ES2354805T3 - Proceso biomimético para el recubrimiento de sustratos. - Google Patents

Abstract

Proceso para el recubrimiento de un sustrato, particularmente un dispositivo médico, con una composición biomimética, que comprende: a) producir por lotes en un sistema cerrado una composición acidificada biomimética que comprende una mezcla salina acuosa que contiene iones de calcio, magnesio, fosfato y bicarbonato y una sustancia bioactiva, b) contactar el sustrato con dicha composición biomimética y c) almacenar la composición biomimética en contacto con el sustrato y permitir que ocurra un incremento gradual del pH y causar la precipitación de sales y la coprecipitación de la sustancia bioactiva en dicho sustrato y obtener un sustrato recubierto, dicha sustancia bioactiva siendo seleccionada del grupo que consiste en un factor de crecimiento osteogénico, un factor que promueve el crecimiento celular, un factor de angiogénesis, un factor lipogénico, una sustancia antibiótica, una proteína, una vitamina, una hormona, un inhibidor, un gen o fragmento de un gen que muestra efectos similares a aquellos de los factores de crecimiento.

Description

Proceso biomimético para el recubrimiento de sustratos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso biomimético para el recubrimiento de sustratos, en particular a dispositivos médicos tales como implantes, a tales sustratos recubiertos y a la aplicación en la ingeniería del hueso, tejido conjuntivo, tejido adiposo y tejido muscular.

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Antecedentes de la invención

La investigación en el campo de la implantología dental y ortopédica está focalizada actualmente en desarrollar herramientas y metodologías para potenciar la osteointegración y para agilizar el reestablecimiento de la funcionalidad completa. Con la realización de estos objetivos, la fase de curación y tiempo de convalecencia de los pacientes podría ser acortada y su reinserción social y profesional establecida cuanto antes.

Una mejora en la osteoconductividad de los implantes ya ha sido lograda recubriendo sus superficies con capas de fosfato cálcico en varias formas cristalinas o amorfas. También se han hecho intentos para hacer estos recubrimientos osteoinductivos por la adición de factores de crecimiento osteogénicos, tal como factor de crecimiento transformante beta o proteínas morfogenéticas óseas. Pero, hasta recientemente, esta tarea representaba un gran escollo. La mayor parte de las técnicas usadas para preparar recubrimientos inorgánicos son realizadas bien a temperaturas extremadamente altas (p. ej., la pulverización de plasma) o bajo otras condiciones físicas altamente no fisiológicas, que excluyen la incorporación de moléculas proteínicas biológicamente activas durante su deposición.

Los investigadores han intentado circunvenir esta dificultad adsorbiendo secundariamente agentes osteogénicos sobre las superficies de los estratos inorgánicos preformados. No obstante, tales moléculas superficialmente adsorbidas sirven sólo como un depósito bidimensional, y por lo tanto limitado, que es liberado rápidamente, en un único estallido, tras la exposición a un entorno fisiológico. Por lo tanto, los efectos osteoinductivos de estos agentes son restringidos tanto temporalmente como espacialmente. Los investigadores han intentado superar este problema incrementando la concentración del factor de crecimiento adsorbido a niveles no fisiológicos. No obstante, las moléculas todavía son liberadas rápidamente en un único estallido, y los niveles locales altos generados resultan en la indeseable unión no específica a las fibrillas de colágeno y otras moléculas de matriz extracelulares en la proximidad del
implante.

Los estratos de fosfato cálcico preformados también han sido químicamente modificados en un intento de retardar la liberación de los factores de crecimiento adsorbidos. Pero incluso con tales manipulaciones, el índice de liberación del medicamento aún es más rápido que de un depósito tridimensional (retículo-incorporado). Un inconveniente más de estas técnicas de recubrimiento físico es que pueden ser aplicadas sólo en los materiales altamente resistentes a la temperatura, tales como las aleaciones metálicas, y a aquellos con una topografía de la superficie relativamente homogénea.

Varios métodos han sido propuestos en los últimos años para depositar un recubrimiento en todo tipo de sustratos. Estos métodos han sido reseñados en un artículo en Proc Instn Mech Engrs Vol 212 parte H por K. de Groot et al. En este articulo de reseña se han descrito varias técnicas tales como la pulverización de plasma, pulverización de plasma al vacío, pulverización de oxicombustible de alta velocidad y más técnicas mojadas tal como la deposición electroforética, deposición electroquímica, deposición biomimética y finalmente técnicas de pulverización catódica es decir depósito por pulverización catódica estándar, deposición de ión asistido, deposición con láser de pulsación, deposición por magnetrón, prensado isostático en caliente y esmaltado de frita.

Es de particular interés un método de deposición biomimético que implica formar un hueso biológicamente activo como estrato de apatita en un sustrato por inmersión en una solución de sal equilibrada (sobresaturada) de Hank o líquido biológico simulado.

El documento EP 0 987 031 describe un método para el recubrimiento de un sustrato, particularmente un dispositivo médico con una composición biomimética que comprende agentes biológicamente activos (Cf. D1, párrafo 43), D1 también describe el sustrato recubierto.

El documento US 6 569 489 describe un sustrato recubierto y el método para el recubrimiento de un sustrato, particularmente un dispositivo médico con una composición biomimética.

El documento US 2003/00113438 describe un sustrato recubierto, el recubrimiento que comprende una sustancia bioactiva y el método para el recubrimiento de dicho sustrato, particularmente un dispositivo médico con una composición biomimética que comprende agentes biológicamente activos.

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La patente US 6.207.218 describe un método para el recubrimiento de un implante que comprende las etapas de

a)

poner el implante en contacto con una solución acuosa de iones magnesio, calcio y fosfato

b)

pasar gas de dióxido de carbono a través de la solución acuosa para mantener una solución concentrada de los iones; y

c)

desgasificar la solución acuosa para causar la precipitación de sales en el implante.

Una desventaja de este método es que el proceso se lleva a cabo en un sistema abierto que por otra parte no se mantiene bajo condiciones estériles. Por otra parte es difícil de controlar el espesor del recubrimiento y las micro condiciones del proceso de recubrimiento. En este procedimiento uno no puede incorporar una sustancia bioactiva de manera simple. A fin de lograr esto, se necesitaría aplicar un proceso de 2 etapas que implica producir primero un recubrimiento fino que representa un estrato de siembra y luego cambiar a un sistema cerrado (que puede contener una molécula bioactiva) y producir un estrato secundario de por ejemplo recubrimiento de fosfato de calcio. Tal procedimiento es complejo y no adecuado para aplicaciones comerciales. También requiere un volumen muy grande de soluciones en la segunda etapa del proceso que da lugar a pérdidas muy altas de las moléculas bioactivas que uno desea incorporar en el recubrimiento. Por lo tanto, el proceso se vuelve bastante costoso.

Resumen de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un proceso en donde las mencionadas desventajas son aliviadas a una gran extensión. Según la presente invención una composición de recubrimiento biomimético es producida que consiste en una solución de electrolito que simula la composición de electrolito de los tejidos, particularmente tejido blando o tejido conjuntivo, que contiene una sustancia bioactiva que puede ser liberada de manera sostenida o retardada, producida por la coprecipitación de dicho material bioactivo con los otros componentes, principalmente sales que resultan en la incorporación de la sustancia bioactiva, preferiblemente sustancialmente en cantidades fisiológicas en el entramado formando una parte íntegral del recubrimiento, dicho recubrimiento se marca como una película, ventajosamente en una etapa en el sustrato a distinción del proceso de 2-etapas de la técnica anterior.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un proceso de recubrimiento que se lleva a cabo en un sistema cerrado, preferiblemente bajo condiciones asépticas o prácticamente estériles.

Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar un proceso en donde el espesor del recubrimiento y el estado físico del recubrimiento (formas cristalinas, amorfas o mezcladas) es manipulado pre-programando la composición de los constituyentes de la mezcla de inicio usados.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un proceso biomimético es decir típicamente un proceso moderado llevado a cabo a una temperatura que no tiene efecto perjudicial en la actividad y estabilidad de la sustancia bioactiva incorporada en el recubrimiento.

Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar un proceso comercialmente viable, altamente reproducible en donde son requeridos volúmenes relativamente bajos en un sistema microreactor, es decir volúmenes de menos de 100 ml y preferiblemente entre 5 y 20 ml en donde el dispositivo médico o implante es empapado en la composición de recubrimiento.

Finalmente es un objeto de la presente invención proporcionar composiciones y dispositivos de recubrimiento particularmente útiles en la ingeniería del tejido conjuntivo, tejido óseo, tejido graso y tejido muscular.

Estos y otros objetivos y ventajas se volverán aparentes en la descripción más detallada de la invención.

Descripción detallada de la invención

En su forma más general está provisto el proceso biomimético para el recubrimiento de un sustrato según la reivindicación 1.

En el proceso según la invención la sustancia bioactiva ya está incorporada en la mezcla inicial. Coprecipita con las sales inorgánicas y se recoge en la estructura o retículos cristalinos.

El reactor en el que se lleva a cabo el proceso es accionado preferiblemente bajo condiciones asépticas o prácticamente estériles. Las maneras y medios para lograr esto son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo los filtros bacteriológicos pueden ser usados y donde es posible tal cosa, se puede aplicar un tratamiento térmico en el equipamiento y en soluciones que pueden aguantar temperaturas altas de alrededor de aprox. 100ºC-110ºC. La esterilización también se puede llevar a cabo usando un gas de esterilización. El sustrato recubierto es posteriormente secado al aire, o secado bajo un gas inerte o a veces liofilizado preferiblemente bajo condiciones estériles.

No obstante también es posible accionar el proceso bajo condiciones que no son asépticas y esterilizar usando irradiación gamma en una fase posterior después de la etapa c).

El reactor está diseñado como un sistema cerrado. El reactor puede consistir en un recipiente con cierre hermético que en su forma más simple puede ser una botella de vidrio.

El proceso puede llevarse a cabo en un mini o micro sistema en vista de los volúmenes relativamente bajos (a menudo de menos de 100 ml o incluso menos de 20 ml) empleados en el proceso de recubrimiento según la inven-
ción.

En el proceso según la invención se añade un ácido en una cantidad suficiente para disolver todos los ingredientes incluyendo la sustancia bioactiva que puede ser una proteína, teniendo en cuenta el punto isoeléctrico de dicha proteína. Se entenderá fácilmente que en el presente proceso se puede añadir ácido a la mezcla acuosa salina o las sales pueden ser añadidas a agua acidificada. El ácido usado puede, en principio ser un ácido orgánico tal como ácido acético o un ácido inorgánico pero es preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en, ácido hidroclórico, sulfúrico y fosfórico. Es conveniente añadir al menos parte de la cantidad de ácido para ser usada a agua y posteriormente añadir las varias sales.

Para realzar la disolución de todos los constituyentes de la mezcla, es adecuado un pH que oscila de 5.2-6.6. La gama preferida es 5.8-6.4.

Posteriormente, se permite alzar el pH y la mezcla se almacena preferiblemente bajo agitación durante un periodo suficientemente largo para permitir que el pH alcance un valor que oscila preferiblemente de 7.0-8.5 y para lograr la precipitación y recubrimiento del sustrato. El incremento de pH puede inducir las siguientes etapas: subsaturación, supersaturación o un estado metaestable y nucleación y crecimiento de cristales. La nucleación heterogénea tiene lugar cuando una solución ha alcanzado el límite de supersaturación o el estado metaestable. En la supersaturación los cristales pueden crecer de las soluciones metaestables. En concentraciones más altas, puede ocurrir la nucleación homogénea o precipitación. Variando el pH, los mencionados cambios son modulados.

Una forma de realización preferida de la presente invención implica producir una solución añadiendo las sales en la siguiente secuencia:

i)

cloruro de magnesio, preferiblemente en su forma de hexahidrato,

ii)

cloruro de calcio, preferiblemente en su forma de dihidrato,

iii)

fosfato de hidrógeno de sodio, preferiblemente en su forma de dihidrato, a agua acidificada que tiene un pH dentro de la gama dada después de lo cual

iv)

se añade bicarbonato sódico.

Después de la última adición de bicarbonato el pH se eleva gradualmente hasta alcanzar, en última instancia un valor dentro de la mencionada gama alcalina moderada.

Las mencionadas sales constituyen los componentes básicos que estimulan la composición de electrolito de ambos tejidos blandos y óseos. Hemos encontrado que el añadir una cantidad menor de cloruro de potasio por ejemplo 0.1-1 g/l era útil cuando son previstos depósitos de tejidos blandos. La composición salina simula la composición electrolítica de los tejidos. Puede ser ventajoso en algunos casos usar una composición isotónica con sangre.

El deseado espesor del recubrimiento es preprogramado por así decirlo, por una selección juiciosa de los componentes de la mezcla y sus concentraciones respectivas.

Una composición muy preferida que ha demostrado ser muy eficaz es producida de: 0.2-2.0 g/l de cloruro de magnesio, 0.4 -2.0 g/l de cloruro de calcio, 1.0-5.0 g/l de bicarbonato sódico, 0.2-1.5 g/l de Na_{2}HPO_{4}.

En la práctica, se descubrió ser extremadamente útil añadir una cantidad apropiada de cloruro sódico en la composición a fin de influir en la naturaleza del recubrimiento en cuanto a la cristalinidad o estado amorfo o formas mezcladas dependiendo de la aplicación prevista. El grado de cristalinidad puede ser monitorizado o medido por la difracción de rayos X, el así llamado modelo de ruido da una indicación del grado de cristalinidad.

Tanto el cloruro de magnesio como el cloruro sódico reducen la velocidad de precipitación y ralentizan el proceso de precipitación. Un proceso gradual, lento es ventajoso para conseguir recubrimientos adecuados del espesor correcto.

Normalmente una concentración de cloruro sódico en la mezcla acuosa que oscila de 20-50 g/l será adecuada.

El proceso biomimético de recubrimiento según la invención es normalmente llevado a cabo dentro de la gama de 15-50ºC, preferiblemente 20-45ºC lo más preferiblemente 25-40ºC e idealmente a 37ºC. La elección de la temperatura ideal depende de la naturaleza de la sustancia bioactiva usada y la temperatura en la que su estabilidad y actividad podría ser afectada perjudicialmente. La variación de la temperatura puede contribuir a modular la duración del proceso de recubrimiento.

El periodo de almacenamiento del sustrato en contacto con la composición de recubrimiento oscilará normalmente de 3-96 horas y preferiblemente 5-48 horas o más si fuera necesario, para lograr un recubrimiento con un espesor que oscila de 0.5 a 100 micrones. El espesor del recubrimiento es un factor que determina el retraso de la liberación de la sustancia bioactiva. Otro factor que determina el tiempo de degradación del recubrimiento cuando es implantado en el cuerpo es la cantidad de células gigantes u osteoclastos de cuerpo movilizado que se puede desencadenar incorporando factores adecuados en la composición de recubrimiento. Tras la degradación del recubrimiento, los factores de crecimiento del tejido osteogénico, lipogénico o conjuntivo son liberados.

El recubrimiento obtenido puede comprender una gran variedad de sales seleccionadas de carbonato cálcico, dihidrato de fosfato dicálcico, fosfato de ortocalcio, apatita de carbonato de hidroxilo y similares, en estado amorfo, cristalino o amorfo a cristalino y una cantidad efectiva de sustancia bioactiva.

El sustrato, dispositivo médico o implante puede consistir en polímeros blandos o duros tales como colágeno, gelatina de polilactato, posiblemente en forma de una membrana, y puede ser biodegradable o no biodegradable, sobre el que se aplica un recubrimiento sostenido o de liberación retardada que contiene, por ejemplo, una sustancia osteogénica, un factor que promueve el crecimiento celular tal como BMP, FGF, TGF/CTGF (factor de crecimiento de tejido y tejido conjuntivo), un factor de angiogénesis que podría ser el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o FGF-2 (factor 2 de crecimiento de firboblastos), fármacos tales como una sustancia antibiótica, cualquier proteína, vitamina, hormona o sustancias que inhiben algunas funciones fisiológicas, que se añade en la mezcla de inicio de los componentes usados para preparar la composición de recubrimiento y se coprecipita en el sustrato. Incluso es posible coprecipitar genes o fragmentos de los mismos que muestran efectos similares a aquellos de los factores de crecimiento. Aplicaciones interesantes del mencionado principio son la odontología o cirugía plástica, por ejemplo, la cirugía plástica correctiva en defectos genéticos como el paladar hendido.

Otra aplicación interesante se refiere a la inducción de la formación de tejido graso por la incorporación de un sólo factor de angiogénesis o en combinación con un factor lipogénico, por ejemplo para lograr el aumento del pecho de la mujer.

Por último pero no menos importante, las composiciones biomiméticas pueden ser aplicadas en un proceso de recubrimiento que implica la producción de un nuevo diente, incorporando en la composición sustancias de señales diferentes para los diferentes estratos del diente y aplicando tal recubrimiento en los apropiados portadores de la matriz.

A continuación la invención se ilustrará en los siguiente ejemplos que no deben ser interpretados de manera limitativa.

Ejemplos

Ejemplo 1

En un minireactor cerrado con un volumen de 20 ml fue producida una mezcla acuosa salina añadiendo mientras se agitan los siguientes componentes en agua acidificada con una cantidad suficiente de una solución 1M de HCl para alcanzar un pH de 6.0., en la secuencia dada, para producir una composición de recubrimiento en la que las concentraciones finales se dan entre paréntesis.

Cloruro de magnesio (O.5 g/l), cloruro de calcio (1.0 g/l), Na_{2}HPO_{4}. (0.25 g/l), NaHCO_{3} (5.0 g/l), cloruro de sodio (40 g/ml).

Proteína (BSA) fue añadida como una sustancia de prueba en una concentración de 20 microgramos/ml.

Discos de titanio de 15 mm de diámetro fueron puestos en contacto con la composición de recubrimiento en el minirreactor. El minirreactor y sus contenidos fueron almacenados bajo agitación magnética.

Durante un periodo de almacenamiento de 6 horas a temperatura ambiente el pH se elevó gradualmente a un valor de pH alrededor de 8 y la precipitación de sales incluyendo la proteína tuvo lugar, resultando en la formación en los discos de un recubrimiento pelicular que contiene la proteína a partir de la cual fueron retirados los discos de la solución salina y secados al aire. Fueron producidos discos recubiertos, cuyo espesor era de aproximadamente 4 micrones.

Todas las etapas de la operación fueron llevadas a cabo a temperatura ambiente, bajo condiciones estériles y fue usado un filtro bacteriológico para filtrar todas las soluciones.

Ejemplo 2

El ejemplo 1 fue repetido, partiendo esta vez de la siguiente mezcla de sales con las concentraciones finales dadas: cloruro de magnesio (1.52 g/l), cloruro de calcio 1.84 g/l, Na_{2}HPO_{4} (0.89 g/l), NaHCO_{3} (1.76 g/l), cloruro sódico (40 g/l).

Fueron obtenidos recubrimientos excelentes en los discos. El espesor del recubrimiento era de aproximadamente 4 micrones.

Ejemplo 3

El ejemplo 2 fue repetido sin cloruro sódico. Los recubrimientos obtenidos eran más finos que aquellos obtenidos en el ejemplo 2. El pH alcalino fue alcanzado en menos de 3 horas y la precipitación y recubrimiento resultó dentro de un tiempo más corto que en el ejemplo anterior.

Ejemplo 4

En los siguientes experimentos comparativos el siguiente grupo de muestras fueron producidas y fueron evaluadas con respecto a sus propiedades de liberación físicas, mecánicas, propiedades fisiológicas tanto in vivo como in vitro.

a)

muestra de control no recubierta.

b)

muestra de control sin la proteína BMP-2.

c)

muestra de control con la proteína BMP-2 usando un estrato preformado y BMP superficialmente absorbido.

d)

muestra representativa según la invención que implica la coprecipitación de la proteína BMP-2 y sales.

Fue investigado el potencial osteoinductivo de los implantes de aleación de titanio que producen recubrimientos biomiméticos que contienen BMP-2 in vivo. Para este propósito, fue usado un modelo de osificación (subcutánea) ectópica bien establecida en ratas, que se emplea ampliamente para detectar la actividad osteogénica de los biomateriales y agentes bioactivos. Por primera vez usando este modelo, fueron presentados datos en referencia al índice semanal neto de formación ósea y al índice de degradación del recubrimiento (que es probablemente mediado por la célula) durante el curso de un periodo de seguimiento de 5 semanas. La extensión espacial de la formación ósea inducida por BMP-2 también es cuantificada. Este parámetro es de importancia clínica práctica en el puenteo de espacios grandes, que frecuentemente no consiguen curarse después de la implantación quirúrgica. Además, bajo condiciones osteoporóticas locales, la inducción activa y rápida de la formación de hueso de periimplante puede ayudar a mejorar la estabilidad mecánica de las prótesis en una fase temprana.

Materiales y métodos Diseño del estudio

Este estudio se divide en dos partes: la primera consiste en experimentos in vitro en referencia a la preparación y caracterización de los recubrimientos de los implantes; la segunda consiste en los experimentos de implantación in vivo en ratas, que incluye un análisis histológico e histoquímico y una evaluación histomorfométrica de la formación de tejido óseo y degradación del recubrimiento durante el curso de un periodo de seguimiento de 5 semanas.

Experimentos in vitro Preparación de los recubrimientos de los implantes

Discos (1 cm de diámetro) de aleación de titanio (Ti6A14V) fueron sumergidos en líquido biológico simulado concentrado 5 veces (MgCl_{2} 1.52 g/l,Ca Cl_{2} 1.84 g/l Na_{2}HPo_{4} 0.89 g/l,NaCl 40 g/l; NaHCO_{3} 1.76 g/l, durante 24 h a 37ºC bajo condiciones de alta nucleación para inhibir el crecimiento del cristal. El estrato fino y denso de mezcla amorfa de sales como se describe en el ejemplo 1, producido así sirve como una superficie de siembra para la deposición de un estrato cristalino. Éste último fue producido sumergiendo muestras (n = 90) en una solución sobresaturada de una mezcla de sales como se describe en el ejemplo 1 (pH 7.4), que bien carecía (n = 60) o contenía (n = 30) el BMP-2 recombinante humano (10 mg/l) Wyeth, Cambridge, MA, EEUU), durante 40 h a 37ºC. Como un control positivo para BMP-2 superficialmente adsorbido, una parte (n = 30) de la mezcla de sales como se describe en el ejemplo 1 los recubrimientos preparados en la ausencia de BMP-2 fueron sumergidos entonces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía BMP-2 (10 mg/l) durante 48 h a 37ºC. Todas las muestras fueron preparadas bajo condiciones estériles y almacenadas entonces a -80C.

Cuantificación de BMP-2 asociada a los recubrimientos

La cantidad de BMP-2 asociada a cada recubrimiento fue determinada por ELISA (n = 6 para cada variante (10)). Cada recubrimiento fue retirado mecánicamente de su disco de aleación de titanio subyacente y disuelto en 1 ml de 20% de EDTA. Muestras del extracto fueron diluidas 10 o 100 veces y partes alícuotas de 100 \mul de cada una fueron transferidas entonces a microplacas de 96 pocillos. 100 \mul de BMP-2 antihumano recombinante [(Wyeth, Cambridge, MA, EEUU) diluido 1:10000 en PBS] fueron añadidos a cada pocillo y la intensidad del producto de reacción coloreado fue medida colorimétricamente a una longitud de onda de absorción de 405 nm usando un lector de microplacas. Las lecturas fueron convertidas en ng de BMP-2 usando una curva de calibración.

Medición de espesores de recubrimiento

El espesor inicial de cada recubrimiento fue medido in vitro usando una sonda de inducción magnética (Electrophysik minitest 2100, Alemania), cuya gama de medición se encuentra entre 0 y 100 \mum. Fueron tomadas seis mediciones para cada muestra. y el valor medio fue determinado.

Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier

Esta técnica fue usada para determinar las características cristalinas de los recubrimientos. Cada recubrimiento fue pelado de su disco de aleación de titanio subyacente y 0.6-.0.8 mg del material de muestra fue mezclado con 280 mg de bromuro de potasio. El granulado resultante transparente fue analizado en un espectrómetro infrarrojo por transformada de Fourier (espectro 1000, Perkin-Elmer. UK).

Microscopía electrónica de barrido y análisis de rayos x por energía dispersiva

Discos de aleación de titanio fueron recubiertos con partículas de carbono hasta un espesor de 12-16 mm. Entonces fueron examinados en un microscopio electrónico de barrido (modelo 525, Philips, Eindhoven. Países Bajos) y sometidos simultáneamente a un análisis de rayos x por energía dispersiva (EDX. Voyager. Philips. Eindhoven, Países Bajos).

Fuerza mecánica de los recubrimientos

La fuerza mecánica de cada recubrimiento fue evaluada por medio de una prueba de microrrayado, que fue realizada usando un sistema mecánico avanzado de evaluación de superficies (CSEM Instruments, Neuchatel. Suiza). Implica generar un rayado con un estilete de diamante esférico (diamante Rockwell C; diámetro de la punta: 100 \mum) que fue dibujado a una velocidad constante (10 mm por minuto) a través del recubrimiento (todavía fijado a su disco de aleación de titanio subyacente) bajo cargas de incremento progresivo, producidas a un índice constante (30 N por minuto). La carga crítica, es decir, aquella en la que el rayado genera material no de corte "limpio" sino desintegrado (no coherente), depende (entre otros factores) de la fuerza mecánica (adhesión y cohesión) del recubrimiento.

Experimentos in vivo Diseño de experimentos

Un grupo experimental (BMP-2 incorporado) y tres de control fueron establecidos: discos de aleación de titanio que portan un estrato coprecipitado de una mezcla de sales como se describe en el ejemplo 1 y BMP-2 (grupo BMP-2 incorporado);

discos de aleación de titanio descubiertos [control negativo para los efectos de un estrato de fosfato cálcico y de BMP-2 (grupo no recubierto)] discos de aleación de titanio que contienen un estrato biomimético de una mezcla de sales como se describe sólo en el ejemplo 1 [control negativo para los efectos de BMP.2 (grupo sin BMP-2)]; y discos de aleación de titanio que contienen un estrato biomimético de una mezcla de sales como se describe en el ejemplo 1 y BMP-2 adsorbido superficialmente {control positivo de BMP-2 (grupo de BMP-2 adsorbido)]. Seis discos por cada grupo y por cada punto en el tiempo fueron implantados subcutáneamente en ratas. Cada animal recibió dos discos, uno en el lado izquierdo y uno en el lado derecho, en un emplazamiento dorsal. Los discos en los lados contralaterales de cualquier rata fueron derivados, en todos los animales de diferentes grupos de prueba. No obstante, cada rata siempre recibió bien discos con contenido de BMP-2 (grupo de BMP-2 incorporado o grupo de BMP-2 adsorbido) o unos sin contenido de BMP-2 (grupo no recubierto o grupo sin BMP-2). Esta estrategia fue adoptada para evitar la posibilidad de la reactividad cruzada. Con esta precondición, los varios tipos de disco fueron distribuidos entre los 60 animales según un protocolo sistemático. En un estudio preliminar, no ocurrió ninguna reactividad cruzada entre los discos en el grupo de BMP-2 incorporado y aquellos en el grupo de BMP-2 adsorbido (es decir, una respuesta osteogénica fue observada en el caso anterior pero no en el último). Los discos implantados fueron recuperados para el análisis en intervalos de 7 días a lo largo de un periodo de 5 semanas (vea la Tabla 1).

Implantación

Sesenta ratas Wistar jóvenes adultas varón (que pesaban 185-250 g) fueron usadas para este estudio. Los animales fueron alimentados con una dieta estándar y tuvieron acceso ilimitado al agua. La cirugía fue realizada bajo condiciones de anestesia general [usando Vetalar ® (clorhidrato de quetamina)). Las regiones izquierda y derecha dorsales de cada rata fueron afeitadas y desinfectadas y se hizo una incisión en la piel. Un implante fue insertado subcutáneamente en cada lado de cada animal y el corte quirúrgico fue cerrado luego por suturación. Los animales fueron alojados de acuerdo con las normas holandesas para la experimentación animal y el estudio fue aprobado por el comité de estudio experimental animal holandés (Cbe/00/13883).

Explicación, procesamiento de tejidos y protocolo de muestreo

Las ratas fueron matadas administrando una sobredosis de dióxido de carbono gaseoso. Los implantes fueron recuperados, junto con una cantidad mínima de tejido circundante, por disección cortante. Este mínimo fue determinado por el grado de encapsulación del implante con el tejido conjuntivo. El material fue fijado por inmersión en 10% de formaldehído a temperatura ambiente durante varios días. Entonces las muestras fueron enjuagadas en agua del grifo, deshidratadas en etanol e introducidas en metilmetacrilato. Aplicando un protocolo de muestreo sistemático aleatorio [22], cinco lonchas, cada una de 600 \mum de espesor y 2 mm aparte, fueron preparadas de cada muestra usando una sierra de diamante. Las lonchas fueron montadas en soportes de plexiglás, pulidas y la superficie manchada con tetracromo de McNeil, fucsina básica y azul O de toluidina [46] en preparación para el análisis histológico en el microscopio óptico.

Evaluación histomorfométrica

La formación ósea, degradación del recubrimiento y actividad de las células de reabsorción (cobertura por células gigantes de cuerpo extraño u osteoclastos) fueron evaluadas histomorfométricamente. Usando un protocolo definido de muestreo sistemático aleatorio en dos ampliaciones finales diferentes (x 74 y x 184), ocho imágenes digitales por sección (es decir, para cada una de las cinco secciones tomadas por disco) fueron obtenidas en un microscopio óptico Nikon-Eclipse e impresas en color. El análisis histomorfométrico fue realizado en estos impresos de color usando las metodologías de punto e intersección elaboradas por Cruz-Orive et al Gunderson et al. que se describe en la bibliografía. Los siguientes parámetros morfométricos fueron determinados; la densidad del volumen de tejido óseo por sección por punto en el tiempo, y la densidad de volumen del material de recubrimiento presente fueron estimados usando el método de Cavalieri que se describe en la bibliografía. El índice neto de formación ósea por disco por semana y el índice neto de degradación del recubrimiento por disco por semana fue calculado entonces por grupo por cada semana postoperatoria.

La distancia máxima fuera de la superficie del implante en la que la neoformación ósea fue observada en cada sección fue medida perpendicular a esta superficie usando una regla. La distancia media máxima fue determinada entonces para cada grupo en cada punto del tiempo (cuando aplicable).

Manchado histoquímico para TRAP

Usando secciones cuya superficie fue manchada con tetracromo de McNeil, Fucsina básica y azul O de Toluidina, el porcentaje del implante o superficie de recubrimiento cubierta con células multinucleadas (es decir, células gigantes de cuerpo extraño más osteoclastos) fue estimado por el cálculo de intersección, usando un sistema de líneas que fue orientado perpendicular a la superficie del disco. Después de la finalización de éste y los demás análisis morfométricos que se describen en la precedente sección, los especimenes de tejido fueron pulidos por aproximadamente 20-30 \mum para el manchado histoquímico según la reacción de la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) usando un protocolo estándar. Sólo los osteoclastos son TRAP-positivos; las células gigantes de cuerpo extraño permanecen sin manchas. Usando la misma técnica de cálculo de intersección que aquella que se describe anteriormente, el porcentaje del implante o de la superficie de recubrimiento cubierta con células TRAP-positivas (es decir, osteoclastos) fue estimado. El porcentaje de la superficie cubierta con células gigantes de cuerpos extraños fue determinado sustrayendo el número de células TRAP-positivas (es decir; osteoclastos) del número total de células multinucleadas (estimado usando secciones manchadas convencionalmente).

Análisis estadísticos

Diferencias entre los varios grupos en un tiempo de muestreo particular (cobertura de la superficie con células gigantes de cuerpos extraños en cada uno de los cuatro grupos; volúmenes de recubrimiento en los tres grupos relevantes), y dentro del mismo grupo a cada tiempo de muestreo, fueron analizados estadísticamente usando la prueba de ANOVA de sentido único, el nivel de significación siendo establecido a P < 0.05. Software estadístico SAS (versión 8.2) fue empleado para este propósito. Comparaciones post hoc fueron hechas entonces usando correcciones de Bonferroni. Datos pertenecientes al espesor del recubrimiento, la cantidad total de BMP-2 incorporada en los recubrimientos, la cantidad total de BMP-2 adsorbida en los recubrimientos, fuerza del recubrimiento (prueba de micro-rayado), el volumen óseo total depositado por cada punto en el tiempo en el grupo de BMP-2 incorporado, cobertura ósea de los discos por cada punto en el tiempo en el grupo de BMP-2 incorporado, y cobertura de la superficie con osteoclastos por cada punto en el tiempo en el grupo BMP-2 incorporado, fueron analizados usando las mismas pruebas estadísticas. Todos los datos numéricos son presentados como valores medios conjuntamente bien con la desviación estándar (SD) o el error estándar de la media (SEM).

Resultados Datos in vitro Incorporación de BMP-2 en recubrimientos biomiméticos

Los recubrimientos preparados por la coprecipitación de una mezcla de sales como se describe en el ejemplo 1 y BMP-2 fueron divulgados por ELISA para tener 1.7 \pm 0.079 \mug (media \pm DE) incorporado del factor de crecimiento osteogénico por cada disco, o 0.5 \pm 0.138 \mug por cada mg de recubrimiento. La cantidad de BMP-2 adsorbida superficialmente sobre las superficies de mezclas preformadas de sales como se describe en el ejemplo 1 fue significativamente inferior (P < 0.05) a 0.98 \pm 0.045 \mug (media \pm ED) por cada disco, o 0.1 \pm 0.0003 \mug de recubrimiento (tabla 1).

Características del recubrimiento

Los recubrimientos fueron de un espesor uniforme, con valores medios (\pm SD) de 25.00 (\pm 6.4) \mum (n = 6) y 23.85 (\pm 4.8) \mum (n = 6) para aquellos preparados en ausencia y presencia de BMP-2, respectivamente. No hubo ninguna diferencia significante entre los dos. Mezclas de sales preformadas como se describen en el ejemplo 1 llevando un estrato de BMP-2 superficialmente adsorbido no difirió significativamente en espesor antes y después de la deposición de este agente.

La espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier reveló que los recubrimientos biomiméticos poseían las características típicas de una estructura de cristal de octacalcio de fosfato, independientemente de la ausencia o presencia de BMP-2. La microscopía electrónica de barrido reveló que el entramado inorgánico está compuesto enteramente de unidades de cristal tipo planas, rectas con los bordes punzantes; ningún cambio en esta geometría fue provocado por la presencia de BMP-2.

La prueba de micro-rayado reveló mezclas de sales como se describen en el ejemplo 1 preparadas en la presencia de BMP-2 para poseer mayor fuerza mecánica que aquellas preparadas en la ausencia de este agente, el principio crítico en cada caso, es decir, aquel en el rayado generó un corte no "limpio" sino material desintegrado (no coherente), siendo 2.5 \pm 0.37 N (media \pm SD) y 1.8 \pm 0.08 N (media \pm SD), respectivamente (P < 0.05 n = 6 para cada grupo).

Datos in vivo Histología

Después de la primera semana de implantación, los discos en el grupo no recubierto y en el grupo sin BMP-2 fueron cubiertos con células gigantes de cuerpos extraños a una extensión del área de 80-90%. La cobertura disminuyó progresivamente durante las 4 semanas consiguientes. A finales de la quinta semana, la cobertura en el grupo no recubierto (41%) era significativamente más alta (P < 0.05) que en cualquiera de los tres grupos recubiertos (Fig. 1 y tabla 2).

En el grupo no recubierto y en el grupo sin BMP-2, fue observada una respuesta inflamatoria moderada implicando linfocitos y macrófagos a distancias de 50-200 \mum de los discos. El grado y extensión de esta respuesta disminuyó gradualmente con el tiempo. Los discos fueron sometidos a encapsulación progresiva con tejido conjuntivo vascularizado. En la quinta semana, estructuras cristalinas grandes tipo aguja eran aparentes en muchos lugares a lo largo de los discos en el grupo sin BMP-2. Estas estructuras no tenían ninguna similitud con aquellas que constituyen el entramado inorgánico original. Ningunos depósitos de este tipo fueron observados en el grupo no recubierto.

Los discos en el grupo de BMP-2 adsorbido fueron asimismo cubiertos con células gigantes de cuerpos extraños en una extensión del área del 80% después de la primera semana de la implantación (Fig. 1), y similarmente fueron observadas respuestas inflamatorias moderadas dentro del entorno inmediato. Cerca de los discos, fueron muy ocasionalmente observadas islas pequeñas de tejido óseo con osteoclastos y osteoblastos adheridos. Pero esta actividad osteogénica fue tan rara como para no ser mensurable morfométricamente. Se basó en un mecanismo directo, no encondral de osificación. Después de la segunda semana de la implantación, estas islas de tejido óseo habían sido completamente reabsorbidas. Durante el resto del curso de seguimiento, no se manifestó ninguna evidencia adicional de la actividad osteogénica, bien a lo largo de la superficie del recubrimiento o dentro del circundante tejido conjuntivo. La respuesta inflamatoria moderada, aparente durante la fase postoperatoria temprana (semanas 1 y 2) había cesado prácticamente en la tercera semana. En esta última coyuntura, fue observada una cápsula de tejido conjuntivo sustanciosa. La cobertura del área de los revestimientos con células gigantes de cuerpos extraños habían disminuido al 60% en la tercera semana y a 25% en la quinta (Fig. 1). En esta última coyuntura, los discos en el grupo de BMP-2 adsorbido llevaban depósitos de estructuras cristalinas tipo aguja que eran similares a aquellas observadas en el grupo sin BMP-2.

En el grupo de BMP-2 incorporado, la imagen histológica manifestada después de la primera semana de implantación corresponde a aquella registrada para el grupo no recubierto y el grupo sin BMP-2. No fue aparente ninguna actividad osteogénica. En la segunda semana, fueron vistos muchos focos osteogénicos, no sólo sobre los recubrimientos sino también a distancias de hasta 150 \pm 5.3 (SEM) \mum del mismo. Esta actividad osteogénica fue basada apabullantemente en un mecanismo de osificación directa. Sólo unos pocos emplazamientos de formación ósea endocondral fueron observados. De hecho, estos eran tan escasos como para no ser mensurables morfométricamente. La actividad osteogénica fue sostenida durante la tercera, cuarta y quinta semana (figs. 4a-d) dando lugar a la formación de una masa en aumento de tejido óseo. Las trabéculas óseas fueron observadas tanto en contacto directo con los recubrimientos como dentro de la cápsula de tejido conjuntivo. El tejido óseo estrecho era aparente no sólo entre las trabéculas óseas sino también en contacto directo con los recubrimientos. En la quinta semana, la respuesta inflamatoria moderada fue casi completamente atenuada, pero la resorción de los recubrimientos por células gigantes de cuerpos extraños (y osteoclastos) continuaron. Las células gigantes de cuerpos extraños ocupaban frecuentemente partes de los recubrimientos que no estaban cubiertas con hueso. A las 5 semanas, la cobertura del área de los recubrimientos con células gigantes de cuerpos extraños (11%) fue inferior en este grupo de BMP-2 incorporado que en cualquiera de los otros (Fig. 1). No obstante, si el número de células gigantes de cuerpos extraños fuese expresado en relación al área del disco que estaba desprovisto de hueso recién formado u osteoclastos, entonces la cobertura del área sería similar en cada uno de los tres grupos recubiertos [24-32% (datos no presentados)]. Al final de la quinta semana, los discos en el grupo de BMP-2 incorporado estaban casi completamente rodeados de tejido óseo fibroso. El tejido óseo fue observado a distancias máximas de 340 \pm 13 (SEM) \mum y 217 \pm 5.4 (SEM) \muM de los discos en la tercera y quinta semana, respectivamente. La disminución en esta distancia es atribuible probablemente a la remodelación ósea incrementada (véase la siguiente sección: histomorfometría).

En cada grupo, la reactividad nativa del tejido a las superficies del disco fue sorprendentemente baja. Aparte de la encapsulación del tejido conjuntivo, las respuestas inflamatorias fueron moderadas y suprimidas con el tiempo. Nunca se observó que se extendieran más allá de una distancia de 400 \mum de la superficie del implante. Ningunos indicios del rechazo agudo, tal como la presencia de granulocitos, fue jamás aparente.

Histomorfometría

La histomorfometría no reveló ninguna evidencia mensurable de actividad osteogénica durante la primera semana de implantación en cualquiera de los grupos. Después de la segunda semana, el tejido óseo fue depositado alrededor de los discos en el grupo BMP-2 incorporado, pero en ninguno de los otros. El volumen neto de hueso formado incrementó de 5.8 mm^{3} en la segunda semana a 10.3 mm^{3} en la tercera. En la cuarta semana, ha disminuido de 6.8 mm^{3}, pero entonces incrementó otra vez a alrededor del valor de la tercera semana en 5 semanas [10.4 mm^{3}. El índice neto semanal de formación ósea fue máximo durante la segunda semana (5.8 mm^{3} por disco por semana); cayó ligeramente durante la tercera (4.49 mm^{3} por disco por semana), y nuevamente durante la quinta semana (3.64 mm^{3} por disco por semana). Durante la cuarta semana, el índice neto semanal de resorción ósea excedió aquel de formación ósea. Sin embargo, la cobertura ósea de los implantes se incrementó a un ritmo constante entre la tercera y quinta semana. Al final de la quinta semana la mayoría de los discos en el grupo de BMP-2 incorporado estaban completamente rodeados por tejido óseo recién formado. En esta última coyuntura, el volumen de recubrimiento ha disminuido aproximadamente un 60% [calculado en la base del valor del punto del tiempo "cero". Por lo tanto, durante el periodo de seguimiento de 5 semanas, la masa ósea se incrementó y el volumen del recubrimiento disminuyó.

Los recubrimientos de los discos en el grupo de BMP-2 y en el grupo de BMP-2 incorporado fueron degradados irregularmente durante el periodo de seguimiento de 5 semanas. Aquellos en el grupo de BMP-2 adsorbido fueron sometidos a degradación sólo durante la tercera (sustancial) y quinta semana (tabla 3).

Histoquímica de TRAP

El manchado histoquímico por TRAP reveló la población multinucleada de células asociadas con discos en cada uno de los tres grupos de control para ser exclusivamente TRAP-negativos. Fueron por lo tanto identificados todos como células gigantes de cuerpos extraños. Después de la primera semana de implantación, los discos en el grupo (experimental) de BMP-2 incorporado fueron cubiertos sólo con células TRAP-negativas (gigantes de cuerpos extraños). Pero después de la segunda semana, cuando se manifestó la actividad osteogénica, aparecieron células TRAP-positivas (es decir; osteoclastos). La presencia de ambas células gigantes de cuerpo extraño y osteoclastos probablemente representa los altos índices de degradación del recubrimiento observado durante la tercera y quinta semana (tabla 3) en este grupo.

Discusión

La osteoconductividad de los implantes metálicos usados en odontología y cirugía ortopédica pueden ser mejorados recubriendo sus superficies con un estrato bien de una mezcla de sales como se describe en el ejemplo 1 basado en o de material óseo tipo matriz. Estos estratos inorgánicos son por supuesto redes reticuladas tridimensionales, que se pueden usar para entregar agentes osteoinductivos al emplazamiento del periimplante. En un estudio precedente, incorporamos el factor de crecimiento osteogénico BMP-2 en mezclas de sales como se describe en el ejemplo 1 usando la técnica biomimética. BMP-2 formó una parte íntegral del entramado inorgánico tridimensional y no fue meramente adsorbida sobre su superficie. Además, la osteogenicidad de BMP-2 así incorporado no sólo fue retenida sino también potenciada en un sistema in vitro compuesto de células osteoprogenitoras cultivadas.

En el presente estudio, hemos querido evaluar el potencial osteoinductivo de los implantes de aleación de titanio que llevan un estrato co-precipitado biomiméticamente de BMP-2 y mezclas de sales como se describen en el ejemplo 1 in vivo, usando un modelo de rata ectópica (subcutánea).

Nuestros descubrimientos histológicos e histomorfométricos confirmaron nuestras expectativas: BMP-2 incorporado en los recubrimientos biomiméticos no sólo indujo la formación ósea ectópica a un nivel farmacológico muy bajo, sino que sostuvo este proceso a través del periodo íntegro de seguimiento de 5 semanas. Cuando BMP-2 fue adsorbido sólo superficialmente sobre recubrimientos preformados biomiméticos, sólo fue capaz de inducir una respuesta osteogénica muy transitoria y esporádica, que perduró no más de 1 semana y que era cuantitativamente insignificante, aunque la cantidad total de BMP-2 depositado exclusivamente en la superficie (0.98 \mug por disco) no difirió en mayor medida de aquella distribuida a través del entramado íntegro en el grupo de BMP-2 incorporado (1.7 \mug por disco).

El hecho de que el tejido óseo fuera depuesto por un mecanismo directo en lugar de por uno endocondral fue un descubrimiento inesperado de nuestro estudio. En otras investigaciones que han hecho uso de este modelo de rata de osificación ectópica, el BMP-2 indujo una cascada de osificación endocondral, que fue sostenida durante no más de 12-14 días; después de este tiempo, se inicio la resorción ósea y se completó en la tercera semana. Se conoce que la osificación directa ocurre sólo dentro de un campo mecánicamente estable, en la ausencia de un esfuerzo cortante. Y en nuestro sistema, tal entorno fue obviamente provisto por los discos de aleación de titanio rígidos. En estudios precedentes, BMP-2 fue vinculado bien a pequeñas partículas o a matrices colagenosas o de vidrio, que son sometidas al contacto friccional durante el movimiento de los músculos de la piel de una rata. En sólo un estudio BMP-2 fue aplicado dentro de una masa membranosa grande de colágeno fibrilar, y en este ejemplo, tuvo lugar la osificación directa.

En nuestro estudio, a diferencia de la situación en estas precedentes investigaciones, el tejido óseo no empezó a resorber después de 2 semanas,. Fue formado continuamente durante las 3 restantes semanas del periodo de seguimiento. Una disminución en el índice semanal de formación ósea fue observado durante la cuarta semana, pero esto reflejó el predominio de actividades de remodelación ósea en esta fase, lo que es de esperar en ausencia de campos de esfuerzo activos. Y a pesar de esta circunstancia, el volumen total óseo presente en la cuarta semana no dismininuyó sustancialmente. Además, la pérdida fue confinada al entorno del implante, ya que la cobertura ósea de los mismos discos se incrementó a ritmo constante (sin depresión) entre la tercera y quinta semana. Después de 5 semanas, aproximadamente un 40% del material de recubrimiento permanecía subgradado, lo que sugiere que una parte similar del BMP-2 incorporado no fue liberada. La implicación es que la actividad osteogénica podría haber continuado durante varias semanas más después de la terminación del experimento. El sostenimiento de la entrega de MP-2 y la actividad osteogénica es por supuesto el propósito de un recubrimiento osteoinductivo; y esta característica es de gran importancia para la osteointegración óptima de un implante. Ya que aproximadamente 60% del material de recubrimiento fue degradado durante el periodo de seguimiento de 5 semanas, 60% de la cantidad inicialmente incorporada de BMP-2 (1.7 \mug por disco) también fue probablemente liberada durante este periodo, es decir, 1.02 \mug durante el curso de 5 semanas. El hecho de que esta cantidad de BMP-2 fuera suficiente para inducir y sostener la actividad osteogénica a un nivel relativamente alto a lo largo de las 5 semanas, mientras que una cantidad similar de BMP-2 (0.98 \mug por disco) adsorbida superficialmente no provocó más que una respuesta osteogénica muy transitoria, esporádica y abortiva cuando fue liberada en un único estallido de corta duración (que probablemente no excede varios días), implica que un nivel farmacológico sostenido algo inferior del fármaco es osteogénicamente más potente y eficaz que una dosis más alta entregada durante un periodo de tiempo corto.

Otros tipos de sistema de aplicación para la liberación controlada de factores de crecimiento también han sido descritos en la bibliografía. Por ejemplo, poli-D.L-láctido ha sido usado para portar el factor-1 de crecimiento tipo insulina y la transformación del factor de crecimiento beta-1. En combinación con este portador de fármacos, estos agentes osteogénicos fueron asimismo más eficaces en la estimulación de osteogénesis a un bajo pero sostenido índice de dosis baja que lo que fueron cuando fueron administrados libremente en una única dosis alta (análoga a la liberación por estallido de un depósito adsorbido superficialmente).

La eficacia osteoinductiva de BMP-2 ha sido evaluada también en otros sistemas. Por ejemplo, ha sido aplicado directamente a las mezclas de sales como se describen en el ejemplo 1, matrices recubiertas de colágeno y al cemento. No obstante, la concentración de BMP-2 que era requerida para provocar una respuesta osteogénica era varias órdenes de magnitud superior a aquella usada en el presente estudio. En efecto, hemos demostrado nosotros mismos que cuando BMP-2 es entregado a un emplazamiento ectópico en ratas mediante esponjas de colágeno, una concentración superior del fármaco es requerida para inducir la actividad osteogénica que cuando es incorporada biomiméticamente en mezclas de sales como se describen en el ejemplo 1. Estos descubrimientos enfatizan la importancia del modo de entrega del fármaco. Cuando son usados materiales menos biocompatibles para portar BMP-2, este agente tiene una bioactividad inferior, debido al alto nivel de reactividad adversa del tejido (es decir, una aumentada respuesta de células gigantes de cuerpos extraños). Asimismo en conjunto con tales materiales, BMP-2 provoca una reacción de resorción ósea intensa muy temprana, que podría dominar sobre las actividades de formación ósea.

Durante la primera semana postoperatoria, la degradación de los recubrimientos biomiméticos que contienen una mezcla de sales como se describen en el ejemplo 1, el BMP-2 incorporado fue mediado exclusivamente por las células gigantes de cuerpos extraños; sólo a partir de ahí participaron los osteoclastos en el proceso. El alto índice de degradación del recubrimiento observado durante y después de la tercera semana (tabla 3), que condujo a una reducción significante en el volumen del recubrimiento llegado el fin de la quinta semana, se explica lo más probablemente por las actividades resortivas sinergísticas de las células gigantes de cuerpos extraños y osteoclastos. Durante la fase posoperatoria inicial (la primera semana), las células gigantes de cuerpos extraños, al ser atraídas al emplazamiento de la implantación como parte de la respuesta inflamatoria montada contra el material extraño, y al embarcar en sus tareas destructivas atacando el recubrimiento, pueden en realidad promover la actividad osteogénica liberando BMP-2 de la matriz inorgánica según la degradan. Podrían asumir así el papel jugado por los osteoclastos en la formación ósea fisiológica y en trayectorias de señalamiento basadas en la remodelación, un papel que los mismos osteoclastos cumplen en nuestro modelo después de la primera semana de la implantación. Por lo tanto, las células gigantes de cuerpos extraños potencialmente destructivas podrían funcionar en una capacidad constructiva. No obstante, actualmente no tenemos ninguna evidencia para apoyar esta hipótesis. Podría por supuesto ser argumentado que el BMP-2 es liberado espontáneamente de los recubrimientos. No obstante, en un estudio precedente, la liberación espontánea de una proteína de modelo incorporado (albúmina de suero bovino) se descubrió ser insignificante según el ensayo ELISA. La cantidad de BMP-2 liberada de esta manera probablemente también es insignificante y casi ciertamente se encuentra por debajo del umbral osteoinductivo. Esta suposición está soportada por nuestros descubrimientos para el grupo de BMP-2 adsorbido. Estos recubrimientos indujeron sólo una respuesta osteogénica abortiva durante la primera semana posoperatoria, y las islas de hueso formadas fueron tan pequeñas y tan poco frecuentes como para no ser mensurables cuantitativamente; en la segunda semana, este tejido óseo había sido completamente resorbido.

El tejido óseo fue depositado no sólo en la proximidad inmediata de los discos en el grupo de BMP-2 incorporado, sino también directamente sobre sus superficies. La médula ósea, también, fue observada en contacto directo con estos recubrimientos. Estos descubrimientos, particularmente éste último, indican que los recubrimientos biomiméticos eran altamente biocompatibles, ya que la médula ósea contiene células inmunocompetentes que son muy sensibles al material extraño. El hecho de que la cobertura del área de la superficie de estos recubrimientos con células gigantes de cuerpos extraños sólo fue moderada al final del periodo de seguimiento de 5 semanas también argumenta en esta dirección.

Focos osteogénicos también fueron observados dentro de las cápsulas de tejido conjuntivo de los discos en el grupo de BMP-2 incorporado. Por lo tanto, las fibrillas de colágeno en ellas sirvió aparentemente como una estructura estable para el crecimiento óseo directo. Tejido óseo fue depositado a una distancia de 340 \pm 13 (SEM) \mum de los discos después de 3 semanas. Este es un descubrimiento impresionante para un emplazamiento ectópico, que difiere tanto bioquímica como mecánicamente del ortotópico. Los niveles locales sostenidos de BMP-2 pueden haber explicado este fenómeno. Llegado el final de la quinta semana, esta distancia máxima había disminuido a 217 \pm 5.4 (SEM) \mum, indicando que el proceso de formación ósea inicialmente generalizado se estaba circunscribiendo a la proximidad inmediata del implante y que las actividades de remodelación ósea aumentaban. Aunque fuese así, la actividad osteogénica todavía predominaba en esta coyuntura final, y la masa ósea total todavía se estaba incrementando.

En resumen, la incorporación de BMP-2 en recubrimientos biomiméticos según la invención produce propiedades altamente biocompatibles, osteoconductivas y osteoinductivas. Además, BMP-2 es liberado no sólo a un nivel que es suficiente para inducir la osteogénesis, sino que también gradualmente, lo más probablemente de manera mediada por células, de manera que la actividad osteogénica es sostenida durante un periodo considerable de tiempo. En experimentos futuros, este principio será optimizado para la aplicación en emplazamientos ortotópicos.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones. Bibliografía de Patentes citada en la descripción

\sqbullet EP 0987031 A [0008]

\sqbullet US 6569489 B [0009]

\sqbullet US 200300113438 A [0010]

\sqbullet US 6207218 B [0011]

Bibliografía distinta de patentes citada en la descripción

\sqbullet K. de Groot Proc Instn Mech Engrs, vol. 212, [0006]

Claims (17)

1. Proceso para el recubrimiento de un sustrato, particularmente un dispositivo médico, con una composición biomimética, que comprende:

a)

producir por lotes en un sistema cerrado una composición acidificada biomimética que comprende una mezcla salina acuosa que contiene iones de calcio, magnesio, fosfato y bicarbonato y una sustancia bioactiva,

b)

contactar el sustrato con dicha composición biomimética y

c)

almacenar la composición biomimética en contacto con el sustrato y permitir que ocurra un incremento gradual del pH y causar la precipitación de sales y la coprecipitación de la sustancia bioactiva en dicho sustrato y obtener un sustrato recubierto, dicha sustancia bioactiva siendo seleccionada del grupo que consiste en un factor de crecimiento osteogénico, un factor que promueve el crecimiento celular, un factor de angiogénesis, un factor lipogénico, una sustancia antibiótica, una proteína, una vitamina, una hormona, un inhibidor, un gen o fragmento de un gen que muestra efectos similares a aquellos de los factores de crecimiento.

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2. Proceso según la reivindicación 1, en donde la coprecipitación y marcado de una película de recubrimiento en el sustrato se logra en una única etapa.

3. Proceso según la reivindicación 1, en donde la composición biomimética se pasa a través de un filtro bacteriológico antes de ser contactado con el sustrato.

4. Proceso según la reivindicación 1, en donde todas las sales y sustancias bioactivas en la solución salina son disueltas completamente y esta solución salina tiene un pH que oscila de 5.2-6.6, que es producido añadiendo un ácido.

5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el pH es ajustado añadiendo un ácido seleccionado del grupo que consiste en ácido hidroclórico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y combinaciones de los mismos.

6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición biomimética es almacenada en contacto con el sustrato hasta que el pH ha aumentado a un valor que varía de 7.0-8.5.

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7. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición biomimética es preparada añadiendo a agua acidificada

i)

cloruro de magnesio,

ii)

cloruro de calcio,

iii)

hidrógeno fosfato de sodio,

después de lo cual

iv)

se añade bicarbonato sódico y se permite el aumento del pH.

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8. Proceso según la reivindicación 7, en donde las sales son añadidas y disueltas en agua acidificada en la secuencia i), ii), iii), iv) dada.

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9. Proceso según las reivindicaciones 7-8, en donde las siguientes sales son incorporadas en la composición biomimética en las concentraciones indicadas:

\quad

0.2-2.0 g/l de cloruro de magnesio, 0.4 -2.0 g/l de cloruro de calcio, 1.0-5.0 g/l de bicarbonato sódico, 0.2-1.5 g/l de Na_{2}HPO_{4} y opcionalmente 0.1-1 g/l de cloruro de potasio.

\vskip1.000000\baselineskip

10. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el periodo de almacenamiento del sustrato en contacto con la composición del recubrimiento varía de 5-48 horas y el espesor del resultante recubrimiento está dentro de la gama de 0.5 100 micrones.

11. Proceso según las reivindicaciones 1-10 en donde la composición contiene además cloruro sódico.

12. Proceso según la reivindicación 10, en donde se usa cloruro sódico en una concentración de 20-50 g/l.

13. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1-12, en donde una composición biomimética es producida para los depósitos de tejido blando incluyendo una sal de potasio en una cantidad que varía preferiblemente de 0.1-1 g/l.

14. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde la composición salina en la mezcla inicial es isotónica con sangre.

15. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que produce un recubrimiento que comprende carbonato cálcico, dihidrato de fosfato dicálcico, fosfato de ortocalcio e carbonato de hidroxil apatita, en estado amorfo, cristalino o amorfo a cristalino o formas mezcladas de los mismos, y una cantidad eficaz de sustancia bioactiva.

16. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el sustrato comprende un polímero blando o duro seleccionado del grupo que consiste en colágeno, polilactato y gelatina.

17. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el sustrato es una prótesis ósea, una prótesis dental o una prótesis mamaria.