JP2002529082A - 標的抗原に特異的なｔ細胞ならびにこれに基づく方法およびワクチン - Google Patents

標的抗原に特異的なｔ細胞ならびにこれに基づく方法およびワクチン

Info

Publication number
JP2002529082A
JP2002529082A JP2000581183A JP2000581183A JP2002529082A JP 2002529082 A JP2002529082 A JP 2002529082A JP 2000581183 A JP2000581183 A JP 2000581183A JP 2000581183 A JP2000581183 A JP 2000581183A JP 2002529082 A JP2002529082 A JP 2002529082A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
dna
tumor
cell
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2000581183A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2002529082A5 (ja
JP4451987B2 (ja
Inventor
モーリス ゾードラー，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Rochester
Original Assignee
University of Rochester
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Rochester filed Critical University of Rochester
Publication of JP2002529082A publication Critical patent/JP2002529082A/ja
Publication of JP2002529082A5 publication Critical patent/JP2002529082A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4451987B2 publication Critical patent/JP4451987B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1072—Differential gene expression library synthesis, e.g. subtracted libraries, differential screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識され、そしてヒト腫瘍、癌および感染細胞に特異的な抗原を同定するための新規な方法、ならびに哺乳動物（ヒトを含む）における腫瘍、癌または感染の後退を誘導するための免疫学的組成物またはワクチンにおけるこのような抗原の使用に関する。本発明は、ヒト腫瘍、癌または感染細胞に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の誘導または単離のための方法、およびこれらの特異的Ｔ細胞によって認識される標的抗原をコードする遺伝子の改善された選択のための方法を包含する。本発明は、正常組織に対して腫瘍性組織、癌性組織または感染組織において示差的に発現されるＤＮＡフラグメントの分解能を改善し、かつその偽陽性の頻度を減少するディファレンシャルディスプレイ方法に関する。本発明は、腫瘍、癌または感染細胞に特異的な抗原についての発現ベクターとしての組換えウイルス操作に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願において反映される研究は、一部、国立衛生研究所からの助成金によっ
て支持され、そして政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】 （１．導入） 本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識され、そしてヒト腫瘍、
癌および感染細胞に特異的な抗原を同定するための新規な方法、ならびに、哺乳
動物（ヒトを含む）における腫瘍、癌または、感染の後退を誘導するための免疫
学的組成物またはワクチンにおけるこのような抗原の使用に関する。本発明は、
ヒト腫瘍、癌、または感染細胞に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の誘導または単離の
ための方法、およびこれらの特異的Ｔ細胞によって認識される標的抗原をコード
する遺伝子の改善された選択のための方法を包含する。本発明はまた、正常組織
に対して腫瘍性組織、癌性組織、または感染組織において示差的に発現されるＤ
ＮＡフラグメントの分解能を改善する、およびその偽陽性の頻度を減少する、デ
ィファレンシャルディスプレイ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）
方法に関する。本発明はさらに、腫瘍特異的抗原、癌特異的抗原、または感染細
胞特異的抗原についての発現ベクターとしての組換えウイルスの操作に関する。
【０００３】 （２．発明の背景） 癌についての現在の治療としては、外科手術、化学療法および放射線が挙げら
れる。免疫治療的アプローチの開発および使用（例えば、抗体結合体を使用する
腫瘍標的化、「癌ワクチン」など）は、魅力的な代替物であるが、現在まで、多
くの理由のために成功が制限されている。例えば、腫瘍抗原に特異的なモノクロ
ーナル抗体の開発は、困難であることが証明され、これは、一部、モノクローナ
ル抗体によって認識される抗原ならびに腫瘍および癌細胞によって発現される抗
原がまた、しばしば、正常な非癌性細胞によって発現されるからである。さらに
、抗体によって標的される膜抗原の発現は、頻繁に、その細胞表面でそれらの抗
原を発現しない腫瘍改変体の増殖を許容するように調節される。細胞媒介免疫応
答は、このような応答に関与する、異なる一連のエフェクター機能のため、およ
びＴ細胞媒介応答が、膜抗原のみならず主要組織適合性分子と関連してプロセシ
ングされ得そして存在し得る、任意の腫瘍特異的細胞内タンパク質もまた標的に
するための両方のために、腫瘍の根絶により効果的であり得る。この理由のため
に、腫瘍が、膜発現を調節することによってＴ細胞サーベイランスを回避するこ
とが、非常により困難である。
【０００４】 細胞媒介免疫応答に基づく免疫治療アプローチは、より有効であるようである
が、腫瘍によって発現されそして細胞媒介免疫応答において認識される抗原は、
同定および産生することが困難である。ワクチン接種および引き続く細胞媒介免
疫の刺激を通じた癌のための有効な処置の開発は、困難な問題のままである；細
胞媒介応答を刺激するために有効な抗原の同定は、特定の場合（例えば、黒色腫
）においてのみ首尾よいものであった。黒色腫において、黒色腫に対する細胞性
免疫応答を媒介する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、その腫瘍自身を浸潤し、そ
してこのようなＣＴＬは、この腫瘍から収集され得、そして他の黒色腫に対する
反応性についてスクリーニングするために使用され得る。しかし、リンパ球を浸
潤する腫瘍の単離はまだ、ほとんどの他の腫瘍（特にヒトの癌の８０％より多く
を生じる上皮細胞癌腫）に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を回収するための首尾よい
ストラテジーではない。
【０００５】 ワクチン接種における使用のために有効な抗原を同定する問題に取り組むため
に、最も最近の研究は、潜在的な腫瘍抗原を同定するために腫瘍特異的ＣＴＬを
有する発現ライブラリーをスクリーニングすることに焦点を置いていた。過度の
労働および有効でないスクリーニングプロセスならびにほとんどの型の腫瘍につ
いての腫瘍特異的ＣＴＬを単離することの相当な困難性を含む、有効な抗原を同
定する既存の方法に有意な制限が存在する。
【０００６】 （２．１．癌ワクチン） 腫瘍細胞の変更された特徴が非自己としてその免疫系によって認識され、そし
て防御的免疫を誘導し得る可能性は、癌ワクチンを開発するための試みについて
の基礎である。これが実行可能なストラテジーであるか否かは、形質転換された
細胞の特徴がどのように変更されるかに依存する。腫瘍形質転換における変異の
中心的役割の評価により、腫瘍抗原が遺伝的に不安定な細胞においてランダムな
変異の結果として生じるという仮説を生じた。ランダムな変異は、免疫原性を示
し得るが、これらは、各々の腫瘍について固有の特定の免疫を誘導することが予
測される。これは、広範に有効な腫瘍ワクチンの開発について都合が悪い。しか
し、代替の仮説は、腫瘍抗原が、形質転換プロセスに関連する系統的および再生
可能な組織特異的遺伝子の調節解除の結果として生じ得ることである。これは、
免疫治療のための適切な標的であり得る、特定の型の腫瘍において共有される抗
原の定性的または定量的な示差的発現を生じ得る。初期の結果は、いくつかの実
験的腫瘍の免疫原性がランダムな変異に対して追跡され得ることを実証し（Ｄｅ
Ｐｌａｅｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５：２２７４−２２７８；ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＯｌｄ、１９８９、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ９：７８）、最初の仮説を支持した。しかし、ラン
ダムな変異および系統的遺伝子調節解除の両方が、腫瘍において新たな免疫原性
発現を生じ得る演繹的理由は存在しない。確かに、実験的腫瘍（Ｓａｈａｓｒａ
ｂｕｄｈｅら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５１：６２０２−６３
１０；Ｔｏｒｉｇｏｅら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３２５１）
およびヒト黒色腫（ｖａｎ Ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２５４：１６４３−１６４７；Ｂｒｉｃｈａｒｄら、１９９３、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９−４９５；Ｋａｗａｋａｍｉら、１９９４、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５−３５１９；Ｂｏｅ
ｌら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２：１６７−１７５；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅ
ｙｎｄｅら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：６８９−６９８）の両方
における、より最近の研究は、調節解除された正常な遺伝子によってコードされ
る共有された腫瘍抗原の発現を明確に実証した。異なるヒト黒色腫に共通のＭＡ
ＧＥ−１および他の抗原の同定は、複数の腫瘍ワクチンの将来の開発について大
きな期待を抱かせる。
【０００７】 黒色腫における進歩にもかかわらず、細胞傷害性Ｔ細胞によって認識される共
有された抗原は、他のヒト腫瘍について記載されていない。この主な問題は、技
術的なものである。腫瘍細胞において固有に発現される免疫原性分子を同定する
ための、最も広く行き渡りかつ現在までに最も首尾よいアプローチは、腫瘍特異
的ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）を用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングすることである。このストラテジーの適用は、ヒト黒色腫において優勢に発
現されるいくつかの遺伝子ファミリーの同定を導いた。しかし、このアプローチ
の２つの主要な制限は、（１）スクリーニングが、いくつかのプールの少ない成
分によってＴ細胞刺激をアッセイするために別々の標的集団に組換えＤＮＡの多
くの小さなプールの労働集約的なトランスフェクションを必要とし、；および（
２）腎細胞癌の可能な例外を除き、腫瘍特異的ＣＴＬを、他の型の腫瘍（特に、
ヒト腫瘍の８０％より多くを含む上皮細胞癌腫）を有する患者の腫瘍浸潤リンパ
球（ＴＩＬ）またはＰＢＬのいずれかから単離することが非常に困難であったこ
と、である。黒色腫において、隔離されている腫瘍特異的ＣＴＬを生じる組織特
異的な特性が存在し得るようである。
【０００８】 腫瘍特異的遺伝子産物を用いる直接免疫は、いくつかの共有された腫瘍抗原に
対する免疫応答を誘発するために必須であり得る。腫瘍が強力な抗原を発現した
場合、これが臨床的徴候の前に根絶されるべきであることが議論されてきた。お
そらく、次いで、腫瘍は弱い抗原のみを発現する。免疫学者は、何が抗原を弱く
または強くするかという問題において長い間興味を抱いている。２つの主要な仮
説が存在している。弱い抗原は、不十分にプロセシングされ得、そしてＴ細胞に
対して有効に提示されることができない。あるいは、適切な特異性を有する生物
におけるＴ細胞の数は、活発な応答に非適切であり得る（いわゆる、「レパート
リーにおける孔（ｈｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）」）。抗原
性ペプチドが細胞表面に対する輸送およびＴ細胞に対する提示のためにＭＨＣ分
子と会合する複雑な細胞性プロセスの解明は、現代の免疫学の功績の１つである
。これらの実験は、プロセシング欠損または他のペプチドからの競合に起因する
提示の失敗が、特定のペプチドをほとんど免疫原性でないようにし得ることを、
明確に確証した。対照的に、技術的理由について、Ｔ細胞レパートリーにおける
クローナル提示の頻度が低い応答性の重要な機構であることを確証することは、
より困難であった。しかし、Ｔ細胞レセプタートランスジェニックマウスにおけ
るタンパク質抗原変化の、免疫優性と潜在のペプチドとの間の関係を実証する最
近の研究は、ペプチド特異的Ｔ細胞の相対度数が、確かに、特定のペプチドがＴ
細胞応答において潜在性または優性であるか否かにおける決定因子であり得るこ
とを、示唆する。これは、ワクチンの開発についての意味を与えた。現在の方法
に関して、腫瘍の抗原性ペプチドがＴ細胞に対してプロセシングされ、そして提
示される方法の改変を行うことは、複雑かつ困難である。しかし、特異的Ｔ細胞
集団の相対度数は、先のワクチン接種によって直接的かつ効果的に増加され得る
。従って、これは、他の潜在性応答を免疫防御的にするために必要な、重要な操
作であり得る。
【０００９】 広範に有効なヒトワクチンの開発についての別の主要な関心は、ＨＬＡクラス
Ｉ分子の極度な多型である。クラスＩ ＭＨＣ：細胞ペプチド複合体は、特異的
なＣＤ８＋ ＣＴＬについての標的抗原である。内因性に合成されたタンパク質
の分解に由来する細胞ペプチドは、プレゴルジ区画に移行し、ここでそれらは細
胞表面への輸送のためにクラスＩ ＭＨＣ分子に結合する。ＣＤ８分子は、クラ
スＩ 重鎖のα３ドメインへの結合によって、Ｔ細胞と標的との間の相互作用の
アビディティに寄与する。すべての内因性タンパク質が代謝回転するので、任意
の細胞質タンパク質または核タンパク質由来のペプチドは、ＭＨＣ分子に結合し
得、そして細胞表面への提示のために輸送され得る。このことは、Ｔ細胞が、分
泌されるかまたは細胞膜に組み込まれるかのいずれかであるタンパク質のみの構
造的決定基を認識することに限定されている抗体よりも、細胞タンパク質のより
広い提示を概観することを可能にする。
【００１０】 Ｔ細胞レセプター抗原結合部位は、ペプチドおよび周辺のＭＨＣの両方の決定
基と相互作用する。Ｔ細胞特異性は、従って、ＭＨＣ：ペプチド複合体によって
規定されなければならない。ＭＨＣ分子に対するペプチド結合の特異性は、特異
的抗体の抗原結合部位と比較して、非常に広範であり、そして相対的に低い親和
性である。クラスＩ結合ペプチドは、一般的に８〜１０残基長であり、そしてＭ
ＨＣペプチド結合部位におけるポケットに一致する特定の重要な位置での制限さ
れた多様性のアミノ酸側鎖に適応する。特定のＭＨＣ分子に結合するペプチドの
これらの重要な特徴は、ペプチド結合モチーフを構成する。
【００１１】 従って、ヒトの腫瘍、癌、および感染細胞に特異的なＴ細胞の誘導および単離
を容易にする方法、ならびに適切なＭＨＣ含量でのこれらのＴ細胞によって認識
される主要な標的抗原をコードする遺伝子を効率的に選択する方法についての必
要性が存在する。
【００１２】 （２．２．ワクシニアベクター） ポックスウイルスベクターは、タンパク質および抗原（例えば、ワクチン抗原
）、真核生物細胞における発現についての発現ビヒクルとして広範に使用される
。種々の宿主細胞におけるクローニングおよび増殖の容易さは、特に、外来性タ
ンパク質の発現のためのポックスウイルスベクターの広範な使用、およびワクチ
ン抗原のための送達ビヒクルとしての使用をもたらした（Ｍｏｓｓ，Ｂ．１９９
１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６６２−７）。
【００１３】 慣例的に、外来性ＤＮＡは、相同組換えによってポックスウイルスゲノムに導
入される。標的タンパク質コード配列は、ポックスウイルス中の非必須領域に対
して相同である配列と隣接するワクシニアプロモーターの後ろにクローニングさ
れ、そしてプラスミド中間体は、相同組換えによってウイルスゲノムに組み換え
られる。この方法論は、原核生物宿主によって許容される比較的小さなインサー
トについて効率的に働く。相同組換えの頻度は低く、そしてインサートサイズが
増大するにつれて減少するので、大きなインサートが要求される場合；労力のか
かるプラスミド中間体の構築を必要とする場合（例えば、発現ライブラリー産生
において）；およびＤＮＡの増殖が細菌において許容されない場合、この方法は
、より実行可能でなくなる。従って、このような労力のかかる遺伝子操作を必要
としない、高い頻度で大きなインサートを導入する改善された方法についての必
要性が存在する。
【００１４】 直接連結ベクターを使用する代替的な方法は、相同組換えが容易にはできない
状況においてキメラゲノムを効率的に構築するために開発されてきた（Ｍｅｒｃ
ｈｌｉｎｓｋｙ，Ｍ．ら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：５２２−５２
６；Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ，Ｆ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：９９７７−９９８１）。これらの直接連結プロト
コールは、ポックスウイルスキメラゲノムを生成するための相同組換えの必要性
を回避した。このようなプロトコールにおいて、このゲノム由来のＤＮＡは消化
され、インビトロでインサートＤＮＡに連結され、そしてヘルパーウイルスで感
染された細胞にトランスフェクトされた（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ，Ｍ．ら、１
９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：５２２−５２６、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅ
ｒ，Ｆ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
：９９７７−９９８１）。１つのプロトコールにおいて、ゲノムは、独特のＮｏ
ｔＩ部位で消化され、そしてキメラゲノムの選択および検出のためのエレメント
を含むＤＮＡインサートは、ゲノムアームに連結された（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇ
ｅｒ，Ｆ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８
９：９９７７−９９８１）。この直接連結法は、ワクシニアウイルスゲノム中へ
の外来性のＤＮＡの挿入について記載された（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒら、１９９
５、Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６：２９５７−２９６２）。あ
るいは、ワクシニアＷＲゲノムは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｆフラグメント中のＮｏｔ
Ｉ部位を除去することによって改変され、そしてチミジンキナーゼ遺伝子の近位
にＮｏｔＩ部位を再導入し、その結果この遺伝子座における配列の導入は、チミ
ジンキナーゼ遺伝子を破壊し、このことは、薬物選択の使用を介してキメラゲノ
ムの単離を可能にする（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ，Ｍ．ら、１９９２、Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ １９０：５２２−５２６）。
【００１５】 直接連結ベクターであるｖＮｏｔＩ／ｔｋは、少なくとも２６キロ塩基対長の
ＤＮＡインサートを効率的にクローニングおよび増殖させることを可能にした（
Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ，Ｍ．ら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：５２
２−５２６）。大きなＤＮＡフラグメントはゲノムに効率的にクローニングされ
たが、ＤＮＡインサートによってコードされるタンパク質は、チミジンキナーゼ
遺伝子（ワクシニアにおいて相対的に弱く発現される初期のクラスの遺伝子）に
対応する低いレベルでのみ発現される。さらに、そのＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位に
両方の方向で挿入される。従って、ＤＮＡインサートによってコ−ドされるタン
パク質産物の高いレベルの発現を伴って、大きなＤＮＡフラグメントをウイルス
ゲノムにクローニングする、より効率的な方法についての必要性が存在する。改
善された直接連結ベクターについての必要性もまた、存在する。このようなベク
ターは、癌ワクチンの開発のためにより普遍的に有用である。
【００１６】 （３．発明の要旨） 本発明は、ＣＴＬによって認識される標的抗原の同定のための方法、および標
的抗原を発現する標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に対する細胞媒介免疫を誘導す
るための免疫原性組成物またはワクチンにおけるこのような抗原の処方物および
使用に関する。
【００１７】 ２つの基本的なアプローチが標的抗原の同定について記載される。１つのアプ
ローチでは、非標的（例えば、非腫瘍形成性の）細胞対応物に対して寛容化され
た動物におけるオーセンティックな標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に対して生成
されたＣＴＬが、標的細胞由来（例えば、腫瘍由来）のＤＮＡ、ＲＮＡ、または
ｃＤＮＡから作製された発現ライブラリーをスクリーニングするために使用され
て、標的抗原を発現するクローンを同定する。本明細書中に記載される方法によ
って生成されるＣＴＬは、正常細胞とは交差反応性ではなく、従って、スクリー
ニングのためのより良好なツールである。改善された発現ライブラリーもまた、
記載される。
【００１８】 標的抗原を同定するための第２のアプローチでは、標的細胞（例えば、腫瘍細
胞）中で示差的に発現される遺伝子の産物は、動物を免疫して、オーセンティッ
クな標的細胞に対する活性について評価されるＨＬＡ拘束ＣＴＬを生成するため
に使用される。第１のアプローチと同様に、この第２のストラテジーもまた、患
者から腫瘍特異的なＣＴＬを直接的に生成することが不可能である多くのヒト腫
瘍の型についてエピトープを同定するために特に有用であり得る。さらに、それ
は、腫瘍特異的なＣＴＬの提示が、腫瘍細胞産物を用いるワクチン接種によって
最初に増大される場合、インタクトな腫瘍細胞の潜在性の抗原（すなわち、免疫
原性になり得る腫瘍細胞産物）を同定し得る。分解能を改善し、そして擬陽性を
減少するディファレンシャルディスプレイについての改変された方法が記載され
る。
【００１９】 本発明に従って、標的細胞は、細胞媒介免疫応答を誘導することが所望される
細胞である。身体中での標的細胞の例には、腫瘍細胞、悪性細胞、形質転換され
た細胞、ウイルス、真菌、もしくは放線菌に感染した細胞、または標的抗原の産
生をもたらす任意の他の疾患状態に供せられた細胞が含まれるが、これらに限定
されない。
【００２０】 本発明はまた、高収量の、候補標的抗原の発現、およびワクチン処方物のため
の組換えウイルスの産生を含む。
【００２１】 （３．１．略号） ＣＴＬ−細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｔ細胞） ＰＢＬ−末梢血リンパ球 ＲＤＡ−提示差分析 ＴＩＬ−腫瘍浸潤リンパ球 （５．発明の詳細な説明） 本発明は、ＣＴＬによって認識される標的抗原の同定のための方法、および標
的抗原を発現する細胞に対する細胞媒介免疫応答を誘導するための免疫原性組成
物またはワクチンにおけるそのような抗原の使用に関する。
【００２２】 本発明の１つの実施形態において、動物において生成された腫瘍特異的ＣＴＬ
は、腫瘍細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡから生成された発現ライブラリ
ーをスクリーニングするために使用され、反応性の標的抗原を同定する。この目
的のために、非腫瘍原性ヒト細胞株を用いて寛容化された動物は、非腫瘍原性細
胞株に由来する腫瘍細胞を用いて免疫される。得られるＣＴＬ（これは、腫瘍特
異的であるが、正常細胞とは交差反応性ではない）は、腫瘍細胞由来のＤＮＡ、
ＲＮＡ、またはｃＤＮＡから構築された発現ライブラリーをスクリーニングする
ために使用され得る。ライブラリー中でこのように同定されたクローンは、本発
明の免疫原性組成物およびワクチンについての候補である標的抗原をコードする
。「３分子（ｔｒｉ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）組換え」アプローチを使用するこの
ようなＤＮＡライブラリーの効率的な構築のための改善または改変されたワクシ
ニアウイルスベクターは、スクリーニング効率を改善するために記載される。
【００２３】 ヒト腫瘍細胞を用いて免疫する前に、動物（例えば、正常マウスまたはトラン
スジェニックマウス）を、正常ヒト細胞を用いて寛容化することは、本発明の好
ましい実施形態である。寛容誘導は好ましい。なぜなら、動物の免疫応答は、他
の場合では、腫瘍形質転換に特異的には関連しない、広範に発現される多数のヒ
トタンパク質についての特異性によって支配されるからである。特に好ましい実
施形態において、そしてこのアプローチの効率を増強するために、インビトロ発
癌または発癌遺伝子形質転換によって不死化された非腫瘍原性ヒト細胞株に由来
するヒト腫瘍を用いて働くことが好都合である。これは、新生仔マウスおよび成
体マウスの両方において、拡張された寛容化プロトコールのための正常コントロ
ール細胞の容易な供給源を提供する。例えば、このアプローチによって生成され
たＣＴＬ（以下の第７節を参照のこと）は、選択手順（例えば、以下の第８節に
おいて記載される手順）において利用されて、腫瘍ｃＤＮＡライブラリー（例え
ば、３分子組換え（以下の第６節を参照のこと）によってワクシニアウイルスに
おいて構築されたもの）由来の標的抗原をコードする組換えクローンを単離し得
る。
【００２４】 本発明の別の実施形態において、腫瘍細胞において示差的に発現される遺伝子
産物は、オーセンティックな腫瘍細胞に対する活性について評価されるＨＬＡ拘
束ＣＴＬを産生するために使用される。これは、提示差分析（ＲＤＡ）およびデ
ィファレンシャルディスプレイのような方法が、正常細胞に対して腫瘍細胞にお
ける示差的に発現される遺伝子フラグメントを同定するために利用される場合に
、特に好ましい。簡便には、これらの遺伝子産物が他の関連する腫瘍（例えば、
以下の第１０節および第１１節を参照のこと）において広範に発現することが決
定される場合、それらは、ライブラリーからより長いクローンを選択するために
使用され得る（例えば、第９．５節を参照のこと）。このライブラリーは、例え
ば、ヒトＣＤ８およびＨＬＡトランスジェニックマウスにおける腫瘍特異的免疫
応答を誘導する能力について試験され得る（例えば、第１２節を参照のこと）。
腫瘍特異的細胞媒介免疫を生成する遺伝子産物はまた、本発明の免疫原性組成物
およびワクチンの候補である。擬陽性を減少させることによってスクリーニング
効率を増強し、そして全長ｃＤＮＡを単離する効率を増強する、ディファレンシ
ャルディスプレイのための改善された方法が記載される。
【００２５】 上記の任意の戦略を使用して同定された抗原は、組換えＤＮＡ方法によって大
量に産生され、そして細胞性免疫応答を促進するアジュバント中に処方され得る
。好ましくは、標的抗原をコードするＤＮＡは、ヒトを含む動物宿主にワクチン
接種するために使用され得る組換えウイルス中へと、操作される。この点につい
て、ワクチンを産生するために使用され得る、改善された直接的連結ワクシニア
ベクターが、記載される。
【００２６】 本発明の別の治療戦略は、人種集団を超えて上昇した頻度で発現するＨＬＡク
ラスＩ分子の小さなセットを標的とするワクチンを設計することである。異なる
ヒトクラスＩ ＭＨＣ分子のペプチド結合モチーフの広範な特徴づけによって、
ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の４つの主要なサブタイプが存在し、そ
の結果多くのペプチドが１つの群の複数のメンバーに結合し得ることが示唆され
た（Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：２
６１〜２６６）。本発明はまた、患者があるクラスＩ ＭＨＣ群中の一員である
ことに基づき、その患者にワクチンを標的化する方法を提供する。特定の実施形
態において、クラスＩ ＭＨＣサブタイプＡ２、Ａ３、Ｂ７およびＢ４４が標的
とされる。各群は、人種集団を超えて、４０％と５０％との間の平均提示（ｒｅ
ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を有する。４つの全ての群の組み合わせ（全ての公
知のＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子の５０％〜６０％を含む）が、ヒト
集団の９５％を網羅することが、確立されている。特定の実施形態において、ヒ
ト集団において最も頻繁に発現するＨＬＡ対立遺伝子（白人４３％、黒人２０％
、中国人２５％）であり、そしてＡ２サブタイプの優性なメンバーであるＨＬＡ
−Ａ２．１を、標的とした。
【００２７】 記載される本発明の方法は、腫瘍細胞中の反応性の標的抗原を同定するために
使用されるが、この方法はまた、細胞性免疫を誘導することが所望される他の標
的細胞中の標的抗原を同定するためにも、使用され得る。例えば、本発明の差示
的な免疫学的方法を、マウスを非感染細胞で寛容化して、次に感染後の異なる時
点で感染細胞によって免疫することによって、ウイルス、真菌またはミコバクテ
リアに感染した細胞の免疫原性分子を同定するために適用し得る。単離されたＣ
ＴＬを使用して、プラスミドまたはウイルス発現ライブラリー中の標的抗原をコ
ードする組換え体を選択し得る。発現ライブラリーは、３分子組換えを使用する
ワクシニアウイルスベクター中の、感染細胞から単離されたｃＤＮＡを用いて構
築し得る。
【００２８】 このアプローチの特に有利な点は、病原体によって発現される潜在抗原を同定
するのみではなく、感染の結果その遺伝子発現が変化した、宿主細胞によって発
現される潜在的な抗原をも、同定することにある。多くの病原体は、頻繁な再生
および変異によって免疫監視機構を巧みに避けるので、変異の対象ではないよう
な宿主遺伝子産物を標的とするワクチンを開発することは、非常に価値があるか
もしれない。
【００２９】 本発明の差示的遺伝子発現戦略はまた、ウイルス、真菌またはミコプラズマに
よって感染された細胞の免疫原性分子を同定するために、適用され得る。病原体
または宿主のいずれかの遺伝子によってコードされる、より安定な抗原および／
または以前に同定されていない抗原（それ以前の特定のワクチン接種がなければ
、潜在性であり続け得る抗原を含む）を、同定し得る。
【００３０】 病原体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない： ウイルス病原体（例えば、ヒト免疫不全症ウイルス、エプスタイン−バーウイル
ス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、サイトメガロ
ウイルス、ＲＳウイルス）；真菌病原体（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃ
ａｎｓ、ニューモシスティスカリニ）；およびミコバクテリア病原体（例えば、
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ）。
【００３１】 以下の詳述および実施例は、腫瘍細胞における主要な標的抗原について言及す
る。上記から明らかなように、本発明の方法は、他の標的細胞（例えば、ウイル
ス感染細胞）中の標的抗原を同定するために適応され得、そしてワクチンの開発
に有用であり得る。
【００３２】 （５．１．ワクチンにおける使用のための標的抗原の同定） 以下の小節は、免疫原性処方物またはワクチンにおける使用のための候補であ
る、標的抗原または標的エピトープの同定のために使用され得る２つの戦略を記
載する。本明細書において記載される２つの戦略は、腫瘍特異的エピトープ、ウ
イルス、真菌またはミコバクテリアによって感染された細胞に特異的なエピトー
プ、ならびに／または自己免疫疾患に特異的なエピトープを含むがこれらに限定
されない標的エピトープを同定するために適応され得る。
【００３３】 （５．１．１．ヒト腫瘍に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導および標的エ
ピトープをコードするＤＮＡ組換え体を選択するためのそれらの使用） 本発明のこの実施形態において、ヒト腫瘍に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を、同
時刺激物質（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）活性を発現しない非腫瘍形成性の不死
化正常ヒト細胞株で寛容化した動物中で誘導する。その後、これらの動物は、同
時刺激物質でトランスフェクトされた（例えば、Ｂ７でトランスフェクトされた
）腫瘍細胞（インビトロの変異誘発によって誘導された腫瘍細胞、または同一の
正常な不死化ヒト細胞株からのオンコジーン形質転換によって誘導された腫瘍細
胞）で免疫される。この同一の様式において使用され得る、適合性の正常細胞お
よび腫瘍細胞の対の代替的な供給源は、同一の患者の異なる組織サンプルから正
常の細胞株および腫瘍細胞株を誘導することである。免疫の目的のために、同時
刺激物質活性をまた、マウスＢ７でトランスフェクションすることによって、こ
れらの腫瘍細胞中に導入し得る。この免疫レジメは、同種の正常細胞と交差反応
しない腫瘍特異的ＣＴＬを生じる。腫瘍特異的ＣＴＬを誘導する主な目的は、以
下に記載するように、腫瘍特異的ＣＴＬを使用して標的抗原をコードする組換え
腫瘍ＤＮＡのクローンを選択し得ることである。そのような抗原は正常細胞と比
較して腫瘍において差示的に免疫原性なので、その抗原は、免疫原性処方物また
はワクチンのための候補である。異なる種の哺乳動物（最も一般的には、近交系
マウスの多様な種）を、この目的のために使用し得る。任意の特定の個体におい
て、特定の処方物またはワクチンが免疫原性であるか否かは、その抗原由来の特
定のペプチドがプロセスされ得、そしてその個体によって発現される特定のＭＨ
Ｃ分子と共同して提示されるか否かに依存する。この選択プロセスの焦点を、特
定のヒトＨＬＡ分子が会合するペプチドが由来し得る抗原に限定するために、第
７節に記載のように、ＨＬＡ拘束されたＣＴＬを、ＨＬＡおよびヒトＣＤ８トラ
ンスジェニックマウスから直接誘導することが可能である。あるいは、ヒト腫瘍
の差示的に免疫原性である分子を、任意の動物ＭＨＣに対して拘束された腫瘍特
異的ＣＴＬを使用して、最初に同定し得る。その後、そのように同定された抗原
を、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の一次インビトロ刺激によってか、または第
１２節に記載のように、ＨＬＡおよびヒトＣＤ８トランスジェニックマウスの免
疫によって、プロセスされる能力および異なるヒトＨＬＡタイプと会合して提示
される能力について特徴付けし得る。ＨＬＡトランスジーンは、マウス胸腺にお
ける、高親和性、ＨＬＡ拘束Ｔ細胞レパートリーの選択を可能にする。さらに、
ヒトＣＤ８トランスジーンは、最も好ましい。なぜなら、マウスＣＤ８は、ヒト
クラスＩ ＭＨＣと効率的に相互作用しないからである。
【００３４】 差示的免疫原性を決定するための方法は、マウスＭＨＣ分子をコードする遺伝
子がトランスフェクションによってヒト細胞株中に導入される場合、正常のマウ
ス中で行われ得る（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｍ．、１９９１、Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓ
ｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎ
ｕａｌ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）。あるいは、ヒ
ト細胞株の抗原を、インビボ（Ｈｕａｎｇら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６
４：９６１〜９６５）およびインビトロ（Ｉｎａｂａら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ
．Ｍｅｄ．１７６：１７０２；Ｉｎａｂａら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．
１７８：４７９〜４８８）におけるマウスの専門的（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ
）抗原提示細胞によって、再提示し得る。マウス樹状細胞によるヒト抗原の再提
示の間にＴ細胞寛容を誘導するために、抗Ｂ７．１抗体および抗Ｂ７．２抗体を
用いて同時刺激物質活性をブロックすることが必要であり得る。この方法におい
て生成されたＣＴＬの特異性を、ヒト腫瘍細胞と、ＨＬＡクラスＩでトランスフ
ェクトされた正常標的細胞またはＨＬＡクラスＩで感染された正常標的細胞また
はＨＬＡクラスＩ組換えワクシニアウイルスで感染された正常標的細胞との溶解
を比較することによって決定し得る。
【００３５】 任意の個体における抗原の免疫原性は、その抗原に由来するペプチドが、その
特定の個人のＭＨＣ分子と会合してＴ細胞に対して提示され得るか否かに依存す
るので、ヒトボランティアの免疫、またはヒトＣＤ８およびＨＬＡトランスジェ
ニックマウスの免疫によって、どのヒトＨＬＡ分子が任意の同定された抗原のペ
プチドを提示し得るのかを、個別に決定し得る。正常のマウスよりもむしろＨＬ
Ａトランスジェニックマウスを最初の免疫において使用する場合に、免疫原性お
よびＨＬＡ関連提示の２つの問題に同時に対処し得る。
【００３６】 トランスジェニックマウスの構築は、当該分野において周知であり、そして例
えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈｏｇａｎら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９９４に記載される。ヒトＣＤ８トラ
ンスジェニックマウスは、ＬａＦａｃｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１３
１５−２５（１９９５）の方法によって構築され得る。ヒトＣＤ８αサブユニッ
トおよびＣＤ８βサブユニットを発現するトランスジェニックマウスの新しい系
統の構築は、対応するヒトｃＤＮＡをヒトＣＤ２ミニジーン（ｍｉｎｉｇｅｎｅ
）に基づくトランスジェニックマウス中のＴ細胞特異的発現のためのベクター中
に挿入することによって作製され得る（Ｚｈｕｍａｂｅｋｏｖら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８５：１３３〜１４０（１９９５））。ＨＬＡクラ
スＩトランスジェニックマウスを、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７６９０〜７６９４（１９８８）また
はＢｅｒｎｈａｒｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１１５７〜６２（１９８
８）またはＶｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７〜１０
１５（１９９１）またはＢａｒｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３６８１
〜９（１９９３）の方法によって構築し得る。
【００３７】 さらなるＨＬＡクラスＩトランスジェニックマウスの構築は、遺伝子調節にお
いて以前に関連付けられている最初の２つのイントロンとともに、２ｋｂの上流
調節領域を含むＨ−２Ｋｂカセットの構築によって達成され得る（Ｋｒａｌｏｖ
ａら、１９９２、ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４５９１〜４６００）。内在性の翻訳開
始部位がこの領域から除去され、そしてＨＬＡ ｃＤＮＡの挿入のための制限部
位が、第３エキソン中に導入され、その後にポリＡ付加部位が続く。この構築物
の３’末端にゲノムＨ−２Ｋｂ配列のさらなる３ｋｂを含ませることによって、
クラスＩ遺伝子が、胚性幹細胞中のＨ−２Ｋｂ遺伝子座において、相同組換えの
標的となり得る。このことは、マウスクラスＩ発現と適合することが公知である
規定された遺伝子座においてトランスジーンが発現される可能性があること、お
よびこれらのマウスが細胞膜におけるＨ−２Ｋｂ発現による可能性のある競合を
欠失している可能性があることの、利点を有する。このことは、同一の構築物中
に導入された多様なヒトクラスＩ ｃＤＮＡの比較的再現性のある発現をもたら
すと考えられる。
【００３８】 最も好ましくは、腫瘍細胞株は、全ての腫瘍細胞が単一の不死化、非腫瘍形成
性の細胞株に由来する腫瘍細胞株のパネルである。非腫瘍形成性細胞は、腫瘍細
胞においてもまた発現される、大量の正常ヒトタンパク質に対する耐性を誘導す
るために最も好ましい。
【００３９】 好ましくは、スクリーニングは、腫瘍細胞株（多様な発癌物質またはオンコジ
ーン形質転換によって、独立して、同一の正常細胞に由来する）のそのようなパ
ネルにおいて実行される。腫瘍細胞株のそのようなパネルのスクリーニングによ
って、発癌物質特異的な抗原の変化、または腫瘍細胞株のインビトロでの増殖の
間のランダムな遺伝子変動により生じ得る抗原の変化を、フィルターを通して除
去することが可能となる。
【００４０】 標的エピトープをコードするクローンを同定するために、上記のように生成さ
れた腫瘍特異的ＣＴＬを使用して、標的腫瘍細胞から調製された発現ライブラリ
ーをスクリーニングし得る。本明細書において記載されるように、哺乳動物細胞
に対して感染性のウイルスベクター中に構築されたＤＮＡライブラリーを、ＣＴ
Ｌによる、特異的組換え体の効率的な選択のために使用し得る。これら感染性ウ
イルスベクターの主要な利点は、１）組換え体が哺乳動物細胞中に導入され、そ
して発現し得ることの容易さ、および効率、ならびに２）感染された細胞のＭＨ
Ｃ分子と会合する組換え遺伝子産物の効率的なプロセシング、および効率的な提
示、である。低い感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）において、多くの標的細胞が、感
染の天然の経過の間の数時間以内に増幅される、単一の組換え体を発現する。
【００４１】 本発明の１つの実施形態において、代表的なＤＮＡライブラリーは、ワクシニ
アウイルス中に構築される。好ましくは、改変されたワクシニアウイルスベクタ
ーおよび関連するトランスファープラスミドを使用する３分子組換え方法を使用
して、ワクシニアウイルス中に代表的なＤＮＡライブラリーを構築する。この方
法は、ほぼ１００％の組換えワクシニアウイルスを生成する（第６節、第６．２
節および第６．３節を参照のこと）。
【００４２】 好ましい実施形態において（第１４節、第１４．１１節も参照のこと）、ワク
シニアウイルス移入プラスミドｐＪ／Ｋ（インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）の
ＮｏｔＩ部位を含むワクシニアウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を有するｐＵＣ
１３由来のプラスミド）をさらに、２つの強力なワクシニアウイルスプロモータ
ー（例えば、７．５Ｋワクシニアウイルスプロモーターまたは強力な合成初期／
後期（Ｅ／Ｌ）プロモーター）の１つ、それに続くＮｏｔＩおよびＡｐａＩ制限
部位を取り込むように改変する。ＡｐａＩ部位の前には、好ましくは、ＡＴＧコ
ドンを含む強力な翻訳開始配列がある。この改変は、好ましくは、ワクシニアウ
イルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子内に導入され、その結果ウイルスのｔ
ｋ遺伝子の調節配列およびコード配列に隣接する。プラスミドベクターのｔｋ遺
伝子内の２つの改変の各々は、ワクシニアウイルスＷＲ株由来のｖＮｏｔＩ-ベ
クターのゲノム中の隣接するｔｋ配列中に、相同組換えによって移され、新たな
２つのウイルスベクターを生成し得る。重要なことに、これら２つのウイルスベ
クターのＮｏｔＩおよびＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ消化の後、各々がワク
シニアｔｋ遺伝子の別々の非相同セグメントを含み、そしてともに感染性ウイル
ス粒子のアセンブリに必要な全ての遺伝子を含む２つの大きなウイルスＤＮＡフ
ラグメントが、単離される。
【００４３】 １つの実施形態において、そのような改変は、哺乳動物細胞中で複製欠損であ
る、ワクシニアのＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）株（
Ｍｅｙｅｒら、１９９１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１０３１〜１０３８
）中に導入される。
【００４４】 好ましい実施形態において、以下の方法を使用して、特異的な細胞傷害性Ｔ細
胞の標的エピトープを発現する組換えウイルスで感染させた細胞を、富化して、
そして選択する。細胞の付着性単層に、組換えウイルスライブラリー（例えば、
ワクシニア組換えウイルスライブラリー）を、１以下のｍ．ｏ．ｉ．で感染させ
る。これらの細胞は、それら自体では、特異的ＣＴＬによって認識される標的エ
ピトープを発現しないが、これらのエピトープは、ウイルスライブラリーに表れ
ることが重要である。さらに、ＣＴＬの選択のために、感染された細胞は、標的
ペプチドと会合してＴ細胞に対して提示し得る適切なＭＨＣ分子を発現しなくて
はならない。
【００４５】 組換えウイルスでの感染の１２時間後、その単層を洗浄して、任意の非付着性
細胞を除去する。規定された特異性のＣＴＬを、３０分間添加する。この間、標
的エピトープの発現をもたらす、組換え粒子で感染された付着細胞のいくつかは
、特異的なＣＴＬと相互作用して、溶解事象を起こす。溶解事象を起こした細胞
は、単層から放出され、そして浮遊する細胞集団中に収集され得る。上記のプロ
トコールを、好ましくは、５サイクル以上繰り返し、この手順によって得られる
、富化のレベルを上昇させる。
【００４６】 （５．１．２．腫瘍細胞中で差示的に発現される遺伝子の産物に対して生成さ
れた細胞傷害性リンパ球の、真正の腫瘍細胞に対する活性についてのスクリーニ
ング） 本発明のこの実施形態において、腫瘍において差示的に発現する遺伝子の産物
を使用して、ＨＬＡ拘束ＣＴＬを生成する（例えば、トランスジェニック動物の
免疫によるか、または適切なＭＨＣを発現する抗原提示細胞でのヒトＰＢＬのイ
ンビトロでの刺激による）。効果的な標的エピトープをコードする、差示的に発
現される遺伝子を同定するために、そのように生成されたＣＴＬを、真正な腫瘍
細胞に対する活性についてアッセイする。
【００４７】 本質的に、腫瘍特異的抗原を同定するこのアプローチは、前述の節に記載され
る戦略の逆である。真正な腫瘍細胞に対して生成されたＣＴＬを単離して、腫瘍
特異的ｃＤＮＡの発現ライブラリーをスクリーニングするよりもむしろ、腫瘍特
異的ｃＤＮＡまたは腫瘍特異的遺伝子産物（すなわち、腫瘍において差示的に発
現している遺伝子の産物）を使用してＣＴＬを生成して、次に、ＣＴＬを真正な
腫瘍を用いてスクリーニングする。この戦略は、患者から直接的に腫瘍特異的Ｃ
ＴＬを生成することが不可能であった場合に、多くのヒト腫瘍型についての標的
エピトープを同定するために、非常に有利に使用される。この戦略は、潜在腫瘍
抗原が同定され得るというさらなる利点を提供する。腫瘍細胞中で何が免疫原性
であるのかについてのみをアッセイするよりもむしろ、本発明のこの実施形態は
、腫瘍特異的Ｔ細胞の提示が、第１にワクチン接種によって増強される場合に免
疫原性となり得る腫瘍細胞の産物の評価およびアセスメントを可能にする。
【００４８】 腫瘍に由来する差示的に発現される遺伝子を、当業者に周知の標準的な技術を
使用して、同定し得る（例えば、ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ、１９９２、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７〜９７１を参照のこと、その全体を本明細書にお
いて参考として援用する）。好ましくは、第９．２節および第９．３節（下記）
に記載される改善された差示的ディスプレイ方法を使用して、疑陽性を減少して
、同定されたＤＮＡフラグメントに対応する全長ｃＤＮＡの単離の効率を増強し
得る。差示的に発現された遺伝子産物の各々は、潜在的に免疫原性であり、そし
て低アバンダンスまたは高アバンダンス転写物として示され得る。
【００４９】 腫瘍免疫療法についての候補であり得る、差示的に発現された遺伝子産物を同
定するために、ヒトＨＬＡと会合したペプチドに対するＴ細胞応答が誘導され得
る環境において、免疫のために産物を送達する手段を有する必要がある。この目
的のために、差示的に発現されたｃＤＮＡを、発現ベクター（好ましくは、ウイ
ルスベクター（例えば、本明細書に記載のワクシニアベクター））中に取り込み
、その結果、免疫に適切な量の遺伝子産物を産生する。免疫は、サブユニットワ
クチン中に処方された、（例えば、細胞性免疫応答を増強し得る適切なアジュバ
ントと混合した）組換え発現された遺伝子産物を使用して、達成され得る。好ま
しくは、組換えウイルス発現ベクター（例えば、ワクシニア）を使用して、免疫
し得る（ＢｅｎｎｏｃｋおよびＹｅｗｄｅｌｌ、１９９０、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔ
ｏｐｉｃｓ Ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：
１５３−１７８）。最も好ましくは、ヒトクラスＩ ＭＨＣ分子を発現するトラ
ンスジェニックマウスを使用し、その結果、その遺伝子産物に特異的なＨＬＡ拘
束マウス細胞傷害性Ｔ細胞を誘導および単離し得る（Ｓｈｉｒａｉ，Ｍ．ら、１
９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２７３３〜４２；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら
、１９９６、Ｅｕｒ．Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７〜１０１）。あ
るいは、ヒトＰＢＬを、同種のＨＬＡを発現する抗原提示細胞を用いて、インビ
トロで刺激する。
【００５０】 ＨＬＡ適合性の重要性は、抗原提示細胞の表面に結合し、そして主要組織適合
分子と会合して、抗原提示細胞の表面に輸送されるペプチドを、Ｔ細胞が、認識
するということである。従って、ＨＬＡトランスジェニックマウスのＴ細胞は、
プライムされて、発現されたヒトＨＬＡと会合する特異的なペプチドを認識し、
そしてヒト腫瘍細胞の交差反応性は、同一のＨＬＡ分子と会合した同一の腫瘍ペ
プチドの発現に依存する。
【００５１】 免疫によって誘導されたＣＴＬは、対応するｍＲＮＡを発現するＨＬＡ適合腫
瘍（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｔｕｍｏｒ）に関する交差反応性について試験され
得る。ＣＴＬは、インビトロまたはインビボで真正（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）腫瘍
細胞を殺傷するための能力についてアッセイされ得る。この終了までに第７章に
おいて記載されるアッセイが使用され得、または腫瘍細胞の特異性および死滅（
ｋｉｌｌｉｎｇ）を決定するための当業者に周知である他の同様のアッセイが使
用され得る。
【００５２】 このアプローチを使用して、ヒトの患者における腫瘍免疫治療のための特に良
い候補である標的エピトープが、以下の判断基準に適合するエピトープとして同
定される：（ａ）遺伝子は、多様なヒト腫瘍において示差的に発現される；（ｂ
）遺伝子産物は、ＨＬＡに関連して免疫原性である；そして（ｃ）誘導される特
定のＣＴＬはヒト腫瘍細胞に関して交差反応性である。
【００５３】 （５．２． ワクチン処方物） 本発明は、真核生物組換え発現ベクターまたは原核生物組換え発現ベクターの
いずれかにおいて同定された標的エピトープの発現；ならびに免疫原性および／
または抗原組成物として同定されたエピトープの処方物を包含する。本発明と一
致して、組換えによって発現した標的エピトープは、サブユニットワクチンとし
て発現され、精製されそして処方され得る。同定された標的エピトープはまた、
ワクチンにおける使用のためにウイルスベクターに構築され得る。これに関して
、生組換えウイルスワクチン、不活化された組換えウイルスワクチン、または殺
傷された組換えウイルスワクチンのいずれかが、処方され得る。
【００５４】 （５．２．１． 原核生物発現系および真核生物発現系における標的エピトー
プの発現） 本発明は、発現系（真核生物発現ベクターおよび原核生物発現ベクターの両方
）を包含し、これらは同定された標的エピトープを発現するために使用され得る
。この同定されたエピトープは、特にサブユニットのワクチンの形成のために、
短縮型形態または全長形態のエピトープの両方において発現され得る。
【００５５】 本発明は、同定されたエピトープおよび免疫学的に等価なフラグメントをコー
ドする、核酸配列の発現を包含する。このような免疫学的に等価なフラグメント
は、同定されたエピトープ（配列の５’末端および／または３’末端で切断され
、そして／または１つ以上の内部欠失を有する）をコードするヌクレオチド配列
のアナログを作製すること、アナログヌクレオチド配列を発現すること、および
生じるフラグメントが、免疫学的にエピトープ特異的ＣＴＬｓによって認識され
、そして細胞媒介免疫応答を誘導するか否かを決定することによって、同定され
得る。
【００５６】 本発明は、ＤＮＡ発現ベクター（コード配列の発現を指向する調節エレメント
と作動可能に連結される任意の前述のコード配列を含む）および遺伝的に操作さ
れた宿主細胞（その宿主細胞において、コード配列の発現を指向する調節エレメ
ントと作動可能に連結される任意の前述のコード配列を含む）を包含する。本明
細書中において使用されるように、調節エレメントとしては、誘導性プロモータ
ーおよび非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、および発現を駆
動しかつ制御する当業者に公知の他のエレメントが挙げられるがこれらに限定さ
れない。
【００５７】 標的エピトープ遺伝子産物またはそのペプチドフラグメントは、当該分野にお
いて周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。従って、エ
ピトープ遺伝子配列を含む核酸を発現することによる、本発明のエピトープ遺伝
子ポリペプチドおよびペプチドを調製するための方法が、本明細書中に記載され
る。当業者に周知である方法が、発現ベクター（エピトープ遺伝子産物コード配
列ならびに適切な転写制御シグナルおよび適切な翻訳制御シグナルを含む）を構
築するために使用され得る。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換え
ＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝的組換えが挙げられる。例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９、前出
に記載される技術を参照のこと。あるいは、糖タンパク質エピトープ遺伝子産物
の配列をコードすることが可能なＲＮＡが、例えば、シンセサイザーを使用して
、化学的に合成され得る。例えば、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ」、１９８４、Ｇａｉｔ、Ｍ．Ｊ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘ
ｆｏｒｄ（この全体が本明細書中で参考として援用される）に記載される技術を
参照のこと。
【００５８】 本発明は、同定されたエピトープ遺伝子産物のペプチドフラグメントをコード
するヌクレオチド配列もまた包含する。例えば、選択されたエピトープの細胞外
ドメインに対応するポリペプチドまたはペプチドは、分泌を容易にする「可溶性
」タンパク質として有用であり得、特にサブユニットワクチンの産生において有
用であり得る。市販されている抗体によって認識される異種エピトープに連結さ
れ得る選択されたエピトープ遺伝子産物またはそのペプチドフラグメントもまた
、本発明に包含される。耐久性（ｄｕｒａｂｌｅ）融合タンパク質もまた、操作
され得；（すなわち、選択されたエピトープ配列と異種タンパク質配列との間に
位置する切断部位を有する融合タンパク質）、その結果、選択されたエピトープ
は、異種部分から離れて切断され得る。例えば、コラゲナーゼ切断認識コンセン
サス配列は、選択されたエピトープタンパク質または選択されたエピトープペプ
チドと異種ペプチドまたは異種タンパク質との間で操作され得る。エピトープド
メインは、コラゲナーゼを用いた処置により、この融合タンパク質から放出され
得る。本発明の好ましい実施形態において、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼの融合タンパク質および選択されたエピトープタンパク質が、操作され得る
。
【００５９】 ワクチン調製法（特に、サブユニットワクチン調製法）における使用のための
本発明の選択されたエピトープタンパク質は、実質的に、純粋または相同である
。サンプルの少なくとも６０〜７５％が、単一のポリペプチド配列を示した場合
、このタンパク質は、実質的に、純粋または相同であると考えられる。実質的に
純粋なタンパク質は、好ましくは、６０〜９０％のタンパク質サンプルを含み、
より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは９９％を含む。当業者に周知の
方法が、タンパク質の純度または等質性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）を決定する
ために使用され得る（例えば、サンブルをポリアクリルアミドゲル電気泳動後、
染色ゲル上で単一のポリペプチドバンドを視覚化する）。より高い分解能が、Ｈ
ＰＬＣまたは当該分野において周知の他の同様な方法を使用して、決定され得る
。
【００６０】 本発明は、これらのタンパク質をコードする組換えヌクレオチド配列を発現す
る宿主細胞から代表的に精製されるポリペプチドを包含する。このようなタンパ
ク質精製は、当該分野において周知の種々の方法によって達成され得る。好まし
い実施形態において、本発明のエピトープタンパク質は、グルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現される。アフィニティクロマト
グラフィによって精製される、得られた組換え融合タンパク質およびエピトープ
タンパク質ドメインは、実質的に純粋なタンパク質サンプルにおいて得られる異
種部分から離れて切断される。当業者に公知の他の方法が使用され得る；例えば
、「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１９９０、Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、
１９８２、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（これらはその
全体が本明細書中において参考として援用される）に記載される技術を参照のこ
と。
【００６１】 （５．２．１．１． 真核生物および原核生物の発現ベクター） 本発明は、発現系（真核生物発現ベクターおよび原核生物発現ベクターの両方
）を包含し、これらは、選択されたエピトープを発現するために使用され得る。
種々の宿主発現ベクター系は、本発明の選択される標的エピトープ遺伝子を発現
するために利用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生さ
れ得、そして後に精製され得るビヒクルを示すが、適切なヌクレオチドコード配
列を用いて形質転換またはトランスフェクトされる場合、インサイチュで本発明
の選択されたエピトープ遺伝子産物を示し得る細胞もまた示す。これらとしては
、微生物（例えば、組換えバクテリオファージＤＮＡを用いて形質転換された細
菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、選択されたエピトープ遺
伝子産物コード配列を含むプラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ
発現発現ベクター；選択されたエピトープ遺伝子産物コード配列を含む組換え酵
母発現ベクターを用いて形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；選択されたエピトープ遺伝子産物コード配列を含む組換
えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いてインフェクトさ
れた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイク
ウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を用いて感染された植
物細胞系または選択されたエピトープ遺伝子産物コード配列を含む組換えプラス
ミド発現ベクター（例えば、Ｔｉ プラスミド）を用いて形質転換された植物細
胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチ
オネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例え
ば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ
ー）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨ
Ｏ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６２】 （５．２．１．２． 宿主細胞） 本発明は、動物細胞株および昆虫細胞株における選択されたエピトープの発現
を包含する。本発明の好ましい実施形態において、選択されたエピトープは、非
グリコシル化抗原（ｕｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）を産生す
るために昆虫細胞株中のバキュロウイルスベクターにおいて発現される。本発明
の別の好ましい実施形態において、選択されたエピトープは、安定にトランスフ
ェクトされた哺乳動物宿主細胞（例えば、グリコシル化抗原を産生するＴリンパ
球細胞株）において発現される。これらの細胞株によって組換えで発現される選
択されたエピトープが、サブユニットワクチンとして処方され得る。
【００６３】 挿入された配列の発現を調節する、または所望される特定の様式における遺伝
子産物を改変およびプロセスする宿主細胞株が、選択され得る。このようなタン
パク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断
）は、タンパク質の機能に対して重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク
質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび翻訳後修飾のための特徴的かつ
特異的なメカニズムを有する。適切な細胞株または適切な宿主系が、発現される
外来タンパク質の正確な改変を保証するために選択され得る。この終了までに、
遺伝子産物の一次転写、遺伝子産物のグリコシル化、および遺伝子産物のリン酸
化の適切なプロセシングのための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用され
得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅ
Ｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、およびＷＩ３８細胞株が挙げられる
がこれらに限定されない。
【００６４】 長期間の、組換えタンパク質の高収率の産生、安定した発現が、好ましい。例
えば、選択された標的エピトープを安定して発現する細胞株が、操作され得る。
ウイルス起源の複製を含む発現ベクターを使用するよりむしろ、宿主細胞は、適
切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写タ
ーミネ−ター、ポリアデニル化部位など）、および選択マーカーによって制御さ
れるＤＮＡを用いて形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された
細胞が、富化培地において１〜２日間の増殖が可能になり得、そして次いで、選
択的培地に切り換えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、その選
択に対する耐性を付与し、そして細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定に組
み込み、そして増殖して、順にクローン化され得そして細胞株に拡大され得る増
殖巣を形成することを可能にする。この方法は、有利に細胞株を操作するために
使用され得る。この方法は、選択されたエピトープ遺伝子産物を発現する細胞株
を操作するために有利に使用され得る。このような細胞株は、特に、選択された
エピトープ遺伝子産物の内因性の活性に影響する化合物のスクリーニングおよび
評価に有用である。
【００６５】 多くの選択系が使用され得、疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌ
ｅｒら、１９７７、Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホス
ホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌ
ｓｋｉ、１９６２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２
０２６）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ
ら、１９８０、Ｃｅｌｌ ２２：８１７）が挙げられこれらに限定されされず、
それぞれｔｋ-、ｈｇｐｒｔ-またはａｐｒｔ-細胞において用いられ得る。また
、代謝拮抗物質耐性が、以下の遺伝子についての選択のベースとして使用され得
る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキセートに対する耐性を付与る（Ｗｉｇｌｅｒら
、１９８０、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５６７；Ｏ’Ｈａ
ｒｅら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１
５２７）；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を付与する（Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７８：２０７２）；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対す
る耐性を付与する（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）；およびｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対
する耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４、Ｇｅｎｅ ３０：１４７
）。
【００６６】 あるいは、任意の融合タンパク質は、発現される融合タンパク質に対して特異
的な抗体を利用することによって容易に精製され得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃ
ｈｔらによって記載される系は、ヒト細胞株において発現される非変性融合タン
パク質の早い精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７６）。この系に
おいて、目的の遺伝子は、ワクシニア組換えプラスミドにサブクローン化され、
その結果、遺伝子のオープンリーディングフレームが、６つのヒスチジン残基か
らなるアミノ末端タグと、翻訳的に融合される。組換えワクシニアウイルスを用
いて感染された細胞からの抽出物が、Ｎｉ2+ニトリロ酢酸アガロースカラムにロ
ードされ、そしてヒスチジンタグ化タンパク質が、イミダゾール含有緩衝液を用
いて、選択的に溶出される。
【００６７】 （５．２．２． 組換えウイルスワクチンにおける標的エピトープの発現） 本発明の別の実施形態において、選択された標的エピトープを発現する生組換
えウイルスワクチンまたは不活化組換えウイルスワクチンのいずれかが、操作さ
れ得る。生ワクチンが好まれ得、なぜなら、宿主における増殖が、天然の感染に
おいて起こるのと同様の性質および大きさの延長された刺激を導き、そして従っ
て、実質的に長く永続的な免疫性を付与するからである。このような生組換えウ
イルスワクチン処方物の産生は、細胞培養におけるウイルスの増殖またはニワト
リ胚の尿膜におけるウイルスの増殖、続く精製を含む従来の方法を使用して、達
成され得る。
【００６８】 これに関して、種々のウイルスは、遺伝的に操作されて、選択されたエピトー
プを発現し得る。ワクチンの目的のために、組換えウイルスは、弱毒化特性を示
すことが必要とされ得る。ヒトにおける使用のための現在の生ウイルスワクチン
候補体は、寒冷受容性、温度感受性、または弱毒化のいずれかである。トランス
フェクションに使用されるテンプレートへの適切な変異（例えば、欠失）の導入
は、弱毒化特性を用いて新規のウイルスを提供し得る。例えば、温度感受性また
は寒冷受容性に関連する特異的で多様なミスセンス変異は、個々のウイルス遺伝
子に導入され得る欠失変異および／または多様な変異へと作製され得る。これら
の変異体は、単一の点変異を含む寒冷感受性変異体または温度感受性変異体より
安定であるべきであり、そして復帰変異の頻度は顕著に低くあるべきである。あ
るいは、「自殺」特性を有する組換えウイルスが、構築され得る。このようなウ
イルスは、宿主において１または数回だけ複製を行う。
【００６９】 本発明の目的のために、任意のウイルスが、本発明に一致して使用され得、こ
れは：（ａ）弱毒化された表現型を示すかまたは弱毒化特性を示すように操作さ
れ得る；（ｂ）哺乳動物（特にヒト）に対する向性を示すか、またはこのような
向性を示すように操作され得る；そして（ｃ）本発明の選択された標的エピトー
プを発現するように操作され得る。
【００７０】 ワクシニアウイルスベクターは、本発明と一致して使用され得る。なぜなら、
ＤＮＡの大きなフラグメントが、容易にそのゲノムにクローン化されるからであ
り、そして組換え弱毒化ワクシニア改変は、記載されている（Ｍｅｙｅｒら、１
９９１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｔｒｏｌ．７２：１０３１−１０３８）。オルトミク
ソウイルス（インフルエンザを含む）；パラミクソウイルス（ＲＳウイルスおよ
びセンダイウイルスを含む）；およびラブドウイルスが、弱毒化された表現型を
生じる変異を発現するために操作され得る（米国特許出願第５，５７８，４７３
号、１９９６年１１月２６日発行を参照のこと）。これらのウイルスゲノムもま
た、本発明の選択されたエピトープのような外来ヌクレオチド配列を発現するた
めに操作され得る（米国特許出願第５，１６６，０５７号、１９９２年１１月２
４日発行、その全体が本明細書中に参考として援用される）。逆方向遺伝的技術
（ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）は、弱毒化された表
現型を生じる変異を導入するように−鎖ＲＮＡウイルスゲノムおよび＋鎖ＲＮＡ
ウイルスゲノムを操作するために適用され得る（インフルエンザウイルス、単純
疱疹ウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス、シン
ドビスウイルスおよびポリオウイルス（Ｐａｌｅｓｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３５４−１１３５８を参照の
こと）において実証されるように）。これらの技術は、本発明と一致してワクチ
ンとして使用される組換えウイルスベクターを作製するための、外来ＤＮＡ（す
なわち、選択された標的エピトープ）を導入するためにもまた利用され得る。さ
らに、弱毒化されたアデノウイルスおよびレトロウイルスは、標的エピトープを
発現するために操作され得る。従って、広範な種々のウイルスが、本発明のワク
チンを設計するために操作され得る（しかし、例として、および制限ではなく、
本明細書中において記載されるワクチンとして使用のための選択された標的エピ
トープを発現する組換え弱毒化ワクチンベクター）。
【００７１】 １つの実施形態において、組換え改変ワクシニア改変体である、改変ウイルス
アンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）が、ワク
チン処方物において使用される。この改変ウイルスは、トリ細胞において５００
サイクルの間継代されており、そして哺乳動物細胞において完全な感染性サイク
ルを起こすことができない（Ｍｅｙｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ
．７２：１０３１−１０３８）。ワクチンとして使用される場合、この組換えウ
イルスは、単一の複製サイクルを終了し、そして十分なレベルの免疫応答を誘導
するが、さらにヒト宿主中には入らず、そして疾患を引き起こさない。１つ以上
の基本的なワクシニアウイルス遺伝子を欠く組換えウイルスは、複製の連続的な
回を起こすことができない。このような欠陥ウイルスは、ウイルス複製に必要と
される特異的な遺伝子を欠くワクシニアベクターを半永久的に発現する細胞株に
同時トランスフェクトすることによってこの遺伝子において産生され得る。基本
的な遺伝子を欠くウイルスが、これらの細胞株において複製されるが、ヒト宿主
に投与される場合、１回の複製を完遂することはできない。このような調製物が
、この不全（ａｂｏｒｔｉｖｅ）サイクルにおいて、十分な数の遺伝子を転写お
よび翻訳し得、免疫応答を誘導する。
【００７２】 あるいは、多量の株が投与され得、その結果これらの調製物が、不活化（死菌
）ウイルス、ワクチンとして機能する。不活化ワクチンについて、異種遺伝子産
物が、ウイルス成分として発現、その結果、この遺伝子産物は、ビリオンと関連
することが好ましい。このような調製物の利点は、それらがネイティブタンパク
質を含み、そして死菌ウイルスワクチンの製造において使用されるホルマリンま
たは他の薬剤を用いての処理により、不活化を起こさないことである。
【００７３】 本発明の別の実施形態において、不活化ワクチン処方物が、組換えウイルスを
殺傷するために従来の技術を使用して調製される。不活化ワクチンはそれらの感
染性が破壊されている意味において「死」である。理想的には、このウイルスの
感染性は、免疫原性に影響しないで破壊される。不活化ワクチンを調製するため
に、組換えウイルスが、細胞培養においてまたはニワトリ胚の尿膜において増殖
され得、ゾーン超遠心分離によって精製され得、ホルムアルデヒドまたはβ−プ
ロピオラクトンによって不活化され得、そしてプールされ得る。生じたワクチン
は、通常、筋肉内に接種される。
【００７４】 不活化ウイルスは、免疫学的応答を増強するために適切なアジュバントととも
に処方され得る。このようなアジュバントとして、ミネラルゲル（例えば、アル
ミニウム水酸化物）；表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリ
オール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン）；ペプチド；油性
（ｏｉｌ）エマルジョン；および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、Ｂ
ＣＧおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が挙げられ得るが
これらに限定されない。
【００７５】 （５．２．３．処置および／またはワクチン接種の方法） 同定された本発明の標的エピトープは、大量に産生され得るので、このように
して産生および精製される抗原は、ワクチン調製物における使用を有する。この
標的エピトープは、サブユニットワクチン調製物に処方され得るか、またはウイ
ルスベクターに操作され、そしてワクチン調製物に処方され得る。あるいは、標
的エピトープをコードするＤＮＡが直接ワクチン調製物として投与され得る。一
旦、被験体に投与された「裸の（ｎａｋｅｄ）」プラスミドＤＮＡは、細胞に侵
入し、Ｔリンパ球が選択されたエピトープを提示する細胞を攻撃するために、侵
入された細胞の表面上に発現され、そして細胞性免疫応答を誘発する。この選択
されたエピトープはまた、診断における用途を有する（例えば、被験体由来の体
液のサンプルにおいて腫瘍の存在を検出または測定し、そしてこのようにして癌
および腫瘍を診断し、そして／またはワクチン接種後の被験体の細胞性免疫応答
をモニターする）。
【００７６】 本発明の組換えウイルスは、腫瘍細胞に対する免疫応答を発生させるために、
腫瘍保有哺乳動物（ヒトを含む）を処置するために使用され得る。十分なそして
適切な免疫応答の発生は、インビボで腫瘍の後退を導く。このような「ワクチン
」は、単独または他の治療的な養生法（化学療法、放射線療法、手術、骨髄移植
などを含むが、これらに限定されない）との組み合わせのいずれかで、腫瘍の処
置のために使用され得る。例えば、外科技術または放射線技術は、腫瘍塊を減量
するために使用され得、その後、身体中に残っている腫瘍塊または微小転移巣の
後退を確実にし、そして進行を予防するために、本発明のワクチン処方物が投与
され得る。あるいは、この「ワクチン」の投与は、このような外科的、放射線療
法的または化学療法的処置に先行し得る。
【００７７】 あるいは、本発明の組換えウイルスは、腫瘍を含まない被験体を免疫化または
「ワクチン接種」して腫瘍の形成を予防するために使用され得る。遺伝子検査の
出現とともに、今や、被験体の癌に対する素因を予測することが可能である。従
って、このような被験体は、適切な腫瘍関連抗原を発現する組換えワクシニアウ
イルスを用いて免疫化され得る。
【００７８】 エピトープワクチン処方物抗原の免疫効力は、試験動物における免疫化後の免
疫応答をモニタリングすることにより、または当該分野において公知の任意の免
疫アッセイの使用により決定され得る。細胞媒介免疫応答の発生は、免疫応答の
指標として得られ得る。試験動物としては、マウス、ハムスター、イヌ、ネコ、
サル、ウサギ、チンパンジーなどが挙げられ得、そして最終的にヒト被験体が挙
げられ得る。
【００７９】 このようなワクチンの適切な調製物としては、注射液（液体溶液または懸濁液
のいずれかとして）が挙げられ；注射前の、溶液中の溶液、溶液中の懸濁液に適
切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、乳化され得るか、または
リポソーム中にカプセル化されるポリペプチドであり得る。活性な免疫原生成分
は、しばしば薬学的に受容可能かつ、この活性成分と適合性の賦形剤と混合され
る。適切な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセ
ロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせが挙げられる。さらに、所
望であれば、このワクチン調製物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、お
よび／またはワクチンの効力を高めるアジュバントなどの少量の補助物質を含有
する。
【００８０】 効果的であり得るアジュバントの例としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル
−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ
−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−
イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−
グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン、ＧＭ−ＣＳＦ、
ＱＳ−２１（治験薬、Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，
Ｉｎｃ．）、ＤＥＴＯＸ（治験薬、Ｒｉｂｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
）およびＢＣＧ。
【００８１】 アジュバントの効果は、標的エピトープに対して指向される細胞性免疫応答の
誘発を測定することにより決定され得る。
【００８２】 本発明のワクチンは、多価または一価であり得る。多価ワクチンは、１を超え
る抗原の発現を指向する組換えウイルスから作製される。
【００８３】 所望であれば、この組成物はまた、少量の湿潤剤あるいは乳化剤、またはｐＨ
緩衝剤を含有し得る。この組成物は、液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、
カプセル、徐放性処方物、または粉末であり得る。経口処方物は、標準的なキャ
リア（例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン
酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸水素マグネシウムな
ど）を含有し得る。
【００８４】 一般的に、これらの成分は、別々に供給されるか、または単位投薬形態（例え
ば、凍結乾燥粉末または密封容器（例えば、アンプルまたは活性薬剤の量を示す
サシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ））に入った無水濃縮物）に一緒に混合されて供給さ
れるかのいずれかである。この組成物が注射により投与される場合、これらの成
分を投与前に混合するために、滅菌された希釈剤のアンプルが提供され得る。
【００８５】 特定の実施形態においては、本発明の凍結乾燥されたエピトープは、第一の容
器で提供され；第二の容器は、５０％グリセリン、０．２５％フェノール、およ
び防腐剤（例えば０．００５％ブリリアントグリーン）の水溶液からなる希釈剤
を含有する。
【００８６】 精製抗原のワクチン調製物としての使用は、標準的な方法により行われ得る。
例えば、精製タンパク質は適切な濃度に調整され、任意の適切なワクチンアジュ
バントと共に処方され、使用のために包装されるべきである。適切なアジュバン
トは、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ゲル状鉱物（例えば、水酸
化アルミニウム）；界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌ
ｕｒｏｎｉｃ）ポリオール）；ポリアニオン；ペプチド；油乳濁液；ミョウバン
、およびＭＤＰ。免疫原はまた、リポソームに取り込まれるかまたは、ポリサッ
カライドおよび／またはワクチン処方物における使用のための他のポリマーに結
合体化され得る。例えば、組換え抗原がハプテン（すなわち、同族の抗体と選択
的に反応し得るという点で抗原性であるが、免疫応答を誘発し得ないという点で
免疫原性でない分子）の場合においては、このハプテンは、キャリアまたは免疫
原性の分子と共有結合され得る；例えば、血清アルブミンのような大きいタンパ
ク質は、それに結合するハプテンに免疫原性を与える。ハプテンキャリアは、ワ
クチンとしての使用のために処方され得る。
【００８７】 多くの方法が、上述のワクチン処方物を患者に導入するために使用され得る。
これらの方法としては、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、
経皮、硬膜外、肺、胃、腸管、直腸、膣、または尿道の経路が挙げられるが、こ
れらに限定されない。本発明の生組換えワクシニアワクチン処方物を用いる処置
の方法の場合、ワクシニアウイルス感染の天然の経路を経て（すなわち、口、鼻
、胃、腸管、直腸、膣または尿管などの粘膜または表面の経路を通じて）、この
処方物を導入することが好適であり得る。ＣＴＬ応答を誘導するために、投与の
粘膜経路は、口または鼻の膜を通り得る。あるいは、投与の筋内または腹腔内経
路が用いられ得る。好ましくは、１０6〜１０7ＰＦＵ（プラーク形成単位）の投
与量の寒冷適応（ｃｏｌｄ ａｄａｐｔｅｄ）組換えワクシニアウイルスがヒト
患者に与えられる。
【００８８】 この処方物中に使用されるワクチン調製物の正確な用量はまた、投与の経路お
よび患者の性質に依存し、そして熟練者の判断および標準的な臨床技術に従った
各患者の状況に従って決定されるべきである。効果的な免疫化の量は、ワクチン
調製物が投与される宿主における抗原に対する免疫応答を引き起こすために十分
な量である。
【００８９】 引き続く用量または追加免疫の用量が必要とされる場合、ＭＶＡなどの改変ワ
クシニアウイルスが組換えを生じさせるために用いられる親ウイルスとして選択
され得る。あるいは、他のウイルス（例えば、アデノウイルス、カナリア痘ウイ
ルス）またはサブユニット調製物が追加投与に用いられ得る。免疫化および／ま
たは癌免疫療法は、組み合わされた免疫化養生法（例えば、本発明の組換えワク
シニアウイルスワクチンを用いる免疫化および組換えワクシニアウイルスワクチ
ンの追加免疫）を用いて達成され得る。このような実施形態においては、強い二
次ＣＤ８+Ｔ細胞応答が、同じエピトープを発現する異なるウイルスを用いる初
回刺激および追加免疫の後に誘導される（このような免疫化および追加免疫の方
法については、例えば、Ｍｕｒａｔａら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１７３：９６−１０７を参照のこと）。例えば、患者は、エピトープ（例えば、
選択された腫瘍関連抗原またはそれらのフラグメント）を発現する組換えワクシ
ニアウイルスを含有する本発明のワクチン処方物で、まず初回刺激される。次い
で、この患者は、同様のエピトープを発現するワクシニア以外の組換えウイルス
を含有するワクチン処方物で追加免疫（例えば、２１日後）される。このような
初回刺激に続く追加免疫は、強い二次ＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘導する。このよう
な初回刺激および追加免疫養生法は、選択された腫瘍関連抗原を発現する、腫瘍
、転移または腫瘍性の増殖を有する患者を処置するために、好ましくは用いられ
る。
【００９０】 なお別の実施形態においては、この組換えワクシニアウイルスは、不活化され
た腫瘍細胞、腫瘍関連抗原あるいはそのエピトープを含有するサブユニットワク
チン、または別の組換えウイルスワクチン（例えば、アデノウイルス、カナリア
痘ウイルス、またはＭＶＡ）を用いる一次免疫化に続く追加免疫として使用され
得る。
【００９１】 代替の実施形態においては、特定の腫瘍関連抗原、エピトープまたはそれらの
フラグメントをコードする組換えワクシニアウイルスは、患者と組織適合性であ
り、かつ腫瘍関連抗原に対して特異的なＴリンパ球の活性化のための選択的免疫
療法において使用され得る（選択的免疫療法の方法については、例えば、１９８
７年９月１日に発行された、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４，６９０，９１
５号；１９９２年１月１４日に発行された、Ｚａｒｌｉｎｇら、米国特許第５，
０８１，０２９号を参照のこと）。このようなＴリンパ球は、患者または組織適
合性のドナーから単離され得る。このＴリンパ球は、インビトロで本発明の組換
えワクシニアウイルスに曝すことにより活性化される。活性化されたＴリンパ球
は、増殖され、そして腫瘍関連抗原エピトープに対して指向されるＴ細胞免疫を
移すために、患者へと接種される。
【００９２】 本発明はまた、１以上の本発明のワクチン処方物の成分を含有する１以上の容
器を含む薬学的なパックまたはキットを提供する。このような容器には、化学薬
品または生物学商品の製造、使用または販売を規制する行政機関により定められ
た形式の通知が付随され得る。この通知は、その機関による、ヒトへの投与に対
する製造、使用または販売の承認を示す。
【００９３】 本発明は、以下の実施例において詳細に記載される例示的な実施形態を参考に
することにより、より良く理解される。
【００９４】 （６．実施例：発現ライブラリーを作製するための改変されたワクシニアウイ
ルスベクターを使用する３分子組換え） 本実施例は、改変されたワクシニアウイルスベクターを使用する３分子組換え
方法、および１００％近い組換えワクシニアウイルスを産生する関連するトラン
スファープラスミドを記載し、そして初めて、ワクシニアウイルスにおける代表
的なＤＮＡライブラリーの効率的な構築を可能にする。
【００９５】 （６．１． ベクターの構築） 先に記載されたワクシニアウイルストランスファープラスミドｐＪ／Ｋ（イン
フレームでＮｏｔ Ｉサイトを含むワクシニアウイルスチミジンキナーゼ遺伝子
を有するｐＵＣ１３誘導プラスミド（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ，Ｍ．ら、Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ １９０：５２２−５２６））は、さらに改変されて、強力なワクシ
ニアウイルスプロモーターに続いてＮｏｔ ＩおよびＡｐａ Ｉ制限サイトを組
み入れる。２つの異なるベクター、ｐ７．５／ｔｋおよびｐＥＬ／ｔｋは、それ
ぞれ、７．５Ｋワクシニアウイルスプロモーターまたは強い合成の初期／後期（
Ｅ／Ｌ）プロモーターのいずれかを含む（図１）。このＡｐａ Ｉサイトを、Ａ
ＴＧコドンを含む強い翻訳開始配列の前に配置した。この改変は、それをウイル
スのワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子の制御配列およびコー
ド配列に隣接させるために、ｔｋ遺伝子内に導入された。これら２つの新しいプ
ラスミドベクターのｔｋ遺伝子内の改変は、隣接するｔｋ配列における相同組換
えにより、ワクシニアウイルスＷＲ株誘導ｖＮｏｔ Ｉ-ベクターのゲノムに移
され、新しいウイルスベクターｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋを生成した。
重要なことには、これらのウイルスベクターのＮｏｔ ＩおよびＡｐａ Ｉ制限
エンドヌクレアーゼ消化に続き、２つの大きいウイルスＤＮＡフラグメントが単
離され、各々、別々のワクシニアｔｋ遺伝子の非相同的なセグメントを含み、そ
して共に、感染性のウイルス粒子の構築に対して必要な全ての遺伝子を含む。こ
れらのベクターの構築および特徴付け、ならびにワクシニアウイルスにおけるＤ
ＮＡフラグメントの直接的な連結のためのそれらの代替の使用に関するさらなる
詳細は、以下の第１４節に記載される。
【００９６】 （６．２． 増加した頻度のワクシニアウイルス組換え体の産生） ワクシニアウイルスにおける組換え体の産生のための標準的な方法は、組換え
ワクシニアトランスファープラスミドとウイルスゲノムとの間の、相同組換えを
利用する。表１は、ワクシニアウイルス感染細胞への組換えトランスファープラ
スミドのトランスフェクションの後の相同組換えの頻度を、標準的な条件下でア
ッセイしたモデル実験の結果を示す。機能的なアッセイを容易にするため、Ｈ−
２Ｋbと会合するオボアルブミンの免疫優性の２５７〜２６４ペプチドエピトー
プをコードするミニ遺伝子を、トランスファープラスミドｔｋ遺伝子のＮｏｔ１
部位に挿入した。相同組換えの結果、分裂されたｔｋ遺伝子は、任意の組換えウ
イルスの野生型ウイルスｔｋ＋遺伝子で置換される。これは、組換えのためのマ
ーカーとして役立つ。なぜならば、ｔｋ−ウイルスに感染したｔｋ−ヒト１４３
Ｂ細胞は、野生型ｔｋ＋ウイルスに感染した細胞と対照的に、ＢｒｄＵの毒性効
果に対して耐性があるからである。組換えウイルスは、１２５ｍＭのＢｒｄＵの
存在下で培養された１４３Ｂ細胞上のウイルスｐｆｕにより記録され得る。この
様式において誘導される組換え体の頻度は、０．１％のオーダーの頻度である（
表１）。
【００９７】 （表１：標準的な相同的組換えによる組換えワクシニアウイルスの産生）
【００９８】
【表１】 * ワクシニアウイルス株ｖＮｏｔ１** ％組換え＝（ＢｒｄＵありの力価／ＢｒｄＵなしの力価）×１００。
【００９９】 この組換え頻度は非常に低いため、ワクシニアベクターにおけるｃＤＮＡライ
ブラリーの効率的な構築が可能ではない。以下の２つの手順を、増加した頻度の
ワクシニアウイルス組換え体の産生のために用いた。
【０１００】 （ｉ）ワクシニアウイルス感染細胞へのプラスミドトランスファーベクターの
トランスフェクションの後の相同的な組換えにより産生されるウイルス組換え体
の頻度を制限する１つの要因は、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションが相
対的に非効率的なのに対してウイルス感染が非常に効率的なことである。その結
果、多くの感染細胞は組換えプラスミドを取り込まず、そしてそれ故、野生型ウ
イルスのみを産生し得る。この組換えの効率の希釈を減少させるため、裸のウイ
ルスＤＮＡおよび組換えプラスミドＤＮＡの混合物を家禽ポックスウイルス（Ｆ
ＰＶ）感染哺乳動物細胞にトランスフェクトした。他書（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇ
ｅｒ，Ｆ．ら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
９：９９７７−９９８１）により以前記載されたように、ＦＰＶは哺乳動物細胞
において複製しないが、非感染性の裸のワクシニアＤＮＡを用いてトランスフェ
クトされた細胞への成熟したワクシニアウイルス粒子のパッケージングのために
必要とされる必要なヘルパー機能を提供する。この相同組換え技術の改変のみで
、ウイルス組換え体の頻度を約３５倍の３．５％まで増加させた（表２）。
【０１０１】 （表２：改変された相同組換えによる組換えワクシニアウイルスの産生）
【０１０２】
【表２】 表２：ＢＳＣ１細胞のコンフルエントな単層（５×１０5細胞／ウェル）をｍｏ
ｉ＝１．０の家禽ポックスウイルス株ＨＰ１で感染させた。２時間後、上清を除
去し、細胞をＯｐｔｉ−Ｍｅｍ Ｉ培地で２回洗浄し、そしてリポフェクトアミ
ンを用いて、６００ｎｇのワクシニア株ＷＲゲノムＤＮＡを単独、または１：１
もしくは１：１０（ワクシニア：プラスミド）モル比のプラスミドｐＥ／Ｌｏｖ
ａのいずれかでトランスフェクトした。このプラスミドは、ＳＩＩＮＦＥＫＬエ
ピトープをコードするオボアルブミンｃＤＮＡのフラグメントを含み、マウスの
クラスＩ ＭＨＣ分子Ｋbと高い親和力で結合することが知られている。このミ
ニ遺伝子の発現を、強い、合成の初期／後期ワクシニアプロモーターにより制御
させる。この挿入物を、ワクシニアｔｋＤＮＡに隣接させる。３日後、細胞を収
集し、そしてドライアイス イソプロパノール／３７℃水浴における３サイクル
の凍結／解凍によりウイルスを抽出した。粗ウイルスストックを、ヒトＴＫ−１
４３Ｂ細胞において、ＢｒｄＵあり、およびＢｒｄＵなしでプラークアッセイに
より力価を測定した（ｔｉｔｅｒ）。* ％組換え＝（ＢｒｄＵありの力価／ＢｒｄＵなしの力価）×１００。
【０１０３】 （ｉｉ）ウイルス性組換えの頻度におけるさらなる有意な増加は、ＦＰＶ感染
細胞を、組換えプラスミド、ならびにＮｏｔＩおよびＡｐａＩ制限エンドヌクレ
アーゼを用いて消化することにより産生されたワクシニアウイルスＶ７．５／ｔ
ｋ ＤＮＡの２つの大きなおよそ８０キロベースのフラグメントおよび１００キ
ロベースのフラグメントの混合物でトランスフェクトすることによって得られた
。ＮｏｔＩおよびＡｐａＩ部位がｔｋ遺伝子の中に導入されたので、これらの大
きなワクシニアＤＮＡアームの各々は、ｔｋ遺伝子のフラグメントを含む。２つ
のｔｋ遺伝子フラグメントの間には、相同性がないので、２つのワクシニアアー
ムが連結され得る唯一の方法は、組換え転移プラスミド中の挿入物に隣接する相
同なｔｋ配列を通した架橋によるものである。表３の結果は、感染されたｔｋ細
胞のＢｒｄＵ耐性により決定された場合に、３重にトランスフェクトされた細胞
中に産生された感染性ワクシニアウイルスの９９％より多くが、ＤＮＡ挿入物に
対して組換え体であることを示す。
【０１０４】
【表３】 表３：ワクシニア株Ｖ７．５／ｔｋ（１．２μｇ）由来のゲノムＤＮＡを、Ａｐ
ａＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて消化した。消化したＤＮＡ
を、半分に分けた。１つのプールを、ｐＥ／Ｌｏｖａの１：１（ワクシニア：プ
ラスミド）モル比で混合した。このプラスミドは、オボアルブミンｃＤＮＡのフ
ラグメントを含み、これは、ＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープをコードし、マウスの
クラスＩ ＭＨＣ分子に対する高い親和性Ｋbで結合することが公知である。こ
のミニ遺伝子の発現は、強力な合成的初期／後期ワクシニアプロモーターによっ
て制御される。この挿入物は、ワクシニアｔｋ ＤＮＡに隣接する。ＤＮＡを、
リポフェクタミンを用いて、ｍｏｉ＝１．０ ＦＰＶで２時間前に感染されてい
るＢＳＣ１細胞のコンフルエントな単層中（５×１０5細胞／ウェル）にトラン
スフェクトさせた。１つのサンプルは、６００ｎｇの未処理ゲノムＶ７．５／ｔ
ｋＤＮＡを用いてトランスフェクトさせた。３日後、細胞を収集し、そしてウイ
ルスを、ドライアイスイソプロパノール／３７℃水浴での３回の凍結融解によっ
て抽出した。粗ウイルスストックを、ＢｒｄＵ選択ありおよびなしで、ＴＫ−１
４３Ｂ細胞上にプラーク形成させた。 ★ ％組換え体＝（ＢｒｄＵありの力価／ＢｒｄＵなしの力価）×１００ （６．３．ワクシニアウイルス中の提示的（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ）
ｃＤＮＡライブラリーの構築） ｃＤＮＡライブラリーを、既知の細胞性ｍＲＮＡ配列の提示的な発現を示すた
めに、ワクシニアベクター中に構築する。
【０１０５】 さらなる改変が、感染細胞における組換え発現の効率を増強するために、ｐ７
．５／ｔｋ転移プラスミドおよびｖ７．５／ｔｋウイルスベクターの中に導入さ
れた。これらは、３つの異なる読み取り枠中の翻訳開始部位、ならびに翻訳終止
シグナルおよび転写終止シグナルの両方、およびＤＮＡ挿入物のためのさらなる
制限部位の導入を含む。
【０１０６】 第一に、ｐ７．５／ｔｋのＨｉｎｄＩＩＩ Ｊフラグメント（ワクシニアｔｋ
遺伝子）を、このプラスミドからｐＢＳファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
のＨｉｎｄＩＩＩ部位へサブクローン化し、ｐＢＳ．Ｖｔｋを作製した。
【０１０７】 第二に、ｐＢＳ．Ｖｔｋの本来の多重クローニング部位の一部分は、プラスミ
ドをＳｍａＩおよびＰｓｔＩを用いて切断、大豆ヌクレアーゼを用いて処理し、
そしてそれ自身に連結しなおし、ｐＢＳ．Ｖｔｋ．ＭＣＳ−を産生することによ
って除去された。この処理は、ｐＢＳ．Ｖｔｋから独特のＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ
、ＳａｌＩ、およびＰｓｔＩ部位を除去した。
【０１０８】 第三に、この時点における目的は、新しい多重クローニング部位をｐＢＳ．Ｖ
ｔｋ．ＭＣＳ−の中の７．５ｋプロモーターの下流に導入することであった。新
しい多重クローニング部位は、４つの異なる上流のプライマーおよび共通の下流
のプライマーを使用したＰＣＲによって産生された。共に、これら４つのＰＣＲ
産物は、ＡＴＧ開始コドンのいずれも、すなわち３つの可能性がある読み取り枠
の各々におけるＡＴＧ開始コドンを含まない。さらに、各ＰＣＲ産物は、その３
’最末端に、３つの読み取り枠全てにおける翻訳終止コドン、およびワクシニア
ウイルス転写二重終止シグナルを含む。これら４つのＰＣＲ産物は、別々にｐＢ
Ｓ．Ｖｔｋ．ＭＣＳ−のＮｏｔＩ／ＡｐａＩ部位の中に連結され、４つのベクタ
ーｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ１／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ３
／ｔｋ、およびｐ７．５／ＡＴＧ４／ｔｋを産生した。これらのｐ７．５／ｔｋ
ベクターと比較した配列改変は、図２に示される。各ベクターは、ＤＮＡ挿入物
のクローニングのために独特なＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、およびＳａｌ
Ｉ部位を含み、このＤＮＡ挿入物は、それら自身の内在性翻訳開始部位を使用す
るか（ベクターｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋにおいて）、または３つの可能な読み
取り枠のいずれか１つにおけるベクターの翻訳開始部位を利用するか（ｐ７．５
／ＡＴＧ１／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ３／ｔｋ、およびｐ７．５／ＡＴＧ４／ｔ
ｋ）のいずれかである。
【０１０９】 モデル実験において、ｃＤＮＡは、マウス腫瘍細胞株（ＢＣＡ３９）のポリ−
Ａ＋ｍＲＮＡから合成され、そして４つの改変されたｐ７．５／ｔｋ転移プラス
ミドの各々の中に連結された。ＮｏｔＩおよびＡｐａＩで消化されたｖ／ｔｋワ
クシニアウイルスＤＮＡアームの２０μｇ等量は、４つの組換えプラスミドｃＤ
ＮＡライブラリーの等モル混合物と共に、ＦＰＶヘルパーウイルス感染ＢＳＣ−
１細胞中に３分子組換え（ｔｒｉ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ
ｉｏｎ）のためにトランスフェクトされた。回収されたウイルスは、９０％より
多くがＢｒｄＵ耐性であった６×１０6ｐｆｕの合計力価を有した。
【０１１０】 組換えワクシニアライブラリー中のｃＤＮＡ挿入物の大きさの分配を特徴付け
るために、個々の隔離されたプラークを、滅菌パスツールピペットを用いて拾い
上げ、そして１００μｌリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む１．５ｍｌチ
ューブに移した。ウイルスは、ドライアイス／イソプロパノールおよび３７℃水
浴中での３回の凍結融解によって細胞から放出された。およそ３分の１の各ウイ
ルスプラークを、最終容量２５０μｌのｔｋ−ヒト１４３Ｂ細胞を含む１２ウェ
ル皿の１つのウェルへ感染させるために使用した。２時間の感染期間の最後に各
ウェルを、２．５％ウシ胎仔血清（ＤＭＥＭ−２．５）および最終濃度を１２５
μｇ／ｍｌとするに十分なＢＵｄＲを有する、１ｍｌ ＤＭＥＭで覆った。細胞
を３７℃でのＣＯ2インキュベーター内で３日間インキュベートした。３日目に
、細胞を回収し、遠心分離によってペレット状にし、そして５００μｌのＰＢＳ
中で再懸濁した。ウイルスは、上記したような３回の凍結融解によって細胞から
放出された。各ウイルスストックの２０％を、５０ｍｍ組織培養皿中で最終容量
が３ｍｌ ＤＭＥＭ−２．５において、コンフルエントな単層ＢＳＣ−１細胞を
感染させるために使用した。２時間の感染期間の最後に、細胞を３ｍｌのＤＭＥ
Ｍ−２．５で覆った。細胞を３７℃でのＣＯ2インキュベーター内で３日間イン
キュベートした。３日目に、細胞を回収し、遠心分離によってペレット状にし、
そして３００μｌのＰＢＳ中で再懸濁した。ウイルスは、上記したような３回の
凍結融解によって細胞から放出された。粗ウイルスストックの１００μｌを１．
５ｍｌチューブに移し、等量の融解した２％低融点アガロースを加え、そしてウ
イルス／アガロース混合物をパルスフィールドゲルサンプルブロック中に移した
。アガーのウォーム（ｗｏｒｍ）が凝固したとき、これらをサンプルブロックか
ら取り出し、そして３つの等しい切片に切断した。全ての３切片は、同じ１．５
ｍｌチューブに移され、そして２５０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１％サルコシ
ル、０．５ｍｇ／ｍｌプロテインキナーゼＫを添加した。このウォームを、この
溶液中で３７℃にて２４時間インキュベートした。ウォームを、５００μｌの０
．５×ＴＢＥ緩衝液中で数回洗浄し、そして各ウォームの１つの切片を、１％の
低融点アガロースゲルのウェルに移した。ウォームを添加した後、さらなる融解
した１％の低融点アガロースを添加することによりウェルを密閉した。次にこの
ゲルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄパルスフィールドゲル電気泳動装置で、０．５×ＴＢＥ
中１６時間、２００ボルト、８秒のパルス時間において電気泳動した。ゲルを、
エチジウムブロマイド中で染色し、そしてワクシニアゲノムＤＮＡを含むアガロ
ースの部分を、ゲルから摘出し、そして１．５ｍｌチューブに移した。ワクシニ
アＤＮＡを、β−Ａｇａｒａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて製造者の推奨に従って
アガロースから精製した。精製したワクシニアＤＮＡを、５０μｌのｄｄＨ2Ｏ
中で再懸濁した。１μｌの各ＤＮＡストックを、製造者の推奨に従って最終容量
２０μｌにおいて、ワクシニアＴＫ特異的プライマーＭＭ４２８およびＭＭ４３
０（これは挿入の部位に隣接する）ならびにＫｌｅｎｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として使用し
た。反応条件は、９５℃で５分間の最初の変性工程、引き続く以下の３０サイク
ル：９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、６８℃で３分を含んだ。２．５μｌの各
ＰＣＲ反応物を、１％アガロースゲルで分離し、そしてエチジウムブロマイドを
用いて染色した。多様なサイズの増幅フラグメントが、観察された。ＰＣＲで増
幅された隣接するベクター配列について補正された場合、挿入物は、サイズが３
００ｂｐと２５００ｂｐとの間の範囲である。
【０１１１】 ワクシニアウイルスｃＤＮＡライブラリーは、マウスαチューブリン配列に対
して相同なクローンの提示という点でさらに特徴付けられた。ライブラリー由来
の３００、９００または２，７００ウイルスｐｆｕのいずれかの平均を有する２
０の別々のプールは、ＢｒｄＵが存在下で、１４３Ｂ ｔｋ−細胞の単層を感染
させることにより増幅された。ＤＮＡを、３日後に各感染された培養物から抽出
し、そしてαチューブリン配列の存在について、チューブリン特異的プライマー
を用いたＰＣＲによりアッセイした。陽性プールの頻度のポアソン分析は、あら
ゆる２０００〜３０００ウイルスｐｆｕに対して１つのαチューブリン組換え体
の頻度を示す。これは、このマウス腫瘍細胞株におけるαチューブリン配列の推
定された頻度とは有意に異ならず、そしてワクシニアｃＤＮＡライブラリーにお
けるこの無作為に選択された配列の提示的な発現を示唆する。
【０１１２】 （６．４．議論） 上記された３分子組換えストラテジーは、１００％に近いウイルス組換え体を
産生する。これは、プラスミド転移ベクターをワクシニアウイルス感染細胞中へ
トランスフェクトすることによるウイルス組換え体産生に対する近年の方法を超
える、高度に顕著な改良である。この後者の手順は、わずか０．１％オーダーの
頻度においてウイルス組換え体を産生する。３分子組換えにおけるウイルス組換
え体の高い収率は、初めて、ワクシニアウイルス由来ベクター中で効果的にゲノ
ムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを構築することを可能にする。実験
の初期の段階では、６×１０6組換えウイルスの力価は、ＮｏｔＩおよびＡｐａ
Ｉで消化したワクシニアベクターアームと等モル濃度の腫瘍細胞ｃＤＮＡとの２
０μｇの混合物を用いたトランスフェクションに従って得られた。この技術的な
進歩は、新しくそして効率的なスクリーニング、ならびに特異的なゲノムクロー
ンおよびｃＤＮＡクローンの単離のための選択ストラテジーの可能性を創造する
。
【０１１３】 本明細書中に開示されるような３分子組換え方法は、ワクシニアウイルスおよ
びヘルペスウイルスを含む哺乳動物ウイルスのような他のウイルスを用いて使用
され得る。典型的に、相同性を有さない２つのウイルスアームが産生される。ウ
イルスアームが連結され得る唯一の方法は、プラスミドのような転移ベクター中
の挿入物に隣接した相同性配列を通した架橋による。２つのウイルスアームおよ
び転移ベクターが同じ細胞に存在する場合、産生された感染性ウイルスのみが、
転移ベクター中のＤＮＡ挿入物について組換え体である。
【０１１４】 ワクシニアウイルスおよび他の哺乳動物ウイルスにおいて本発明の３分子組換
え方法によって構築されるライブラリーは、ワクシニアウイルスおよび本発明の
ＣＴＬスクリーニング系における標的抗原の同定の際におけるその使用について
本明細書中に記載される利点に類似した利点を有し得る。より複雑なアッセイを
真核細胞において行う場合、同様の利点が、ワクシニアウイルスまたは他の哺乳
動物ウイルス中で構築されたＤＮＡライブラリーに対して期待される。このよう
なアッセイは、真核細胞のレセプターおよびリガンドをコードするＤＮＡのスク
リーニングを含むが、これらに限定されない。
【０１１５】 （７．実施例：ＨＬＡおよびヒトＣＤ８トランスジェニックマウスにおけるヒ
ト腫瘍に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の導入） 本実施例において、ＨＬＡおよびヒトＣＤ８トランスジェニックマウスは、マ
ウスＴ細胞に対する同時刺激因子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）活性を発現しな
い非腫瘍形成性の不死化された正常ヒト細胞株と寛容化され、そして引き続いて
その同じ正常細胞株からインビトロ変異誘発または癌遺伝子形質転換によって誘
導されたＢ７（同時刺激因子）トランスフェクトされた腫瘍細胞で免疫された。
ＨＬＡ導入遺伝子は、マウス胸腺における高親和性のＨＬＡ−拘束Ｔ細胞のレパ
ートリーの選択を可能にする。さらに、ヒトＣＤ８導入遺伝子は、マウスＣＤ８
がヒトクラスＩ ＭＨＣと効率的に相互作用しないので、必要とされる。Ｂ７ト
ランスフェクトされた腫瘍細胞を用いた免疫の次に、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離
し、そしてインビトロにおいて、非腫瘍形成性の不死化されたヒト細胞での同時
刺激の非存在下で再度刺激する。腫瘍形成性細胞株および非腫瘍形成性細胞株に
よって共有される抗原に対する寛容誘導の２つの経路は、これらの操作を通して
活性化され得る。当業者に公知のように、非常に若いマウスにおける抗原の暴露
は、クローンの欠失およびＴ細胞アネルギーの誘導の両方を含み得る機構による
寛容誘導に有利である。さらに、同時刺激因子活性の非存在下における、それら
の抗原特異的レセプターを通した活性化Ｔ細胞の再刺激は、これらＴ細胞のアポ
トーシス性排除を誘導する。この免疫のレジメンは、相同な正常細胞と交差反応
しない腫瘍特異的ＣＴＬを富化した。
【０１１６】 一連の腫瘍細胞株が使用された。これらは全て、一つの不死化された非腫瘍形
成性細胞株から由来する。非腫瘍形成性細胞は、腫瘍細胞においてもまた発現さ
れる多数の正常ヒトタンパク質に対する寛容を誘導するために使用された。多様
な発癌物質または癌遺伝子形質転換によって同じ正常細胞から別々に誘導された
腫瘍のパネル（ｐａｎｅｌ）の利用可能性は、発癌物質特異的であるかまたは、
腫瘍細胞株のインビトロ増殖の間の無作為な遺伝的浮動によって生じ得る抗原の
変化を濾し出す（ｆｉｌｔｅｒ ｏｕｔ）ことを可能にする。
【０１１７】 ヒト膀胱腫瘍細胞株に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は、腫瘍が由来する正常細胞
株に対し寛容化された、（ＨＬＡ−Ａ２／Ｋb×ヒトＣＤ８）Ｆ1ハイブリッド二
重トランスジェニックマウスから誘導および単離された。新生児マウスは、５×
１０6非腫瘍形成性ＳＶ−ＨＵＣを用いて腹腔内に注射された。７週間後、これ
らは、５×１０6 Ｂ７．１でトランスフェクトされたｐｐＴ１１．Ｂ７腫瘍細
胞を用いて免疫された。ｐｐＴ１１は、インビトロ発癌現象によってＳＶ−ＨＵ
Ｃから誘導されたいくつかの独立した腫瘍細胞株のうちの１つである（Ｃｈｒｉ
ｓｔｉａｎら、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：６０６６−６０７３；
Ｐｒａｔｔら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：６８８−６９５；Ｂｏ
ｏｋｌａｎｄら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１６０６−１６１４
）。免疫の１週間後、脾臓を取り出し、そして単一細胞懸濁液を調製した。ＣＤ
８陽性Ｔ細胞前駆体を、製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｕｎ
ｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により推奨されるように、抗Ｌｙｔ−２でコーティングさ
れたＭＡＣＳ（磁気細胞分類ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉ
ｎｇ ｂｅａｄｓ）上で富化した。次に、１．５×１０6のＣＤ８により富化さ
れたＴ細胞を、３ｍｌのＲＰＭＩ １６４０＋１０％ウシ胎仔血清中の４×１０ 5 ＳＶ−ＨＵＣを用いて、インビトロで再刺激した。この理論的根拠は、新生
児の寛容誘導を免れ、そしてｐｐＴ１１．Ｂ７の交差反応性決定基での刺激によ
ってインビボで活性化される任意のＳＶ−ＨＵＣ特異的Ｔ細胞は、ここでインビ
トロにおける同時刺激因子活性がネガティブなＳＶ−ＨＵＣ細胞での再刺激によ
るアポトーシスを受けるように、誘導され得るということである。２４時間後、
Ｔ細胞は、２０００ユニット／ｍｌの組換えマウスＩＬ−６の存在下で、ｐｐＴ
１１．Ｂ７で再度刺激される。７日目、ｐｐＴ１１．Ｂ７を用いた再刺激により
２４時間後に続けられるＳＶ−ＨＵＣ刺激のサイクルを、繰り返す。このｐｐＴ
１１．Ｂ７を用いた２回の刺激は、１０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−７およ
び５０ユニット／ｍｌの組換えマウスＩＬ−２の存在下で実行される。ＣＴＬ活
性は、５日後に、標識化した標的ＳＶ−ＨＵＣ、ｐｐＴ１１．Ｂ７、およびＹＡ
Ｃ−１、マウスＮＫ細胞による非特異的殺傷に感受性である細胞株からの標準的
なクロムの放出アッセイによって決定される。表４の結果は、以前にＳＶ−ＨＵ
Ｃに対して寛容されなかったｐｐＴ１１．Ｂ７免疫マウス由来のＣＴＬが、ＳＶ
−ＨＵＣおよびｐｐＴ１１標的細胞と同等に反応性であることを示す。対照的に
、ＳＶ−ＨＵＣでの新生児寛容化後、エフェクター：標的の割合が５：１である
細胞溶解性Ｔ細胞は、ＳＶ−ＨＵＣとよりもｐｐＴ１１．Ｂ７腫瘍細胞と有意に
より反応性である。Ｂ７同時刺激因子の活性は、同様の結果がＢ７トランスフェ
クトされた標的細胞またはトランスフェクトされていない標的細胞で観察される
ように、エフェクター段階では必要とされないことに注意する。
【０１１８】 表４：ＳＶ−ＨＵＣ親細胞を用いて新生児期に寛容され、次にＢ７同時刺激因
子でトランスフェクトされたｐｐＴ１１．Ｂ７ヒト膀胱腫瘍細胞を用いて免疫さ
れた（ＨＬＡ−Ａ２／Ｋb×ヒトＣＤ８）Ｆ1ハイブリッドトランスジェニックマ
ウスにおける腫瘍特異的応答。
【０１１９】
【表４】 本実施例手順の意義は、これが、ヒト上皮腫瘍細胞に対して特異的なマウスの
ＨＬＡ−拘束細胞溶解性Ｔ細胞を選択する手段を提供するということである。先
に示したように、これは、そのようなＴ細胞を、患者ＰＢＬまたは黒色腫そして
おそらく腎細胞癌腫以外の腫瘍の腫瘍浸潤性リンパ球のいずれかから直接的に単
離することが、非常に困難であることが証明されている。さらに、５．１．１節
に強調されるように、この同じストラテジーが、２つの段階において実行され得
る。ヒト腫瘍の示差的に免疫原性な分子は、種々の異なる動物のＭＨＣに拘束さ
れた腫瘍特異的ＣＴＬを用いて初めに同定され得る。これらの抗原は、実施例１
２に記載されるように、異なるヒトＨＬＡ型に関連してプロセスおよび提示され
る能力について、ヒトの被験体もしくはトランスジェニックマウスにおいて引き
続き特徴付けられ得る。この２段階のアプローチの利点は、多くの異なるＭＨＣ
分子が種々の近交系の株に利用可能であること、そしてこれらが、同等に広範な
腫瘍特異的免疫原性ペプチドを、最初のスクリーニングにおいて獲得するために
使用され得るということである。
【０１２０】 （８．実施例：特異的細胞傷害性Ｔ細胞の標的エピトープをコードするライブ
ラリーからＤＮＡ組換え体を選択するための高スループットストラテジー） この実施例において、モデル系をアッセイして、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞
の標的エピトープをコードするＤＮＡ組換え体を選択する手順を通して得られ得
る濃縮のレベルを決定した。
【０１２１】 （８．１．方法および結果） 十分に特徴付けられた卵白アルブミンペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（配列番
号φφ）をコードする特異的ワクシニア組換え体を、非組換えウイルスで希釈し
た。その結果、この組換え体は、０．２％、０．０１％、または０．００１％の
いずれかのウイルスｐｆｕを構成した。この卵白アルブミンペプチドは、プロセ
シングされ、そしてマウスのクラスＩ ＭＨＣ分子Ｈ−２Ｋbと結合して特異的
ＣＴＬに提示されることが公知である。Ｈ−２Ｋbを発現するＭＣ５７Ｇ細胞の
付着性単層を、このウイルス混合物にｍ．ｏ．ｉ．＝１（ウェル当たり約５×１
０5細胞）にて感染させた。ＭＣ５７Ｇ細胞はそれ自身では卵白アルブミンペプ
チドを発現しないが、Ｈ−２Ｋbを発現し、それによって、この細胞が卵白アル
ブミンペプチドを結合し、そしてこれをＴ細胞へ提示することを可能とする。
【０１２２】 卵白アルブミンペプチドを発現する組換えワクシニアウイルスに１２時間感染
した後、卵白アルブミンでプライムされた脾臓Ｔ細胞を、イムノドミナント卵白
アルブミンＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでインビトロで刺激することを繰り返すこ
とによって誘導された卵白アルブミンペプチド特異的ＣＴＬを、３０分間添加し
た。
【０１２３】 この間に、卵白アルブミンペプチドの発現を引き起こす組換え粒子に感染した
いくつかの付着細胞が、特異的細胞傷害性Ｔ細胞と相互作用し、溶解現象を起こ
した。溶解現象を起こした細胞を、単層から離した。３０分後、この単層を穏や
かに洗浄し、浮遊する細胞および残っている付着細胞を別々に収集した。
【０１２４】 それぞれの細胞集団から抽出したウイルスを、卵白アルブミン組換えウイルス
ｐｆｕの頻度のために力価測定した。浮遊した細胞から抽出したウイルスを、次
いで、新鮮な付着性ＭＣ５７Ｇ細胞および卵白アルブミンペプチド特異的ＣＴＬ
と共に、別の濃縮サイクルへのインプットとして使用した。総ウイルスの１０％
より多くまでのＶＶｏｖａの濃縮後に、続くサイクルのｍ．ｏ．ｉ．が１から０
．１に減少する場合に、組換えウイルスのさらなる濃縮が促進されることが観測
された。表５に示されるこの結果は、５濃縮サイクルにおける初期濃度０．２％
から４９％または０．０１％から３９％まで、および６濃縮サイクルにおける０
．００１％から１８％までの、ＶＶｏｖａ組換えウイルスの顕著な濃縮を実証す
る。ウェルあたり５×１０5個の付着性ＭＣ５７Ｇ細胞およびｍ．ｏ．ｉ＝１の
場合、平均して０．００１％のＶＶｏｖａ組換えウイルスの初期濃度は、１つの
培養ウェルにおいて５×１０3個の野生型ワクシニアウイルスのうち５つの組換
えｐｆｕのみを播種することと等価であることに注意のこと。非常に実質的な濃
縮が、これらの条件の下でも達成される。
【０１２５】
【表５】 （８．２．考察） 特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の標的エピトープをコードするＤＮＡクローンをウ
イルスライブラリーから単離するための上記の選択方法は、同じ目的を達成する
ための既存の方法よりもはるかに効率的である。本発明に先立って、最も広く使
われている方法は、いくつかのプールの微量な成分によりＴ細胞刺激をアッセイ
するために、組換えプラスミドの多数の小さなプールの、別々の標的集合へのト
ランスフェクションが必要である。これは、多くのネガティブプラスミドのプー
ルをスクリーニングする必要があるため、これは、本明細書に記載のポジティブ
選択方法よりも遥かに骨の折れる集約的手順である。所定の資源の投資にとって
、本明細書に記載の方法は、他の方法で可能な頻度よりかなり低い頻度で生じる
ポジティブＤＮＡクローンを検出し得る。このストラテジーの主要な原理は、特
異的抗体ならびにＣＴＬを用いるＤＮＡクローンのスクリーニングおよび選択へ
と直接拡張され得る。
【０１２６】 （９．実施例：腫瘍中で示差的に発現する潜在的腫瘍特異的抗原の同定） ヒトの腫瘍、癌、または感染した細胞中で示差的に発現した遺伝子の同定は、
広く効果的なヒトワクチンの開発を促進し得る。示差的な遺伝子の発現を同定す
るほとんどの方法は、差し引き（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）ハイブリダイゼーシ
ョンまたはより最近記載されたディファレンシャルディスプレイ技術のいずれか
の改変形である。
【０１２７】 表示差異分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＤＡ）は差し引きハイブリダイゼーションに基づいた、
全細胞のＤＮＡの「表示」に適用される方法である（Ｌｉｓｉｔｓｙｎ，Ｎおよ
びＮ．，Ｍ．Ｗｉｇｌｅｒ．１９９３．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅｓ．、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５９：９４６−９５１）。ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ（１
９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７−９７１）のディファレンシャルディ
スプレイ方法は、恣意的な１０ヌクレオチドプライマーおよび固定されたオリゴ
−ｄＴを使用し、ＤＮＡ分子のより複雑なセットから恣意的なフラグメントのサ
ブセットをＰＣＲ増幅する。以下に記載のように（９．２節）、本発明者らは、
示差的に発現する遺伝子を同定し得るよう効率を増大するために、ディファレン
シャルディスプレイを改変した。この実施例において本発明者らは、これらの方
法を、腫瘍特異的な遺伝子生成物の同定を容易にする単一の非腫瘍形成性の不死
化細胞株から独立的に誘導される腫瘍の関連するセットに適用する方法を例示す
る。
【０１２８】 Ｓａｈａｓｒａｂｕｄｈｅら（１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５１
：６３０２−６３１０）によって記載された実験は、マウス腫瘍細胞株のセット
に焦点を合わせており、その全ての細胞株は、単一のクローン化された非腫瘍形
成性のＢＡＬＢ／ｃ胚性繊維芽細胞株から独立的に誘導された。これらの腫瘍は
、それらが免疫保護抗原を共有することが公知であるために格別興味深かった。
これらの実験の目的は、共有された腫瘍抗原の分子規定への到達であった。以下
に記載の方法による示差的な遺伝子の発現および腫瘍免疫原性の効率的な分析の
ために、腫瘍細胞、ならびにその腫瘍細胞が誘導された正常細胞からすぐに入手
可能であることを利用した。
【０１２９】 多様な発癌物質（または発癌遺伝子の形質転換）によって、同じ正常細胞から
独立して誘導される複数の腫瘍が入手可能であることもまた、抗原性の変化を取
り出すことを可能とし、その変化は、インビトロでの腫瘍細胞の増殖の間に発癌
物質特異的であるか、またはランダムな遺伝的変動の結果として発生し得る。（
実施例１０を参照のこと。ここで、一連のヒト腫瘍細胞株が記載され、それはこ
の分析の要求を満たす）。
【０１３０】 共有された腫瘍拒絶抗原の形質転換および発現のプロセスの間の関係を、Ｂ／
Ｃ−Ｎ７．１Ｃ．１（ＢＡＬＢ／ｃ胎仔から誘導された連続した繊維芽細胞株の
、接触阻害された非腫瘍形成性クローン（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８２、Ｎａｔ
ｕｒｅ ２９９：１６７；Ｌｉｎら、１９８５、ＪＮＣＩ ７４：１０２５））
から独立して誘導された一連のマウス腫瘍（ＢＣＡ ３４、ＢＣＡ ３９、ＢＣ
Ａ ２２、およびＢＣＢ １３）間の免疫学的関係を特徴付けることによって研
究した。腫瘍の形質転換の最も近い原因は、発癌物質により誘導された変異であ
ったかもしれないが、このモデルは、形質転換のプロセスもまた限定数の共有さ
れた抗原の発現と関係あるか否かを決定する機会を提供した。
【０１３１】 Ｓａｈａｓｒａｂｕｄｈｅら（１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５１
：６３０２−６３１０）によって報告されているように、免疫学的な分析は、４
つのＢ／ｃ．Ｎ由来の腫瘍のうち３つが、お互いに対する交差保護性の免疫を付
与することを示す。インビボでの交差保護のデータと一致して、１つの免疫学的
に関係した腫瘍で免疫されたマウスからの細胞溶解性Ｔ細胞クローンは、３つ全
ての免疫学的に関係した腫瘍を特異的に溶解するが、重要なことに、親のＢ／ｃ
．Ｎ細胞または免疫学的に独立したＢＣＢ １３腫瘍とは反応しない。クローン
化された非腫瘍形成性の親細胞株から独立して誘導された腫瘍群間の免疫学的な
交差反応性の観察は、非無作為の形質転換に関連するプロセスが同じ腫瘍抗原（
単数または複数）の再発性の発現を生じることを、強く示唆する。示差的な遺伝
子の発現を分析する２つの方法（表示差異分析（ＲＤＡ）および改変したディフ
ァレンシャルディスプレイ）を、関連した腫瘍抗原（単数または複数）をコード
し得るｃＤＮＡの単離に使用した。
【０１３２】 （９．１．表示差異分析（ＲＤＡ）） ＲＤＡのＰＣＲ ＳＥＬＥＣＴTMの改変型が、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって市販されている。本文および図３に要約された以下の
一般的プロトコールは、製造業者の推薦の概要である。ｃＤＮＡを、トレーサー
（ＢＣＡ ３９腫瘍ｍＲＮＡによって表示される）およびドライバー（親のＢ／
ｃ．Ｎ ｍＲＮＡによって表示される）の両方から合成する。トレーサーおよび
ドライバーのｃＤＮＡの両方の「表示物」は、４塩基認識配列ＧＴＡＣを切断し
て、平滑末端フラグメントを生じる、ＲｓａＩでの消化によって作製する。最終
的にＰＣＲのプライマー部位として作用するアダプターを、トレーサーｃＤＮＡ
フラグメントのみの５’末端に結合する（図３）。トレーサー表示物の２つのア
リコートを、２つの異なるアダプターを用いて別々に結合する。一連の２つのハ
イブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションの第１のセットにおいて
、アダプターに連結された各々のトレーサーサンプルを変性し、そしてドライバ
ーｃＤＮＡの１０倍過剰の変性された表示物と８時間ハイブリダイズする。これ
らの条件下での全ての分子の再アニーリングは不完全であり、そして高コピーお
よび低コピー両方の分子のいくつかは一本鎖のままである。再アニーリングの速
度が、より大量の種についてより速いため、これは、低コピー数の一本鎖分子の
相対的な濃縮を介した分布の規格化を導く。アダプターに連結された異なるトレ
ーサーｃＤＮＡ表示物の各々との２つのハイブリダイゼーション反応を、次いで
、細分化またはさらなる変性なしで、しかし、第２のハイブリダイゼーション反
応でのより新しく変性されたドライバーの添加と組み合せ、この反応を約２０時
間、さらに進行させて完了させる。
【０１３３】 第２のハイブリダイゼーションからの生成物のアリコートを、結合したアダプ
ターの５’末端の既知の配列をプライマーとして用いて、高いストリンジェンシ
ーのＰＣＲ反応のテンプレートとして使用する。ここでの重要なポイントは、１
）第１のハイブリダイゼーションを通じて一本鎖のままであり、そして２）第２
のハイブリダイゼーションにいて代わりのアダプターに結合した相補的なトレー
サー配列へハイブリダイズする、腫瘍トレーサー配列のみが、ＰＣＲの間に指数
関数的に増幅され得ることである。これは、一本鎖を維持するか、または過剰の
ドライバーにハイブリダイズされたかのいずれかのトレーサーおよびドライバー
種の両方（これらが、相補的なプライマーを分子の１つの末端にのみ有するか、
またはどちらの末端にも有さないため）、ならびに、同じアダプターを有する分
子にハイブリダイズするトレーサー配列（なぜなら、このアダプターはプライマ
ーより長く、そしてそれら自身の相補体が変性した一本鎖分子の反対の末端に存
在するとき、それら自身の相補体と高い親和性でハイブリダイズするため（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈによって「抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）ＰＣＲ」と呼ばれた反
応））を除外する。最終的に、高いストリンジェンシーの第２のＰＣＲを、アダ
プターに組み込んだネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを使用して行って、
バックグラウンドをさらに減少させ、そして示差的に発現した配列をさらに濃縮
する。第２のＰＣＲの生成物を、アガロースゲル上で電気泳動し、そして可視化
する。個々のバンドをさらなる分析のために切出し、そしてサブクローン化する
。
【０１３４】 （９．２．潜在的な腫瘍免疫原をコードする遺伝子の表示差異分析） この実施例は、ＰＣＲ ＳＥＬＥＣＴTM ｃＤＮＡの差し引き方法（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、免疫学的に関連したマウス腫瘍のセ
ットにおける共有された腫瘍抗原についての強力な候補を同定するために首尾良
く使用した方法を記載する。
【０１３５】 図４に示されるように、フラグメント化された正常細胞ｃＤＮＡの表示物を、
ＢＣＡ ３９腫瘍ｃＤＮＡの同様の表示物から差し引くと、結果として、約３０
０から２２００塩基対のサイズの範囲の一連の７つの明らかに識別可能な差し引
き生成物を同定した。これらのＤＮＡフラグメントが実際に示差的に発現された
ことを確認するため、各バンドをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）にクローン化し、それぞれのバンド由来の少なくとも５コロニーの
ＤＮＡインサートを、５つの異なる細胞株（親細胞、３つの免疫学的に交差反応
性の腫瘍細胞株、および１つの非交差反応性の腫瘍細胞株）のＲＮＡに対するノ
ーザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。ＲＤＡバンド１に由
来するクローン３ｆの代表的な結果を、図５Ａに示す。
【０１３６】 そのプローブは、ＢＣＡ ２２、３４および３９の腫瘍ｍＲＮＡにおいて少な
くとも３つの転写物にハイブリダイズした。３つの転写物の発現は、これらの３
つの免疫学的に交差反応性の腫瘍に独特である。最少のハイブリダイゼーション
は、親のＢ／ｃ．Ｎ細胞または非交差反応性のＢＣＢ １３腫瘍の、ＲＮＡを用
いて検出された。同様の結果が、独立したＲＮＡ調製物を用いた４つのノーザン
ブロットにおいて観察された。ＲＮＡサンプルの完全性および相対的ローディン
グを、マウスＧ３ＰＤＨ遺伝子のフラグメントに対するハイブリダイゼーション
により決定した（図５Ｂ）。
【０１３７】 クローン３ｆの配列を決定し、マウス槽内のＡ型粒子（ＩＡＰエレメント）の
配列の一部に強く相同性であることを見出した（Ａｏｔａら、１９８７，Ｇｅｎ
ｅ ５６：１−１２）。ＩＡＰは、小胞体の槽に局在化する内在性のレトロウイ
ルス様の粒子である。ＩＡＰは、機能的にパッケージングされたタンパク質をコ
ードしないために非感染性であり、その配列の潜在的ｅｎｖ領域は、多くの保存
された終止コドンを含む（ＫｕｆｆおよびＬｕｅｄｅｒｓ、１９８８，Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１：１８３−２７６）。
大部分のＩＡＰは、７３ｋＤａの主要なｇａｇタンパク質、およびいくつかの逆
転転写酵素の特性を有するｐｏｌポリペプチドをコードする（Ｗｉｌｓｏｎおよ
びＫｕｆｆ、１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９
：１５３１−１５３６）。ＩＡＰ転写物の発現は、種々のマウスの原発性腫瘍（
プラズマ細胞腫、乳頭腫、癌腫、乳癌、肉腫、肝細胞腫を含む）および樹立され
たマウス腫瘍およびマウス細胞株（フレンド赤白血病、骨髄単球性白血病、Ｔリ
ンパ腫、骨髄腫を含む）において記載された。正常な胸腺における発現は増大し
得るが、大部分の正常なマウスの体細胞組織において、非常に低いレベルの発現
のみが検出される（ＫｕｆｆおよびＬｕｅｄｅｒｓ、１９８８，Ａｄｖａｎｃｅ
ｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１：１８３−２７６）。
【０１３８】 （９．３．ＲＤＡからの示差的に発現した遺伝子配列の特徴付け） 半定量的なＰＣＲは、示差的な発現にとってノーザンブロット分析よりもより
敏感な試験である。クローン３ｆ配列に特異的なプライマーを、ＢＣＡ ３９腫
瘍およびその親細胞株の両方由来の全長オリゴ−ｄＴプライムされたｃＤＮＡの
増幅のために使用した。マウスチューブリンプライマーを用いる増幅を、この２
つの細胞株間のテンプレートの量の規格化のために使用した。それぞれのテンプ
レートの等しいアリコートを、可変数のＰＣＲサイクルを介して増幅した。それ
ぞれの場合において、相対的テンプレートの濃度の推定は、サイクル数に応じて
生成物が指数関数的に増加する増幅曲線の部分に直線を適合させる事によって誘
導した。この仮定は、この領域において収量が、（初期のテンプレートの濃度）
＊（ａn）の線形関数であることであり、ここでａは、そのＰＣＲ領域における
サイクルあたりの増幅の平均であり、通常は１．５と１．８との間であり、そし
てｎはサイクル数である。親Ｂ／ｃ．Ｎ．と比較して、ＢＣＡ３９腫瘍ｃＤＮＡ
において、３ｆフラグメントの発現は少なくとも７倍多いことが決定された。
【０１３９】 腫瘍ＲＮＡにおける示差的な発現を、他の６つのＲＤＡバンドに由来するさら
なる１２クローンのインサートについて確認した。ノーザン分析は、クローン３
ｆについて観察したのと同一の、ＩＡＰ転写物のハイブリダイゼーションパター
ン特性を示した。それぞれのクローンの配列を決定し、そのＩＡＰのゲノムの他
の領域と相同的であることを見出した。１０の独特なＲＤＡクローンの相対部位
のマップを図６に示す。累積的に、これらのインサートが、このＩＡＰゲノムの
大部分をカバーすることが理解され得る。
【０１４０】 これらのＩＡＰ配列の発現が、この３つの免疫学的に交差反応性の腫瘍（ＢＡ
Ｃ ３９、ＢＣＡ ３４、およびＢＣＡ ２２）の間で共有されているが、Ｂ／
ｃ．Ｎ親細胞および免疫学的に無関係のＢＣＢ １３腫瘍の両方においては存在
しないか、または非常に低いことが特に印象的である。従って、ＩＡＰエピトー
プは、この共有された腫瘍抗原についての強力な候補である。異なるＲＤＡクロ
ーンを抗原ネガティブＢ／ｃ．Ｎ細胞にトランスフェクトする実験が進行中であ
り、この細胞を、次いで、腫瘍特異的なＣＴＬによる溶解に対する感作について
試験する。ＩＡＰを含む内在性のレトロウイルスエレメントの転写活性化は、新
しいクラスの共有された腫瘍拒絶抗原を表し得る。マウスＬＥＣ自発性白血病の
腫瘍抗原ＬＥＣ−Ａも、ＩＡＰエレメントのｇａｇ遺伝子によりコードされるこ
とが報告されている（ｄｅ Ｂｅｒｇｅｙｃｋら、１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．２４：２２０３−２２１２）。最近、マウス結腸腫瘍の腫瘍拒絶抗
原であるＣＴ２６が、別の型の内在性レトロウイルスであるＣ型粒子によってコ
ードされることが見出された（Ｈｕａｎｇら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９７３０−９７３５）。レトロウイルス様エ
レメントもまた、ヒトゲノム中に存在し：ｐｏｌ遺伝子の発現がヒト乳房（Ｍｏ
ｙｒｅｔら、１９８８，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８：１２７９−１２８
３）、および結腸直腸癌（Ｍｏｓｈｉｅｒら、１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３９：１０７１−１０７７）において検
出され、そしてｇａｇ遺伝子生成物に対する抗体が、ヒト精上皮腫の患者の血清
（Ｓａｕｔｅｒら、１９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：４１４−４２１）、およ
び腎臓細胞癌の患者の血清（Ｗａｈｌｓｔｒｏｍら、１９８５，Ｌａｂ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．５３：４６４−４６９）において報告された。
【０１４１】 （９．４．潜在的な腫瘍免疫原をコードする遺伝子の、改変されたディファレ
ンシャルディスプレイ） 以下の実施例において、ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅのディファレンシャル
ディスプレイ方法（１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７−９７１）を、
ＤＮＡフラグメントの分離の改良のため、および偽陽性の頻度の減少のために、
改変した。
【０１４２】 ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅによって本来記載されたディファレンシャルデ
ィスプレイ方法（１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７−９７１）は、恣
意的な１０ヌクレオチドプライマーおよび固定されたオリゴ−ｄＴを使用し、Ｄ
ＮＡのより複雑なセットから恣意的なフラグメントのサブセットをＰＣＲ増幅す
る。原理的には、正常な細胞株および腫瘍の細胞株から産生したフラグメント間
の相異は、その２つの細胞型における遺伝子発現の相異を反映するはずである。
実際には、この方法は、時々良好に働くが、しばしば多数の偽陽性を生じる。す
なわち、さらなる特徴付けの際に、示差的提示されたように見えるバンドが、示
差的に発現されていないことが見出される。おそらくこれは、複合集団における
個々の種の可変性のＰＣＲ増幅、および顕著でないバンドを不明瞭にし得る比較
的高いバックグラウンドに起因する。示差的な発現の確立には相当の努力が要求
されるため、これらの固有の偽陽性は、有効性および生産性の点では高価である
。
【０１４３】 単一の恣意的なプライマーもまた、Ｗｅｌｃｈら（３、４）によって記載され
るように、ディファレンシャルディスプレイに使用され得る。しかし、単一プラ
イマーの使用は、複合ｃＤＮＡ集団の同じ範囲に達するために、独立したプライ
マーの非常に多くのセットの合成を必要とする。
【０１４４】 それ故に、ＤＮＡフラグメントの分離の改良および偽陽性の頻度の減少のため
に改良されたディファレンシャルディスプレイ方法が必要である。
【０１４５】 フラグメントの分離の改良および偽陽性の頻度の減少のために、ＰＣＲ増幅に
おいて使用される固定されたオリゴ−ｄＴを、第２の恣意的なプライマーに置換
した。これは、結果として、各々のＰＣＲ反応において、より少ないＤＮＡ産物
が産生し、その結果、個々のＤＮＡフラグメントを、配列決定ゲル上でより確実
に分離し得る。
【０１４６】 この改変されたディファレンシャルディスプレイプロトコルにおいて産生する
フラグメントの各々のサブセットが、全ｃＤＮＡのより小さな提示であるため、
適切な試料採取のために、より多くのプライマー対が必要である。可能な６６個
全てのプライマー対の組み合わせにおいて、１２の独立したプライマーを利用す
る場合、平均の大きさの真核生物のｃＤＮＡについて少なくとも１つのプライマ
ー対が７０ｂｐ以上のサイズの代表的なＰＣＲフラグメントを増幅することに、
８５％より大きい可能性が存在することが、負の２項分布を用いることで予想さ
れ得る。
【０１４７】 表６は、そのプライマー対が改変されたディファレンシャルディスプレイから
選択された、１２の任意の十量体の配列を列挙する。この特異的なプライマーを
、それらの配列の多様性、３'ハイブリダイゼーション親和性、および最小の対
様式（ｐａｉｒ−ｗｉｓｅ）ハイブリダイゼーションに基づいて選出した。
【０１４８】
【表６】 各々のプライマーを用いて、０．１μｇのポリＡ−ＲＮＡおよびＳｕｐｅｒｓｃ
ｒｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いる分離ｃＤＮＡの合成反応
行った。プライマー対の各々のメンバーを用いて作製されたｃＤＮＡ産物の５パ
ーセントをＫｌｅｎ Ｔａｇ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）を用いて３０ＰＣＲサイクルにおける増幅のためにそのプライマー対と共に
混合した。ＰＣＲプライマーをｃＤＮＡ合成のために使用し、オリゴｄＴプライ
ムしたｃＤＮＡ合成により加えられる３'の偏りを回避した。各々のプライマー
を用いて分離合成を行うことにより、ｃＤＮＡ中の２つのプライマーの相対的配
向性を無作為化した。これらのｃＤＮＡを、ＰＣＲ増幅のために選択されたプラ
イマーとして同じ組み合せで混合し得る。ＰＣＲ増幅したｃＤＮＡフラグメント
をオートラジオグラフィーのために、６％アクリルアミドゲル上で分離し、そし
て乾燥した。少なくとも２つの腫瘍サンプルにおいて示差的提示されたこれらの
バンドを、切断し、そして再水和しそして親細胞におけるバンドではそれらを行
わなかった。この回収したＤＮＡのアリコート（１／５）を、同じプライマーセ
ットおよび同位体の添加無しである以外は、同じＰＣＲ条件を用いて、再増幅し
た。この第二のＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離し、個々のバンドをβ
アガラーゼ（ａｇａｒａｓｅ）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）とのインキュベーショ
ンにより回収した。回収した各々のＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１／
Ｚｅｏ（＋）ファージミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に平滑末端連結
によりクローンニングした。１つのバンドが１つより多い分子種を含み得ること
が可能であるので、適切なサイズの挿入物を有する、少なくとも４つの異なる形
質転換体を、さらなる特徴付けのために拾い上げる。ノーザン分析（ＲＮａｓｅ
保護アッセイおよび半定量的ＰＣＲ）を、示差的発現を確認するために行った。
【０１４９】 マウス腫瘍細胞株において、多くのより示差的に発現した遺伝子フラグメント
がＲＤＡによるよりもディファレンシャルディスプレイによって同定されるよう
であることを観察した。さらに、ＲＤＡフラグメントは、２、３時間だけ曝した
ノーザンブロット上で、陽性の結果を与える。対照的に、ディファレンシャルデ
ィスプレイにより同定されたフラグメントは、しばしば数日後でさえノーザンブ
ロットにおいてシグナルを与えない。この場合、示差的発現を、ＲＮａｓｅ保護
および配列特異的プライマーを用いる半定量的ＰＣＲにより確認した。これらの
観察は、理論上の予想と一致する。この予想は、少量のｃＤＮＡのハイブリダイ
ゼーションを駆動して完結させる困難さのために、このような配列はＲＤＡに基
づくハイブリダイゼーションによるよりも、ＰＣＲに基づくディファレンシャル
ディスプレイによって、より容易に同定されるということである。さらに、改変
したディファレンシャルディスプレイのより高い感度についての別の理由が存在
し得る。少量のｍＲＮＡ種は、より小さく、より安定で、そしてより大量のｍＲ
ＮＡ種のサイズの平均して２倍のサイズであることが報告された（Ｍｅｙｕｈａ
ｓおよびＰｅｒｒｙ、１９７９、Ｃｅｌｌ １６：１３９−１４８）。従って、
任意のプライマー対の両方のメンバーは、より多量に発現されたより短い（平均
２ｋｂ）ｍＲＮＡ種の２０％からよりも、細胞当たり非常に少数のコピーにより
表されるより長い（平均４．９ｋｂ）非常に多様なｍＲＮＡ種の８０％から示差
的に発現したｃＤＮＡにハイブリダイズし、そしてそのｃＤＮＡを検出するよう
である。
【０１５０】 予備実験において、示差的提示された３つのバンドの平均を、それぞれのプラ
イマー対について同定した。１２の独立したプライマーのすべての可能な組み合
わせから生じた総計６６のプライマー対を用いて、約２００の遺伝子フラグメン
トを同定し得た。いくつかの場合において、複数のフラグメントが、同じ遺伝子
に由来し得る。図７は、任意の十量体（ＭＲ＿１（ＴＡＣ ＡＣＣ ＧＡＧ Ｇ
）およびＭＲ＿５（ＧＧＡ ＣＣＡ ＡＧＴ Ｃ））の１つの対で観察されたデ
ィファレンシャルディスプレイフラグメントのパターンを示す。４つすべての腫
瘍に関連するが、親細胞に関連しない多くのバンドを同定し得る。この分布は、
腫瘍細胞の免疫原性に関連しない。なぜならば、４つの腫瘍の３つだけが免疫学
的に交差反応的であるからである。２、３時間だけ曝されたノーザンブロットで
ポジティブな結果を与えたＲＤＡにより同定される、示差的に発現されたバンド
と対照的に、ディファレンシャルディスプレイにより同定されたフラグメントは
、数日後でさえ、ノーザンブロットにおいてシグナルを与えなかった。しかし、
ディファレンシャルディスプレイフラグメントの示差的発現を、ＲＮａｓｅ保護
アッセイにより、または配列特異的プライマーを用いた半定量的ＰＣＲにより確
認し得る。図８に例を示し、これは、ディファレンシャルディスプレイバンド９
からのクローン９０を用いたＲＮａｓｅ保護アッセイの結果である。Ｇｅｎｅ
Ｂａｎｋデータベースの登録と十分な相同性を有しないこの配列は、親Ｂ／ｃ．
Ｎではなく、全ての４つの腫瘍株において発現された。
【０１５１】 上記で議論したように、本発明者らは、ＲＤＡおよびディファレンシャルディ
スプレイの結果におけるこの著しい相違を、ハイブリダイゼーションに基づくＲ
ＤＡ方法と比較すると、ＰＣＲに基づく改変したディファレンシャルディスプレ
イのより優れた感度に起因するとする。異なる腫瘍および正常細胞株における発
現のパターンに基づき、同系の腫瘍細胞を用いたマウスの直接的な免疫後に検出
した共有された腫瘍抗原は、より大量に発現したＩＡＰ遺伝子によりコードされ
得るようである。本実施例において記載される方法は、改変したディファレンシ
ャルディスプレイにより同定した、より少量に発現された遺伝子の産物が、可能
性のある潜在的な腫瘍抗原を表すか否かを決定するために用いられ得る。
【０１５２】 （９．５．潜在的な腫瘍免疫原をコードする全長ｃＤＮＡの選択） このセクションは、提示の差分析により、または改変したディファレンシャル
ディスプレイにより同定された、示差的に発現した遺伝子のフラグメントからの
、対応する全長ｃＤＮＡの選択を容易にするための方法を表す（図９）。一本鎖
のビオチン化したプローブを、単離したｃＤＮＡフラグメントから合成し、そし
てｃＤＮＡライブラリーからレスキューされた一本鎖サークルに対する溶液ハイ
ブリダイゼーションにより、相補的配列を含む、より長いｃＤＮＡファージミド
腫瘍を選択するために用いた。この方法は、特に、２つの任意のプライマーを利
用する改変したディファレンシャルディスプレイ方法により単離したＤＮＡフラ
グメントの使用に最適である。ディファレンシャルディスプレイにおける所定の
フラグメントのＰＣＲ増幅に用いた、この同じ任意のプライマーを修飾し、その
フラグメントから一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを産生し得る。これは
、目的の各々の新しいフラグメントのためのフラグメント特異的プライマーの新
しい対を配列決定、選択および合成することの必要性を回避する。
【０１５３】 ｉ）ディファレンシャルディスプレイにおいて利用するＰＣＲプライマーの対
の２つのオリゴヌクレオチドは、修飾される：（ビオチン−ｄＴ）−ｄＴ−（ビ
オチン−ｄＴ）を、１つのプライマーの５’末端に組み込み、そしてリン酸を第
二のプライマーの５’末端に組み込む。これらの改変したプライマーは、同じ非
修飾の任意のプライマーで本来のＰＣＲ増幅後に選択したディファレンシャルデ
ィスプレイフラグメントの２つの鎖に、ＰＣＲによって組み込む。この二本鎖Ｐ
ＣＲ産物から、５’リン酸で標識した鎖を、λエキソヌクレアーゼで消化し、一
本鎖ビオチン標識プローブを生じる。
【０１５４】 ｉｉ）一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡサークルを、ヘルパーウイルスとしてＭ１３Ｋ０
７パッケージング欠損ファージを用いて、ファージミドｃＤＮＡライブラリーか
らレスキューする。このライブラリーを、Ａｐａ Ｉ制限部位とＥｃｏ ＲＶ制
限部位との間で（ＡｐａＩ）オリゴ−ｄＴプライムされたｃＤＮＡのインサート
を有する、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ファージミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に構築する。高力価のｃＤＮＡライブラリーの
構築に必要な効率的な連結を達成するための重要な操作は、連結前にＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼで処理することにより、ｃＤＮＡインサートが５’リン酸化
されることを確実にすることである。ディファレンシャルディスプレイフラグメ
ントから生じたビオチン標識した一本鎖プローブを、ファージミドライブラリー
のｓｓＤＮＡサークルに溶液中でハイブリダイズした。次いで、ビオチン標識し
たハイブリダイゼーション複合体を、さらなる分析のために、ストレプトアビジ
ン磁気ビーズ上の無関係なｓｓＤＮＡから分離し得、そしてｓｓサークルを溶出
し得る（図９）。
【０１５５】 この濃縮方法の試験として、モデルプラスミド混合物を調製し、それは、１％
の特異的な任意に選択した組み換えクローンである３ｆ ＩＡＰを含む。ビオチ
ン化ｓｓプローブを、３ｆ ＲＤＡフラグメントから調製し、そしてその１％プ
ラスミド混合物から一本鎖ファージミドサークルを選択するために用いた。スト
レプトアビジンビーズから溶出した後、一本鎖サークルを、細菌の形質転換前に
第二のプラスミド鎖の合成をプライムするために配列特異的オリゴヌクレオチド
にハイブリダイズした。プラスミドＤＮＡを、形質転換した６３のコロニーから
調製した。６３のこれらのプラスミド調製物のうち６３が、標的３Ｆ ＩＡＰ挿
入を発現した。従って、この方法は非常に効率的であるようである。
【０１５６】 この同じ方法は、以前には同定されていない、非免疫原性の親細胞におけるよ
りも約１０倍増の濃度で４つ全てのマウスの腫瘍において発現する、配列を表す
ディファレンシャルディスプレイフラグメント（Ｂ４）の、よりストリンジェン
トな場合において同様の効率で作用するようである。２００ｂｐのＢ４ＤＮＡフ
ラグメントを有する一本鎖サークルの選択後、無作為に取り出された５つの形質
転換体のうちの５つは、配列特異的プライマーを用いたＰＣＲにより、ポジティ
ブなより長い挿入を有した。従って、この方法は、非常に効率的のようである。
【０１５７】 （１０．実施例：非腫瘍形成性の、不死化した細胞株由来の独立ヒト腫瘍細胞
株） 以下の実施例は、異なる発癌物質または、同じクローン化した、非腫瘍形成性
の親細胞株からの癌遺伝子形質転換により、独立的に由来するヒト腫瘍のセット
を記載する。マウスの腫瘍において示差的に発現した遺伝子産物の同定のための
、ＲＤＡおよび改変したディファレンシャルディスプレイの使用の、先の実施例
におけるように、関連する正常および腫瘍細胞株の有効性は、潜在的な癌ワクチ
ンの分子および免疫学的分析の重要な利点を有する。これは、容易に入手可能な
正常なコントロール細胞源およびＲＮＡ源を供給するだけでなく、発癌物質に依
存しない分子の特徴に集中することを可能にする。なぜならば、それらは複数の
独立した腫瘍により共有され、インビトロでの増殖中の無作為な遺伝的ドリフト
（ｄｒｉｆｔ）の産物ではないようであるからである。
【０１５８】 ヒト尿路上皮腫瘍のセットは、ヌードマウスにおいて、ＳＶ４０不死化ヒト尿
路上皮細胞株であるＳＶ−ＨＵＣ（それ自体を接触阻止し、足場依存性であり、
そして非腫瘍形成性）から、Ｄｒ．Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆの
研究室（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ大学、Ｍａｄｉｓｏｎ）で誘導された（Ｃｈｒｉｓ
ｔｉａｎら、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：６０６６−６０７３）。
一連の独立腫瘍細胞株を、ｒａｓ形質転換（Ｐｒａｔｔら、１９９２、Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．５２：６８８−６９５）または膀胱特異的であるいくつかを含む
異なる発癌物質を用いるＳＶ−ＨＵＳのインビトロ変異誘発（Ｂｏｏｋｌａｎｄ
ら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１６０６−１６１４）のいずれか
により、誘導した。形質転換した細胞を、初めに、変更したインビトロ成長要求
に基づいて選択し、そして各々の細胞は、ヌードマウスにおいて腫瘍形成性を示
した。これらの腫瘍のサブセットの移行上皮癌の表現型を保持するものを選択す
る。表７は、インビトロでこれらの５つの腫瘍株を誘導するために利用した親細
胞および発癌物質を列挙する。系統的なプログラムを、１）これらの腫瘍におい
て示差的に発現された全長ｃＤＮＡを同定するため、および２）ワクシニアウイ
ルス発現ベクター中にクローン化されたこれらのｃＤＮＡ産物のＨＬＡおよびヒ
トＣＤ８トランスジェニックマウスにおける免疫原性を試験した。
【０１５９】
【表７】 代表的な差分析および改変したディファレンシャルディスプレイ実験の両方を
適用して、親ＳＶ−ＨＵＣと比較してＭＣ ｐｐＴ１１−Ａ３腫瘍（ｐｐＴ１１
Ａ３）において、示差的に発現した遺伝子フラグメントを同定する。全ての示差
的発現したフラグメントを、他の腫瘍細胞株のｍＲＮＡにおける並行発現のため
に、ノーザン分析およびＲＮａｓｅ保護アッセイにより試験した。腫瘍細胞株由
来の５つのＳＶ−ＨＵＣのうちの少なくとも３つにおいて発現したＤＮＡクロー
ンのみを、さらなる特徴付けのために選択する。
【０１６０】 腫瘍特異的遺伝子産物の同様の分析を、代表的な他のヒト組織のＳＶ４０ラー
ジＴまたはＨＰＶ Ｅ６もしくはＨＰＶ Ｅ７不死化細胞株に由来する腫瘍を用
いて行い得る。公開された実施例は、前立腺上皮（Ｐａｒｄａら、１９９３、Ｔ
ｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２３：９１−９８）、哺乳動物上皮（Ｂａｎｄら、１
９９０、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：７３５１−７３−５７）、および気管支
上皮（Ｇｅｒｗｉｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８９：２７５９−２７６３；Ｋｌｅｉｎ−Ｓｚａｎｔｏら、１９９２、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６６９３−６６９７）を
含む。
【０１６１】 （１１．実施例：新鮮な患者の膀胱腫瘍における遺伝子発現） 示差的に発現する遺伝子の同定のための上記の方法は、腫瘍および正常なコン
トロール細胞ｍＲＮＡの両方が容易に入手可能であることを要求する。前述のセ
クションは、不死化細胞株からインビトロで誘導された腫瘍に集中し、そこから
、ｍＲＮＡを容易に大量に入手し得る。
【０１６２】 ｍＲＮＡを容易に入手し得る、インビトロで誘導された腫瘍を用いて働く利点
にも関わらず、いくつかの形質転換が関連する遺伝子発現が失敗し得るか、また
は逆に、検出されるいくつかの示差的遺伝子発現が関連する形質転換でないかも
しれない可能性に注意を向ける必要がある。正常なコントロールは接触阻止的、
足場依存的および非腫瘍形成性であるにも関わらず、インビトロにおける連続し
た成長のための基礎であるいくつかの前腫瘍性の事象を経験したようである。恐
らく、より大きな関心は、インビトロ増殖に関連する外来性遺伝子発現を同定し
得ることである。そのような事象を除外するための２つの方法を利用する。第一
に、５つの膀胱腫瘍株のうちの少なくとも３つにおいて発現するが、インビトロ
で順応した親細胞において発現されない遺伝子を分析した。このことは、ａ）そ
れがこの正常な親細胞により共有されるので、インビトロの成長により選択され
る任意の系統的な遺伝子発現が徐々に知られ得、そしてｂ）それらは多様な発癌
物質（または癌遺伝子形質転換）により誘導される複数の独立した腫瘍により共
有されることが期待されないので、発癌物質特異的であるか、またはインビトロ
での増殖中の無作為の遺伝的ドリフトの結果として生じ得る遺伝子発現における
任意の変化を同定する。第二に、そして最も重要である、新鮮な患者の腫瘍物質
の複数サンプルにおいて発現することもまた示し得る、これらの示差的発現した
遺伝子のみを、さらなる特徴付けのために選択する。
【０１６３】 患者の腫瘍物質を、正常な膀胱上皮と一緒に手術後凍結保存する。ほかのいく
つかの癌と比較して、正常な組織コントロールは膀胱癌患者から容易に入手可能
である。全ＲＮＡを酸グアニジニウムイソシアネート方法（ＬｅｅおよびＣｏｓ
ｔｌｏｗ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：
６３３−６４８）により冷凍サンプルから抽出する。ＤＮａｓｅ Ｉ処理後、ポ
リＡ ｍＲＮＡをオリゴｄＴビーズ上に分画し、そして遺伝子発現をノーザンブ
ロット、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、および半定量的ＲＴ／ＰＣＲにより分析した
。インビトロの腫瘍株において同定した各々の示差的発現した遺伝子フラグメン
トについて、遺伝子の発現を、２０患者の腫瘍および正常な組織コントロールの
パネルにおいて特徴付ける。このサンプルサイズは、遺伝子を発現する患者の比
率の０．１１％以下の標準誤差（ＳＥ＝ｓｑｒｔ［ｐ＊（１−ｐ）／ｎ］、ここ
で、ｐ＝真の比率、そしてｎ＝サンプルサイズである。ｐ＝０．５、集団（１０
／２０患者）の比率において、ＳＥは最大であり、ＳＥ＝±０．１１であり；任
意の他のｐの値については、ＳＥはより小さい）で遺伝子を発現することを可能
にする。これらの遺伝子のいくつかの発現は、異なる腫瘍サンプル中に相関し得
る。このことは、異なるヒトＭＨＣ分子と関連し得る複数のＴ細胞エピトープの
可能性を引き起こすので、有用である。
【０１６４】 正常な他の成体および胎仔組織において、正常な膀胱上皮に対して、膀胱腫瘍
において示差的発現される任意の遺伝子の発現パターンをもまた決定する。３０
を超える異なる正常なヒト成体または胎仔組織から調製される、全ＲＮＡまたは
第一鎖のｃＤＮＡ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＬｉｎｅTM ＲＮＡおよびＧｅｎｅ
ＰｏｏｌTM ｃＤＮＡ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を
使用する。正常な成体組織ではなく、胎仔における発現は特に興味深く、そして
免疫治療薬剤としての考慮を排除しない。中程度の量の種の発現を、ノーザン分
析により決定する。少量の種を、ＲＮａｓｅ保護アッセイおよび半定量的ＰＣＲ
により定量する。複数の患者由来の腫瘍において周期的に発現し、そして正常な
組織においては最も低く関連した発現を有する、これらの配列は、潜在的な腫瘍
特異的抗原として、さらなる特徴付けのために選択した。
【０１６５】 （１２．実施例：示差的発現し、オーセンティックな腫瘍と交差反応的なＣＴ
Ｌを生じる発現した遺伝子産物の使用） 腫瘍免疫治療のための候補であり得る、示差的発現する遺伝子産物を同定する
ために、ヒトＨＬＡと関連するペプチドに対するＴ細胞応答が誘導され得る環境
における免疫のための産物を送達する手段を有することが必要である。次いで、
免疫原性産物により誘導されるＴ細胞を、対応するｍＲＮＡを発現するＨＬＡ適
合腫瘍上での交差反応性について試験し得る。この実施例は、ヒトＨＬＡと関連
するペプチドに対するＴ細胞応答の誘導のためのＨＬＡおよびヒトＣＤ８トラン
スジェニックマウスの使用を記載する。全てのこれらの条件が、１）この遺伝子
が複数のヒト腫瘍において示差的発現するが正常な組織対応物ではない、２）遺
伝子産物がＨＬＡと関連して免疫原性である、および３）誘導された特異的Ｔ細
胞が、ヒト腫瘍細胞で交差反応的である場合と一致する場合、これは、臨床的ワ
クチンの試験の開始の準備的である重要な予備的データを構成する。
【０１６６】 示差的発現した遺伝子産物が免疫原性であるか否かを決定するために、３つの
（ＨＬＡ−Ａ２．１ × ｈｕＣＤ８）Ｆ1トランスジェニックマウスの群を、
５×１０8ｐｆｕの各々特異的組み換えワクシニアウイルス（Ｂｅｎｎｉｎｋお
よびＹｅｗｄｅｌｌ、１９９０、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１５３−１７８）で、静脈内
に免疫化した。少なくとも２週間後、マウスを屠殺し、ＣＤ８＋脾臓Ｔ細胞を、
抗ＣＤ８でコートした磁気ビーズ上で濃縮した。ＣＤ８＋細胞溶解性前駆体を、
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）プラスミド発現ベクター（セクション９・３）
において以前に単離した示差的発現する組換え遺伝子を用いてトランスフェクト
した親ＳＶ−ＨＵＣ細胞でインビトロで再刺激する。インビトロの再刺激のため
のワクシニアベクターの代わりのプラスミド組換え体での置換は、ラージワクシ
ニアベクター特異的応答を回避するために必要である。インビトロ培養５日後、
細胞溶解活性を、特異的組換えプラスミドまたはコントロール卵白アルブミン遺
伝子組換え体のいずれかでトランスフェクトしたＳＶ−ＨＵＣ標的細胞からの51 Ｃｒの放出により定量する。
【０１６７】 この同じ細胞溶解性アッセイを、関連するＣＴＬエピトープもまた対応するｍ
ＲＮＡを発現するＨＬＡ適合腫瘍細胞により提示されるか否かを決定するために
容易に適用し得る。Ｔ細胞が（ＨＬＡ−Ａ２．１ × ｈｕＣＤ８）Ｆ1トラン
スジェニックマウスにおいて誘導される場合、ＨＬＡ適合標的は、天然のＨＬＡ
−Ａ２．１を発現するか、またはＨＬＡ−Ａ２．１を用いてトランスフェクトし
たいずれかの腫瘍細胞を含む。示差的発現する遺伝子産物の免疫原性を確立し、
そしてヒト腫瘍細胞との交差反応が存在するか否かを決定する。この知見は、同
じｍＲＮＡが正常な組織ではなく、新鮮な患者の腫瘍の複数のサンプルにおいて
発現されることの実証（セクション１１）と共に、臨床的なワクチン試験の開始
の前に必要とされる。
【０１６８】 ワクチン開発のための重要な考慮は、ヒトクラスＩ ＨＬＡの広範な多型であ
る。上記で議論したように、魅力的なストラテジーは、４つの主要なＨＬＡサブ
タイプ（民族的集団を超えた広範囲を提供する、Ａ２、Ａ３、Ｂ７およびＢ４４
）を標的化することである。多くのペプチドが単一のサブタイプの複数のメンバ
ーに結合する。いくつかのＣＴＬエピトープを各々のサブタイプについて同定す
る場合、これは、広く効果的なワクチンの処方を非常に容易にし得る。
【０１６９】 （１３．実施例：防御免疫の誘導） 特に、低い存在量のｍＲＮＡによってコードされる、潜在的腫瘍抗原の場合に
おいては、示差的に発現された遺伝子産物に対するＴ細胞の応答が、防御腫瘍免
疫を与えるか否かを決定することが望ましい。多くの示差的に発現された遺伝子
が、上記のマウス腫瘍モデルにおいて同定されているため、このような実験を、
マウスにおいて行う。
【０１７０】 ４つのうち３つの独立的に誘導された腫瘍が、免疫学的に交差反応性であるこ
とが、このマウス腫瘍モデルについて、以前に報告されている（Ｓａｈａｓｒａ
ｂｕｄｈｅら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５１：６３０２−６３
１０）。これらの腫瘍において同定された、示差的に提示されたバンドの多くは
、対照的に、すべての４つの腫瘍において存在する。従って、これらのフラグメ
ントを誘導する遺伝子が、これらの腫瘍を接種された動物においては、免疫学的
に優性ではなさそうである。
【０１７１】 示差的に遺伝子を発現した組み換え体を用いた直接的な免疫化が、それにもか
かわらず、防御免疫を与えることを示す場合は、これは、潜在的腫瘍抗原を用い
たワクチン接種の有効性の強制的な証拠を提供する。
【０１７２】 マウス腫瘍に対して同系のＢＡＬＢ／ｃ系統の５匹のマウスの群を、全長のｃ
ＤＮＡ（すべての４つのマウス腫瘍株において示差的に発現されるが、親のＢ／
ｃ．Ｎ細胞では発現されない）についての各々のワクシニアウイルス組み換え体
を用いて免疫化する（図７）。マウスの各々の群を、１×１０6ＢＣＡ３９の腫
瘍細胞の腫瘍形成性接種物を用いてチャレンジすることにより、防御免疫の誘導
についてのアッセイを行う（Ｓａｈａｓｒａｂｕｄｈｅら、１９９３、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ １５１：６３０２−６３１０）。防御免疫が相対的な量的発
現に相関するか否かを決定するために、独立した遺伝子産物を試験するが、これ
は半定量的なＰＣＲによって決定されるように、示差的な発現の異なるレベルを
表す。
【０１７３】 （１４．実施例：ワクチンの使用のためのワクシニア発現ベクターの構築およ
び特徴付け） 本実施例は、直接連結ベクターの新規のセット（キメラのワクシニアゲノムの
産生について広く適用可能であるように設計された）の構築および特徴付けを記
載する。この目的は、より広く有用である直接連結ベクターを獲得するために、
ｖＮｏｔＩ／ｔｋのゲノムを改変することであった。第一に、挿入部位を、チミ
ジンキナーゼ遺伝子の最初に、２つの固有の制限酵素のための部位を置くことに
よって変化させた。これにより、挿入ＤＮＡの配向を固定し、そしてウイルスア
ームの再連結後の、夾雑する野生型ゲノムの産物を排除することが可能になる。
第二に、高レベルのタンパク質を発現する直接連結ベクターを産生するために、
チミジンキナーゼ遺伝子の前に、強力な構成的ワクシニアウイルスプロモーター
を配置した。
【０１７４】 これらの新規の連結ベクターは、ポックスウイルスアームの再連結を排除する
ため、および挿入ＤＮＡの配向を、強力に発現する構成的ワクシニアプロモータ
ーの後で固定するために、一対の固有の制限部位（ＮｏｔＩおよびＡｐａＩ）を
含む。挿入カセットは、組み換え体の単離において薬物選択を利用するために、
ワクシニアのチミジンキナーゼ遺伝子の最初に置かれている。
【０１７５】 （１４．１． 材料および方法） （１４．１．１． プラスミド構築） アニーリングすると、オリゴヌクレオチドのペアが構築され、これは、７．５
ｋ遺伝子プロモーター、
【０１７６】
【化１】 ならびに、ＮｏｔＩおよびＡｐａＩの制限部位を含んだ。二本鎖オリゴヌクレオ
チドを、２時間にわたる９４℃から２０℃の勾配によってアニーリングし、そし
て、ｐＪＮｏｔＩ／ｔｋ中に存在するＮｏｔＩ部位、ｖＮｏｔＩ／ｔｋ由来のＨ
ｉｎｄＩＩＩ Ｊフラグメントを含むプラスミドに連結し、プラスミドｐ７．５
／ｔｋおよびプラスミドｐＥＬ／ｔｋを得た。
【０１７７】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、ｐＢＩ２２１（β−グルクロニダーゼ（
β−ｇｌｕ）をコードするＥ．ｃｏｌｉ ｇｕｓＡ遺伝子を含むプラスミド）に
対して、以下のプライマー
【０１７８】
【化２】 を用いて行い、そして得られたフラグメントを、ｐＣＲＩＩにクローニングした
（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。このプラスミドを、Ｎｏ
ｔＩ（ＭＭ４４０／ＭＭ４４２産物）を用いて切り出し、そしてＮｏｔＩを用い
て消化されたｐＪＮｏｔ／ｔｋにクローニングして、ｐＪＮｏｔ／ｔｋ−ＧＵＳ
を生成するか、またはＮｏｔＩおよびＡｐａＩ（ＭＭ４４０／ＭＭ４４１産物）
を用いて切り出し、そしてＡｐａＩおよびＮｏｔＩを用いて以前に消化されたｐ
ＥＬ／ｔｋおよびｐ７．５／ｔｋに挿入して、ｐ７．５／ｔｋ−ＧＵＳおよびｐ
ＥＬ／ｔｋ−ＧＵＳを生成した。
【０１７９】 アニーリングすると、オリゴヌクレオチドのペアが構築され、これは、７．５
ｋ遺伝子プロモーター、およびオボアルブミン（１１）に対する細胞障害性Ｔ細
胞エピトープをコードするヌクレオチド配列を含んだ：
【０１８０】
【化３】 二本鎖オリゴヌクレオチドを、２時間にわたる９４℃から２０℃の勾配によっ
てアニーリングし、そして、ｐＪＮｏｔＩ／ｔｋ中に存在するＮｏｔＩ部位、ｖ
ＮｏｔＩ／ｔｋ由来のＨｉｎｄＩＩＩ Ｊフラグメントを含むプラスミドに連結
し、プラスミドｐ７．５／ｔｋ−ｏｖａおよびプラスミドｐＥＬ／ｔｋ−ｏｖａ
を得た。
【０１８１】 （１４．１．２． 組み換えウイルスの産生） 細胞およびウイルスを、Ｅａｒｌら（１９９１、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ．Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮｅｗＹｏｒｋ）によって記載される通り、維持
および操作した。組み換えウイルスを、ＣＶ−１細胞を０．０５の感染多重度（
ｍｏｉ）で感染させ、そして２時間後に、ＤＮＡを、リポフェクタミン（Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いて、製造業
者によって提案される通りに、感染した細胞にトランスフェクトすることによる
相同組み換えを用いて作製された。７２時間後、細胞を収集し、そして単離され
たプラークを、ブロモデオキシウリジンの存在下で、Ｈｕｔｋ-細胞（Ｅａｒｌ
ら、１９９１、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ）、またはＨＡＴを補充された培地（Ｗｅｉｒら、１９８２、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９：１２１０−１２１４）に継代
することによって選択した。
【０１８２】 ワクシニアウイルスを、鶏痘ウイルスを用いたレスキューによりウイルスＤＮ
Ａから産生した（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９９７７−９９８１）。ワクシニアウイル
スを、ショ糖中でのバンド形成および沈降によって、感染されたＨｅＬａ細胞か
ら単離した（Ｅａｒｌら、１９９１、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅ
ｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒ
ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。精製されたウイルス粒子を、プロテイナ
ーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて処理し、そして０
．３Ｍ酢酸ナトリウム中の２．５容エタノールを用いた沈殿の前に、飽和フェノ
ール緩衝液、フェノール：クロロホルム（５０：５０）緩衝液、およびクロロホ
ルム緩衝液を用いて徐々に抽出し、そしてＴＥ（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐ
Ｈ８．０ １ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した（Ｅａｒｌら、１９９１、Ａｕｓｕ
ｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。１２ウ
ェル皿由来のＢＳＣ−１細胞のコンフルエントなウェルを、鶏痘ウイルスを用い
て感染し、そして３７℃での２時間のインキュベーションの後、リポフェクタミ
ン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用い
て０．６μｇの全長のワクシニアＤＮＡでトランスフェクトした（製造業者によ
って提案される通りに）。２４、４８および７２時間後に、細胞を収集し、３回
の凍結融解サイクルによって溶解し、そしてＢＳＣ−１細胞におけるプラークア
ッセイによって、スクリーニングした（Ｅａｒｌら、１９９１、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ。Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ
／Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【０１８３】 （１４．１．３． 直接連結による組み換えウイルスの産生） １．１ｋＢのＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ制限エンドヌクレアーゼフラグメント（
ｐＨｂｅｔａ−Ｏｖａ−ｎｅｏ由来のオボアルブミンを含む）（Ｐｕｌａｓｋｉ
ら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３６６
９−３６７４）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
のＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ部位に挿入し、ｐＢＳ．ｏｖａを産生した。ｐＢ
Ｓ．ｏｖａにおいて、プライマー
【０１８４】
【化４】 を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）由来のＤＮＡ産物を、ＡｐａＩおよび
ＮｏｔＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて消化し、
製造業者の推奨に従って、β Ａｇａｒａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて低融点のアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）から、ゲル
精製し、そしてＮｏｔＩおよびＡｐａＩを用いて消化されているｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＫＳ＋にクローニングし、ｐＢＳ．ＶＶｏｖａを産生した。オボアル
ブミンをコードするＤＮＡフラグメントを、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩを用いたこ
のプラスミドの消化により、ｐＢＳ．ＶＶｏｖａから切り出し、そしてβ Ａｇ
ａｒａｓｅを用いた低融点アガロースゲルに通した電気泳動の後に、精製した。
１μｇの精製ｖＥＬ／ｔｋ ＤＮＡを、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し
、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１００濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）に通して遠心し、小
さな介在フラグメントを取り除いた。ｖＥＬ／ｔｋ ＤＮＡアームおよびオボア
ルブミンをコードするＤＮＡフラグメントを、５ユニットのＴ４ ＤＮＡリガー
ゼを含有する３０μｌ中において、４：１（挿入物：ウイルス）モル比で、室温
で一晩連結した。連結産物を、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、１２ウェルプレート由来のコンフルエントなＢ
ＳＣ−１細胞のウェルへ、感染から２時間後に１細胞あたり１ｐｆｕで、鶏痘ウ
イルスを用いてトランスフェクトした。３日後、細胞を収集し、そして単離され
たプラークを、ブロモデオキシウリジンの存在下で、Ｈｕｔｋ−細胞に継代する
ことによって選択した（Ｅａｒｌら、１９９１、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
．Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【０１８５】 （１４．１．４． ウイルスＤＮＡゲノムの分析） ＢＳＣ−１細胞を、高感染多重度（ｍｏｉ）で、ワクシニアＷＲ、ｖＥＬ／ｔ
ｋ、ｖ７．５／ｔｋまたはｖＮｏｔＩ／ｔｋによって感染した。２４時間後、細
胞を収集し、そしてＣｅｌｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｌｕｇ Ｋｉｔ）に、１ｍｌあたり１×１
０7個の細胞の割合で、再懸濁した。５０℃で予めインキュベートした等量の２
％ＣｌｅａｎＣｕｔアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加し、そして細胞懸濁液
を１００μｌのプラグへ形成した。４℃で硬化した後、タンパク質を消化するた
めに、以前に記載した通りにプラグを処理した（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１
９８９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１５９５−１６０３）。電気泳動の前に、プラ
グを適切な制限酵素緩衝液および１ｍＭ ＰＭＳＦ中で、室温で１６時間平衡化
し、制限酵素緩衝液、１００ｎｇ／ｍｌウシ血清アルブミンおよび５０ユニット
のＮｏｔＩまたはＡｐａＩとともに、３７℃（ＮｏｔＩ）または室温（ＡｐａＩ
）で２時間インキュベートした。
【０１８６】 ＢＳＣ−１の６ウェル皿の１つのウェルを、ｖ７．５／ｔｋまたはｖＥＬ／ｔ
ｋを用いて、高感染多重度（ｍｏｉ）で感染し、そして４８時間後に細胞を収集
し、低速遠心によりペレット化し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて
リンスし、そしてＤＮＡを、ＤＮＡｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて単離した。最
終ＤＮＡ産物を、５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０ １
ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、そして２．５μｌを、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＡｐａＩ、または、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し
、１．０％アガロースゲルに通して電気泳動し、そしてＴｕｒｂｏｂｌｏｔｔｅ
ｒ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）を用いてＮｙｔｒａｎ（
Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）へ転写した。サンプルを、ｐ
７．５／ｔｋ（図１１ａ）またはｐＥＬ／ｔｋ（図１１ｂ）を用いてプローブし
、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ）を用いて、ＱｕｉｃｋＨｙｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で32Ｐで標識
化し、そしてＫｏｄａｋ ＸＡＲフィルム上で可視化した。
【０１８７】 ＢＳＣ−１細胞の６ウェル皿の１つのウェルを、ｖ７．５／ｔｋ、ｖＥＬ／ｔ
ｋ、ｖＮｏｔＩ／ｔｋ、ｖｐＮｏｔＩ、ｖＮｏｔＩ／ｌａｃＺ／ｔｋまたは野生
型ワクシニアＷＲを用いて、高感染多重度（ｍｏｉ）で感染させ、そして４８時
間後に細胞を収集し、低速遠心によりペレット化し、リン酸緩衝化生理食塩水（
ＰＢＳ）を用いてリンスし、そしてＤＮＡを、ＤＮＡｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を用
いて単離した。最終ＤＮＡ産物を、５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ
、ｐＨ８．０ １ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、そしてプライマー
【０１８８】
【化５】 を用いて、ＰＣＲ（３０サイクル、１分間９４℃、２分間５５℃、３分間７２℃
、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−１００）に用いた。ヌクレオチド配列を、
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、35Ｓ配列決定により決定し、そして８％
変性ポリアクリルアミドゲルに通した電気泳動後、Ｂｉｏ−Ｍａｘフィルム（Ｋ
ｏｄａｋ）への露光により、可視化した。
【０１８９】 （１４．１．５． β−グルクロニダーゼ活性の測定） １２ウェルプレート由来のＢＳＣ−１細胞のウェルを、ｖＮｏｔＩ／ｔｋ−Ｇ
ＵＳ、ｖ７．５／ｔｋ−ＧＵＳおよびｖＥＬ／ｔｋ−ＧＵＳを用いて、１のｍｏ
ｉで感染し、感染から２０時間後に細胞を収集し、０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁
し、そして３サイクルの凍結融解により破砕した。抽出物を、ショートマイクロ
フュージスピン（ｓｈｏｒｔ ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ｓｐｉｎ）（１分間、１４
，０００ｒｐｍ）により清澄化し、そして上清を、Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２、Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに記載される通り、９６ウェルプレートに適合させる
ようにβ−ｇｌｕユニットについて分析した。Ａ405値をマイクロプレートリー
ダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ３０００）上で測定し、そしてβ−ｇｌｕ活性を
、同じアッセイにおいて分析されたβ−ｇｌｕ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）標準との比
較により測定した。
【０１９０】 （１４．１．６． 細胞障害性（ｃｙｔｏｘｉｃ）Ｔ細胞応答の分析） ６ウェルプレートのウェル中におけるＭＣ５７Ｇ細胞のコンフルエントな単層
を、１のｍｏｉで、ｖＥＬ／ｔｋ、ｖ７．５／ｔｋ−ｏｖａ、ｖＥＬ／ｔｋ−ｏ
ｖａ、ｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａＦＬクローン１およびｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａＦＬク
ローン２（ｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａＦＬは、直接連結によって生成された全長オボ
アルブミンのウイルスクローンである）を用いて感染した。感染から１６時間後
、細胞を収集し、１００μＣｉの51Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（Ｄｕｐｏｎｔ）を用いて
、３７℃で１時間標識し、そして１０4個の細胞を４つ組の９６ウェルの丸底プ
レートのウェルに添加した。１μＭの精製ｏｖａ２５７−２６４ペプチドを用い
てインキュベートした非感染ＭＣ５７Ｇ細胞のサンプルもまた、ポジティブコン
トロールとして51Ｃｒとともにインキュベートし、そしてネガティブコントロー
ルとして非処理ＭＣ５７Ｇ細胞を用いた。ｏｖａ２５７−２６４に対して特異的
なＴ細胞を、２：１および１０：１の割合で、標的細胞に添加した。細胞を、３
７℃で４時間インキュベートし、上清を収集し、そして51Ｃｒ放出を測定した。
自発的な放出は、培地のみとの標的細胞のインキュベートにより誘導され、そし
て最高の放出は、５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００との標的細胞のインキュベート
により測定した。特異的な溶解の割合は、式：％特異的溶解＝（（実験的放出−
自発的放出）／（最高放出−自発的放出））×１００を用いて算出した。各々の
場合において、４つ組ウェルの平均を、上記の式において用いた。
【０１９１】 （１４．２． 結果） （１４．２．１． 直接連結ベクターの構築） ワクシニアＷＲゲノムは、長さが約１９０キロベースであり、そしてＡ残基お
よびＴ残基に富む。ワクシニアＷＲゲノムの完全な配列は、Ｂｅｒｎａｒｄ Ｍ
ｏｓｓ研究所（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、
ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＰ．Ｅａｒｌによって提供さ
れた。ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＩＢＩ）を用いたワクシニアＷＲゲノムの完全な配
列の制限酵素検索は、ＡｐａＩ、ＡｓｃＩ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、ＦｓｅＩ、Ｒｓｒ
ＩＩ、ＳｆｉＩ、ＳｒｆＩおよびＳｇｆＩについての制限部位の欠如を明らかに
した。酵素の高度に活性かつ純粋な調製ならびに消化における付着末端の産生の
容易な有用性のおかげで、ｖＮｏｔ／ｔｋ中にすでに存在するＮｏｔＩ部位と組
み合わせて、第２の部位としてＡｐａＩを用いることを選択した。
【０１９２】 ワクシニアウイルスを基にした発現ベクターは、外来タンパク質を構成的に発
現する場合に、最も有用である。ウイルス複製の初期の間の外来タンパク質の発
現は、細胞障害性Ｔ細胞応答に不可欠であり（Ｂｅｎｎｉｃｋら、１９９０、Ｔ
ｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１５３−１８４）
、そして高レベルの総タンパク質発現が、ウイルス複製の後期の間に活性なプロ
モーターを用いて観察されている。本発明者らは、構成的に発現された７．５ｋ
遺伝子に対応するプロモーター（Ｍａｃｋｅｔｔら、１９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ、４９：８５７−８６４）、および構成的に発現された合成プロモーター
ＥＬ（高レベルの発現で際立つ）を組み込むことを決定した。
【０１９３】 任意の新規なベクターにおいて保持されねばならないｖＮｏｔＩ／ｔｋの有用
な特徴は、活性チミジンキナーゼ遺伝子に対する選択を用いた、組み換えウイル
スゲノムについて識別する能力である。ｔｋ遺伝子についてのコード配列内への
ＡｐａＩ部位の導入は、制限酵素部位を適応させるために、アミノ酸の総数にお
ける増加を必要とする。種々の動物およびウイルス種由来のチミジンキナーゼ遺
伝子についてのアミノ酸配列の比較は、最大の不均質な領域が、タンパク質のＮ
末端であったことを示し、タンパク質のこの領域が、アミノ酸の数におけるあま
り多くない増加を許容し得たことを示唆した。
【０１９４】 組み換え非依存性クローニングベクターを、改変チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺
伝子を含むプラスミド中間体の作製、およびｖＮｏｔＩ／ｔｋゲノムにおけるｔ
ｋ配列の相同組み換えによる置換によって、構築した。アニーリングすると、２
つのセットのオリゴヌクレオチドペアが構築され、これは、７．５ｋ遺伝子につ
いてのプロモーターまたは合成ＥＬ配列、ならびにＮｏｔＩおよびＡｐａＩにつ
いての制限部位を含んだ。改変チミジンキナーゼ遺伝子を、二本鎖オリゴヌクレ
オチドのアニーリング、およびｐＪＮｏｔＩ／ｔｋ（ｖＮｏｔＩ／ｔｋ由来のＨ
ｉｎｄＩＩＩ Ｊフラグメントを含むプラスミド）におけるチミジンキナーゼ遺
伝子の最初に存在するＮｏｔＩ部位への産物の連結によって構築した。オリゴヌ
クレオチドペアは、ｐＪＮｏｔＩ／ｔｋにおけるＮｏｔＩ部位へ連結され、そし
てこの部位を排除して、新規のＮｏｔＩ部位、近接して続くプロモーターの後の
ＡｐａＩ部位を産生し、そしてチミジンキナーゼ遺伝子における最初のメチオニ
ンをコードするヌクレオチドに隣接させ、プラスミドｐ７．５／ｔｋおよびｐＥ
Ｌ／ｔｋとを得る（図１）。ＡｐａＩ部位の獲得を、プラスミドＤＮＡの制限酵
素分析によって確認し、そしてチミジンキナーゼ遺伝子プロモーターのヌクレオ
チド配列を決定し、そして図１に示される通りに見出した。
【０１９５】 ｐ７．５／ｔｋおよびｐＥＬ／ｔｋに由来する組み換えウイルスは、ＨＡＴ（
ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）の存在下におけるポジティブ薬物
選択に頼る戦略を用いて、単離された（Ｗｅｉｒら、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：１２１０−１２１４）。ウイルスｖｐＮ
ｏｔＩ、すなわちｖＮｏｔＩ／ｔｋのＮｏｔＩ部位で挿入されたｐＢＲ３２２の
コピーを含むウイルス（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ １９０：５２２−５２６）、およびｖＮｏｔＩ／ｌａｃＺ／ｔｋ、すなわち
ｖＮｏｔＩ-におけるチミジンキナーゼを遮断するｌａｃＺ遺伝子のコピーを有
するウイルス（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９
０：５２２−５２６）は、ｔｋ遺伝子の最初の挿入ＤＮＡ以外はｖＮｏｔＩ／ｔ
ｋと同一な、チミジンキナーゼネガティブ（ｔｋ-）ウイルスである。プラスミ
ドｐ７．５／ｔｋおよびｐＥＬ／ｔｋは、ＣＶ−１細胞におけるｖｐＮｏｔＩお
よびｖＮｏｔＩ／ｌａｃＺ／ｔｋヘルパーウイルスと組み換わり、そして感染さ
れた単層を収集およびＨｕｔｋ-細胞に対してＨＡＴ培地の存在下で継代した。
個々のプラークを、増大および分析の前に、Ｈｕｔｋ-細胞に対して、さらに３
回継代および単離した。
【０１９６】 （１４．２．２． ウイルスゲノムの構造の分析） ＨＡＴを補充された培地におけるｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋウイルス
の増殖は、ｖｐＮｏｔおよびｖＮｏｔ／ｌａｃＺ／ｔｋと対照的に、これらのウ
イルスが、活性チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含むことを暗示する。しかし
、活性ｔｋ遺伝子は、７．５ｋまたはＥＬプロモーター配列を欠失する多種多様
な交差（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）から生じ得、正常なｔｋプロモーターを有するウ
イルスを産生した。ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋゲノムは、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ Ｊフラグメント内に、ＮｏｔＩおよびＡｐａＩの両方についての固有の部位
を含むはずである。単離されたウイルスストックのゲノム構造を、ＮｏｔＩまた
はＡｐａＩを用いた、ウイルス感染細胞由来のアガロースプラグにおけるＤＮＡ
の制限酵素消化、および１％アガロースに通した産物の電気泳動によって分析し
た（図１０）。非切断ワクシニアＷＲ（レーン２）は、バクテリオファージλ（
レーン１）のマルチマーと比較したときに、１９０キロ塩基対のサイズで移動す
る。ＮｏｔＩを用いた消化の後に、ワクシニアＷＲを、長さが約１５０および４
０キロ塩基対の２つのフラグメントに切断し（左から７番目のレーン）、一方、
ｖＮｏｔ／ｔｋ、ｖＥＬ／ｔｋおよびｖ７．５／ｔｋを、約１１０および８０キ
ロ塩基対のフラグメントに切断した。同じサンプルがＡｐａＩを用いて消化され
た場合、非切断ゲノムのサイズの、１つのフラグメントのみが、ワクシニアＷＲ
およびｖＮｏｔ／ｔｋの両方において観察され、一方、ｖＥＬ／ｔｋおよびｖ７
．５／ｔｋは、ＮｏｔＩを用いた消化の後に観察された同じサイズのフラグメン
トを与えた。従って、ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋの両方は、ＡｐａＩお
よびＮｏｔＩの両方に固有の部位を含み、これらの部位はｖＮｏｔ／ｔｋにおけ
るＮｏｔＩ部位と同じ位置であり、そしてこれらの部位は、ワクシニアＷＲにお
けるＮｏｔＩ部位を含むＨｉｎｄＩＩＩ Ｆフラグメントよりもゲノムの中心的
位置にある。細胞ＤＮＡフラグメントのバックグラウンドは、６塩基対認識部位
を有するＡｐａＩ消化において、ＮｏｔＩ消化についてよりも顕著である。
【０１９７】 ｖＥＬ／ｔｋおよびｖ７．５／ｔｋについてのゲノムを、図１１に示すように
、ＨｉｎｄＩＩＩ ＪフラグメントにおけるＡｐａＩおよびＮｏｔＩ部位の位置
を確認するために、サザンブロッティングによって分析した。フィルターを、ｐ
７．５／ｔｋまたはｐＥＬ／ｔｋ由来の32Ｐ標識されたＨｉｎｄＩＩＩ Ｊフラ
グメントにハイブリダイズした。ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋについての
ゲノムは、ｖＮｏｔＩ／ｔｋにおいて現れないＡｐａＩ部位を有し（各々のブロ
ットにおけるレーン７および８を、レーン５と比較のこと）、一方、ＮｏｔＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩを用いた消化は、等しいサイズのフラグメントのセットを生
じる。ＮｏｔＩまたはＡｐａＩ消化から生じたＨｉｎｄＩＩＩ Ｊの左手側由来
の０．５キロベースのＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｐａ
Ｉフラグメントは、アガロースゲルの下部から離れて電気泳動している。
【０１９８】 プロモーター配列の完全な特徴づけは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産
物を利用した。ｔｋ遺伝子の最初に隣接する一対のプライマーを、図１２に示す
ように、ウイルス（ｖＮｏｔＩ／ｔｋ、ｖ７．５／ｔｋまたはｖＥＬ／ｔｋ）お
よびそれらの同属プラスミド由来のＤＮＡフラグメントを産生するために用いた
。ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋについてのＰＣＲ産物は、ウイルス（ｐ７
．５／ｔｋおよびｐＥＬ／ｔｋ）を産生するために用いたプラスミドについて観
察された産物と同じサイズであり、そしてワクシニアＷＲおよびｖＮｏｔＩ／ｔ
ｋについて見られた産物より大きい。ＰＣＲフラグメントは、プラスミドｐＣＲ
ＩＩにクローニングされ、ヌクレオチド配列が決定され、そして図１に示される
配列に一致することが示された。
【０１９９】 （１４．２．３．プロモーター活性の定量） ｖ７．５／ｔｋベクターおよびｖＥＬ／ｔｋベクターは、ｖＮｏｔＩ／ｔｋに
比べて、上昇したレベルの挿入タンパク質を構成的に発現するように設計された
。感染効率５でのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）の存在下および非存在下で
のコンフルエントなＢＳＣ−１細胞への感染、この細胞の収集、Ｔｒｉｚｏｌ（
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いるＲＮＡの単離、およびプライマ
ー伸張によるチミジンキナーゼＲＮＡ合成のレベルの分析により、ＲＮＡ合成の
レベルを測定した（Ｗｅｉｒら、１９９０、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ １６：１０２６７〜１０２８２）。ＡｒａＣを用いたインキュベ
ーションは、ウイルスＤＮＡ複製をブロックし、ウイルスプロモーターのクラス
を同定することを可能にする。
【０２００】 ウイルスプロモーターの初期のクラスは、ＤＮＡ複製の前に活性であり、そし
て感染においてＡｒａＣにより影響されない。後期プロモーターは、ＤＮＡ複製
の発生後のみに発現されそしてそれらの活性はＡｒａＣの存在下で抑止される。
変性ポリアクリルアミドゲル上での産物の精査により、ｖＮｏｔ／ｔｋに比較し
て、有意により多い（少なくとも１０倍と見積もられた）ｔｋＲＮＡプライマー
伸展産物が、ｖＥＬ／ｔｋ感染により合成されたことが実証された。ｖＮｏｔ／
ｔｋで感染した細胞において、ＡｒａＣインキュベーションに対して非感受性の
単一のＲＮＡ開始部位が観察され、一方、ｖＥＬ／ｔｋ感染においては、２つの
異なる開始部位（１つはＡｒａＣに対して耐性でかつ適切な初期開始部位に対応
し（Ｄａｖｉｓｏｎら、１９８９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１０：７４９〜７
６９）、そして１つの種はＡｒａＣに感受性でかつＲＮＡの適切な後期開始に対
応する（Ｄａｖｉｓｏｎら、１９８９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１０：７７１
〜７８４））が観察された（データ示さず）。ｖ７．５／ｔｋでの感染から誘導
されたＲＮＡ種のパターンは、絶対的レベルのＲＮＡ発現を有するｖＥＬ／ｔｋ
について観察されたパターンと類似であり、このｖＥＬ／ｔｋについて観察され
たパターンは、ｖＥＬ／ｔｋおよびｖＮｏｔ／ｔｋについて観察されたパターン
に対して中間であった。
【０２０１】 ウイルスベクターに挿入された遺伝子の発現のレベルを確認するために、β−
グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕ）をコードするＥ．ｃｏｌｉ ｇｕｓＡ遺伝子を
ｖＮｏｔＩ／ｔｋウイルスベクター、ｖ７．５／ｔｋウイルスベクターおよびｖ
ＥＬ／ｔｋウイルスベクター中にクローニングし、そして相対的なプロモーター
強度を測定した。β−ｇｌｕ遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを、ｐＪＮ
ｏｔ／ｔｋ−ＧＵＳ、ｐ７．５／ｔｋ−ＧＵＳおよびｐＥＬ／ｔｋ−ＧＵＳを生
成する各プロモーターを含むプラスミド中に挿入した。ｐＪＮｏｔ／ｔｋ中のイ
ンサートβ−ｇｌｕ遺伝子の正しい方向を、制限酵素分析により確認した。この
プラスミドをｖＮｏｔＩ／ｔｋで組換え、そしてこの組換えウイルスをＸ−ｇｌ
ｕでの染色により同定し（Ｃａｒｒｏｌｌら、１９９５、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ １９：３５２〜３５５）、Ｈｕｔｋ-細胞を通じて３回継代し、そして
ウイルスストックであるｖＮｏｔＩ／ｔｋ−ＧＵＳ、ｖ７．５／ｔｋ−ＧＵＳお
よびｖＥＬ／ｔｋ−ＧＵＳを生成するために増殖させた。この組換えウイルスの
構造をサザンブロット分析により確認した。
【０２０２】 ｖＮｏｔＩ／ｔｋ−ＧＵＳ、ｖ７．５／ｔｋ−ＧＵＳおよびｖＥＬ／ｔｋ−Ｇ
ＵＳによるβ−ｇｌｕの発現のレベルを、ＡｒａＣの存在下または非存在下でＢ
ＳＣ−１細胞の感染したコンフルエント単層から測定した（図１３）。ｖ７．５
／ｔｋ−ＧＵＳおよびｖＥＬ／ｔｋについてのβ−ｇｌｕ発現のレベルは、ｖＮ
ｏｔＩ／ｔｋ−ＧＵＳについて観察されたレベルよりも非常に高く、そしてｖＥ
Ｌ／ｔｋ−ＧＵＳでは、最高であった（約２０倍高い）。β−ｇｌｕの発現をシ
トシンアラビノシドの存在下で３つのウイルスすべてについて観察し、このこと
は各プロモーターがウイルスプロモーターの初期クラスのメンバーであることを
示す。ｖＮｏｔＩ／ｔｋ−ＧＵＳ中のβ−ｇｌｕのレベルは、ＡｒａＣの存在下
または非存在下で変化せず、このことはこのプロモーターが感染の初期の間にの
み活性であることを示す。一方、ｖ７．５／ｔｋ−ＧＵＳおよびｖＥＬ／ｔｋ−
ＧＵＳにおけるβ−ｇｌｕレベルは、ＡｒａＣの存在下ではより低く、このこと
はこれらのプロモーターが感染の初期および後期の両方の時とも活性であること
を示す。
【０２０３】 （１４．２．４．ウイルスベクターの生化学的特徴付け） ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋベクターは、ＨＡＴ補充培地の存在下での
増殖により最初に単離され、そしてブロモデオキシウリジンの存在下でＨｕｔｋ - 細胞における継代を介してインサートを有するウイルスの選択を可能にするた
めに活性なｔｋ遺伝子を含むように設計される（Ｅａｒｌら、１９９１、Ｉｎ
Ａｕｓｕｂｅｌら、（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓ
ｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
）。両方のベクターを、薬物選択を用いてＨｕｔｋ−細胞中でのプラークアッセ
イにより試験し、そしてｖＥＬ／ｔｋについてのこの結果を図１４に示す。薬物
なしでのインキュベーションまたはｖｐＮｏｔまたはｖＮｏｔ／ｌａｃＺ／ｔｋ
についてのプラーク形成を妨害するのに十分な濃度でのＨＡＴ補充物とのインキ
ュベーションは、（データは示さないが）等しい数の同様のサイズのプラークを
生じた。驚くべきことに、等しい数のプラーク（サイズが非常により小さいにも
かかわらず）が、ワクシニアＷＲがＨｕｔｋ-細胞上でプラーク形成する能力を
妨害するのに十分な濃度である２５ｍＭブロモデオキシウリジン中でのインキュ
ベーションでｖＥＬ／ｔｋについて観察された（データ示さず）。１２５ｍＭブ
ロモデオキシウリジンの添加は、ｖＥＬ／ｔｋ（図１４）およびｖ７．５／ｔｋ
（データ示さず）についてのプラーク形成を阻害するのに十分だった。より高い
濃度のブロモデオキシウリジンは、ｖＮｏｔＩ／ｌａｃＺ／ｔｋのようなｔｋ-
ウイルスの増殖を妨害しないか（データ示さず）、またはＨｕｔｋ-細胞株の生
存度に影響しなかった。
【０２０４】 （１４．２．５．直接連結による組換えウイルスの構築） 直接連結ベクターは、裸のＤＮＡ由来の感染ウイルスの生成が容易でかつ効率
的である場合、複合体発現ライブラリーの生成にのみ有用である。以前に、条件
致死温度感受性ウイルス（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ．１９０：５２２〜５２６）または鶏痘（ｆｏｗｌｐｏｘ）（Ｓｃｈｅｉｆ
ｌｉｎｇｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、
８９：９９７７〜９９８１）での同時感染により、ＤＮＡ連結産物でトランスフ
ェクトされた細胞中にヘルパーウイルス活性が供給された。高レベルの複製して
いる野生型ウイルスは、ウイルスＤＮＡをパッケージする能力を妨害し、そして
ワクシニアウイルスは、インプット（ｉｎｐｕｔ）ＤＮＡと組換えられ得るので
、条件欠損ワクシニアウイルスのみがヘルパーとして用いられ得る（Ｍｅｒｃｈ
ｌｉｎｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９０：５２２〜５２６）。鶏
痘は、３７℃で用いられる場合に、優れたヘルパーウイルスであり、非常に複製
する株に復帰せず、そしてワクシニアＤＮＡと組換えしないかまたは初代細胞株
に生産的に感染しないので、ワクシニアより高い感染効率で用いられ得る。鶏痘
が効率的なヘルパーウイルスとして働くか否かを決定するため、ＢＳＣ−１細胞
を含有する１２ウェルプレートからの一連のウェルを異なる感染効率の鶏痘に感
染させ、そして全長ワクシニアＷＲ ＤＮＡでトランスフェクトし、この細胞を
２４時間、４８時間または７２時間後に収集し、そしてこのウイルス力価を表８
に示すとおり決定した。鶏痘なしのＤＮＡのトランスフェクションまたは鶏痘単
独での感染は、プラークを生じなかった。レスキューされたワクシニアのレベル
は、後の収集物で増加し、そして鶏痘感染の感染効率に比例した。
【０２０５】
【表８】 （表８．鶏痘ウイルスによるワクシニアＤＮＡのパッケージング） 第１４．１節（材料および方法）に記載のように、リポフェクタミンを用いて、
鶏痘ウイルスに感染したＢＳＣ−１細胞にワクシニアＤＮＡをトランスフェクト
した。この細胞をトランスフェクション後、１、２、または３日目に収集し、凍
結融解サイクルにより溶解し、そしてＢＳＣ−１細胞上でのプラークアッセイに
より感染ウイルスについてアッセイした。
【０２０６】 オボアルブミンｃＤＮＡの１．１キロベース対フラグメント（Ｐｕｌａｓｋｉ
ら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：３６６
９〜３６７４）をモデルインサート（挿入物）として用いて、直接連結により機
能的組換えウイルスの生成を研究した。このオボアルブミンインサートを「材料
および方法」に記載のとおり、その５’末端にＮｏｔＩ部位を、その３’末端に
翻訳終止コドン、ワクシニア転写終止シグナルおよびＡｐａＩ部位を含むように
改変した。このインサートは、ＮｏｔＩおよびＡｐａＩで消化され、そしてＮｏ
ｔＩおよびＡｐａＩで消化されていた精製されたｖＥＬ／ｔｋ ＤＮＡアームと
連結された。この連結混合物を、鶏痘が感染したＢＳＣ−１細胞にトランスフェ
クトし、細胞を収集し、そして３日後、この細胞抽出物を１２５ｍＭのブロモデ
オキシウリジンの存在下または非存在下でＨｕｔｋ-細胞に継代した。薬物選択
なしで得た力価は、２．７×１０3ｐｆｕであり、そして薬物選択で得た力価は
、２．８×１０4ｐｆｕであった。個々のプラークをブロモデオキシウリジンの
存在下または非存在下でＨｕｔｋ-細胞から拾い上げ、そしてオボアルブミンｃ
ＤＮＡプローブを用いたドットブロットハイブリダイゼーションによりオボアル
ブミンインサートの存在について試験した。ブロモデオキシウリジンの存在下で
拾い上げた１５の全てのプラーク、およびブロモデオキシウリジンの非存在下で
拾い上げた１０の全てのプラークはオボアルブミンインサートを含んだ。これら
のウイルスをｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａＦＬと名付けた。２つの個々のクローンをさ
らに増殖させ、そしてｏｖａ２５７〜２６４特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴ
Ｌ）による溶解に対して宿主細胞を感作させる能力について試験した。この実験
の結果を表９に示す。コントロールとして、ｏｖａ ２５７〜２６４ミニ遺伝子
（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）、ｖ７．５／ｔｋ−ｏｖａおよびｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａに
ついてのワクシニア組換え体を相同組換えにより生成した。これらのｏｖａペプ
チド組換えウイルスを、ｏｖａ特異的ＣＴＬによる溶解に対する宿主細胞を感作
させる能力について、ｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａＦＬクローンと呼応して試験した。
表９に示すとおり、全長またはミニ遺伝子のオボアルブミンワクシニア組換え体
のいずれかでの感染は、ＯＶＡ−特異的ＣＴＬによる溶解に対する標的細胞の感
作のための１μＭの精製されたＯＶＡ２５７〜２６４ペプチドでのパルシング（
ｐｕｌｓｉｎｇ）と同じく効率的であった。
【０２０７】
【表９】 （表９．組換えワクシニアウイルス感染細胞上でのＣＭＬアッセイ）ウイルス感
染したＭＣ５７Ｇ細胞を第１４．１節（材料および方法）に記載のとおり生成し
た。ＭＣ５７Ｇ細胞の１つのサンプルをｏｖａ２５７〜２６４ペプチド（１μＭ
）で処理し、細胞の別のサンプルを未処理のまま残した。２つの異なる比のｏｖ
ａ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球とともに細胞を３７℃で４時間インキュベートし
、そして特異的溶解パーセントを第１４．１節（材料および方法）に記載のとお
り決定した。
【０２０８】 （１４．３．考察） 大きいＤＮＡウイルスは、細胞プロセスの研究のために、特に有用な発現ベク
ターである。なぜなら、それらは種々の細胞株においてそれらのネイティブな形
態で多くの異なるタンパク質を発現し得るからである。さらに、組換えワクシニ
アウイルスにおいて発現される遺伝子産物は、効率的に処理され、そして細胞傷
害性Ｔ細胞を刺激するためＭＨＣクラスＩと結合して提示されることが示されて
いる。目的の遺伝子は、通常、このウイルス中の非必須領域に相同である配列に
隣接するプロモーターの制御下のプラスミドにクローニングされ、そしてこのカ
セットは相同組換えを介してゲノムに導入されている。発現、選択および検出の
ための一式のベクターが、種々のクローニングおよび発現ストラテジーを適応す
るために考案されている。しかし、相同組換えは、複合体ライブラリーの生成を
必要とする状況で、またはインサートＤＮＡが大きい場合に組換えウイルスを作
製する非効率的な手段である。インサートへのウイルスＤＮＡ「アーム（ａｒｍ
）」の直接連結および引き続く感染ウイルスのレスキューに依る組換えゲノムの
構築のための代替ストラテジーは、ポックスウイルス（Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙ
ら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：５２２〜５２６；Ｐｆｌｅｉｄｅｒ
ｅｒら、１９９５、Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６：２９５７〜
２９６２；Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９９７７〜９９８１）、ヘルペスウイルス（Ｒｉ
ｘｏｎら、１９９０、Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：２９３１
〜２９３９）およびバキュロウイルス（Ｅｒｎｓｔら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：２８５５〜２８５６）のゲノムにつ
いて研究されてきた。
【０２０９】 ポックスウイルスは、真核生物細胞における研究のための遍在性のベクターで
ある。なぜならそれらは、容易に構築され、そして高レベルの外来性タンパク質
を発現するように操作されるからである。このウイルスの広範な宿主範囲は、種
々の細胞型においてタンパク質を忠実に発現することを可能にする。直接クロー
ニングストラテジーは、ポックスウイルスのウイルスキメラについての適用の範
囲を広げるために考案されてきた。ここでは、組換えゲノムがワクシニア「アー
ム」へのＤＮＡフラグメントの直接連結、およびヘルペスウイルスで感染された
細胞へのＤＮＡ混合物のトランスフェクションによりインビトロで構築される（
Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：５２２〜５
２６；Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９９７７〜９９８１）。このアプローチは、外来タン
パク質の高レベル発現（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒら、１９９５、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ ７６：２９５７〜２９６２）のために、および２６キロベース長
程度のの大きさのフラグメントを効率的にクローニングする（Ｍｅｒｃｈｌｉｎ
ｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：５２２〜５２６）ために用い
られてきた。
【０２１０】 ワクシニアウイルスＤＮＡは、ウイルスとしては感染性ではない。なぜならこ
のウイルスは、細胞性転写機構を利用し得ず、そしてウイルスＲＮＡの合成のた
めにそれ自体のタンパク質に依存するからである。以前、温度感受性条件致死（
Ｍｅｒｃｈｌｉｎｓｋｙら、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：５２２〜５
２６）または非相同ポックスウイルス鶏痘（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら、１９
９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ８９：９９７７〜９９８１）は
、パッケージングのためのヘルパーウイルスとして利用されてきた。理想的なヘ
ルパーウイルスは、効率的に感染性ウイルスを生成するが、宿主細胞中では複製
しないか、またはワクシニアＤＮＡ産物を組換えない。鶏痘ウイルスは、３７℃
で用いられる場合、理想的なヘルパーウイルスの特性を有し、高度に複製する株
には復帰せず、そしてワクシニアＤＮＡと組換えしないかまたは初代細胞株に生
産的に感染しないので、ワクシニアよりも相対的に高い感染効率で用いられ得る
。
【０２１１】 ワクシニアに基づく直接連結ベクターｖＮｏｔＩ／ｔｋの有用性は、Ｍｅｒｃ
ｈｌｉｎｓｋｙら（１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：５２２〜５２６）に
より記載されている。このゲノムは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｆフラグメントにおいて
通常に存在するＮｏｔＩ部位を欠失し、そしてこのコード配列とインフレームに
おけるチミジンキナーゼ遺伝子の開始において特有のＮｏｔＩ部位を含む。これ
は、ＮｏｔＩ部位へのＤＮＡフラグメントの挿入および薬物選択による組換えゲ
ノムの同定を可能にする。このｖＮｏｔＩ／ｔｋベクターを用いて、大きいＤＮ
Ａフラグメントを効率的にクローニングし得るが、これはＤＮＡインサートの方
向を固定しないか、または外来タンパク質の高い発現を導かない。本実施例は、
直接連結に適切な１対のワクシニアＤＮＡベクターゲノムｖ７．５／ｔｋおよび
ｖＥＬ／ｔｋの構築および特徴付けを記載する。このｖ７．５／ｔｋおよびｖＥ
Ｌ／ｔｋベクターを、チミジンキナーゼの開始部位にＮｏｔＩおよびＡｐａＩに
ついて特有の制限部位を含むように設計した。これにより、ＤＮＡを方向付けて
クローニングすること、およびワクシニアベクターアームの追放から生じるイン
タクトなゲノムを排除することが可能になる。
【０２１２】 ｖＮｏｔＩ／ｔｋベクターは、チミジンキナーゼ遺伝子（ウイルス感染の早期
の間にのみ作られる弱く発現された遺伝子）のレベルで外来タンパク質のみを発
現する。高いレベルのタンパク質発現を誘導するため、ウイルス７．５ｋプロモ
ーターおよび合成ＥＬプロモーター（ＣｈａｋｒａｂａｒｔｉおよびＭｏｓｓに
より考案された）をコードする配列を用いて、内因性チミジンキナーゼプロモー
ターを置き換えた。いずれかのプロモーターにより誘導された発現のレベルは、
ｖＮｏｔＩ／ｔｋで観察されたレベルよりも非常に高く、そしてこのプロモータ
ーは感染後、全ての時点で活性であった。これらの持続発現ベクターは、初期発
現（例えば、Ｔ細胞エピトープ提示）に依存する場合に、およびタンパク質のバ
ルク発現のために適用可能である。
【０２１３】 外来ＤＮＡのための挿入部位としてのチミジンキナーゼ遺伝子の使用により、
ヘルパーまたは野生型のゲノムから組換え体を識別するための選択プロトコール
の実行が可能になる。ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋにおけるｔｋ発現のレ
ベルは、ワクシニアＷＲまたはｖＮｏｔ／ｔｋにおいてよりも非常に高いはずで
ある。しかし、ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋにおけるｔｋ遺伝子の開始に
おけるＡｐａＩ部位は、ＮｏｔＩ部位に余分なヌクレオチドを付加することによ
りｖＮｏｔ／ｔｋから形成された。さらなるヌクレオチドは、ｖ７．５／ｔｋお
よびｖＥＬ／ｔｋにおいてＭｅｔ−Ａｓｎ−ＧｌｙからＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙに、野生型ｔｋ遺伝子のＮ末端でアミノ酸配
列を増加させる。チミジンキナーゼ遺伝子の発現レベルおよびＮ末端アミノ酸配
列における改変は、ブロモデオキシウリジンに対するウイルスの感受性を増加し
得る（タンパク質増）か、または低下させ得る（異なる配列）。プラークが、よ
り小さいにもかかわらず、野生型ワクシニアＷＲについてのプラーク形成を完全
に抑制するのに十分なブロモデオキシウリジンの濃度でのｖ７．５／ｔｋおよび
ｖＥＬ／ｔｋ感染において、観察された。プラーク形成は、細胞の生存度を妨害
しないか、またはｔｋ-ウイルスがプラークを形成する能力を妨げない薬物レベ
ルである５倍高い濃度のブロモデオキシウリジンで抑制された。ブロモデオキシ
ウリジンに対する変更された感受性についての説明には、タンパク質のさらなる
特徴付けが待たれる。なぜなら、変更されたチミジンキナーゼ遺伝子は、ブロモ
デオキシウリジンのトリホスフェート形態の形成に対する異なる反応速度、また
はブロモデオキシウリジンを結合する能力の低下を有し得る。
【０２１４】 直接連結ベクターの開発は、ポックスウイルス発現ベクターについての可能性
のある適用を増加させた。このｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋベクターは、
方向付けされたクローニング、外来タンパク質の高レベルの発現、および組換え
ウイルスの選択の利点を、直接連結ベクターに組み込むように設計された。それ
らは、感染中、全ての時点で高レベルのタンパク質を発現することが示された。
これらのベクターの有用性は、オボアルブミンのＣＴＬエピトープを含有する組
換え体（プラスミドでの相同組換えにより構築された）またはオボアルブミンコ
ード配列を含有する組換え体（直接連結プロトコールにより構築された）、を構
築することにより実証され、そしてこれは両方の組換え体が、どのように強力な
ＣＴＬ応答を誘発し得たのかを示す。
【０２１５】 複合体発現ライブラリーの構築のためのプロトコールへのこれらのベクターの
適用は、野生型および混入物を排除または最小化するために、組換え体の効率的
な産生および強力な選択を必要とする。２つの制限部位の使用は、ＤＮＡフラグ
メント（例えば、ＰＣＲの産物）の方向づけられたクローニングのためのクロー
ニングストラテジーを設計すること（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒら、１９９５、Ｊ．
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６：２９５７〜２９６２）、および所望
の組換え体の頻度を増加させることを可能にする。なぜなら、野生型ゲノムは、
ワクシニアのアームの連結によっては、もはや生成され得ないからである。予め
ＮｏｔＩおよびＡｐａＩで消化されたｖ７．５／ｔｋまたはｖＥＬ／ｔｋのＤＮ
Ａが、鶏痘に感染した細胞へトランスフェクトされた場合、このウイルス力価は
、インタクトな非切断ＤＮＡについてよりも１００分の１未満であった。また、
ｖＥＬ／ｔｋ−ｏｖａＦＬの単離の間、ブロモデオキシウリジンの存在および非
存在下（１５は、ブロモデオキシウリジンを有し、そして１０はブロモデオキシ
ウリジンなし）において単離された全てのプラークは、オボアルブミンインサー
トを含んだ。感染性ウイルス形成の効率はまた、相対的に高い感染効率で、ヘル
パーウイルスである鶏痘の使用で上昇される。また、大きいＤＮＡフラグメント
のトランスフェクションは、脂質の型および調製物で変動し（Ｍｉｌｅｓ Ｃａ
ｒｒｏｌｌ、私信）、そして本発明者らは、現在、直接連結プロトコールのため
の最適条件を見出すため、異なる脂質混合物および細胞型をアッセイし、そして
他のパラメーターを研究している。ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋベクター
は、ポックスウイルスについての、１セットの普遍的に適用可能な直接連結クロ
ーニングベクターを提供する。
【０２１６】 本発明は、本発明の個々の局面の単一の例示として意図される、記載された特
定の実施形態により、範囲内に限定されるとべきでなく、そして機能的に等価で
ある、任意の構築物、ウイルスまたは酵素は、本発明の範囲内である。実際、本
明細書において示されかつ記載されるものに加えて、本発明の種々の改変は、前
述の記載および添付の図面から当業者に明白となる。このような改変は、添付の
特許請求の範囲内におさまることが意図される。
【０２１７】 本明細書に記載される全ての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物ま
たは特許出願が参考として援用されることが詳細にかつ個々に示されるのと同じ
程度まで参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐ７．５／ｔｋおよびｐＥＬ／ｔｋのヌクレオチド配列。ｖ７．５／ｔｋおよ
びｖＥＬ／ｔｋについてのプロモーターおよびチミジンキナーゼ遺伝子の開始部
のヌクレオチド配列。
【図２】 ｐ７．５／ｔｋワクシニア移入プラスミドのヌクレオチド配列における改変。
４つの新規なベクター、ｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ１／ｔｋ
、ｐ７．５／ＡＴＧ３／ｔｋ、およびｐ７．５／ＡＴＧ４／ｔｋは、本文中に記
載されるように、ｐ７．５／ｔｋワクシニア移入プラスミドから誘導された。各
ベクターは、ＤＮＡインサートをクローニングするための、独特なＢａｍＨＩ、
ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、およびＳａｌＩ部位を含み、これは、それらの内因性の翻
訳開始部位を利用するか（ベクターｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋにおいて）、また
は３つの可能なリーディングフレームのいずれか１つにおけるベクター翻訳開始
部位を利用するか（ｐ７．５／ＡＴＧ１／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ３／ｔｋ、お
よびｐ７．５／ＡＴＧ４／ｔｋ）のいずれかである。
【図３】 提示的示差分析のＣｌｏｎｔｅｃｈ ＰＣＲ ＳＥＬＥＣＴTM法の概略図であ
る。製造者によって提供される情報から改変した。
【図４】 Ｂ／ｃ．Ｎ親の配列のＲＤＡ差引き後にＰＣＲによって増幅したＢＣＡ３９腫
瘍ＤＮＡフラグメント。ＢＣＡ３９腫瘍細胞ｃＤＮＡに連結されたＲＤＡアダプ
ターに組み込まれたネステッドプライマーを、ＲＤＡから回収されたＤＮＡフラ
グメントの連続的なＰＣＲ増幅のため用いた。バンドを、２％Ｍｅｔａｐｈｏｒ
アガロースゲルで分離した。１つのさらなる低分子量のバンドが、図示したゲル
から流出し、そしてより短い電気泳動から回収された。
【図５】 （Ａ）ＩＡＰ ｐｏｌ遺伝子のＲＤＡフラグメント、または（Ｂ）遍在的に発
現されるマウスＧ３ＰＤＨ ｃＤＮＡのフラグメントの、ＢＣＡ３９腫瘍ＲＮＡ
のノーザンブロットへのハイブリダイゼーションを示す。総ＲＮＡの１５マイク
ログラムを、１０×ＳＳＣ中でキャピラリーブロットによって、１％アルカリア
ガロースゲルからＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎナイロンメンブレンに転写した。ノーザ
ンブロットは、最初に32Ｐ標識したＲＤＡクローン１ＤＮＡ（１０5ｃｐｍ／ｍ
ｌ Ｓｔａｒｋ’ｓハイブリダイゼーション緩衝液）にハイブリダイズさせ、次
いでストリッピングし、そしてＧ３ＰＤＨ ｃＤＮＡの３５０ｂｐフラグメント
を用いてハイブリダイズを行った。
【図６】 全長ＩＡＰクローンＭＩＡ１４と比較した、ＩＡＰ遺伝子エレメントのフラグ
メントをコードするＲＤＡクローンを示す。各ＲＤＡクローンの末端領域（黒長
方形の枠）のうちの一方または両方を配列決定し、ＩＡＰエレメントのサブ領域
に対する相同性を同定した。重複の程度は、フラグメントサイズ、または、フラ
グメントの両方の末端の配列が決定された場所、そのフラグメントの２つの末端
にわたる既知のＩＡＰ ＭＩＡ１４配列のいずれかから推定された。１つの場合
（クローン２．１９）において、２つの測定値は一致しなかった。このことは、
ＢＣＡ３９腫瘍細胞中のこのＩＡＰフラグメントにおける欠失を示唆する。
【図７】 親の細胞Ｂ／ｃ．Ｎならびに腫瘍ＢＣＡ３９、ＢＣＡ３４、ＢＣＡ２２、およ
びＢＣＢ１３のｃＤＮＡの改変されたディファレンシャルディスプレイ。親の細
胞および腫瘍細胞のｃＤＮＡのフラグメントを、一対の任意のデカマー、ＭＲ＿
１（ＴＡＣ ＡＡＣ ＧＡＧ Ｇ）およびＭＲ＿５（ＧＧＡ ＣＣＡ ＡＧＴ
Ｃ）を用いて増幅した。各細胞株について、第１の鎖のｃＤＮＡ合成を、ＭＲ−
１またはＭＲ＿５を用いて別々にプライムした。次いで、２つのｃＤＮＡ調製物
を、ＭＲ＿１とＭＲ＿５との両方を用いるＰＣＲ増幅についてプールした。４つ
すべての腫瘍と結合するが、不死化された、非腫瘍形成性の親の細胞株には結合
しない、多くのバンドが同定され得る。
【図８】 ディファレンシャルディスプレイクローン９０の腫瘍株における示差的発現。
ＲＮａｓｅ保護アッセイ：３００ピコグラムのクローン９０アンチセンスプロー
ブを、ＲＮａｓｅ消化および５％変性ＰＡＧＥでの保護されたフラグメントの分
析の前に、５マイクログラムの総ＲＮＡとハイブリダイズさせた。
【図９】 溶液中での遺伝子の単離。ファージミドライブラリーからレスキューされた単
鎖環からのより長いｃＤＮＡの選択のための方法の概略図。ＲＤＡまたは改変さ
れたディファレンシャルディスプレイを通して同定されたＤＮＡフラグメントを
用いて、より全長に近いｃＤＮＡを選択する。
【図１０】 ＣＨＥＦゲルを使用する、ウイルスゲノムの制限酵素分析を示す。ＢＳＣ−１
細胞を、ワクシニアＷＲ、ｖＥＬ／ｔｋ、ｖ７．５／ｔｋ、またはｖＮｏｔＩ／
ｔｋによって、高い感染多重度（ｍｏｉ）で感染させた。２４時間後、細胞を収
集し、そしてアガロースプラグ（ｐｌｕｇ）を形成した。このプラグは、適切な
制限酵素緩衝液および１ｍＭ ＰＭＳＦ中で、室温で１６時間平衡化され、制限
酵素緩衝液、１００ｎｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、および５０単位のＮｏｔＩ
またはＡｐａＩとともに３７℃（ＮｏｔＩ）または室温（ＡｐａＩ）で２時間イ
ンキュベートし、そして１．０％アガロースゲル中で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＣＨＥ
ＦＩＩ装置上で、１５時間、６Ｖ／ｃｍで、切り換え時間１５秒間で電気泳動し
た。最も左のサンプルは、λＤＮＡを含み、第２のサンプルは、未消化のワクシ
ニアＤＮＡを含み、そして残りのサンプルは、各ウェルに、ＡｐａＩまたはＮｏ
ｔＩで消化した上記のＤＮＡサンプルを含み、ここで、ｖＥＬとは、ｖＥＬ／ｔ
ｋのことをいい、そしてｖ７．５とは、ｖ７．５／ｔｋのことをいう。この図の
下の部分は、各ウイルスでのＮｏｔＩ部位およびＡｐａＩ部位の位置を示す概略
マップである。
【図１１】 ウイルスゲノムｐ７．５／ｔｋおよびｐＥＬ／ｔｋのサザンブロット分析。ウ
イルスｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋを使用して、ＢＳＣ−１細胞の６ウェ
ルディッシュのウェルに高い感染多重度（ｍｏｉ）で感染させ、そして４８時間
後、細胞を収集し、ＤＮＡｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を使用してＤＮＡを単離した。
最終ＤＮＡ産物を、５０μｌのＴＥ ８．０に再懸濁し、そして２．５μｌをＨ
ｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩ、またはＨｉｎｄＩＩＩおよびＮ
ｏｔＩを用いて消化し、１．０％アガロースゲルを通して電気泳動し、そしてＴ
ｕｒｂｏｂｌｏｔｔｅｒ（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）を使用
して、Ｎｙｔｒａｎ（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ）に転写した
。サンプルを、ＱｕｉｃｋＨｙｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中でランダムプライ
マーＤＮＡ標識キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して32Ｐを用いて標識したｐ７
．５／ｔｋ（図１１ａ）またはｐＥＬ／ｔｋ（図１１ｂ）を用いて探索した。こ
の図の下の部分は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、およびＡｐａＩ部位の位置を図
示した、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｊフラグメントのマップを示す。最も左の０．５キロ
ベースフラグメントは、ゲルの底から電気泳動で流出した。
【図１２】 ＰＣＲによるｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋの分析を示す。ｖ７．５／ｔ
ｋ、ｖＥＬ／ｔｋ、ｖＮｏｔＩ／ｔｋ、ｖｐＮｏｔＩ、ｖＮｏｔＩ／ｌａｃＺ／
ｔｋ、または野生型ワクシニアＷＲを用いて、ＢＳＣ−１細胞の６ウェルディッ
シュの１つのウェルに高い感染多重度（ｍｏｉ）で感染させ、そして４８時間後
、細胞を収集し、ＤＮＡｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を使用してＤＮＡを単離した。最
終ＤＮＡ産物を、５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０、１
ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁し、そしてプライマーＭＭ４０７およびＭＭ４０８を
用いるＰＣＲで使用した。これらのプライマーは、ワクシニアＷＲ中で５１８ヌ
クレオチド離れており、そしてチミジンキナーゼ遺伝子のＮ末端を含むフラグメ
ントを産生する。生成物を、２％アガロースゲルを通して電気泳動した。最も左
のサンプルは、ｐｈｉＸ １７４ ＨａｅＩＩＩ消化産物を含む；他のすべては
、ウェルの上に示すＤＮＡサンプルを用いて、プライマーＭＭ４０７およびＭＭ
４０８を使用したＰＣＲ産物を含む。
【図１３】 組換えウイルスのプロモーター強度。β−ｇｌｕ活性の単位は、９６ウェルプ
レートについて適合されるように、Ｍｉｌｌｅｒ（１０）によって記載されるよ
うに決定された。Ａ405の値は、マイクロプレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ
ＭＲ３０００）で決定され、そしてβ−ｇｌｕ活性は、同じアッセイにおいて
分析されたβ−ｇｌｕ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）標準との比較によって決定された。
【図１４】 ｖＥＬ／ｔｋ上のプラークアッセイ。１０倍希釈のｖＥＬ／ｔｋを、Ｈｕｔｋ - 細胞とともに、１０％ウシ胎仔血清を有するＥ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）１ｍｌ
中で、３７℃にて、１時間インキュベートした（上から下）。培地を、５％メチ
ルセルロース（Ｓｉｇｍａ Ｍ−０３８７）、５％ウシ胎仔血清、およびＨＡＴ
補充物（Ｇｉｂｃｏ）、２５ｍＭもしくは１２５ｍＭ ブロモデオキシウリジン
、または薬物なし、を有するＥ−ＭＥＭ ３ｍｌで置き換え、３７℃で４８時間
インキュベートし、そして０．５％ クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ Ｃ
０７７５）、２０％ エタノール、７．５％ ホルムアルデヒドを用いて染色
した。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年８月１８日（２０００．８．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０４】
【表３】 表３：ワクシニア株Ｖ７．５／ｔｋ（１．２μｇ）由来のゲノムＤＮＡを、Ａｐ
ａＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて消化した。消化したＤＮＡ
を、半分に分けた。１つのプールを、ｐＥ／Ｌｏｖａの１：１（ワクシニア：プ
ラスミド）モル比で混合した。このプラスミドは、オボアルブミンｃＤＮＡのフ
ラグメントを含み、これは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１０）エピトープをコ
ードし、マウスのクラスＩ ＭＨＣ分子に対する高い親和性Ｋbで結合すること
が公知である。このミニ遺伝子の発現は、強力な合成的初期／後期ワクシニアプ
ロモーターによって制御される。この挿入物は、ワクシニアｔｋ ＤＮＡに隣接
する。ＤＮＡを、リポフェクタミンを用いて、ｍｏｉ＝１．０ ＦＰＶで２時間
前に感染されているＢＳＣ１細胞のコンフルエントな単層中（５×１０5細胞／
ウェル）にトランスフェクトさせた。１つのサンプルは、６００ｎｇの未処理ゲ
ノムＶ７．５／ｔｋＤＮＡを用いてトランスフェクトさせた。３日後、細胞を収
集し、そしてウイルスを、ドライアイスイソプロパノール／３７℃水浴での３回
の凍結融解によって抽出した。粗ウイルスストックを、ＢｒｄＵ選択ありおよび
なしで、ＴＫ−１４３Ｂ細胞上にプラーク形成させた。 ★ ％組換え体＝（ＢｒｄＵありの力価／ＢｒｄＵなしの力価）×１００ （６．３．ワクシニアウイルス中の提示的（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ）
ｃＤＮＡライブラリーの構築） ｃＤＮＡライブラリーを、既知の細胞性ｍＲＮＡ配列の提示的な発現を示すた
めに、ワクシニアベクター中に構築する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０８】 第三に、この時点における目的は、新しい多重クローニング部位をｐＢＳ．Ｖ
ｔｋ．ＭＣＳ−の中の７．５ｋプロモーターの下流に導入することであった。新
しい多重クローニング部位は、４つの異なる上流のプライマーおよび共通の下流
のプライマーを使用したＰＣＲによって産生された。共に、これら４つのＰＣＲ
産物は、ＡＴＧ開始コドンのいずれも、すなわち３つの可能性がある読み取り枠
の各々におけるＡＴＧ開始コドンを含まない。さらに、各ＰＣＲ産物は、その３
’最末端に、３つの読み取り枠全てにおける翻訳終止コドン、およびワクシニア
ウイルス転写二重終止シグナルを含む。これら４つのＰＣＲ産物は、別々にｐＢ
Ｓ．Ｖｔｋ．ＭＣＳ−のＮｏｔＩ／ＡｐａＩ部位の中に連結され、４つのベクタ
ーｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ１／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ２
／ｔｋ、およびｐ７．５／ＡＴＧ３／ｔｋを産生した。これらのｐ７．５／ｔｋ
ベクターと比較した配列改変は、図２に示される。各ベクターは、ＤＮＡ挿入物
のクローニングのために独特なＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、およびＳａｌ
Ｉ部位を含み、このＤＮＡ挿入物は、それら自身の内在性翻訳開始部位を使用す
るか（ベクターｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋにおいて）、または３つの可能な読み
取り枠のいずれか１つにおけるベクターの翻訳開始部位を利用するか（ｐ７．５
／ＡＴＧ１／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ２／ｔｋ、およびｐ７．５／ＡＴＧ３／ｔ
ｋ）のいずれかである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１２１】 （８．１．方法および結果） 十分に特徴付けられた卵白アルブミンペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（配列番
号１０）をコードする特異的ワクシニア組換え体を、非組換えウイルスで希釈し
た。その結果、この組換え体は、０．２％、０．０１％、または０．００１％の
いずれかのウイルスｐｆｕを構成した。この卵白アルブミンペプチドは、プロセ
シングされ、そしてマウスのクラスＩ ＭＨＣ分子Ｈ−２Ｋbと結合して特異的
ＣＴＬに提示されることが公知である。Ｈ−２Ｋbを発現するＭＣ５７Ｇ細胞の
付着性単層を、このウイルス混合物にｍ．ｏ．ｉ．＝１（ウェル当たり約５×１
０5細胞）にて感染させた。ＭＣ５７Ｇ細胞はそれ自身では卵白アルブミンペプ
チドを発現しないが、Ｈ−２Ｋbを発現し、それによって、この細胞が卵白アル
ブミンペプチドを結合し、そしてこれをＴ細胞へ提示することを可能とする。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１４８】
【表６】 各々のプライマーを用いて、０．１μｇのポリＡ−ＲＮＡおよびＳｕｐｅｒｓｃ
ｒｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いる分離ｃＤＮＡの合成反応
行った。プライマー対の各々のメンバーを用いて作製されたｃＤＮＡ産物の５パ
ーセントをＫｌｅｎ Ｔａｇ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）を用いて３０ＰＣＲサイクルにおける増幅のためにそのプライマー対と共に
混合した。ＰＣＲプライマーをｃＤＮＡ合成のために使用し、オリゴｄＴプライ
ムしたｃＤＮＡ合成により加えられる３'の偏りを回避した。各々のプライマー
を用いて分離合成を行うことにより、ｃＤＮＡ中の２つのプライマーの相対的配
向性を無作為化した。これらのｃＤＮＡを、ＰＣＲ増幅のために選択されたプラ
イマーとして同じ組み合せで混合し得る。ＰＣＲ増幅したｃＤＮＡフラグメント
をオートラジオグラフィーのために、６％アクリルアミドゲル上で分離し、そし
て乾燥した。少なくとも２つの腫瘍サンプルにおいて示差的提示されたこれらの
バンドを、切断し、そして再水和しそして親細胞におけるバンドではそれらを行
わなかった。この回収したＤＮＡのアリコート（１／５）を、同じプライマーセ
ットおよび同位体の添加無しである以外は、同じＰＣＲ条件を用いて、再増幅し
た。この第二のＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離し、個々のバンドをβ
アガラーゼ（ａｇａｒａｓｅ）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）とのインキュベーショ
ンにより回収した。回収した各々のＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１／
Ｚｅｏ（＋）ファージミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に平滑末端連結
によりクローンニングした。１つのバンドが１つより多い分子種を含み得ること
が可能であるので、適切なサイズの挿入物を有する、少なくとも４つの異なる形
質転換体を、さらなる特徴付けのために拾い上げる。ノーザン分析（ＲＮａｓｅ
保護アッセイおよび半定量的ＰＣＲ）を、示差的発現を確認するために行った。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１５０】 予備実験において、示差的提示された３つのバンドの平均を、それぞれのプラ
イマー対について同定した。１２の独立したプライマーのすべての可能な組み合
わせから生じた総計６６のプライマー対を用いて、約２００の遺伝子フラグメン
トを同定し得た。いくつかの場合において、複数のフラグメントが、同じ遺伝子
に由来し得る。図７は、任意の十量体（ＭＲ＿１（ＴＡＣ ＡＣＣ ＧＡＧ Ｇ
）（配列番号１１）およびＭＲ＿５（ＧＧＡ ＣＣＡ ＡＧＴ Ｃ）（配列番号
１３））の１つの対で観察されたディファレンシャルディスプレイフラグメント
のパターンを示す。４つすべての腫瘍に関連するが、親細胞に関連しない多くの
バンドを同定し得る。この分布は、腫瘍細胞の免疫原性に関連しない。なぜなら
ば、４つの腫瘍の３つだけが免疫学的に交差反応的であるからである。２、３時
間だけ曝されたノーザンブロットでポジティブな結果を与えたＲＤＡにより同定
される、示差的に発現されたバンドと対照的に、ディファレンシャルディスプレ
イにより同定されたフラグメントは、数日後でさえ、ノーザンブロットにおいて
シグナルを与えなかった。しかし、ディファレンシャルディスプレイフラグメン
トの示差的発現を、ＲＮａｓｅ保護アッセイにより、または配列特異的プライマ
ーを用いた半定量的ＰＣＲにより確認し得る。図８に例を示し、これは、ディフ
ァレンシャルディスプレイバンド９からのクローン９０を用いたＲＮａｓｅ保護
アッセイの結果である。Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋデータベースの登録と十分な相同性
を有しないこの配列は、親Ｂ／ｃ．Ｎではなく、全ての４つの腫瘍株において発
現された。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１７６】
【化１】 ならびに、ＮｏｔＩおよびＡｐａＩの制限部位を含んだ。二本鎖オリゴヌクレオ
チドを、２時間にわたる９４℃から２０℃の勾配によってアニーリングし、そし
て、ｐＪＮｏｔＩ／ｔｋ中に存在するＮｏｔＩ部位、ｖＮｏｔＩ／ｔｋ由来のＨ
ｉｎｄＩＩＩ Ｊフラグメントを含むプラスミドに連結し、プラスミドｐ７．５
／ｔｋおよびプラスミドｐＥＬ／ｔｋを得た。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１７８】
【化２】 を用いて行い、そして得られたフラグメントを、ｐＣＲＩＩにクローニングした
（ＴＡクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。このプラスミドを、Ｎｏ
ｔＩ（ＭＭ４４０／ＭＭ４４２産物）を用いて切り出し、そしてＮｏｔＩを用い
て消化されたｐＪＮｏｔ／ｔｋにクローニングして、ｐＪＮｏｔ／ｔｋ−ＧＵＳ
を生成するか、またはＮｏｔＩおよびＡｐａＩ（ＭＭ４４０／ＭＭ４４１産物）
を用いて切り出し、そしてＡｐａＩおよびＮｏｔＩを用いて以前に消化されたｐ
ＥＬ／ｔｋおよびｐ７．５／ｔｋに挿入して、ｐ７．５／ｔｋ−ＧＵＳおよびｐ
ＥＬ／ｔｋ−ＧＵＳを生成した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８０】
【化３】 二本鎖オリゴヌクレオチドを、２時間にわたる９４℃から２０℃の勾配によっ
てアニーリングし、そして、ｐＪＮｏｔＩ／ｔｋ中に存在するＮｏｔＩ部位、ｖ
ＮｏｔＩ／ｔｋ由来のＨｉｎｄＩＩＩ Ｊフラグメントを含むプラスミドに連結
し、プラスミドｐ７．５／ｔｋ−ｏｖａおよびプラスミドｐＥＬ／ｔｋ−ｏｖａ
を得た。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８４】
【化４】 を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）由来のＤＮＡ産物を、ＡｐａＩおよび
ＮｏｔＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて消化し、
製造業者の推奨に従って、β Ａｇａｒａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて低融点のアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）から、ゲル
精製し、そしてＮｏｔＩおよびＡｐａＩを用いて消化されているｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＫＳ＋にクローニングし、ｐＢＳ．ＶＶｏｖａを産生した。オボアル
ブミンをコードするＤＮＡフラグメントを、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩを用いたこ
のプラスミドの消化により、ｐＢＳ．ＶＶｏｖａから切り出し、そしてβ Ａｇ
ａｒａｓｅを用いた低融点アガロースゲルに通した電気泳動の後に、精製した。
１μｇの精製ｖＥＬ／ｔｋ ＤＮＡを、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し
、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１００濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）に通して遠心し、小
さな介在フラグメントを取り除いた。ｖＥＬ／ｔｋ ＤＮＡアームおよびオボア
ルブミンをコードするＤＮＡフラグメントを、５ユニットのＴ４ ＤＮＡリガー
ゼを含有する３０μｌ中において、４：１（挿入物：ウイルス）モル比で、室温
で一晩連結した。連結産物を、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、１２ウェルプレート由来のコンフルエントなＢ
ＳＣ−１細胞のウェルへ、感染から２時間後に１細胞あたり１ｐｆｕで、鶏痘ウ
イルスを用いてトランスフェクトした。３日後、細胞を収集し、そして単離され
たプラークを、ブロモデオキシウリジンの存在下で、Ｈｕｔｋ−細胞に継代する
ことによって選択した（Ｅａｒｌら、１９９１、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
．Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１８８】
【化５】 を用いて、ＰＣＲ（３０サイクル、１分間９４℃、２分間５５℃、３分間７２℃
、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−１００）に用いた。ヌクレオチド配列を、
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、35Ｓ配列決定により決定し、そして８％
変性ポリアクリルアミドゲルに通した電気泳動後、Ｂｉｏ−Ｍａｘフィルム（Ｋ
ｏｄａｋ）への露光により、可視化した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２１３】 外来ＤＮＡのための挿入部位としてのチミジンキナーゼ遺伝子の使用により、
ヘルパーまたは野生型のゲノムから組換え体を識別するための選択プロトコール
の実行が可能になる。ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋにおけるｔｋ発現のレ
ベルは、ワクシニアＷＲまたはｖＮｏｔ／ｔｋにおいてよりも非常に高いはずで
ある。しかし、ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋにおけるｔｋ遺伝子の開始に
おけるＡｐａＩ部位は、ＮｏｔＩ部位に余分なヌクレオチドを付加することによ
りｖＮｏｔ／ｔｋから形成された。さらなるヌクレオチドは、ｖ７．５／ｔｋ（
配列番号２、アミノ酸１〜７）およびｖＥＬ／ｔｋ（配列番号４、アミノ酸１〜
７）においてＭｅｔ−Ａｓｎ−ＧｌｙからＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙに、野生型ｔｋ遺伝子のＮ末端でアミノ酸配列を増加させ
る。チミジンキナーゼ遺伝子の発現レベルおよびＮ末端アミノ酸配列における改
変は、ブロモデオキシウリジンに対するウイルスの感受性を増加し得る（タンパ
ク質増）か、または低下させ得る（異なる配列）。プラークが、より小さいにも
かかわらず、野生型ワクシニアＷＲについてのプラーク形成を完全に抑制するの
に十分なブロモデオキシウリジンの濃度でのｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋ
感染において、観察された。プラーク形成は、細胞の生存度を妨害しないか、ま
たはｔｋ-ウイルスがプラークを形成する能力を妨げない薬物レベルである５倍
高い濃度のブロモデオキシウリジンで抑制された。ブロモデオキシウリジンに対
する変更された感受性についての説明には、タンパク質のさらなる特徴付けが待
たれる。なぜなら、変更されたチミジンキナーゼ遺伝子は、ブロモデオキシウリ
ジンのトリホスフェート形態の形成に対する異なる反応速度、またはブロモデオ
キシウリジンを結合する能力の低下を有し得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】 ｐ７．５／ｔｋ（配列番号１）およびｐＥＬ／ｔｋ（配列番号３）のヌクレオ
チド配列。ｖ７．５／ｔｋおよびｖＥＬ／ｔｋについてのプロモーターおよびチ
ミジンキナーゼ遺伝子の開始部のヌクレオチド配列。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】 ｐ７．５／ｔｋ（配列番号５）ワクシニア移入プラスミドのヌクレオチド配列
における改変。４つの新規なベクター、ｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋ（配列番号６
）、ｐ７．５／ＡＴＧ１／ｔｋ（配列番号７）、ｐ７．５／ＡＴＧ３／ｔｋ（配
列番号８）、およびｐ７．５／ＡＴＧ４／ｔｋ（配列番号９）は、本文中に記載
されるように、ｐ７．５／ｔｋワクシニア移入プラスミドから誘導された。各ベ
クターは、ＤＮＡインサートをクローニングするための、独特なＢａｍＨＩ、Ｓ
ｍａＩ、ＰｓｔＩ、およびＳａｌＩ部位を含み、これは、それらの内因性の翻訳
開始部位を利用するか（ベクターｐ７．５／ＡＴＧ０／ｔｋにおいて）、または
３つの可能なリーディングフレームのいずれか１つにおけるベクター翻訳開始部
位を利用するか（ｐ７．５／ＡＴＧ１／ｔｋ、ｐ７．５／ＡＴＧ２／ｔｋ、およ
びｐ７．５／ＡＴＧ３／ｔｋ）のいずれかである。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】 親の細胞Ｂ／ｃ．Ｎならびに腫瘍ＢＣＡ３９、ＢＣＡ３４、ＢＣＡ２２、およ
びＢＣＢ１３のｃＤＮＡの改変されたディファレンシャルディスプレイ。親の細
胞および腫瘍細胞のｃＤＮＡのフラグメントを、一対の任意のデカマー、ＭＲ＿
１（ＴＡＣ ＡＡＣ ＧＡＧ Ｇ）（配列番号１１）およびＭＲ＿５（ＧＧＡ
ＣＣＡ ＡＧＴ Ｃ）（配列番号１３）を用いて増幅した。各細胞株について、
第１の鎖のｃＤＮＡ合成を、ＭＲ−１またはＭＲ＿５を用いて別々にプライムし
た。次いで、２つのｃＤＮＡ調製物を、ＭＲ＿１とＭＲ＿５との両方を用いるＰ
ＣＲ増幅についてプールした。４つすべての腫瘍と結合するが、不死化された、
非腫瘍形成性の親の細胞株には結合しない、多くのバンドが同定され得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/12 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｅ 39/395 Ｔ Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/10 31/10 31/12 31/12 35/00 35/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/574 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 DA02 EA03 EA04 GA11 4B063 QA01 QA18 QR80 4B065 AA90X AB01 AC14 BA02 CA24 CA45 4C085 AA03 AA13 AA14 BA09 BA49 BA51 BB01 EE01 GG01 4C087 AA02 BC83 MA01 NA14 ZB26 ZB33 ZB35

Claims (42)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的エピトープを同定するための方法であって、該方法は、
    該標的エピトープを発現する細胞に対して生成された細胞傷害性Ｔ細胞を用いて
    該細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡから生成された発現ライブラリーの生成物をス
    クリーニングして、該標的エピトープを発現するＤＮＡクローンを同定する工程
    を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記標的エピトープがウイルス、真菌またはミコバクテリア
    を用いて感染された細胞に特異的である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記標的エピトープが自己免疫疾患に特異的である、請求項
    １に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記発現ライブラリーが哺乳動物細胞に対して感染性のウイ
    ルスベクターにおいて構築される、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記ウイルスベクターが３分子組換えによって構築される、
    請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記ウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである
    、請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】 腫瘍特異的標的エピトープを同定するための方法であって、
    該方法は、該標的エピトープを発現する腫瘍細胞に対して生成された細胞傷害性
    Ｔ細胞を用いて該腫瘍細胞由来のＤＮＡまたはＲＮＡから生成された発現ライブ
    ラリーの生成物をスクリーニングして、該標的エピトープを発現するＤＮＡクロ
    ーンを同定する工程を包含する、方法。
  8. 【請求項８】 前記細胞傷害性Ｔ細胞が、非腫瘍形成性細胞株由来の腫瘍細
    胞と反応し、そして該非腫瘍形成性細胞株と交差反応しない、請求項７に記載の
    方法。
  9. 【請求項９】 前記細胞傷害性Ｔ細胞が、非腫瘍形成性細胞株で寛容化され
    た動物から誘導され、そして次いで、該非腫瘍形成性細胞株由来の腫瘍細胞で免
    疫される、請求項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記細胞傷害性Ｔ細胞が、同時刺激活性を発現しない非腫
    瘍形成性細胞株で寛容化された動物から誘導され、そして続いて同時刺激活性を
    発現する腫瘍細胞株で刺激される、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記腫瘍細胞において発現された遺伝子が、腫瘍細胞に対
    する活性について評価されるＨＬＡ制限細胞傷害性Ｔ細胞を生成するために使用
    される、請求項７に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記腫瘍細胞が単一の不死化非腫瘍形成性細胞株由来であ
    る、請求項７に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記スクリーニングが、単一の非腫瘍形成性細胞から各々
    独立して由来する腫瘍細胞株のパネル上で実施される、請求項１２に記載の方法
    。
  14. 【請求項１４】 前記発現ライブラリーが哺乳動物細胞に対して感染性のウ
    イルスベクターにおいて構築される、請求項７に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記ウイルスベクターが３分子組換えによって構築される
    、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記ウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターであ
    る、請求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 標的エピトープまたは抗原を同定するための方法であって
    、以下の工程： （ａ）該標的エピトープを発現する細胞によって示差的に発現される遺伝子産物
    に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を提供する工程、および （ｂ）該細胞について該細胞傷害性Ｔ細胞の交差反応性を測定する工程であって
    、ここで、標的エピトープが細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する該遺伝子産物として同
    定される、工程 を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 前記標的エピトープがウイルス、真菌またはミコバクテリ
    アを用いて感染された細胞に特異的である、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記標的エピトープが自己免疫疾患に特異的である、請求
    項１７に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 ＤＮＡフラグメントの分解能を増大し、そして偽陽性の頻
    度を減少する、改変されたディファレンシャルディスプレイ方法が利用される、
    請求項１７に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記ＤＮＡフラグメントを使用して、ファージミドＤＮＡ
    ライブラリーからレスキューされる一本鎖環に対する溶液ハイブリダイゼーショ
    ン後により長い遺伝子産物を単離する工程をさらに包含する、請求項２０に記載
    の方法。
  22. 【請求項２２】 腫瘍特異的標的エピトープまたは抗原を同定するための方
    法であって、以下の工程： （ａ）該標的エピトープを発現する腫瘍細胞によって示差的に発現される遺伝子
    産物に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を提供する工程、および （ｂ）該腫瘍細胞について該細胞傷害性Ｔ細胞の交差反応性を測定する工程であ
    って、ここで、標的エピトープが細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する該遺伝子産物とし
    て同定される、工程 を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 前記腫瘍細胞が単一の不死化非腫瘍形成性細胞株由来であ
    る、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記アッセイが単一の非腫瘍形成性細胞から各々独立して
    由来する腫瘍細胞株のパネル上で実施される、請求項２２に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 腫瘍細胞と反応する前記生成された細胞傷害性Ｔ細胞が、
    非腫瘍形成性Ｔ細胞と反応しない、請求項２２に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ＤＮＡフラグメントの分解能を増大し、そして偽陽性の頻
    度を減少する、改変されたディファレンシャルディスプレイ方法が利用される、
    請求項２２に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記ＤＮＡフラグメントを使用して、ファージミドＤＮＡ
    ライブラリーからレスキューされる一本鎖環に対する溶液ハイブリダイゼーショ
    ン後により長い遺伝子産物を単離する工程をさらに包含する、請求項２６に記載
    の方法。
  28. 【請求項２８】 制限酵素についての固有の部位によって隣接されるＤＮＡ
    インサートを含むウイルスベクターであって、該部位は、該ウイルスベクターア
    ームの再連結が妨げられ、そして該インサートＤＮＡの方向が固定され、そして
    該ＤＮＡインサートが強力な調節性エレメントと作動可能に結合されるように位
    置付けられる、ウイルスベクター。
  29. 【請求項２９】 前記ベクターが３分子組換えによって構築される、請求項
    ２８に記載のウイルスベクター。
  30. 【請求項３０】 前記ウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターであ
    る、請求項２８に記載のウイルスベクター。
  31. 【請求項３１】 前記ベクターがプラスミドｐ７．５／ｔｋ（配列番号 ）
    またはその誘導体を用いる組換えによって誘導される、請求項２８に記載のベク
    ター。
  32. 【請求項３２】 前記ベクターがプラスミドｐＥＬ／ｔｋ（配列番号 ）ま
    たはその誘導体を用いる組換えによって誘導される、請求項２８に記載のベクタ
    ー。
  33. 【請求項３３】 制限酵素についての固有の部位によって隣接されるＤＮＡ
    インサートを含むウイルスベクターであって、該部位は、該ウイルスベクターア
    ームの再連結が妨げられ、そして該インサートＤＮＡの方向が固定され、そして
    該ＤＮＡインサートが強力な調節性エレメントと作動可能に結合されるように位
    置付けられ、ここで、該ＤＮＡインサートが請求項１に記載の方法によって同定
    された標的エピトープをコードする、ウイルスベクター。
  34. 【請求項３４】 制限酵素についての固有の部位によって隣接されるＤＮＡ
    インサートを含むウイルスベクターであって、該部位は、該ウイルスベクターア
    ームの再連結が妨げられ、そして該インサートＤＮＡの方向が固定され、そして
    該ＤＮＡインサートが強力な調節性エレメントと作動可能に結合されるように位
    置付けられ、ここで、該ＤＮＡインサートが請求項７に記載の方法によって同定
    された標的エピトープをコードする、ウイルスベクター。
  35. 【請求項３５】 前記ウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターであ
    る、請求項３３または３４に記載のウイルスベクター。
  36. 【請求項３６】 制限酵素についての固有の部位によって隣接されるＤＮＡ
    インサートを含むワクシニアウイルスベクターであって、該部位は、該ウイルス
    ベクターアームの再連結が妨げられ、そして該インサートＤＮＡの方向が固定さ
    れ、そして該ＤＮＡインサートが強力な調節性エレメントと作動可能に結合され
    るように位置付けられ、ここで、該ＤＮＡインサートが請求項１７に記載の方法
    によって同定された標的エピトープをコードする、ワクシニアウイルスベクター
    。
  37. 【請求項３７】 制限酵素についての固有の部位によって隣接されるＤＮＡ
    インサートを含むワクシニアウイルスベクターであって、該部位は、該ウイルス
    ベクターアームの再連結が妨げられ、そして該インサートＤＮＡの方向が固定さ
    れ、そして該ＤＮＡインサートが強力な調節性エレメントと作動可能に結合され
    るように位置付けられ、ここで、該ＤＮＡインサートが請求項２２に記載の方法
    によって同定された標的エピトープをコードする、ワクシニアウイルスベクター
    。
  38. 【請求項３８】 前記ウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターであ
    る、請求項３６または３７に記載のウイルスベクター。
  39. 【請求項３９】 同時刺激活性を発現しない、非腫瘍形成性細胞株で寛容化
    された、トランスジェニック動物。
  40. 【請求項４０】 同時刺激活性を発現する腫瘍細胞株でさらに刺激される、
    請求項３９に記載のトランスジェニック動物。
  41. 【請求項４１】 請求項３９に記載のトランスジェニック動物に由来する細
    胞傷害性Ｔ細胞。
  42. 【請求項４２】 請求項４０に記載のトランスジェニック動物に由来する細
    胞傷害性Ｔ細胞。
JP2000581183A 1998-11-10 1998-11-10 標的抗原に特異的なｔ細胞ならびにこれに基づく方法およびワクチン Expired - Lifetime JP4451987B2 (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US1998/024029 WO2000028016A1 (en) 1998-11-10 1998-11-10 T cells specific for target antigens and methods and vaccines based thereon

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2002529082A true JP2002529082A (ja) 2002-09-10
JP2002529082A5 JP2002529082A5 (ja) 2006-01-05
JP4451987B2 JP4451987B2 (ja) 2010-04-14

Family

ID=22268281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000581183A Expired - Lifetime JP4451987B2 (ja) 1998-11-10 1998-11-10 標的抗原に特異的なｔ細胞ならびにこれに基づく方法およびワクチン

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1137769B1 (ja)
JP (1) JP4451987B2 (ja)
AT (1) ATE407206T1 (ja)
AU (1) AU776865B2 (ja)
CA (1) CA2350207C (ja)
DE (1) DE69839970D1 (ja)
WO (1) WO2000028016A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014502841A (ja) * 2010-12-21 2014-02-06 マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フェルデルンク デル ヴィッセンシャフテン エー．ファウ． 抗マイコバクテリアのワクチン接種の有効性の判定

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1214407A2 (de) * 1999-09-21 2002-06-19 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Verfahren zur identifizierung von mhc-restringierten antigenen
WO2001064864A2 (en) * 2000-02-28 2001-09-07 Maxygen, Inc. Single-stranded nucleic acid template-mediated recombination and nucleic acid fragment isolation
US7067251B2 (en) 2000-03-28 2006-06-27 University Of Rochester Methods of directly selecting cells expressing inserts of interest
WO2002102855A2 (en) * 2000-11-17 2002-12-27 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
EP1830190A3 (en) * 2000-11-17 2008-07-09 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
AU2007200500A1 (en) * 2000-11-17 2007-03-01 University Of Rochester In Vitro Methods of Producing and Identifying Immunoglobulin Molecules in Eukaryotic Cells
CN101676389A (zh) 2000-11-23 2010-03-24 巴法里安诺迪克有限公司 改良安卡拉痘苗病毒变体
US7445924B2 (en) 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
US7214515B2 (en) 2001-01-05 2007-05-08 The General Hospital Corporation Viral delivery system for infectious transfer of large genomic DNA inserts
GB0102947D0 (en) * 2001-02-06 2001-03-21 Oxford Biomedica Ltd Method
AU2008202554C1 (en) * 2001-02-23 2011-07-07 Dsm Ip Assets B.V. Novel genes encoding novel proteolytic enzymes
AU2002354374A1 (en) 2001-12-04 2003-06-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha CELL PROLIFERATION INHIBITOR CONTAINING ANTI-PepT ANTIBODY
EP1504108B1 (en) 2002-02-01 2013-04-17 Oxford Biomedica (UK) Limited Lentiviral vector
US7666610B2 (en) 2002-03-29 2010-02-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Expressing transporters on viral envelopes
WO2003104453A1 (ja) 2002-06-05 2003-12-18 中外製薬株式会社 抗体作製方法
DK1434858T4 (en) 2002-09-05 2019-04-01 Bavarian Nordic As PROCEDURE FOR AMPLIFICATION OF A POXVIRUS UNDER SERUM-FREE CONDITIONS
US7731960B2 (en) 2003-03-28 2010-06-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies that inhibit transport activity of peptide transporters
US7964767B2 (en) 2004-03-31 2011-06-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Transgenic mice expressing baculovirus soluble GP64 and methods of using such mice to make antibodies
KR101754433B1 (ko) 2009-05-08 2017-07-05 백시넥스 인코포레이티드 항-ｃｄ100 항체 및 이의 사용 방법
ES2669209T3 (es) 2011-10-11 2018-05-24 Vaccinex, Inc. Uso de moléculas de unión a semaforina-4D para la modulación de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica
US9708601B2 (en) 2012-04-26 2017-07-18 Vaccinex, Inc. Fusion proteins to facilitate selection of cells infected with specific immunoglobulin gene recombinant vaccinia virus
US10494440B2 (en) 2012-05-11 2019-12-03 Vaccinex, Inc. Use of semaphorin-4D binding molecules to promote neurogenesis following stroke
EP3656392A1 (en) 2013-06-25 2020-05-27 Vaccinex, Inc. Use of semaphorin-4d inhibitory molecules in combination with an immune modulating therapy to inhibit tumor growth and metastases
NZ630881A (en) 2013-10-10 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treatment of atherosclerosis
NZ630892A (en) 2013-10-21 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treating neurodegenerative disorders
AU2017252427B2 (en) 2016-04-22 2023-07-13 Vaccinex, Inc. Integral membrane protein display on poxvirus extracellular enveloped virions
EP3494131B1 (en) 2016-08-02 2024-09-18 Vaccinex, Inc. Improved methods for producing polynucleotide libraries in vaccinia virus/eukaryotic cells
CN113105527B (zh) * 2020-01-13 2024-04-26 沈阳医健生命科技有限责任公司 一条hla-a2限制性肿瘤相关抗原e蛋白的抗肿瘤优势ctl表位肽及应用
CN111518879B (zh) * 2020-04-24 2021-02-12 上海茂槿生物技术有限公司 一种提高多重pcr扩增文库质量的方法
BR112022022529A2 (pt) 2020-05-06 2023-02-23 Vaccinex Inc Exibição de proteína de membrana integral em vírions envelopados extracelulares de poxvírus

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10501136A (ja) * 1994-06-02 1998-02-03 カイロン コーポレイション ウイルスに基づく感染／トランスフェクションシステムを用いる核酸免疫化
US6080409A (en) * 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
PT879282E (pt) * 1996-01-17 2003-11-28 Imp College Innovations Ltd Imunoterapia utilizando linfocitos t citotoxicos (ctl)
US5792604A (en) * 1996-03-12 1998-08-11 University Of British Columbia Method of identifying MHC-class I restricted antigens endogenously processed by cellular secretory pathway
US5804382A (en) * 1996-05-10 1998-09-08 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for identifying differentially expressed genes and differences between genomic nucleic acid sequences

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014502841A (ja) * 2010-12-21 2014-02-06 マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フェルデルンク デル ヴィッセンシャフテン エー．ファウ． 抗マイコバクテリアのワクチン接種の有効性の判定

Also Published As

Publication number Publication date
AU1397799A (en) 2000-05-29
CA2350207A1 (en) 2000-05-18
EP1137769A1 (en) 2001-10-04
EP1137769B1 (en) 2008-09-03
AU776865B2 (en) 2004-09-23
JP4451987B2 (ja) 2010-04-14
DE69839970D1 (de) 2008-10-16
ATE407206T1 (de) 2008-09-15
CA2350207C (en) 2011-02-08
WO2000028016A1 (en) 2000-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2002529082A (ja) 標的抗原に特異的なｔ細胞ならびにこれに基づく方法およびワクチン
US6706477B2 (en) Methods for producing polynucleotide libraries in vaccinia virus
JP2021525076A (ja) 共有抗原
TW202333779A (zh) 阿爾法病毒新抗原載體
CA2514288C (en) Compositions and methods employing alternative reading frame polypeptides for the treatment of cancer and infectious disease
KR20200058508A (ko) 게놈 편집을 위한 폴리뉴클레오티드, 조성물 및 방법
KR20160102024A (ko) 아데노바이러스 및 상응하는 플라스미드의 제조 방법
JP4900884B2 (ja) 腫瘍抗原
JP2022534282A (ja) 改変アデノウイルス
JP2022512912A (ja) アルファウイルス新生抗原ベクター及びインターフェロン阻害因子
CN113573729A (zh) 前列腺新抗原及其用途
JPH10504702A (ja) 免疫原製剤
CN116438308A (zh) 多表位疫苗盒
JP2002532066A (ja) 鳥類におけるポリヌクレオチドワクチンを用いる抗体の産生
Sundaram et al. A novel multivalent human CTL peptide construct elicits robust cellular immune responses in HLA-A∗ 0201 transgenic mice: implications for HTLV-1 vaccine design
JP2023523413A (ja) 抗原コードカセット
JP2024535855A (ja) Ｋｒａｓネオ抗原療法
US20080138354A1 (en) Cytomegalovirus vaccine
JPWO2020243719A5 (ja)
WO1988002757A1 (en) Hybrid proteins or polypeptides
JP3898009B2 (ja) 多段階差次的クローニング技術と細胞増殖制御遺伝子
TWI856108B (zh) 經修飾之腺病毒
US20240139306A1 (en) Methods and compositions for detecting and producing porcine morbillivirus and vaccines thereof
RU2803566C2 (ru) Неоантигенные векторы на основе альфавируса
Vogel et al. Overlapping palindromic sequences associated with somatic deletion and meiotic recombination of MHC class I genes

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20051107

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20051107

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080716

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20081016

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090828

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20091127

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20100105

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20100129

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130205

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140205

Year of fee payment: 4

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term