JP2003199575A

JP2003199575A - 新規ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素及びそれをコードする核酸

Info

Publication number: JP2003199575A
Application number: JP2001401827A
Authority: JP
Inventors: Hisashi Narimatsu; 久成松; Jiro Inaba; 二朗稲葉; Akiteru Ou; 暁輝王
Original assignee: JGS KK; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: JGS KK; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2001-12-28
Publication date: 2003-07-15
Anticipated expiration: 2021-12-28
Also published as: AU2002367265A1; JP4300267B2; WO2003057868A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】ガラクトースにN−アセチルグルコサミンを
β-1,6結合で転移する活性を有する酵素及びそれをコー
ドする核酸を提供すること。【解決手段】ヒト由来の特定のアミノ酸配列又は該ア
ミノ配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換し若
しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数
のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配列を
有し、ガラクトースにN−アセチルグルコサミンをβ-1,
６結合で転移する活性を有するタンパク質及びこのタン
パク質をコードする核酸を提供した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ガラクトースにN
−アセチルグルコサミンをβ-1,6結合で転移する活性を
有する新規な酵素及びそれをコードする核酸、並びに酵
素活性を測定するための核酸に関する。

【０００２】

【従来の技術】ガラクトースβ１−４N-アセチルグルコ
サミンβ１−３ガラクトースβ１−４N−アセチルグル
コサミン−R（以下、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ
１−４Glc(Nac)−R：所謂ポリラクトサミン構造）の還
元末端のガラクトースにN-アセチルグルコサミンをβ１
−６で転移する酵素として、ヒトでは一種類（IGnT）(B
ierhuizen MF, Maemura K, Kudo S, Fukuda M. Glycobi
ology. 1995 5, 417-25.)、マウスでは二種類（IGnTAお
よびIgnTB）(Chen GY, Kurosawa N, Muramatsu T.Glyco
biology. 2000 10, 1001-11.)が知られていた。このポ
リラクトサミン構造の糖鎖は、糖脂質（例えば、Galβ
１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ
１−４Glcβ１−１セラミド：Lacto-N-nor-hexaosylcer
amide）やタンパク質のアスパラギン酸のアミノ基に結
合している糖鎖（N-結合型糖鎖）などに存在することが
知られている。さらに、IGnTにより分岐している糖鎖構
造が知られている（例えば：Galβ１−４GlcNAcβ１−
３（Galβ１−４GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAcβ
１−３Galβ１−４Glcβ１−１セラミド：Lacto-N-iso-
octaosylceramide）など（FEIZI,T., Childs, A.R., Wa
tanabe, K and Hakomori,S. J.Exp.Med. 1979, 149, 9
75-980）がある。また、Ii血液型が知られている。この
i（small i）血液型の抗原は、血球上のポリラクトサミ
ンであり、I血液型の抗原は、血球上のポリラクトサミ
ンにβ１−６結合でGlcNAcが分岐した構造である。すな
わち、IGnTのような酵素によってI抗原が産生されてい
ると考えられ、I合成酵素の絶対的または相対的欠損に
よりi(small i)血液型になると考えられる。最近、既知
の酵素のIGnTの一塩基変異、または遺伝子の欠損によっ
て起こることが報告された（Molecular basis of the a
dult I phenotype and the gene responsible for the
exoression of the human blood group I antigen. Blo
od. 2001 98(13), 3840-3845, Yu LC, Twu YC, Chang C
Y, Lin M。しかし、赤血球上のI抗原を合成する酵素に
ついては、完全には同定されていない。すなわち、Ii血
液型を決定する遺伝子である可能性があるガラクトース
にβ-１,６結合でN-アセチルグルコサミンを転移する遺
伝子および酵素を同定する必要がある。さらに、i(smal
l i)血液型のヒトでは、先天性白内障の発症率が非常に
高く、I合成酵素の欠損と先天性白内障の関連性が指摘
されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ガラクトースにN−ア
セチルグルコサミンをβ-1,６結合で転移する活性を有
する酵素を単離し、その遺伝子の構造を明らかにするこ
とにより、該酵素の遺伝子工学的な生産や、該遺伝子に
基づく血液型等の診断が可能になる。既に１種類の酵素
（IGnT）が同定されている。しかしながら、同じ転移活
性を有する酵素が別にあるか、血液型を決定している遺
伝子・酵素であるのか、今だ不明な点が多い。

【０００４】従って、本発明の目的は、ガラクトースに
N−アセチルグルコサミンをβ-1,6結合で転移する活性
を有する酵素及びそれをコードする核酸を提供すること
である。また、本発明の目的は、該核酸を宿主細胞内で
発現する組換えベクター及び該核酸が導入され、前記核
酸および酵素タンパク質を発現する細胞を提供すること
である。また、発現該酵素タンパク質は、抗体作製用に
利用でき、該酵素タンパク質の産生方法を提供するもの
である。さらに、発現該酵素タンパク質および該酵素タ
ンパク質に対する抗体を用いたい免疫組織染色およびRI
AやEIAなどの免疫測定法に利用できる。さらに、本発明
の目的は、上記本発明の核酸を測定するための測定用核
酸を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記の通り、目的とする
酵素は、未だ不明な点が多いため、その部分アミノ酸配
列を知ることもできない。一般に、細胞に微量しか含ま
れていないタンパク質を単離精製することは容易ではな
く、現在に至るまで単離されていない酵素を細胞から単
離することは容易でないことが予想される。本願発明者
は、目的とする酵素と比較的類似した作用を有する種々
の酵素遺伝子の塩基配列間に、もしも相同性の高い領域
が存在していれば、目的とする酵素の遺伝子もその相同
配列を有しているかもしれないと考えた。そして、公知
のβ１，６−N−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子
等の塩基配列を検索した結果、相同な領域が見つかっ
た。そこで、バイオインフォマティクスの技術を用いて
遺伝子領域を予測し、PCRを用いて該酵素の遺伝子のク
ローニングに成功し、その塩基配列及び推定アミノ酸配
列を決定することができ、本発明に至った。

【０００６】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
又は３に示されるアミノ酸配列又は該アミノ配列におい
て１若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、
若しくは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿
入され若しくは付加されたアミノ配列を有し、ガラクト
ースにN−アセチルグルコサミンをβ-1,６結合で転移す
る活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明
は、該タンパク質をコードする核酸を提供する。さら
に、本発明は、該核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発
現することができる組換えベクターを提供する。さら
に、本発明は、該組換えベクターにより形質転換され、
前記核酸を発現する細胞を提供する。さらに、本発明
は、核酸と特異的にハイブリダイズする、該核酸の測定
用核酸を提供する。

【０００７】

【発明の実施の形態】下記実施例において詳述する方法
によりクローニングされた、本発明のタンパク質をコー
ドする核酸は、配列表の配列番号２又は配列番号４に示
される塩基配列を有し、それがコードする推定アミノ酸
配列が、該塩基配列の下に記載されている。配列番号１
および３には、該アミノ酸配列のみを取り出して示す。

【０００８】下記実施例で得られた本発明のタンパク質
(「IGnT2」および「IGnT3」と命名）は、次の性質を有
する酵素である。なお、各性質及びその測定方法は下記
実施例において詳述されている。作用：ガラクトースにN−アセチルグルコサミンをβ-
1,６結合で転移する。触媒する反応を反応式で記載する
と、１．UDP-N-アセチルグルコサミン + ガラクトシ
ルβ１−４N-アセチルグルコサミニルβ１−３ガラクト
シルβ１−４N-アセチルグルコサミニル-R → UDP +
ガラクトシルβ１−４N-アセチルグルコサミニルβ１
−３（N−アセチルグルコサミニルβ１−６）ガラクト
シルβ１−４N-アセチルグルコサミニル-R（Galβ１−
４GlcNAcβ１−３Galβ１−４Glcβ１-R ＋ UDP-GlcN
Ac → Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−
６）Galβ１−４Glcβ１-R + UDP）。２．UDP-N-アセ
チルグルコサミン + N-アセチルグルコサミニルβ１
−３ガラクトシルβ１−４N-アセチルグルコサミニル-R
→ UDP + N-アセチルグルコサミニルβ１−３（N−
アセチルグルコサミニルβ１−６）ガラクトシルβ１−
４N-アセチルグルコサミニル-R（GlcNAcβ１−３Galβ
１−４Glcβ１-R ＋ UDP-GlcNAc → GlcNAcβ１−
３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４Glcβ１-R + UD
P）。などの反応を触媒する。

【０００９】なお、一般に、酵素のような生理活性を有
するタンパク質において、そのアミノ酸配列のうち、１
若しくは複数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若し
くは該アミノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入さ
れ若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維
持されることがあることは周知である。従って、配列番
号１又は３に示されるアミノ配列において１若しくは複
数のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミ
ノ配列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは
付加されたアミノ配列を有し、ポリラクトサミンのガラ
クトースにN−アセチルグルコサミンをβ-1,6結合で転
移する活性を有するタンパク質（以下、便宜的に「修飾
タンパク質」）も本発明の範囲に含まれる。このような
修飾タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１又は３に
示されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％
以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するこ
とが好ましい。なお、アミノ酸配列の相同性は、FASTA
のような周知のコンピューターソフトを用いて容易に算
出することができ、このようなソフトはインターネット
によっても利用に供されている。さらに、該修飾タンパ
ク質としては、配列番号１又は３に示されるアミノ酸配
列又は該配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換
し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは
数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ配
列を有するものが特に好ましい。

【００１０】本発明は、配列番号１又は配列番号３で示
されるアミノ酸配列をコードする核酸及び上記修飾タン
パク質のアミノ酸配列をコードする核酸も提供する。核
酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コド
ンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配
列が複数存在するアミノ酸もあるが、上記アミノ酸配列
をコードする塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有
するものも本願発明の範囲に含まれる。なお、下記実施
例において実際にクローニングされたｃＤＮＡの塩基配
列が配列番号２および配列番号４に示されている。配列
番号２又は配列番号４に示す塩基配列を有する核酸とス
トリンジェントな条件下(すなわち、5 xDenhardt's rea
gent, 6 x SSC,0.5% SDS又は0.1% SDSといった一般的な
ハイブリダイゼーション溶液を用いて５０〜６５℃で反
応を行なう)において、ハイブリダイズし、かつ、上記
修飾タンパク質をコードする核酸も本発明の範囲内に入
る。

【００１１】上記本発明の核酸は、下記実施例に詳述す
る方法により調製することもできるし、また、本発明に
よりその塩基配列が明らかにされたので、下記実施例で
用いているヒト奇形癌細胞PA-1（American Type Cultur
e collection 以下ATCC）を材料として用い、常法であ
るRT-PCR法を行うことにより容易に調製することができ
る。また、上記本発明のタンパク質は、例えば下記実施
例に詳述するように、上記本発明の核酸を発現ベクター
に組み込み、宿主細胞中で発現させ、精製することによ
り容易に調製することができる。

【００１２】上記本発明の核酸を、発現ベクターのクロ
ーニング部位に挿入することにより、宿主細胞中で上記
核酸を発現させることができる組換えベクターを得るこ
とができる。発現ベクターとしては、種々の宿主細胞用
の種々のプラスミドベクター及びウイルスベクターが周
知であり、市販もされている。本発明では、このような
市販の発現ベクターを好ましく用いることができる。ま
た、このような組換えベクターで宿主細胞を形質転換又
は形質導入する方法も周知である。本発明はまた、該核
酸が形質転換、形質導入又はトランスフェクション等に
より宿主細胞に導入され、該核酸を発現する細胞を提供
する。宿主細胞に外来遺伝子を導入する方法自体は周知
であり、上記組換えベクターを用いること等により容易
に行うことができる。宿主細胞としては、特に限定され
ず、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、細菌等を用いるこ
とができる。なお、組換えベクターの構築及びそれを用
いて本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法の具体例が
下記実施例に詳述されている。

【００１３】なお、本発明のタンパク質は、そのアミノ
酸配列が上記した通りのものであり、上記した酵素活性
を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合してい
てもよい。すなわち、本発明の「タンパク質」は「糖タ
ンパク質」をも包含する。

【００１４】本発明により、本発明の新規酵素のｃＤＮ
Ａの塩基配列が明らかになったので、該酵素のｍＲＮＡ
又はｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする、前記本発
明の測定用核酸（以下、単に「測定用核酸」）が本発明
により提供された。ここで、「特異的」とは、検査対象
となる細胞中に存在する他の核酸とハイブリダイズせ
ず、上記本発明の核酸とのみハイブリダイズするという
意味である。測定用核酸は、上記本発明の核酸、とりわ
け配列番号２又は４に示される塩基配列を有する核酸中
の部分領域と相同的な配列を有することが一般的に好ま
しいが、１〜２塩基程度の不一致があっても差し支えな
いことが多い。測定用核酸は、プローブ又は核酸増幅法
におけるプライマーとして用いることができる。特異性
を確保するために、測定用核酸の塩基数は１５塩基以
上、さらに好ましくは１８塩基以上である。サイズは、
プローブとして用いる場合には、１５塩基以上、さらに
好ましくは２０塩基以上、コード領域の全長（１２０６
塩基または１２０９塩基）以下が好ましく、プライマー
として用いる場合には、１５塩基以上、さらに好ましく
は１８塩基以上、５０塩基以下が好ましい。被検核酸の
部分領域と相補的な配列を有する核酸をＰＣＲのような
遺伝子増幅法のプライマー、又はプローブとして用いて
被検核酸を測定する方法自体は周知であり、下記実施例
には、ヒト細胞中の本発明の酵素のｍＲＮＡをノーザン
ブロット及びインサイチューハイブリダイゼーションに
より測定した方法が具体的に詳述されている。なお、本
明細書において、「測定」には、検出、定量、半定量の
いずれもが包含される。

【００１５】ＰＣＲのような核酸増幅法自体は、この分
野において周知であり、そのための試薬キット及び装置
も市販されているので容易に行うことができる。上記し
た本発明の測定用核酸の一対をプライマーとして用い、
被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検
核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれ
ない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出する
ことにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知るこ
とができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電
気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方
法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不
動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プ
ローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出す
ることにより行うことができる。また、クエンチャー蛍
光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタ
イム検出ＰＣＲを行うことにより、検体中の被検核酸の
量を定量することも可能である。なお、リアルタイム検
出ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行う
ことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づい
て被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検
核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮ
Ａであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅する
場合には、上記一対のプライマーを用いたNASBA法(3SR
法、TMA法）を採用することもできる。NASBA法自体は周
知であり、そのためのキットも市販されているので、上
記一対のプライマーを用いて容易に実施することができ
る。

【００１６】プローブとしては、上記測定用核酸に蛍光
標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プ
ローブを用いることができる。被検核酸又はその増幅物
を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄
後、固相に結合された標識を測定することにより、検体
中に被検核酸が存在するか否かを調べることができる。
あるいは、測定用核酸を固相化し、被検核酸をハイブリ
ダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等
で検出することも可能である。このような場合、固相に
結合した測定用核酸もプローブと呼ばれる。

【００１７】本発明の酵素を、ポリラクトサミン糖鎖を
有する糖タンパク質、オリゴ糖、糖脂質又は多糖等に作
用させることにより、N−アセチルグルコサミンがβ-1,
６結合される。従って、本発明の酵素は、糖タンパク質
の糖鎖の修飾、糖脂質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用
いることができる。さらに、この酵素を免疫原として動
物に投与することにより、該酵素に対する抗体を作製す
ることができ、該抗体を用いて免疫測定法により該酵素
を測定することが可能になる。従って、本発明の酵素及
びこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に
有用である。

【００１８】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００１９】１．遺伝子データベースの検索とIGnT２、
IGｎT3の塩基配列決定既存のβ１，６−N−アセチルグルコサミン転移酵素遺
伝子を用いて、遺伝子データベースから類似遺伝子の検
索を行った。用いた配列はβ１，６−N−アセチルグル
コサミン転移酵素遺伝子の配列番号（Gene Bank）：M9
7347, NM004751, NM001490, NM001491である。また検
索は、Blast[Altschul et al., J. Mol.Biol. 215, 403
-410(1990)]等のプログラムを利用した。

【００２０】その結果、第六染色体のゲノム配列クロー
ンのGene Bank Accetion No.AL139039およびNo.AL35877
7が見出された。さらに、この二つの配列を網羅した第
六染色体のGene Bank accetion No. NT_007291が見出
された。この部分配列は、既知のIGnTと相同性が高く、
ゲノム上で既知のIGnTの第一エクソンを挟むように存在
していた。この新規の２つの配列について遺伝子領域解
析ソフトのGeneScan、HMMgene等を用いて翻訳領域を解
析した。その結果、新規の２つの配列は、別々な第一エ
クソンであり、この独立した第一エクソンは既知のIGnT
のエクソン２、エクソン３を共用している可能性が認め
られた。そこで、ここの第一エクソンと第三エクソンに
プラマーを設計して、トランスクリプトとして存在する
か調べた。また、既知のIGnTを「IGnT1」とし、新規の
２つを「IGnT2」と「IGnT3」と命名した。

【００２１】具体的には、株化細胞PA-1（奇形芽腫、AT
CCより入手）より、総RNAを抽出し、常法に従ってｃDNA
を合成した。このｃDNAを鋳型として使用した。用いた
プライマーは、IGnT1はフォワードプライマー（5'−tga
ggcatgcctttatcaatgcgttacc-3'）,リバースプライマー
（5'−tgaatagctcaaaaatacctgctgggttgt-3':全て共
通）、IGnT2はフォワードプライー（5'-tgaatgatgggctc
ttggaagcactgtc-3'）、IGnT3はフォワードプライー(5'-
gtgaaaataatgaacttttggaggtactgctt-3')を用いてPCR（9
5℃30秒、60℃30秒、72℃2分を32サイクル）を行なっ
た。

【００２２】その結果、約1.2kbaseの増幅産物が得られ
た。このPCR増幅産物の配列を調べた。このPCR溶液をQI
Aquick PCR Purification kit(キアゲン)にてPCR増幅産
物を精製した。この精製PCR産物を鋳型としてシークエ
ンスを調べた。シークエンスの結果、IGnT2とIGnT3の配
列（配列番号２、４）が得られた。また、IGnT1とIGnT3
に関しては、pCRIIベクター（インビトロジェン社）に
一般的なTAクローニング法により、サブクローニングし
た。

【００２３】２．IGnT２およびIGnT３の発現ベクターへ
の組込み IGnT2およびIGnT3の発現系を作成するため、まずIGnT2
およびIGnT3をインビトロジェン社のGatewayシステムの
pDONR201に組込み、さらにインビトロジェン社のBac-to
-BacシステムによるBacmidを作製した。さらに、陽性対
照対照としてIGnT1も同様に以下に詳細を述べる。

【００２４】GatewayシステムによるpFastBacへの組込
みエントリークローンの作成 pCRIIにサブクローニングしたIGnT１およびIGnT3を鋳型
にした。IGnT2はMarathon cDNAを鋳型として、IGnT1に
対するプライマーF１（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcag
gcttcCTAAATATCTCAGACCCTTTGAGGCTGACT-3'）,プライマ
ーF2(5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcTGCACATCTTT
TATCAATGGAAAAACA-3')、IGnT2に対するプライマーF1
（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGAGGGCAGCTCT
GTCCAATGCTTCA-3'）,プライマーF2（5'-ggggacaagtttgt
acaaaaaagcaggcttcTGTCATCAGATTTTTGAGGGGAAAG-3'）、I
GnT3に対するプライマーF1（5'-ggggacaagtttgtacaaaaa
agcaggcttcCTGAACAGTTCCAGTGAAAGGTATTTTAG-3'）,プラ
イマーF2（5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcTGTAAT
CACGCCTTAGAGAAAATGCCA-3'）と共通のプライマーR（5'-
ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaAAAATACCAGCTGGGTT
GTATCGCAG-3'）を用いて、PCR（98℃10秒、55℃30秒、7
2℃1分を30サイクル）により再度DNA断片を得た。Micro
Spin S-400 HR（アマシャムファルマシアバイオテク）
にてDNA断片を精製し、精製後BP クロナーゼ反応によ
ってpDONR201へ組込み、「エントリークローン」を作成
した。反応は目的とするDNA断片１μl、pDONR201１μl
（150ng）、反応緩衝液2μｌ、BP クロナーゼ mix 2μ
l、TE溶液４μlを25℃で1時間インキュベートして行っ
た。プロテイナーゼKを１μl加えて37℃10分おき反応を
終了させた。

【００２５】その後上記mix全量（1μl）をコンピテン
トセル（大腸菌DH５α）50μlと混合し、ヒートショッ
ク法の後、カナマイシンを含むLBプレートにまいた。翌
日コロニーをとり、直接PCRで目的DNAを確認し、ベクタ
ー（pDONR−IGnT1-F1、pDONR-IGnT1-F2、pDONR-IGnT2-F
1、pDONR-IGnT2-F2、pDONR-IGnT3-F1、pDONR-IGnT3-F
2）を抽出・精製した。

【００２６】発現クローンの作成上記エントリークローンは挿入部位の両側にラムダファ
ージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるattL
を持つもので、LRクロナーゼ（ラムダファージの組換酵
素Int、IHF、Xisを混合したもの）とデステイネーショ
ンベクターと混合することで、挿入部位がデステイネー
ションベクターに移り、発現クローンが作成される。具
体的工程は以下のとおりである。

【００２７】まずエントリークローン１μl、ｐFBIHを
１μl（100ng）、LR反応緩衝液2μl、TE4μl、LR クロ
ナーゼmix 2μlを25℃で1時間反応させ、プロテイナー
ゼ Kを1μl加えて37℃10分インキュベートして反応を終
了させた（この組換え反応でｐFBIH-IGnT1-F1、ｐFBIH-
IGnT1-F2、ｐFBIH-IGnT2-F1、ｐFBIH-IGnT2-F2、ｐFBIH
-IGnT3-F1、ｐFBIH-IGnT3-F2、が生成される）。ｐFBIH
は、pFastBac１にIgκシグナル配列（MHFQVQIFSFLLISA
SVIMSRG）とHisタグ(His 6個)のシーケンスを加えたも
ので、OT５（5'-gatcatgcattttcaagtgcagattttcagcttcc
tgctaatcagtgcctcagtcataatgtcacgtggacatcaccatcaccat
cac-3'）を鋳型に、プライマーOT20 (5'-cgggatccat g
cattttcaa gtgcag-3')と、OT22 （5'-ggaattcgtgatggtg
atggtgatg-3'）を用いてPCRを行い、得られたDNA断片を
Bam H1 とEco R1 で挿入した。さらに、Gateway配列を
挿入するため、Gateway Vector Conversion System（イ
ンビトロジェン社）を用いてConversion cassetteを入
れた。Igκシグナル配列は発現タンパク質を分泌型にす
るため、Hisタグは精製のため挿入した。

【００２８】その後上記混合液全量（5μl）をコンピテ
ントセル（大腸菌DH５α）50μlと混合し、ヒートショ
ック法の後、アンピシリンを含むLBプレートにまいた。
翌日コロニーをとり、直接PCRで目的DNAを確認し、ベク
ター（pFBIH-IGnT1-F1、pFBIH-IGnT1-F2、pFBIH-IGnT2-
F1、pFBIH-IGnT2-F2、pFBIH-IGnT3-F1、pFBIH-IGnT3-F
2、:同様の工程をする場合、pFBIH-IGnTsとする）を抽
出・精製した。

【００２９】またpFBIHに変えてｐFBIFでも同様に実験
を行った。即ちｐFBIFはHisタグに変えて、精製用にFLA
Gペプチド（DYKDDDDK）を入れたもので、OT3（5'-gatca
tgcattttcaagtgcagattttcagcttcctgctaatcagtgcctcagtc
ataatgtcacgtggagattacaaggacgacgatgacaag-3'）を鋳型
とし、プライマーOT20（上記と配列同じ）と、OT21
（5'-ggaat tcttgt catcg tcgtc cttg-3'）によって得
られたDNA断片を上記と同様にBam H1 とEco R1 で挿入
し、Gateway配列を挿入するため、Gateway Vector Conv
ersion System（インビトロジェン社）を用いてConvers
ion cassetteを入れた。

【００３０】Bac-to-BacシステムによるBacmidの作成続いてBac-to-Bacシステム（インビトロジェン社）を用
いて上記ｐFBIH- IGnTs又はｐFBIF-IGnTsとBacmidとの
間で組換えをさせ、昆虫細胞中で増殖可能なBacmidにIG
nTsにその他の配列を挿入した。このシステムはTn7の組
換部位を利用して、Bacmidを含む大腸菌（DH10BAC）に
目的遺伝子を挿入させたpFastBac（pFBIH-IGnTsまたはp
FBIF-IGnTs）を導入するだけで、ヘルパープラスミドか
ら産生される組換タンパク質によって目的とする遺伝子
がBacmidへとりこまれるというものである。またBacmid
にはlacZ遺伝子が含まれており、古典的な青（挿入な
し）−白コロニー（挿入あり）による選択が可能であ
る。

【００３１】即ち、上記精製ベクター（ｐFBIH-IGnTs又
はｐFBIF-IGnTs）をコンピテントセル（大腸菌DH10BA
C）50μlと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシ
ン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、Bluo-gal、及
びIPTGを含むLBプレートにまき、翌日白い単独コロニー
をさらに培養し、Bacmidを回収した。

【００３２】３． Bacmidの昆虫細胞への導入上記白コロニーから得られたBacmidに目的配列が挿入し
ていることを確認した後、このBacmidを昆虫細胞Sf21
（インビトロジェン社より市販）に導入した。即ち35mm
のシャーレにSf21 細胞9x10⁵ 細胞/2ml （抗生物質を
含むSf-900SFM(インビトロジェン社）を加え、27℃で１
時間培養して細胞を接着した。（SolutionA）精製した
Bacmid DNA 5 μｌに抗生物質を含まないSf-900SFM(イ
ンビトロジェン社）100μｌ加えた。（Solution B）Cel
lFECTIN Reagent(インビトロジェン社） 6μｌに抗生物
質を含まないSf-900SFM(インビトロジェン社）100μｌ
加えた。その後、Solution AおよびSolution Bを丁寧に
混合して15〜45分間、室温でインキュベートした。細胞
が接着したことを確認して、培養液を吸引して抗生物質
を含まないSf-900SFM(インビトロジェン社）2mlを加え
た。Solution AとSolution Bを混合して作製した溶液(l
ipid-DNA complexes)に抗生物質を含まないSf900II 800
μｌを加えて丁寧に混和した。細胞から培養液を吸引
し、希釈したlipid-DNA complexes溶液を細胞に加え、2
7℃で5時間インキュベーションした。その後、トランス
フェクション混合物を除き、抗生物質を含むSf-900SFM
(インビトロジェン社）培養液2mlを加えて２７℃で７２
時間インキュベーションした。トランスフェクションか
ら７２時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細
胞と培養液を回収した。これを3000rpm, 10分間遠心
し、上清を別のチューブに保存した（この上清が一次ウ
イルス液となる）。

【００３３】T75培養フラスコにSf21細胞 1x10⁷ 細胞/2
0ml Sf-900SFM(インビトロジェン社)（抗生物質入り）
を入れて、27℃で1時間インキュベートした。細胞が接
着したら一次ウイルスを800μｌを添加して、27℃で48
〜72時間培養した。培養終了後にピペッティングにより
細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを3000rp
m, 10分間遠心し、上清を別のチューブに保存する（こ
の上清を二次ウイルス液とした）。

【００３４】さらに、T75培養フラスコにSf21細胞 1x10
⁷ 細胞/20ml Sf-900SFM(インビトロジェン社）（抗生
物質入り）を入れて、27℃で1時間インキュベートし
た。細胞が接着したらニ次ウイルス液1000μｌを添加し
て、27℃で72〜96時間培養した。培養後にピペッティン
グにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これ
を3000rpm, 10分間遠心し、上清を別のチューブに保存
した（この上清を三次ウイルス液とした）。

【００３５】加えて、100ml用スピナーフラスコにSf21
細胞６ｘ１０^５細胞/ml濃度で100mlを入れ、三次ウイル
ス液を１ｍｌ添加して２７℃で約９６時間培養した。培
養後に、細胞及び培養液を回収した。これを3000rpm, 1
0分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上
清を四次ウイルス液とした）。

【００３６】三次のセルペレットをソニケーションし
（ソニケーション緩衝液：20mM HEPESpH7.5、2 % Trito
n X-100）細胞粗抽出液をH₂Oで20倍にし、常法によりS
DS-PAGEによる電気泳動についてウエスタンブロッテイ
ングを行い、目的とするIGnT1,IGｎT2, IGｎT3（3種類
同時に示す場合IGnTs）のタンパク質の発現を確認し
た。抗体は、ヒスチジンタグのついたIGnTsにはモノク
ローナル抗体６−His（MMS-156P、COVANCE社）、FLAG配
列のついたIGnTsには抗FLAG M2-ペルオキシダーゼ（A-8
592、SIGMA社）を用いた。

【００３７】FLAG-IGnTsは、４２Kまたは４１Kの位置に
バンドが検出された。

【００３８】四次感染のFLAG-IGnTs上清10mlにNaN₃（0.
05 %）、NaCl (150 mM)、CaCl₂ (2mM)、抗M1レジン（Si
gma 社）(50 μｌ)を混合し、4℃で一夜攪拌した。翌日
遠心して（3000rpm 5分4℃）ペレットを回収し、2 mMの
CaCl₂・TBSを900μｌ加えて再度遠心分離（2000rpm 5分
4℃）し、ペレットを50μｌの1 mM CaCl₂・TBSに浮遊
させ活性測定のサンプル（IGnTs酵素液）とした。

【００３９】５． IGnT2およびIGnT3の受容体基質の探
索 IGnT2およびIGnT3は、β1,６−N−アセチルグルコサミ
ニル転移酵素である既知IGnT1と相同性が高く、IGnT1と
それぞれ73.4%、74.1%であった。そこで、第一に供与体
基質（donor substrate）としてUDP-GlcNAcを用いて検
討した。

【００４０】以下の反応系を用いて、IGnTsの受容体基
質を調べた。下記反応液の「受容体基質」には、Galβ
１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４Glc（LNnT：CALBIOCH
EM）、GlcNAcβ１−３Galβ１−４Glc（agalacto-LNn
T）、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃ
（２L1:生化学工業）、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Gal
β１−４GlcNAｃβ１−３Galβ１−４GlcNAc（３L1：生
化学工業）、GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃβ１−
３Galβ１−４GlcNAc（agalacto-3L1）を２−アミノベ
ンズアミド（２AB）化したものを用いてそれぞれが受容
体として機能するかどうかを調べた。２AB標識糖鎖は、
HPLCを用いて蛍光検出器で検出した。

【００４１】反応液（カッコ内は最終濃度）は受容体基
質（10 nmol）、カコジル酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）
(50mM) 、EDTA(35 mM) 、UDP-GlcNAC (10mＭ) 、Triton
-X100(0.5%)、牛血清アルブミン（2mg/ml）から成り、
これにIGnTs酵素液を2.5 μｌ加えて、さらにH₂Oを加え
て全量10μｌとした。

【００４２】上記反応混合液を37℃で一昼夜反応させ、
反応終了後、９７℃５分間過熱して軽く遠心後上清を取
得した。この反応溶液５０μlをHPLCにて分析した。HPL
Cの分析条件は、カラムはTSKgel ODS-80Ts QAカラム(4.
6ｘ250 mm; Tosoh)、溶媒（移動相）は７％メタノール
を含む20mM酢酸アンモニウム緩衝液（ｐH４．０）、ま
たは受容体基質として３L1の場合のみ５％メタノールを
含む20mM酢酸アンモニウム緩衝液（ｐH４．０）、流速
は1ml/min、励起波長：330nm、蛍光測定波長：420nmで
行なった。

【００４３】その結果、陽性対照として用いたIGnT1
は、受容基質LNｎT（溶出時間１８．６分）を用いた場
合、生成物は１７分にピークが認められた。すなわち、
この１７分の生成物は、LNnTにβ１−６結合でN-アセチ
ルグルコサミンが結合したGalβ１−４GlcNAcβ１−３
（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４Glcである。IGnT2およ
びIGnT3に関しても全く同様の結果が得られた。すなわ
ち、IGnT2およびIGnT3は、ポリラクトサミン構造（Gal
β１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAcのような構
造で基本的には「Galβ１−４GlcNAc」の繰り返し構造
をポリラクトサミン構造とする）の還元末端ではないガ
ラクトースにβ１−６結合でN-アセチルグルコサミンを
転移する酵素であることを確認した。そこで、他の基質
についても検討した。その結果を以下の表１にまとめ
た。agalacto-LNnTを基質とした場合の生成物はGlcNAc
β１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４Glcである。2L
1を基質としたときは、生成物はGalβ１−４GlcNAcβ１
−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃである。ag
alacto-3L1を基質としたときは、生成物はGlcNAcβ１−
３Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ
１−４GlcNAｃおよびGlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−
６）Galβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Gal
β１−４GlcNAｃである。３L1を基質としたときは、生
成物はGalβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）G
alβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１
−４GlcNAｃ、Galβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４G
lcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）Galβ１−４GlcNAｃ
およびGalβ１−４GlcNAcβ１−３（GlcNAcβ１−６）G
alβ１−４GlcNAcβ１−３Galβ１−４GlcNAｃである。

【００４４】

【表１】表１

【００４５】８．種々株化細胞での発現各種株化細胞より総RNAを抽出し、常法によりcDNAを作
製した。このｃDNAを用いてPCRにより発現を確認した。
使用したプライマーは、IGnT3はBFF1(5'-caagggactctgc
taacttcgtcc-3')、GP-60（5'-ggaatcctgttgagtgtcaccca
g-3'）である。使用した酵素はAdvantage cDNA polymer
ase(クロンテック社)を使用した。反応は、94℃30秒、6
8℃120秒、72℃30秒を30サイクルで行い、2％アガロー
スゲル電気泳動で確認した。予想PCR増幅産物は、115塩
基であり、このサイズの増幅産物が認められた場合を
“＋”とし、増幅産物が認められない場合“−”で示し
た。増幅産物はシングルバンドとして認められ、それ以
外は増幅産物が認められなかった。また、幾つかの増幅
産物については、制限酵素処理を行ない、IGnT3遺伝子
由来の増幅産物であることを確認している。結果は以下
の表２に示した。

【００４６】

【表２】表２

【００４７】９．正常組織での発現ヒト正常組織での発現について各組織のMarathon cDNA
(クロンテック社)を用いて発現を確認した。使用したプ
ライマーは、IGnT3は、No.2863(5'-atagttcagcatctgaaa
gga-3')、No.2846（5'-tgcatttggcatagagccagg-3'）で
ある。使用した酵素はLA Taq(TakaRa)を使用した。反応
は、94℃30秒、58℃30秒、72℃60秒を30サイクルで行
い、1％アガロースゲル電気泳動で確認した。予想PCR
増幅産物は、346塩基であり、このサイズの増幅産物が
認められた場合を“＋”とし、増幅産物が認められない
場合“−”で示した。結果は以下の表３に示した。増幅
産物はシングルバンドとして認められ、それ以外は増幅
産物が認められなかった。この条件で発現している組織
は、骨髄、結腸、心臓、であった。

【００４８】

【表３】表３

【００４９】１０．正常組織での発現（IGｎT1,２およ
び３の発現量の違い）ヒト正常組織での発現について各組織のMarathon cDNA
(クロンテック社)を用いて発現を確認した。使用したプ
ライマーは、IGnT1は、IGnT-1F1: 5'-gatctggctgtaata
tcggcac-3'、IGnT-1R1: 5'-aagacttctcatggatcattag-
3'、 IGnT2は、IGnT-2F1: 5'-caacctagtggtaagtgaaga
g-3'、IGnT-2R1: 5'-tagcttcatcaagggtagttttc-3'、IG
nT3は、IGnT-3F1: 5'-cagaccaaagtgagagagggac-3'、IG
nT-3R1:5'-ggacacttcgcaaaggtgatgg-3'である。使用し
た酵素はLA Taq(TakaRa)を使用した。反応は、94℃30
秒、58℃30秒、72℃60秒を3５サイクルで行い、1.5％
アガロースゲル電気泳動で確認した。予想PCR増幅産物
は、約４５０塩基であり、このサイズの増幅産物が認め
られたバンドの濃さでを“＋＋＋”、“＋＋”、“＋”
の三段階とし、増幅産物が認められない場合“−”で示
した。結果は以下の表４に示した。予想される大きさの
増幅産物が認められた。特に大きな差が認められた部分
は、IGnT1およびIGnT2に比較してIGnt3は、骨髄および
心臓で強く発現していた。このことから、I血液型抗原
の合成には、IGnT3の関与が示唆される。

【００５０】

【表４】表４

【００５１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY JAPAN GENOME SOLUTIONS INC. <120> Novel acetylglucosamine transferase and nucleic acid encoding the same <130> 01757 <160> 22

【００５２】 <210> 1 <211> 401 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ser Trp Lys His Cys Leu Phe Ser Ala Ser Leu Ile Ser Ala 1 5 10 15 Leu Ile Phe Val Phe Val Tyr Asn Thr Glu Leu Trp Glu Asn Lys Arg 20 25 30 Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ser Asn Ala Ser Leu Leu Ala Glu Ala Cys 35 40 45 His Gln Ile Phe Glu Gly Lys Val Phe Tyr Pro Thr Glu Asn Ala Leu 50 55 60 Lys Thr Thr Leu Asp Glu Ala Thr Cys Tyr Glu Tyr Met Val Arg Ser 65 70 75 80 His Tyr Val Thr Glu Thr Leu Ser Glu Glu Glu Ala Gly Phe Pro Leu 85 90 95 Ala Tyr Thr Val Thr Ile His Lys Asp Phe Gly Thr Phe Glu Arg Leu 100 105 110 Phe Arg Ala Ile Tyr Met Pro Gln Asn Val Tyr Cys Val His Leu Asp 115 120 125 Gln Lys Ala Thr Asp Ala Phe Lys Gly Ala Val Lys Gln Leu Leu Ser 130 135 140 Cys Phe Pro Asn Ala Phe Leu Ala Ser Lys Lys Glu Ser Val Val Tyr 145 150 155 160 Gly Gly Ile Ser Arg Leu Gln Ala Asp Leu Asn Cys Leu Glu Asp Leu 165 170 175 Val Ala Ser Glu Val Pro Trp Lys Tyr Val Ile Asn Thr Cys Gly Gln 180 185 190 Asp Phe Pro Leu Lys Thr Asn Arg Glu Ile Val Gln Tyr Leu Lys Gly 195 200 205 Phe Lys Gly Lys Asn Ile Thr Pro Gly Val Leu Pro Pro Asp His Ala 210 215 220 Val Gly Arg Thr Lys Tyr Val His Gln Glu Leu Leu Asn His Lys Asn 225 230 235 240 Ser Tyr Val Ile Lys Thr Thr Lys Leu Lys Thr Pro Pro Pro His Asp 245 250 255 Met Val Ile Tyr Phe Gly Thr Ala Tyr Val Ala Leu Thr Arg Asp Phe 260 265 270 Ala Asn Phe Val Leu Gln Asp Gln Leu Ala Leu Asp Leu Leu Ser Trp 275 280 285 Ser Lys Asp Thr Tyr Ser Pro Asp Glu His Phe Trp Val Thr Leu Asn 290 295 300 Arg Ile Pro Gly Val Pro Gly Ser Met Pro Asn Ala Ser Trp Thr Gly 305 310 315 320 Asn Leu Arg Ala Ile Lys Trp Ser Asp Met Glu Asp Arg His Gly Gly 325 330 335 Cys His Gly His Tyr Val His Gly Ile Cys Ile Tyr Gly Asn Gly Asp 340 345 350 Leu Lys Trp Leu Val Asn Ser Pro Ser Leu Phe Ala Asn Lys Phe Glu 355 360 365 Leu Asn Thr Tyr Pro Leu Thr Val Glu Cys Leu Glu Leu Arg His Arg 370 375 380 Glu Arg Thr Leu Asn Gln Ser Glu Thr Ala Ile Gln Pro Ser Trp Tyr 385 390 395 400 Phe

【００５３】 <210> 2 <211> 1206 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atg ggc tct tgg aag cac tgt ctt ttt agc gcg tct ctt atc tct gcc 48 Met Gly Ser Trp Lys His Cys Leu Phe Ser Ala Ser Leu Ile Ser Ala 1 5 10 15 ctg att ttt gta ttt gtt tac aat act gag tta tgg gag aat aaa cgt 96 Leu Ile Phe Val Phe Val Tyr Asn Thr Glu Leu Trp Glu Asn Lys Arg 20 25 30 ttt ctg agg gca gct ctg tcc aat gct tca ctg tta gca gaa gcc tgt 144 Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ser Asn Ala Ser Leu Leu Ala Glu Ala Cys 35 40 45 cat cag att ttt gag ggg aaa gtt ttt tac cca aca gaa aat gca ttg 192 His Gln Ile Phe Glu Gly Lys Val Phe Tyr Pro Thr Glu Asn Ala Leu 50 55 60 aaa act acc ctt gat gaa gct acc tgc tat gag tac atg gtt cga agc 240 Lys Thr Thr Leu Asp Glu Ala Thr Cys Tyr Glu Tyr Met Val Arg Ser 65 70 75 80 cac tat gta aca gaa aca ctc tct gaa gaa gag gct ggg ttc cct tta 288 His Tyr Val Thr Glu Thr Leu Ser Glu Glu Glu Ala Gly Phe Pro Leu 85 90 95 gct tac aca gtg acc atc cac aaa gac ttc ggc act ttt gag agg ctc 336 Ala Tyr Thr Val Thr Ile His Lys Asp Phe Gly Thr Phe Glu Arg Leu 100 105 110 ttc agg gcg att tat atg ccc caa aat gtc tac tgt gtg cac ctg gat 384 Phe Arg Ala Ile Tyr Met Pro Gln Asn Val Tyr Cys Val His Leu Asp 115 120 125 cag aag gcg acg gat gcc ttt aaa ggt gca gtg aaa cag tta ctc agc 432 Gln Lys Ala Thr Asp Ala Phe Lys Gly Ala Val Lys Gln Leu Leu Ser 130 135 140 tgc ttc cca aat gct ttt ctg gct tcc aag aag gag tcg gtt gtc tat 480 Cys Phe Pro Asn Ala Phe Leu Ala Ser Lys Lys Glu Ser Val Val Tyr 145 150 155 160 ggg ggg atc tcc agg ctc cag gct gac ctg aac tgc ctg gaa gac ctt 528 Gly Gly Ile Ser Arg Leu Gln Ala Asp Leu Asn Cys Leu Glu Asp Leu 165 170 175 gtg gcc tct gaa gtt ccc tgg aag tat gtc atc aac acc tgc ggg caa 576 Val Ala Ser Glu Val Pro Trp Lys Tyr Val Ile Asn Thr Cys Gly Gln 180 185 190 gac ttt ccc ctg aaa acc aac agg gaa ata gtt cag tat ctg aag gga 624 Asp Phe Pro Leu Lys Thr Asn Arg Glu Ile Val Gln Tyr Leu Lys Gly 195 200 205 ttt aaa ggg aaa aat atc acc ccc gga gtg ctg cct cct gac cac gct 672 Phe Lys Gly Lys Asn Ile Thr Pro Gly Val Leu Pro Pro Asp His Ala 210 215 220 gtt gga cgg act aaa tac gtc cac caa gaa ctg tta aac cac aaa aat 720 Val Gly Arg Thr Lys Tyr Val His Gln Glu Leu Leu Asn His Lys Asn 225 230 235 240 tcc tac gtg att aaa aca aca aaa tta aaa act cct cct cct cat gac 768 Ser Tyr Val Ile Lys Thr Thr Lys Leu Lys Thr Pro Pro Pro His Asp 245 250 255 atg gtg att tac ttt ggc acg gcc tac gtg gct ctc aca agg gac ttt 816 Met Val Ile Tyr Phe Gly Thr Ala Tyr Val Ala Leu Thr Arg Asp Phe 260 265 270 gct aac ttc gtc ctc caa gac cag ctc gca ctt gac tta ctc tcc tgg 864 Ala Asn Phe Val Leu Gln Asp Gln Leu Ala Leu Asp Leu Leu Ser Trp 275 280 285 tcc aag gac acc tac agc ccc gac gaa cat ttc tgg gtg aca ctc aac 912 Ser Lys Asp Thr Tyr Ser Pro Asp Glu His Phe Trp Val Thr Leu Asn 290 295 300 agg att ccc ggt gtt cct ggc tct atg cca aat gca tcc tgg act gga 960 Arg Ile Pro Gly Val Pro Gly Ser Met Pro Asn Ala Ser Trp Thr Gly 305 310 315 320 aac ctc aga gct ata aag tgg agt gac atg gaa gac aga cac gga ggc 1008 Asn Leu Arg Ala Ile Lys Trp Ser Asp Met Glu Asp Arg His Gly Gly 325 330 335 tgc cac ggc cac tat gta cat ggt att tgt atc tat gga aac gga gac 1056 Cys His Gly His Tyr Val His Gly Ile Cys Ile Tyr Gly Asn Gly Asp 340 345 350 tta aag tgg ctg gtt aat tca cca agc ctg ttt gct aac aag ttt gag 1104 Leu Lys Trp Leu Val Asn Ser Pro Ser Leu Phe Ala Asn Lys Phe Glu 355 360 365 ctt aat acc tac ccc ctt act gtg gaa tgc cta gaa ctg agg cat cgc 1152 Leu Asn Thr Tyr Pro Leu Thr Val Glu Cys Leu Glu Leu Arg His Arg 370 375 380 gaa aga acc ctc aat cag agt gaa act gcg ata caa ccc agc tgg tat 1200 Glu Arg Thr Leu Asn Gln Ser Glu Thr Ala Ile Gln Pro Ser Trp Tyr 385 390 395 400 ttt tga 1206 Phe

【００５４】 <210> 3 <211> 402 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asn Phe Trp Arg Tyr Cys Phe Phe Ala Phe Thr Leu Leu Ser Val 1 5 10 15 Val Ile Phe Val Arg Phe Tyr Ser Ser Gln Leu Ser Pro Pro Lys Ser 20 25 30 Tyr Glu Lys Leu Asn Ser Ser Ser Glu Arg Tyr Phe Arg Lys Thr Ala 35 40 45 Cys Asn His Ala Leu Glu Lys Met Pro Val Phe Leu Trp Glu Asn Ile 50 55 60 Leu Pro Ser Pro Leu Arg Ser Val Pro Cys Lys Asp Tyr Leu Thr Gln 65 70 75 80 Asn His Tyr Ile Thr Ser Pro Leu Ser Glu Glu Glu Ala Ala Phe Pro 85 90 95 Leu Ala Tyr Val Met Val Ile His Lys Asp Phe Asp Thr Phe Glu Arg 100 105 110 Leu Phe Arg Ala Ile Tyr Met Pro Gln Asn Val Tyr Cys Val His Val 115 120 125 Asp Glu Lys Ala Pro Ala Glu Tyr Lys Glu Ser Val Arg Gln Leu Leu 130 135 140 Ser Cys Phe Gln Asn Ala Phe Ile Ala Ser Lys Thr Glu Ser Val Val 145 150 155 160 Tyr Ala Gly Ile Ser Arg Leu Gln Ala Asp Leu Asn Cys Leu Lys Asp 165 170 175 Leu Val Ala Ser Glu Val Pro Trp Lys Tyr Val Ile Asn Thr Cys Gly 180 185 190 Gln Asp Phe Pro Leu Lys Thr Asn Arg Glu Ile Val Gln His Leu Lys 195 200 205 Gly Phe Lys Gly Lys Asn Ile Thr Pro Gly Val Leu Pro Pro Asp His 210 215 220 Ala Ile Lys Arg Thr Lys Tyr Val His Gln Glu His Thr Asp Lys Gly 225 230 235 240 Gly Phe Phe Val Lys Asn Thr Asn Ile Leu Lys Thr Ser Pro Pro His 245 250 255 Gln Leu Thr Ile Tyr Phe Gly Thr Ala Tyr Val Ala Leu Thr Arg Glu 260 265 270 Phe Val Asp Phe Val Leu Arg Asp Gln Arg Ala Ile Asp Leu Leu Gln 275 280 285 Trp Ser Lys Asp Thr Tyr Ser Pro Asp Glu His Phe Trp Val Thr Leu 290 295 300 Asn Arg Val Ser Gly Val Pro Gly Ser Met Pro Asn Ala Ser Trp Thr 305 310 315 320 Gly Asn Leu Arg Ala Ile Lys Trp Ser Asp Met Glu Asp Arg His Gly 325 330 335 Gly Cys His Gly His Tyr Val His Gly Ile Cys Ile Tyr Gly Asn Gly 340 345 350 Asp Leu Lys Trp Leu Val Asn Ser Pro Ser Leu Phe Ala Asn Lys Phe 355 360 365 Glu Leu Asn Thr Tyr Pro Leu Thr Val Glu Cys Leu Glu Leu Arg His 370 375 380 Arg Glu Arg Thr Leu Asn Gln Ser Glu Thr Ala Ile Gln Pro Ser Trp 385 390 395 400 Tyr Phe

【００５５】 <210> 4 <211> 1209 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ATG AAC TTT TGG AGG TAC TGC TTT TTT GCT TTC ACT CTG CTC AGC GTG 48 Met Asn Phe Trp Arg Tyr Cys Phe Phe Ala Phe Thr Leu Leu Ser Val 1 5 10 15 GTC ATT TTT GTG AGA TTT TAC AGT AGC CAA TTG AGC CCG CCA AAA AGT 96 Val Ile Phe Val Arg Phe Tyr Ser Ser Gln Leu Ser Pro Pro Lys Ser 20 25 30 TAT GAG AAG CTG AAC AGT TCC AGT GAA AGG TAT TTT AGG AAA ACT GCC 144 Tyr Glu Lys Leu Asn Ser Ser Ser Glu Arg Tyr Phe Arg Lys Thr Ala 35 40 45 TGT AAT CAC GCC TTA GAG AAA ATG CCA GTC TTT TTG TGG GAA AAT ATA 192 Cys Asn His Ala Leu Glu Lys Met Pro Val Phe Leu Trp Glu Asn Ile 50 55 60 TTA CCA TCA CCT TTG CGA AGT GTC CCT TGC AAG GAT TAC CTG ACC CAG 240 Leu Pro Ser Pro Leu Arg Ser Val Pro Cys Lys Asp Tyr Leu Thr Gln 65 70 75 80 AAT CAC TAC ATC ACA AGT CCC CTG TCG GAA GAA GAG GCT GCA TTC CCT 288 Asn His Tyr Ile Thr Ser Pro Leu Ser Glu Glu Glu Ala Ala Phe Pro 85 90 95 TTG GCC TAT GTC ATG GTC ATC CAT AAG GAC TTT GAC ACC TTT GAA AGG 336 Leu Ala Tyr Val Met Val Ile His Lys Asp Phe Asp Thr Phe Glu Arg 100 105 110 CTC TTT AGG GCT ATC TAT ATG CCC CAA AAT GTC TAC TGT GTT CAC GTG 384 Leu Phe Arg Ala Ile Tyr Met Pro Gln Asn Val Tyr Cys Val His Val 115 120 125 GAT GAG AAA GCC CCA GCT GAG TAT AAG GAA TCT GTG AGG CAG TTA CTG 432 Asp Glu Lys Ala Pro Ala Glu Tyr Lys Glu Ser Val Arg Gln Leu Leu 130 135 140 AGT TGC TTC CAA AAT GCT TTC ATT GCT TCA AAG ACA GAG TCT GTG GTT 480 Ser Cys Phe Gln Asn Ala Phe Ile Ala Ser Lys Thr Glu Ser Val Val 145 150 155 160 TAT GCA GGC ATT TCC AGA CTC CAG GCT GAC CTG AAC TGT CTG AAA GAC 528 Tyr Ala Gly Ile Ser Arg Leu Gln Ala Asp Leu Asn Cys Leu Lys Asp 165 170 175 CTT GTC GCC TCT GAG GTT CCC TGG AAG TAC GTC ATC AAC ACC TGT GGA 576 Leu Val Ala Ser Glu Val Pro Trp Lys Tyr Val Ile Asn Thr Cys Gly 180 185 190 CAA GAC TTC CCC CTG AAA ACC AAC CGG GAG ATA GTT CAG CAT CTG AAA 624 Gln Asp Phe Pro Leu Lys Thr Asn Arg Glu Ile Val Gln His Leu Lys 195 200 205 GGA TTT AAA GGG AAA AAT ATC ACC CCA GGG GTG CTG CCT CCT GAC CAT 672 Gly Phe Lys Gly Lys Asn Ile Thr Pro Gly Val Leu Pro Pro Asp His 210 215 220 GCA ATT AAG CGA ACT AAA TAT GTC CAC CAA GAG CAT ACA GAT AAA GGT 720 Ala Ile Lys Arg Thr Lys Tyr Val His Gln Glu His Thr Asp Lys Gly 225 230 235 240 GGC TTT TTT GTG AAA AAT ACT AAT ATT TTG AAA ACT TCA CCT CCA CAT 768 Gly Phe Phe Val Lys Asn Thr Asn Ile Leu Lys Thr Ser Pro Pro His 245 250 255 CAG CTG ACC ATC TAC TTT GGC ACT GCC TAT GTG GCG CTT ACC AGA GAG 816 Gln Leu Thr Ile Tyr Phe Gly Thr Ala Tyr Val Ala Leu Thr Arg Glu 260 265 270 TTT GTC GAC TTT GTT CTA CGT GAC CAA AGG GCC ATT GAT CTA CTA CAA 864 Phe Val Asp Phe Val Leu Arg Asp Gln Arg Ala Ile Asp Leu Leu Gln 275 280 285 TGG TCA AAA GAT ACC TAT AGT CCT GAT GAG CAT TTC TGG GTG ACA CTT 912 Trp Ser Lys Asp Thr Tyr Ser Pro Asp Glu His Phe Trp Val Thr Leu 290 295 300 AAT AGG GTT TCA GGT GTT CCT GGC TCT ATG CCA AAT GCA TCC TGG ACT 960 Asn Arg Val Ser Gly Val Pro Gly Ser Met Pro Asn Ala Ser Trp Thr 305 310 315 320 GGA AAC CTC AGA GCT ATA AAG TGG AGT GAC ATG GAA GAC AGA CAC GGA 1008 Gly Asn Leu Arg Ala Ile Lys Trp Ser Asp Met Glu Asp Arg His Gly 325 330 335 GGC TGC CAC GGC CAC TAT GTA CAT GGT ATT TGT ATC TAT GGA AAC GGA 1056 Gly Cys His Gly His Tyr Val His Gly Ile Cys Ile Tyr Gly Asn Gly 340 345 350 GAC TTA AAG TGG CTG GTT AAT TCA CCA AGC CTG TTT GCT AAC AAG TTT 1104 Asp Leu Lys Trp Leu Val Asn Ser Pro Ser Leu Phe Ala Asn Lys Phe 355 360 365 GAG CTT AAT ACC TAC CCC CTT ACT GTG GAA TGC CTA GAA CTG AGG CAT 1152 Glu Leu Asn Thr Tyr Pro Leu Thr Val Glu Cys Leu Glu Leu Arg His 370 375 380 CGC GAA AGA ACC CTC AAT CAG AGT GAA ACT GCG ATA CAA CCC AGC TGG 1200 Arg Glu Arg Thr Leu Asn Gln Ser Glu Thr Ala Ile Gln Pro Ser Trp 385 390 395 400 TAT TTT TGA 1209 Tyr Phe

【００５６】 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide forward primer used in PCR for amplifying IGnT1 c DNA <400> 5 tgaggcatgc ctttatcaat gcgttacc 28

【００５７】 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide reverse primer used in PCR for amplifying IGnT1, IGnT2 and IGnT3 cDNAs <400> 6 tgaatagctc aaaaatacct gctgggttgt 30

【００５８】 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide forward primer used in PCR for amplifying IGnT2 c DNA <400> 7 tgaatgatgg gctcttggaa gcactgtc 28

【００５９】 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide forward primer used in PCR for amplifying IGnT3 c DNA <400> 8 gtgaaaataa tgaacttttg gaggtactgc tt 32

【００６０】 <210> 9 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide forward primer used in PCR for amplifying IGnT1 c DNA <400> 9 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cctaaatatc tcagaccctt tgaggctgac 60 t 61

【００６１】 <210> 10 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide forward primer used in PCR for amplifying IGnT1 c DNA <400> 10 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt ctgcacatct tttatcaatg gaaaaaca 58

【００６２】 <210> 11 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide forward primer used in PCR for amplifying IGnT2 c DNA <400> 11 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cctgagggca gctctgtcca atgcttca 58

【００６３】 <210> 12 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide forward primer used in PCR for amplifying IGnT2 c DNA <400> 12 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt ctgtcatcag atttttgagg ggaaag 56

【００６４】 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide forward primer used in PCR for amplifying IGnT3 c DNA <400> 13 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cctgaacagt tccagtgaaa ggtattttag 60

【００６５】 <210> 14 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide forward primer used in PCR for amplifying IGnT3 c DNA <400> 14 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt ctgtaatcac gccttagaga aaatgcca 58

【００６６】 <210> 15 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide reverse primer used in PCR for amplifying IGnT1, IGnT2 and IGnT3 cDNAs <400> 15 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcaaaaatac cagctgggtt gtatcgcag 59

【００６７】 <210> 16 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence of Igκ <400> 16 Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser Val Ile Met 1 5 10 15 Ser Arg Gly 20

【００６８】 <210> 17 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template used for PCR <400> 17 gatcatgcat tttcaagtgc agattttcag cttcctgcta atcagtgcct cagtcataat 60 gtcacgtgga catcaccatc accatcac 88

【００６９】 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 18 cgggatccat gcattttcaa gtgcag 26

【００７０】 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 19 ggaattcgtg atggtgatgg tgatg 25

【００７１】 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flag peptide emplyed for purification <400> 20 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

【００７２】 <210> 21 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template used for PCR <400> 21 gatcatgcat tttcaagtgc agattttcag cttcctgcta atcagtgcct cagtcataat 60 gtcacgtgga gattacaagg acgacgatga caag 94

【００７３】 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 22 ggaattcttg tcatcgtcgt ccttg 25

【００７４】 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 23 gatctggctg taatatcggc ac 22

【００７５】 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 24 aagacttctc atggatcatt ag 22

【００７６】 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 25 caacctagtg gtaagtgaag ag 22

【００７７】 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 26 tagcttcatc aagggtagtt ttc 23

【００７８】 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 27 cagaccaaag tgagagaggg ac 22

【００７９】 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer used for PCR <400> 28 ggacacttcg caaaggtgat gg 22

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (72)発明者稲葉二朗茨城県つくば市東１−１−１独立行政法人産業技術総合研究所つくばセンター内 (72)発明者王暁輝茨城県つくば市東１−１−１独立行政法人産業技術総合研究所つくばセンター内Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA10 CA04 CA09 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 HA12 4B050 CC01 CC03 DD07 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR55 QR62 QR82 QS25 QS34 QS36 QX02 4B065 AA01X AA57X AA90X AA93Y AB01 BA01 CA29 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１又は３に示されるア
ミノ酸配列又は該アミノ配列において１若しくは複数の
アミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配
列に１若しくは複数のアミノ酸が挿入され若しくは付加
されたアミノ配列を有し、ガラクトースにＮ−アセチル
グルコサミンをβ-1,6結合で転移する活性を有するタン
パク質。
【請求項２】前記タンパク質は、配列番号１又は配列
番号３に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を
有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】前記タンパク質は、配列番号１又は配列
番号３に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を
有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】前記タンパク質は、配列番号１又は３に
示されるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数
個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミ
ノ配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは
付加されたアミノ配列を有する請求項１記載のタンパク
質。
【請求項５】前記タンパク質は、配列番号１又は配列
番号３に示されるアミノ酸配列を有する請求項４記載の
タンパク質。
【請求項６】請求項１ないし５のいずれか１項に記載
のタンパク質をコードする核酸。
【請求項７】配列番号２又は４に示される塩基配列を
有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズする、請求項１記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項８】配列表の配列番号２に示される塩基配列
の1nt〜1203ntまで又は配列表の配列番号４に示される
塩基配列の1nt〜1206ntの塩基配列を有する請求項６記
載の核酸。
【請求項９】請求項６ないし８のいずれか１項に記載
の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することがで
きる組換えベクター。
【請求項１０】請求項６ないし８のいずれか１項に記
載の核酸が導入され、該核酸を発現する細胞。
【請求項１１】請求項６ないし８のいずれか１項に記
載の核酸と特異的にハイブリダイズする、該核酸の測定
用核酸。
【請求項１２】請求項８記載の核酸中の部分領域と相
補的な配列を有する請求項１１記載の測定用核酸。
【請求項１３】プローブ又はプライマーである請求項
１１又は１２記載の測定用核酸。
【請求項１４】塩基数が１５塩基以上である請求項１
３記載の測定用核酸。