KR20030070713A

KR20030070713A - 고형표면의 칼슘포스페이트 결정박막 형성방법

Info

Publication number: KR20030070713A
Application number: KR1020020010227A
Authority: KR
Inventors: 김현만; 고재승
Original assignee: 김현만
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2003-09-02

Abstract

본 발명은 고형표면의 칼슘포스페이트 결정박막 형성방법에 관한 것으로, 구체적으로 고형물질의 표면을 소수성 도메인(domain)과 친수성 도메인을 함께 갖는 유기물질로 이루어진 코팅제로 코팅한 후 그 위에 과포화 칼슘포스페이트 용액을 이용하여 칼슘포스페이트 결정박막을 형성시키는 것으로 이루어진 칼슘포스페이트 결정박막 형성방법에 관한 것으로, 종래 고형물질의 표면에 칼슘포스페이트 결정박막 형성에 비해 짧은 시간에 결정박막을 형성할 수 있으며, 칼슘포스페이트 결정박막의 형성이 어려운 소수성 표면에 칼슘포스페이트 결정박막을 용이하게 형성시킬 수 있어 생체 적합성이 우수한 생체물질의 제조에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

고형표면의 칼슘포스페이트 결정박막 형성방법{METHOD FOR PREPARING THIN FILM OF CALCIUM PHOSPHATE CRYSTALS ON THE SOLID SURFACES}

본 발명은 고형표면의 칼슘포스페이트 결정박막 형성방법에 관한 것으로, 구체적으로 고형물질의 표면을 소수성 도메인(domain)과 친수성 도메인을 함께 갖는 유기물질로 이루어진 코팅제로 코팅시킨 후 그 위에 과포화 칼슘포스페이트 용액을 이용하여 칼슘포스페이트 결정박막을 형성시키는 것으로 이루어진 칼슘포스페이트 결정박막 형성방법에 관한 것이다.

칼슘포스페이트 결정(calcium phosphate crystal)은 생체적합성(biocompatibility)이 있으며 그 중에도 인회석 결정(apatite crystal)은 유일하게 생체 석회화 조직에 존재하는 것으로서, 주로 뼈 대체 물질로 사용되어 왔다(H.-M. Kimet al., J. Bone-Miner. Res.10., 1589∼1601(1995); 미합중국특허 제5,565,502호; 미합중국특허 제5,691,397호). 또한 인회석 결정은 티타늄과 같은 금속 등으로 만들어진 생체 재료의 표면에 인회석 결정 막을 형성시키고 조직과 접촉시켜 조직의 적합성을 높이기 위해서 또는 고체 입자로서도 널리 사용되어 왔다(R. G. T. Geesink,Clin. Orthop. Relat. Res.261, 39∼58(1990); M. G. Dunn and S. H. Maxian,J. Long Term Effect. Med. Implants, 1, 193∼203(1991)).

한편, 생체재료로 널리 쓰이는 대부분의 폴리머 표면은 소수성이어서 세포가 부착되기 어려우며 이를 해결하기 위해 세포가 부착되기 쉽도록 소수성 표면에 새로운 반응기를 형성시켜 세포 부착이 쉽게 일어나도록하는 방법이 개발되어왔다. 그러나 새로운 반응기들을 표면에 생성시키는 방법은 반응기의 생체안전성을 검증해야하는 문제가 있다.

또한, 세포가 부착되기 쉽도록 하기 위해 소수성 표면에 생체안정성과 반응성이 높은 칼슘포스페이트 결정박막을 형성시키는 방법이 개발되었다. 그러나 소수성 고형물질의 표면은 반응성이 낮아 칼슘포스페이트 결정박막을 형성시키기 어렵다. 이에 칼슘포스페이트 결정박막을 소수성 표면에 용이하게 형성하는 방법을 개발할 필요성이 요구되어 왔다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 연구한 결과, 소수성 표면에 부착력이 높은 유기물질로 이루어진 코팅제를 우선 소수성 표면에 코팅한 후 그 위에 과포화된 칼슘포스페이트 용액을 이용하여 칼슘포스페이트 결정박막을 용이하게 형성시킬 수 있음을 발견하였으며, 상기 방법이 칼슘포스페이트 결정방막의 형성이 어려운 소수성 표면에 칼슘포스페이트 결정박막을 짧은 시간에 형성할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 고형물질 표면에 칼슘포스페이트 결정박막을 형성시키는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 결정박막 형성방법에 의해 얻어진 칼슘포스페이트 결정박막을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 의해 제조된 인회석 결정(apatite crystal)박막을 나타낸 주사전자현미경(SEM) 사진(×5,000)이며,

도 2는 소수성 폴리스틸렌(polystylene) 표면에 MG63 세포가 부착되지 못함을 보여주는 위상차현미경(Phase Contrast Microscope) 사진(×100)이며,

도 3은 소수성 폴리스틸렌 표면에 본 발명에 의해 형성된 인회석 결정박막 위에 부착된 MG63 세포를 보여주는 위상차현미경 사진(×100)이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 고형물질 표면에 칼슘포스페이트 결정박막을 형성하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 결정박막 형성방법에 의해 얻어진 칼슘포스페이트 결정박막을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 고형물질 표면에 칼슘포스페이트 결정박막을 형성하는 방법을 포함한다. 구체적으로, 고형물질의 표면에 고형표면에 부착되어 박막형성을 촉진하는 유기물질로 이루어진 코팅제를 코팅한 후 과포화 칼슘포스페이트 용액을 접촉시키고 이를 배양하여 칼슘포스페이트 결정박막을 형성시키는 것으로 이루어진 칼슘포스페이트 결정박막 형성방법을 포함한다.

상기 유기물질로 이루어진 코팅제는 소수성 도메인과 친수성 도메인을 함께 갖는 구조를 가지며, 고형표면에 부착되어 소수성 표면과 칼슘포스페이트를 연결시켜주는 링커(linker)로 작용하여 박막형성을 촉진하며 인체에 면역반응을 일으키지 않는 것을 사용한다. 바람직하게 알부민을 사용한다.

고형물질의 표면에 유기물질로 이루어진 코팅제 코팅시, 코팅제의 농도는 고형물질 및 코팅제의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 알부민 코팅시 알부민의 농도는 0.05∼1 %가 바람직하다. 알부민의 농도가 0.05 %이하일 경우, 알부민 코팅을 통한 효과를 나타낼 수 없으며, 농도가 1 %이상일 경우, 이론상 표면 부착이 포화부착될 뿐 알부민을 더욱 첨가함에 따른 효과를 상승을 볼 수 없어 경제적인 손실을 가지게 된다. 또한, 반응온도 및 반응시간은 고형물질 및 코팅제에 따라 달라지며, 반응 온도 및 반응 시간에 따라 달리질 수 있다. 바람직하게 알부민의 경우, 반응 온도는 4∼37℃이며, 반응 시간은 4℃에서 12∼16시간 또는 37℃에서 1∼3시간이다.

상기 코팅제가 코팅된 고형물질의 표면에 과포화 칼슘포스페이트 용액을 접촉시키고 이를 배양하여 나노 칼슘포스페이트 결정박막을 형성한다. 상기 과포화 칼슘포스페이트 용액은 통상적인 방법으로 제조할 수 있으며, 일예로 Ca(NO₃)₂·4H₂O 수용액과 암모니아수를 포함한 (NH₄)₂·HPO₄증류수에 녹인 용액을 혼합한 후 냉동 건조시켜 인회석 결정을 제조하고, 제조된 인회석 결정을 HCl에 용해시켜 칼슘이온과 포스페이트이온을 포함하는 산성 이온용액을 제조하였다. 상기 산성이온 용액을 HCl 용액으로 희석하여 칼슘포스페이트의 농도를 적절히 조절한 후 PBS 및 NaOH 용액과 혼합하고 교반하여 pH 7.6의 이온용액을 제조하고 4℃로 유지한다. 상기 이온용액에서 생성된 무형 칼슘포스페이트를 제거하여 중화 이온완충용액(neutralized ionic buffer solution)의 과포화 칼슘포스페이트 용액을 제조한다.

상기 배양온도는 배양시간에 다양하게 수행할 수 있으며, 바람직하게는 4∼60℃가 바람직하다. 또한 결정 박막이 형성되는 단계의 반응 시간은 구체적인 반응 조건 및 고체 표면의 종류에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 결정박막 형성방법을 적용하여 결정박막을 형성시킬 수 있는 고형표면은 소수성 유기 폴리머를 비롯하여 금속, 세라믹, 유리, 동물이나 식물의 생체 조직 표면 등의 다양한 표면이 포함된다. 예를 들어, 상기 방법은 세포 부착을 위한 골격을 제공할 뿐만 아니라 약물 운반에 사용되고 있는 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리락트산(polylactic acid), 폴리(락틴-글리콜산) 공중합체 등의 폴리머에 적용하며 그 위에 칼슘포스페이트 인회석 결정 박막을 제조하는데 이용할 수도 있다.

또한, 고형 물질의 기하학적 모양에도 제한이 없다. 따라서 평판형, 원통형, 입방체, 원뿔, 각주 또는 이들의 복합 형상 등 다양한 구조가 칼슘포스페이트 결정반점을 형성하기 위한 고형물질로 사용될 수 있다. 또한 상기 고형물질의 표면은 전하를 띠지 않은 것일 뿐만 아니라 전하를 띤 것을 사용할 수 있다.

또한, 소수성 유기폴리머, 고분자 생체물질, 금속, 세라믹, 유리 또는 동물이나 식물의 생체 조직의 고형물질 표면에 유기물질로 이루어진 코팅층이 형성되고, 상기 코팅층 위에 칼슘포스페이트 인회석 결정박막이 형성된 것을 특징으로 하는 생체대체물질을 포함한다. 바람직하게는 상기 칼슘포스페이트 결정박막 형성방법에 의해 제조된 나노 칼슘포스페이트 인회석 결정박막을 포함한다.

상기 결정박막 형성방법에 의해 형성된 나노 칼슘포스페이트 인회석 결정박막은도 1에서 보는 바와 같이, 인회석 박막이 결정의 크기가 균일하고 세포가 부착될 수 있도록 고밀도로 형성된 안정한 구조를 가지고 있으며, 결정을 분쇄하여 FT-IR(Perkin Elmer, 미국)로 분석한 결과 인회석 이외에는 다른 종류의 칼슘포스페이트 결정이 나타나지 않음을 알 수 있다. 또한 소수성 표면에 세포가 잘 부착되지 못하는 것(도 2참조)과는 달리도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 나노 칼슘포스페이트 인회석 결정 고밀도 박막은 세포가 결정박막위에 안정하고 쉽게 부착될 수 있어 고밀도로 형성된 것과 생체적합성이 있음을 나타내고 있다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세하게 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<제조예 1> 과포화 칼슘포스페이트 용액의 제조

Ca(NO₃)₂·4H₂O 17.7 ㎎을 증류수 250 ㎖에 녹인 용액과 (NH₄)₂·HPO₄40 ㎎과암모니아수 1 ㎖를 증류수 500 ㎖에 녹인 용액을 급속히 혼합하여 여과한 후 냉동 건조시켜 인회석 결정을 제조하였다. 제조된 인회석 결정 400 ㎎을 0.2 M HCl 40 ㎖에 용해시켜 칼슘이온과 포스페이트이온을 포함하는 산성 이온용액을 제조하였다. 상기 산성이온 용액을 0.2 M HCl 용액으로 희석하여 칼슘포스페이트의 농도가 30%가 되도록 하였다. 상기 용액을 PBS로 1:1.7(w/w) 희석한 후 PBS로 1:1.7(w/w) 희석한 0.2 N NaOH 용액과 혼합하고 교반하여 pH 7.6의 이온용액을 제조하였다. 상기에서 모든 용액의 온도는 4℃로 유지하였다. 상기 이온용액을 4℃에서 10 분간 방치한 후, 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 생성된 무형 칼슘포스페이트를 제거하여 중화 이온완충용액(neutralized ionic buffer solution)을 제조하였다. 얻어진 과포화 용액은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

<실시예 1> 칼슘포스페이트 인회석 결정박막의 제조 1

폴리스틸렌(polystylene)조각을 1 % 알부민용액에 담그고 37℃에서 1 시간동안 방치하여 코팅하였다. 이후 코팅되지 않은 알부민을 증류수를 이용하여 수세하였다.

상기 제조예 1에서 제조된 알부민 코팅된 폴리스틸렌에 과포화 칼슘포스페이트 용액을 부은 후 37℃로 유지되는 항온조에 30분간 방치하여 박막을 형성시켰다.

<실시예 2> 칼슘포스페이트 인회석 결정박막의 제조 2

폴리스틸렌(polystylene)조각을 1 % 알부민용액에 담그고 4℃에서 12 시간동안 방치하여 코팅한 것을 제외하고 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 박막을 형성시켰다.

<실시예 3> 칼슘포스페이트 인회석 결정박막의 제조 3

폴리스틸렌(polystylene)조각을 0.25 % 알부민용액에 담그고 37℃에서 3시간동안 방치하여 코팅한 것을 제외하고 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 박막을 형성시켰다.

<실험예 1> 나노칼슘포스페이트 인회석 결정박막의 관찰

상기 실시예 1에서 제조된 칼슘포스페이트 인회석결정으로 구성된 박막을 주사전자현미경(SEM; 840A, JEOL, 일본)을 이용하여 5,000배로 확대하여 관찰하였다. 결과는도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 의한 나노칼슘포스페이트 인회석 결정박막은 결정의 크기가 균일하고 안정된 구조를 가지고 있음을 알 수 있다.

<실험예 2> 생체 적합성 실험

세균배양접시에 상기 실시예 1의 조건과 동일하게 인회석 고밀도 결정박막을 제조하였다. 상기 인회석 결정박막이 형성된 배양접시에 골모세포주(MG63 osteoblast, ATCC)를 첨가하고 CO₂항온조 내에 방치하여 95% 공기와 5%의 이산화탄소를 공급하여 주며 37℃에서 배양하였다. 6일 후, 상기 배양접시의 표면을 위상차현미경(×100)으로 관찰하였다. 결과는도 3에 나타내었으며,도 2는 비교예로 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 소수성 표면에서 세포가 잘 부착되지 못하는 것과는 달리도 3에서 보는 바와 같이, 세포가 고밀도 칼슘포스페이트 인회석 결정박막위에서 안정하게 부착됨을 알 수 있다. 이는 본 발명에 의해 제조된 칼슘포스페이트 인회석 결정박막이 생체 적합성이 있음을 나타내는 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 칼슘포스페이트 결정박막 형성방법은 소수성 고형표면에 용이하고 빠른 속도로 반응성이 좋고 결정도가 낮아 품질이 우수한 칼슘포스페이트 인회석 결정박막을 형성시킬 수 있으며, 상기 결정박막의 형성박막에 의해 제조된 결정박막은 고밀도로 형성되어 세포가 부착될 수 있으며, 다른 칼슘포스페이트 제재와 같이 생체적합성이 있어 생체 재료에 응용할 수 있다. 구체적으로 섬유모세포(fibroblast), 골모세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast), 치근세포(periodontal ligament cell) 등 여러 가지 세포에 상기 결정박막을 부착시켜 증식시킬 수 있으며, 생체 물질에도 적용할 수 있다.

Claims

고형물질의 표면에 고형표면에 부착되어 박막형성을 촉진하는 유기물질로 이루어진 코팅제를 코팅한 후 과포화 칼슘포스페이트 용액을 접촉시키고 그것을 배양하여 칼슘포스페이트 결정박막을 형성시키는 것을 특징으로 하는 칼슘포스페이트 결정박막의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 유기물질로 이루어진 코팅제가 알부민인 것을 특징으로 하는 칼슘포스페이트 결정박막의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 고형물질이 소수성 유기폴리머, 고분자 생체물질, 금속, 세라믹, 유리 또는 동물이나 식물의 생체 조직인 것을 특징으로 하는 칼슘포스페이트 결정박막 형성방법.
제 1항에 의해 얻어진 칼슘포스페이트 결정박막.