線を作
製するには法外な量の時間を要する。
存在下で最大細胞応答を、ならびにアゴニストに関するEC50値およびアンタゴ
ニストに関するpA2値を算定するために当業界で用いられる。BQ−123を
含有しない活性化曲線から算定されるEC50値は10pMであり、図11におけ
る活性化曲線はBQ−123の存在下では右に平行移動することがわかり、これ
は、競合型の抑制に特徴的であるとして当業界では既知である。2つの異なる濃
度のBQ−123から算定される平均pA2値は、7.96である。これは、1
1nMというBQ−123に関する抑制定数K1に対応する。EC50およびpA2 値は、文献データとぴったり一致する(Masaki Ihara et al., 1992)。
カルシウム動員の抑制を示す。同一細胞生理学的計器装置および細胞調製手法は
、実施例1と同じものをここで用いた。
定濃度で導入し、BQ−123を装置の「化合物」ノズルを通して導入した。こ
の実験では、実施例1の場合と同様に、濃縮行程は5分間で、反応時間(混合か
ら検出まで)は40秒であった。
の校正後、DPBS緩衝液と混合することによりプロポーショニングバルブ32
7により調製された既定濃度で、アゴニスト標準物質溶液であるET−1溶液を
、プライミングバルブ329、混合ゾーン331、切り換えバルブ333および
プライミングバルブ341を通って混合ゾーン343に向け、ここでTE−67
1細胞の懸濁液と混合して、最終濃度の細胞4x105細胞/mlを提供する。
同時に、DPBをET−1溶液と1:1の容量比で、プロポーショニングバルブ
311、プライミングバルブ313の流入口309および流出口312を通って
混合ゾーン331へ、さらに流体システムを通って検出器355へ向かわせた。
標準アゴニストの存在下で細胞内カルシウム濃度を安定させた後、アンタゴニス
ト試験化合物としてのBQ−123をプロポーショニングバルブ311の流入口
307から、DPBSの代わりに、ET−1溶液との1:1の容量比でシステム
を通して、プロポーショニングバルブ311においてBQ−123をDPBSと
混合することにより調製した連続変動濃度で混合ゾーン331に向けた。混合ゾ
ーン343では、一定濃度のET−1の混合流および連続変動適時濃度のBQ−
123を細胞と2:1の比で混合する。これは、混合ゾーン343を、そして最
終的には検出器355を通過する流れの各構成成分に関して3倍の最終稀釈液を
生じる。プロポーショニングバルブ327を予備プログラミングして、検出器で
のET−1の最終濃度を40pMとした。プロポーショニングバルブ311を予
備プログラミングして、BQ−123の最終濃度を0〜300nMとした。検出
器355を通過するTE−6712細胞中の細胞内カルシウムイオン濃度の変化
を、上記と同様に蛍光色素FURA−2を用いてBQ−123濃度の一関数とし
てリアルタイムで測定した。
施例は、実施例1および2と同一計器および同一試薬を用いる。 本実施例では、本発明の装置の「標準物質」ノズル323から進入するET−
1の一次濃度グラジエントを、「化合物」ノズルから進入する緩衝溶液を用いて
調製する。最終ET−1濃度が40pMの値に達したら、グラジエント装置1は
ET−1濃度を一定に保持し、グラジエント装置2は「化合物」ノズルから進入
するBQ−123の濃度を上げ始める。アゴニストグラジエントを、アゴニスト
の任意の既定濃度で、アンタゴニストに切り換えることができる。
細胞表面レセプターのパターンを測定し得る。試験されるべき異なる細胞型の各
々を複数の細胞懸濁液リザーバの1つに入れるか、あるいは単一細胞型が検査さ
れるべきものである場合には、単一細胞懸濁液リザーバを有する装置を用いて細
胞を保持し得る。特定のレセプターの活性に効果を及ぼすことが既知の1つまた
はそれ以上の試験作用物質の効果を、細胞懸濁液を試験作用物質と組合せて試験
混合物を生成し、試験混合物を検出ゾーンに通して、上記の手法を用いて細胞応
答を測定することにより、測定する。好ましくは、試験作用物質は、1つまたは
それ以上のレセプターアゴニストを含む。しかしながら、いくつかの実施形態で
は、試験作用物質はアンタゴニスト、またはアゴニストとアンタゴニストの混合
物であり得る。
活性化であり得る。あるいは、試験作用物質がアンタゴニストである場合には、
細胞応答は細胞活性の抑制であり得る。同様に、試験作用物質がアゴニストとア
ンタゴニストの組合せである場合には、細胞応答は、アンタゴニストの存在によ
りアゴニストに応答して普通は得られる活性の低減または非存在であり得る。試
験作用物質が試験化合物である場合には、細胞応答はその作用物質を用いて観察
されると予測される応答であるだろう。
、または特定のレセプターと相互作用することが既知の試験作用物質を用いて観
察される場合、評価される細胞型はそのレセプターを保有する。細胞生理学に及
ぼすいくつかのアゴニスト、アンタゴニスト、アゴニスト/アンタゴニスト混合
物または試験化合物の作用を試験することにより、評価される細胞型上のレセプ
ターのスペクトルを測定し得る。多数の細胞型が試験されるべきものである場合
、この方法を一連の細胞型の各々に関して反復し、各細胞型中に存在するレセプ
ターのスペクトルを測定する。多数の細胞型の分析を促すために、各細胞型を上
記の装置中の複数の細胞懸濁液リザーバの1つに入れてもよい。
に効果を及ぼすことを確証し得る。試験作用物質は、アゴニスト、アンタゴニス
トまたはアゴニストとアンタゴニストの混合物であり得る。試験作用物質は、レ
セプターの活性に効果を及ぼすことが既知の作用物質、またはレセプターに及ぼ
すその作用が未知である作用物質であり得る。レセプターを欠く細胞型は陰性対
照として役立ち、細胞懸濁液リザーバの1つに入れられる。レセプターを発現す
るよう工学処理されているか、または誘発されていた陰性対照と同一細胞型の細
胞を、別の細胞懸濁液リザーバ中に入れる。細胞を試験作用物質と接触させて陰
性対照混合物および試験混合物を生成し、陰性対照混合物および試験混合物を検
出ゾーンを通って向かわせ、陰性対照細胞および工学処理または誘発細胞の細胞
応答を測定することにより、1つまたはそれ以上の試験作用物質の効果をこれら
の細胞型の各々で査定する。陰性対照細胞の応答と比較した工学処理または誘発
細胞の応答における差は、試験作用物質がレセプターの活性に及ぼす作用を有す
ることを示す。
般に「トランスフェクトされた細胞」と呼ばれる。工学処理細胞を得るために、
形質転換、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、電子穿刺、ウイルス
感染、転位または当業者に周知のその他の技法を用いて、レセプターをコードす
る遺伝子を陰性対照細胞と同一型の細胞中に導入し得る。レセプター遺伝子の発
現は、当業者に周知の種々のベクターにより指図され得る。あるいは、化学的作
用物質または生物活性物質、例えば増殖因子、サイトカイン、細胞分化因子また
は当業界で既知のその他の作用物質を用いた処理により、レセプターを発現する
よう細胞を誘発し得る。
効果を及ぼされ得る。したがって、同一レセプターは、異なる細胞型間の活性に
おける変異を示し得る。本発明はまた、レセプター活性におけるこのような細胞
型依存性の差を査定するために用い得る。査定されるべき細胞型の各々を細胞懸
濁液リザーバに入れ、細胞を1つまたはそれ以上の試験作用物質と接触させて試
験混合物を生成し、試験混合物を検出ゾーンを通って向かわせ、そして試験混合
物が検出ゾーンを通って流れる時に細胞の細胞応答を測定することにより、細胞
上の1つまたはそれ以上のレセプターの活性に及ぼす1つまたはそれ以上の試験
作用物質の作用を測定する。試験作用物質は、上記のような既知のレセプターゴ
ニスト、既知のアンタゴニスト、既知のアゴニストと既知のアンタゴニストの混
合物、またはその活性が未知の化合物であり得る。本方法は、各細胞型における
細胞応答の性質および大きさを測定するために試験されるべき細胞型の各々に関
して実施される。多数の細胞型の分析を促すために、上記の装置中の複数の細胞
懸濁液リザーバのうちの1つに各細胞型を入れ得る。
」を実施するために本発明において用い得るアルゴリズムを示す。まず、細胞を
標準アゴニストと混合し(ステップ1301)、混合物を検出器に提供する(ス
テップ1302)。次に、装置は、この標準アゴニストが、細胞との接触時に、
任意の細胞応答の引き金となるか否かを測定する(ステップ1303)。2つの
可能性が存在する:標準アゴニストがいかなる応答も生じない(いいえ)か、ま
たは標準アゴニストが細胞応答を誘発する(はい)かである。細胞応答は、評価
される特定の標準アゴニストに関して検出器からのシグナルをモニタリングする
ことにより測定する。対照システムは、まず、ベースラインおよび最大応答を確
立するよう校正し、それらの値間にある検出器からのいずれのシグナルも陽性応
答であると考えられる。
じない場合(いいえ)、システムはアゴニスト計数器を増大し(ステップ130
9)、これはアゴニストの特定セット中の次の標準アゴニストが特定細胞システ
ムを用いて試験されることを示す。次にシステムは、すべての利用可能なアゴニ
ストが試験されたか否かを測定する(ステップ1305)。標準アゴニストのす
べてが特定細胞システムを用いて試験されたわけではない場合には、元の細胞シ
ステムから新たな細胞がシステムに供給される(ステップ1306)。これら新
規の細胞は次に、自動的にアゴニストの既定セット溶液からの次の標準アゴニス
トと接触させられる(ステップ1301)。そのセットの各アゴニスト溶液は、
既知の細胞レセプター、イオンポンプまたはイオンチャンネル分子の刺激により
細胞応答を開始することが既知の1つまたはそれ以上の成分を含有する。装置は
、細胞応答が特定の標準アゴニストにより誘発されることを検出するまで、また
はその機械で利用可能なすべてのアゴニストが試験されるまで、異なる標準アゴ
ニスト物質と細胞との混和を反復し続ける。
測定される場合、本方法は作用の効力モードに切り換えられ(ステップ1306
)、この場合、標準アゴニストの種々の濃度レベルでの細胞応答を記録する。ス
テップ1306完了後、本方法は次に、標準アゴニストの種々の濃度レベルで所
定の細胞システム中で生成された細胞応答のレベルを示す効力パラメーターまた
はプロフィールを記録する(ステップ1307)。本方法は次に、利用可能な標
準アゴニストが試験されたが否かを再び測定する(ステップ1304)。すべて
の利用可能なアゴニストが試験されていた場合には(はい)、システムは次に、
すべての利用可能な細胞システムが試験されたか否かを測定する(ステップ13
08)。この質問に対する答えがイエスである場合、本方法を完了する(ステッ
プ1312)。
ではないことが測定された場合(ステップ1310)、細胞計数器は増大され、
これは細胞システムの特定セット中の次の細胞システムが試験されることを示す
。次に、標準アゴニスト計数器をリセットし(ステップ1310)、これは新規
の細胞システムをすべての利用可能な標準アゴニストを用いて試験し、標準アゴ
ニストの特定セット中の一次指定アゴニストを用いて開始する。次に新規の細胞
システムからの細胞をシステムに供給し(ステップ1311)、続いて特定アゴ
ニストと混合する(ステップ1301)。次に上記の方法ステップ1301〜1
311を反復する。一実施形態では、装置は、装置に利用可能なすべてのアゴニ
ストが装置に利用可能なすべての細胞システムに関して試験されたことを検出す
るまで、異なる標準アゴニスト物質と細胞との混和を反復し続ける。
性化を実施するために本発明に用い得るアルゴリズムを示す。まず、ステップ1
401では、装置は既知のオーファンレセプターを産生する遺伝子でトランスフ
ェクトされた細胞を供給し、それらを標準アゴニストと混合する(ステップ14
02)。その混合物を検出器に提供する(ステップ1403)。次に装置は、こ
の標準アゴニストが、細胞との接触時に、任意の細胞応答の引き金となるか否か
を測定する(ステップ1404)。2つの可能性が存在する:標準アゴニストが
いかなる応答も生じない(いいえ)か、または標準アゴニストが細胞応答を誘発
する(はい)かである。細胞応答は、評価される特定の標準アゴニストに関して
検出器からのシグナルをモニタリングすることにより測定される。対照システム
は、まず、ベースラインおよび最大応答を確立するよう校正し、それらの値間に
ある検出器からのいずれのシグナルも陽性応答であると考えられる。
じない場合(いいえ)、システムは標準アゴニスト計数器を増大し(ステップ1
405)、これは、標準アゴニストの特定セット中の次の標準アゴニストがトラ
ンスフェクトされた細胞を用いて試験されることを示す。次にシステムは、すべ
ての利用可能な標準アゴニストがトランスフェクトされた細胞とともにすでに試
験されたか否かを測定する(ステップ1406)。試験されていない場合、本方
法はステップ1401に戻り、ここでは同一のトランスフェクトされた細胞シス
テムからの新たな細胞は、のアゴニストの既定セット溶液からの次の標準アゴニ
ストと自動的に接触させられる(ステップ1402)。そのセットの各標準アゴ
ニスト溶液は、既知の細胞レセプター、イオンポンプまたはイオンチャンネル分
子の刺激により細胞応答を開始することが既知の1つまたはそれ以上の成分を含
有する。装置は、細胞応答が特定の標準アゴニストにより誘発されることを検出
するまで、または機械に利用可能なすべてのアゴニストが試験されるまで、異な
る標準アゴニスト物質とトランスフェクトされた細胞との混和を反復し続ける。
ンスフェクトされた細胞の標準アゴニストとの接触が細胞応答を開始する(はい
)ことが測定された場合には、本方法は、同一標準アゴニストと混合される(ス
テップ1408)べき宿主細胞を供給する(ステップ1407)。この混合物を
次に、宿主細胞上で標準アゴニストにより生成される細胞応答を測定するために
、検出器に供給する(ステップ1409)。次にシステムは、標準アゴニストが
宿主細胞中で細胞応答を生成するか否かを測定する(ステップ1410)。細胞
応答が検出される場合(はい)には、システムは標準アゴニスト計数器を増大し
(ステップ1405)、その後、システムはすべての利用可能なアゴニストが試
験されたか否かを測定する(ステップ1410)。利用可能なアゴニストがすべ
て試験された場合には、本方法を完了する(ステップ1412)。利用可能な標
準アゴニストのすべてが試験されたわけではない場合には、本方法をステップ1
401に戻し、そこで、新たなトランスフェクトされた細胞が供給され、標準ア
ゴニストセット中の次の標準アゴニストと混合され(ステップ1402)、上記
の方法ステップを反復する。
成されない場合、本方法は宿主細胞およびトランスフェクトされた細胞間の差を
検出していた。この時点で、本方法を完了する(ステップ1412)。一実施形
態では、装置は、特定アゴニストがオーファンレセプターでトランスフェクトさ
れた細胞において応答を刺激し、宿主細胞では応答を刺激しないことを検出する
まで、あるいは機械に利用可能なすべての標準物質溶液が試験されるまで、異な
る標準アゴニスト物質の細胞との混和を反復し続ける。
グおよび細胞レセプター「フィンガープリンティング」方式の連続フロー図を、
図16a〜16fに示す。この方式を実行するために、切り換えバルブ347を
、各々が異なる細胞懸濁液を含入する多数のリザーバを、別々に共通流出口34
6に連結することを可能にするマルチチャンネル切り換えバルブ347に取り換
え、したがって、特定細胞システムを用いて実験が完了すると、バルブ347は
次の細胞リザーバに切り換え得る。
、そこで、すべてのパラメーターをそれらの初期値に設定する。これらの初期パ
ラメーターとしてはゼロ合わせ計数器、ソフトウェア変数の内部初期化およびサ
ブルーチンが挙げられるが、これらに限定されない。
大数の標準アゴニストLMAXおよび最大数の細胞システムCMAXに関する値を入力
するようオペレーターに要求する(ステップ1503)。オートサンプラー30
1および315(図4Aおよび4B)は取込みノズル307および323を、洗
浄緩衝液リザーバ305が占める対応する「ゼロ」位置に配備し(ステップ15
04)、プロポーショニングバルブ311および327、切り換えバルブ333
、335および347、ならびにプライミングバルブ313、329、341お
よび345をオフにする(ステップ1506)。オフ状態では、プライミングバ
ルブ313、329、341および345は通常は開かれ、プロポーショニング
バルブ311および327はそれぞれそれらの流出口312および328を対応
する「通常開放」流入口309および325と連結し、切り換えバルブ335は
その共通流出口334を「通常開放」流入口336と連結し、切り換えバルブ3
33はその共通流出口342を「通常開放」流入口332と連結し、そしてマル
チチャンネル切り換えバルブ347はその共通流出口346を、調査中の一次細
胞懸濁液を含有するリザーバに連結された一次流入口348と連結する。
。これは、オートサンプラー301および315の「ゼロ」位置に置かれたリザ
ーバからの洗浄緩衝液を、ノズル309および325ならびにプロポーショニン
グバルブ311および327のそれぞれ流出口312および328、プライミン
グバルブ313および329、混合ゾーン331、切り換えバルブ333の流入
口332および流出口342、プライミングバルブ341、混合ゾーン343、
反応展開ライン353、検出器355、ポンプ357を通って、ドレーン容器3
59に流れさせる。混合ゾーン343で、この流れを、一次細胞システムに連結
された取込み管348、およびプライミングバルブ345を通ってマルチチャン
ネル切り換えバルブ347の流出口346から進入する細胞懸濁液349と混合
する。したがって、混合ゾーン343を通過する総流量は、3つの流れの合計で
あり、第1の流れはプロポーショニングバルブ311から、第2の流れはバルブ
327から、そして第3の流れはマルチチャンネル切り換えバルブ347から進
入する。このステップ中、両プロポーショニングバルブは、最終流動混合物が、
細胞懸濁液349:洗浄緩衝液305が1:2の割合に成るように、各オートサ
ンプラーの「ゼロ」位置に置かれたリザーバから洗浄緩衝液305を供給する。
であるステップ1509で測定される遅延後、検出器355は細胞単独により生
成される基底シグナルを記録する(ステップ1510)。基底シグナルの登録後
、それは参照シグナルBSiとして保存され(ステップ1512)、コンピュー
ター123(図1Aおよび1B)は計数器Lを増加させる(ステップ1514)
。
器の数値は、試験されるべき標準アゴニスト319のセットをサンプリングする
オートサンプラー315の流入口323のノズルの位置を決定する。次にステッ
プ1516では、増分計数器Lの数値含量Lkを試験されるべき最大数Lmaxの標
準アゴニストの前進入(ステップ1503)値と比較する。
アゴニスト319のラックのLk位置に置かれる標準アゴニストリザーバに配置
する(ステップ1518)。次に、プロポーショニングバルブ327をオンに切
り換えて、その「通常閉鎖」流入口323を共通出力口328に開く(ステップ
1520)。ステップ1520中、混合ゾーン343内での、その後検出器35
5中での混合流は、一部はプロポーショニングバルブ311のノズル309を通
って進入する緩衝液305で、一部はプロポーショニングバルブ327のノズル
323から進入する試験されるべき標準アゴニスト319で、および一部はマル
チチャンネル切り換えバルブ347の出力口346に取込み管348を通って多
数の細胞リザーバの1つから進入する特定細胞懸濁液349で構成される。安定
化するために混合過程に必要なステップ1521により提供される遅延後、検出
器355は、所定の標準アゴニストLkの存在下で所定細胞により生成される標
準アゴニスト誘発シグナルSLkを記録する(ステップ1522)。SLkシグナ
ルを登録後、その値をSLk値として保存し(ステップ1523)、装置は、プ
ロポーショニングバルブ327がオフにされ、したがって通常開放流入口325
を緩衝液305と連結するステップ1530に進む。ステップ1532では、オ
ートサンプラー315はそのノズル323を、洗浄緩衝液を充填したリザーバが
占有するゼロ位置に移動させる。プロポーショニングバルブ327をオンに切り
換えて(ステップ1534)、通常閉鎖投入口323を出力口328と連結する
。ステップ1536で決定された遅延は、プロポーショニングバルブ327の流
入口323および流出口328、プライミングバルブ329、混合ゾーン331
、切り換えバルブ333の流入口332および流出口342、プライミングバル
ブ341、混合ゾーン343,反応展開ライン353ならびに検出器355で構
成される流動経路を、上記化合物の残りをきれいに洗浄させる。遅延後、プロポ
ーショニングバルブ327をステップ1538でOFFに切り換えて、システム
を元の状態に戻す。
比較する(ステップ1544)。SLkシグナルがBSiシグナルより大きい場合
、コンピューター123(図1Aおよび1B)は対応する標準アゴニストを「陽
性」として「フラッグする」(ステップ1540)が、これは、特定細胞が特定
アゴニストにより刺激されるレセプターを発現することを意味する。SLkがB
Siより大きくない場合には、コンピュータ123は対応する標準アゴニストを
「陰性」として「フラッグする」が、これは、特定細胞が特定アゴニストにより
刺激され得るレセプターを含有しないことを意味する。
って進み、グラジエント方式の作用を開始する。グラジエント方式では、ステッ
プ1550は、ステップ1514で測定されたLk値に対応する位置にオートサ
ンプラー315を動かす。その後、プロポーショニングバルブ327をオンにし
てグラジエント方式で操作する(ステップ1552)。ステップ1554では、
標準アゴニスト刺激シグナルに関して用量応答曲線を記録する。ステップ155
6は、特定レベルのシグナルを生じさせるいくつかの特定濃度のアゴニストとし
て測定され得る効力パラメーターを算定する。データをステップ1558で保存
する。
560)、オートサンプラー315をゼロ位置に動かし(ステップ1562)、
プロポーショニングバルブ327をオンにし(ステップ1564)、そしてステ
ップ1566で測定された洗浄遅延期間後、バルブ327を再びオフに切り換え
る(ステップ1568)。ステップ1568を実施後、本方法は、ライン0を経
て増分計数器Lに戻る(ステップ1514)。
ステップ1542はA陰性=とフラッグするが、これは、特定細胞が、発現され
た特定レセプターを有さないことを意味し、そしてプログラムの流れはラインM
を通ってステップ1514に戻る。
アゴニストが試験されたことを示し、本方法はラインNを経てステップ1570
に移動し、コンピューター123は細胞計数器Cを増大する。計数器の数値(ス
テップ1572)を、ステップ1503で進入した細胞の最大数と比較する。計
数器値CiがCMAXを超えない場合には、制御装置Lをステップ1574でゼロに
設定し、マルチチャンネル切り換えバルブ347を次の位置に切り換えて、新規
の細胞リザーバを出力346と連結し、本方法をラインPを経てステップ150
9に戻す(図16a)。ステップ1572において、Ci値がCMAXより高い場合
には、本方法はステップ1578に移動し、そこでオートサンプラー315をそ
のゼロ位置に移動させて、プロポーショニングバルブ327をオンに切り換える
(ステップ1580)。ステップ1582で測定された洗浄遅延後、バルブ32
7をオフに切り換えて(ステップ1584)、ポンプ357をオフにし(ステッ
プ1586)、そして全プログラムをステップ1588で停止する。
ファンレセプター検出方式の連続フロー図を図17a〜17gに示す。この方式
を実行するために、切り換えバルブ347を、ネイティブのまたはエンプティー
ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞、および当該オーフェンレセプター
でトランスフェクトされた細胞を含有する少なくとも2つのリザーバ349を別
々に共通流出口346に連結させるマルチチャンネル切り換えバルブ347に取
り換える。
れはすべてのパラメーターをそれらの初期値に設定する。これらの初期パラメー
ターとしては、ソフトウェア変数の内部初期化およびサブルーチンが挙げられる
が、これらに限定されない。次にプログラムは、試験されるべき最大数のアゴニ
ストを書き入れるオペレーターを要する(ステップ1603)。
4Aおよび4B)は取込みノズル307および323を、洗浄緩衝液リザーバ3
05が占める対応する「ゼロ」位置に移動させる(ステップ1604)。プロポ
ーショニングバルブ311および327、切り換えバルブ333、335および
347、ならびにプライミングバルブ313、329、341および345をオ
フに切り換える(ステップ1606)。オフ状態では、プライミングバルブ31
3、329、341および345は通常は開かれ、プロポーショニングバルブ3
11および327の流出口312および328は、対応する「通常開放」流入口
309および325と連結され、切り換えバルブ335の流出口334は「通常
開放」流入口336と連結され、切り換えバルブ333の共通流出口342は「
通常開放」流入口332と連結される。
、位置1の宿主細胞を含有するリザーバと連結するように設定される。ポンプ3
57を始動して液体をポンピングする(ステップ1610)。これは、オートサ
ンプラー301および315の「ゼロ」位置に置かれたリザーバからの洗浄緩衝
液を、ノズル309および325、ならびにプロポーショニングバルブ311お
よび327のそれぞれ流出口312および328、プライミングバルブ313お
よび329、混合ゾーン331、切り換えバルブ333の流入口332および流
出口342、プライミングバルブ341、混合ゾーン343、反応展開ライン3
53、検出器355、ポンプ357を通って、ドレーン容器359に強制的に流
入させる。混合ゾーン343で、この流れを、取込み管348、およびプライミ
ングバルブ345を通ってマルチチャンネル切り換えバルブ347の流出口34
6から進入する宿主細胞懸濁液と混合する。したがって、混合ゾーン343を通
過する総流量は、3つの流れの合計であり、第1の流れはプロポーショニングバ
ルブ311から、第2の流れはプロポーショニングバルブ327から、そして第
3の流れはマルチチャンネル切り換えバルブ347から進入する。このステップ
中、両プロポーショニングバルブは、最終混合物が、宿主細胞懸濁液:洗浄緩衝
液が1:2の割合から成るように、各オートサンプラーの「ゼロ」位置に置かれ
たリザーバから洗浄緩衝液305を供給する。
プ1612で測定される遅延後、検出器355は宿主細胞により生成される基底
シグナルを記録する(ステップ1614)。基底シグナルの登録後、それは参照
シグナル(BS)HCとして保存される(ステップ1616)。ステップ1620
では、マルチチャンネル切り換えバルブ347を位置2に切り換えて、流出口3
46にトランスフェクトされた細胞の懸濁液を供給する。新規の細胞懸濁液およ
び洗浄緩衝液の混合物の流動を安定化するために必要なステップ1622で測定
された遅延後、検出器355は、トランスフェクトされた細胞により生成された
二次基底シグナルを記録する(ステップ1624)。基底シグナルの登録後、そ
れを参照シグナル(BS)TCとして保存し(ステップ1626)、ポンプをオフ
に切り換える(ステップ1628)。コンピューター123(図1Aおよび1B
)は増分計数器Lをトリガする(ステップ1630)。
て、試験されるべきアゴニスト319のセットをサンプリングするオートサンプ
ラー315の流入口323のノズルの位置を決定する。次に増分計数器Lの数値
含量Lkを、試験されるべき標準アゴニストの最大数Lmaxと比較する(ステップ
1632)。
Lkにより測定される位置でラック319に置かれるアゴニストリザーバに配置
する(ステップ1634)。ポンプ357をステップ1636でオンに切り換え
て、プロポーショニングバルブ327をオンに切り換えて、その「通常閉鎖」流
入口323を共通出力口328に開き(ステップ1638)、したがって特定ア
ゴニストは、プライミングバルブ329、混合ゾーン331、切り換えバルブ3
33の流入口332および流出口342、プライミングバルブ341、混合ゾー
ン343を通して流れ、ここで、マルチチャンネル切り換えバルブ347の出力
口346およびプライミングバルブ345から進入するトランスフェクトされた
細胞の懸濁液と混合される。混合ゾーン343でのトランスフェクトされた細胞
との混合後、液体流は反応展開ライン353を通って検出器355に進み、さら
に廃液リザーバ359に進む。安定化のために混合過程に必要であるステップ1
640により提供された遅延後、検出器355は、所定のアゴニストLkの存在
下で特定のオーファンレセプタートランスフェクトされた細胞により生成される
アゴニスト誘発シグナル(SLk)TCを記録する(ステップ1642)。シグナ
ルを登録後、その値(SLk)TCをステップ1643で保存し、装置はステップ
1644に進み、ここでプロポーショニングバルブ327をオフに切り換え、し
たがって、通常開放流入口325を緩衝液305で流出口328に連結する。ス
テップ1646では、オートサンプラー315はそのノズル323を、洗浄緩衝
液を充填したリザーバが占有するゼロ位置に動かす。プロポーショニングバルブ
327を再びオンに切り換えて(ステップ1648)、流入口323を出力口3
28と連結する。ステップ1650で決定された遅延は、プロポーショニングバ
ルブ327の流入口323および流出口328、プライミングバルブ329、混
合ゾーン331、切り換えバルブ333の流入口332および流出口342、プ
ライミングバルブ341、混合ゾーン343、反応展開ライン353ならびに検
出器355で構成される流動経路をアゴニストの残りを洗い流す。遅延(ステッ
プ1650)後、プロポーショニングバルブ327をステップ1652でOFF
に切り換えて、ポンプ357をステップ1654でオフにし、システムを元の状
態に戻す。
参照基底シグナル(BS)TCの値と比較する(ステップ1658)。アゴニスト
誘発シグナル(SLk)TCの値が基本値(BS)TCの値より大きくない場合、コ
ンピューター123(図1Aおよび1B)は対応するアゴニストLkを「陰性」
として「フラッグする」(ステップ1660)が、これは、細胞が特定アゴニス
トにより刺激され得るレセプターを含有しないことを意味し、流れはラインMを
通って増分計数器Lに戻る(ステップ1630)。(SLk)TCシグナルが(B
S)TCシグナルより大きい場合には、コンピューター123は、「陽性TC」とし
て対応するアゴニストを「フラッグし」(ステップ1656)、これは、トラン
スフェクトされた細胞が特定アゴニストにより刺激され得るレセプターを発現す
ることを意味する。
きオーファンレセプターとそれを区別するためにこのレセプターを発現するか否
かを測定することである。それを実行するためには、標準アゴニストLkがステ
ップ1656で陽性であるとフラッグされた後、プログラムの流れはループK−
Oに入り、ここで、ステップ1662において、オートサンプラー315はその
ノズル323を計数器Lで得られる値Lkに対応する位置に動かす。ステップ1
664は切り換えバルブ347を位置1に動かし、これは、宿主細胞懸濁液リザ
ーバ349を、共通出力346を通して、マルチチャンネル切り換えバルブ34
7の流入口348を通して、そしてプライミングバルブ345を通して、混合ゾ
ーンと連結する。ステップ1666および1668はそれぞれバルブ327およ
びポンプ357をオンに切り換えて、オートサンプラー301の流入口309か
ら進入する緩衝液305、ならびにプロポーショニングバルブ327の流入口3
23および流出口328から進入する標準アゴニストLkを混合ゾーン331で
一緒にさせて、その後、この溶液を混合ゾーン343で宿主細胞と混合する。細
胞およびアゴニストの混合物流を安定化するために必要なステップ1670によ
り測定された遅延後、検出器355は、宿主細胞中のアゴニスト誘発シグナル(
SLk)HCを記録する(ステップ1672)。
BS)HCと比較する。比較結果によって、アゴニストLkを「陽性TC/陽性HC」
(ステップ1676)または「陽性TC/陰性HC」(ステップ1678)としてマ
ークする。いずれの場合も、研究者によるさらなる評価のために、ステップ16
80でデータを保存する。
で位置2に切り換え、プロポーショニングバルブ327をオフに切り換えて(ス
テップ1684)、オートサンプラー315をゼロ位置に動かし(ステップ16
86)、プロポーショニングバルブ327をオンに切り換えて(ステップ168
8)、ステップ1690で測定された洗浄遅延後、再びオフに切り換えて(ステ
ップ1692)、ポンプ357をオフに切り換える(ステップ1694)。ステ
ップ1694の実施後、ラインOを通して流れを増分計数器Lに戻す(ステップ
1630)。
をステップ1700(図17g)に動かして、ここで計数器Lをゼロに設定する
。次に、オートサンプラー315をステップ1702でゼロ位置に動かして、プ
ロポーショニングバルブ327をステップ1704でオンに切り換え、ステップ
1706で測定された洗浄遅延後、プロポーショニングバルブ327およびポン
プ357をともにそれぞれステップ1708および1710でオフに切り換えて
、その後、プログラムをステップ1712で停止する。
をモニタリングし得る。例えばシグナル伝達経路の活性化または全体的細胞応答
の誘発を示すシグナルを生成するために蛍光色素のような試薬を用いてシグナル
伝達経路および全体的細胞応答を試験するために、生体細胞を用い得る。好まし
くは、蛍光色素は、細胞の活性化状態の変化を示す生化学的媒介物質または生物
物理的パラメーターのレベルまたは状態に感受性である。特に、細胞中の非結合
Ca2+イオンの濃度の変化を測定するためには、指示薬は色素indo−1であ
り得る。その他の指示薬は、細胞内pH(例えばSNARF−1)、細胞内K+
(例えばPBFI)、細胞内Na+(例えばSBFI)、膜貫通電位(例えばオ
キソノールおよびDiBAC色素)、脂質流動度(例えばメロシアミン540)
、脂質酸化(例えばシス−パラナリン酸)および細胞内酸化電位および状態(例
えばMC−H2DCFDA)を測定し得る。上記の指示薬は、Molecular Probes
(Eugene, OR)またはその他の売り主から入手可能である。
たは個々の細胞における細胞応答を測定し得る本発明の装置および方法、例えば
検出器が、生体細胞中の試験化合物に対する細胞応答を測定するためのフローサ
イトメーターである装置の使用を実証する。
から標的細胞を採取し、必要な場合には、緩衝化塩溶液で洗浄し、そして計数す
る。上記のように、標的細胞は、単一細胞型を含有する培養から、または複数の
細胞型を含有する培養から入手し得る。培養が細胞の混合集団を含有する場合、
細胞型同定試薬は、以下に記載したように用いられる。
染色する。負荷条件は、用いられる色素によって変わる。考慮されるべき条件と
しては、細胞密度、温度、色素プローブの継続期間および濃度が挙げられるが、
これらに限定されない。
めの方法は、当業者に既知である。例えば、インド−1、SNARF−1、PB
FLおよびMC−H2DCFDAは、1〜10μMで、室温で、膜透過、エステ
ラーゼ切断可能形態を用いて、細胞中に負荷される。オキソノールおよびDiB
AC色素、メロシアニン540およびシス−パラナリン酸は、1〜50μMで室
温で、平衡条件下で負荷し、保持される。細胞の生存度を延ばすために、負荷お
よび染色は、可能な場合はいつでも、ハイブリドーマ培地(HM Sigma)中で実施
し得る。
細胞/mlで再懸濁する。試験化合物との混合および分析前に、絶えず撹拌しな
がら容器中で細胞を室温に保持する。
性ポンプにより生成される陰圧を用いて細胞を装置中に引き抜き得る。いくつか
の実施形態では、細胞を、上記のような試験化合物および標準化合物の混合物に
曝露し得る。
は試験混合物を含む試料スラグ(slug)を次にフローサイトメーターに送達する
。上記のように、カップリング装置は、好ましくは、混合チャンバから進入する
反応展開ラインからスラグ(slug)を単離し、陽性空気圧下でそれらをフローサ
イトメーターに送達する。あるいは、カップリング装置を用いずに、細胞を直接
フローサイトメーターに送達し得る。
る。励起光線散乱特性および蛍光発光は、舵取り二色性(steering dichroics)お
よび帯域濾波器を用いて光学的に選択される。各細胞に関連した蛍光および/ま
たは非蛍光工学的シグナルは、電子シグナルに変換されるが、これを処理し、グ
ラフで表す。
造により測定される時点で各細胞から検出する。応答は、全集団の平均として、
またはある蛍光値を超えた細胞のパーセンテージとして定量し得る。将来的参照
のために、データをデータベースに保存する。
胞応答を測定可能な本発明の装置および方法、例えば検出器がフローサイトメー
ターである本発明の実施形態は、1種類より多い細胞を含む細胞集団における細
胞応答を評価するために、単一細胞型、または集団の1分画のみが刺激に応答す
る組織から得られる細胞集団における応答を評価するために、あるいは多数の細
胞応答を同時に評価するために用い得る。
胞型同定試薬、例えばその細胞型に特異的な抗体を用いて、個々の細胞を標識化
する。各細胞型同定試薬は、検出器に別個のシグナルを提供して、どの細胞型が
試験化合物に応答しているかの測定を可能にする。
たはそれ以上の試験化合物および標準化合物を含む試験混合物と接触させる。あ
るいは、細胞を、上記のような試験化合物の混合物および標準化合物の混合物に
曝露し得る。細胞は、上記の実施例7に記載したような細胞応答指示試薬とも接
触させられ、これが特定細胞応答を示すシグナルを提供する。
接触させた細胞を検出器に送り、検出器は細胞応答および細胞応答が起きている
細胞型を示すシグナルを検出する。このようにして、単数または複数の試験化合
物に曝露されると細胞応答を示す単数または複数の細胞型が同定され得る。
指示試薬および1種または複数種の試験化合物と接触させる。あるいは、細胞を
、上記のような試験化合物および標準化合物の混合物に曝露し得る。応答指示試
薬の各々は、検出器に別個のシグナルを提供して、細胞応答の測定を可能にする
。細胞は単一細胞型であり得るし、または上記のような細胞型の混合集団を含み
得る、と理解されるであろう。1種または複数種の試験化合物および複数の応答
指示試薬と接触させた細胞を細胞応答を示すシグナルを検出する検出器に送る。
さらに、細胞型の混合集団が用いられる場合、検出器は各応答を示している単数
または複数の細胞型を示すシグナルを検出する。
市販の蛍光脂質挿入色素、例えばDiOC18(3)またはDiIC18(3)で異
なる細胞型を標識する。負荷手法は、用いられる細胞型および色素によって変わ
るが、しかし、1〜5μMの色素で数時間〜一夜のインキュベーションで普通は
十分である。その他の蛍光色素も、細胞を標識するために用い得る。例としては
、イオン電荷により細胞室内に閉じ込められる色素(例えばカルボキシフルオレ
セイン、Molecular Probes)または細胞内タンパク質または細胞小器官と共役す
るようになる色素(例えばミトトラッカーレッド、Molecular Probes)が挙げら
れるが、これらに限定されない。このような色素は、典型的には1〜50μMの
インキュベーション濃度を用いて細胞中に負荷される。さらに、細胞集団上の独
特のマーカーに特異的な蛍光色素共役抗体を用いて、集団を同定し得る。適切な
色素および染色試薬は、FCM形状の利用可能な励起スペクトル、ならびにある
細胞集団を別の集団と区別し得る所望のスペクトル発光によって選択される。
ような手法においては、細胞をまず採取し、次に抗体で標識する。抗体で細胞を
標識するために、細胞を高密度で氷冷染色溶液中に再懸濁する。染色溶液は、氷
上で15分以内にすべての結合部位を完全に飽和させるのに十分な濃度の抗体を
含有する緩衝化塩溶液である。細胞を洗浄して、非結合抗体を除去する。
薬色素を負荷する。上記の混合システムを用いて細胞を1つまたはそれ以上の試
験化合物または試験化合物/標準混合物に曝露し、上記のようにフローサイトメ
ーターに送る。
実施して、個々の細胞型を区別し、集団内の応答細胞の頻度を定量する。
なる細胞応答指示薬、例えば生体応答レポーター色素を負荷する。例えば色素は
、Ca2+応答のためのインド−1およびpHを測定するためのSNRF−1であ
り得る。上記と同様に色素を負荷し、細胞を採取する。
この場合、蛍光リガンドは、上記のような通常試験アゴニストまたはアンタゴニ
ストとして用いられる。これは、細胞生体応答およびリガンド結合の同時分析お
よび定量を同時的に可能にする。
含む試験化合物/標準混合物に曝露し、上記と同様に分析する。FCMを、個々
のレポーター色素に関連した各蛍光パラメーターを検出するよう適合させる。F
CMによる細胞応答の分析時に、電子ゲーティングを実施して、細胞内の別個の
生体応答を測定し、集団内の応答細胞の頻度を定量する。
は、実施例8Aおよび8Bに記載した手法を併用し得る、と理解されるであろう
。
ける細胞応答を測定し得る上記の装置および方法、例えば検出器がフローサイト
メーターである装置を用いて、レセプター活性に及ぼす試験化合物の作用を評価
し、リガンドによるレセプター占有の程度と、レセプターにより誘発される機能
的応答とを相関させ得る。
細胞活性または状態の変化を生じる関連下流事象を活性化する。天然リガンド結
合を直接または間接的に遮断する、あるいは二次メッセンジャー経路を活性化す
るために天然リガンドを模倣する化合物が同定され得る。このような化合物は、
物質または療法的作用物質としての使用を含めた種々の用途を有する。
プター媒介性細胞応答を分析し、かつ/または多数のレセプター媒介性応答を同
時に評価し得る。このような実施形態では、細胞応答を示す試薬は、レセプター
結合または活性を示す試薬である。さらに、混合細胞集団を用いる場合、細胞は
細胞型同定試薬とも接触される。
個の蛍光色素または抗体で細胞型を標識して、FCMによる区別を可能にする。
例7に記載したように採取する。複数の細胞応答を同時に評価する場合には、採
取後、細胞に2つまたはそれ以上の実施例8Bに記載したような細胞応答指示剤
、例えば生体応答指示薬色素を負荷する。1つより多い細胞型を含む集団におい
て複数の細胞応答を測定したい場合には、実施例8Aおよび8Bの手法を併用す
る。
物質を含む試験化合物/標準混合物と混合し、実施例7に記載したようにFCM
により分析して、レセプター活性に及ぼす試験化合物または試験化合物/標準混
合物の作用を測定する。
関連する各蛍光パラメーターを検出するように適合させる。電子ゲーティング(
electronic gating)を用いて、各生体応答を、個々の細胞集団の各々に関して同
時に測定する。電子ゲーティング(electronic gating)を用いて、各集団内の応
答細胞の頻度も同時に定量する。
ける細胞応答を測定し得る上記の装置および方法、例えば検出器がフローサイト
メーターである装置を用いて、イオンチャンネルまたは非選択的細孔の活性に及
ぼすそれらの作用に関して、1つまたはそれ以上の試験化合物あるい1つまたはそ
れ以上の試験化合物および標準物質を含む試験化合物/標準混合物を分析し得る
。
細孔の活性化を示す試薬である。さらに、混合細胞集団を用いる場合、細胞は細
胞型同定試薬とも接触される。指示薬色素の異なる特性は、イオンチャンネルお
よび細孔機能を調べるのに利用し得る。例えばある種のチャンネルは特定イオン
に対して透過性であり、これらのイオンは細胞内色素の蛍光特性を変え得る。例
えばCa2+チャンネルの活性化は、Ca2+感知色素を用いて直接的に、またはチ
ャンネルを通過し、Ca2+指示薬色素の蛍光を消滅させるMn2+の能力を基礎に
した技法を用いて間接的に可視化し得る。
、透過性変化を検出し得る。これらの色素は、核酸と結合されるとそれらの蛍光
を劇的に増大し、それゆえ孔の開放により、それらが細胞に入るのを可能となる
場合にのみ、蛍光:シグナルを産生する。
験化合物に対する多数のチャンネルおよび孔媒介性細胞応答を可能にする。
記のような細胞型同定試薬、例えば別個の蛍光色素または抗体で細胞型を標識す
る。
例7に記載したように採取する。複数の細胞応答を同時に評価する場合には、採
取後、細胞に2つまたはそれ以上の、実施例8Bに記載したような細胞応答指示
剤、例えば生体応答指示薬色素を負荷する。1つより多い細胞型を含む集団にお
いて複数の細胞応答を測定したい場合には、実施例8Aおよび8Bの手法を併用
する。
チャンネル透過イオン、例えば色素蛍光を消滅させるMn2+のチャンネルを通る
流れを遮断または強化する試験化合物の能力を評価し得る。他のイオンにおける
フラックス(flux)を感知する他の色素、例えばNa+に対するSBFIも、競合
的イオンのNa+チャンネルを通る流れを検出するために用いられ得る。標的細
胞活性が活性化可能な非選択的細孔である情況では、1つより多い生体応答が同
時にモニタリングされるのでない限り、細胞は生体応答指示薬を負荷されない。
以上の試験化合物および標準物質を含む試験化合物/標準混合物と混合し、FC
Mにより分析するが、但し、競合的イオン、例えばMn2+(最終濃度1〜100
μM)または核酸結合色素、例えば7−AAD(1〜100μM)を試験化合物
または試験化合物/標準混合物とともに導入する。イオンまたは核酸感知色素の
ための十分な時間は、FCM分析前にシステムの反応時間を調整することにより
可能になる。
ネルのアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。例えば評価されるチャンネ
ルがL型電圧ゲート化Ca2+チャンネルである場合、アゴニスト BayK86
44またはアンタゴニストニモジピン、ベラパミルまたはジルチアゼムを標準化
合物として用い得る。
、アンタゴニスト、例えばω−コノトキシンGVIA、ω−コノトキシンMVI
ICは標準化合物として用い得る。
ーター、例えばバトラコトキシン、α−スコルピオン毒素、クラス2βスコルピ
オン毒素またはアンタゴニスト、例えばテトロドトキシン、またはサキシトシン
は標準化合物として用い得る。
ーおよび多細胞フォーマットで適切な光学的シグナルを検出するように適合する
。
ける細胞応答を測定し得る本発明の装置および方法、例えば検出器がフローサイ
トメーターである装置を用いて、二次メッセンジャー経路に関与するレセプター
またはチャンネルの下流の点で二次メッセンジャーの活性に及ぼすそれらの効果
に関して、一種または複数種の試験化合物を分析し得る。上記のように、本発明
の装置および方法は、混合細胞集団における二次メッセンジャーに及ぼす一種ま
たは複数種の試験化合物の作用を分析するために、かつ/または多数の二次メッ
センジャーを同時に評価するために用い得る。このような実施形態では、細胞応
答を示す試薬は、直接または間接的に二次メッセンジャーの活性を示す試薬であ
る。さらに、混合細胞集団を用いる場合、細胞を細胞型同定試薬にも接触させる
。
通レセプターにより活性化される「二次メッセンジャー」酵素である。活性時に
、酵素は、膜脂質からのイノシトールトリホスフェート(IP3)の生成を触媒
する。IP3はCa2+チャンネルとして機能する小胞体(ER)上でIP3レセプ
ターを結合し、活性化する。これは、ERからの保存Ca2+の放出を引き起こす
。Ca2+のこの突然の放出は、細胞内遊離Ca2+レベルを数秒以内に100nM
から1μMに上げる可能性がある。
レセプターに関連したGプロテインサブユニットの直接活性剤または阻害剤を試
験するために用い得る。このような手法においては、本発明の装置を用いて、所
望の酵素を含有する細胞に候補化合物を導入する。Ca2+動員応答を、蛍光Ca 2+ 指示薬、例えばインドールを用いてモニタリングする。
ける細胞応答を測定し得る本発明の装置および方法、例えば検出器がフローサイ
トメーターである装置を用いて、細胞アポトーシスまたは細胞毒性に及ぼすそれ
らの効果に関して、一種または複数種の試験化合物を分析し得る。上記のように
、本発明の装置および方法は、混合細胞集団における細胞アポトーシスに及ぼす
一種または複数種の試験化合物の作用を分析するために、かつ/またはアポトー
シスを含めた複数の細胞応答を同時に評価するために用い得る。このような実施
形態では、細胞応答を示す試薬は、細胞アポトーシスまたは細胞毒性に関与する
作用物質の活性を示す試薬である。さらに、混合細胞集団を用いる場合、細胞を
細胞型同定試薬にも接触させる。
析を説明する。
による区別を可能にするために上記のような別個の蛍光色素または抗体で標識す
る。
7に記載したように採取する。複数の細胞応答を同時に評価する場合には、採取
後、細胞に2つまたはそれ以上の、実施例8Bに記載したような細胞応答指示剤
、例えば生体応答指示薬色素を負荷する。1つより多い細胞型を含む集団におい
て複数の細胞応答を測定したい場合には、実施例8Aおよび8Bの手法を併用す
る。
例としては、ミトコンドリア膜電位下落を測定するための1〜10μMで負荷す
るJC−1、酸素フリーラジカルの蓄積を測定するためのジヒドロフルオレシン
、およびクロマチン縮合および変性を査定するために0.1〜10μg/mlで
負荷するHOE33342が挙げられるが、これらに限定されない。
試験化合物および標準物質を含む試験化合物/標準混合物で細胞集団を処理し、
既定最適時間の間、インキュベートする。最適インキュベーション時間は細胞型
により変わるが、しかし正常培養条件下で1〜4時間であると考えられる。
試薬は、アポトーシスの付加的センサーおよび検出体である。このような試薬は
、システムのさらに別の投入ラインを通して投入し得る。このような試薬の例と
しては、アポトーシス中に形質膜の外部リーフレットに配向されるホスファチジ
ルセリンを結合するFITC共役化アネキシンVが挙げられるが、これに限定さ
れない。カップリング装置および/または混合チャンバからの反応展開ラインの
長さの調整により、付加的蛍光試薬のそれらの標的との相互作用を可能にする時
間が得られる。
ーおよび多細胞フォーマットで適切な光学的シグナルを検出するように適合する
。
によりアポトーシスの誘発を受けやすい。応答指示薬色素、例えばインドールま
たはFuraレッド(Ca2+)またはJC−1(ミトコンドリア電位)を、すべ
て1〜10μMで細胞に負荷する。次に負荷細胞をマルチウエルプレートにアリ
コート化して、試験化合物で処理する。細胞を1〜4時間インキュベートして、
早期にアポトーシス事象を起こさせる。次に細胞をオートサンプラーにより本発
明の装置に投入し、試料投入ラインを通して、付加的アポトーシス検出試薬、例
えばフルオロクロム共役化アネキシンV(0.1〜100ug/ml)に曝露す
る。
るのに十分な時間(1〜5分)を、試料混合物に提供する。例えば反応チャンバ
の長さを延長して、十分な時間が提供されるのを保証し得る。次に、カップリン
グ装置(PFC)を介して試料を検出器に送達する。
ける細胞応答を測定し得る上記の装置および方法、例えば検出器がフローサイト
メーターである装置を用いて、細胞ネクローシスに関与する作用物質の活性に及
ぼすそれらの効果に関して、1つまたはそれ以上の試験化合物あるいは1つまた
はそれ以上の試験化合物および標準物質を含む試験化合物/標準混合物を分析し
得る。上記のように、本発明の装置および方法は、混合細胞集団における細胞ネ
クローシスに関与する作用物質に及ぼす一種または複数種の試験化合物の作用を
分析するために、かつ/または多数の細胞応答を同時に評価するために用い得る
。このような実施形態では、細胞応答を示す試薬は、細胞ネクローシスに関与す
る作用物質の活性を示す試薬である。さらに、混合細胞集団を用いる場合、細胞
を細胞型同定試薬にも接触させる。
。
オセンサーが、アポトーシスよりむしろネクローシスを検出するのに適している
。一例は、カルセインAMを1〜10μMで用いて、カルセインを細胞に負荷す
ることである。アポトーシス状態とは違って、ネクローシス状態下では、形質膜
は、本方法では早期にカルセインのような大型分子を透過させるようになる。通
常は良好に保持される緑色蛍光カルセインは、ネクローシス状態下では漏出し、
これは緑色蛍光低減として明らかである。
トサンプラー口を通してシステムに投入する。細胞を、適切な場合には実施例1
2に記載したような付加的投入ラインを用いて、膜透過性を示す付加的蛍光指示
薬に曝露する。一例は赤色蛍光形質膜不透過DNA染色ヨウ化プロピジウムであ
る。
ーターおよび多細胞フォーマットで適切な光学シグナルを検出するように適合さ
せる。
ける細胞応答を測定し得る上記の装置および方法、例えば検出器がフローサイト
メーターである装置を用いて、ネクローシスおよびアポトーシスに及ぼすそれら
の作用に関して、1つまたはそれ以上の試験化合物あるいは1つまたはそれ以上
の試験化合物および標準物質を含む混合物を分析し得る。上記のように、本発明
の装置および方法は、混合細胞集団におけるネクローシスおよびアポトーシスの
両方に及ぼす単数または複数の試験化合物の作用を分析するために、かつ/また
は多数細胞応答を同時に評価するために用い得る。このような実施形態では、細
胞応答を示す試薬は、細胞ネクローシスおよびアポトーシスに関与する作用物質
の活性を示す試薬である。さらに、混合細胞集団を用いる場合、細胞を細胞型同
定試薬にも接触させる。
性の分析を説明する。
シスおよびネクローシスを検出する。標識および応答感知色素の適切な組合せを
、ネクローシスおよびアポトーシス細胞の両方を査定するために、実験上の必要
性に応じて選択する。上記のように、予め染色した細胞をオートサンプラー口を
通してシステムに取りこむ。適切な場合には、実施例12および13に記載した
ように輸送中に、付加的色素を細胞集団に添加する。
色素に適した多重パラメーターおよび多細胞フォーマットで適切な光学シグナル
を検出するように適合させる。
ける細胞応答を測定し得る上記の装置および方法、例えば検出器がフローサイト
メーターである装置を用いて、所望の表現型または細胞応答プロフィールを有す
る細胞集団を得るかまたはクローン化する。このような実施形態では、フローサ
イトメーターを装備して、所望の表現型を示す細胞を選別する。システムを、所
望の表現型または細胞応答プロフィールを有する細胞の蛍光標示式細胞分取を可
能にするように適合し得る。好ましくはこのような手法に用いられる1つまたは
それ以上の細胞応答を検出するための試薬は、細胞応答を示す蛍光シグナルを提
供する。付加的表現型マーカー、例えば特定細胞表面マーカーの存在を検出する
蛍光抗体を用いて、所望の特徴を有する細胞を分離することもできる。これは、
所望の特徴を示さない集団中の他の細胞からの、所望の表現型または細胞応答を
有する細胞の分離またはクローニングを可能にする。このようにして、所望の特
徴を示す細胞の均一集団を生成し、検定に用い得る。以下の実施例15は、この
ような実施形態を説明する。
別を可能にするために前記のような別個の蛍光色素または抗体で細胞型を標識す
る。
7に記載したように採取する。複数の細胞応答を同時に評価する場合には、採取
後、細胞に2つまたはそれ以上の、実施例8Bに記載したような細胞応答指示剤
、例えば生体応答指示薬色素を負荷する。細胞応答指示試薬は、本明細書中に列
挙したもののいずれかであり得る。例えば検出される細胞応答がカルシウム流入
である場合、細胞応答指示薬はインド−1であり得る。1つより多い細胞型を含
む集団において複数の細胞応答を測定したい場合には、実施例8Aおよび8Bの
手法を併用する。
それ以上の分子と混合し、混合物を、前記のように複数の細胞応答を同時に検出
し得るか、または個々の細胞における細胞応答を検出し得る検出器に通して誘導
する。検出器を、細胞の集団から所望の特徴を示す細胞を選別しまたはクローン
化するようにも適合させる。細胞および1つまたはそれ以上の試験化合物を含む
試料プラグを連続的にフローサイトメーターに送達する。プラグがフローサイト
メーターにより分析されると、所望の特徴を有する細胞が受容容器に送達される
。将来的な保存または使用のために送達細胞を培養中で拡張し得る。
粒子との相互作用を評価し得る上記の装置および方法、例えば検出器がフローサ
イトメーターである装置を用いて、1つまたはそれ以上の生化学分子が試料中に
存在するか否かを測定するための生化学分析を実施し得る。このような実施形態
では、試料中の生化学的分子の存在を同定するために、試料を試薬に接触させる
。このような実施形態では、評価される各生化学的分子に関する別個のシグナル
を提供する検出試薬を用いて、試料中のいくつかの生化学的分子の存在を同時に
評価する。いくつかの実施形態では、多数の生化学的分子の評価は、別個のシグ
ナルを提供するビーズまたは粒子を用いて成し遂げる。
リペプチドの存在に関して試料を同時に評価し得る。
チドを同時に評価するこのようなウエスタン分析の一実施形態を説明する。しか
しながら、本発明の装置および方法は、試料中に存在するあらゆる種類のポリペ
プチドに関してウエスタン分析を実行するために用いられ得る、と理解される。
体を保有するミクロスフェア集団を調製する。最適共役条件は各抗体に関して変
化するが、しかし例としては、ビオチン化抗体によるコーティングを可能にする
ためのストレプタビジン被覆ミクロスフェアの使用が挙げられる。ミクロスフェ
アは、蛍光性であるか、または異なるサイズを有して、各ビーズ集団をFCMに
より同定可能にする。サイズまたは蛍光パラメーターに基づいて、いくつかの独
特かつ位置付け可能なビーズおよび抗体組合せを構築し得る。これは、集団がF
CMにより分析される場合に、多重検定を単一実験で実施可能にする。
リペプチドである場合、採取前に試験化合物で細胞集団を処理し、所定の最適時
間、インキュベートして、適切な下流シグナル伝達事象を起こさせる。洗剤、例
えば0.1〜1.0%NP−40で細胞を溶解して、細胞内分子を遊離する。特
異的抗体を保有するミクロスフェアを溶解物に添加して、特定細胞タンパク質を
吸着する。
試料を流体素子工学システム中に引き込む。第2の投入システムを通して試料ス
ラグ(slug)に流体素子工学システム内の第二抗体(10μM)を導入すること
により、ビーズ集団をこの第二抗体に曝露する。第二抗体を蛍光分子と共役させ
て、FCMによる同定を可能にする。第二抗体は、各独特のビーズ集団上の捕獲
細胞タンパク質の修飾を検出し得る。一例は、ホスホチロシン標識化タンパク質
を検出するための抗ホスホチロシン抗体の使用である。結合デバイス装置および
/または混合チャンバからの反応発生ラインの長さは、第二抗体の捕獲タンパク
質との結合を可能にするのに十分である(2〜5分)。
る。精密な励起レーザーならびに光線散乱および発光収集光学素子を有するFC
Mを造形して、多数の捕獲細胞タンパク質の同時分析を可能にする。多数の独特
のビーズ集団を用いて、多数の細胞タンパク質の修飾状態を同時に分析し得る。
粒子との相互作用を評価し得る上記の装置および方法、例えば検出器がフローサ
イトメーターである装置を用いて、多数のmRNAまたはDNAの存在に関して
試料を同時に評価するためのノーザンまたはサザン分析を実施し得る。
ーザン分析を実施するようなノーザン分析の一実施形態を説明する。しかしなが
ら、ノーザン分析は試料中の任意の所望のmRNAの存在を検出するために実施
し得る、と理解される。本方法は、試料中の任意の所望のDNAの存在を検出す
るために実施し得る、とも理解される。
の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプローブを保有するミクロスフェア集団を
調製する。最適共役条件は各オリゴヌクレオチドに関して変化する。一例は、ビ
オチン化オリゴヌクレオチドプローブによるコーティングを可能にするためにス
トレプタビジン被覆ミクロスフェアを使用することである。ミクロスフェアは、
蛍光性であるか、または異なるサイズを有して、各ビーズ集団をFCMにより同
定可能にする。サイズまたは蛍光パラメーターに基づいて、いくつかの独特のか
つ位置付け可能なビーズおよびオリゴヌクレオチドの組合せを構築し得る。これ
は、集団がFCMにより分析される場合に、多重検定を単一実験で実施可能にす
る。
物で細胞集団を処理し、所定の最適時間、インキュベートして、新規のmRNA
種の合成を生じる適切な細胞事象を起こさせる。RNAゾル(RNAzol)のような試
薬で細胞を溶解して、細胞内mRNAを遊離し、保存する。特異的オリゴヌクレ
オチドプローブを保有するミクロスフェアを溶解物に添加して、ビーズ上のオリ
ゴヌクレオチドプローブの相補的mRNAとのハイブリダイゼーションを可能に
する。
するオリゴヌクレオチドプローブもハイブリダイゼーションミックスに添加する
。ビーズ結合プローブ、mRNA種およびビオチン化プローブ間のハイブリダイ
ゼーションは、最適化条件下で進行する。
ビオチン抗体(1〜5μg/ml)を導入することにより、この抗体にビーズ集
団を曝露する。抗体を蛍光分子と共役させて、FCMによる同定を可能にする。
結合デバイスおよび/または混合チャンバからの反応展開ラインの長さは、抗体
の第2のオリゴヌクレオチドプローブとの結合を可能にするのに十分である(2
〜5分)。捕獲mRNAを伴う位置付け可能抗体被覆ビーズが次にFCMに入る
。
を造形して、多数の捕獲細胞mRNAの同時分析を可能にする。多数の独特のビ
ーズ集団を用いて、多数のmRNA種を同時に検出し得る。
粒子との相互作用を評価し得る上記の装置および方法、例えば検出器がフローサ
イトメーターである装置を用いて、多数の−塩基多型(SNP)の存在に関して
試料を同時に評価し得る。
多数の方法がある。一アプローチは、プライマーの3'末端が多型塩基に直接隣
接するように、SNPを含有するPCR増幅ゲノムDNAとハイブリダイズする
短いミニシーケンシングプライマーを調製することである。DNAポリメラーゼ
を用いて、プライマーを多型部位に一塩基延長する。蛍光性塩基を用いる場合、
増幅DNAの配列により指図される挿入塩基の同一性は、延長プライマーの蛍光
サインにより同定し得る。このような蛍光性塩基は一般に、高速DNAシーケン
シングの試みに用いられ、市販されている。オリゴヌクレオチドプローブを、F
CM位置付け可能ミクロスフェアに添付され得るように構築することによって、
FCMによりDNAポリメラーゼ反応の生成物を検出し得る。多数のSNPは、
各SNPに対するプライマーを異なる位置付け可能ビーズと連結することにより
、DNAの単一試料中で検出し得る。
チドトリホスフェートを用いて、マイクロタイターウエル中で延長反応を実施す
る。各反応は、独特のSNP部位を標的にする。
クロスフェアのスラリーの添加である。この段階は、混合システムにより実施す
る。
ートからシステムに入る。プライマーを、別の口から取り込んだストレプタビジ
ン被覆ビーズと混合する。反応時間を調整して、結合デバイスまたは混合チャン
バからの配管を通過させながら、ビーズに延長プライマーを吸着させる。FCM
を、各ビーズセット上のビーズ集団およびプライマー関連蛍光を同定するように
適合させる。
の粒子との相互作用を評価し得る前記の装置および方法、例えば検出器がフロー
サイトメーターである装置を、酵素的活性の多重パラメータ分析に用い得る。
集団を調製する。最適共役条件は各基質に関して変化する。一例は、ビオチン化
基質によるコーティングを可能にするためのストレプタビジン被覆ミクロスフェ
アを使用することである。ミクロスフェアは、蛍光性であるかまたは異なるサイ
ズを有して、各ビーズ集団をFCMにより同定可能にする。サイズまたは蛍光パ
ラメーターに基づいて、いくつかの独特のかつ位置付け可能なビーズおよび基質
の組合せを構築し得る。これは、集団がFCMにより分析される場合に、多重検
定を単一実験で実施可能にする。
る。ビーズを酵素および候補酵素アンタゴニストまたはアゴニストと混合する。
いくつかの実施形態では、ビーズを酵素、候補アンタゴニストまたはアゴニスト
、および標準物質と混合し得る。結合デバイスおよび/または混合チャンバから
の反応展開ラインの遅延時間を、基質に対する酵素活性の反応動力学、および所
望の情報により測定する。
性基質を切断する酵素の能力を、ビーズ集団の蛍光の低減として検出する。試験
化合物または試験化合物/標準混合物が酵素の触媒活性を抑制する場合には、切
断される基質はより少ない。ビーズ集団の蛍光強度は、対照集団とほぼ同じ明る
さのままである。試験化合物または混合物が酵素の触媒活性を増大する場合には
、より多くの基質が切断される。
を造形して、試験化合物または混合物による多数の酵素基質の修飾の同時分析を
可能にする。
の粒子との相互作用を評価し得る前記の装置および方法、例えば検出器がフロー
サイトメーターである装置を、分子アセンブリー検定の多重パラメータ分析に用
い得る。
互作用に関して評価される第1の分子を保有するミクロスフェア集団を調製する
。いくつかの実施形態では、第1の分子および第2の分子はともにポリペプチド
である。例えば第1の分子は、シグナル伝達に関与するポリペプチドであり得る
。したがって、本発明の装置および方法を用いて、シグナル伝達に関与する同源
分子が1つまたはそれ以上の試験化合物の存在下でそれらの標的分子と結合する
能力を査定し得る。
ティングを可能にするストレプタビジン被覆ミクロスフェアを使用することであ
る。ミクロスフェアは、蛍光性であるかまたは異なるサイズを有して、各ビーズ
集団をFCMにより同定可能にする。サイズまたは蛍光パラメーターに基づいて
、いくつかの独特かつ位置付け可能なビーズおよび分子の組合せを構築し得る。
これは、集団がFCMにより分析される場合に、多重検定を単一実験で実施可能
にする。
子工学フォーマットで試験混合物および蛍光同源分子に曝露する。この型の検定
では、試験化合物による分子相互作用の抑制は、標的との結合の低減による同源
分子の蛍光シグナルの低減として目に見える。
を造形して、同源分子の多数の分子標的との結合および試験混合物の作用の同時
分析を可能にする。
標的分子を結合する同源シグナル伝達分子が、試験混合物の存在下で標的分子と
結合する能力を査定することであり、レセプター標的の多重パラメータ分析に用
い得る。
の粒子との相互作用を評価し得る前記の装置および方法、例えば検出器がフロー
サイトメーターである装置を用いて、多数のレセプターのリガンドとの相互作用
を同時に評価し得る。実施例21は、多膜スパニングレセプターのそれらのリガ
ンドとの相互作用が同時に評価されるこのような分析の一実施形態を説明する。
しかしながら、本発明の装置および方法は、任意の種類の分子の考え得る結合相
手との相互作用を同時に評価するために用い得ることが理解される。
例えば膜スパニングレセプターは、当該レセプターに特異的なミクロスフェア結
合抗体を用いて、洗剤可溶化細胞から免疫沈降を実施することにより単離し得る
。結合レセプターによるビーズの採取後、結合レセプターを伴うビーズを混合シ
ステムに用い得る。
理され、組換え体形態で発現され得る。次にタグを用いて、溶解物をNi+被覆
ミクロスフェアのスラリーと混合することにより、可溶化細胞からレセプターを
単離する。レセプター被覆ミクロスフェアは、混合システムで用い得る。
る。レセプターとの蛍光リガンドの会合に及ぼす試験化合物の作用を、FCM測
定により査定する。
を造形して、リガンドの多レセプターとの結合および試験化合物の作用の同時分
析を可能にする。
者には明らかであるあらゆる変更および修正が本発明の精神および範囲内にある
と理解される。本明細書中に特に記載しなかったその他の実施形態も、特許請求
の範囲に提供されるような本発明の精神および範囲内であり得る。
ンビナトリアルスクリーニング装置の一実施形態のブロック図である。
れを示す図である。
ンビナトリアルスクリーニング装置において用いられ得る正圧流体システムのブ
ロック図である。
ンビナトリアルスクリーニング装置において用いられ得る好ましいシステムの一
実施形態のブロック図である。
スクリーニングモードの簡略アルゴリズムを表す図である。
効力モードの簡略アルゴリズムを表す図である。
ましい第一モード演算のフロー図である。図7a〜図7dの組合せからなる。
ましいスクリーニングモード演算のフロー図である。図8a〜図8gの組合せか
らなる。
ましい効力モード演算のフロー図である。図9a〜図9eの組合せからなる。
実験結果を表す図である。
Q−123を用いた抑制の実験結果を表す図である。
る細胞マッピングモードの簡略アルゴリズムを表す図である。
るオーファンレセプターモードの機能的特性化の簡略アルゴリズムを表す図であ
る。
好ましい細胞マッピングモード演算のフロー図である。図16a〜図16fの組
合せからなる。
好ましいオーファンレセプター測定モード演算のフロー図である。図17a〜図
17gの組合せからなる。
する方法のフロー図である。
ー図である。
。
る方法のフロー図である。
るか、もしくはクローニングするか、または所望の表現型もしくは細胞応答プロ
フィールを有する細胞のクローン集団を得る方法のフロー図である。
る方法のフロー図である。
フロー図である。
性を検出する方法のフロー図である。
。
Claims (85)
- 【請求項1】 (a)自動コンピューター制御装置を用いて、1つまたはそ
れ以上の試験化合物と多数の細胞懸濁液の各々を順次混合して、多数の試験混合
物の各々を順次作成する工程と、 (b)多数の細胞応答を同時に検出することができる検出ゾーンを通して、前
記多数の試験混合物の各々を順次誘導する工程と、 (c)前記多数の試験混合物の各々が前記検出ゾーンを通って流れているとき
に、前記懸濁細胞における前記1つまたはそれ以上の試験化合物に対する多数の
細胞応答を同時に測定する工程 とを含む、細胞応答を引き起こす化合物を同定する方法。 - 【請求項2】 前記多数の細胞応答は、レセプター媒介性応答の活性化また
は抑制、イオンチャンネルの活性化または抑制、非選択的細孔の活性化または抑
制、レセプターまたはチャンネルの下流点での二次メッセンジャー経路の活性化
または抑制、アポトーシスの活性化または抑制、細胞ネクローシスの活性化また
は抑制、および細胞毒性からなる群から選択される細胞応答を含む請求項1に記
載の方法。 - 【請求項3】 前記多数の細胞応答は、特定の細胞応答を示すシグナルを発
生する1つまたはそれ以上の応答指示試薬と前記細胞を接触させることにより測
定される請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 前記応答指示試薬により発生する前記シグナルは、蛍光であ
る請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】 検出ゾーンを通して、前記多数の試験混合物の各々を順次誘
導する前記工程は、個々の細胞における前記細胞応答を検出することができる前
記検出ゾーンを通して、前記多数の試験混合物の各々を誘導することを含む請求
項1に記載の方法。 - 【請求項6】 検出ゾーンを通して、前記多数の試験混合物の各々を順次誘
導する前記工程は、フローサイトメーターを通して、前記多数の試験混合物の各
々を誘導することを含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 多数の細胞応答を同時に測定する前記工程は、スラグが前記
検出ゾーンを通って流れているときに、前記懸濁細胞における前記多数の細胞応
答を測定することを含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 前記多数の細胞懸濁液の各々は、1つより多くの型の細胞を
含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項9】 (a)自動コンピューター制御装置を用いて、1つまたはそ
れ以上の試験化合物と多数の細胞懸濁液の各々を順次混合して、多数の試験混合
物の各々を作成する工程と、 (b)個々の細胞における細胞応答を検出することができる検出ゾーンを通し
て、前記多数の試験混合物の各々を順次誘導する工程と、 (c)前記多数の試験混合物の各々が前記検出ゾーンを通って流れるときに、
個々の懸濁細胞における前記1つまたはそれ以上の試験化合物に対する1つまた
はそれ以上の細胞応答を測定する方法 とを含む、細胞応答を引き起こす化合物を同定する方法。 - 【請求項10】 前記1つまたはそれ以上の細胞応答は、レセプター媒介性
応答の活性化または抑制、イオンチャンネルの活性化または抑制、非選択的細孔
の活性化または抑制、レセプターまたはチャンネルの下流点での二次メッセンジ
ャー経路の活性化または抑制、アポトーシスの活性化または抑制、細胞ネクロー
シスの活性化または抑制、および細胞毒性からなる群から選択される請求項9に
記載の方法。 - 【請求項11】 前記1つまたはそれ以上の細胞応答は、特定の細胞応答を
示すシグナルを発生する1つまたはそれ以上の応答指示試薬と前記細胞を接触さ
せることにより測定される請求項9に記載の方法。 - 【請求項12】 前記応答指示試薬により発生する前記シグナルは、蛍光で
ある請求項11に記載の方法。 - 【請求項13】 検出ゾーンを通して、前記多数の試験混合物の各々を誘導
する前記工程は、フローサイトメーターを通して、前記多数の試験混合物の各々
を誘導することを含む請求項9に記載の方法。 - 【請求項14】 前記多数の細胞懸濁液の各々は、1つより多くの型の細胞
を含む請求項9に記載の方法。 - 【請求項15】 多数の細胞応答を同時に測定する前記工程は、スラグが前
記検出ゾーンを通って流れているときに、前記懸濁細胞における前記多数の細胞
応答を測定することを含む請求項9に記載の方法。 - 【請求項16】 自動コンピューター制御装置を用いて、多数の試料の各々
と1つまたはそれ以上の分子を結合することができる1つまたはそれ以上の物質
とを順次混合して、多数の試験混合物を作成する工程と、 検出ゾーンを通して、前記多数の試験混合物の各々を順次誘導する工程と、 前記試験混合物の各々が前記検出ゾーンを通って流れているときに、前記1つ
またはそれ以上の物質が前記1つまたはそれ以上の分子に結合するかどうかを測
定する工程 とを含む、試料が1つまたはそれ以上の分子を含有するかどうかを測定する方法
。 - 【請求項17】 前記1つまたはそれ以上の物質は、固体支持体に固定され
ている請求項16に記載の方法。 - 【請求項18】 多数の分子に結合することができる多数の物質は、特異的
に同定できる固体支持体に固定されている請求項17に記載の方法。 - 【請求項19】 前記測定工程は、個々の固体支持体からシグナルを検出す
ることを含み、前記シグナルは、前記固体支持体上の前記物質が前記分子に結合
したことを示す請求項18に記載の方法。 - 【請求項20】 前記1つまたはそれ以上の物質は、抗体、核酸、ポリペプ
チド、酵素基質、およびレセプターからなる群から選択される請求項16に記載
の方法。 - 【請求項21】 前記1つまたはそれ以上の分子は、ポリペプチド、核酸、
レセプターリガンド、酵素アゴニストおよび酵素アンタゴニストからなる群から
選択される請求項16に記載の方法。 - 【請求項22】 1つまたはそれ以上のポリペプチドに特異的に結合する1
つまたはそれ以上の抗体を固体支持体に結合させる工程と、 自動コンピューター制御装置を用いて、試料と、固体支持体に結合した前記1
つまたはそれ以上の抗体を順次混合して、多数の試験混合物を作成する工程と、 検出ゾーンを通して、前記多数の試験混合物の各々を順次誘導する工程と、 前記試験混合物の各々が前記検出ゾーンを通って流れているときに、前記1つ
またはそれ以上の抗体が前記1つまたはそれ以上のポリペプチドに結合されてい
るかどうかを測定する工程 とを含む、試料が1つまたはそれ以上のポリペプチドを含むかどうかを測定する
方法。 - 【請求項23】 多数のポリペプチドに特異的に結合する多数の抗体は、特
異的に同定できる固体支持体に固定されている請求項22に記載の方法。 - 【請求項24】 前記測定工程は、個々の固体支持体からシグナルを検出す
ることを含み、前記シグナルは、前記抗体が前記分子に結合したことを示す請求
項23の方法。 - 【請求項25】 前記シグナルは、前記分子に結合する検出可能なように標
識した第二抗体により発生される請求項24に記載の方法。 - 【請求項26】 核酸に特異的に結合する1つまたはそれ以上の核酸プロー
ブを固体支持体に結合させる工程と、 自動コンピューター制御装置を用いて、試料と前記固体支持体に結合した1つ
またはそれ以上のプローブを順次混合して、多数の試験混合物を作成する工程と
、 検出ゾーンを通して、前記多数の試験混合物の各々を順次誘導する工程と、 前記試験混合物の各々が前記検出ゾーンを通って流れているときに、前記1つ
またはそれ以上のプローブが前記1つまたはそれ以上の核酸に結合されているか
どうかを測定する工程 とを含む、試料が1つまたはそれ以上の核酸を含むかどうかを測定する方法。 - 【請求項27】 多数の核酸プローブは、特異的に位置づけ可能な固体支持
体に固定されている請求項26に記載の方法。 - 【請求項28】 前記測定工程は、個々の固体支持体からシグナルを検出す
ることを含み、前記シグナルは、前記プローブが前記核酸に結合したことを示す
請求項27に記載の方法。 - 【請求項29】 前記シグナルは、前記核酸に結合する検出可能な核酸プロ
ーブにより発生する請求項28に記載の方法。 - 【請求項30】 多数の核酸試料の各々用の1つまたはそれ以上の核酸プラ
イマーであって、1つまたはそれ以上の一塩基多型の多型性塩基のすぐ隣に3’
末端を有する1つまたはそれ以上の核酸プライマーを用いて、前記多数の核酸試
料の各々における伸長反応を行って、それにより、前記核酸プライマーに1つの
塩基を組み込む工程と、 固体支持体に前記伸長プライマーを結合させる工程と、 装置における検出ゾーンを通して、前記多数の核酸試料の各々用のプライマー
が結合した前記固体支持体を順次誘導する工程と、 前記伸長反応で組み込まれた塩基の同一性を測定する工程 とを含む、試料が1つまたはそれ以上の一塩基多型を含むかどうかを測定する方
法。 - 【請求項31】 多数のプライマーは、特異的に同定可能な固体支持体に固
定される請求項30に記載の方法。 - 【請求項32】 前記測定工程は、個々の固体支持体からシグナルを検出す
ることを含み、前記シグナルは、SNPにおける多型性塩基の同一性を示す請求
項31に記載の方法。 - 【請求項33】 前記シグナルは、前記伸長反応で組み込まれた検出可能な
ように標識したヌクレオチドにより発生される請求項32に記載の方法。 - 【請求項34】 (d)前記細胞の前記細胞応答に対して既知の効果を有す
る1つまたはそれ以上の標準化合物と前記細胞の懸濁液を混合して、標準混合液
を作成する工程と、 (e)前記検出ゾーンを通して、前記標準混合物を誘導する工程と、 (f)前記1つまたはそれ以上の標準化合物に対する前記細胞の前記細胞応答
を測定する工程 とをさらに含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項35】 前記混合する工程において、前記1つまたはそれ以上の標
準化合物および前記1つまたはそれ以上の試験化合物を前記細胞と同時に混合し
、前記測定工程は、前記既知の効果または前記既知の効果の改変を検出する請求
項34に記載の方法。 - 【請求項36】 前記1つまたはそれ以上の標準化合物は、前記細胞応答の
アンタゴニストである請求項35に記載の方法。 - 【請求項37】 前記1つまたはそれ以上の標準化合物は、前記細胞応答の
アゴニストである請求項35に記載の方法。 - 【請求項38】 前記細胞懸濁液は、1より多くの細胞型を含む請求項35
に記載の方法。 - 【請求項39】 検出ゾーンを通して、前記試験混合物を誘導する工程は、
フローサイトメーターを通して、前記試験混合物を誘導することを含む請求項3
5に記載の方法。 - 【請求項40】 (a)自動コンピューター制御装置を用いて、細胞応答を
引き起こす1つまたはそれ以上の化合物と多数の細胞懸濁液の各々を順次混合し
て、多数の試験混合物を作成する工程と、 (b)多数の細胞パラメータを同時に検出することができる検出ゾーンを通し
て、前記多数の試験混合物の各々を順次誘導する工程と、 (c)前記多数の試験混合物の各々が前記検出ゾーンを通って流れているとき
に、前記懸濁細胞における多数の細胞パラメータを同時に測定する工程と、 (d)所望の表現型または細胞応答プロフィールを有する細胞を受容器に送達
する工程 とを含む、所望の表現型または細胞応答プロフィールを有する細胞を得る方法。 - 【請求項41】 (a)自動コンピューター制御装置を用いて、細胞応答を
引き起こす1つまたはそれ以上の化合物と多数の細胞懸濁液の各々を順次混合し
て、多数の試験混合物を作成する工程と、 (b)個々の細胞における細胞応答を検出することができる検出ゾーンを通し
て、前記多数の試験混合物の各々を順次誘導する工程と、 (c)前記多数の試験混合物の各々が前記検出ゾーンを通って流れているとき
に、前記懸濁細胞における多数の細胞パラメータを同時に測定する工程と、 (d)所望の表現型または細胞応答プロフィールを有する細胞を受容器に送達
する工程 とを含む、所望の表現型または細胞応答プロフィールを有する細胞を得る方法。 - 【請求項42】 多数の試験化合物の各々を順次提供することが可能な自動
試験化合物供給源と、 多数の試験基質の各々を順次提供することが可能な自動試験基質供給源と、 前記試験化合物供給源および前記試験基質供給源と液絡している混合チャンバ
であって、前記試験基質供給源から受け入れた試験基質と前記試験化合物供給源
から受け入れた試験化合物を混合して、混合物を生成するように適合されている
混合チャンバと、 前記混合チャンバと液絡している検出器であって、前記混合物が前記検出器を
通過している間に、前記試験化合物と前記試験基質の間の多数の相互作用を同時
に検出することができる検出器 とを含む装置。 - 【請求項43】 前記試験化合物供給源は、多数の試料の各々を順次提供す
るための1つまたはそれ以上の試料投入口を含み、前記試料の各々は、細胞応答
を引き起こす能力を評価すべき1つまたはそれ以上の試験化合物、または分子の
存在を評価すべき溶液を含み、 前記試験基質供給源は、多数の細胞懸濁液または粒子の各々を順次提供するた
めの1つまたはそれ以上の細胞または粒子投入口を含み、 前記混合チャンバは、前記試験化合物供給源から試料を受け入れ、前記細胞ま
たは粒子投入口から前記懸濁液または粒子を受け入れ、前記細胞懸濁液または粒
子と試料の各々を混合し、 前記検出器が前記懸濁細胞における多数の細胞応答を同時に測定することがで
きるか、または多数の分子が前記試料に存在するかどうかを同時に測定すること
ができるように、前記検出器は、多数のシグナルを同時に検出することができる
請求項42に記載の装置。 - 【請求項44】 前記検出器は、前記細胞懸濁液における単一細胞または単
一粒子からシグナルを検出する請求項43に記載の装置。 - 【請求項45】 前記検出器は、フローサイトメーターである請求項43に
記載の装置。 - 【請求項46】 前記混合ゾーンと前記検出器の間に配置される連結器をさ
らに含む請求項43に記載の装置。 - 【請求項47】 前記連結器は、前記試料および前記細胞懸濁液または粒子
を含むスラグを前記検出器に送達する請求項46に記載の装置。 - 【請求項48】 前記連結器は、実質的に非希釈のスラグを前記検出器に送
達する請求項47に記載の装置。 - 【請求項49】 前記検出器は、所望の表現型または細胞応答を有する細胞
を受容器に送達する請求項43に記載の装置。 - 【請求項50】 前記1つまたはそれ以上の試料投入口は、試験化合物ライ
ブラリーから多数の特定の試験化合物の各々を順次選択することができる自動ロ
ボットサンプラーを含む請求項43に記載の装置。 - 【請求項51】 自動ロボットサンプラーの動作を制御するための、前記1
つまたはそれ以上の試料投入口に連結された制御装置と、 コンピューターにより実行されるソフトウェアプログラムに従って、前記制御
装置に指令シグナルを送信し、それにより前記試験化合物ライブラリーから前記
1つまたはそれ以上の試料投入口による試験化合物の選択および回収を制御する
ための、前記制御装置に連結されたコンピューター とをさらに含む請求項50に記載の装置。 - 【請求項52】 前記試料投入口から前記混合ゾーンに移された前記試験化
合物の濃度レベルを調節するための、前記試料投入口に連結された、投入口およ
び流出口を有するグラジエントポンプをさらに含む装置であって、前記試料投入
口は、 前記特定の試験化合物の各々を受け入れるたの第1の取込みノズルと、 緩衝溶液を受け入れるための第2の取込みノズル とを含み、前記グラジエントポンプは、第1および第2の取込みノズルに連結さ
れ、それぞれ第1および第2の取込みノズルにより受け入れる試験化合物および
緩衝溶液の量を調節することにより、特定の濃度の前記特定の試験化合物の各々
を受け入れ、ここで前記緩衝溶液は前記試験化合物の希釈剤である請求項51記
載の装置。 - 【請求項53】 前記混合ゾーンに前記細胞または粒子投入口からの前記細
胞の懸濁液または前記粒子をポンピングするための、前記混合ゾーンの投入口に
連結された第2のポンプをさらに含む請求項52に記載の装置。 - 【請求項54】 前記混合ゾーンの流出口に連結された投入口、および前記
検出器と液絡している流出口を有する反応展開ラインをさらに含み、前記反応展
開ラインは、前記混合ゾーンから受け取った混合物のための反応時間遅延を提供
する請求項53記載の装置。 - 【請求項55】 前記装置に負圧を提供するための、前記検出器の流出口に
連結されたポンプと、 前記1つまたはそれ以上の試料投入口から前記混合ゾーンに移される前記試験
化合物の濃度レベルを調節するための、前記試料投入口に連結されたプロポーシ
ョニングバルブ とをさらに含む装置であって、前記1つまたはそれ以上の試料投入口は、 前記特定の試験化合物の各々を受け入れるための第1の取込みノズルと、 緩衝溶液を受け入れるための第2の取込みノズル とをさらに含み、前記プロポーショニングバルブはそれぞれ第1および第2の取
込みノズルにより受け入れられる試験化合物および緩衝溶液の量を調節すること
により、特定の濃度の前記特定の試験化合物の各々を受け入れ、前記緩衝液は前
記試験化合物の希釈剤である請求項54記載の装置。 - 【請求項56】 多数の細胞懸濁液リザーバをさらに含む請求項43に記載
の装置。 - 【請求項57】 前記懸濁細胞の前記細胞応答における既知の効果または前
記粒子との既知の相互作用を有する1つまたはそれ以上の標準化合物を提供する
ための、前記混合ゾーンに連結された標準化合物サンプラーをさらに含む装置で
あって、前記混合ゾーンは、前記標準化合物サンプラーから前記1つまたはそれ
以上の標準化合物を受け入れ、前記懸濁細胞または粒子と前記1つまたはそれ以
上の標準化合物を混合し、前記検出器は、前記1つまたはそれ以上の標準化合物
に対する前記懸濁細胞の細胞応答、または前記1つまたはそれ以上の標準化合物
と前記粒子の間の相互作用を測定する請求項43記載の装置。 - 【請求項58】 前記混合ゾーンは、前記懸濁細胞または前記粒子と、前記
試料および前記1つまたはそれ以上の標準化合物を同時に混合し、前記検出器は
、前記懸濁細胞の前記細胞応答における前記既知の効果もしくは既知の効果の改
変、または前記標準化合物と前記粒子の間の前記既知の相互作用もしくは前記標
準化合物と前記粒子の間の前記既知の相互作用の改変を検出する請求項57に記
載の装置。 - 【請求項59】 前記標準化合物サンプラーは、標準化合物のライブラリー
から特定の標準化合物を選択することができる自動ロボットサンプラーである請
求項58に記載の装置。 - 【請求項60】 多数の試料の各々を順次提供するための1つまたはそれ以
上の自動試料投入口であって、前記試料の各々は、細胞応答を引き起こす能力が
評価されるべき1つまたはそれ以上の試験化合物、または分子の存在が評価され
るべき溶液を含む、自動投入口と、 多数の細胞懸濁液または粒子の各々を順次提供するための1つまたはそれ以上
の自動細胞または粒子投入口と、 前記試料を受け入れ、前記細胞または粒子投入口から前記細胞懸濁液または粒
子を受け入れ、前記細胞懸濁液または粒子と前記試料の各々を混合するための、
前記試料投入口に連結した混合ゾーンと、 単一細胞または粒子から1つまたはそれ以上のシグナルを検出する検出器であ
って、前記混合ゾーンに連結され、前記懸濁細胞における1つまたはそれ以上の
細胞応答を測定することができるか、あるいは1つまたはそれ以上の分子が前記
試料中に存在するかどうかを測定することができる検出器 とを含む装置。 - 【請求項61】 前記混合ゾーンと前記検出器の間に配置された連結器をさ
らに含む請求項60に記載の装置。 - 【請求項62】 前記連結器は、前記試料および前記細胞懸濁液または粒子
を含むスラグを、前記検出器に送達する請求項61に記載の装置。 - 【請求項63】 前記連結器は、実質的に非希釈のスラグを前記検出器に送
達する請求項62に記載の装置。 - 【請求項64】 前記混合ゾーンに溶液を投入するための投入システムをさ
らに含む請求項60に記載の装置。 - 【請求項65】 前記検出器は、所望の表現型または細胞応答を有する細胞
を受容器に送達する請求項60に記載の装置。 - 【請求項66】 前記試験化合物供給源は、単一濃度で、またはある濃度範
囲にわたって前記試験化合物を提供することができる請求項42に記載の装置。 - 【請求項67】 既知の細胞応答を引き起こす多数の化合物の各々を順次提
供することができる既知の化合物供給源をさらに含み、前記既知の化合物供給源
は、前記混合チャンバが試験化合物、既知の細胞応答を引き起こす化合物、およ
び細胞懸濁液を混合することができるように、前記混合チャンバと液絡している
請求項42に記載の装置 - 【請求項68】 前記既知の化合物供給源は、単一濃度で、またはある濃度
範囲にわたって既知の細胞応答を引き起こす前記化合物を提供することができる
請求項67に記載の装置。 - 【請求項69】 前記1つまたはそれ以上の試料投入口は、単一濃度で、ま
たはある濃度範囲にわたって前記試験化合物を提供することができる請求項60
に記載の装置。 - 【請求項70】 既知の細胞応答を引き起こす多数の化合物の各々を順次提
供することができる既知の化合物供給源をさらに含み、前記既知の化合物供給源
は、前記混合チャンバが試験化合物、既知の細胞応答を引き起こす化合物、およ
び細胞懸濁液を混合することができるように、前記混合チャンバと液絡している
請求項60に記載の装置。 - 【請求項71】 前記既知の化合物供給源は、単一濃度で、またはある濃度
範囲にわたって既知の細胞応答を引き起こす前記化合物を提供することができる
請求項70に記載の装置。 - 【請求項72】 ある濃度範囲の前記試験化合物は、前記細胞懸濁液と混合
される請求項1に記載の方法。 - 【請求項73】 前記多数の細胞懸濁液および前記試験化合物と、既知の細
胞応答を引き起こす1つまたはそれ以上の化合物を混合することをさらに含む請
求項1に記載の方法。 - 【請求項74】 既知の細胞応答を引き起こす、ある濃度範囲の前記1つま
たはそれ以上の化合物が、前記多数の細胞懸濁液および前記試験化合物と混合さ
れる請求項73に記載の方法。 - 【請求項75】 ある濃度範囲の前記試験化合物が、前記細胞懸濁液と混合
される請求項9に記載の方法。 - 【請求項76】 前記多数の細胞懸濁液および前記試験化合物と、既知の細
胞応答を引き起こす1つまたはそれ以上の化合物を混合することをさらに含む請
求項9に記載の方法。 - 【請求項77】 既知の細胞応答を引き起こす、ある濃度範囲の前記1つま
たはそれ以上の化合物が、前記多数の細胞懸濁液および前記試験化合物と混合さ
れる請求項76に記載の方法。 - 【請求項78】 前記分子を結合することができる、ある濃度範囲の前記物
質が、前記試料と混合される請求項1に記載の方法。 - 【請求項79】 ある濃度範囲の前記化合物が、前記細胞懸濁液と混合され
る請求項40に記載の方法。 - 【請求項80】 前記多数の細胞懸濁液および前記化合物と、既知の細胞応
答を引き起こす1つまたはそれ以上の化合物を混合することをさらに含む請求項
40に記載の方法。 - 【請求項81】 既知の細胞応答を引き起こす、濃度範囲の前記1つまたは
それ以上の化合物は、前記多数の細胞懸濁液および前記化合物と混合される請求
項80に記載の方法。 - 【請求項82】 ある濃度範囲の前記化合物が、前記細胞懸濁液と混合され
る請求項41に記載の方法。 - 【請求項83】 前記多数の細胞懸濁液および前記化合物と、既知の細胞応
答を引き起こす1つまたはそれ以上の化合物を混合することをさらに含む請求項
41に記載の方法。 - 【請求項84】 既知の細胞応答を引き起こす、ある濃度範囲の前記1つま
たはそれ以上の化合物が、前記多数の細胞懸濁液および前記化合物と混合される
請求項83に記載の方法。 - 【請求項85】 1つまたはそれ以上の標準化合物および前に1つまたはそ
れ以上の試験化合物は、前記細胞懸濁液の各々と同時に混合され、前記測定工程
は、前記1つまたはそれ以上の試験化合物が前記1つまたはそれ以上の標準化合
物の既知の効果を改変するかどうか検出する請求項1に記載の方法。
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