JP2003504195A - 磁性粒子を流体と混合するための装置および方法 - Google Patents
磁性粒子を流体と混合するための装置および方法Info
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Abstract
Description
)常磁性粒子を流体と効率的に混合する方法、および磁性粒子を流体から分離し
、続いて任意選択で、粒子を別の流体に再懸濁させる方法に関する。
生物検定法および精製法がある。例えば、免疫検定法、核酸のハイブリッド形成
検定法などである。
それらを分離することもできる。磁性粒子を使用して混合物からある成分を分離
できるのは、例えば磁性粒子が、その成分に特異的な親和力を有する試薬でコー
ティングされているためである。
し、任意選択で別の流体に置き換えることができる。特定の成分をその中から取
り出す流体と磁性粒子を混合することができ、その成分は磁性粒子に結合し、成
分と結合した粒子を、磁石を使用して流体中の残りの混合物から分離することが
できる。任意選択で、磁性粒子を洗浄すること、および別の流体中で分離させる
ことができる。あるいは、その成分を磁性粒子から再び別の流体中に取り出すこ
とができる。
知られている。
o)およびWO96/41811(Boehringer Mannheim)
に記載されている。これらの出願には、核酸を含む試料溶液をカオトロピックな
物質で処理して核酸を解放する方法が記載されている。溶菌緩衝液中の生物学的
実体からNAを解放した後、NAを磁性粒子に結合させる。
試料に含まれる全てのNAの一般的な結合を与える金属酸化物コーティング(例
えばシリカ)を有する粒子の両方が使用される。ターゲットを結合させた後、洗
浄緩衝液(または一連の洗浄緩衝液)中で磁性粒子を洗浄することによって、細
胞の破片、酵素、タンパク質、抗凝結剤、塩などの妨害成分を除去する。最後に
、小体積の溶離緩衝液中で粒子を混合することによって、精製されたNAを粒子
から解放する。粒子から核酸が溶離されるので、このプロセスは溶離と呼ばれる
。
関連緩衝液と十分に混合される必要がある。この洗浄および溶離プロセスは一般
に、溶菌試料中の特定の成分(例えばゲノムDNA)の磁性粒子への吸着、また
は粒子中に誘起された残留磁気双極子場によって生じた磁性粒子の凝集またはク
ロッギング(clogging)によって妨害される。具体的には、シリカでコ
ーティングした(磁性)粒子を、かなりの量のゲノムDNA(全血、唾液、組織
)を含む試料とともに使用すると、処理が難しい目の詰まったペレットが生じる
。
ng)、音波法(sonification)またはピペット法(pipett
ing)である。しかしこれらの方法は自動化が難しく、かつ/またはエーロゾ
ル発生による試料間汚染の危険があり、またはNAターゲットを劣化させる可能
性がある。さらにこれらの方法は、溶離プロセスで必要となるようなごく小体積
の液体(一般に0.01ml)に対してはあまり適していない。
をいくらか純粋な形で分離し、以降の使用に適したより小体積の別の流体中に濃
縮する分離手順とともに使用するのに特に適している。
出のための検定、あるいはその両方である。
Diatec instruments)に開示されている。
これを再懸濁させることが開示されている。第1および第2の磁場の適用は、粒
子を含む容器の周りを別の位置に回転する同じ磁石で提供することができる。た
だし、離隔した対向する2つの電磁石を使用することもできる。これらの電磁石
に交互に通電して第1および第2の磁場を作り出し、これらの磁場が粒子を懸濁
状態に保ち、粒子を含む流体と粒子とを混合する。
の中を容器の壁に沿って移動させることができる。このようにすれば粒子を液体
の外に移動させることもでき、第2の容器に移すこともできる。
記載されている。これらのタイプの検定は、例えばマイクロタイタープレートで
実行することができる。磁性微粒子は、マイクロタイタープレートのそれぞれの
ウェルの中に存在する。この装置は複数のオリフィスを有し、それぞれのオリフ
ィスの周囲には複数、好ましくは4つの永久磁石がある。この磁石/オリフィス
構造は固定式である。すなわち、磁石は、動かすことを想定しておらず、磁石自
体および装置のベースに対して固定されて取り付けられている。全ての磁石は整
列しており、磁石の場の方向は、全ての磁石の場の方向が同じであるか、または
近隣の磁石の場の方向が反対向きである。したがってこの磁石の方向によって、
オリフィスあたり4つのスポット引力サイトが生じる。磁石は純粋に分離だけが
目的である。この特許には、この装置が、容器内の試薬を攪拌する手段をさらに
含むことができることが開示されている。
任意選択で前記流体から粒子を分離することができる方法および装置に関する。
変化する反対方向の磁場を利用する。流体中の磁性または磁化可能粒子がこれら
の磁場を受けると、粒子は、場の影響で流体と効率的に接触することが分かった
。このような粒子は通常、流体との効率的な混合を妨げるクロット(clot)
を形成しやすい。流体および粒子を含む容器に変化する異なる方向の磁場をかけ
ることによって、非常に効率的な混合プロセスとなるような方法で、粒子は互い
から効率的に分離され、流体を横切って引き寄せられることが分かった。この方
法では、流体がごく小体積であっても粒子を効率的に混合することができる。し
たがって本発明の方法は、例えば洗浄流体を節約することができ、必要な流体の
体積を減らすことができるという利点を有する。したがって例えば分離手順では
、本発明の方法によって、試薬を高濃度に精製することができる。また、従来技
術の方法は面倒で時間がかかるが、この方法は短時間で済み、実施が簡単である
。
子を2つ以上の磁石を使用して流体と混合する方法であって、容器の位置に対し
て磁石を動かし、かつ/または磁石の位置に対して容器を動かすことによって、
容器が、変化する異なる方向の磁場を受ける方法を提供する。
。したがって混合とは、粒子が洗浄され、または流体中に存在する成分と反応す
るときのような非常に効率的な方法で「接触」することを意味する。この文脈に
おいて混合は、プロセスが終わった後に均一な混合物を必ずしも提供しない。粒
子は、磁石を除去したときには粒子を含む容器の底に分離し、または容器の壁の
特定の位置に磁石によって保持することができる。この混合プロセスを使用して
例えば、粒子を洗浄し、または粒子を液体中の成分と反応させ、または粒子をお
おっている試薬に液体の成分を結合させることができる。同様に、この混合プロ
セスによって、粒子上に元々存在するある成分を周囲の液体中に溶離させること
もできる。本発明の方法は、これらのそれぞれのプロセスに適用可能であり、磁
性または磁化可能粒子をある体積の流体と接触させる、効率的で高速かつ便利な
方法を提供する。
子を流体と混合する汎用方法を提供する。この方法はさらに、粒子に結合した試
薬、例えば核酸を粒子から解放し、小さな体積に濃縮することができる。この方
法は自動化が容易であり、高スループットフォーマットによく適する。この方法
は、液滴またはエーロゾルによる汚染の危険を最小化する。
置することによって(凝集した)粒子を左から右に液体中を引っ張り、続いてこ
の第1の磁石を引っ込め、同時に容器の反対側(左)の壁の近くに第2の磁石を
配置して反対方向に粒子を引っ張る。本発明はさらに、前記方法を実行するため
の装置を提供する。
化する異なる方向の磁場を容器が受けるように、前記容器の位置に対して前記磁
石を動かす手段、ならびに/あるいは前記磁石の位置に対して前記容器を動かす
手段を備える。
体試料を保持するのに適した任意の容器を使用することができる。容器は、小体
積の液体試料の保持に適することが好ましい。例えば容器を、エッペンドルフ(
Eppendorf)カップ、PCR容器またはマイクロタイタープレートスト
リップとすることができる。
置に対して磁石を動かし、または磁石の位置に対して容器を動かすことができ、
それぞれの容器の中に変化する異なる極性の磁場を発生させる任意の幾何形状を
使用することができる。
って)強く反発し合うように配置すると、この洗浄(または溶離)プロセスが特
に効率的になることが分かった。この配置のため、容器の中の磁性ビーズが位置
する領域の磁力線は、それぞれのサイクルの間にその方向を突然に強く変化させ
る。同じ極どうし(N−NまたはS−S)が向かい合っているために強く反発し
合う2つの磁石の間に容器を配置すると、磁石または容器を互いに対してわずか
に動かしただけでも、容器の中の粒子が受ける磁場は突然に強く変化する。これ
は、粒子がクロットを形成しやすいとき、または既に流体中でクロットを形成し
ているときでも、粒子を流体と混合することができる非常に効率的な方法となる
ことが分かった。
することが好ましい。
性の磁石を、それぞれの容器の両側に沿ったまっすぐな平行経路上で前後に動か
すことができるような方法で一列に配置することができる。
の容器の反対側にある近隣の磁石列の全ての磁石の極が、第1の磁石列の磁極に
対して逆方向を向くように磁石を一列に配置することによって有利に達成するこ
とができる。
返し置かれる。
って反対方向に動かすことができる。
に考案することができる。
示す。磁性粒子は、容器の中に入れられた緩衝液の中にある。(凝集した)粒子は
、容器内に誘導される磁場の極性が磁石が動くたびに変化するように配置された
少なくとも2つの磁石から成る一組の磁石を平行移動させることによって、液体
を横切って左から右、および右から左に引っ張られる。
。したがって本発明による方法および装置では、いくつかの容器のバッチ操作を
同時に実施することができる。本発明による方法および装置は、それぞれの容器
の中の多数の流体を同時に処理するのに特に適する。
何学配置(intervening array geometry)に配置さ
れる。この配置は、本発明の方法を使用して、高スループットフォーマットを与
えることを可能にする。
容器(例えばエッペンドルフカップ、PCR容器またはマイクロタイタープレー
トストリップ)がアレイ形に配置され、容器に対して平行移動する第2のアレイ
に磁石が固定されている。
は、手で、または当技術分野では周知の多チップ自動ディスペンサー器具によっ
て実施することができる。
なわち、液体が容器の中ではなく、例えば管の中に含まれた系である。したがっ
て、本発明の方法とともに使用する容器には、バッチ操作で使用される容器だけ
ではなく、閉鎖系で使用される管などの容器も含まれる。このような本発明によ
る装置の代替実施形態を図3に示す。粒子および液体は容器ではなく管の中に含
まれ、閉鎖系内で粒子を処理することができる。
形が可能である。例えば、容器の形状を変更することができ、前記容器に対する
磁石の位置の変更も可能である。
もに使用する装置として特に適している。
できる。
きる。この装置を、さまざまな体積の試料流体とともに使用できるように調整す
ることもできる。
だけではなく、容器の壁に沿った方向(容器が直立位置にあるときには垂直方向
)にも動かすことができる。
ができる。したがって、ごく小さな体積の流体を粒子と混合するときには、同じ
容器で大きな体積の流体を混合するときよりも低い位置に磁石を配置する。
の磁石を使用して、容器の下部まで粒子を引き寄せることができるという、追加
の利点を有する。したがって、磁石で粒子を下の方に保持しながら、流体の体積
の大きな部分を例えばピペッターによって除去することができる。
、磁石を使用して、容器の壁に沿って流体の表面よりも高い位置まで粒子を引き
上げることもできる。この方法によって、流体から粒子を分離することができ、
残りの流体を容器から取り除き、または例えば、残りの流体を別の流体に置き換
えることができる。その後は、磁石を使用して粒子を液面下に引き下ろし、新た
な流体と混合する。
ある。それらは全て本発明の範囲に含まれる。
できるようにするため、およびそれぞれの流体との粒子の効率的な混合およびそ
れからの分離を達成するために、容器に対しても調整を実施することができる。
できないという問題が生じる可能性がある。これは単に、流体が容器の底をおお
って多少なりとも広がり、粒子をおおうまでには至らないためである。
子の効率的な混合が可能な容器を考案することができる。このような容器および
その使用も同様に本発明の一部分を構成する。
適した部分を備えた容器を使用することができる。この部分は、大体積の試料を
収容するのに適した部分に接続される。このような容器の一例を図4に示す。
先端を備え、先端よりも上の部分はより大体積の試料を収容するのに適する。
を使用するのに適し、それに応じて、容器に対する磁石の高さを調整することが
できる。
を集めることを可能にする。次いで、誤って粒子を取り出してしまうことなく、
液体の主要な部分を容器から除去することができる。
している。
たEP389063に開示の方法である。
およびケイ質固相を含む溶菌緩衝液を用いた生物材料の処理を含む。ケイ質固相
は、磁性シリカ粒子の形態で提供することができる。
する。したがって、溶菌緩衝液中の粒子と生物材料は互いに十分に接触しなけれ
ばならない。これには、この方法に従った装置の使用が重要な役割を果たす。続
いて、核酸が付着した粒子を残りの試料から磁石を使用して分離することができ
る(この目的に適合しているならば、本発明による装置を用いてこれを実施する
こともできる)。続いて、核酸を含む粒子を洗浄しなければならず、これには洗
浄緩衝液と粒子の混合が必要である。これは、本発明による装置によって実行す
ることができるもう1つの機能である。次いで、洗浄液から粒子を取り出し、粒
子を溶離緩衝液と接触させ(再び、粒子と溶離緩衝液の間の十分な接触が必要で
ある)、これによって粒子から溶離緩衝液中に核酸を解放する。一般に、洗浄に
必要な液体の体積は、溶離に必要な液体の体積の約10倍である。洗浄液の体積
(1容器、1洗浄ステップあたり)は一般に0.2〜0.5mlである。溶離緩
衝液の体積は一般に0.010/0.050mlである。
有する容器を使用する装置の実施形態は、核酸を分離する、先に説明したいわゆ
る「ブーム法」とともに使用するのに特に適している。
を実行することができる。
きい。したがって洗浄の間、磁性粒子は容器の上部(レベル1)にある(図4の
状況1)。しかし、ほとんどの応用では、核酸ターゲットを、一般に10から5
0μlの緩衝液中に濃縮する必要がある。このような小体積の液体は取扱いが難
しい。このような小体積の液体のサイズを制御すること、および磁性粒子ととも
に容器の中でそれを操作して、境界のないステップを実行するための懸濁液を形
成することは難しい。
し(状況1)、ピペッターの先端で洗液を吸引する。
すことによって磁性粒子を容器の下端(レベル3)に移動させる(状況2)。下
方へ動かすときに洗浄中にするように磁石アレイを平行移動させることによって
、粒子の輸送を速めることができる。ET緩衝液の組成は、緩衝液の温度がRT
を超えない限りシリカから核酸が解放されないような組成である。
積(例えば10μl)に対応するレベルに達するまで容器の中に導入する(状況
3参照)。
上昇させる(状況4)。
手順を開始する。ただし、このときに磁石のレベルは3にする。溶離中、ヒート
ブロックを容器と接触したままにして、溶離緩衝液の温度を55〜60℃に保つ
ことが好ましい。
磁石をレベル2まで移動させて(状況5)、粒子を溶離緩衝液から引きあげる。
これで、後続の処理(増幅、配列決定)に対する準備は完了である。
(状況4)、ヒートブロックが、磁石アレイの寸法および容器の形状を考慮した
専用の設計を有することが好ましい。
ブロックはアルミニウムから製作し、従来技術で知られているセラミック加熱部
品を含む。
手順を自動化しスピードアップさせる装置の使用方法を示した。
ることができる。
ぞれの容器の中の磁場の方向が繰り返し反転するよう、反対の極性の磁石を、そ
れぞれの容器の両側に沿ったまっすぐな平行経路上で前後に動かすことができる
ような方法で一列に配置された装置を示す図である。
、磁石を垂直方向にも動かすことができ、容器が、小体積の液体を保持するため
の先端を備えた管形容器である装置を示す図である。
Claims (16)
- 【請求項1】 1つまたは複数の容器の中で2つ以上の磁石を使用して磁性
または(超)常磁性粒子を流体と混合する方法であって、容器の位置に対して磁
石を動かし、かつ/または磁石の位置に対して容器を動かすことによって、容器
が、変化する異なる方向の磁場を受け、磁石と容器のホルダが介在アレイ状幾何
学配置に配置されることを特徴とする方法。 - 【請求項2】 容器または磁石を動かすことによって、容器が、反対の極性
の磁場を受ける請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 磁石または容器の移動の結果、同じ極どうしが向かい合った
2つの磁石の間に容器が繰り返し移動する請求項1または2に記載の方法。 - 【請求項4】 磁極を有する第1の磁石を容器の一方の壁面に近づけること
によって、磁性または(超)常磁性粒子を、流体中を横切って容器の前記一方の
壁面に移動させ、続いて、第1の磁石と同じ磁極を有する第2の磁石を容器の反
対側の壁面に近づけることによって、磁性または(超)常磁性粒子を前記反対側
の壁面に移動させる方法で、容器の位置に対して磁石を動かし、または磁石の位
置に対して容器を動かす請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項5】 容器に対して磁石を動かす請求項1から4のいずれか一項に
記載の方法。 - 【請求項6】 1つまたは複数の容器の中で磁性または(超)常磁性粒子を
流体と混合する装置であって、前記1つまたは複数の容器および2つ以上の磁石
を保持する手段、ならびに変化する異なる方向の磁場を容器が受けるように、前
記容器の位置に対して前記磁石を動かす手段、ならびに/あるいは前記磁石の位
置に対して前記容器を動かす手段を備える装置。 - 【請求項7】 容器の内容が温まるように容器のすぐ近くに移動させ、再び
遠ざけることができるように配置されたヒートブロックを備える請求項1から6
のいずれか一項に記載の装置。 - 【請求項8】 ヒートブロックが容器の下に配置され、ヒートブロックが、
ヒートブロックを容器のすぐ近くに近づけたときに容器の先端を取り囲むウェル
を有する請求項7に記載の装置。 - 【請求項9】 それぞれの磁石が、その近隣のそれぞれ磁石と反発し合うよ
うな向きに配置された請求項1に記載の装置。 - 【請求項10】 それぞれの容器の中の磁場の方向が繰り返し反転するよう
な方法で磁石を、それぞれの容器の両側に沿ったまっすぐな平行経路上で前後に
動かすことができる請求項1から9のいずれか一項に記載の装置。 - 【請求項11】 ある列の全ての磁石の極が同じ方向を向き、近隣の磁石列
の全ての磁石の極が、第1の磁石列の磁極に対して逆方向を向くように磁石が一
列に配置された請求項1に記載の装置。 - 【請求項12】 容器の壁に対してさまざまな高さのところに磁石を配置す
ることができるよう、磁石を垂直方向にも動かすことができる請求項1から11
のいずれか一項に記載の装置。 - 【請求項13】 容器が閉鎖系の一部分である請求項1から12のいずれか
一項に記載の装置。 - 【請求項14】 容器が、より小径の先端を備えた管形容器である請求項1
から13のいずれか一項に記載の装置。 - 【請求項15】 請求項6から13のいずれか一項に記載の装置の核酸分離
法での使用。 - 【請求項16】 出発材料から核酸を分離する方法であって、 (a)出発材料を、適当な溶菌緩衝液および磁化可能なシリカ粒子とともに、
請求項11に記載の装置の1つまたは複数の容器の中に入れるステップと、 (b)それぞれの容器の中の磁場の方向が繰り返し反転するように、試料の体
積に合わせて調整された高さに磁石を保持したまま、磁石アレイを容器に対して
十分な時間、動かすことによって、容器の内容成分を混合するステップと、 (c)磁石を使用して容器の壁のところに粒子を集めるステップと、 (d)大部分の試料液を装置から除去するステップと、 (e)十分な量の洗浄緩衝液を装置に加えるステップと、 (f)ステップ(b)から(d)を繰り返すステップと、 (g)適当な量の溶離緩衝液を装置に加えるステップと、 (h)磁石をより低い位置に動かすことによって、容器の先端の中へ粒子を引
き下げるステップと、 (i)任意選択で、容器のすぐ近くにヒートブロックを移動させることによっ
て容器を加熱するステップと、 (j)任意選択で、適当な量の溶離緩衝液を装置から除去するステップと、 (k)ステップ(b)を繰り返すステップと、 (l)磁石を、流体面よりも高い位置まで垂直方向に動かすステップと、 (m)分離された核酸をその中に含む溶離緩衝液を集めるステップ を含む方法。
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