JP2003065997A

JP2003065997A - バイオセンサ

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Publication number: JP2003065997A
Application number: JP2002058992A
Authority: JP
Inventors: Yoshikazu Hasegawa; 美和長谷川; Tomohiro Yamamoto; 智浩山本; Kiichi Watanabe; 基一渡邊; Takahiro Nakaminami; 貴裕中南; Makoto Ikeda; 信池田; Toshihiko Yoshioka; 俊彦吉岡; Shiro Nankai; 史朗南海
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2001-06-14
Filing date: 2002-03-05
Publication date: 2003-03-05
Anticipated expiration: 2022-03-05
Also published as: JP3856438B2

Abstract

(57)【要約】【課題】血液のろ過によって得られる血漿が、迅速に
電極系に達し、高精度で応答性に優れたコレステロール
センサを提供する。【解決手段】絶縁性基板、電極系、試薬を含む反応
層、前記電極系と前記反応層とを含む試料液供給路、試
料液供給部、および前記試料液供給路と試料液供給部と
の間に設けられたフィルタを具備するバイオセンサにお
いて、前記フィルタを前記試料液供給路内に侵入させ
ず、前記試料液が前記フィルタを通過する方向を垂直方
向とし、さらに前記血漿が前記試料液供給路の開口部か
ら前記空気孔に向かって通過する方向を水平方向になる
ように設計する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の特定成分
について、迅速、高感度、かつ簡便に定量することがで
きるバイオセンサ、特にコレステロールセンサに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来のバイオセンサの例を、グルコース
センサについて説明する。代表的なものとして、絶縁性
の基板上にスクリーン印刷などの方法により、少なくと
も測定極および対極を含む電極系を形成し、この電極系
上に、親水性高分子、酸化還元酵素および電子メディエ
ータを含む酵素反応層を形成して得られるグルコースセ
ンサがある。酸化還元酵素にはグルコースオキシダーゼ
が、また電子メディエータにはフェリシアン化カリウ
ム、フェロセン誘導体、キノン誘導体などの金属錯体や
有機化合物などがそれぞれ用いられる。酵素反応層に
は、必要に応じて緩衝剤が加えられる。

【０００３】このバイオセンサの酵素反応層上に、基質
を含む試料液を滴下すると、酵素反応層が溶解して、酵
素と基質が反応し、この反応に伴い電子メディエータが
還元される。酵素反応終了後、この還元された電子メデ
ィエータを電気化学的に酸化する酸化電流値から試料液
中の基質濃度を求めることができる。このタイプのグル
コースセンサでは、酵素反応の結果生じた電子メディエ
ータの還元体を電極で酸化し、その酸化電流値からグル
コース濃度を求める。このようなバイオセンサは、測定
対象物質を基質とする酵素を用いることで、様々な物質
に対する測定が原理的には可能である。例えば、酸化還
元酵素にコレステロールオキシダーゼまたはコレステロ
ールデヒドロゲナーゼを用いれば、各種医療機関で診断
指針に用いられる血清中のコレステロール値を測定する
ことができる。

【０００４】コレステロールエステラーゼの酵素反応の
進行は非常に遅いので、適切な界面活性剤を添加するこ
とにより、コレステロールエステラーゼの活性を向上さ
せ、全体の反応に要する時間を短縮することができる。
しかし、反応系に界面活性剤が含まれることから、界面
活性剤が血球に悪影響を及ぼすため、グルコースセンサ
のように全血そのものを測定することは不可能である。

【０００５】そこで、血球をろ過した血漿のみを迅速に
センサ内に供給するために、試料液供給路の開口部付近
にフィルタ（血球ろ過部）を設ける提案がなされてい
る。図９に、血液を分離するメカニズムを説明するため
のフィルタ装置の概略断面図を示す。血球を分離する方
法としては、図９の（ａ）に示すように、血液をフィ
ルタの一次側部分の側端部に滴下して、水平方向におい
てろ過し、フィルタの二次側部分の端部から血漿をにじ
み出させる水平分離（Lateral Separation）方式、図９
の（ｂ）に示すように、血液をフィルタの上表面に直
接滴下して、垂直方向においてろ過し、前記フィルタの
底面またはその付近の端部から血漿をにじみ出させる垂
直分離（Vertical Separation）方式、および図９の
（ｃ）に示すように、血液をフィルタの一次側部分の
上表面に直接滴下して、垂直方向においてろ過するとと
もに水平方向においてもろ過し、フィルタの二次側部分
の端部から血漿がにじみ出る複合分離（Combination）
方式の３種類がある。従来からは、水平分離（例えば特
願２０００−３９９０５６号明細書）または複合分離
（例えば特願２００１−１５２８６８号明細書）が用い
られている。

【０００６】しかし、センサ内へのフィルタの組み込み
方が適していないと、フィルタ内に捕捉される血球が破
壊され、ヘモグロビンが溶出してしまう。ヘモグロビン
程度にまで小さくなると、血球成分をフィルタでろ過す
ることが困難となり、試料液供給路内にヘモグロビンが
流入し、測定誤差の原因となってしまう。これは、試料
液を吸収する前のフィルタの厚みと、試料液を吸収した
後に膨張したフィルタの厚みとの差が、フィルタを上下
から保持している押さえ部の間隔と適合していない点に
原因があると考えられる。フィルタを上下から保持して
いる押さえ部の間隔が、膨張したフィルタの厚みに対し
て狭すぎると、フィルタの膨張が妨げられる。そして、
膨張が妨げられたフィルタの孔径は十分に広がることが
できず、浸透してきた血球を破壊してしまうのである。

【０００７】これに対し、試料液によってそのヘマトク
リット値（赤血球容積比）が異なり、これに起因してフ
ィルタの膨張の程度も異なるため、あらかじめ膨張した
フィルタの厚みを想定して前記押さえ部の上下の間隔を
広めに設定すると、保存期間中にフィルタがずれてしま
うおそれがある。この問題を解決するために、複合分離
方式において、前記フィルタ表面を保持する押さえ部
を、前記フィルタのいずれかの部分において、前記フィ
ルタの上下いずれか一方とだけ接触するようにすること
が考えられている（例えば特願２００１−１５２８６８
号明細書）。

【０００８】この構成により、フィルタを保持する上下
押さえ部の間の距離が、試料液を吸収して膨張したフィ
ルタの厚みに適合しなくても、フィルタの膨張が妨げら
れることがなく、さらに膨張が妨げられることによって
起こる血球破壊に起因する測定誤差を回避することがで
きる。すなわち、前記フィルタを保持する押さえ部が、
前記フィルタの上下から押さえていないことにより、フ
ィルタが膨張した際、押さえ部以外の試料液供給部、お
よび空隙部の部分において膨張することが可能となり、
フィルタの孔径が自由に変化することができ、血球破壊
が起こることがない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの方法
は、試料液の量を低減する方法としては有効であるが、
得られるバイオセンサの構造が複雑になるという問題が
あった。例えば、垂直方向への陰影図において三角形状
を有する平らなフィルタを用いる場合、先端部（頂点部
分）を試料液供給路の開口部（幅０．８ｍｍ）の内側に
約１ｍｍでも挿入することが、製造上非常に困難であっ
た。また、およびの分離方式はの分離方式よりも
ろ液の流速が遅いという問題があった。これに対し、得
られるバイオセンサの構造を簡素化することができる
が、コレステロールセンサとして適用する場合、電極と
対向する部分に試薬を担持させる必要があることから、
構造上、通常の垂直分離方式を採用することは不可能で
あった。この理由は２つあり、ひとつは構造上の問題で
あり、もうひとつは試薬担持位置の問題である。

【００１０】ひとつ目の問題点は、例えば特願昭６２−
１８０４３４号および特願昭６２−２９２３２３号各明
細書において指摘されている。例えば、上記の分離方
式を用いる場合は、図１０〜１２に示すような構造を採
用する必要があった。図１０に示すように、このタイプ
のバイオセンサは、絶縁性基板２０１の上に作用極２０
２および対極２０３が設けられ、その上に酸化還元酵素
層２０５、空隙部２０６、フィルタ２０７および多孔体
２０８が設けられている。この際のろ過は、重力を利用
した自然ろ過法に分類されるが、試料液中に気泡が生じ
たり、多孔体２０８に試料液が入りにくかったりして流
速が遅いことから、ろ液が電極に充分に到達せず、測定
精度に劣るという問題があるため、上部にポンプのタイ
プの加圧装置２１１が設け、圧力２１４をかけることに
よって試料液２１２をろ過している。

【００１１】この点、特願昭６２−２９２３２３号明細
書に記載されているセンサにおいては、図１１および１
２に示すように、加圧装置に替えて、フィルタ３０８を
通過したろ液を電極３０２’、３０３’および３０４’
に導くように誘導層３０７がセンサ内に設置されてい
る。これにより、ろ液は誘導層３０７に導かれて最初に
電極を濡らし、電極表面の親水性高分子層３１２の助け
も借りて電極上に広がるため、作用極上に気泡が生じる
ことはなく、精度の高い測定が可能となっている。な
お、図１１および１２において、誘導層３０７の上部に
は、フィルタ３０８、保持枠３０９、多孔体３１０およ
びカバー３１１が設けられている。基板３０１の上部に
は電極３０２、３０３および３０４が配され、絶縁層３
０５が設けられている。しかし、いずれの場合にあって
も、センサの構造が複雑であるという問題がある。

【００１２】一方、ふたつ目の試薬担持位置に関する問
題点は、特願２０００−０１８８３４号明細書に記載さ
れている。当該明細書に開示されているコレステロール
センサは、血糖センサと異なり非常に濃い濃度の試薬を
担持させるため、血糖センサのように必要な試薬を全て
一ヵ所に担持させると試薬の拡散の妨げとなり、応答電
流値の精度が下がるという問題がある。また、試薬中に
は血糖センサにはない界面活性剤が含まれており、これ
が他の試薬の保存安定性に悪影響を与えるため、分離し
て担持しなければならない。そのため、試薬を上下（電
極上とカバー側）に分離して担持し、電極の上部にフィ
ルタを具備するという従来の構造を採用することは不可
能であった。

【００１３】そこで、本発明は、垂直分離方式を採用す
る際の上述のような不都合を回避し、血液のろ過によっ
て血球を分離して得られる血漿が、迅速に電極系に達す
るように改良したバイオセンサを提供することを目的と
する。さらに具体的には、本発明は、高精度で応答性に
優れ、全血を測定対象とするコレステロールセンサを提
供することを目的とする。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、絶縁性の基
板、前記基板上に設けられた作用極と対極を有する電極
系、少なくとも酸化還元酵素と電子メディエータを含む
反応層、前記電極系と前記反応層とを含み、終端部側に
空気孔を有する試料液供給路、試料液を導入するための
試料液供給部、および前記試料液供給路と試料液供給部
との間に設けられた、試料液をろ過するフィルタを具備
し、前記フィルタでろ過されたろ液が毛細管現象によっ
て前記試料液供給路内に吸引されるようにしたバイオセ
ンサであって、前記フィルタが前記試料液供給路内に侵
入しておらず、前記試料液が前記フィルタを通過する方
向が垂直方向であり、さらに前記血漿が前記試料液供給
路の開口部から前記空気孔に向かって通過する方向が水
平方向であることを特徴とするバイオセンサに関する。

【００１５】前記フィルタは円柱状であるのが有効であ
る。また、前記フィルタの円状端面の直径が５ｍｍ以下
であるのが有効である。また、前記フィルタの上部に前
記試料液を滴下するための開口部があることが有効であ
る。さらに、前記フィルタの一次側部分から二次側部分
までの領域において、前記フィルタの表面を一回り囲む
空隙部を少なくとも１つ有するのが有効である。また、
前記試料液供給部の底部に前記フィルタに通じる孔があ
るのが有効である。さらにまた、前記試料液供給部の開
口部のサイズが前記フィルタのサイズよりも小さいのが
有効である。前記フィルタの表面とフィルタ保持部が接
触しない部分を有するのが有効である。

【００１６】また、前記バイオセンサにおいては、前記
フィルタがガラス繊維ろ紙で構成されているのが有効で
ある。この場合、前記フィルタが前記電極系と非接触で
あるのが有効である。また、前記フィルタの底面の少な
くとも一部が前記絶縁性基板に接触しているのが有効で
ある。前記フィルタがガラス繊維ろ紙で構成されている
場合は、前記フィルタを構成する繊維がポリビニルアル
コールでコーティングされているのが有効である。ま
た、前記フィルタの試料液滴下部から試料液供給路の開
口部までの領域において、前記フィルタ表面を一回り囲
む空隙部を少なくとも１つ有するのが有効である。

【００１７】

【発明の実施の形態】上述のように、本発明は、絶縁性
の基板、前記基板上に設けられた作用極と対極を有する
電極系、少なくとも酸化還元酵素と電子メディエータを
含む反応層、前記電極系と前記反応層とを含み、終端部
側に空気孔を有する試料液供給路、試料液を導入するた
めの試料液供給部、および前記試料液供給路と試料液供
給部との間に設けられた、試料液をろ過するフィルタを
具備し、前記フィルタでろ過されたろ液が毛細管現象に
よって前記試料液供給路内に吸引されるようにしたバイ
オセンサにおいて、前記フィルタが前記試料液供給路内
に侵入しておらず、前記試料液が前記フィルタを通過す
る方向が垂直方向であり、さらに前記血漿が前記試料液
供給路の開口部から前記空気孔に向かって通過する方向
が水平方向であることを特徴とするバイオセンサに関す
る。このような技術的事項を具備することにより、得ら
れるバイオセンサの構造を簡素化することが可能であ
る。

【００１８】本発明に係るバイオセンサにおいては、血
球分離の方法としては垂直分離方式を用いるが、試料液
として血液を用い、フィルタの二次側部分からにじみ出
た血漿は、試料液供給路において、開口部からその終端
部にある空気孔に向かって徐々に試薬を溶解しながら水
平に流れることから、試料液供給路内に上下に分離して
担持されている試薬の位置を変えることなく、センサ構
造の簡素化を図ることが可能となる。また、前記フィル
タが前記試料液供給路内に侵入していないことから、フ
ィルタが試料液供給路内の反応層に含まれる試薬と接触
せず、この試薬がフィルタ内に拡散しにくい。これによ
り、試薬の濃度にバラツキが生じることがなく、安定し
たセンサ精度を実現することができる。

【００１９】本発明に用いる電子メディエータは、フェ
リシアン化カリウムの他、コレステロールオキシダーゼ
などの酸化還元酵素との電子伝達能を有するレドックス
化合物から選択することができる。酸化還元酵素は測定
対象物を基質とする酵素であり、グルコースを測定対象
物とするセンサでは、グルコースオキシダーゼを用い
る。診断指針に用いられる血清中のコレステロール値を
測定するには、コレステロールの酸化反応を触媒する酵
素コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデ
ヒドロゲナーゼと、コレステロールエステルをコレステ
ロールに変化させる過程を触媒する酵素コレステロール
エステラーゼとを用いる。コレステロールエステラーゼ
の酵素反応の進行は非常に遅いので、適切な界面活性剤
を添加することにより、コレステロールエステラーゼの
活性を向上させ、全体の反応に要する時間を短縮するこ
とができる。

【００２０】電子メディエータおよび酸化還元酵素など
の試薬を含む反応層は、センサ内の電極系上またはその
近傍の位置に配置する。電極系を設けた基板に組み合わ
されるカバー部材であって、基板との間に電極系に試料
液を供給する試料液供給路を形成するカバー部材を有す
るセンサにおいては、前記試料液供給路に露出する部分
または試料液供給路の開口部などに前記反応層を配置す
ることができる。いずれの位置であっても、導入された
試料液によって前記反応層が容易に溶解して電極系に到
達できることが好ましい。また、電極を保護し、形成さ
れる反応層の剥離を抑制するために、電極上に接して親
水性高分子層を形成するのが好ましい。電極系以外で
も、反応層を形成する際の下地として親水性高分子層を
形成するのが好ましく、また、反応層を複数の層で構成
する場合には最下層に親水性高分子を含ませるのが好ま
しい。

【００２１】電子メディエータを含む反応層は、溶解性
を高めるために、界面活性剤と分離して設けることが好
ましい。また、保存安定性のために、コレステロールの
酸化反応を触媒する酵素コレステロールオキシダーゼお
よびコレステロールエステラーゼと分離することが好ま
しい。血糖値を測定するバイオセンサでは、試料液が反
応層へ導入されるのを容易にするため、電極系上に形成
された層などを被覆するように、脂質を含む層を形成す
る例がある（例えば、特開平２−０６２９５２号公
報）。本発明のコレステロールを測定するバイオセンサ
は、反応層の一部を凍結乾燥法により形成するか（特願
２０００−０１８８３４号明細書）、カバー部材の表面
を界面活性剤またはプラズマ照射などにより親水処理す
るという構成をとるのが好ましく、そのような構成にす
ると、脂質層はなくてもよい。

【００２２】親水性高分子としては、例えばエチルセル
ロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよびカルボキ
シメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体の
他、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゼ
ラチン、アガロース、ポリアクリル酸およびその塩、デ
ンプンおよびその誘導体、無水マレイン酸の重合体およ
びその塩、ポリアクリルアミド、メタクリレート樹脂、
ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレートなどがあげ
られる。

【００２３】界面活性剤としては、例えば、ｎ−オクチ
ル−β−Ｄ−チオグルコシド、ポリエチレングリコール
モノドデシルエーテル、コール酸ナトリウム、ドデシル
−β−マルトシド、ジュークロースモノラウレート、デ
オキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナ
トリウム、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロ
ピル）デオキシコールアミドおよびポリオキシエチレン
（１０）オクチルフェニルエーテルなどがあげられ、本
発明の効果を損なわない範囲で、これら以外の界面活性
剤を用いることもできる。

【００２４】脂質を使用する場合、例えばレシチン、ホ
スファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールア
ミンなどのリン脂質で両親媒性脂質が好適に用いられ
る。酸化電流の測定方法としては、測定極と対極のみの
二電極方式と、参照極を加えた三電極方式があり、三電
極方式の方がより正確な測定が可能である。以下、具体
的な実施の形態により本発明を詳細に説明する。

【００２５】実施の形態１図１は、好ましい実施の形態に係るバイオセンサの分解
斜視図である。図１に示すように、本発明に係るバイオ
センサは、例えばポリエチレンテレフタレートなどの絶
縁性樹脂からなる絶縁性基板１を有する。図１におい
て、基板１の左側上面にパラジウム部分がスパッタ法ま
たは蒸着法などによって形成されており、レーザートリ
ミングにより作用極２と対極３を含む電極系が形成され
ている。電極の面積は、後述するスペーサ５上に形成さ
れるスリット８の幅により決定される。

【００２６】前記基板１に組み合わせるスペーサ５に
は、得られるバイオセンサにおいて試料液供給路を形成
するスリット８、スリット８の開口部７、フィルタ４を
収納する連通部６が形成されている。また、カバー９に
は、フィルタ４を収納する連通部１０の他に、空気孔１
１が形成されている。フィルタ保持板１２には、空隙部
１３と、フィルタ４を直接支える突起状のフィルタ保持
部（突起部）１４が形成されている。さらに、試料液滴
下部を構成する上カバー１５には、フィルタ４の上表面
に通じる開口部１６が形成されている。なお、フィルタ
保持板１２は、後述する実施例２に示すように、複数の
部材で構成されていてもよい。

【００２７】上述の基板１、スペーサ５、カバー９、フ
ィルタ保持板１２および上カバー１５を一体化した際に
は、スリット８に連なる連通部６、カバー９に形成され
ている連通部１０、フィルタ保持板１２に形成されてい
る空隙部１３、および上カバー１５に形成されている開
口部１６が連通する。血球ろ過部であるフィルタ４は、
ガラス繊維製のろ紙からなり、直径２〜５ｍｍ、高さ
（厚み）２００〜１０００μｍの円柱状の形状を有す
る。

【００２８】このセンサを組み立てるには、後述のよう
に基板１の所定の部分に反応層を形成する。また、図１
に示す位置関係に基づいて、カバー９とスペーサ５を組
み合わせた合体基板Ａのスリット８により形成される凹
部（試料液供給路）において、後述のように所定の部材
に反応層を形成する。さらに、図１に示す位置関係に基
づいて、フィルタ保持板１２と上カバー１５を組み合わ
せた合体基板Ｂを作製する。そして、基板１、合体基板
Ａ、フィルタ４および合体基板Ｂを、図１の点線および
一点鎖線で示すように設置する。

【００２９】ここで、図１の構成にしたがって得られる
本発明に係るバイオセンサの概略斜視図を図２に示す。
さらに、図２におけるＸ−Ｘ線断面図を図３に示す。図
３の断面図に示すように、本発明に係るバイオセンサに
おいては、フィルタ４と他の部材が非接触となる空隙部
１３が形成される。妨害物質である血球を完全に除去す
るためには、試料液がフィルタを必ず通過するように、
開口部１６から開口部７までの領域においてフィルタ保
持部と非接触の箇所、すなわちフィルタ表面を一回りす
る空隙部１３を少なくとも一ヵ所設けることが必要であ
る。図２では反応層および電極系を省略したが、図４
に、反応層および電極系を表した図３に対応する部分拡
大断面図を示す。基板１の電極２および３上に、親水性
高分子の層１７および反応層１８ａが形成されている。
また、試料液供給路の天井に相当するカバー９の下面に
は反応層１８ｂが形成されている。なお、図４に示すそ
の他の部材は、図３に示すものと同じである。

【００３０】図１〜４に示すバイオセンサは、その構造
をわかりやすくするために、フィルタ４と５種類の部材
（基板）を用いて作製されるものである。しかし、上カ
バー１５とフィルタ保持板１２を一つの部材で形成した
り、さらにこれらとカバー９を一つの部材で形成しても
よい。また、フィルタ４の厚みによっては、フィルタ保
持板１２またはフィルタ保持部１４を省略してもよい。

【００３１】実施の形態２図５は、別の好ましい実施の形態に係るバイオセンサの
分解斜視図である。図５に示すように、本発明に係るバ
イオセンサは、例えばポリエチレンテレフタレートなど
の絶縁性樹脂からなる絶縁性基板１０１を有す。図５に
おいて、基板１０１の左側上面にパラジウム部分がスパ
ッタ法または蒸着法などによって形成されており、レー
ザートリミングにより、作用極１０２と対極１０３を含
む電極系が形成されている。電極の面積は、後述するス
ペーサ１０５の上に形成されるスリット１０８の幅に対
応して決定される。

【００３２】前記基板１０１に組み合わせるスペーサ１
０５には、得られるバイオセンサにおいて試料液供給路
を構成するスリット１０８、スリット１０８の開口部１
０７、フィルタ１０４よりも小さい直径を有しフィルタ
１０４を収納する連通部１０６が形成されている。ま
た、カバー１０９には、フィルタ１０４よりも小さい直
径を有しフィルタ１０４を収納する連通部１１０、およ
び空気孔１１１が形成されている。ここで、上記実施の
形態１におけるフィルタ保持板１２は一枚の板状体で構
成されているが、実施の形態２におけるフィルタ保持板
１１２は、フィルタ保持板１１２ａ、１１２ｂおよび１
１２ｃで構成されている。

【００３３】フィルタ保持板１１２ａには、フィルタ１
０４よりも大きい直径の空隙部１１３ａが形成されてお
り、フィルタ保持板１１２ｂには、空隙部１１３ａと同
じ直径を有する空隙部１１３ｂと、フィルタ１０４を直
接支える突起状のフィルタ保持部（突起部）１１４が形
成されている。また、フィルタ保持板１１２ｃは、フィ
ルタ保持板１１２ａと同形であり、空隙部１１３ｃが形
成されている。さらに、試料液滴下部を構成する上カバ
ー１１５には、フィルタ１０４の上表面に通じる開口部
１１６が形成されている。

【００３４】上述の基板１０１、スペーサ１０５、カバ
ー１０９、フィルタ保持板１１２ａ、１１２ｂおよび１
１２ｃ、ならびに上カバー１１５を一体化した際には、
スリット１０８に連なる連通部１０６、カバー１０９に
形成されている連通部１１０、フィルタ保持板１１２ａ
に形成されている空隙部１１３ａ、フィルタ保持板１１
２ｂに形成されている空隙部１１３ｂ、フィルタ保持板
１１２ｃに形成されている空隙部１１３ｃ、ならびに上
カバー１１５に形成されている開口部１１６が連通す
る。血球ろ過部であるフィルタ１０４は、ガラス繊維製
のろ紙からなり、直径３ｍｍ、高さ（厚み）５００〜１
０００μｍの円柱状の形状を有する。そして、ガラス繊
維製のろ紙を構成する繊維はＰＶＡがコーティングされ
ている。

【００３５】このセンサを組み立てるには、まず、図５
に示す位置関係に基づいて、スペーサ１０５上にカバー
１０９をのせ、合体基板Ｃを得る。このとき、カバー１
０９およびスペーサ１０５を合体するときにスリット１
０８により形成される凹部（試料液供給路）において、
後述するように反応層を形成する。さらに、図５に示す
位置関係に基づいて、フィルタ保持板１１２ａ上にフィ
ルタ保持板１１２ｂおよびフィルタ保持板１１２ｃをの
せ、さらにその上に上カバー１１５をのせて合体基板Ｄ
を得る。基板１および合体基板Ａを、図５に示す位置関
係に基づいて組み合わせ、連通した連通部１０６および
１１０の真上に、フィルタ１０４を設置する。そして、
基板１、合体基板Ｃおよび合体基板Ｄを、右端が一致す
るような位置関係で組み合わせる。

【００３６】ここで、図５の構成にしたがって得られる
本発明に係るバイオセンサの概略斜視図を図６に示す。
さらに、図６におけるＹ−Ｙ線断面図を図７に示す。図
７では反応層および電極系を省略したが、図８に、反応
層および電極系を表した図７に対応する部分拡大断面図
を示す。基板１０１の電極系（１０２および１０３）上
に、親水性高分子の層１１７および反応層１１８ａが形
成されている。また、試料液供給路の天井に相当するカ
バー１０９の下面には反応層１１８ｂが形成されてい
る。なお、図８に示すその他の部材は、図７に示すもと
の同じである。

【００３７】図５〜８に示す本発明のバイオセンサは、
その構造をわかりやすく説明するために、フィルタ１０
４と７種類の基材を用いて作製されるものである。しか
し、カバー１０９とスペーサ１０５を一つの部材で構成
したり、フィルタ１０４の厚みによっては、フィルタ保
持板１１２ａおよび１１２ｂ、またはフィルタ保持板１
１２ｂおよび１１２ｃを省略してもよい。また、フィル
タ保持部１１４を省略してもよい。

【００３８】図１〜４または図５〜８に示すバイオセン
サを用いて血液中のコレステロールを測定するために
は、例えば穿刺により指先から採取した試料液である血
液を上カバー１５または１１５の開口部１６または１１
６へ供給する。ここに供給された血液は、フィルタ４ま
たは１０４の一次側部分の上表面からその内へ浸透し、
ろ過される。そして、血球以外のろ液である血漿が二次
側部分からしみ出す。そして、しみ出した血漿は、電極
系を覆う位置および／またはカバー９または１０９の裏
面に担持された反応層を溶解しながら、電極系近傍、さ
らに空気孔１１または１１１まで延びるスリット８また
は１０８で構成される試料液供給路８’または１０８’
全体を満たす。試料液供給路８’または１０８’全体が
満たされると、フィルタ４または１０４に滴下された液
体の流動も停止する。

【００３９】フィルタ４または１０４としては、不連続
かつ不均等質な内部構造を有し、不均一な孔径分布を有
するものを用いるのが好ましい。したがって、フィルタ
４または１０４の内部の流路の形態も不規則であるのが
好ましい。なお、ろ過はフィルタ４または１０４の内部
で行われる。また、上記実施の形態２においては、フィ
ルタ１０４を構成する繊維をＰＶＡでコーティングして
おく。このような血球ろ過の過程を経て、血漿により溶
解された反応層と血漿中の測定成分（例えばグルコー
ス、総コレステロールまたはＬＤＬコレステロールな
ど）との化学反応が生じ、一定時間経過後、電極反応に
より電流値を測定し、血漿中の成分を定量することがで
きる。

【００４０】上述のように、図４および８は、試料液供
給路８’または１０８’中の電極系近傍における反応層
の配置例を示している。基板１または１０１の電極系２
および３または１０２および１０３上には、カルボキシ
メチルセルロースのナトリウム塩（以下、単に「ＣＭ
Ｃ」と表す）などを含む親水性高分子の層１７または１
１７、および、例えば電子メディエータなどの反応試薬
を含む反応層１８ａまたは１１８ａが形成されている。
また、カバー９または１０９とスペーサ５または１０５
を組み合わせた合体基板ＡまたはＣにおいては、カバー
９または１０９の試料液供給路８’または１０８’に露
出する面に、酸化還元反応酵素を含む反応層１８ｂまた
は１１８ｂが形成されている。

【００４１】特に、上記実施の形態１においては、フィ
ルタ保持板１２の連通部１０は、フィルタ保持部１４を
除いて、フィルタ４と接触しておらず、フィルタ４の膨
張を妨げることがないよう設計されている。そのため、
試料液中の血球が破壊される恐れもない。図１〜４に示
す構造を有するバイオセンサでは、前記試料液供給路の
幅が１.５ｍｍ以下、高さが１５０μｍ以下、長さが４.
５ｍｍ以下であることが好ましい。

【００４２】本発明に係るバイオセンサの体積が０．０
５μｌ以上、１．０１２５μｌ以下であることが好まし
い。また、前記電極系が、貴金属からなる電極であるの
が好ましい。前記試料液供給路の幅が、好ましくは１.
５ｍｍ以下であるため、スクリーンを用いた印刷電極で
は電極面積を決定する精度が劣る。しかし、貴金属電極
は、０．１ｍｍ幅でレーザートリミングすることが可能
であり、電極面積を決定する精度が高いからである。

【００４３】なお、特に、実施の形態１に係るバイオセ
ンサにおいては、図１３に示すように、フィルタ４の二
次側部分の少なくとも一部が、基板１、スペーサ５およ
びカバー９に接触していればよく、例えば図１４示すよ
うに、フィルタ４の二次側部分を斜めに切断して傾斜部
を設けてもよい。このように、基板１との接触面におい
て、開口部７に向かって開くような形状の傾斜部を設け
ることによって、ろ液を試料液供給路８’に導きやすく
することができる。また、図１３に示すように、前記フ
ィルタの一次側部分の断面積（Ｆ１）が前記試料液供給
路の開口部７の断面積（Ｓ１）よりも大きいのが好まし
い。これにより、センサの試料液供給路８’内がろ過さ
れた血漿で飽和される速度が速くなるという効果が得ら
れる。さらに、図１５に示すように、前記フィルタの一
次側部分の断面積（Ｆ１）が、前記試料液供給路の開口
部７側において基板１に接する二次側部分の断面積（Ｆ
２）よりも大きいのが好ましい。これにより、センサの
試料液供給路８’内がろ過された血漿で飽和される速度
がさらに速くなるという効果が得られる。なお、図１３
〜１５において、基板１、フィルタ４、スペーサ５およ
びカバー９以外の構成要素は省略した。

【００４４】

【実施例】以下に、実施例を用いて本発明を説明する
が、本発明はこれらのみに限定されれるものではない。《実施例１》図１〜４に示す構造を有し、測定対象を総
コレステロールとするバイオセンサであって、反応層１
８ａに電子メディエータが含まれ、反応層１８ｂにコレ
ステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ
および界面活性剤が含まれたバイオセンサを作製した。
まず、基板１の電極系上に、ＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶
液を５μｌ滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾
燥させることにより親水性高分子の層１７を形成した。
つぎに、フェリシアン化カリウム水溶液４μｌ（フェリ
シアン化カリウム７０ｍＭ相当）を親水性高分子の層１
７上に滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥さ
せることにより、フェリシアン化カリウムを含む反応層
１８ａを形成した。

【００４５】ノカルジア由来のコレステロールオキシダ
ーゼ（ＥＣ１．１．３．６：ＣｈＯＤ）とシュードモナ
ス由来のコレステロールエステラーゼ（ＥＣ．３．１．
１．１３：ＣｈＥ）を溶解した水溶液に、界面活性剤で
あるポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエー
テル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を添加した。この混合
液を、スペーサ５とカバー９を一体化して形成される凹
部（カバー９の試料液供給路８’の上側に相当する部
分）に０.４μｌ滴下し、−１９６℃の液体窒素にて予
備凍結後、凍結乾燥機で２時間乾燥させることにより、
４５０Ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、１１２５
Ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼおよび２ｗｔ％界
面活性剤を含む反応層１８ｂ（図４）を形成した。

【００４６】なお、測定対象をＬＤＬコレステロールと
するバイオセンサを得る場合は、ＬＤＬのみを選択的に
可溶化させる界面活性剤を使用すればよい。これによ
り、ＬＤＬコレステロールを反応系に導き、ＬＤＬコレ
ステロールを測定することが可能となる。ＬＤＬ以外の
リポ蛋白（カイロミクロン、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ）に対す
る酵素反応は、この界面活性剤により阻害されるため、
これらのリポ蛋白はコレステロールの反応系に導かれる
ことなく、反応液中にリポ蛋白の形で残存する。

【００４７】センサの各寸法については、スリット幅は
０.８ｍｍ、スリット長（試料液供給路の開口部から空
気孔までの長さ）は４.５ｍｍ、スペーサ５の厚み（基
板１からカバー９までの距離）は１００μｍが好まし
い。フィルタ４は、厚さ約７００μｍのガラス繊維ろ紙
を、直径２．５ｍｍの円形に打ち抜いて、円柱状のもの
として作製した。基板１、スペーサ５、カバー９および
フィルタ保持板１２の合体して得られる連通部６、連通
部１０および空隙部１３からなる空間にフィルタ４を設
置した。この後、フィルタ保持板１２の上部に上カバー
１４を設置することにより、図１〜４に示す構造を有す
るバイオセンサを作製した。

【００４８】得られたバイオセンサの開口部１６から、
試料液として全血１０μｌまたは標準血清を滴下し、１
８０秒後に対極を基準にして作用極にアノード方向へ＋
０.２Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後に作用極と対極
との間に流れる電流値を測定した。その結果である応答
特性を図１６に示した。図１６から明らかなように、本
発明に係るバイオセンサによれば、総コレステロール濃
度と応答値との間に良好な直線性が得られる。

【００４９】《実施例２》図５〜８に示す構造を有し、
測定対象を総コレステロールとするバイオセンサであっ
て、反応層１１８ａには電子メディエータが含まれ、反
応層１１８ｂにはコレステロールオキシダーゼ、コレス
テロールエステラーゼおよび界面活性剤が含まれたバイ
オセンサを作製した。まず、基板１０１の電極系上に、
ＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶液を５μｌ滴下し、５０℃の
温風乾燥機中で１０分間乾燥させることにより親水性高
分子の層１１７を形成した。つぎに、フェリシアン化カ
リウム水溶液４μｌ（フェリシアン化カリウム７０ｍＭ
相当）を親水性高分子の層１１７上に滴下し、５０℃の
温風乾燥機中で１０分間乾燥させることにより、フェリ
シアン化カリウムを含む反応層１１８ａを形成した。

【００５０】ノカルジア由来のコレステロールオキシダ
ーゼ（ＥＣ１．１．３．６：ＣｈＯＤ）とシュードモナ
ス由来のコレステロールエステラーゼ（ＥＣ．３．１．
１．１３：ＣｈＥ）を溶解した水溶液に、界面活性剤で
あるポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエー
テル（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を添加した。この混合
液を、スペーサ１０５とカバー１０９を一体化して形成
される凹部（カバー１０９の試料液供給路１０８’の上
側に相当する部分）に０.４μｌ滴下し、−１９６℃の
液体窒素にて予備凍結後、凍結乾燥機で２時間乾燥させ
ることにより、４５０Ｕ／ｍｌコレステロールオキシダ
ーゼ、１１２５Ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼお
よび２ｗｔ％界面活性剤を含む反応層１１８ｂ（図８）
を形成した。

【００５１】なお、測定対象をＬＤＬコレステロールと
するバイオセンサを得る場合は、ＬＤＬのみを選択的に
可溶化させる界面活性剤を使用すればよい。これによ
り、ＬＤＬコレステロールを反応系に導き、ＬＤＬコレ
ステロールを測定することが可能となる。ＬＤＬ以外の
リポ蛋白（カイロミクロン、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ）に対す
る酵素反応は、この界面活性剤により阻害されるため、
これらのリポ蛋白はコレステロールの反応系に導かれる
ことなく、反応液中にリポ蛋白の形で残存する。

【００５２】フィルタ１０４は、ＰＶＡでコーティング
されたガラス繊維ろ紙を、直径２.５ｍｍの円形に打ち
抜いて作製した。この後、前記基板１０１と合体基板Ｃ
との上にフィルタ１０４を設置し、ついで、フィルタ保
持板１１２ａ、１１２ｂおよび１１２ｃならびに上カバ
ー１１５とを一体化した合体基板Ｂをフィルタ１０４上
に接着し、図５〜８に示す構造を有するバイオセンサを
作製した。

【００５３】得られたバイオセンサの開口部１１６に、
試料液として全血１０μｌを滴下し、１８０秒後に対極
を基準にして測定極にアノード方向へ＋０.２Ｖのパル
ス電圧を印加し、５秒後に作用極と対極との間に流れる
電流値を測定した。その結果である応答特性を図１７に
示した。図１７から明らかなように、本発明に係るバイ
オセンサによれば、コレステロール濃度と応答値との間
に良好な直線性が得られる。

【００５４】

【発明の効果】本発明によれば、例えば指先の穿刺によ
って採取した血液を測定する場合、指先にある血液を効
率的に導入することのできるバイオセンサを提供するこ
とができる。また、本発明によれば、妨害物質である血
球をフィルタにより溶血することなく除去し、フィルタ
厚が薄くても血球除去後の血漿を迅速に電極系へ供給す
ることができ、したがって、応答特性に優れた電気化学
的バイオセンサを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施の形態に係るバイオセンサの分
解斜視図である。

【図２】図１のバイオセンサの合体斜視図である。

【図３】反応層などを省略した図２のＸ−Ｘ線断面図で
ある。

【図４】図２の電極系付近の拡大断面図である。

【図５】本発明の別の実施の形態に係るバイオセンサの
分解斜視図である。

【図６】図５のバイオセンサの合体斜視図である。

【図７】反応層などを省略した図６のＹ−Ｙ線断面図で
ある。

【図８】図６の電極系付近の拡大断面図である。

【図９】血液を分離するメカニズムを説明するためのフ
ィルタ装置の概略断面図である。

【図１０】従来のバイオセンサの縦断面図である。

【図１１】また別の従来のバイオセンサの分解斜視図で
ある。

【図１２】図１１に示すバイオセンサの縦断面図であ
る。

【図１３】本発明のバイオセンサにおけるフィルタの二
次側部分の形態を示す部分断面図である。

【図１４】本発明のバイオセンサにおけるフィルタの二
次側部分の別の形態を示す部分断面図である。

【図１５】本発明のバイオセンサにおけるフィルタの二
次側部分のまた別の形態を示す部分断面図である。

【図１６】実施例１におけるバイオセンサの応答特性を
示すグラフである。

【図１７】実施例２におけるバイオセンサの応答特性を
示すグラフである。

【符号の説明】

１、１０１基板２、１０２作用極３、１０３対極４、１０４フィルタ５、１０５スペーサ６、１０６連通部７、１０７開口部８、１０８スリット８’、１０８’ 試料液供給路９、１０９カバー１０、１１０連通部１１、１１１空気孔１２、１１２フィルタ保持板１３、１１３空隙部１４、１１４フィルタ保持部１５、１１５上カバー１６、１１６開口部１７、１１７親水性高分子の層１８ａ、１１８ａ反応層１８ｂ、１１８ｂ反応層

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５３Ｒ３５３Ｕ (72)発明者渡邊基一大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内 (72)発明者中南貴裕大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内 (72)発明者池田信大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内 (72)発明者吉岡俊彦大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内 (72)発明者南海史朗大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内Ｆターム(参考） 2G045 AA13 BA01 BB05 CA26 DA69 FB01 FB05 HA01 4B029 AA07 AA09 BB16 CC01 FA12 HA06

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】絶縁性基板、前記基板上に設けられた作
用極と対極を有する電極系、少なくとも酸化還元酵素と
電子メディエータを含む反応層、前記電極系と前記反応
層とを含み、終端部側に空気孔を有する試料液供給路、
試料液を導入するための試料液供給部、および前記試料
液供給路と試料液供給部との間に設けられた、試料液を
ろ過するフィルタを具備し、前記フィルタでろ過された
ろ液が毛細管現象によって前記試料液供給路内に吸引さ
れるようにしたバイオセンサであって、前記フィルタが前記試料液供給路内に侵入しておらず、
前記試料液が前記フィルタを通過する方向が垂直方向で
あり、さらに前記ろ液が前記試料液供給路の開口部から
前記空気孔に向かって通過する方向が水平方向であるこ
とを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】前記フィルタの上部に前記試料液を滴下
するための開口部を有することを特徴とする請求項１記
載のバイオセンサ。
【請求項３】前記フィルタの一次側部分から二次側部
分までの領域において、前記フィルタの表面を一回り囲
む空隙部を少なくとも１つ有することを特徴とする請求
項１または２記載のバイオセンサ。
【請求項４】前記フィルタの一次側部分の断面積が、
前記試料液供給路の開口部の断面積よりも大きいことを
特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のバイオセン
サ。
【請求項５】前記フィルタの一次側部分の断面積が、
前記フィルタの二次側部分の断面積よりも大きいことを
特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のバイオセン
サ。
【請求項６】前記フィルタがガラス繊維ろ紙で構成さ
れていることを特徴とする請求項１記載のバイオセン
サ。
【請求項７】前記フィルタが前記電極系と非接触であ
ることを特徴とする請求項１または６記載のバイオセン
サ。
【請求項８】前記フィルタの底面の少なくとも一部が
前記絶縁性基板に接触していることを特徴とする請求項
１、６または７記載のバイオセンサ。
【請求項９】前記フィルタを構成する繊維がポリビニ
ルアルコールでコーティングされていることを特徴とす
る請求項７記載のバイオセンサ。
【請求項１０】前記フィルタの試料液滴下部から試料
液供給路の開口部までの領域において、前記フィルタ表
面を一回り囲む空隙部を少なくとも１つ有することを特
徴とする請求項１および６〜９のいずれかに記載のバイ
オセンサ。
【請求項１１】前記フィルタの一次側断面積が、前記
試料液供給路の開口部の断面積よりも大きいことを特徴
とする請求項６〜１０のいずれかに記載のバイオセン
サ。