JP2002524375A - カルシウムホスファート過飽和溶液の製造方法およびその溶液を利用したカルシウムホスファート結晶薄膜製造方法 - Google Patents

カルシウムホスファート過飽和溶液の製造方法およびその溶液を利用したカルシウムホスファート結晶薄膜製造方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、カルシウムイオンとホスファートイオンの過飽和溶液の製造方法およびその溶液を利用して固体表面上にカルシウムホスファート結晶の薄膜を製造する方法に関する。特に、温度を低くしたり、加えて選択的に適切な緩衝システムを使用することにより、水溶液中でのカルシウムホスファートの沈殿を抑制し、これにより、高濃度のカルシウムイオンとホスファートイオンの過飽和溶液を製造できる。そしてその溶液を利用して、固体表面上に反応性が高く結晶度が低い品質が優秀なカルシウムホスファート結晶薄膜を短時間で製造できる。また、本発明により製造されたカルシウムホスファート結晶薄膜は生体適合性を有し、生物材料として利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、過飽和カルシウムホスファート溶液の製造方法及びその溶液を利用
して固体表面上にカルシウムホスファート結晶薄膜を製造する方法に関するもの
である。
【０００２】 具体的には、温度を低くしたり、加えて選択的に適切な緩衝システムを使用す
ることにより、水溶液内でカルシウムホスファート結晶の沈澱反応を抑制して、
高濃度のカルシウムイオンおよびホスファートイオンの過飽和溶液を製造できる
。このように製造した溶液を利用して、固体表面上に反応性が高く結晶度が低い
品質が優秀なカルシウムホスファート結晶薄膜を短い時間内に製造する方法に関
するものである。
【０００３】
【発明の背景】
カルシウムホスファート結晶は、生体適合性(biocompatibility)があるものと
して知られている。その中でも燐灰石結晶(apatite crystal)は、唯一生体石灰
化組織に存在するものであり(H.-M. Kim et al., j. Bone Miner. Res., 10, 15
89-1601, 1995; 米国特許第5,565,502号明細書; 及び米国特許第5,691,397号明
細書 ),骨の代替物質として使用されてきた。また、燐灰石結晶は、金属で作ら
れた生体材料の表面に燐灰石結晶膜を生成させ、組織との適合性を高めるために
、または、固体粒子としても広く使われてきた(R. G. T. Geesink, Clin. Ortho
p. Relat. Res., 261, 39-58, 1990およびM. G. Dunn and S. H. Maxian, J. Lo
ng Term Effect. Med. Implants, 1, 193-203, 1991)。
【０００４】 今まで、カルシウムホスファート結晶を使うことにより生体適合性を高める目
的で、カルシウムホスファート結晶を形成するためのいろいろなコーティング方
法が開発されたが、特に、チタニウムなどの基質表面に燐灰石膜を塗布する方法
が開発されてきた。その中でも、最も広く使われる方法は、プラズマコーティン
グである。この方法では、高温で燐灰石膜を生成して成長させるために水酸化燐
灰石(hydroxy apatite)を生成する。この水酸化燐灰石は結晶度がとても高く、
大きさが大きいため生体反応性が低い欠点があった。それに、燐灰石結晶の他に
副産物として他の相のカルシウムホスファートやカルシウムオキシドのような物
質も生成するものであると知られている(H. G. Pfaff et al., Properties of H
A-Coatings in 'Bioceramics', vol. 6, eds., P. Ducheyne and D. Christians
en, pp. 419-424, Butterworth-Heinemann Ltd., 1993)．そして、今まで、この
ような副産物が生体適合性にどのような悪い影響を与えるのか、正確に確認され
なければならない。したがって、骨燐灰石結晶と同じように結晶度が低いことに
より生体反応性が好ましく、大きさが小さいことにより反応表面積が広い燐灰石
結晶膜を基質表面に生成する方法の開発が求められてきた。
【０００５】 カルシウムイオン、ホスファートイオン及びヒドロキシルイオンで構成されて
いる純粋な水酸化燐灰石結晶は、長い棒のような構造が並列している化学量論的
な(stoichiometric)結晶で、結晶度が高い。反面、骨や石灰化軟骨組織から分離
された生体結晶(biocrystal)は、非化学量論的な(nonstoichiometric)燐灰石で
あり結晶度が低い(Elliott J. C. In Structure and Chemistry of the Apatite
s and Other Calcium Orthophosphates, Studies in Inorganic Chemistry 18,
Amsterdam: Elsevier, pp 111-190, 1994)。生体結晶は、大きさがとても小さい
薄い板構造のナノクリスタル(骨の場合は長さ27.3×幅15.8nm, 石灰化軟骨組織
の場合は長さ103×幅68nm)であり、比表面積がとても広いため生体結晶の表面の
反応性が高く、代謝活性を示す(H.-M.Kim et al., j. Bone-Miner. Res. 10: 15
89-1601, 1995; Posner A. S. et. al. Skeletal Research: An Experimental A
pproach, Academic Press: New York, pp 167-192, 1979)。
【０００６】 結晶学的な特性が、生体結晶と似た結晶膜を生成するために、カルシウムおよ
びホスファートイオン溶液を使用して、低温で固体表面に結晶膜を直接形成させ
る方法が開発された。しかし、過飽和溶液で自発的に起きる沈殿現象のため、イ
オンを高濃度で維持できず、溶液中の[Ca2+]×[HPO4 2-]の濃度を6mM2より高く維
持することは困難であった(H. B. Wen et al., J. Biomed. Mater. Res., 41,
27-236, 1998)。また、このような低い過飽和濃度では、とても限られた狭い範
囲の温度及び固体表面の条件でだけ固体表面に結晶膜を生成できる。つまり、温
度は、約37℃程度に維持しなければならず、コーティング工程は、表面の条件に
よっては、一ヶ月より長い時間がかかった。温度は、結晶膜の結晶学的特徴を決
定する要素である。また、温度に敏感な生理活性物質を固体上に生成された結晶
にさらにかぶせる場合には、さらに温度を低くしなければならない。したがって
、温度を調節したり、さらに低くしなければならない場合には、上記のような方
法を使用できない。また、大部分の場合において、電荷を帯びた表面だけ、基質
に用いることができた。
【０００７】 本発明者らは、上記の問題点を解決すべく努力の結果、温度を下げたり、それ
に加えて選択的に適切な緩衝システムを選択することにより、水溶液内でカルシ
ウムホスファート結晶の沈殿反応を抑制し、高濃度のカルシウムイオン及びホス
ファートイオンの過飽和溶液を製造でき、このように製造した溶液を利用するこ
とによって、固体表面上に反応性が良く、結晶性が低く品質が優秀なカルシウム
ホスファート結晶薄膜を短い時間内に生成でき、このように生成されたカルシウ
ムホスファート結晶薄膜は、生体適合性を持つということを明らかにして、本発
明を完成した。
【０００８】
【発明の要旨】
本発明目的は、カルシウムイオンとホスファートイオンの濃度を高く維持でき
るカルシウムホスファート過飽和溶液の製造方法を提供することである。本発明
の他の目的は、上記方法によって得た溶液を利用して、固体表面の上に反応性が
良く結晶度が低く、品質が優秀なカルシウムホスファート結晶薄膜を短い時間内
に製造する方法を提供することである。
【０００９】
【詳細な説明】
本発明は、 １） カルシウムホスファート結晶または、カルシウムとホスファートの塩を酸
性溶液に溶かしてカルシウムイオンとホスファートイオンの高濃度溶液を製造す
る段階(段階1)、 ２） 段階1で製造されたカルシウムイオンとホスファートイオンの高濃度酸性
溶液を低い温度で、アルカリ溶液と混合する段階(段階2)、および ３） 溶液中でのさらなる沈殿反応と結晶の成長を抑制するために、段階2で製
造された溶液から、沈殿および結晶成長の核として行動し得る無定型カルシウム
ホスファート微粒子または結晶を除去する段階(段階3) を含むカルシウムイオンとホスファートイオンの濃度を高く維持できる過飽和カ
ルシウムホスファート溶液の製造方法を提供する。
【００１０】 段階2で、低い温度のために溶液内でのカルシウムホスファートの同種沈殿(ho
megeneous nucleation)が抑制され、それによって自由イオンが失われないため
、以後、カルシウムホスファート薄膜形成に使用できる。また、適切な緩衝シス
テムを使用することによってこのような抑制効果は増進される。
【００１１】 本発明の過飽和カルシウムホスファート溶液の製造には、どのような種類のカ
ルシウム塩とホスファート塩でもすべて使用できる。また、本発明では、どんな
種類のカルシウムホスファート結晶でもすべて使用できる。本発明で使用される
カルシウムホスファート結晶は、公知の合成方法によって得ることができる。た
とえば、C. Rey等によって報告されているように(Calcif. Tissue Int., 45,
157-164, 1989; Calcif. Tissue Int解除. 46, 157-164, 1990)Ca(N
O3)2・4H2O を蒸留水に溶かした溶液と(NH4)2HPO4と液体アンモニアを蒸留水に
溶かした溶液を急激に混合して濾過し、凍結乾燥させて燐灰石を得ることができ
る。また、CaCl2・2H2OとKH2PO4を使用して燐灰石を得ることができる。また、
本発明に使用される燐灰石結晶は、骨組織から分離することもできる(H.-M. Ki
m等, J. Bone Miner. Res. 10, 1589-1601, 1995)。合成されたカルシウ
ムホスファート結晶を利用する場合は、溶液内に含まれるイオンの種類を、カル
シウムイオン、ホスファートイオン、炭酸イオン等、結晶を構成するイオンだけ
に制限できるという長所がある。また、石灰化組織を酸性溶液で脱石灰して製造
された溶液を段階2に使用することもできる。
【００１２】 上記カルシウムホスファート結晶を溶解させるために使用される酸性溶液には
、どんな種類の酸も使用できる。たとえば、N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン
-N'-[2-エタンスルホン酸], N-トリス-[ヒドロキシメチル]メチル-2-アミノエ
タンスルホン酸, 1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸, (3-N-モルホリノ)プロ
パンスルホン酸, 酢酸のような一般的な有機酸、HCl, HBr, HI, H2SO4, H3 PO4, HNO3, H2CO3のような無機酸またはこれらの混合物を使用できる。好まし
くは、HClとN-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸]を使
用する。カルシウムホスファート結晶は、アルカリ溶液と混合された溶液状態で
、結晶沈殿物の生成が可能な濃度より多く溶解させる。
【００１３】 無定形のカルシウムホスファート微粒子の析出のために、アルカリ溶液をカル
シウムホスファートが溶解している酸性溶液に加える。このとき溶液内カルシウ
ムホスファートの沈殿反応を抑制し、自由イオンを高濃度で維持させるためには
、両溶液の温度及び反応温度を低く維持しなければならない。好ましくは、0〜3
7℃に維持される。
【００１４】 アルカリ溶液としては、NaOH, KOH, LiOH, Ca(OH)2, Mg(OH)2, NH4OHの
ような一般的な無機塩基、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン、ビス[2-ヒ
ドロキシエチル]アミノトリス［ヒドロキシメチル]メタン、1,3-ビス［トリス(
ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパンのような有機塩基またはこれらの混合
物を使用できる。このとき有機緩衝剤を、求めるpH範囲によってまた各緩衝剤の
緩衝範囲を考慮して選択する。また、過飽和カルシウムホスファートイオン溶液
の製造が可能な境界になる温度は、無機塩基を使用するときより有機塩基を使用
するときがより高いかも知れない。
【００１５】 このアルカリ溶液は、混合溶液のpHが6.0〜8.0、好ましくは、7.0〜7.6になる
ように添加する。カルシウムホスファート結晶は、pHによって、生成される結晶
学的特性が変化する。したがって、 pHを調整することによって求める型の結晶
を得ることができる。ジカルシウムホスファート二水和物の結晶を製造するため
の過飽和溶液のpHは6.0〜6.5に、オクタカルシウムホスファートの結晶を製造す
るための過飽和水溶液のpHは6.5〜6.8に、また生体材料とし広く使用されている
燐灰石結晶膜を製造するためにはpHを6.8〜8.0にそれぞれ調節する。
【００１６】 その次に、上記溶液を使用して均一な表面を持った燐灰石膜を得るためには、
溶液内に生成された無定形カルシウムホスファート微粒子を除去しておくことが
好ましい。アルカリ溶液で中和した溶液に含まれる無定形カルシウムホスファー
ト微粒子は、通常の濾過法や遠心分離法で除去できる。濾過法を実行すれば、溶
液内の病原菌も同時に除去できるため、後でさらに滅菌する必要がない。
【００１７】 本発明によって製造された過飽和カルシウムホスファート溶液のイオン濃度は
、反応条件によって、6.0〜30.0 mM2 [Ca2+]×[HPO4 2-]である。溶液のイオン
濃度が同種沈殿が生じる程度に十分に高い場合であっても、前記工程の温度を下
げることによって溶液内の沈殿または結晶の生成は抑制される。しかし、この溶
液を固体表面と接触させると、このような沈殿抑制効果を越えて異種沈殿(heter
ogeneous nucleation)により表面に結晶が生成し付着し成長し得る。
【００１８】 さらにこの溶液内の自由イオン濃度はとても高いため、低い温度でも異種沈殿
によってたやすく結晶が生成し得る。また、電荷量が小さい表面状態と同様に高
いエネルギーが必要な条件下においても異種沈殿によって、たやすく結晶が生成
され得る。その結果、今まで開発された方法では結晶を生成させられなかった条
件下でもいろいろな材料の表面にカルシウムホスファート結晶膜を形成すること
ができる。
【００１９】 また本発明は、 １） カルシウムホスファート結晶またはカルシウム塩とホスファート塩を酸性
溶液に溶かして、カルシウムイオンとホスファートイオンとの高濃度溶液を製造
する段階(段階1)、 ２） 段階1で製造されたカルシウムイオンとホスファートイオンの高濃度酸性
溶液を低い温度で、アルカリ溶液と混合する段階(段階2)、 ３） 段階2で製造された溶液から、沈殿および結晶成長の核として行動し得る
無定形カルシウムホスファート微粒子または結晶を、溶液中でのさらなる沈殿と
結晶の成長を抑えるために除去する段階(段階3)、および ４）段階3で製造された溶液を固体表面に適用し、カルシウムホスファート結晶
の薄膜を製造する段階(段階4) からなるカルシウムホスファート薄膜の製造方法を提供する。
【００２０】 カルシウムホスファート結晶の薄膜は、カルシウムイオンとホスファートイオ
ンの前記過飽和溶液を固体表面に接触させ、それを培養することによって製造で
きる。
【００２１】 段階4での薄膜形成時の温度は0〜60℃であり、好ましくは固体表面に結晶が形
成される初期段階では0〜37℃にし、その後この結晶を増殖および成熟させる段
階では0〜60℃である。結晶形成の初期段階、増殖段階および成熟段階の反応時
間は、反応条件および固体表面の種類によって変わることがある。
【００２２】 結晶膜を形成する表面は、金属、セラミック、有機ポリマー、ガラス、動物や
植物の生体組織表面などの材料の表面が含まれる。たとえば、前記溶液は、骨の
成長のための核を提供するだけではなく、薬物および細胞運搬に使用されている
ポリグリコール酸、ポリラクト酸、ポリ(ラクティン-グリコール酸)共重合体等
の多孔性ポリマーに適用しカルシウムホスファート燐灰石薄膜を製造するのに利
用することもできる。
【００２３】 また、固体基質に使われる物質の幾何学的構造も制限がない。したがって、平
板形、円筒形、立方体、円錐形、角柱またはこれらの複合形状など多様な構造が
カルシウムホスファート薄膜を生成するための基質として使用できる。また、そ
の固体表面は、電荷を帯びたものだけではなく電荷を帯びていないものでもよい
。
【００２４】 本発明によって製造される過飽和のカルシウムイオンとホスファートイオンの
溶液は、温度を下げることによって非常に高濃縮できる。低い温度は、カルシウ
ムホスファートの同種沈殿を抑制する。高濃縮された溶液は、適当な緩衝システ
ム、たとえて言うなら、適当な酸性またはアルカリ性溶液を使用することによっ
てさらに安定化できる。
【００２５】 特に、本発明の高濃縮されたカルシウムホスファートの過飽和溶液の濃度は、
以前の技術と比較するととても高く、カルシウムホスファート結晶の薄膜を金属
、セラミック、有機高分子、ガラス、動物や植物の組織のような物体のどんな表
面にも早く生成することが可能である。また、上記の溶液を使用することによっ
て0〜60℃という低い温度においても結晶の薄膜を表面に形成できる。あわせて
、前記溶液を使用して製造されたカルシウムホスファートの薄膜は、繊維芽細胞
, 骨芽細胞, 破骨細胞, 歯根細胞などの、色々な細胞をその表面に付着させ
増殖することができるという生体適応性があり、生体物質に応用できる可能性も
持っている。
【００２６】
【実施例】
実際的で、望ましい本発明の実施例を下記に記述する。
【００２７】 ただし、下記の実施例は、本発明を例示する為だけのものであり、本発明の内
容が実施例によって限定されるものではなく、本発明の範囲内で変更したり向上
させることができる。 <実施例1> 過飽和カルシウムホスファート溶液１の製造 Ca(NO3)2・4H2O 17.7mgを蒸留水250mlに溶かした溶液と(NH4)2HPO4 40mgと液
体アンモニア1mlを蒸留水500mlに溶かした溶液を急激に混合し濾過し、凍結乾燥
させて燐灰石結晶を合成した。燐灰石結晶400mgを0.2 MのHCl 40mlに溶解しカル
シウムホスファートイオンを含む酸性イオン溶液を製造した。この酸性溶液を0.
2 MのHClで稀釈してカルシウムホスファートの濃度が15%になるようにした。前
記溶液を0.2 NのNaOHと混合し撹拌してpH7.4のイオン溶液を製造した。前記のす
べての溶液の温度は、4℃に維持した。このとき無定形カルシウムホスファート
が急激に生成されたが、温度を低くしたため無定形カルシウムホスファート微粒
子の生成に参与しなかった自由イオンが残っており、析出した結晶の量は、ゆっ
くりと減少し、平衡になった。この溶液を4℃で10分間放置後、0.2mmのフィルタ
ーを使用し生成した無定形カルシウムホスファート微粒子を除去し、中和された
緩衝溶液(neutralized ionic buffer solution)を製造した。
【００２８】 製造された溶液は、原子吸収スペクトル法(Perkin Elmer, 米国)と測色法によ
り、イオンの濃度が15〜20 mM2[Ca2+]×[HPO4 2-]であり、過飽和溶液であること
が確認できた。
【００２９】 このようにして得られた過飽和溶液は、使用するまで4℃で保管した。 <実施例2> 過飽和カルシウムホスファート溶液２の製造 0.2 NのNaOH溶液の代わりに0.2 Mトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタンを使
用してアルカリ溶液を製造し、これを使ってpH7.4のトリス-HCl緩衝溶液を製造
すること以外は、実施例1と同じ条件でカルシウムホスファート溶液を製造した
。
【００３０】 製造された溶液は、原子吸収スペクトル法(Perkin Elmer, 米国)と測色法によ
り、イオンの濃度が15〜20 mM2[Ca2+]×[HPO4 2-]であり、過飽和溶液であること
が確認できた。
【００３１】 このようにして得られた過飽和溶液は、使用するまで4℃で保管した。 <実施例3> 過飽和カルシウムホスファート溶液３の製造 酸性溶液の種類を代えること以外は、実施例1と同じ条件でカルシウムホスフ
ァート溶液を製造した。
【００３２】 酸性溶液には、HClの代わりに、N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エ
タンスルホン酸]とHClを使用して製造した。0.1 NのHCl溶液を 0.2 MのN-[2-ヒ
ドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸]溶液に添加して、N-[2-ヒ
ドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸]溶液のpHは、常に4.0に維
持した。カルシウムイオンとホスファートイオンを含む酸性溶液は、0.2 NのNaO
H溶液と混合し撹拌して pH7.4のヘペス(Hepes)緩衝溶液を製造した。
【００３３】 製造された溶液は、原子吸収スペクトル法(Perkin Elmer, 米国)と測色法によ
り、イオンの濃度が15〜20 mM2[Ca2+]×[HPO4 2-]であり、過飽和溶液であること
が確認できた。 このようにして得られた過飽和溶液は、使用するまで4℃で保管した。 <実施例4> 過飽和カルシウムホスファート溶液４の製造 CaCl2・2H2O 93mgとKH2PO4 52mgを直接0.2 MのHCl溶液75mlに直接溶かすこと
を除けば、実施例1と同じ条件でカルシウムホスファート溶液を製造した。
【００３４】 製造された溶液は、原子吸収スペクトル法(Perkin Elmer, 米国)と測色法によ
り、イオンの濃度が15〜20 mM2[Ca2+]×[HPO4 2-]であり、過飽和溶液であること
が確認できた。
【００３５】 このようにして得られた過飽和溶液は、使用するまで4℃で保管した。 <実施例5> 過飽和カルシウムホスファート溶液５の製造 0.2 NのNaOHの代わりに0.2 Mトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタンを使用し
てアルカリ溶液を製造し、これを使ってpH7.4のトリス-HCl緩衝溶液を製造しす
ること以外は、実施例4と同じ条件でカルシウムホスファート溶液を製造した。
【００３６】 製造された溶液は、原子吸収スペクトル法(Perkin Elmer, 米国)と測色法によ
りで測定した結果、イオンの濃度が15〜20 mM2[Ca2+]×[HPO4 2-]であり、過飽和
溶液であることが確認できた。 このようにして得られた過飽和溶液は、使用するまで4℃で保管した。 <実施例6> 過飽和カルシウムホスファート溶液６の製造 酸性溶液の種類を代えること以外は、実施例4と同じ条件でカルシウムホスフ
ァート溶液を製造した。
【００３７】 酸性溶液には、HClの代わりに、N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エ
タンスルホン酸]とHClを使用して製造した。0.1 NのHCl溶液を 0.2 MのN-[2-ヒ
ドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸]溶液に添加して、N-[2-ヒ
ドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸]溶液のpHは、常に4.0に維
持した。カルシウムイオンとホスファートイオンを含む酸性溶液は、0.2 NのNaO
H溶液と混合し撹拌して pH7.4のヘペス緩衝溶液を製造した。
【００３８】 製造された溶液は、原子吸収スペクトル法(Perkin Elmer, 米国)と測色法によ
り、イオンの濃度が15〜20 mM2[Ca2+]×[HPO4 2-]であり、過飽和溶液であること
が確認できた。
【００３９】 このようにして得られた過飽和溶液は、使用するまで4℃で保管した。 <実施例7> 燐灰石１の薄膜の製造 実施例1で製造した過飽和溶液を培養皿(Corning, 米国)に注いだ後、8℃に維
持された恒温槽に2時間置いた。その後、温度を20℃まで上げてこの温度で24時
間さらに放置して薄膜を生成させた。
【００４０】 カルシウムホスファート燐灰石結晶で構成された薄膜は、走査電子顕微鏡(SEM
) (840A, JEOL, 日本)で観察した。表面を10,000倍に拡大したSEM写真を図1に示
す。図1から分かるように本発明の方法によって製造された燐灰石薄膜は、結晶
の大きさが均一であり安定した構造を持っていた。培養皿の上に生成された結晶
の大きさは、長さが16.7±3.7nm、幅が12.2±2.4nm(n=50)であった。
【００４１】 培養皿の表面から掻出した結晶を掻出し、100mA、50kVでパウダーX線回折(XRD
)(MXP18, Mac Science, 日本)により分析した。その結果、薄膜には燐灰石以外
の他の層のカルシウムホスファート結晶はなく、この燐灰石結晶は、骨結晶と類
似して低い結晶度を持っているということが分かった(表1参照)。このように結
晶の大きさが極度に小さくなることによって比表面積が広くなり、それによって
燐灰石結晶の表面の反応性が高くなり、細胞または有機環境下で高い相互作用が
可能になった。
【００４２】
【表１】
【００４３】 <実施例8〜12> 燐灰石２〜６の薄膜の製造 実施例2〜6で製造した溶液を使用して、実施例7と同じ条件でそれぞれ燐灰石
薄膜を製造した。
【００４４】 このように製造された燐灰石薄膜のSEM写真は、実施例7で製造された薄膜のSE
M写真と類似していた。つまり、製造された燐灰石薄膜の結晶の大きさは均一で
安定した構造を持っていた。 <実施例13> 燐灰石１の薄膜の製造および生体適合性試験 培養皿の代わりにポリラクチン910 (vicryl)繊維を使用することを除けば、実
施例7と同じ条件で燐灰石薄膜を製造した。その後、燐灰石薄膜が形成されたそ
の繊維を繊維芽細胞L929(ATCC NCTC clone 929)培養液内に入れて、空気95%と二
酸化炭素5%を供給するCO2恒温槽中、37℃で培養した。3日後この繊維をSEM(×1,
300)で観察した。
【００４５】 図2に示されるように、細胞がカルシウムホスファート燐灰石の薄膜上に均一
で安定に付着し、増殖した。その結果、本発明によって製造されるカルシウムホ
スファート燐灰石薄膜は、生体適合性があることが確認できた。 <実施例14〜18> 燐灰石２〜６の薄膜の製造および生体適合性試験 実施例2〜6で製造した溶液を使用して、実施例13と同じ条件でそれぞれ燐灰石
薄膜を製造した。その後、上記燐灰石薄膜上に実施例13と同じ条件で繊維芽細胞
を培養した。
【００４６】 このように製造された燐灰石薄膜のSEM写真は、実施例13で製造された薄膜のS
EM写真と類似していた。つまり、細胞がカルシウムホスファート燐灰石の薄膜上
に均一で安定に付着し、増殖した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明によって製造された燐灰石結晶薄膜の走査電子顕微鏡(SEM
)の写真(×10,000)を示したものである。
【図２】 繊維表面に形成された本発明の燐灰石結晶薄膜上で培養された細
胞の走査電子顕微鏡写真(×1,300)を示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＮ，ＪＰ，Ｕ Ｓ (72)発明者 コ，ジェ−セウン 大韓民国、137−069 ソウル、セオチョー −ク、バンバエ・ボン−ドン、787−２、 ナンバー・17−３ (72)発明者 キム，ヨーン−ジィ 大韓民国、137−030 ソウル、セオチョー −ク、ジャムウォン−ドン、ハンシン・ナ インティーンス・アパートメント、ナンバ ー・330−607 (72)発明者 パーク，ソー−ジン 大韓民国、156−011 ソウル、ドンジャク −ク、シンダエバン・１−ドン、598、ナ ンバー・15−３ Ｆターム(参考） 4C081 AB01 BA13 CF011 DA02 DC03 EA05 EA06 EA12

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 1) カルシウムホスファート結晶または、カルシウムとホス
    ファートの塩を酸性溶液に溶かしてカルシウムイオンとホスファートイオンの高
    濃度溶液を製造する段階(段階1)、 2) 段階1で製造されたカルシウムイオンとホスファートイオンの高濃度酸性溶液
    を低い温度で、アルカリ溶液と混合する段階(段階2)、および 3) 溶液中でのさらなる沈殿反応と結晶の成長を抑制するために、段階2で製造さ
    れた溶液から、沈殿および結晶成長の核として行動し得る無定形カルシウムホス
    ファート微粒子または結晶を除去する段階(段階3) を含むカルシウムイオンとホスファートイオンの濃度を高く維持できる過飽和カ
    ルシウムホスファート溶液の製造方法。
  2. 【請求項２】 酸性溶液の温度、アルカリ溶液の温度および段階2の反応温
    度は、0〜37℃であることを特徴とする請求項１記載の過飽和カルシウムホスフ
    ァート溶液の製造方法。
  3. 【請求項３】 段階1の酸性溶液は、無機酸、有機酸またはそれらの混合物
    を使用して製造することを特徴とする請求項１記載の過飽和カルシウムホスファ
    ート溶液の製造方法。
  4. 【請求項４】 無機酸は、HCl, HBr, HI, H2SO4, H3PO4, HNO3およびH2CO3
    からなる群より選ばれ、有機酸は、N-[2-ヒドロキシエチル]ピペラジン-N'-[2-
    エタンスルホン酸]、N-トリス-[ヒドロキシメチル]メチル-2-アミノエタンスル
    ホン酸、1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸、(3-N-モルホリノ)プロパンスルホ
    ン酸および酢酸からなる群より選ばれることを特徴とする請求項３記載の過飽和
    カルシウムホスファート溶液の製造方法。
  5. 【請求項５】 段階2のアルカリ溶液は、無機塩基、有機塩基またはそれら
    の混合物を使用して製造することを特徴とする請求項１記載の過飽和カルシウム
    ホスファート溶液の製造方法。
  6. 【請求項６】 無機塩基は、NaOH, KOH, LiOH, Ca(OH)2, Mg(OH)2およびNH4 OHからなる群より選ばれ、有機塩基は、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン
    、ビス[2-ヒドロキシエチル]アミノトリス［ヒドロキシメチル]メタンおよび1,3
    -ビス［トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパンからなる群より選ばれ
    ることを特徴とする請求項５記載の過飽和カルシウムホスファート溶液の製造方
    法。
  7. 【請求項７】 段階2の溶液のpHは、アルカリ溶液を添加することにより6.0
    〜8.0とすることを特徴とする請求項１記載の過飽和カルシウムホスファート溶
    液の製造方法。
  8. 【請求項８】 段階3の無定形カルシウムホスファート微粒子または結晶は
    、多孔質フィルターによる濾過または遠心分離で除去することを特徴とする請求
    項１記載の過飽和カルシウムホスファート溶液の製造方法。
  9. 【請求項９】 請求項１記載の方法により製造された過飽和カルシウムホス
    ファート溶液を使用し、固体表面にコーティングすることを特徴とするカルシウ
    ムホスファート結晶薄膜の製造方法。
  10. 【請求項１０】 温度は、0〜60℃であることを特徴とする請求項９記載の
    カルシウムホスファート結晶薄膜の製造方法。
  11. 【請求項１１】 結晶形成の初期段階温度は、0〜37℃であり、結晶の増殖
    および成熟段階の温度は、0〜60℃であることを特徴とする請求項１０記載のカ
    ルシウムホスファート結晶薄膜の製造方法。
  12. 【請求項１２】 固体表面は、電荷を帯びまたは電荷を帯びていないことを
    特徴とする請求項９記載のカルシウムホスファート結晶薄膜の製造方法。
  13. 【請求項１３】 固体表面は、金属、セラミックス、有機高分子、ガラス、
    動物または植物の生体組織からなる群より選ばれる材料の表面であることを特徴
    とする請求項９記載のカルシウムホスファート結晶薄膜の製造方法。
  14. 【請求項１４】 請求項９記載の方法によって製造されるカルシウムホスフ
    ァート結晶薄膜。
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