WO2005030986A1 - 細胞観察装置および細胞観察方法 - Google Patents

細胞観察装置および細胞観察方法 Download PDF

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Yuji Imaizumi
Yoshitaro Nakano
Ichiro Sase
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Nikon Corporation
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    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/251—Colorimeters; Construction thereof
    • G01N21/253—Colorimeters; Construction thereof for batch operation, i.e. multisample apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the present invention relates to a cell observation device and a cell observation method for observing a cell reaction, and in particular, to a background art related to a cell observation device and the like suitable for screening in the process of drug development.
  • Non-Patent Document 1 By culturing a large number of cells using a well-known synchronized culture method (for example, see Non-Patent Document 1), the state of such a large number of cells (for example, the timing of the cell cycle division phase) can be homogenized, and the drug It has been practiced to give a stimulus such as the introduction of a cell and observe the cell response. According to this method, the average response of a large number of cells can be observed.
  • Non-Patent Document 1 Weimer R, Haaf T, Kruger J, Poot M, Schmid M. ⁇ Characterization of centromere arrangements and test for random distribution in G0, Gl, S, G2, Gl, and early S 'phase in human lymphocytes. Human Genetics 88: 673-682 (1992) Disclosure of the Invention
  • Ion channels are the small conductance (SK) type 2 calcium-activated potassium channels.
  • the measurement was performed by a well-known Western blot method using an anti-SK2 channel antibody.
  • Figure 4 shows the measurement results.
  • the horizontal axis in FIG. 4 is time, and the start time of the G1 phase of the cell cycle is set to 0, and the time of each of the S phase and the G2 / M phase is divided.
  • the vertical axis of FIG. 4 represents the expression level of the ion channel in the relative distribution density (relative density). From these measurement results, it was found that the expression level of the ion channel increased or decreased depending on the stage in the cell cycle.
  • the expression level of the ion channel and the cell response are correlated, so the above measurement results imply that the cell response changes depending on the stage in the cell cycle. I have. Specifically, in the case of the SK2 channel, reactivity is high in the G1 phase and low in the S phase and the G2 / M phase.
  • An object of the present invention is to provide a cell observation device and a cell observation method capable of easily examining a correlation between an initial state of a cell and a reaction without using a synchronous culture method.
  • the cell observation device of the present invention provides an image capturing device for capturing an image of a specimen including a plurality of cells.
  • a step a stimulating unit for applying a predetermined stimulus to the plurality of cells, and an initial image of each of the plurality of cells based on the image captured by the image capturing unit before the stimulating unit applies the stimulus.
  • a certifying means for certifying a state; and a detecting means for detecting a reaction of each of the plurality of cells due to the stimulus based on the image captured by the image capturing means after the stimulating means provides the stimulus.
  • Generating means for generating correlation information between the initial state of each of the plurality of cells and the reaction.
  • the certifying unit refers to a plurality of the images sequentially taken by the image taking unit before the stimulating unit gives the stimulus, and based on a morphological change of each of the plurality of cells. , An initial state of each of the plurality of cells.
  • the certifying means certifies an initial state of each of the plurality of cells based on a morphological change associated with a cell cycle of each of the plurality of cells.
  • the certifying means certifies each of the plurality of cells immediately before the stimulating means gives the stimulus as the initial state.
  • the certifying unit certifies a phase shift of the cell cycle of each of the plurality of cells as the initial state.
  • the cell observation device of the present invention may further include an image capturing unit that captures an image of a specimen including a plurality of cells, a stimulating unit that applies a predetermined stimulus to the plurality of cells, and before the stimulating unit applies the stimulus.
  • an image capturing unit that captures an image of a specimen including a plurality of cells
  • a stimulating unit that applies a predetermined stimulus to the plurality of cells
  • the stimulating unit applies the stimulus. Referring to the plurality of images sequentially captured by the image capturing means, based on a morphological change associated with the cell cycle of each of the plurality of cells, the mitotic phase of each of the plurality of cells is specified, and Calculating means for calculating, for each of the plurality of cells, an elapsed time from a period of time until the stimulating means gives the stimulus; and A detection unit for detecting a response of each of the plurality of cells due to the stimulus; and a generation unit for generating correlation information between the elapsed time and the response of each of the plurality of
  • the cell observation method of the present invention includes a first step of capturing an image of a specimen containing the plurality of cells before applying a predetermined stimulus to the plurality of cells; And after the second step, capturing an image of the specimen, A third step of detecting a response of each of the plurality of cells due to the stimulus, based on the image, and certifying an initial state of each of the plurality of cells based on the image captured in the first step; And a fourth step of generating correlation information between the initial state and the reaction.
  • a plurality of the images are sequentially taken in, and in the fourth step, the plurality of images are referred to, and based on a morphological change of each of the plurality of cells, The initial state of each of the plurality of cells is identified.
  • an initial state of each of the plurality of cells is identified based on a morphological change associated with a cell cycle of each of the plurality of cells.
  • each state of the plurality of cells immediately before giving the stimulus is recognized as the initial state.
  • a phase shift of the cell cycle of each of the plurality of cells is identified as the initial state.
  • the cell observation method of the present invention further comprises a first step of sequentially capturing a plurality of images of a specimen containing the plurality of cells before applying a predetermined stimulus to the plurality of cells; A second step of obtaining an image of the specimen after the second step, and detecting a reaction of each of the plurality of cells due to the stimulus based on the image; and With reference to the plurality of images captured in one step, the mitotic phase of each of the plurality of cells is specified based on a morphological change associated with the cell cycle of each of the plurality of cells. A fourth step of calculating an elapsed time until the stimulus is applied to each of the plurality of cells, and generating correlation information between the elapsed time and the response.
  • the correlation between the initial state of a cell and the reaction can be easily examined without using a synchronized culture method.
  • FIG. 1 is a diagram showing an overall configuration of a cell observation device 10.
  • FIG. 2 is a flowchart showing a procedure for observing a cell reaction.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a morphological change associated with a cell cycle.
  • FIG. 4 is a result of examining a correlation between an initial state of a cell and a reaction using a conventional method.
  • the cell observation device 10 of the present embodiment includes an electric XY stage 11, a heat retaining container 12, a pipette device 13, a transmission illumination unit (14, 15), and an epi-illumination unit (16-19). ), An optical microscope section (20-22), and a computer 23.
  • a microplate 24 made of transparent polystyrene and having 96 wells 25 is mounted on the electric XY stage 11, for example.
  • Each well 25 of the microplate 24 contains a specimen containing a large number of cells (live cells). Cells are sinking to the bottom of the well 25.
  • the culture of the cells in the well 25 is performed by a general and simple method, rather than a method involving complicated operations such as a well-known synchronized culture method. For this reason, the state of many cells (for example, the timing of the division phase (M phase) of the cell cycle) in each well 25 is uneven.
  • the electric XY stage 11 is a mechanism that moves the microplate 24 in the XY direction and positions one of the 96 wells 25 in the observation optical path 10A. With this electric XY stage 11, the center of each well 25 can be positioned in order on the observation optical path 10A.
  • the electric XY stage 11 and the microplate 24 are arranged inside the heat retaining container 12.
  • the heat retaining container 12 has an inlet 26 and outlets 27 and 28 provided on a wall of a heat insulating material.
  • the air inlet 26 is arranged on the side, and the air outlets 27 and 28 are arranged on the upper and lower sides along the observation optical path 10A.
  • a sufficient amount of air (temperature: 37 ° C., humidity: 100%, carbon dioxide gas: 5%) is supplied from the air inlet 26 into the heat insulating container 12. For this reason, even if there is some air escaping from the exhaust ports 27 and 28, the inside of the heat retaining container 12 is always kept under a constant condition.
  • the established cell line has a constant cell cycle length under the same conditions (for example, 24 hours).
  • the state of a large number of cells in each well 25 The non-uniformity of the phase appears as, for example, a phase shift in the cell cycle or a time shift in the mitotic phase of the cell cycle.
  • the purpose of keeping the concentration of carbon dioxide constant is to keep the pH of the solution constant
  • thermo insulation container 12 Above the thermal insulation container 12, a pipette device 13 and a transmitted illumination unit (14, 15) are arranged.
  • the pipette device 13 and the transmitted illumination units (14, 15) can be moved, for example, along the X direction by a stage (not shown). Then, the pipette device 13 or the transmitted illumination units (14, 15) are inserted into the observation optical path 10A.
  • FIG. 1 shows a state in which the transmitted illumination units (14, 15) are inserted into the observation optical path 10A.
  • the pipette device 13 is a device for storing a drug (eg, protein acetylcholine) in a specified amount (not shown), and then introducing the drug into the well 25 of the microplate 24.
  • a drug eg, protein acetylcholine
  • the pipette device 13 is inserted into the observation optical path 10A. Then, the drug is introduced into one of the 96 wells 25 of the microplate 24, which is positioned in the observation optical path 10 ⁇ / b> A, through the exhaust port 27 of the heat retaining container 12.
  • the transmitted illumination unit (14, 15) includes a light source 14 and a condenser lens 15, and is inserted into the observation optical path 10A when observing cells by transmitted illumination.
  • the illuminating light from the light source 14 passes through the condenser lens 15 and the exhaust port 27 of the heat retaining container 12, and then, out of the 96 wells 25 of the microplate 24, one well positioned in the observation optical path 10A. It is incident on 25 and illuminates the cells in it.
  • the light transmitted through the cells passes through the exhaust port 28 on the lower side of the heat retaining container 12, and is then guided to the optical microscope unit (20-22).
  • An epi-illumination unit (16-19) is arranged below the heat retaining container 12 in addition to the optical microscope unit (20-22).
  • the epi-illumination unit (16-19) includes a light source 16, an excitation filter 17, a dichroic mirror 18, and a fluorescent filter 19, and is inserted into the observation optical path 10A to observe cells by epi-illumination.
  • the illumination light from the light source 16 is guided to the observation optical path 10A via the excitation filter 17 and the dichroic mirror 18, and passes through the objective lens 20 of the optical microscope section (20-22) and the exhaust port 28 of the thermal insulation container 12.
  • one of the 96 wells 25 of the microplate 24 is incident on one well 25 positioned in the observation optical path 10A to illuminate the cells therein.
  • Epi-illumination In the case of (1), the fluorescent dye previously introduced into the cells is excited by the illumination light. The fluorescent light emitted from the fluorescent dye passes through the exhaust port 28 on the lower side of the heat retaining container 12 again, and is then guided to the optical microscope (20-22).
  • the optical microscope section (20-22) is composed of an objective lens 20, an imaging lens 21, and a camera 22.
  • the light transmitted through the cells in the well 25 by the above-mentioned transmitted illumination enters the camera 22 via the objective lens 20 and the imaging lens 21.
  • the fluorescent light emitted from the cells (fluorescent dye) in the well 25 by the above-mentioned epi-illumination enters the camera 22 via the objective lens 20, the dichroic mirror 18, the fluorescent filter 19, and the imaging lens 21.
  • an enlarged image of the cell is formed on the imaging surface of the camera 22.
  • the camera 22 captures the enlarged image and outputs image data to the computer 23.
  • the computer 23 captures an image of a specimen (including a large number of cells) based on the image data output from the camera 22, and stores the image on the hard disk together with the shooting time. In addition, the computer 23 specifies the timing for capturing images from the camera 22 and
  • a cell observation program that describes a procedure for observing a reaction of a cell with a drug based on the captured image is stored.
  • the computer 23 observes the reaction of the drug-induced cells with reference to the cell observation program stored therein, according to the procedure of the flow chart of FIG. 2 (steps S1 to S5).
  • step S1 the computer 23 transmits the image of the sample by the transmission illumination (14, 15) with the transmission illumination unit (14, 15) inserted into the observation optical path 10A and the pipette device 13 placed outside the observation optical path 10A. (Corresponding to a phase contrast microscope image) intermittently.
  • the microplate 24 is moved in the XY direction by the motorized XY stage 11, and the center of the 96 wells 25 is positioned in the observation optical path 10 A in order, and an image of the specimen is captured in each state. . Then, these images are stored on the hard disk together with the shooting time. Further, when the photographing operation of all the wells 25 of the microplate 24 is completed, the same photographing operation is repeated from the first well 25 in order.
  • the shooting operation in step S 1 is performed continuously for, for example, 24 hours.
  • 720 images in the same field of view are stored in the hard disk of the computer 23 for each well 25 (the shooting interval is 2 minutes).
  • Each image is associated with shooting time information.
  • 24 hours corresponds to the length of the cell cycle. Therefore, a large number of cells in each of the wells 25 divide approximately once while the imaging operation in step S1 is continued.
  • step S1 the 720 images of each well 25 stored on the hard disk are used to identify the mitotic phase (M phase) of each of a large number of cells in the well 25.
  • the mitotic phase is specified in step S4 described below.
  • Step S2 the transmitted illumination unit (14, 15) is retracted from the observation optical path 10A, and the microplate is driven by the electric XY stage 11 with the pipette device 13 inserted into the observation optical path 10A.
  • the computer 23 While moving 24 in the XY direction, the computer 23 introduces the drug from the pipetting device 13 into each of the 96 wells 25 and simultaneously stimulates a large number of cells in each well 25.
  • the type and concentration of the drug may be different in all the wells 25, or the same kind of drug may be introduced into a plurality of wells 25. Further, the drug is not limited to one kind in each well 25, and a plurality of kinds of drugs may be introduced into each well 25 in plural times.
  • the computer 23 records the drug introduction time for each well 25.
  • step S2 since the state of a large number of cells (that is, the timing in the cell cycle) in each well 25 is not uniform, the fact that the drug is introduced at once as in step S2 means that This means that the initial state (state before applying the stimulus) differs for each cell. Cells with different initial states respond differently to drugs (see Figure 4). Cells in the same initial state respond the same to drugs.
  • Step S 3 while moving the microplate 24 in the XY direction by the electric XY stage 11, the computer 23 intermittently captures an image (equivalent to a fluorescent image) of the specimen by epi-illumination. Then, based on these images, the reaction of each of a large number of cells with each drug is detected. Detection of the reaction, for example, the fluorescence imaging power extracted the area of each cell Thereafter, the calculation is performed by calculating the luminance change of each cell region. Response by a drug corresponds to the effect of the drug.
  • Step S4 the computer 23 determines the mitotic phase (M phase) of each of a large number of cells in the well 25 based on the 720 images acquired for each well 25 in Step S1. Is determined, and the elapsed time from each mitosis to drug introduction is calculated. This elapsed time corresponds to a time shift in the division phase (M phase) of each cell, in other words, a phase shift in the cell cycle. It can also be considered as the initial state of each cell (the state before applying the stimulus). In other words, in step S4, the elapsed time from the division period (M phase) of each cell to the introduction of the drug is recognized as the initial state.
  • step S5 When the computer 23 finishes recognizing the elapsed time from the mitotic phase (M phase) of each cell to the introduction of the drug (that is, the initial state of each cell), the computer 23 proceeds to the final step S5, Generates correlation information between the elapsed time (initial state) and the reaction (drug effect) of each cell detected in step S3. Then, the process of observing the reaction by the drug is terminated.
  • a synchronized culture method is used because a large number of cells in each well 25 simultaneously introduce a drug in a heterogeneous state and individually detect a reaction. It is possible to easily examine the correlation between the initial state of the cell and the response.
  • the microplate 24 is used as a sample culture container, the reaction of cells by various types of drugs can be efficiently performed during screening in the process of drug development. Observable.
  • the elapsed time from the division of each cell to the introduction of the drug is initially set.
  • a time lag in the mitotic phase of each cell or a phase lag in the cell cycle may be identified as the initial state.
  • a phase other than the mitosis may be used as a reference.
  • the state of each cell immediately before the stimulus is applied (time in the cell cycle) may be determined as the initial state. In this case, the correlation between the cell cycle and the effect of the drug becomes clear.
  • the characteristic amount relating to the area of the cell is analyzed, but the present invention is not limited to this.
  • a fluorescent reagent such as Dipheny-Hexatriene (DPH)
  • DPH Dipheny-Hexatriene
  • a fluorescent image of the cell membrane is captured by epi-illumination, and the mitotic phase is determined based on its morphological change (that is, shape change). May be specified. The period when the cell membrane is circular is the mitosis.
  • the cell nuclei using specifically stained fluorescent reagent captures the fluorescence image of the cell nuclei by epi-illumination, the shape change force may also be identified mitotic cells.
  • the cell nucleus is oval in the interphase (other than the mitotic phase), but can easily be distinguished at the mitotic phase because it aggregates and becomes smaller.
  • the following characteristics may be recognized as the initial state of the cell (state before stimulation is applied).
  • the amount of calmodulin expressed in each cell may be used as an indicator.
  • Intracellular caspases activated by "interaction between Fas ligand and Fas" by contact with immune cells that cause apoptosis may be detected.
  • the activation of the apoptotic cascade may be detected by detecting an increase or decrease in the p53 protein.
  • a phenomenon that causes an abnormality in a specific hydrolase in the body, such as lysosomal disease, may be detected.
  • the dynamics of the initial endome taken up by endocytosis can be imaged by, for example, incorporating a stained water-soluble substance, and the intracellular accumulation and the like can be determined by observing the fluorescence. be able to.
  • the above is mainly to detect the concentration and form of the fluorescence.
  • the change in the binding substance and the ligand may be detected by detecting a change in the spectrum by FRET (fluorescence energy transfer) or the like, or may be detected by a time-resolved measurement device.
  • the response of each cell was determined from the image information of the fluorescent calcium indicator. Changes in intracellular calcium ion concentration, or changes in membrane potential determined from image information of membrane potential-sensitive dyes, apoptosis determined from image information of caspase-labeled reagents, and changes in intracellular distribution of fluorescently labeled protein kinase , Cell migration, and loss due to cell death.
  • the force of intermittently capturing a plurality of images in order to recognize the initial state of the cell is not limited thereto. Based on one image, the initial state of the cells (the state before applying the stimulus) may be identified.
  • the stimulation was given to each cell by introducing a drug, but the present invention is not limited to this.
  • the present invention is also applicable to a device for observing a cell response to a temperature change stimulus (such as a heat shock protein), a mechanical stimulus (such as a cell stretching stimulus), a light stimulus (such as a photoreceptor cell), or an electrical stimulus. Applicable.
  • the response of the cells is observed by epi-illumination, but the reaction can be observed by transmitted illumination.
  • the pipette device 13 is retracted from the observation optical path 10A, and the transmission illumination section (14, 15) is inserted again into the observation optical path 10A.
  • the number of reactions is limited to one.
  • correlation information between the plurality of reactions and an initial state may be obtained by extracting a plurality of reactions to one stimulus by image information. May be output.
  • the reaction may be a change in intracellular calcium ion concentration obtained from the image information of the fluorescent calcium indicator and apoptosis obtained from the image information of the caspase-labeled reagent.
  • pluripotent cells does not mean only a single type of cell having a different state, but may include a mixture of a plurality of types of cells (eg, glial cells and nerve cells).
  • the cell observation device 10 including the transmission illumination units (14, 15) and the epi-illumination units (16-19) has been described as an example, but the present invention is not limited to this.
  • the present invention can also be applied to a cell observation device provided with either the transmission illumination unit (14, 15) or the epi-illumination unit (16-19).
  • the excitation filter 17, the dichroic mirror 18, and the fluorescence filter 19 are configured to be movable, for example, along the X direction by a stage (not shown) so that the image can be captured by transmitted illumination.
  • the image captured before introducing the drug is read out in step S4 of FIG. 2, and the initial state of the cell is identified, but the present invention is not limited to this.
  • the certification timing of the initial state of the cell may be between step S1 and step S2.
  • the present invention is not limited to the above example, and an electric heater or a steam generator may be installed in the heat insulation container, and the temperature and humidity may be controlled by ON / OFF.
  • the exhaust ports 27 and 28 of the heat retaining container are not limited to the openings, and may be glass windows. In this case, it is preferable that the upper exhaust port 27 can be opened and closed. The glass window of the exhaust port 27 is closed when observation is performed with the transillumination light, and is opened when the drug is introduced by the pipetting device 13.
  • the pipette device for drug introduction is not limited to a device having a single tip, but may be a device having a plurality of tips.
  • the reagent can be simultaneously introduced into a plurality of wells of the microplate.
  • the present invention is not limited to the above example.
  • Two tubes are introduced into a cell culture solution, a culture solution containing a drug is introduced from one of the tubes, and the surplus from the other is introduced.
  • a configuration is conceivable in which the culture solution is sucked.
  • a petri dish may be used as a culture vessel for specimens.

Abstract

　本発明は、同調培養法を用いることなく簡単に細胞の初期状態と反応との相関関係を調べることを目的とする。そのため、複数の細胞を含む標本の画像を取り込む画像取込手段１４～２３と、複数の細胞に所定の刺激を与える刺激手段１３と、刺激手段が刺激を与える前に画像取込手段が取り込んだ画像に基づいて、複数の細胞の各々の初期状態を認定する認定手段２３と、刺激手段が刺激を与えた後に画像取込手段が取り込んだ画像に基づいて、刺激による複数の細胞の各々の反応を検出する検出手段２３と、複数の細胞の各々の初期状態と反応との相関情報を生成する生成手段２３とを備える。                                                                             

Description

明 細 書
細胞観察装置および細胞観察方法
技術分野
[0001] 本発明は、細胞の反応を観察する細胞観察装置および細胞観察方法に関し、特 に、医薬品の開発過程におけるスクリーニングに好適な細胞観察装置などに関する 背景技術
[0002] 周知の同調培養法 (例えば非特許文献 1参照）を用いて多数の細胞を培養すること により、これら多数の細胞の状態 (例えば細胞周期の分裂期のタイミング)を均一化し て、薬物を導入するなどの刺激を与え、細胞の反応を観察することが行われている。 この方法によれば、多数の細胞の平均的な反応を観察できる。
非特許文献 1： Weimer R, Haaf T, Kruger J, Poot M, Schmid M.「Characterization of centromere arrangements and test for random distribution in G0,Gl,S,G2,Gl,and early S' phase in human lymphocytes.」 Human Genetics 88:673-682(1992) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] し力しながら、上記した同調培養法は、その作業が非常に煩雑であった。また、多 数の細胞の初期状態 (例えば刺激を与える直前の状態）と反応との相関関係を調べ ようとすると、細胞の初期状態が異なる多種類の標本を同調培養法により用意しなけ ればならず、膨大な労力と時間が必要となってしまう。
ここで、本発明者らが行った実験について説明する。この実験は、従来の手法を組 み合わせて多数の細胞の初期状態と反応との相関関係を調べたものである。まず、 同調培養法により、多種類の標本を用意する。つまり、対数増幅期にある細胞懸濁 液を濃度が 5 X 105 cells/mlとなるように調整し、最終濃度 (細胞の種類によって異な る）が 0.5— 2.5mMとなるようにチミジン液をカ卩え、 COインキュベータ内で 16— 24
2
時間培養する。この操作により、標本内の多数の細胞は、細胞周期のギャップ期 (G1 期)/ DNA合成期 (S期)の境界と S期に同調する。次に、細胞培養上清 (上澄み)を遠 心分離によって除き、培養液に戻して 15時間培養する。この操作により、標本内の 多数の細胞は、ギャップ期 (G2期)/分裂期 (M期)の境界に進行する。さらに、最終濃 度が 0.5— 2.5mMとなるようにチミジン液をカ卩え、 COインキュベータ内で 16— 24時
2
間培養する。この操作により、標本内の多数の細胞は、 G1期/ S期の境界に同調す る。なお、標本内の多数の細胞が細胞周期の何れの時期に同調したかの確認は、細 胞を propidium iodide(PI)染色した後、周知の Flow Cytometry法を用いて、細胞ごと の DNA量を測定することにより行えばよい。本発明者らは、上記のようにして、細胞 の初期状態 (ここでは細胞周期の中の時期）が異なる多種類の標本を用意した。
[0004] そして、多種類の標本の各々にお!/、て、細胞表面のイオンチャネルの発現量を測 定した。イオンチャネルは、カルシウム活性化カリウムチャネルのうち、小コンダクタン ス（SK)のタイプ 2である。測定は、抗 SK2チャネル抗体を用いた周知の Western blot法により行った。測定結果を図 4に示す。図 4の横軸は時間 (time)であり、細胞 周期の G1期の開始時間を 0として、 S期と G2期/ M期の各々の時間が分力るように なっている。図 4の縦軸は、イオンチャネルの発現量を相対的な分布密度 (relative density)で表したものである。この測定結果から、イオンチャネルの発現量は、細胞周 期の中の時期によって増減することが判明した。一般に、イオンチャネルの発現量と 細胞の反応 (この場合は細胞膜電位変化）は相関しているため、上記の測定結果は 、細胞の反応が細胞周期の中の時期によって変化することを意味している。具体的 には、 SK2チャネルの場合、 G1期では反応性が高ぐ S期と G2期/ M期では反応性 が低くなる。
[0005] このように、従来の手法を用いて細胞の初期状態と反応との相関関係（例えば図 4) を調べるためには、細胞の初期状態が異なる多種類の標本を同調培養法により用意 しなければならず、膨大な労力と時間が必要であった。
本発明の目的は、同調培養法を用いることなく簡単に細胞の初期状態と反応との 相関関係を調べることができる細胞観察装置および細胞観察方法を提供することに める。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明の細胞観察装置は、複数の細胞を含む標本の画像を取り込む画像取込手 段と、前記複数の細胞に所定の刺激を与える刺激手段と、前記刺激手段が前記刺 激を与える前に前記画像取込手段が取り込んだ前記画像に基づいて、前記複数の 細胞の各々の初期状態を認定する認定手段と、前記刺激手段が前記刺激を与えた 後に前記画像取込手段が取り込んだ前記画像に基づいて、前記刺激による前記複 数の細胞の各々の反応を検出する検出手段と、前記複数の細胞の各々の前記初期 状態と前記反応との相関情報を生成する生成手段とを備えたものである。
[0007] 好ましくは、前記認定手段は、前記刺激手段が前記刺激を与える前に前記画像取 込手段が順に取り込んだ複数の前記画像を参照し、前記複数の細胞の各々の形態 変化に基づいて、前記複数の細胞の各々の初期状態を認定するものである。
また、好ましくは、前記認定手段は、前記複数の細胞の各々の細胞周期に連動し た形態変化に基づいて、前記複数の細胞の各々の初期状態を認定するものである。
[0008] また、好ましくは、前記認定手段は、前記刺激手段が前記刺激を与える直前の前 記複数の細胞の各々の状態を前記初期状態として認定するものである。
また、好ましくは、前記認定手段は、前記複数の細胞の各々の前記細胞周期の位 相ずれを前記初期状態として認定するものである。
さらに、本発明の細胞観察装置は、複数の細胞を含む標本の画像を取り込む画像 取込手段と、前記複数の細胞に所定の刺激を与える刺激手段と、前記刺激手段が 前記刺激を与える前に前記画像取込手段が順に取り込んだ複数の前記画像を参照 し、前記複数の細胞の各々の細胞周期に連動した形態変化に基づいて、前記複数 の細胞の各々の分裂期を特定し、該分裂期から前記刺激手段が前記刺激を与える までの経過時間を前記複数の細胞の各々で算出する算出手段と、前記刺激手段が 前記刺激を与えた後に前記画像取込手段が取り込んだ前記画像に基づ 、て、前記 刺激による前記複数の細胞の各々の反応を検出する検出手段と、前記複数の細胞 の各々の前記経過時間と前記反応との相関情報を生成する生成手段とを備えたも のである。
[0009] また、本発明の細胞観察方法は、複数の細胞に対して所定の刺激を与える前に、 前記複数の細胞を含む標本の画像を取り込む第 1工程と、前記複数の細胞に前記 刺激を与える第 2工程と、前記第 2工程の後に、前記標本の画像を取り込み、該画像 に基づいて、前記刺激による前記複数の細胞の各々の反応を検出する第 3工程と、 前記第 1工程で取り込んだ前記画像に基づいて、前記複数の細胞の各々の初期状 態を認定し、該初期状態と前記反応との相関情報を生成する第 4工程とを備えたも のである。
[0010] 好ましくは、前記第 1工程では、複数の前記画像を順に取り込み、前記第 4工程で は、前記複数の画像を参照し、前記複数の細胞の各々の形態変化に基づいて、前 記複数の細胞の各々の初期状態を認定するものである。
また、好ましくは、前記第 4工程では、前記複数の細胞の各々の細胞周期に連動し た形態変化に基づいて、前記複数の細胞の各々の初期状態を認定するものである。
[0011] また、好ましくは、前記第 4工程では、前記刺激を与える直前の前記複数の細胞の 各々の状態を前記初期状態として認定するものである。
また、好ましくは、前記第 4工程では、前記複数の細胞の各々の前記細胞周期の位 相ずれを前記初期状態として認定するものである。
さらに、本発明の細胞観察方法は、複数の細胞に対して所定の刺激を与える前に 、前記複数の細胞を含む標本の複数の画像を順に取り込む第 1工程と、前記複数の 細胞に前記刺激を与える第 2工程と、前記第 2工程の後に、前記標本の画像を取り 込み、該画像に基づいて、前記刺激による前記複数の細胞の各々の反応を検出す る第 3工程と、前記第 1工程で取り込んだ前記複数の画像を参照し、前記複数の細 胞の各々の細胞周期に連動した形態変化に基づいて、前記複数の細胞の各々の分 裂期を特定し、該分裂期から前記刺激を与えるまでの経過時間を前記複数の細胞 の各々で算出し、該経過時間と前記反応との相関情報を生成する第 4工程とを備え たものである。
発明の効果
[0012] 本発明によれば、同調培養法を用いることなく簡単に細胞の初期状態と反応との相 関関係を調べることができる。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]細胞観察装置 10の全体構成を示す図である。
[図 2]細胞の反応の観察手順を示すフローチャートである。 [図 3]細胞周期に連動した形態変化を示す概略図である。
[図 4]従来の手法を用いて細胞の初期状態と反応との相関関係を調べた結果である 発明を実施するための最良の形態
[0014] 以下、図面を用いて本発明の実施形態を詳細に説明する。
本実施形態の細胞観察装置 10は、図 1に示すように、電動 XYステージ 11と、保温 容器 12と、ピペット装置 13と、透過照明部 (14,15)と、落射照明部 (16— 19)と、光学 顕微鏡部 (20— 22)と、コンピュータ 23とで構成されている。電動 XYステージ 11には 、例えば透明ポリスチレン製で 96個のゥエル 25を有するマイクロプレート 24が載置さ れている。
[0015] マイクロプレート 24の各々のゥエル 25の中には、多数の細胞（生細胞）を含む標本 が入っている。細胞は、ゥエル 25の底部に沈んでいる。ここで、ゥエル 25の中の細胞 の培養は、周知の同調培養法のような煩雑な作業を伴う方法ではなぐ一般的で簡 易な方法により行われる。このため、各々のゥエル 25の中で、多数の細胞の状態（例 えば細胞周期の分裂期 (M期)のタイミング）は、不均一となっている。
[0016] 電動 XYステージ 11は、マイクロプレート 24を XY方向に移動させて、 96個のゥェ ル 25のうち何れか 1つを観察光路 10Aに位置決めする機構である。この電動 XYス テージ 11により、各々のゥエル 25の中心部を観察光路 10Aに順に位置決めすること ができる。本実施形態の細胞観察装置 10では、電動 XYステージ 11とマイクロプレ ート 24とが保温容器 12の内部に配置される。
[0017] 保温容器 12は、断熱材料の壁に吸気口 26と排気口 27,28とを設けたものである。
吸気口 26は側方に配置され、排気口 27,28は観察光路 10Aに沿って上側と下側に 配置される。保温容器 12の内部には、吸気口 26から十分な量の空気 (温度 37°C, 湿度 100%,炭酸ガス 5%)が供給される。このため、排気口 27,28から逃げる空気 が多少あっても、保温容器 12の内部は常に一定の条件に保たれる。
[0018] したがって、マイクロプレート 24のゥエル 25の中の細胞を一定の条件で観察するこ とができる。なお、株化した培養細胞は、同じ条件下において、細胞周期の長さが一 定になる（例えば 24時間）。この場合、各々のゥエル 25の中で、多数の細胞の状態 の不均一性は、例えば細胞周期の位相ずれや、細胞周期のうち分裂期の時間ずれ となって現れる。炭酸ガス濃度を一定にするのは溶液の pHを一定にするためである
[0019] 保温容器 12の上側には、ピペット装置 13と透過照明部 (14, 15)が配置されている。
ピペット装置 13と透過照明部 (14, 15)は、不図示のステージにより例えば X方向に沿 つて移動可能である。そして、ピペット装置 13または透過照明部 (14, 15)が、観察光 路 10Aに挿入される。図 1には、透過照明部 (14,15)が観察光路 10Aに挿入された 状態を示す。
[0020] ピペット装置 13は、不図示の薬物保管ゥェルカ 規定量の薬物（蛋白ゃァセチル コリンなど）を吸い上げた後、その薬物をマイクロプレート 24のゥエル 25の中に導入 する装置である。ピペット装置 13による薬物導入の際、観察光路 10Aにはピペット装 置 13が挿入される。そして、マイクロプレート 24の 96個のゥエル 25のうち、観察光路 10Aに位置決めされた 1つのゥエル 25に、保温容器 12の排気口 27を介して薬物が 導入される。
[0021] 透過照明部 (14,15)は、光源 14とコンデンサレンズ 15とで構成され、透過照明によ り細胞を観察する際、観察光路 10Aに挿入される。このとき、光源 14からの照明光は 、コンデンサレンズ 15と保温容器 12の排気口 27を介した後、マイクロプレート 24の 9 6個のゥエル 25のうち、観察光路 10Aに位置決めされた 1つのゥエル 25に入射して 、その中の細胞を照明する。なお、細胞を透過した光は、保温容器 12の下側の排気 口 28を通過した後、光学顕微鏡部 (20— 22)に導かれる。
[0022] 保温容器 12の下側には、光学顕微鏡部 (20— 22)の他に、落射照明部 (16— 19) が配置されている。落射照明部 (16— 19)は、光源 16と励起フィルタ 17とダイクロイツ クミラー 18と蛍光フィルタ 19とで構成され、落射照明により細胞を観察するために、 観察光路 10Aに挿入されて 、る。
このとき、光源 16からの照明光は、励起フィルタ 17とダイクロイツクミラー 18を介して 観察光路 10Aに導かれ、光学顕微鏡部 (20— 22)の対物レンズ 20と保温容器 12の 排気口 28を介した後、マイクロプレート 24の 96個のゥエル 25のうち、観察光路 10A に位置決めされた 1つのゥエル 25に入射して、その中の細胞を照明する。落射照明 の場合、細胞に予め導入された蛍光色素が照明光により励起される。なお、蛍光色 素から放射された蛍光は、再び保温容器 12の下側の排気口 28を通過した後、光学 顕微鏡部 (20— 22)に導かれる。
[0023] 光学顕微鏡部 (20— 22)は、対物レンズ 20と結像レンズ 21とカメラ 22とで構成され る。上記の透過照明によりゥエル 25の中の細胞を透過した光は、対物レンズ 20と結 像レンズ 21を介してカメラ 22に入射する。上記の落射照明によりゥエル 25の中の細 胞 (蛍光色素）から放射された蛍光は、対物レンズ 20とダイクロイツクミラー 18と蛍光 フィルタ 19と結像レンズ 21を介してカメラ 22に入射する。何れの場合にも、カメラ 22 の撮像面には細胞の拡大像が形成される。カメラ 22は、この拡大像を撮像し、画像 データをコンピュータ 23に出力する。
[0024] コンピュータ 23は、カメラ 22から出力される画像データに基づいて、標本（多数の 細胞を含む）の画像を取り込み、この画像を撮影時間と共にハードディスクに記憶さ せる。なお、コンピュータ 23には、カメラ 22から画像を取り込むタイミングを指定したり
、取り込んだ画像に基づ 、て薬物による細胞の反応を観察する手順を記載した細胞 観察プログラムが格納されて 、る。
[0025] 次に、本実施形態の細胞観察装置 10の動作を説明する。コンピュータ 23は、内部 に格納された細胞観察プログラムを参照しながら、図 2のフローチャート (ステップ S1 一 S5)の手順にしたがって、薬物による細胞の反応の観察を行う。
まず (ステップ S1)、透過照明部 (14,15)が観察光路 10Aに挿入され、ピペット装置 13が観察光路 10Aの外に配置された状態で、コンピュータ 23は、透過照明による標 本の画像 (位相差顕微鏡画像に相当）を間欠的に取り込む。
[0026] 具体的には、電動 XYステージ 11によりマイクロプレート 24を XY方向に移動させて 、 96個のゥエル 25の中央部を順に観察光路 10Aに位置決めし、各々の状態で標本 の画像を取り込む。そして、これらの画像を撮影時間と共にハードディスクに記憶させ る。さらに、マイクロプレート 24の全てのゥエル 25の撮影動作が一通り終了すると、再 び 1つ目のゥエル 25から順に同じ撮影動作を繰り返す。 96個のゥエル 25の撮影動 作を繰り返し行うことにより、各々のゥエル 25の同一視野内の画像を間欠的に（例え ば 2分おきに）取り込むことができる。 [0027] 本実施形態では、ステップ S 1の撮影動作を例えば 24時間継続して行う。その結果 、コンピュータ 23のハードディスクには、各々のゥエル 25ごとに、同一視野内の画像 が例えば 720枚蓄積される (撮影間隔は 2分)。各々の画像には撮影時間の情報が 対応づけられている。なお、 24時間とは細胞周期の長さに相当する。このため、各々 のゥエル 25の中の多数の細胞は、ステップ S1の撮影動作を継続している間に、約 1 回ずつ分裂することになる。
[0028] 上記したように、各々のゥエル 25の中で、多数の細胞の状態は不均一であり、各々 の細胞の分裂のタイミングも不均一である（つまり時間ずれがある)。ステップ S1の結 果、ハードディスクに蓄積された各ゥエル 25ごとの 720枚の画像は、ゥエル 25の中の 多数の細胞の各々の分裂期 (M期)を特定するために用いられる。分裂期の特定は、 後述のステップ S4で行う。
[0029] 次に (ステップ S2)、透過照明部 (14,15)を観察光路 10Aから退避させ、ピペット装 置 13を観察光路 10Aに挿入させた状態で、電動 XYステージ 11によりマイクロプレ ート 24を XY方向に移動させながら、コンピュータ 23は、ピペット装置 13から 96個の ゥエル 25の各々の中に薬物を導入し、各ゥエル 25の中の多数の細胞に一括で刺激 を与える。薬物の種類や濃度は、全てのゥエル 25で異なってもいいし、同一種類の 薬物を複数のゥエル 25に導入してもよい。また、薬物は、各ゥエル 25に 1種類とは限 らず、各ゥエル 25に複数の種類の薬物を複数回に分けて導入してもよい。コンビュ ータ 23は、各ゥエル 25ごとに、薬物の導入時間を記録する。
[0030] ここで、各々のゥエル 25の中で多数の細胞の状態（つまり細胞周期の中の時期）は 不均一なため、ステップ S2のように一括で薬物が導入されるということは、各々の細 胞ごとに、初期状態 (刺激を与える前の状態)が異なることを意味する。なお、初期状 態が異なる細胞どうしは、薬物による反応も異なる（図 4参照)。初期状態が同じ細胞 どうしは、薬物による反応も同じである。
[0031] 次に（ステップ S3)、電動 XYステージ 11によりマイクロプレート 24を XY方向に移動 させながら、コンピュータ 23は、落射照明による標本の画像 (蛍光画像に相当）を間 欠的に取り込む。そして、これらの画像に基づいて、多数の細胞の各々の薬物による 反応を検出する。反応の検出は、例えば蛍光画像力 各々の細胞の領域を抽出した 後、各々の細胞の領域の輝度変化を計算することにより行われる。薬物による反応と は、薬物の効果に相当する。
[0032] 次に（ステップ S4)、コンピュータ 23は、ステップ S1で各ゥエル 25ごとに取得した 7 20枚の画像に基づいて、ゥエル 25の中の多数の細胞の各々の分裂期 (M期)を特定 し、各々の分裂期から薬物導入までの経過時間を算出する。この経過時間は、各々 の細胞の分裂期 (M期)の時間ずれに相当し、換言すれば、細胞周期の位相ずれに 相当する。また、各々の細胞の初期状態 (刺激を与える前の状態）と考えることもでき る。つまり、ステップ S4では、各々の細胞の分裂期 (M期)から薬物導入までの経過時 間が初期状態として認定されたことになる。
[0033] ここで、分裂期 (M期)を特定するための画像処理について説明する。一般に、個々 の細胞は、細胞周期の中で図 3のような形態変化を示す。つまり、分裂していないと きは広がっている力 分裂期には、略円形状となって面積が小さくなる。このように、 細胞周期に連動した形態変化（図 3)のうち分裂期が最も他と区別しやすいため、細 胞の面積に関する特徴量を画像処理ソフトによって解析することで、細胞の分裂期を 容易に特定できる。ただし、細胞の面積に関する特徴量を求める前に、画像から各 々の細胞の領域を抽出することが必要となる。
[0034] コンピュータ 23は、各々の細胞の分裂期 (M期)から薬物導入までの経過時間（つま り各々の細胞の初期状態）を認定し終えると、最後のステップ S5に進み、各々の細胞 の経過時間（初期状態）と、ステップ S3で検出した各々の細胞の反応 (薬物の効果） との相関情報を生成する。そして、薬物による反応の観察処理を終了する。
このように、本実施形態の細胞観察装置 10によれば、各ゥエル 25内の多数の細胞 が不均一な状態で同時に薬物を導入して個別に反応を検出するため、同調培養法 を用いることなく簡単に細胞の初期状態と反応との相関関係を調べることができる。
[0035] また、本実施形態の細胞観察装置 10によれば、標本の培養容器としてマイクロプ レート 24を用いるため、医薬品の開発過程におけるスクリーニングの際、多種類の薬 物による細胞の反応を効率よく観察できる。
(変形例）
上記した実施形態では、各々の細胞の分裂期から薬物導入までの経過時間を初 期状態として認定したが、本発明はこれに限定されない。その他、各々の細胞の分 裂期の時間ずれか、細胞周期の位相ずれを初期状態として認定してもよい。位相ず れを初期状態として認定する場合、分裂期以外の時期を基準にしてもよい。さらに、 刺激を与える直前の各々の細胞の状態 (細胞周期の中の時期）を初期状態として認 定してもよい。この場合、細胞周期と薬物の効果との相関関係が明確になる。
[0036] また、上記した実施形態では、細胞の分裂期を特定する際、細胞の面積に関する 特徴量を解析したが、本発明はこれに限定されない。その他、細胞膜を特異的に染 色する蛍光試薬 (Dipheny-Hexatriene (DPH)など）を使用して、落射照明により細胞 膜の蛍光画像を取り込み、その形態変化 (つまり形状変化）に基づいて分裂期を特 定してもよい。細胞膜が円形状の時期が分裂期である。他に、細胞核を特異的に染 色する蛍光試薬 (H0echst33342)を使用して、落射照明により細胞核の蛍光画像を 取り込み、その形状変化力も分裂期の細胞を同定してもよい。細胞核は、間期（分裂 期以外）には長円型であるが、分裂期になると凝集して小さくなるので、容易に判別 できる。
[0037] さらに、上記のような細胞周期に関わるパラメータ (例えば経過時間など）に限らず 、次のような特徴を細胞の初期状態 (刺激を与える前の状態）として認定してもよ 、。 例えば、各々の細胞で発現したカルモジュリン量 (GFP標識したカルモジュリン)を指 標にしてもよい。アポトーシス (apoptosis)を生じるような免疫細胞との接触による「Fasリ ガンドと Fasとの相互作用」によって活性ィ匕される細胞内カスパーゼを検出してもよい。 p53蛋白質の増減を検出することにより、アポトーシスカスケードの起動を検出しても よい。リソソーム病のように体内の特定の加水分解酵素に異常が生じるような現象を 検出してもよい。この場合、染色された水溶性物質を取り込ませることなどにより、ェ ンドサイト一シスにより取り込まれた初期エンドノームの動態を画像ィ匕し、それらの蛍 光観察により細胞内への蓄積などを知ることができる。上記は蛍光の濃度や形態な どを検出することが主となる。結合物質とリガンドの変化の検出には、 FRET (蛍光ェ ネルギー移動）などによるスペクトル変化の検出を用いても、時間分解測定装置によ り蛍光寿命の変化を検出してもよい。
[0038] さらに、個々の細胞の反応の中には、蛍光カルシウム指示薬の画像情報から求め られる細胞内カルシウムイオン濃度の変化、または、膜電位感受性色素の画像情報 から求められる膜電位の変化、カスパーゼ標識試薬の画像情報カゝら求められるアポ トーシス、蛍光標識した蛋白質キナーゼの細胞内分布変化、細胞の移動、細胞の死 滅による消失が含まれる。
また、上記した実施形態では、細胞の初期状態 (刺激を与える前の状態)を認定す るために、複数の画像を間欠的に取り込んだ力 本発明はこれに限定されない。 1枚 の画像に基づ 、て細胞の初期状態 (刺激を与える前の状態)を認定してもよ 、。
[0039] さらに、上記した実施形態では、薬物を導入することにより、各々の細胞に刺激を与 えたが、本発明はこれに限定されない。その他、温度変化刺激 (ヒートショックプロテ インなど)、機械的刺激 (細胞の伸縮刺激など)、光刺激 (視細胞など)、電気刺激な どによる細胞の反応を観察する装置にも、本発明は適用できる。
また、上記した実施形態では、落射照明によって細胞の反応を観察したが、透過照 明によって反応を観察することもできる。この場合には、刺激を与えた後、ピペット装 置 13を観察光路 10Aカゝら退避させ、透過照明部 (14, 15)を再び観察光路 10Aに挿 人させること〖こなる。
[0040] さらに、上記した実施形態では、反応を 1種類に限ったが、 1つの刺激に対する複 数の反応を画像情報力 抽出してもよぐこれら複数の反応と初期状態との相関情報 を出力してもよい。例えば、反応としては、蛍光カルシウム指示薬の画像情報から求 められる細胞内カルシウムイオン濃度の変化と、カスパーゼ標識試薬の画像情報か ら求められるアポトーシスでもよい。
[0041] また、複数の細胞とは、 1種類の細胞で状態が異なるものだけを示すのではなぐ 複数種の細胞 (例えばグリア細胞と神経細胞）が混在してものでもよ ヽ。
さらに、上記した実施形態では、透過照明部 (14,15)と落射照明部 (16— 19)とを備 えた細胞観察装置 10を例に説明したが、本発明はこれに限定されない。透過照明 部 (14,15)と落射照明部 (16— 19)との何れか一方を備えた細胞観察装置にも本発 明を適用できる。また、落射照明部 (16— 19)のうち、励起フィルタ 17とダイクロイツク ミラー 18と蛍光フィルタ 19を不図示のステージにより例えば X方向に沿って移動可 能に構成し、透過照明による画像取り込み時に観察光路 10Aの外に退避させもよい [0042] また、上記した実施形態では、薬物を導入する前に取り込んだ画像を図 2のステツ プ S4で読み出し、細胞の初期状態を認定したが、本発明はこれに限定されない。細 胞の初期状態の認定タイミングは、ステップ S1とステップ S2の間でも構わな 、。 さらに、保温容器 12内の条件を一定にするためには、上記例に限らず、電熱器や 蒸気発生装置を保温容器内に設置し、その ON/OFFによって温度湿度を制御して もよい。炭酸ガス濃度を一定にする他の方法としては、電磁弁を通じて炭酸ガスを供 給し、電磁弁の開閉により炭酸ガス濃度を制御することが考えられる。
[0043] また、保温容器の排気口 27,28は、開口部に限らず、ガラス窓としてもよい。この場 合、上側の排気口 27は開閉可能とすることが好ましい。排気口 27のガラス窓は、透 過照明での観察時に閉めておき、ピペット装置 13で薬物を導入するときには開放さ れる。
また、薬物導入用のピペット装置は、単一先端を持つ装置に限らず、複数先端を持 つ装置でもよい。この場合、マイクロプレートの複数のゥエルに同時に試薬を導入で きる。
[0044] さらに、薬物を導入するためには、上記例に限らず、細胞培養液中に 2本の管を揷 入し、一方から薬物の混入した培養液を導入し、他方カゝら余剰の培養液を吸引する 構成が考えられる。また、マイクロプレート 24に代えてシャーレを標本の培養容器とし て用いてもよい。

Claims

請求の範囲
[1] 複数の細胞を含む標本の画像を取り込む画像取込手段と、
前記複数の細胞に所定の刺激を与える刺激手段と、
前記刺激手段が前記刺激を与える前に前記画像取込手段が取り込んだ前記画像 に基づいて、前記複数の細胞の各々の初期状態を認定する認定手段と、 前記刺激手段が前記刺激を与えた後に前記画像取込手段が取り込んだ前記画像 に基づいて、前記刺激による前記複数の細胞の各々の反応を検出する検出手段と、 前記複数の細胞の各々の前記初期状態と前記反応との相関情報を生成する生成 手段とを備えた
ことを特徴とする細胞観察装置。
[2] 請求項 1に記載の細胞観察装置において、
前記認定手段は、前記刺激手段が前記刺激を与える前に前記画像取込手段が順 に取り込んだ複数の前記画像を参照し、前記複数の細胞の各々の形態変化に基づ いて、前記複数の細胞の各々の初期状態を認定する
ことを特徴とする細胞観察装置。
[3] 請求項 2に記載の細胞観察装置において、
前記認定手段は、前記複数の細胞の各々の細胞周期に連動した形態変化に基づ いて、前記複数の細胞の各々の初期状態を認定する
ことを特徴とする細胞観察装置。
[4] 請求項 2または請求項 3に記載の細胞観察装置にぉ 、て、
前記認定手段は、前記刺激手段が前記刺激を与える直前の前記複数の細胞の各 々の状態を前記初期状態として認定する
ことを特徴とする細胞観察装置。
[5] 請求項 3に記載の細胞観察装置において、
前記認定手段は、前記複数の細胞の各々の前記細胞周期の位相ずれを前記初期 状態として認定する
ことを特徴とする細胞観察装置。
[6] 複数の細胞を含む標本の画像を取り込む画像取込手段と、 前記複数の細胞に所定の刺激を与える刺激手段と、
前記刺激手段が前記刺激を与える前に前記画像取込手段が順に取り込んだ複数 の前記画像を参照し、前記複数の細胞の各々の細胞周期に連動した形態変化に基 づいて、前記複数の細胞の各々の分裂期を特定し、該分裂期から前記刺激手段が 前記刺激を与えるまでの経過時間を前記複数の細胞の各々で算出する算出手段と 前記刺激手段が前記刺激を与えた後に前記画像取込手段が取り込んだ前記画像 に基づいて、前記刺激による前記複数の細胞の各々の反応を検出する検出手段と、 前記複数の細胞の各々の前記経過時間と前記反応との相関情報を生成する生成 手段とを備えた
ことを特徴とする細胞観察装置。
[7] 複数の細胞に対して所定の刺激を与える前に、前記複数の細胞を含む標本の画 像を取り込む第 1工程と、
前記複数の細胞に前記刺激を与える第 2工程と、
前記第 2工程の後に、前記標本の画像を取り込み、該画像に基づいて、前記刺激 による前記複数の細胞の各々の反応を検出する第 3工程と、
前記第 1工程で取り込んだ前記画像に基づいて、前記複数の細胞の各々の初期 状態を認定し、該初期状態と前記反応との相関情報を生成する第 4工程とを備えた ことを特徴とする細胞観察方法。
[8] 請求項 7に記載の細胞観察方法にお 、て、
前記第 1工程では、複数の前記画像を順に取り込み、
前記第 4工程では、前記複数の画像を参照し、前記複数の細胞の各々の形態変化 に基づいて、前記複数の細胞の各々の初期状態を認定する
ことを特徴とする細胞観察方法。
[9] 請求項 8に記載の細胞観察方法にぉ 、て、
前記第 4工程では、前記複数の細胞の各々の細胞周期に連動した形態変化に基 づいて、前記複数の細胞の各々の初期状態を認定する
ことを特徴とする細胞観察方法。
[10] 請求項 8または請求項 9に記載の細胞観察方法にぉ 、て、
前記第 4工程では、前記刺激を与える直前の前記複数の細胞の各々の状態を前 記初期状態として認定する
ことを特徴とする細胞観察方法。
[11] 請求項 9に記載の細胞観察方法において、
前記第 4工程では、前記複数の細胞の各々の前記細胞周期の位相ずれを前記初 期状態として認定する
ことを特徴とする細胞観察方法。
[12] 複数の細胞に対して所定の刺激を与える前に、前記複数の細胞を含む標本の複 数の画像を順に取り込む第 1工程と、
前記複数の細胞に前記刺激を与える第 2工程と、
前記第 2工程の後に、前記標本の画像を取り込み、該画像に基づいて、前記刺激 による前記複数の細胞の各々の反応を検出する第 3工程と、
前記第 1工程で取り込んだ前記複数の画像を参照し、前記複数の細胞の各々の細 胞周期に連動した形態変化に基づいて、前記複数の細胞の各々の分裂期を特定し 、該分裂期から前記刺激を与えるまでの経過時間を前記複数の細胞の各々で算出 し、該経過時間と前記反応との相関情報を生成する第 4工程とを備えた
ことを特徴とする細胞観察方法。
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