JP2003089669A - 還元型補酵素ｑ１０の結晶化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 食品、栄養機能食品、特定保健用食品、栄養
補助剤、栄養剤、動物薬、飲料、飼料、化粧品、医薬
品、治療薬、予防薬等として有用な還元型補酵素Ｑ
₁₀を、工業的規模での生産に適した方法で、高品質且つ
効率的に得る方法の提供。 【解決手段】 還元型補酵素Ｑ₁₀を結晶化する際に、還
元型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相を、還元型補酵素Ｑ₁₀又は
該液相の固化温度以下の温度の貧溶媒中に添加して還元
型補酵素Ｑ₁₀の結晶を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、還元型補酵素Ｑ₁₀
の結晶化方法に関する。還元型補酵素Ｑ₁₀は、酸化型補
酵素Ｑ₁₀に対して高い経口吸収性を示し、優れた食品、
栄養機能食品、特定保健用食品、栄養補助剤、栄養剤、
動物薬、飲料、飼料、化粧品、医薬品、治療薬、予防薬
等として有用な化合物である。

【０００２】

【従来の技術】還元型補酵素Ｑ₁₀は、例えば、合成、発
酵、天然物からの抽出等の従来公知の方法により補酵素
Ｑ₁₀を得た後、クロマトグラフィーにより流出液中の還
元型補酵素Ｑ₁₀区分を濃縮する方法等により得られるこ
とが知られている（特開平１０−１０９９３３号公
報）。この場合には、上記還元型補酵素Ｑ₁₀中に含まれ
る酸化型補酵素Ｑ₁₀を、水素化ホウ素ナトリウム、亜ジ
チオン酸ナトリウム（次亜硫酸ナトリウム）等の一般的
な還元剤を用いて還元した後、クロマトグラフィーによ
る濃縮を行っても良いこと、また、還元型補酵素Ｑ
₁₀は、既存の高純度補酵素Ｑ₁₀に上記還元剤を作用させ
る方法によっても得られることも、該特許公報中に記載
されている。

【０００３】しかしながら、このようにして得られる還
元型補酵素Ｑ₁₀は、好適に結晶化させるのが容易ではな
く、低純度結晶、半固体状や油状物で得られやすい。ま
た、結晶化できたとしても、結晶が微細で、スラリーや
結晶の性状が悪く、晶析濃度が高めにくい、撹拌しにく
い、晶析缶から払い出しにくい、濾過性が悪くて結晶分
離に時間かかる、嵩比重が小さく梱包容器の大型化や個
数の増加につながるといった、生産性や操作性の問題が
あった。

【０００４】また、還元型補酵素Ｑ₁₀は分子酸素によっ
て酸化型補酵素Ｑ₁₀に酸化され易い。酸化防護の観点か
ら、比表面積のより小さい粒子、すなわち、大粒径の結
晶を効率的に取得することが望まれるところでもある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、操作性の極めて優れた還元型補酵素Ｑ₁₀結晶を得る
ための、工業的規模での製造に適した結晶化方法を提供
することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、還元型補酵素
Ｑ₁₀の高濃度液相を、還元型補酵素Ｑ₁₀の固化温度以
下、又は、該液相の固化温度以下の温度の貧溶媒中に添
加することを特徴とする還元型補酵素Ｑ₁₀の結晶化方法
である。

【０００７】本発明の方法によれば、スラリーや結晶の
性状を改善することができるため、生産性や操作性の優
れた方法により、高品質の還元型補酵素Ｑ₁₀を製造する
ことができる。さらに、大粒径の結晶を取得することが
できるため、還元型補酵素Ｑ ₁₀が分子酸素によって酸化
されるのを好適に防護することができ、酸化型補酵素Ｑ
₁₀の副生が最小化され、高品質の還元型補酵素Ｑ₁₀結晶
を取得することができる。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明に使用しうる還元型補酵素
Ｑ₁₀は、先述のごとく、例えば、合成、発酵、天然物か
らの抽出等の従来公知の方法により得ることができる。
好ましくは、既存の高純度補酵素Ｑ₁₀など酸化型補酵素
Ｑ₁₀、あるいは酸化型補酵素Ｑ₁₀と還元型補酵素Ｑ₁₀の
混合物を、一般的な還元剤を用いて還元することにより
得ることができる。まずは、酸化型補酵素Ｑ₁₀を還元す
る方法について説明する。

【００１０】還元型補酵素Ｑ₁₀は分子酸素によって酸化
され酸化型補酵素Ｑ₁₀を副生しやすいため、還元工程の
溶媒として酸化からの防護効果の高い溶媒を用いるのが
好ましい。このような溶媒としては、炭化水素類、脂肪
酸エステル類、エーテル類、及び、ニトリル類のうち少
なくとも一種を用いるのが好ましく、最も好ましくは炭
化水素類である。

【００１１】炭化水素類としては、特に制限されない
が、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲ
ン化炭化水素等を挙げることができる。特に、脂肪族炭
化水素、芳香族炭化水素が好ましく、とりわけ、脂肪族
炭化水素が好ましい。

【００１２】脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を
問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されない
が、通常、炭素数３〜２０、好ましくは、炭素数５〜１
２のものが用いられる。

【００１３】具体例としては、例えば、プロパン、ブタ
ン、イソブタン、ペンタン、２−メチルブタン、シクロ
ペンタン、２−ペンテン、ヘキサン、２−メチルペンタ
ン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタ
ン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、１−ヘキ
セン、シクロヘキセン、ヘプタン、２−メチルヘキサ
ン、３−メチルヘキサン、２、３−ジメチルペンタン、
２，４−ジメチルペンタン、メチルシクロヘキサン、１
−ヘプテン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタ
ン、イソオクタン、エチルシクロヘキサン、１−オクテ
ン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、１−ノ
ネン、デカン、１−デセン、ｐ−メンタン、ウンデカ
ン、ドデカン等を挙げることができる。

【００１４】中でも、炭素数５〜８の飽和脂肪族炭化水
素が好ましく、炭素数５のペンタン、２−メチルブタ
ン、シクロペンタン（ペンタン類と称す）；炭素数６の
ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタ
ン、２，３−ジメチルブタン、メチルシクロペンタン、
シクロヘキサン（ヘキサン類と称す）；炭素数７のヘプ
タン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，
３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン）、
メチルシクロヘキサン、（ヘプタン類と称す）；炭素数
８のオクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソ
オクタン、エチルシクロヘキサン（オクタン類と称
す）、及びこれらの混合物が好ましく用いられる。とり
わけ、上記ヘプタン類は酸化からの防護効果が特に高い
傾向がありさらに好ましく、ヘプタンが最も好ましい。

【００１５】芳香族炭化水素としては、特に制限されな
いが、普通、炭素数６〜２０、特に炭素数６〜１２、と
りわけ炭素数７〜１０のものが好適に用いられる。具体
例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、
ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベ
ンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベン
ゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチル
ベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ド
デシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。好
ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キ
シレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシ
チレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シ
クロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベ
ンゼンであり、より好ましくは、トルエン、キシレン、
ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、クメン、
テトラリンであり、最も好ましくは、クメンである。

【００１６】ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環
状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限され
ないが、一般に、非環状のものが好ましく用いられる。
普通、塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素が好ましく、
特に塩素化炭化水素が好ましい。炭素数１〜６、特に炭
素数１〜４、とりわけ炭素数１〜２のものが好適に用い
られる。

【００１７】具体例としては、例えば、ジクロロメタ
ン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタ
ン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロ
エタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１，１，
２−テトラクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロ
ロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、
１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレ
ン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，
２−ジクロロプロパン、１，２，３−トリクロロプロパ
ン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロ
エタン等を挙げることができる。

【００１８】好ましくは、ジクロロメタン、クロロホル
ム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジ
クロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，
１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエチレ
ン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、
クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタ
ンであり、より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホ
ルム、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレ
ン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロ
エタンである。

【００１９】脂肪酸エステル類としては、特に制限され
ないが、例えば、プロピオン酸エステル、酢酸エステ
ル、ギ酸エステル等を挙げることができる。特に、酢酸
エステル、ギ酸エステルが好ましく、とりわけ、酢酸エ
ステルが好ましい。特に制限されないが、一般に、エス
テル基としては、炭素数１〜８のアルキルエステル又は
アラルキルエステル、好ましくは炭素数１〜６のアルキ
ルエステル、より好ましくは炭素数１〜４のアルキルエ
ステルが好ましく用いられる。

【００２０】プロピオン酸エステルとしては、例えば、
プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン
酸ブチル、プロピオン酸イソペンチルを挙げることがで
きる。

【００２１】酢酸エステルとしては、例えば、酢酸メチ
ル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢
酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸
ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、
酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等を挙げることがで
きる。好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロ
ピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチ
ル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペン
チル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシルであ
り、より好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プ
ロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチ
ルであり、最も好ましくは、酢酸エチルである。

【００２２】ギ酸エステルとしては、例えば、ギ酸メチ
ル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ
酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ｓｅｃ−ブチル、ギ酸
ペンチル等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸メ
チル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イ
ソブチル、ギ酸ペンチルであり、最も好ましくは、ギ酸
エチルである。

【００２３】エーテル類としては、環状、非環状を問わ
ず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、
一般に、飽和のものが好ましく用いられる。普通、炭素
数３〜２０、特に炭素数４〜１２、とりわけ炭素数４〜
８のものが好適に用いられる。

【００２４】具体例としては、例えば、ジエチルエーテ
ル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエー
テル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジ
ヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニ
ルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニ
ルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、
２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロ
ピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレ
ングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジ
ブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテ
ル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレン
グリコールジブチルエーテル等を挙げることができる。

【００２５】好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔ
ｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソ
プロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエー
テル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエー
テル、メトキシトルエン、ジオキサン、２−メチルフラ
ン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレ
ングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジ
エチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテ
ル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレン
グリコールモノエチルエーテルであり、より好ましく
は、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテ
ル、アニソール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エ
チレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコ
ールモノエチルエーテルであり、さらに好ましくは、ジ
エチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ア
ニソール等であり、最も好ましくは、メチルｔｅｒｔ−
ブチルエーテルである。

【００２６】ニトリル類としては、環状、非環状を問わ
ず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、
一般に飽和のものが好ましく用いられる。普通、炭素数
２〜２０、特に炭素数２〜１２、とりわけ炭素数２〜８
のものが好適に用いられる。

【００２７】具体例としては、例えば、アセトニトリ
ル、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブチロニトリ
ル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニ
トリル、グルタロニトリル、ヘキサンニトリル、ヘプチ
ルシアニド、オクチルシアニド、ウンデカンニトリル、
ドデカンニトリル、トリデカンニトリル、ペンタデカン
ニトリル、ステアロニトリル、クロロアセトニトリル、
ブロモアセトニトリル、クロロプロピオニトリル、ブロ
モプロピオニトリル、メトキシアセトニトリル、シアノ
酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリル、ベンゾ
ニトリル、クロロベンゾニトリル、ブロモベンゾニトリ
ル、シアノ安息香酸、ニトロベンゾニトリル、アニソニ
トリル、フタロニトリル、ブロモトルニトリル、メチル
シアノベンゾエート、メトキシベンゾニトリル、アセチ
ルベンゾニトリル、ナフトニトリル、ビフェニルカルボ
ニトリル、フェニルプロピオニトリル、フェニルブチロ
ニトリル、メチルフェニルアセトニトリル、ジフェニル
アセトニトリル、ナフチルアセトニトリル、ニトロフェ
ニルアセトニトリル、クロロベンジルシアニド、シクロ
プロパンカルボニトリル、シクロヘキサンカルボニトリ
ル、シクロヘプタンカルボニトリル、フェニルシクロヘ
キサンカルボニトリル、トリルシクロヘキサンカルボニ
トリル等を挙げることができる。

【００２８】好ましくは、アセトニトリル、プロピオニ
トリル、スクシノニトリル、ブチロニトリル、イソブチ
ロニトリル、バレロニトリル、シアノ酢酸メチル、シア
ノ酢酸エチル、ベンゾニトリル、トルニトリル、クロロ
プロピオニトリルであり、より好ましくは、アセトニト
リル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロ
ニトリルであり、最も好ましくは、アセトニトリルであ
る。

【００２９】上記溶媒の中でも、沸点、粘性等の性質
（例えば、溶解度を高めるための適度な加温ができ、且
つ、湿体からの溶剤の乾燥除去や晶析濾液等からの溶剤
回収の行いやすい沸点（１気圧下、約３０〜１５０
℃）、室温での取り扱い時及び室温以下に冷却した時も
固化しにくい融点（約２０℃以下、好ましくは約１０℃
以下、より好ましくは約０℃以下）を持ち、粘性が低い
（２０℃において約１０ｃｐ以下等））を考慮して選定
するのが好ましい。工業的な作業上の観点から、常温で
揮発し難いものが好ましく、一般に、例えば、沸点が約
８０℃以上、更には約９０℃以上のものが特に好まし
い。

【００３０】上記溶媒のうち、還元反応の溶媒として
は、水と相溶性の低い溶媒を用いるのが特に好ましく、
後述する還元剤や還元剤に由来する不純物を水相に抽
出、除去し、還元型補酵素Ｑ₁₀を効率的に精製、取得す
るのを助成する。

【００３１】還元型補酵素Ｑ₁₀は高濃度の溶液ほど酸化
されにくい傾向にある。上記溶媒に対して還元型補酵素
Ｑ₁₀は高い溶解性を示し、上記溶媒はこの点でも酸化防
護に好適である。還元型補酵素Ｑ₁₀の酸化を防護するた
めに好ましい濃度は、溶媒の種類などにより一律に規定
できないが、上記溶媒に対する還元型補酵素Ｑ₁₀の濃度
として、普通１ｗ／ｗ％以上、好ましくは２ｗ／ｗ％以
上である。上限は、特に制限されないが、実際的な操作
性という観点から、４００ｗ／ｗ％、好ましくは２００
ｗ／ｗ％、より好ましくは１００ｗ／ｗ％、とりわけ５
０ｗ／ｗ％である。

【００３２】しかして、上記溶媒の使用によって、望ま
しくない酸素の副反応は、還元工程を通して最小化され
る。

【００３３】還元反応は、上記の溶媒中、水素化金属化
合物、鉄（金属又は塩としての鉄）、亜鉛（金属として
の亜鉛）、次亜硫酸類、アスコルビン酸類等を還元剤と
して用いて実施することができる。

【００３４】水素化金属化合物としては、特に制限され
ないが、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化リチ
ウムアルミニウム等を挙げることができる。上記水素化
金属化合物の使用量は、水素化金属化合物の種類により
異なり、一律に規定できないが、普通、理論水素当量の
１〜３倍量で好適に実施できる。

【００３５】鉄または亜鉛を用いる還元は、普通、酸を
使用して実施される。酸としては、特に制限されない
が、例えば、酢酸等の脂肪酸、メタンスルホン酸等のス
ルホン酸、塩酸や硫酸等の無機酸等を挙げることができ
る。好ましくは無機酸であり、より好ましくは、硫酸で
ある。

【００３６】鉄の使用量は、特に制限されないが、酸化
型補酵素Ｑ₁₀の仕込み重量に対して、例えば、約１／５
重量以上で好適に実施できる。上限は特に制限されない
が、経済性の観点等から、約２倍重量以下である。な
お、鉄は、金属のみならず、硫酸鉄（II）等の塩の形態
でも使用できる。

【００３７】亜鉛の使用量は、特に制限されないが、酸
化型補酵素Ｑ₁₀の仕込み重量に対して、例えば、約１／
１０重量以上で好適に実施できる。上限は特に制限され
ないが、経済性の観点等から、約２倍重量以下である。

【００３８】次亜硫酸類としては、特に制限されず、普
通、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウ
ム塩等が用いられるが、好ましくはリチウム塩、ナトリ
ウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩であり、より好
ましくはナトリウム塩である。上記次亜硫酸類の使用量
は、特に制限されないが、普通、酸化型補酵素Ｑ₁₀の仕
込み重量に対して、約１／５重量以上、好ましくは約２
／５重量以上、より好ましくは約３／５重量以上であ
る。多くても特に支障はないが、経済的に不利であるた
め、普通、約２倍重量以下、好ましくは同重量以下で用
いられる。普通、約２／５重量〜約同重量の範囲で好適
に実施できる。

【００３９】アスコルビン酸類としては、特に制限され
ず、例えば、アスコルビン酸のみならず、rhamno−アス
コルビン酸、arabo−アスコルビン酸、gluco−アスコル
ビン酸、fuco−アスコルビン酸、glucohepto−アスコル
ビン酸、xylo−アスコルビン酸、galacto−アスコルビ
ン酸、gulo−アスコルビン酸、allo−アスコルビン酸、
erythro−アスコルビン酸、６−デスオキシアスコルビ
ン酸等のアスコルビン酸に類するものを含み、更に、そ
れらのエステル体や塩であってもかまわない。これら
は、Ｌ体、Ｄ体、或いは、ラセミ体であっても良い。具
体的には、例えば、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコル
ビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビルステアレート、
Ｄ−arabo−アスコルビン酸等を挙げることができる。
還元型補酵素Ｑ₁₀の製造において、上記のアスコルビン
酸類をいずれも好適に使用しうるが、生成した還元型補
酵素Ｑ₁₀との分離のしやすさ等を考慮すると、上記のア
スコルビン酸類のうち、特に水溶性のものが好適に用い
られ、最も好ましくは、入手容易性、価格等の観点か
ら、Ｌ−アスコルビン酸、Ｄ−arabo−アスコルビン酸
等のフリー体である。

【００４０】上記のアスコルビン酸類の使用量は、特に
制限されず、酸化型補酵素Ｑ₁₀を還元型補酵素Ｑ₁₀に変
換しうる有効量であればよく、一般的に、酸化型補酵素
Ｑ₁₀に対して、普通１倍モル量以上、好ましくは１．２
倍モル量以上である。上限は特に制限されないが、経済
性も考慮して、普通１０倍モル量、好ましくは５倍モル
量、より好ましくは３倍モル量である。

【００４１】上記還元剤のうち、還元能力、収率、品質
といった観点から、特に、亜鉛、次亜硫酸類、アスコル
ビン酸類が好ましく、特に次亜硫酸類（具体的には、次
亜硫酸塩）、アスコルビン酸類が好ましい。

【００４２】還元反応においては、後述するアルコール
類及び／又は水を好適に併用することができる。水は、
特に還元剤として鉄、亜鉛、次亜硫酸類を用いる場合に
好適である。還元剤として水素化金属化合物やアスコル
ビン酸類を用いる場合にはアルコール類を併用すること
ができる。これら水、アルコール類の併用は、これらの
特性が発揮され、反応速度の向上や反応収率の向上等に
寄与する。

【００４３】以下に好ましい還元方法について詳細に述
べる。

【００４４】上記次亜硫酸類を用いる還元は、水を併用
して、上記の炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル
類、及び、ニトリル類のうち少なくとも一種の有機溶媒
（好ましくは炭化水素類、より好ましくは脂肪族炭化水
素、なかでもヘプタン類、特にヘプタン）との混合溶媒
系で実施するのが好ましい。その際、反応時のｐＨは、
収率等の観点から、普通ｐＨ７以下、好ましくはｐＨ３
〜７、より好ましくはｐＨ３〜６で実施される。上記ｐ
Ｈは、塩酸や硫酸等の鉱酸等の酸や水酸化ナトリウム等
のアルカリ金属水酸化物等の塩基を用いて、調整するこ
とができる。

【００４５】上記次亜硫酸類を用いる還元において、水
の使用量は、特に制限されず、還元剤である次亜硫酸類
を適度に溶解する量であれば良く、例えば、一般的に
は、上記次亜硫酸類の水に対する重量が、普通、３０ｗ
／ｗ％以下、好ましくは２０ｗ／ｗ％以下になるように
調整するのが良い。又、生産性等の観点から、普通、１
ｗ／ｗ％以上、好ましくは５ｗ／ｗ％以上、より好まし
くは１０ｗ／ｗ％以上であるのが良い。

【００４６】上記アスコルビン酸類を用いる還元も、上
記の炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、及
び、ニトリル類のうち、特に水と相溶性の高い溶媒、な
かでも水と相溶性の高いエーテル類及びニトリル類、具
体的には、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニ
トリル等を用いて実施することができるが、後述するア
ルコール類及び／又はケトン類（好ましくは、水と相溶
性の高いアルコール類及び／又はケトン類（具体的に
は、アルコール類としては、炭素数１〜５、好ましくは
炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１〜３の１価又は
２価（好ましくは１価）のアルコール、ケトン類として
は、アセトン、メチルエチルケトン等））を使用するの
が特に好ましい。すなわち、アスコルビン酸類を用いる
還元においては、アルコール類及び／又は水溶性有機溶
媒を用いるのが好ましい。又、アスコルビン酸類を用い
る還元においては、反応促進剤（例えば、反応温度の低
下、反応時間の短縮等）として塩基性物質や亜硫酸水素
塩等の反応促進効果を有する添加剤を共存させて実施す
ることができる。

【００４７】上記の塩基性物質としては、特に制限され
ず、例えば、無機化合物、有機化合物を問わず使用しう
る。上記無機化合物としては、特に制限されないが、例
えば、金属（好ましくは、アルカリ金属、アルカリ土類
金属等）の水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩やアンモニア
等を挙げることができる。その代表的なものとして、例
えば、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭
酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素ナトリ
ウム等のアルカリ金属炭酸水素塩、炭酸マグネシウム等
のアルカリ土類金属炭酸塩等を挙げることができる。上
記有機化合物としては、特に制限されないが、例えば、
トリエチルアミン等のアミン等を挙げることができる。
上記の塩基性物質のうち、金属（好ましくは、アルカリ
金属、アルカリ土類金属等）の炭酸塩、炭酸水素塩、ア
ンモニア等の無機化合物；トリエチルアミン等のアミン
等の有機化合物といった弱い塩基性物質（弱塩基又は弱
アルカリ）を特に好ましく使用できる。最も好ましく
は、上記無機化合物であり、より好ましくは、上記の弱
塩基性の無機化合物である。

【００４８】また、亜硫酸水素塩としては、例えば、亜
硫酸水素ナトリウム等のアルカリ金属亜硫酸水素塩等を
好適なものとして挙げることができる。

【００４９】上記添加剤の量は、期待する程度の反応促
進効果を発揮しうる量（有効量）であればよく、特に制
限されないが、一般的に、経済性も考慮して、アスコル
ビン酸類に対して、普通２０倍モル量以下、好ましくは
１０倍モル量以下、より好ましくは５倍モル量以下、特
に２倍モル以下である。下限は、特に制限されないが、
普通０．０１倍モル量以上、好ましくは０．０５倍モル
量以上、より好ましくは０．１倍モル量以上、特に０．
２倍モル量以上である。

【００５０】還元反応は、強制流動下に実施するのが好
ましい。単位容積当たりの撹拌所要動力として、通常約
０．０１ｋＷ／ｍ³以上、好ましくは約０．１ｋＷ／ｍ³
以上、より好ましくは約０．３ｋＷ／ｍ³以上の流動が
好ましい。上記の強制流動は、通常、撹拌翼の回転によ
り与えられるが、上記流動が得られれば必ずしも撹拌翼
を用いる必要はなく、例えば、液の循環による方法など
を利用しても良い。

【００５１】還元温度は、還元剤の種類や量によって異
なり、一律に規定できない。例えば、次亜硫酸類を用い
る還元においては、普通１００℃以下、好ましくは８０
℃以下、より好ましくは６０℃以下で実施される。下限
は、系の固化温度である。通常、０〜１００℃程度、好
ましくは０〜８０℃程度、より好ましくは０〜６０℃程
度で好適に実施できる。アスコルビン酸類を用いる還元
においては、普通３０℃以上、好ましくは４０℃以上、
より好ましくは５０℃以上で実施される。上限は系の沸
点である。通常、３０〜１５０℃程度、好ましくは４０
〜１２０℃程度、より好ましくは５０〜１００℃程度で
好適に実施できる。

【００５２】反応濃度は、特に制限はないが、一般に、
溶媒の重量に対する酸化型補酵素Ｑ ₁₀の重量として、普
通約１ｗ／ｗ％以上、好ましくは３ｗ／ｗ％以上、より
好ましくは１０ｗ／ｗ％以上、とりわけ１５ｗ／ｗ％以
上である。上限は、特に制限されないが、普通約６０ｗ
／ｗ％、好ましくは５０ｗ／ｗ％、より好ましくは４０
ｗ／ｗ％、とりわけ３０ｗ／ｗ％である。一般に、約２
〜３０ｗ／ｗ％、好ましくは約５〜３０ｗ／ｗ％、より
好ましくは約１０〜３０ｗ／ｗ％で好適に実施できる。

【００５３】還元反応は、通常、４８時間以内、好まし
くは２４時間以内、より好ましくは１０時間以内、とり
わけ好ましくは５時間以内に完了させることができる。

【００５４】このようにして得られた反応混合物から、
生成した還元型補酵素Ｑ₁₀を含有する有機溶媒の溶液を
採取し、本発明の結晶化法に用いることができる。

【００５５】結晶化に際し、該有機溶媒の溶液を、例え
ば、予め水や食塩水等を用いて繰り返し水洗することに
より、夾雑物を除去することもできる。還元型補酵素Ｑ
₁₀を含有する有機溶媒の溶液は、更に好ましくは、濃縮
又は溶媒置換して、還元型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相を得
ることができる。言うまでもなく、反応混合物を濃縮し
てもよい。最も好ましくは、上記有機溶媒の溶液の濃縮
に際して、共存する溶媒を完全に又はほぼ完全に留去す
るために、還元型補酵素Ｑ₁₀の融解温度以上、又は、還
元型補酵素Ｑ₁₀を主成分とする濃縮物の融解温度以上の
温度に高めることにより、還元型補酵素Ｑ₁₀の油状物を
得ることができる。還元型補酵素Ｑ₁₀の油状物を得るた
めの上記温度は、共存する有機溶媒の量にもよる為、一
律には規定できないが、例えば、好ましくは４０℃以
上、より好ましくは４５℃以上、特に５０℃以上、とり
わけ６０℃以上である。溶媒の種類や残存量にもよる
が、好ましくは４０〜１００℃、より好ましくは５０〜
８０℃の範囲で好適に実施できる。

【００５６】また、還元型補酵素Ｑ₁₀の油状物は、酸化
型補酵素Ｑ₁₀の油状物を水中で還元したのち、水相を除
去することによっても取得することができる。この場
合、還元温度は、還元型補酵素Ｑ₁₀の純度等にもよる
が、普通、４５℃以上、好ましくは４８℃以上、より好
ましくは５０℃以上で実施される。上限は、系の沸点で
あるが、通常１００℃以下、好ましくは８０℃以下、よ
り好ましくは６０℃以下である。

【００５７】この方法においては、有機溶媒の分離及び
濃縮といった時間の消費、高価な製造装置や容量の増大
を避けて、還元型補酵素Ｑ₁₀を合成することができる。

【００５８】なお、上記還元反応および後処理（有機相
の分離、洗浄）は、脱酸素雰囲気下で実施するのが極め
て好ましく、特に次亜硫酸類を用いた還元反応では、還
元反応収率向上や還元剤量の削減に大きく寄与すること
も見い出した。脱酸素雰囲気は、不活性ガスによる置
換、減圧、沸騰やこれらを組み合わせることにより達成
できる。少なくとも、不活性ガスによる置換、即ち、不
活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。上記不活性ガ
スとしては、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴ
ンガス、水素ガス、炭酸ガス等を挙げることができ、好
ましくは窒素ガスである。

【００５９】次に、還元型補酵素Ｑ₁₀の結晶化法につい
て説明する。

【００６０】晶析に用いる還元型補酵素Ｑ₁₀は、例え
ば、合成、発酵、天然物からの抽出等の従来公知の方法
により得ることができる。本発明の結晶化方法は、酸化
型補酵素Ｑ₁₀を比較的多く含んだ還元型補酵素Ｑ₁₀に対
しても適用できるが、上記の方法で取得した高純度還元
型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相に適用した場合、特に効果的
である。

【００６１】本発明において、還元型補酵素Ｑ₁₀の結晶
化は、還元型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相を、還元型補酵素
Ｑ₁₀又は該液相の固化温度以下の貧溶媒中に添加又は滴
下することにより行われる。

【００６２】還元型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相としては、
特に制限されないが、還元型補酵素Ｑ₁₀の濃度が、例え
ば５０％以上、特に７０％以上、とりわけ９０％以上の
ものであるのが好ましい。言うまでもなく、還元型補酵
素Ｑ₁₀の油状物は最も好適な形態である。

【００６３】還元型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相中に共存す
る溶媒としては、特に制限されず、炭化水素類、脂肪酸
エステル類、エーテル類、アルコール類、ケトン類、脂
肪酸類、ニトリル類、窒素化合物類（ニトリル類を除
く）、硫黄化合物類、水等を挙げることができる。

【００６４】炭化水素類としては、特に制限されない
が、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲ
ン化炭化水素等を挙げることができる。特に、脂肪族炭
化水素、芳香族炭化水素が好ましく、とりわけ、脂肪族
炭化水素が好ましい。

【００６５】脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を
問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されない
が、通常、炭素数３〜２０、好ましくは、炭素数５〜１
２のものが用いられる。結晶化収率の観点からは、非環
状脂肪族炭化水素が最も好ましい。

【００６６】具体例としては、例えば、プロパン、ブタ
ン、イソブタン、ペンタン、２−メチルブタン、シクロ
ペンタン、２−ペンテン、ヘキサン、２−メチルペンタ
ン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタ
ン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、１−ヘキ
セン、シクロヘキセン、ヘプタン、２−メチルヘキサ
ン、３−メチルヘキサン、２、３−ジメチルペンタン、
２，４−ジメチルペンタン、メチルシクロヘキサン、１
−ヘプテン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタ
ン、イソオクタン、エチルシクロヘキサン、１−オクテ
ン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、１−ノ
ネン、デカン、１−デセン、ｐ−メンタン、ウンデカ
ン、ドデカン等を挙げることができる。

【００６７】中でも、炭素数５〜８の飽和脂肪族炭化水
素が好ましく、炭素数５のペンタン、２−メチルブタ
ン、シクロペンタン（ペンタン類と称す）；炭素数６の
ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタ
ン、２，３−ジメチルブタン、メチルシクロペンタン、
シクロヘキサン（ヘキサン類と称す）；炭素数７のヘプ
タン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，
３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン）、
メチルシクロヘキサン、（ヘプタン類と称す）；炭素数
８のオクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソ
オクタン、エチルシクロヘキサン（オクタン類と称
す）、及びこれらの混合物が好ましく用いられる。とり
わけ、上記ヘプタン類は酸化からの防護効果が特に高い
傾向がありさらに好ましく、収率の観点からはヘプタン
が最も好ましい。

【００６８】芳香族炭化水素としては、特に制限されな
いが、普通、炭素数６〜２０、特に炭素数６〜１２、と
りわけ炭素数７〜１０のものが好適に用いられる。具体
例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、
ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベ
ンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベン
ゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチル
ベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ド
デシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。好
ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キ
シレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシ
チレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シ
クロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベ
ンゼンであり、より好ましくは、トルエン、キシレン、
ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、クメン、
テトラリンであり、最も好ましくは、クメンである。

【００６９】ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環
状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限され
ないが、一般に、非環状のものが好ましく用いられる。
普通、塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素が好ましく、
特に塩素化炭化水素が好ましい。炭素数１〜６、特に炭
素数１〜４、とりわけ炭素数１〜２のものが好適に用い
られる。

【００７０】具体例としては、例えば、ジクロロメタ
ン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタ
ン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロ
エタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１，１，
２−テトラクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロ
ロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、
１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレ
ン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，
２−ジクロロプロパン、１，２，３−トリクロロプロパ
ン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロ
エタン等を挙げることができる。

【００７１】好ましくは、ジクロロメタン、クロロホル
ム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジ
クロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，
１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエチレ
ン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、
クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタ
ンであり、より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホ
ルム、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレ
ン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロ
エタンである。

【００７２】脂肪酸エステル類としては、特に制限され
ないが、例えば、プロピオン酸エステル、酢酸エステ
ル、ギ酸エステル等を挙げることができる。特に、酢酸
エステル、ギ酸エステルが好ましく、とりわけ、酢酸エ
ステルが好ましい。特に制限されないが、一般に、エス
テル基としては、炭素数１〜８のアルキルエステル又は
アラルキルエステル、好ましくは炭素数１〜６のアルキ
ルエステル、より好ましくは炭素数１〜４のアルキルエ
ステルが好ましく用いられる。

【００７３】プロピオン酸エステルとしては、例えば、
プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン
酸ブチル、プロピオン酸イソペンチルを挙げることがで
きる。

【００７４】酢酸エステルとしては、例えば、酢酸メチ
ル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢
酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸
ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、
酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等を挙げることがで
きる。好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロ
ピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチ
ル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペン
チル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシルであ
り、より好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プ
ロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチ
ルであり、最も好ましくは、酢酸エチルである。

【００７５】ギ酸エステルとしては、例えば、ギ酸メチ
ル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ
酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ｓｅｃ−ブチル、ギ酸
ペンチル等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸メ
チル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イ
ソブチル、ギ酸ペンチルであり、最も好ましくは、ギ酸
エチルである。

【００７６】エーテル類としては、環状、非環状を問わ
ず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、
一般に、飽和のものが好ましく用いられる。普通、炭素
数３〜２０、特に炭素数４〜１２、とりわけ炭素数４〜
８のものが好適に用いられる。

【００７７】具体例としては、例えば、ジエチルエーテ
ル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエー
テル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジ
ヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニ
ルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニ
ルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、
２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロ
ピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレ
ングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジ
ブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテ
ル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレン
グリコールジブチルエーテル等を挙げることができる。

【００７８】好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔ
ｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソ
プロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエー
テル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエー
テル、メトキシトルエン、ジオキサン、２−メチルフラ
ン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレ
ングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジ
エチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテ
ル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレン
グリコールモノエチルエーテルであり、より好ましく
は、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテ
ル、アニソール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エ
チレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコ
ールモノエチルエーテルであり、さらに好ましくは、ジ
エチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ア
ニソール等であり、最も好ましくは、メチルｔｅｒｔ−
ブチルエーテルである。

【００７９】アルコール類としては、環状、非環状を問
わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されない
が、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。普通、
炭素数１〜２０、特に炭素数１〜１２、とりわけ炭素数
１〜６、なかでも炭素数１〜５の１価アルコールが好ま
しく、又、炭素数２〜５の２価アルコールが好ましく、
又、炭素数３の３価アルコールが好ましい。

【００８０】１価のアルコールとしては、例えば、メタ
ノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノ
ール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルア
ルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノ
ール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチ
ル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒ
ｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノー
ル、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−
メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノ
ール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノー
ル、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタ
ノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノ
ール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカ
ノール、１−ドデカノール、アリルアルコール、プロパ
ルギルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサ
ノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシ
クロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４
−メチルシクロヘキサノール等を挙げることができる。

【００８１】好ましくは、メタノール、エタノール、１
−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、
２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブ
チルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノー
ル、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、
イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコー
ル、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコ
ール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノー
ル、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−
ブタノール、シクロヘキサノールであり、より好ましく
は、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−
プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソ
ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−
ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、
２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコー
ル、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−
ブタノール、ネオペンチルアルコールであり、さらに好
ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノー
ル、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノー
ル、イソブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノー
ル、イソペンチルアルコールであり、最も好ましくは、
エタノールである。

【００８２】２価のアルコールとしては、１，２−エタ
ンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロ
パンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタ
ンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタン
ジオール、１，５−ペンタンジオール等を挙げることが
できる。好ましくは、１，２−エタンジオール、１，２
−プロパンジオール、１，３−プロパンジオールであ
り、最も好ましくは、１，２−エタンジオールである。

【００８３】３価のアルコールとしてはグリセリン等を
好適に用いることができる。

【００８４】ケトン類としては、特に制限されず、普通
炭素数３〜６のものが好適に用いられる。具体例として
は、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブ
チルケトン、メチルイソブチルケトン等を挙げることが
でき、好ましくは、アセトン、メチルエチルケトンであ
り、最も好ましくは、アセトンである。

【００８５】ニトリル類としては、環状、非環状を問わ
ず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、
一般に飽和のものが好ましく用いられる。普通、炭素数
２〜２０、特に炭素数２〜１２、とりわけ炭素数２〜８
のものが好適に用いられる。

【００８６】具体例としては、例えば、アセトニトリ
ル、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブチロニトリ
ル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニ
トリル、グルタロニトリル、ヘキサンニトリル、ヘプチ
ルシアニド、オクチルシアニド、ウンデカンニトリル、
ドデカンニトリル、トリデカンニトリル、ペンタデカン
ニトリル、ステアロニトリル、クロロアセトニトリル、
ブロモアセトニトリル、クロロプロピオニトリル、ブロ
モプロピオニトリル、メトキシアセトニトリル、シアノ
酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリル、ベンゾ
ニトリル、クロロベンゾニトリル、ブロモベンゾニトリ
ル、シアノ安息香酸、ニトロベンゾニトリル、アニソニ
トリル、フタロニトリル、ブロモトルニトリル、メチル
シアノベンゾエート、メトキシベンゾニトリル、アセチ
ルベンゾニトリル、ナフトニトリル、ビフェニルカルボ
ニトリル、フェニルプロピオニトリル、フェニルブチロ
ニトリル、メチルフェニルアセトニトリル、ジフェニル
アセトニトリル、ナフチルアセトニトリル、ニトロフェ
ニルアセトニトリル、クロロベンジルシアニド、シクロ
プロパンカルボニトリル、シクロヘキサンカルボニトリ
ル、シクロヘプタンカルボニトリル、フェニルシクロヘ
キサンカルボニトリル、トリルシクロヘキサンカルボニ
トリル等を挙げることができる。

【００８７】好ましくは、アセトニトリル、プロピオニ
トリル、スクシノニトリル、ブチロニトリル、イソブチ
ロニトリル、バレロニトリル、シアノ酢酸メチル、シア
ノ酢酸エチル、ベンゾニトリル、トルニトリル、クロロ
プロピオニトリルであり、より好ましくは、アセトニト
リル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロ
ニトリルであり、最も好ましくは、アセトニトリルであ
る。

【００８８】窒素化合物類としては、例えば、ニトロメ
タン、トリエチルアミン、ピリジン、ホルムアミド、Ｎ
−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリ
ドン等を挙げることができる。

【００８９】硫黄化合物類としては、例えば、ジメチル
スルホキシド、スルホラン等を挙げることができる。

【００９０】脂肪酸類としては、例えば、ギ酸、酢酸、
プロピオン酸等を挙げることができるが、ギ酸、酢酸が
好ましく、最も好ましくは酢酸である。

【００９１】上記溶媒のなかでも、還元型補酵素Ｑ₁₀の
高濃度液相中に共存する溶媒としては、炭化水素類（特
に、ヘプタン類等の脂肪族炭化水素）、脂肪酸エステル
類（特に、酢酸エチル等の酢酸エステル）、エーテル類
（メチルｔ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン
等）、ケトン類（アセトン等）、アルコール類（エタノ
ール等）、ニトリル類（アセトニトリル等）が好まし
く、特に、エーテル類、アルコール類、ケトン類、ニト
リル類が好ましく、とりわけ、アルコール類が好まし
い。

【００９２】還元型補酵素Ｑ₁₀の各種有機溶媒に対する
溶解度は高い温度依存性、すなわち、還元型補酵素Ｑ₁₀
は上記有機溶媒に、低温では溶けにくく、高温では溶け
やすい傾向を示す。従って、上記の有機溶媒はいずれ
も、温度を調整することによって貧溶媒としても用いる
ことができる。

【００９３】しかしながら、還元型補酵素Ｑ₁₀の結晶化
においては、貧溶媒は結晶形状や結晶の粒径に重大な影
響を与えることから、上記溶媒のなかでも、貧溶媒とし
ては、炭化水素類（特に、ヘプタン類等の脂肪族炭化水
素）、ケトン類（アセトン等）、アルコール類（エタノ
ール等）、ニトリル類（アセトニトリル等）、水、ケト
ン類と水との混合溶媒、アルコール類と水との混合溶媒
を用いるのが好ましい。より好ましくは、アルコール
類、ケトン類、水、アルコール類と水との混合溶媒、ケ
トン類と水との混合溶媒であり、さらに好ましくは、
水、アルコール類、アルコール類と水の混合溶媒であ
り、最も好ましくは、アルコール類と水の混合溶媒であ
る。

【００９４】さらに上記溶媒のなかでも、互いに相溶性
の高い、好ましくは、互いに相溶性のある溶媒を、本発
明における還元型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相中に共存する
溶媒並びに貧溶媒として用いるのが好ましい。

【００９５】還元型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相中に共存す
る溶媒／貧溶媒の好ましい組み合わせとしては、例え
ば、炭化水素類／炭化水素類、炭化水素類／アルコール
類と水の混合溶媒、アルコール類／アルコール類、アル
コール類／水、アルコール類／アルコール類と水の混合
溶媒、ケトン類／水、ケトン類／アルコール類と水の混
合溶媒、エーテル類／水、エーテル類／アルコール類と
水の混合溶媒、ニトリル類／水、ニトリル類／アルコー
ル類と水の混合溶媒、脂肪酸エステル類／炭化水素類、
脂肪酸エステル類／アルコール類と水の混合溶媒、エー
テル類／炭化水素類、エーテル類／炭化水素類と水との
混合溶媒等を挙げることができる。

【００９６】本発明においては、還元型補酵素Ｑ₁₀の高
濃度液相を、還元型補酵素Ｑ₁₀又は該液相の固化温度以
下の貧溶媒に滴下する。該温度は、還元型補酵素Ｑ₁₀の
高濃度液相中に共存する溶媒の種類や量、貧溶媒の種類
等により異なるので一律に規定できないが、普通約４０
℃以下、好ましくは約３０℃以下、より好ましくは約２
０℃以下である。結晶化速度を高めて、晶析槽内への付
着を減らす、良好な性状のスラリー得る、収率を高める
ためには、上記温度は低いほど好ましい。結晶化時の温
度の下限は、系の固化温度であるが、普通、約−２０℃
以上、好ましくは約−１０℃以上、より好ましくは約０
℃以上である。

【００９７】また、結晶化を促進させるために、種晶を
添加することも好ましく行われる。種晶添加量は、特に
制限されないが、普通、１％以下で充分である。

【００９８】尚、晶析槽内の温度等の条件によっては、
添加又は滴下と同時に固化（結晶化）が進行しうるが、
その場合も特に支障はない。

【００９９】上記結晶化は、普通、強制流動下に実施す
るのが好ましい。目的とする粒径等によっても異なる
が、普通は、単位容積当たりの撹拌所要動力として、通
常約０．０１ｋＷ／ｍ³以上、好ましくは約０．１ｋＷ
／ｍ³以上、より好ましくは約０．３ｋＷ／ｍ³以上の流
動が好ましい。上記の強制流動は、通常、撹拌翼の回転
により与えられるが、上記流動が得られれば必ずしも撹
拌翼を用いる必要はなく、例えば、液の循環による方法
などを利用する方法も考え得る。

【０１００】結晶化時の単位時間当たりの上記高濃度液
相の添加（滴下）量は、特に制限されないが、例えば、
単位時間当たり全量が添加（滴下）される速度（１００
％量／時間）以下であり、好ましくは、単位時間当たり
全量の約５０％量が添加（滴下）される速度（５０％量
／時間）以下、より好ましくは、単位時間当たり全量の
約２５％量が添加（滴下）される速度（２５％量／時
間）以下である。

【０１０１】結晶化終了時の濃度は、特に制限はない
が、一般に、全溶媒の重量に対する還元型補酵素Ｑ₁₀の
重量として、約５０ｗ／ｗ％以下、好ましくは約４０ｗ
／ｗ％以下、より好ましくは約３０％以下である。濃度
の下限は、特に制限されないが、生産性の観点から、通
常、約１ｗ／ｗ％であり、好ましくは約２ｗ／ｗ％であ
る。

【０１０２】このようにして得られる還元型補酵素Ｑ₁₀
の結晶は、好ましくは、例えば、遠心分離、加圧濾過、
減圧濾過等による固液分離、更に、必要に応じてケーキ
洗浄を行い、更に、減圧乾燥（真空乾燥）により乾体と
して取得することができるし、乾体として取得するのが
好ましい。

【０１０３】本発明の一連の操作は、脱酸素雰囲気下で
実施することにより、酸化防止効果を高めることができ
る。脱酸素雰囲気は、不活性ガスによる置換、減圧、沸
騰やこれらを組み合わせることにより達成できる。少な
くとも、不活性ガスによる置換、即ち、不活性ガス雰囲
気を用いるのが好適である。上記不活性ガスとしては、
例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、水素
ガス、炭酸ガス等を挙げることができ、好ましくは窒素
ガスである。

【０１０４】本発明により、工業的規模での生産に適し
た方法で、操作性の極めて優れた還元型補酵素Ｑ₁₀結晶
を簡便且つ効率的に製造することができる。

【０１０５】

【実施例】以下に実施例を揚げて本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるも
のではない。また、実施例中の還元型補酵素Ｑ₁₀の純
度、還元型補酵素Ｑ₁₀と酸化型補酵素Ｑ₁₀との重量比は
下記ＨＰＬＣ分析により求めたが、得られた還元型補酵
素Ｑ₁₀の純度は本発明における純度の限界値を規定する
ものではなく、また、同様に、還元型補酵素Ｑ₁₀と酸化
型補酵素Ｑ₁₀との重量比も、その上限値を規定するもの
ではない。 （ＨＰＬＣ分析条件）カラム：ＳＹＭＭＥＴＲＹ Ｃ１
８（Ｗａｔｅｒｓ製）２５０ｍｍ（長さ）４．６ｍｍ
（内径）、移動相；Ｃ₂Ｈ₅ＯＨ：ＣＨ₃ＯＨ＝４：３
（ｖ：ｖ）、検出波長；２１０ｎｍ、流速；１ｍｌ／ｍ
ｉｎ、還元型補酵素Ｑ₁₀の保持時間；９．１ｍｉｎ、酸
化型補酵素Ｑ₁₀の保持時間；１３．３ｍｉｎ。

【０１０６】（実施例１）１００ｇの酸化型補酵素Ｑ₁₀
（純度９９．４％）を２５℃で１０００ｇのヘプタンに
溶解させた。攪拌（攪拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ³）し
ながら、還元剤として次亜硫酸ナトリウム（純度７５％
以上）１００ｇに１０００ｍｌの水を加えて溶解させた
水溶液を、徐々に添加し、２５℃、ｐＨ４〜６で還元反
応を行った。２時間後、反応液から水相を除去し、脱気
した飽和食塩水１０００ｇでヘプタン相を６回水洗し
た。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施し
た。このヘプタン溶液から、４８℃、減圧下にてヘプタ
ンを留去し、油状物の還元型補酵素Ｑ10を得た。この油
状物を、窒素雰囲気下で２℃の冷水中に２時間かけて滴
下することにより、鱗片状の還元型補酵素Ｑ₁₀を得た。
この結晶を減圧ろ過し（濾過性は極めて良好）、固形物
を冷エタノール、冷水、冷エタノールで順に洗浄（洗浄
に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、減圧乾燥
（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、
白色の乾燥結晶９３ｇを得た（有姿収率９３モル％）。
得られた結晶の還元型補酵素Ｑ₁₀／酸化型補酵素Ｑ₁₀の
重量比は９９．５／０．５、還元型補酵素Ｑ₁₀の純度は
９９．２％であった。

【０１０７】（実施例２）１００ｇの酸化型補酵素Ｑ₁₀
（純度９９．４％）を２５℃で１０００ｇのヘキサンに
溶解させた。攪拌（攪拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ³）し
ながら、還元剤として次亜硫酸ナトリウム（純度７５％
以上）１００ｇに１０００ｍｌの水を加えて溶解させた
水溶液を、徐々に添加し、２５℃、ｐＨ４〜６で還元反
応を行った。２時間後、反応液から水相を除去し、脱気
した飽和食塩水１０００ｇでヘキサン相を６回水洗し
た。なお、以上すべての操作は窒素雰囲気下で実施し
た。このヘキサン溶液から、４８℃、減圧下にてヘキサ
ンを留去し、油状物の還元型補酵素Ｑ₁₀を得た。この油
状物を、窒素雰囲気下で冷水：冷エタノール＝１：１
（ｖ：ｖ）中（２℃）に２時間かけて滴下することによ
り、還元型補酵素Ｑ₁₀を結晶化させた。得られた結晶を
減圧ろ過し（濾過性は極めて良好）、湿結晶を冷エタノ
ール、冷水、冷エタノールで順に洗浄（洗浄に用いた冷
溶媒の温度は２℃）して、さらに、減圧乾燥（２０〜４
０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することにより、白色の乾燥
結晶９３ｇを得た（有姿収率９３モル％）。得られた結
晶は直径約１．５mmの粒状であり、還元型補酵素Ｑ₁₀／
酸化型補酵素Ｑ₁₀の重量比は９９．３／０．７、還元型
補酵素Ｑ₁₀の純度は９９．１％であった。

【０１０８】（実施例３）１０００ｇのエタノール中
に、１００ｇの酸化型補酵素Ｑ₁₀（純度９９．４％）、
６０ｇのＬ−アスコルビン酸、３０ｇの炭酸水素ナトリ
ウムを加え、７８℃にて攪拌し、還元反応を行った。３
時間後、５０℃まで冷却し、同温を保持しながらヘプタ
ン１０００ｇと脱気した水１０００ｇを加えた。２５℃
まで冷却後、水相を除去し、さらに脱気した飽和食塩水
１０００ｇで６回水洗し、水相を除去した。このヘプタ
ン溶液を４８℃にて濃縮し、還元型補酵素Ｑ₁₀の油状物
を得た。この油状物を、窒素雰囲気下で冷水：冷エタノ
ール＝１：１（ｖ：ｖ）中（２℃）に２時間かけて滴下
することにより、還元型補酵素Ｑ₁₀を結晶化させた。得
られた結晶を減圧ろ過し（濾過性は極めて良好）、湿結
晶を冷エタノール、冷水、冷エタノールで順に洗浄（洗
浄に用いた冷溶媒の温度は２℃）して、さらに、減圧乾
燥（２０〜４０℃、１〜３０ｍｍＨｇ）することによ
り、白色の乾燥結晶９３ｇを得た（有姿収率９３モル
％）。得られた結晶は直径約１．５mmの粒状であり、還
元型補酵素Ｑ₁₀／酸化型補酵素Ｑ₁₀の重量比は９９．３
／０．７、還元型補酵素Ｑ₁₀の純度は９９．１％であっ
た。

【０１０９】（参考例１）実施例２と同様にして還元型
補酵素Ｑ₁₀のヘキサン相を得た。このヘキサン相を減圧
下において溶媒置換し、５０℃の還元型補酵素Ｑ₁₀の７
％（ｗ／ｗ）エタノール溶液を調製した。この溶液を窒
素雰囲気下にて攪拌（攪拌所要動力０．３ｋＷ／ｍ³）
しながら２℃まで冷却し、結晶を析出させた。得られた
結晶を減圧ろ過し、湿結晶を冷エタノール、冷水、冷エ
タノールで順に洗浄（洗浄に用いた冷溶媒の温度は２
℃）して、さらに、減圧乾燥（２０〜４０℃、１〜３０
ｍｍＨｇ）することにより、粉末の乾燥結晶を得た。こ
の粉末結晶２ｇと実施例２で得られた粒状結晶２ｇをそ
れぞれ空気中、２５℃で保存した。７日後の還元型補酵
素Ｑ₁₀／酸化型補酵素Ｑ₁₀の重量比は、粉末結晶が８
５．３／１４．７、粒状結晶が９７．３／２．７であっ
た。

【０１１０】（参考例２）表１に示す各種溶媒２０ｇに
１ｇの還元型補酵素Ｑ₁₀（還元型補酵素Ｑ₁₀／酸化型補
酵素Ｑ₁₀の重量比は９９．６／０．４）を、２５℃下で
溶解した。大気中、２５℃で２４時間の攪拌後、液中の
還元型補酵素Ｑ₁₀／酸化型補酵素Ｑ₁₀の重量比を測定し
た結果を表１に示す。

【０１１１】

【表１】

【０１１２】（参考例３）表２に示す各種溶媒１００ｇ
に１ｇの還元型補酵素Ｑ₁₀（還元型補酵素Ｑ₁₀／酸化型
補酵素Ｑ₁₀の重量比は９９．６／０．４）を、３５℃下
で溶解した。大気中、３５℃で２４時間の攪拌後、液中
の還元型補酵素Ｑ₁₀／酸化型補酵素Ｑ₁₀の重量比を測定
した結果を表２に示す。

【０１１３】

【表２】

【０１１４】

【発明の効果】本発明は、上述の構成よりなるので、工
業的規模での生産に適した方法で、高品質の還元型補酵
素Ｑ₁₀を簡便且つ効率的に得ることができる。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】還元型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相を、還元型
   補酵素Ｑ₁₀又は該液相の固化温度以下の温度の貧溶媒中
   に添加することを特徴とする還元型補酵素Ｑ ₁₀の結晶化
   方法。
2. 【請求項２】貧溶媒の温度が４０℃以下である請求項１
   記載の結晶化方法。
3. 【請求項３】還元型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相は、還元型
   補酵素Ｑ₁₀の濃度が５０％以上である請求項１又は２記
   載の結晶化方法。
4. 【請求項４】還元型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相は、還元型
   補酵素Ｑ₁₀の油状物である請求項３記載の結晶化方法。
5. 【請求項５】貧溶媒が、炭化水素類、ケトン類、アルコ
   ール類、ニトリル類又は水である請求項１〜４のいずれ
   かに記載の結晶化方法。
6. 【請求項６】貧溶媒が水である請求項５記載の結晶化方
   法。
7. 【請求項７】貧溶媒が水とアルコール類の混合溶媒であ
   る請求項１〜４のいずれかに記載の結晶化方法。
8. 【請求項８】結晶化は、単位容積当たりの撹拌所要動力
   として０．０１ｋＷ／ｍ³以上の強制流動下に実施する
   請求項１〜７のいずれかに記載の結晶化方法。
9. 【請求項９】結晶化に際して種晶を添加する請求項１〜
   ８のいずれかに記載の結晶化方法。
10. 【請求項１０】還元型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相の添加速
    度は、該液相全量の１００％量／時間以下である請求項
    １〜９のいずれかに記載の結晶化方法。
11. 【請求項１１】還元型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相は、酸化
    型補酵素Ｑ₁₀を還元して生成した還元型補酵素Ｑ₁₀を含
    有する有機溶媒の溶液を採取し、更に濃縮又は溶媒置換
    して還元型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相とするか、又は、該
    有機溶媒の溶液を還元型補酵素Ｑ₁₀又は還元型補酵素Ｑ
    ₁₀を主成分とする濃縮物の融解温度以上で溶媒を留去し
    て、還元型補酵素Ｑ₁₀の油状物とすることにより得られ
    たものである請求項１〜１０のいずれかに記載の結晶化
    方法。
12. 【請求項１２】還元型補酵素Ｑ₁₀の高濃度液相は、酸化
    型補酵素Ｑ₁₀の油状物を水中で次亜硫酸類を用いて還元
    した後、水相を除去して還元型補酵素Ｑ₁₀の油状物とし
    て得られたものである請求項１〜１０のいずれかに記載
    の結晶化方法。
13. 【請求項１３】脱酸素雰囲気下で実施する請求項１〜１
    ２のいずれかに記載の結晶化方法。