ES2563168T3

ES2563168T3 - Un implante de tejido óseo que contiene iones de litio y su método de fabricación

Info

Publication number: ES2563168T3
Application number: ES08785974.0T
Authority: ES
Inventors: Stig Hansson; Ingela Petersson
Original assignee: Dentsply IH AB
Current assignee: Dentsply IH AB
Priority date: 2007-07-09
Filing date: 2008-07-08
Publication date: 2016-03-11
Anticipated expiration: 2028-07-08
Also published as: BRPI0813639A2; KR20100055408A; WO2009007371A1; JP2010533011A; US20120315310A1; JP5487101B2; EP2014259A1; EP2178467A1; AU2008274301A1; AU2008274301B2; BRPI0813639B1; US20110151026A1; CN101686861A; CA2692589A1; US8597676B2; EP2178467B1; CN101686861B

Abstract

Un implante para la implantación en el tejido óseo dotado de una superficie; dicho implante es un implante metálico o un implante no metálico provisto de una superficie metálica; dicha superficie está cubierta por una capa de óxido que contiene iones de litio que se caracteriza porque dicha capa de óxido tiene un espesor del orden de 2 a 100 nm.

Description

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DESCRIPCION

Un implante de tejido oseo que contiene iones de litio y su metodo de fabricacion Area tecnica

La presente invencion se refiere a un implante destinado a la implantacion en el tejido oseo y a un metodo para su fabricacion. El estado anterior de la tecnica mas proximo es el documento U.S. 4 365 356 A, que define el preambulo de la reivindicacion 1.

Antecedentes tecnicos

Hoy en dfa se utiliza a menudo un procedimiento de una etapa para implantar implantes ortopedicos o dentales, generalmente implantes metalicos, en el tejido oseo.

En el procedimiento de una etapa, una primera pieza del implante, como un aditamento dental, se coloca quirurgicamente en el tejido oseo, y una tapa de cicatrizacion o una pieza secundaria del implante, como un pilar, se fija luego directamente a la primera pieza del implante despues de la operacion quirurgica. Despues de eso se deja cicatrizar el tejido blando alrededor de la tapa de cicatrizacion o la pieza secundaria del implante. Cuando se usa una tapa de cicatrizacion, despues de unas pocas semanas o meses se quita la tapa sin ningun procedimiento quirurgico, y se fijan las piezas secundarias del implante, como un pilar y una corona provisoria, a la primera pieza del implante. El procedimiento de una etapa se describe por ejemplo en L Cooper et al: "A multicenter 12-month evaluation of single-tooth implants restored 3 weeks after 1-stage surgery", The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants, Vol 16, No 2 (2001).

El procedimiento de dos etapas, que es otro procedimiento de implantacion conocido, consiste en colocar quirurgicamente en una primera etapa, una primera pieza del implante, como un aditamento dental, en el tejido oseo, donde luego se le permite permanecer descargada e inmovil durante un penodo de cicatrizacion de tres meses o mas para permitir que el tejido oseo crezca sobre la superficie del implante para permitir al implante fijarse bien en el tejido oseo, dejar que el corte de tejido blando que cubre el sitio del implante cicatrice sobre el implante y en una segunda etapa abrir el tejido blando que cubre el implante y fijar las piezas secundarias del implante, como un pilar dental y/o un diente de restauracion, a la primera pieza del implante, por ejemplo dicho aditamento, formando la estructura final del implante. Este procedimiento se describe por ejemplo por Branemark et al: "Osseointegrated Implants in the Treatment of the Edentulous Jaw, Experience from a 10-year period" Almquist y Wiksell International, Estocolmo, Suecia.

Sin embargo, el hecho de que el implante no se deba cargar durante el penodo de cicatrizacion significa que las piezas secundarias del implante no se pueden fijar a la primera pieza del implante ni utilizar durante el penodo de cicatrizacion de tres meses o mas. Habida cuenta del malestar asociado a esto, es deseable minimizar el penodo de tiempo necesario para la primera etapa mencionada antes o incluso realizar todo el procedimiento de implantacion en una sola operacion, es decir utilizar el procedimiento de una etapa.

Para algunos pacientes, se podna considerar mejor esperar al menos tres meses antes de cargar funcionalmente el implante, tanto para el procedimiento de una como de dos etapas. Sin embargo, una alternativa utilizando el procedimiento de una etapa es poner el implante en funcion directamente despues de la implantacion (carga inmediata) o en unas pocas semanas despues de la implantacion (carga precoz). Estos procedimientos son descritos, por ejemplo, por D M Esposito, pp 836-837, en Titanium in Medicine, Material Science, Surface Science, Engineering, Biological Responses and Medical Application, Springer-Verlag (2001).

Es esencial que el implante establezca una suficiente estabilidad y union entre el implante y el tejido oseo para permitir la carga inmediata o precoz del implante dada a conocer precedentemente. Debe senalarse tambien que una carga inmediata o precoz del implante puede ser beneficiosa para la formacion de hueso.

Algunos de los metales o aleaciones, como titanio, circonio, hafnio, tantalio, niobio o sus aleaciones, que se utilizan para los implantes oseos son capaces de formar una union relativamente fuerte con el tejido oseo, una union que puede ser tan fuerte como el tejido oseo por sf mismo, a veces incluso mas fuerte. El ejemplo mas notable de este tipo de material de implante metalico es el titanio y las aleaciones de titanio, cuyas propiedades en este sentido se conocen desde 1950. Esta union entre el metal y el tejido oseo ha sido denominada "osteointegracion" ( Albrektsson T, Branemark P I, Hansson H A, Lindstrom J, "Osseointegrated titanium implants. Requirements for ensuring a long- lasting, direct bone anchorage in man", Acta Orthop Scand, 52:155-170 (1981)).

Cabe senalar que en contacto con oxfgeno, el titanio, circonio, hafnio, tantalio, niobio y sus aleaciones se cubren instantaneamente con una capa delgada de oxido. Esta capa de oxido nativo en implantes de titanio consiste principalmente en dioxido de titanio(IV) (TO2) con cantidades menores de Ti2O3, TiO y Ti3O4.

Aunque la union entre el metal (oxidado), por ejemplo, titanio, y el tejido oseo puede ser comparativamente fuerte, es

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deseable mejorar esta union.

Existen hasta la fecha varios metodos para tratar implantes metalicos con el fin de obtener una mejor fijacion del implante y de esa manera una mejor osteointegracion. Algunos de estos implican alterar la morfolog^a del implante, por ejemplo mediante la creacion de irregularidades en la superficie del implante con el fin de aumentar la rugosidad de la superficie en comparacion con una superficie sin tratar. Se cree que una mayor rugosidad de la superficie, que da una mayor area de contacto y fijacion entre el implante y el tejido oseo, proporciona una mejor retencion mecanica y resistencia entre el implante y el hueso. Es bien sabido en el area que se puede proporcionar una rugosidad superficial mediante, por ejemplo, pulverizacion de plasma, granallado o grabado con acido.

Otros metodos para obtener una mejor fijacion del implante al tejido oseo implican la alteracion de las propiedades qmmicas de la superficie del implante.

Varios metodos implican la aplicacion de una capa de material ceramico, como hidroxiapatita, a la superficie del implante, entre otras cosas para mejorar la union del implante al hueso dado que la hidroxiapatita esta relacionada qmmicamente con el hueso. Una desventaja de los recubrimientos que contienen hidroxiapatita es, sin embargo, que pueden ser fragiles y pueden escamarse o desprenderse de la superficie del implante, lo que a su vez conduce a un fracaso final del implante.

Otros metodos para alterar las propiedades qmmicas del implante implican la aplicacion de fluor y/o fluoruro sobre la superficie del implante (WO 94/13334, WO 95/17217, WO 04/008983 y WO 04/008984).

WO 2006/004297 da a conocer un implante de metal osteoinductor, como titanio o una aleacion de este, que contiene una capa de un oxido metalico y una capa de un material bioactivo compuesto por uno o mas de Li, Na, K, Rb, Cs, Fr, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra, Sc, Y, Lu, Ti, Zr, Hf, Nb, Ta, Cr, Mo, W, Mn, Re, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Zn, Ga, In, Ti, Sn y Bi formada sobre ella. Un ejemplo de trabajo solo se describe, sin embargo, para un implante de titanio que contiene calcio como capa de material bioactivo.

Tambien cabe mencionar a WO 2002/096475 que se refiere a un implante de titanio que contiene calcio, fosforo o azufre en la capa de oxido de titanio, y a WO 2005/084577 que se refiere a un implante de titanio que contiene magnesio en la capa de oxido de titanio.

La publicacion de la solicitud de patente francesa N° 2 216 981 da a conocer endoprotesis ortopedicas para la fijacion al hueso compuesta preferentemente por ceramica de aluminio. Segun una realizacion de la invencion dada a conocer en FR 2 216 981, las partes de la superficie de la protesis destinadas al contacto con el hueso pueden ser mezcladas con iones que estimulan la formacion de una fijacion solida entre la protesis y el tejido oseo. Se han utilizado iones de litio, boro, carbono, fluor, sodio, magnesio, silicio, fosforo, potasio y/o calcio en ceramica vftrea y ceramica de aluminio.

Aunque existen implantes que proporcionan una union comparativamente fuerte entre la superficie del implante y el hueso, existe la necesidad en el area de mejorar esta union, es decir, mejorar el proceso de "osteointegracion" de un implante en el tejido oseo.

Por lo tanto, existe la necesidad en el area de proporcionar un implante que tenga una velocidad de fijacion deseada y que tenga la capacidad de formar una union mecanicamente fuerte entre el hueso y el implante luego de la implantacion de este en el tejido oseo.

Resumen de la invencion

Es un objetivo de la invencion satisfacer las necesidades mencionadas.

Por lo tanto, se va a proporcionar un implante biocompatible destinado a la implantacion en el tejido oseo.

Los inventores encontraron que los iones de litio administrados localmente en el tejido oseo tienen un efecto local sobre la formacion de hueso y la masa osea en el tejido oseo.

Se encontro ademas que un implante que comprende una capa de oxido superficial que contiene o libera iones de litio induce un aumento en la produccion de fosfatasa alcalina en los osteoblastos, lo que es crucial para su diferenciacion y mineralizacion posterior. Por lo tanto, se puede lograr una mejora en la velocidad de formacion de hueso y una mejora en la velocidad de fijacion entre el tejido oseo y el implante, mejorando ademas la posibilidad de carga inmediata o precoz del implante.

Ademas, se encontro que un implante que comprende una capa de oxido superficial que contiene y/o libera iones de litio proporciona un aumento de la proliferacion de osteoblastos y un aumento en la produccion de osteoprotegerina, en comparacion con un implante metalico que comprende una capa de oxido superficial que contiene, por ejemplo, iones de calcio o magnesio. Se proporciona por tanto una mayor masa osea lo que implica una union

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mecanicamente mas fuerte entre el implante y el tejido oseo.

Concordantemente, se encontro que los iones de litio administrados localmente mejoran el proceso de osteointegracion de un implante en el tejido oseo.

Segun un primer aspecto de la invencion, se logran los objetivos anteriores con un implante destinado a la implantacion en el tejido oseo como el definido en la reivindicacion 1.

Segun un segundo aspecto de la invencion, se proporciona un metodo para fabricar un implante de tejido oseo con las caractensticas mencionadas antes. El metodo se define en la reivindicacion 8.

El metodo de la invencion es economico y facil de llevar a cabo, permitiendo por consiguiente la produccion en masa. Ademas, es facil de esterilizar y almacenar.

Otras caractensticas y ventajas de la presente invencion se tornaran evidentes a partir de la descripcion siguiente de la invencion.

Breve descripcion de las figuras

Fig. 1 es una imagen de TOF-SIMS (masas de iones secundarios por tiempo de vuelo) que ilustra la presencia y la distribucion de litio para una muestra de titanio esterilizada luego de la reduccion en LiNO3. (El litio se muestra como puntos blancos).

Fig. 2 ilustra la presencia de litio, (pico N° 7) en una muestra de titanio esterilizada (fig. 2a) en comparacion con la muestra de referencia de una muestra de titanio esterilizada tratada con acido oxalico (fig. 2b) (a partir de mediciones TOF-SIMS).

Fig. 3 es una imagen de TOF-SIMS que ilustra la presencia y la distribucion de litio para una muestra de titanio esterilizada luego del anodizado en LiOH.

Fig. 4 ilustra el grado de proliferacion de celulas MG-63 luego de 3, 7 y 14 dfas de cultivo en poliestireno de celulas tratadas con o sin litio en diferentes concentraciones.

Fig. 5 ilustra la produccion de fosfatasa alcalina en el medio de cultivo celular luego de 3, 7 y 14 dfas de cultivo en poliestireno de celulas tratadas con y sin litio en diferentes concentraciones.

Fig. 6 muestra el grado de proliferacion de las celulas MG-63 en las superficies de referencia 1 y 2 luego de 7 dfas de cultivo con y sin litio en diferentes concentraciones.

Fig. 7 muestra la produccion de fosfatasa alcalina en la superficie de referencia 1 que contiene litio a una concentracion de 1 mM en comparacion con la superficie sin estimular que no contiene litio.

Fig. 8 es una imagen de microscopfa electronica de barrido que ilustra la morfologfa de las celulas MG-63 cultivadas en la superficie de referencia 1 luego de 36 h.

Fig. 9 es una imagen de microscopfa electronica de barrido que ilustra la morfologfa de celulas MG-63 cultivadas en la superficie de referencia 2 luego de 36 h.

Fig. 10 es una imagen de microscopfa electronica de barrido que ilustra la morfologfa de celulas MG-63 cultivadas en la superficie de referencia 1 que contiene litio luego de 36 h.

Fig. 11 ilustra las diferencias en la proliferacion de celulas MG-63 entre la superficie de referencia 1, la superficie de referencia 2 y la superficie de referencia 1 que contiene litio, calcio y magnesio, respectivamente.

Fig. 12 muestra la cantidad de osteoprotegerina medida luego de 7 y 14 dfas de cultivo celular en la superficie de referencia 1 que contiene litio, calcio y magnesio, respectivamente.

Fig. 13 ilustra los valores de la prueba de torque de remocion (RTQ) despues de 6 semanas de la implantacion en tibia de conejo de un implante que contiene litio segun la invencion, en comparacion con un implante con una superficie Osseospeed™ comercial.

Descripcion detallada de la invencion

Segun se usa en este documento el termino "implante" incluye dentro de su alcance cualquier dispositivo destinado a ser implantado en el cuerpo de un animal vertebrado, en particular un mairnfero, como un ser humano. Los

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implantes se pueden utilizar para reemplazar la anatoirna y/o restaurar alguna funcion del cuerpo.

Generalmente, un implante se compone de una o varias piezas de implante. Por ejemplo, un implante dental habitualmente comprende un aditamento dental acoplado a piezas de implante secundarias como un pilar y/o un diente de restauracion. Sin embargo, cualquier dispositivo, como un aditamento dental, destinado a la implantacion puede denominarse solo el un implante aun si tiene otras piezas conectadas al mismo.

Segun se usa en este documento la expresion "implante (destinado) a la implantacion en el tejido oseo" se refiere a los implantes destinados al menos a la implantacion parcial en el tejido oseo, como los implantes dentales, por ejemplo implantes de una pieza, implantes ortopedicos y similares. Un implante para la implantacion en el tejido oseo tambien puede ser denominado un implante de tejido oseo.

Segun se usa en este documento la expresion "superficie del implante" se refiere al menos a una region superficial definida de un implante. Por lo tanto, la region superficial definida puede incluir toda el area superficial del implante o porciones de este.

Un ejemplo de una superficie de un implante destinado a la implantacion en el tejido oseo es la superficie de un aditamento dental destinado a la implantacion en el maxilar de un paciente y a estar en contacto con tejido oseo.

Otro ejemplo de una superficie de un implante destinado a la implantacion en el tejido oseo es la superficie de un implante de cadera destinado a la implantacion en el femur de un paciente.

Un implante segun la invencion es biocompatible y tiene un efecto local sobre la formacion de hueso y la masa osea en el tejido oseo. Ademas, el implante de la invencion provoca un aumento de la proliferacion de osteoblastos y un aumento en la produccion de fosfatasa alcalina y osteoprotegerina en el tejido oseo. La fosfatasa alcalina es una enzima producida por los osteoblastos que juega un papel importante en la mineralizacion del hueso, y la osteoprotegerina es una citocina que se sabe que aumenta la densidad mineral osea y el volumen oseo en el tejido oseo. La produccion de fosfatasa alcalina y osteoprotegerina indica claramente que el implante segun la invencion tiene un efecto positivo sobre la remodelacion osea.

Un implante segun la invencion proporciona mejores estabilidad del implante y respuesta del tejido oseo, segun se miden por la prueba de torque de remocion (RTQ) (fig 13).

La capa de oxido que cubre la superficie del implante contiene iones de litio que estan dispersos en al menos una parte de la capa de oxido.

El litio es un ion pequeno, cargado positivamente, no toxico, liviano que se ha encontrado que se dispersa facilmente en la capa de oxido que cubre la superficie del implante.

Aunque se conoce un efecto terapeutico de las sales de litio para trastornos maniaco-depresivos, los estudios han demostrado que el tratamiento con litio tambien afecta el metabolismo mineral oseo (por ejemplo, Baran et al, "Lithium Inhibition of Bone Mineralization and Osteoid Formation", J Clin Invest, pp 1691-1696 (1978); Nordenstrom et al, "Biochemical Hyperparathyroidism and Bone Mineral Status in Patients Treated Long-Term with Lithium", Metabolism, vol 43, N° 12, pp 1563-1567 (1994); y Mak et al, "Effects of Lithium Therapy on Bone Mineral Metabolism: A Two-Year Prospective Longitudinal Study", J Clin Endocrin and Metabol, vol 83, N° 11, pp 3857-3859 (1998)).

Recientemente, se ha sugerido la administracion oral de cloruro de litio para el tratamiento de trastornos de baja masa osea, como la osteoporosis, puesto que se concluyo que el litio aumenta la formacion de hueso y mejora la masa osea mediante la activacion de la via Wnt canonica lo que resulta, por ejemplo, en la estimulacion de la replicacion de los pre osteoblastos, la induccion de osteoblastogenesis y la inhibicion de la apoptosis de osteoblastos y osteocitos (Clement-Lacroix et al, "Lrp5-independent Activation of Wnt Signalling by Lithium Chloride Increases Bone Formation and Bone Mass in Mice", PNAS, vol 102, N° 48, pp 17406-17411 (2005) y Krishnan et al, "Regulation of Bone Mass by Wnt Signaling", J Clin Invest, vol 116, N° 5, pp 1202-1209 (2006).

Las vfas de senalizacion Wnt son un objetivo atractivo para el tratamiento de la osteoporosis y en general para el descubrimiento de farmacos anabolicos oseos (Rawadi G et al, "Wnt signalling pathway: a new target for the treatment of osteoporosis", Expert. Opin. Ther. Targets, Vol 9, pp 1063-1077 (2005))). El hecho de que el litio active la via Wnt hace a la presente invencion muy adecuada para la implantacion en el tejido oseo.

Ademas, el hecho de que el litio haya sido utilizado previamente para el tratamiento de los trastornos mamaco- depresivos implica que la descripcion toxicologica y los efectos secundarios por la administracion sistemica son bien conocidos.

Ademas, el litio tiene una qmmica relativamente simple y generalmente es indestructible y no es afectado por ejemplo por la esterilizacion.

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La incorporacion de iones de litio en la capa de oxido puede alterar la estructura del oxido volviendolo mas reactivo. Cuando se incorporan iones de litio cargados positivamente a la capa de oxido, se proporciona una mayor densidad de carga superficial positiva en la superficie del oxido (superficie del implante). Por lo tanto, las protemas ricas en electrones del tejido oseo pueden ser electricamente atrafdas a la superficie. Los iones incorporados tambien pueden afectar la conductividad del oxido que puede tener un efecto positivo sobre la osteointegracion y la hemocompatibilidad.

Al menos una parte de la capa de oxido debe contener iones de litio, y el efecto osteoconductor deseado del litio en un implante de la invencion se puede lograr mediante la presencia de los iones en la capa de oxido. No obstante, tambien se puede lograr mediante la liberacion de iones de litio desde la capa de oxido al lfquido fisiologico que rodea al implante.

Preferentemente, los iones de litio estan homogeneamente distribuidos en la capa de oxido. Dicha distribucion homogenea se ilustra en la figura 1.

El implante segun la presente invencion es adecuadamente un implante metalico, por ejemplo un implante hecho de titanio o una aleacion de titanio.

Sin embargo en realizaciones, el implante puede ser un implante no metalico que contenga por ejemplo un material ceramico, plastico o compuesto. En dichas realizaciones, la superficie del implante es una capa metalica del implante aplicada sobre el implante no metalico, mediante lo cual se proporciona una superficie del implante parcialmente metalica. La capa metalica del implante contiene preferentemente titanio o una aleacion de titanio.

Sin embargo, el implante metalico, y la capa metalica del implante no estan limitados a un metal espedfico, sino que se pueden hacer de cualquier material metalico biocompatible, como circonio o una aleacion del mismo, hafnio o una aleacion del mismo, niobio o una aleacion del mismo, tantalio o una aleacion del mismo, una aleacion de cromo- vanadio, o cualquier combinacion de estos materiales.

La capa de oxido que cubre la superficie del implante tiene un espesor del orden de 2 a 100 nm.

En contacto con oxfgeno, el titanio, circonio, hafnio, tantalio, niobio y sus aleaciones se cubren instantaneamente con una capa delgada de oxido. Esta capa de oxido nativo en los implantes de titanio consiste principalmente en dioxido de titani(IV) (TO2) con cantidades menores de Ti2O3, TiO y Ti3O4.

En realizaciones preferidas, la capa de oxido es una capa de oxido que se forma espontaneamente, por ejemplo, en contacto con el aire. El espesor de una capa de oxido formada espontaneamente es del orden de 2 a 18 nm, por ejemplo del orden de 2 a 6 nm.

La capa de oxido segun la invencion no aumenta sustancialmente de espesor con el tiempo y protege la superficie metalica subyacente de reaccionar con cualquier agente circundante.

Las superficies de implantes metalicas cubiertas por capas de oxido son conocidas en el area. Sin embargo, varios documentos del estado anterior de la tecnica hacen hincapie en la importancia de proporcionar una capa de oxido gruesa, preferentemente por encima de 600 nm sobre la superficie del implante (Sul et al, "Resonance frequency and removal torque analysis of implants with turned and anodized surface oxides", Clin. Oral. Impl. Res., Vol 13, pp 252-259 (2002); Sul et al, "Qualitative and quantitative observations of bone tissue reactions to anodised implants", Biomaterials, Vol 23, N° 8, pp 1809-1817 (2002)). Dichos implantes requieren un paso adicional de oxidacion dado que las capas de oxido del espesor mencionado antes no se pueden obtenener espontaneamente.

Los inventores de la presente encontraron que una capa de oxido con un espesor de menos de 100 nm, preferentemente una capa de oxido con el espesor de una capa de oxido nativa, es decir, una capa de oxido formada espontaneamente, de menos de 18 nm es mas adecuada para la implantacion en el tejido oseo puesto que las capas gruesas de oxido pueden ser muy fragiles. Ademas, las capas gruesas de oxido pueden agrietarse y descascararse durante penodos de implantacion mas prolongados de un implante en el tejido oseo.

Este hallazgo se contrapone a Xiropaidis et al quienes manifiestan que los implantes de titanio con capas de oxido nativas se consideran menos osteoconductores. (Xiropaidis et al, "Bone-implant contact at calcium phosphate-coated and porous titanium oxide (TiUnite™)-modified oral implants", Clin. Oral. Impl. Res, N° 16, pp 532-539 (2005)).

Una capa de oxido segun la invencion no interfiere ni modifica la topograffa de la superficie del implante. Por otra parte, un implante que contiene una capa de oxido con un espesor de menos de 100 nm, por ejemplo, de menos de 18 nm, por ejemplo, entre 2 y 6 nm es biocompatible, lo que es adecuado para su incorporacion en el cuerpo humano.

Por lo tanto, una capa de oxido que contiene iones de litio segun la invencion es adecuada para cualquier geometna o cualquier sustrato.

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La superficie del implante, del implante segun la invencion, es preferentemente una superficie del implante metalica que contiene una capa de oxido metalico sobre su superficie.

En particular, el implante, en particular la superficie del implante segun la invencion contiene titanio o una de sus aleaciones. Dicha superficie del implante esta cubierta por lo tanto por una capa de oxido de titanio.

Concordantemente, en un implante de la presente invencion, la capa de oxido que cubre la superficie del implante es una capa de oxido metalico formada sobre la superficie metalica del implante.

En realizaciones, el implante segun la invencion se puede proporcionar ademas con un deposito por encima de la capa de oxido. Dicho deposito puede comprender un agente estimulante oseo, como litio, estroncio, calcio, magnesio o cualquier otro ion que tenga un efecto estimulante oseo. Habitualmente, el deposito contiene iones de litio.

Segun se usa en este documento el termino "deposito" se refiere a una pelfcula continua o discontinua provista sobre la capa de oxido. Dicho deposito puede tener cualquier espesor y no esta incorporado en la capa de oxido, sino que se proporciona sobre ella.

Habitualmente, el deposito es una precipitacion de sal que contiene uno o una combinacion de iones elegidos entre litio, estroncio, magnesio y calcio.

Habitualmente, el deposito es una precipitacion de sal de litio, es decir, una sal de litio que se precipita sobre la capa de oxido de la superficie del implante.

Los ejemplos de sales de litio adecuadas son hidroxido de litio, fluoruro de litio, cloruro de litio, sulfato de litio, nitrato de litio, carbonato de litio. Sin embargo, se puede utilizar cualquier sal de litio capaz de ser disuelta al menos parcialmente en el lfquido fisiologico que rodea el implante. Dichas sales son conocidas por los expertos en el area.

Luego de la implantacion, un deposito que contiene una precipitacion de sal se disuelve facil y rapidamente en el lfquido circundante de modo que los iones estimulantes oseos son liberados desde el implante. Un implante provisto con un deposito de ese tipo sobre su superficie puede ser particularmente beneficioso en situaciones en las que un implante necesita integrarse mas rapidamente, por ej. en hueso de mala calidad y poca cantidad.

Una ventaja asociada a un implante que contiene un deposito del tipo mencionado antes en su superficie es que los iones estimulantes oseos, por ejemplo los iones de litio, son liberados facil y eficazmente en el lfquido fisiologico que rodea el implante. Por lo tanto, se puede liberar una dosis mayor de iones estimulantes oseos, por ejemplo iones de litio, en el lfquido circundante.

Por consiguiente, el efecto deseado del litio se puede obtener tanto de los iones presentes en el oxido de la capa de oxido que esta sobre la superficie del implante como de los iones liberados de ella.

Un implante segun la presente invencion carece convenientemente de un recubrimiento que contenga un compuesto de fosfato de calcio. Como se senalo en la introduccion, estos implantes son mas propensos a escamarse o desprenderse de la superficie del implante, lo que puede conducir a un fracaso final del implante.

En realizaciones de la invencion, la superficie del implante puede comprender ademas una micro rugosidad con una rugosidad media cuadratica (Rq y/o Sq) de < 250 nm (es decir, una micro rugosidad compuesta por poros con un diametro de poro de < 1 pm y una profundidad de poro de < 500 nm) en al menos una parte de la superficie del implante. Segun se usa en este documento la expresion "nano rugosidad o micro rugosidad" se refiere a una rugosidad de la superficie que consta de irregularidades superficiales que tienen dimensiones inferiores a 1 pm.

Tal rugosidad de la superficie es probable que provea de una zona de contacto y fijacion mayor entre el implante y el tejido oseo y proporcione mejores retencion mecanica y resistencia entre el implante y el hueso. En realizaciones alternativas, la superficie del implante se compone de fluor y/o fluoruro, por ejemplo 0.2-20%, y opcionalmente tambien una micro rugosidad con una rugosidad media cuadratica (Rq y/o Sq) de < 250 nm, en al menos una parte de la superficie del implante.

Opcionalmente, la superficie del implante segun la invencion puede contener una macro rugosidad. Segun se usa en este documento la expresion "macro rugosidad" se refiere a una rugosidad de la superficie que comprende irregularidades superficiales que tienen dimensiones superiores a 1 pm.

Tambien se debe hacer constar que la superficie del implante puede ser roscada o sin roscar o se le pueden dar otras caractensticas topograficas dependientes del uso.

Ademas, la presente invencion se refiere a un metodo para fabricar un implante de tejido oseo con las caractensticas descritas antes, que comprende los pasos de:

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a) proporcionar un implante dotado de una superficie de implante;

b) formar una capa de oxido que recubra dicha superficie del implante;

c) formar iones cargados negativamente sobre dicha capa de oxido; y

d) poner en contacto dicha capa de oxido con iones de litio.

Como se menciono previamente, el implante es un implante metalico, o es un implante no metalico provisto de una superficie metalica. Cuando se utilizan implantes no metalicos en la presente invencion, se puede proporcionar una superficie metalica del implante por cualquier tecnica adecuada conocida por los expertos en el area. Por ejemplo, se puede usar cualquier tratamiento electroqmmico adecuado.

Una capa de oxido que cubre la superficie del implante se forma preferentemente espontaneamente, por ejemplo, en contacto con el aire. Dicha capa es pasiva e inerte, es decir, es estable y evita que la superficie metalica subyacente reaccione posteriormente.

Sin embargo, es posible utilizar cualquiera de las tecnicas de oxidacion convencionales en el metodo citado precedentemente. Por lo tanto, el metodo no se limita a la formacion espontanea de una capa de oxido. Por ejemplo, se puede formar una capa de oxido sobre una superficie metalica del implante mediante oxidacion anodica del implante en un electrolito, como una solucion acuosa de un acido organico. Tambien se puede formar una capa de oxido sobre una superficie metalica del implante mediante calentamiento en el aire, por ejemplo, a 150-1300 °C. Ademas, se puede formar una capa de oxido sobre una superficie metalica del implante mediante precipitacion del oxido sobre la superficie del implante desde una solucion adecuada.

Como ya se menciono, una capa de oxido que cubra dicha superficie del implante se forma preferentemente espontaneamente, lo que es una ventaja ya que no es realmente necesario ningun paso adicional de oxidacion.

Por referencia al paso c) en el metodo descrito antes, se pueden formar iones cargados negativamente en dicha capa de oxido sometiendo la superficie del implante a un ambiente alcalino.

En contacto con una solucion acuosa el oxido metalico de la superficie, por ejemplo oxido de titanio, alterara la estructura de la molecula de agua de sus inmediaciones, y, dependiendo del pH, se volvera ya sea positiva o negativamente cargada. Cuando la superficie no esta cargada y no hay iones adsorbidos sobre la superficie, el pH se denomina punto de carga cero pHpzc. El pHpzc para el oxido de titanio es de 5-7.

Por lo tanto, cuando la superficie de oxido de titanio esta rodeada por un ambiente acuoso y alcalino, por ejemplo, una solucion alcalina con un pH superior a 7, la superficie se vuelve ligeramente cargada negativamente debido a la formacion de grupos hidroxido cargados negativamente unidos a la superficie. Los iones de litio cargados positivamente que pueden estar presentes en una solucion circundante pueden ser por lo tanto atrafdos electricamente a la superficie del oxido (superficie del implante) y de esa manera quedar incorporados en al menos parte de la capa de oxido, habitualmente la parte superior de la capa de oxido. Preferentemente, los iones de litio se distribuyen homogeneamente en la capa de oxido.

Se puede lograr un ambiente alcalino localmente sobre la superficie del oxido; es decir se pueden formar iones cargados negativamente sobre la capa de oxido aplicando un potencial que sea mas negativo que -0.5 V; habitualmente en el intervalo entre -0.5 y -3.5 V. La aplicacion de un potencial de ese tipo aumentara la alteracion de las moleculas de agua, generando la formacion de gas de hidrogeno y grupos hidroxido cargados negativamente unidos a la superficie, sobre la superficie del implante.

Alternativamente, se logra un ambiente alcalino sometiendo la superficie del implante a una solucion alcalina, por ejemplo, remojando la superficie del implante en una solucion alcalina. Dicha solucion alcalina debe tener un pH superior a 7, por ej. superior a 10; y habitualmente superior a 11. El tiempo de remojo puede ser menos de 30 minutos, por ejemplo, menos de 20 minutos, por lo general entre 10 y 15 minutos.

Luego la superficie del implante se pone en contacto con iones de litio cargados positivamente; por ejemplo, sometiendo la superficie del implante a una solucion compuesta por iones de litio. El paso de poner dicha capa de oxido en contacto con iones de litio se puede realizar simultaneamente con, o luego, del paso de formar iones negativamente cargados sobre dicha capa de oxido. Preferentemente los pasos c) y d) del metodo segun la invencion se realizan simultaneamente.

Por ejemplo, aplicando un potencial dentro del intervalo de -0,5 V a -3.5 V en una solucion que contiene litio, se formaran grupos hidroxido cargados negativamente, lo que conduce a una interaccion electrostatica entre los grupos hidroxido unidos a la superficie y los iones de litio presentes en la solucion. Esta interaccion electrostatica resulta en que los iones de litio se incorporan en la capa de oxido. Esto se describe adicionalmente en el ejemplo 1.

La solucion que contiene iones de litio puede ser una solucion que contenga hidroxido de litio en una concentracion

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de 5.3 M o menos. La concentracion de hidroxido de litio no debe exceder de 5.3 M, lo que representa el producto de solubilidad del hidroxido de litio. Cuando la concentracion de LiOH exceda de 5.3 M, se formaran cristales de sal y precipitaran sobre la superficie del oxido. En el paso c) del metodo segun la invencion, es deseable que los iones se incorporen en el oxido, y por lo tanto, la concentracion de LiOH no debe exceder el producto de solubilidad.

Una concentracion preferida del hidroxido de litio es dentro del intervalo de 0.05 a 2 M.

Los pasos de formar iones cargados negativamente sobre la superficie del oxido y poner dicha capa de oxido en contacto con los iones de litio, incorporando asf los iones de litio en la capa de oxido que cubre la superficie del implante, no se limitan a un metodo espedfico sino que se pueden lograr mediante cualquier metodo adecuado, o cualquier combinacion de metodos. Por ejemplo, la superficie del implante se puede anodizar en una solucion alcalina compuesta de iones de litio. El ejemplo 1 ilustra la incorporacion de iones de litio mediante anodizado en hidroxido de litio.

Sometiendo la superficie del implante a un paso de anodizacion, el espesor de la capa de oxido se vera afectado. Sin embargo, como el anodizado se realiza preferentemente con una velocidad de barrido relativamente baja, por ejemplo, por debajo de 6 mV/s hasta llegar a 8 V, el espesor del oxido no aumentara a mas de 100 nm.

Por lo tanto, los iones de litio se incorporan en la capa de oxido por medio de la interaccion electrostatica entre grupos hidroxido cargados negativamente formados sobre la superficie del implante y los iones de litio cargados positivamente presentes en una solucion circundante.

Opcionalmente, el metodo segun la invencion puede comprender el paso de enjuague y/o limpieza de dicha superficie del implante despues del paso d). Ademas, la superficie del implante se puede secar y esterilizar luego de dicho paso de enjuague.

En realizaciones, el metodo segun la invencion comprende ademas el paso de formacion de un deposito compuesto por un agente estimulante oseo como litio, estroncio, calcio y magnesio por encima de la capa de dicho oxido, por ejemplo, precipitando una sal que contenga los iones mencionados antes sobre la superficie del implante; es decir sobre la capa de oxido que cubre dicha superficie.

La sal puede ser cualquier sal adecuada de los iones mencionados antes que sea al menos parcialmente soluble en el lfquido fisiologico que rodea el implante. La precipitacion de una sal sobre la superficie del implante formara una pelfcula continua o discontinua sobre la superficie. El espesor del deposito dependera de la cantidad de sal precipitada.

Una sal de ese tipo se disuelve facil y rapidamente en contacto con el lfquido fisiologico que rodea el implante de modo que el efecto estimulante oseo deseado se logra mediante la liberacion de iones estimulantes oseos desde la superficie del implante.

Cuando el deposito es una precipitacion de una sal de litio, el paso de formacion de dichos depositos se puede lograr mediante la modificacion de los metodos descritos antes para la formacion de iones cargados negativamente sobre la superficie de la capa de oxido. Por ejemplo, se puede aplicar un potencial mas negativo que -3.5 V. Dicho potencial negativo da lugar a un desarrollo de gas de hidrogeno significativamente aumentado y una mayor alteracion de las moleculas de agua. Por lo tanto, se forma un exceso de grupos hidroxido unidos a la superficie cargados negativamente que resulta en un deposito, es decir un precipitado de hidroxido de litio por encima de la capa de oxido. Vease el ejemplo 2 por una descripcion adicional.

Ademas, sometiendo la superficie del implante a una solucion compuesta por hidroxido de litio en una concentracion por encima del producto de solubilidad de 5.3 M, se formara un deposito de sal de litio en la superficie del oxido (superficie del implante). Esto tambien se debe al exceso de grupos hidroxido en los alrededores.

Sin embargo, el paso de formacion de un deposito por ejemplo de una sal de litio no se limita a ningun metodo espedfico, sino que se puede utilizar cualquier metodo. Tampoco se limita a una sal de litio espedfica, sino que se puede usar cualquier sal que sea al menos parcialmente soluble en el lfquido fisiologico que rodea a un implante.

Ademas, se puede utilizar cualquier metodo para provocar una precipitacion de sal que contenga cualquiera o una combinacion de los iones elegidos entre litio, estroncio, magnesio y calcio, por ejemplo, la solucion que contiene litio tambien puede contener cualquiera o una combinacion de los iones mencionados precedentemente. En tales casos, una pequena cantidad de esos iones tambien se puede incorporar en la capa de oxido.

El paso de formar un deposito tambien se puede realizar mediante una combinacion de los metodos mencionados antes.

Se debe observar sin embargo que tambien se pueden usar en la presente invencion metodos conocidos para la incorporacion de iones y formacion de deposito sobre la superficie de un implante. Dichos metodos incluyen por

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ejemplo:

• deposito de plasma, por ejemplo mediante fuente de plasma-implantacion ionica o implantacion ionica por inmersion en plasma sobre metales,

• cualquier tratamiento electroqmmico, por ejemplo voltametna en un electrolito compuesto por iones de litio,

• tratamiento del implante con una solucion acuosa o no acuosa compuesta por iones de litio, por ejemplo sumergiendo dicho implante en dicha solucion,

• tratamiento del implante con una tecnica de sol-gel,

• implantacion de haz de iones,

• arco en vado,

• arco en vado filtrado,

• arco en vado de vapor metalico,

• deposito de iones,

• deposito de vapores qmmicos,

• deposito de vapor qmmico asistido por plasma,

• pulverizacion,

• ablacion con laser

• proporcionar un recubrimiento, como un recubrimiento que contenga fosfato de calcio o un recubrimiento de silano, sobre la superficie del implante, en la cual se pueden incorporar o a la cual se puedan fijar los iones de litio,

cualquier combinacion de estos metodos o similares. El metodo segun la invencion puede comprender ademas el paso de creacion de una micro rugosidad en la superficie del implante.

Antes, simultaneamente con o despues de la provision de iones de litio o de una sal de este en la superficie del implante, se puede proporcionar opcionalmente una nano y/o micro rugosidad en la superficie del implante utilizando, por ejemplo, grabado suave, microfabricacion, anodizado, recubrimiento por proyeccion con llama, tratamiento electroqmmico, laser, electroerosion o cualquier otro metodo adecuado de modificacion superficial. Se puede hacer referencia a WO 04/008983 y a WO 04/008984, en las que se dan a conocer metodos adecuados para obtener una superficie del implante de ese tipo. Sin embargo se prefiere que la nano y/o micro rugosidad se proporcione despues del paso a) en el metodo segun la invencion.

El metodo de la invencion tambien puede comprender el paso de aplicacion de fluor a la superficie del implante. Se puede hacer referencia a WO 04/008983, en la que se dan a conocer metodos adecuados para obtener una superficie del implante de ese tipo.

Un metodo adecuado, segun WO 04/008983, para proporcionar fluor y/o fluoruro y una micro rugosidad con una rugosidad media cuadratica (Rq y/o Sq) de < 250 nm en al menos una parte de la superficie del implante es mediante el tratamiento del implante con una solucion acuosa de acido fluorfudrico con una concentracion menor a 0.5 M, por ejemplo de 0.1 M , por un penodo de grabado de hasta 180 s, por ejemplo de 60 s, a temperatura ambiente (vease WO 04/008983 por mas informacion).

Ademas, se puede proporcionar opcionalmente una macro rugosidad en la superficie del implante antes de proporcionar los iones de litio o una de sus sales, y antes de proporcionar opcionalmente la micro rugosidad, sobre ella. Una macro rugosidad se puede proporcionar, por ejemplo, mediante granallado, por ejemplo con partfculas de dioxido de titanio, grabado, microfabricacion, anodizado, recubrimiento por proyeccion con llama, cualquier tratamiento electroqmmico, laser, electroerosion, maquinado, moleteado o cualquier otro metodo adecuado de modificacion superficial.

El metodo para fabricar un implante de tejido oseo segun la invencion no se limita a la incorporacion de iones de litio,

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sino que se puede aplicar para incorporar iones cargados positivamente en la superficie del implante en general. Por lo tanto, este metodo incluye los pasos de:

a) proporcionar un implante dotado de una superficie de implante;

b) formar una capa de oxido que recubra dicha superficie del implante;

c) formar iones cargados negativamente sobre dicha capa de oxido; y

d) poner en contacto dicha capa de oxido con iones cargados positivamente.

Ademas se da a conocer un polvo de granallado, que contiene un oxido metalico, donde el oxido metalico esta compuesto por iones de litio.

El oxido metalico puede ser un oxido metalico elegido del grupo que consiste en oxido de titanio, oxido de circonio, oxido de hafnio, oxido de tantalio y oxido de niobio. Preferentemente el polvo de granallado contiene oxido de titanio en el cual se incorporan iones de litio.

Tambien es posible simplemente utilizar oxido de litio como polvo de granallado.

Puede ser posible utilizar dicho polvo de granallado en el metodo segun la invencion para mejorar aun mas la incorporacion de iones de litio en la capa de oxido que cubre la superficie del implante. Sin embargo, un polvo de granallado se puede utilizar por sf mismo, para incorporar los iones de litio en cualquier capa de oxido sobre cualquier superficie de un implante.

Ademas, se da a conocer un metodo para aumentar localmente la formacion de hueso. Dicho metodo consiste en administrar una composicion que contiene iones de litio o una de sus sales y un portador farmaceuticamente aceptable a una persona que lo necesita. Preferentemente, la composicion que contiene iones de litio o una de sus sales y un portador farmaceuticamente aceptable se administra en un sitio de implantacion en el momento de la implantacion de un implante en el tejido oseo en dicho sitio de implantacion, antes, simultaneamente con, o despues de la colocacion de dicho implante en una cavidad del tejido oseo en dicho sitio.

La composicion compuesta por iones de litio o una de sus sales, se puede administrar dentro y/o en la proximidad de dicha cavidad del tejido oseo.

Los ejemplos de portadores farmaceuticamente aceptables adecuados para utilizar en dicha composicion son una solucion de suero fisiologico; hueso autologo desintegrado; una matriz osea desmineralizada; liposomas; nano o micropartfculas de polfmero(s) biodegradable(s), como acido polilactico (PLA) y acido poliglicolico (PGA); acido hialuronico; colageno; sulfato de condroitina; un hidrogel como alginato; quitosano; un andamio de poliester y fosfato tricalcico; y similares.

Un ejemplo espedfico de un portador adecuado es PepGen P-15 PUTTY™, que son partfculas de hidroxiapatita combinada con P-15, un peptido sintetico que imita la region de union a la celula de colageno tipo I, suspendido en hialuronato de sodio.

La composicion descrita antes puede ser una formulacion de liberacion inmediata, de liberacion retardada o de liberacion controlada.

Los iones de litio o una de sus sales, se pueden utilizar para fabricar una composicion farmaceutica (como la dada a conocer antes) para aumentar localmente la formacion de hueso.

La composicion se puede administrar localmente en un sitio de implantacion en el momento de la implantacion de un implante en el tejido oseo en dicho sitio.

Segun los inventores de la presente, se prefiere la administracion local de iones de litio o una de sus sales directamente en el tejido oseo a la administracion sistemica. Los agentes extranos tienen a menudo una diversidad de efectos sobre el cuerpo humano, que son tanto conocidos como desconocidos. La administracion local de litio o una de sus sales en el tejido oseo es beneficiosa ya que se puede lograr el efecto estimulante oseo evitando simultaneamente los efectos secundarios.

Ademas, la invencion se refiere a un kit para la implantacion de un implante en el tejido oseo que consiste en un implante y una composicion (como la dada a conocer antes) compuesta por iones de litio o una de sus sales y un portador farmaceuticamente aceptable.

Si bien la invencion se ha descrito en detalle y con referencia a sus realizaciones espedficas, sera evidente para un experto en el area que se pueden implementar diversos cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de la

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misma segun se define en las reivindicaciones.

La invencion se ilustrara ahora por medio de los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Incorporacion de iones de litio en una capa de oxido de titanio Reduccion en LiNO3

Se redujeron muestras de titanio por la tecnica de paso potencial en LiNO3 0.1 M, pH 5-6. Se aplico un paso potencial de -3V (todos los potenciales estan referidos a un electrodo de referencia de Ag/AgCI/KCI de doble union, 197 mV contra SHE) sobre la muestra durante 5 minutos, resultando en un desprendimiento continuo de hidrogeno. Despues del proceso de reduccion las muestras se enjuagaron en agua MQ en un bano de ultrasonido durante 2 minutos antes de secarlas y esterilizarlas. La presencia y distribucion de litio se identifico por espectrometna de masas de iones secundarios por tiempo de vuelo (TOF-SlMs) (Figura 1).

Anodizado en una solucion alcalina

Se anodizaron muestras de titanio en LiOH 0.1 M, pH > 11 por LSV (voltametna de barrido lineal) de CA (circuito abierto) a 7 V (todos los potenciales estan referidos a un electrodo de referencia de Ag/AgCI/KCI de doble union, 197 mV contra SHE), a una velocidad de lectura de 2 y/o 5 mV/s y una velocidad de rotacion de 900 rpm. Despues del proceso de anodizado las muestras se enjuagaron en agua Mq en un bano de ultrasonido durante 2 minutos antes de secarlas y esterilizarlas. La presencia de litio sobre la superficie de la muestra de titanio esterilizada se ilustra mediante el espectro de masas de la fig. 2a (pico 7), y se compara con una muestra de referencia de una muestra de titanio esterilizada tratada con acido oxalico (fig. 2b).

La presencia y distribucion de litio se identifico por TOF-SIMS (Figura 3).

Ejemplo 2: Liberacion de litio de la superficie de un implante de titanio

Se redujeron muestras de titanio por la tecnica de paso potencial en LiNO3 0.1 M, pH 5-6. Se aplico un paso potencial mas negativo que -4V (todos los potenciales estan referidos a un electrodo de referencia de Ag/AgCI/KCI de doble union, 197 mV contra SHE) sobre la muestra durante 5 minutos, resultando en un desprendimiento vigoroso de hidrogeno. Despues del proceso de reduccion las muestras se enjuagaron en agua y se secaron.

La liberacion de litio se identifico por ISE (electrodo selectivo de iones) e ICP (plasma inductivamente acoplado). Cuatro muestras en forma de monedas, preparadas segun lo anterior, se colocaron en un vaso con 15 ml de agua MQ. El agua se acidifico a pH 4 con HNO3 20 mM y despues se dejo durante 90 minutos con agitacion moderada antes del analisis. La solucion se analizo usando ISE e ICP, ambos analisis dieron el mismo resultado de 0.4 |jg de litio/ml de muestra.

Ejemplo de referencia 1: Cultivo de celulas MG-63

MG-63 es una lmea de celulas humanas (ATCC N° CRL-1427, U.S.) utilizada convencionalmente en el area para estudios in vitro de osteoblastos. MG-63 se origina de un osteosarcoma humano y presenta numerosos rasgos caractensticos de los osteoblastos humanos, como la fosfatasa alcalina (ALP) y la osteoprotegerina (OPG).

En este estudio, las celulas MG-63 se obtuvieron de celulas congeladas en el segundo pasaje y se cultivaron posteriormente en medio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco que contema 5% de FCS, 1% de PEST, Gibco, Reino Unido) a 37 °C en una atmosfera de 5% de CO2 y 100% de humedad. Cuando las celulas alcanzaron la confluencia se subcultivaron mediante el uso de 0.05% de tripsina-EDTA (Gibco, Reino Unido) hasta que se obtuvo la cantidad de celulas.

La viabilidad de las celulas fue elevada en todos los experimentos (>98%) y se controlo mediante el uso de azul de tripano donde la absorcion del colorante por las celulas muertas se comprobo en un Burkerchamber en un microscopio de luz (LM).

Ejemplo de referencia 2: Proliferacion de celulas MG-63 y produccion de fosfatasa alcalina (ALP)

Con el fin de estudiar el efecto del litio sobre la proliferacion de las celulas MG-63 y la produccion de fosfatasa alcalina (ALP), celulas MG-63 preparadas en el ejemplo de referencia 1 se subcultivaron en placas de 24 pocillos a una densidad de distribucion de 10 000 celulas/cm2, en total 20 000 celulas/pocillo. Se agrego LiNO3 filtrado esteril a concentraciones finales de 10 mM, 5 mM, 3 mM y 1 mM, respectivamente (pH 5.2) a los respectivos pocillos de la placa. Se usaron celulas sin tratar como controles. Las celulas se cultivaron durante 3, 7 y 14 dfas a una temperatura de 37 °C en una atmosfera de 5% de CO2 y 100% de humedad.

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El numero total de celulas en cada pocillo (x 105) despues de cada penodo de tiempo se determino por el metodo de NucleoCassette mediante el NucleoCounter (ChemoMetec A/S Dinamarca).

El numero de celulas se investigo por lisis de las celulas en el "Reactivo A" que tema pH de 1.25 luego de la estabilizacion con el "Reactivo B". En el NucleoCassette, se incorporo yoduro de propidio que se une a la cantidad de ADN liberado. El casete se coloco en el NucleoCounter y la cantidad de fluorocromo medida correspondio a la cantidad de ADN. Se siguieron las instrucciones del fabricante (Chemometec A/S, Dinamarca).

En la recoleccion, se analizo el medio de cultivo celular con relacion al contenido de fosfatasa alcalina. Se midio la fosfatasa alcalina intracelular mediante lisis celular segun las instrucciones del fabricante (SenzoLyte™ pNPP Alkaline Phosphatase Assay Kit Colorimetric BioSite, Suecia). La absorcion se fijo a 405 nm mediante un lector de placas automatico (Vmax, Molecular Device, Reino Unido). Mediante la comparacion de la densidad optica de las muestras con el estandar suministrado con el kit, se pudieron determinar las concentraciones de fosfatasa alcalina. Se siguieron las instrucciones del fabricante (BioSite, Suecia).

Con referencia a la figura 4, se alcanzo un aumento de la proliferacion de celulas MG-63 en los tres puntos temporales con litio 5, 3 y 1 mM. Se observo el mayor numero de celulas detectadas despues de 7 dfas.

La produccion de fosfatasa alcalina fue inicialmente lenta con todas las concentraciones de litio en comparacion con el control (celulas sin estimular). Se detecto un pequeno aumento despues de 7 dfas en comparacion con el control. Sin embargo, se detectaron mayores niveles de fosfatasa alcalina despues de 14 dfas con todas las concentraciones de litio; 1 mM, 3 mM, 5 mM y l0 mM. La mayor cantidad de fosfatasa alcalina se observo con litio 1 mM despues de 14 dfas. Los resultados se ilustran en la figura 5.

Ejemplo de referencia 3: Preparacion de superficies de referencia

Se limpiaron muestras de titanio con la forma de una moneda y luego se sumergieron en una solucion acuosa de acido oxalico 1 M y se dejaron a 80 °C durante 30 minutos con agitacion vigorosa. Despues de 30 minutos las muestras se extrajeron de la solucion de acido oxalico y se enjuagaron en agua seguido de enjuague en agua en un bano de ultrasonido durante 2 minutos. La superficie resultante se denomina "superficie de referencia 1".

Algunas de las muestras se sometieron a un tratamiento secundario con acido fluorhudrico. Aproximadamente 10 minutos despues de enjuagar, las muestras se sumergieron en una solucion acuosa de HF 0.1 M a temperatura ambiente y se agitaron hasta el inicio de la disolucion activa, seguido de un tiempo de tratamiento activo adicional de 40 s. A continuacion, las muestras se extrajeron de la solucion de HF y se enjuagaron en agua seguido de enjuague en agua en un bano de ultrasonido durante 2 minutos. Las muestras se secaron en el aire a temperatura ambiente durante alrededor de 60 minutos antes de la esterilizacion. La superficie resultante se denomina "superficie de referencia 2"

Ejemplo de referencia 4: Proliferacion de MG-63 en las superficies de referencia

Se colocaron monedas de Ti esterilizadas (radiacion p) con superficies de referencia 1 y 2, respectivamente, en placas de 24 pocillos. Las celulas MG-63 se subcultivaron sobre las monedas en las placas de 24 pocillos a una densidad de distribucion de 10 000 celulas/cm2, en total 20 000 celulas/pocillo. Se agrego LiNO3 filtrado esteril a concentraciones finales de 5 mM y 1 mM (pH 5.2) a los respectivos pocillos. Se usaron celulas sin tratar como controles. Las celulas se cultivaron durante 7 dfas a una temperatura de 37 °C en una atmosfera de 5% de CO2 y 100% de humedad.

La superficie de referencia 1 que contema litio a una concentracion de 1 mM indujo un aumento de la proliferacion de las celulas MG-63 despues de 7 dfas de cultivo. La superficie de referencia 2 que contema litio a una concentracion de 1 mM indujo una elevada proliferacion de las celulas despues de 7 dfas de cultivo celular en comparacion con la superficie de referencia 2 sin estimular. La concentracion final de litio de 5 mM indujo un modesto aumento de la proliferacion. Los resultados se ilustran en la figura 6.

Ejemplo de referencia 5: Produccion de fosfatasa alcalina en la superficie de referencia 1

La produccion de fosfatasa alcalina en la superficie de referencia 1 que contema una concentracion de litio 1 mM se comparo con la superficie de referencia 1 sin estimular que no contema litio.

Como se ilustra en la figura 7, la produccion de fosfatasa alcalina aumento con litio 1 mM despues de 7 dfas de cultivo celular.

Ejemplo de referencia 6: Morfologfa

Se prepararon muestras de titanio que teman (i) superficie de referencia 1 (ii) superficie de referencia 2 y (iii) superficie de referencia 1 + litio para microscopfa electronica de barrido (SEM). Las muestras se fijaron con glutaraldehudo a + 4 °C (Kanowsky), seguido de tetroxido de osmio, deshidratacion y finalmente oro pulverizado

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segun las tecnicas estandar.

Las figuras 8, 9 y 10 ilustran la morfologfa de la superficie respectiva despues de 36 h. La superficie de referencia 1 que contema litio tiene una mayor cantidad de celulas en fase proliferativa (fig. 10) (celulas redondas, no dispersas) as^ como una gran cantidad de celulas adhesivas en comparacion con las celulas de las superficies de referencia 1 y 2 que no conteman litio. Tanto en la superficie de referencia 1 (Figura 8) como en la superficie de referencia 2 (Figura 9) las celulas son mas delgadas, mas planas y mas dispersas.

El espacio entre las celulas en las superficies de referencia 1 y 2 es probablemente debido a las dificultades de fijacion y a menudo se ve cuando las celulas son muy delegadas y muy dispersas.

La morfologfa de las celulas cultivadas en la superficie de referencia 1 que contema litio muestra que las celulas estan bien dispersas, indicando alta actividad, proliferan y forman matriz y seudopodos en las superficies. Esto indica que dichas superficies son osteoconductoras asf como osteoconductoras y favorables para la adhesion celular, la proliferacion y la formacion de matriz.

Ejemplo comparativo 1: Proliferacion de MG-63 en superficies de referencia que contienen litio, calcio y magnesio, respectivamente

Se compararon monedas de Ti esterilizadas (radiacion p) con superficies de referencia 1 y 2, con monedas de Ti con superficie de referencia 1 que contema litio, calcio y magnesio, respectivamente, y las monedas se colocaron en placas de 24 pocillos. Las celulas MG-63 se subcultivaron sobre las monedas en las placas de 24 pocillos a una densidad de distribucion de 10 000 celulas/cm2, en total 20 000 celulas/pocillo. Las celulas se cultivaron durante 7 dfas a una temperatura de 37 °C en una atmosfera de 5% de CO2 y 100% de humedad.

El numero de celulas se investigo por lisis de las celulas en el "Reactivo A" que tema un pH de 1.25 luego de la estabilizacion con el "Reactivo B". En el NucleoCassette, se incorporo yoduro de propidio que se une a la cantidad de ADN liberado. El casete se coloco en el NucleoCounter y la cantidad de fluorocromo medida correspondio a la cantidad de ADN. Se siguieron las instrucciones del fabricante (Chemometec A/S, Dinamarca).

Con referencia a la figura 11, la proliferacion con la superficie de referencia 1 que contema litio mostro la mayor proliferacion de celulas MG-63 despues de 7 dfas de cultivo celular. La proliferacion celular fue marcadamente superior que con las superficies de referencia que conteman calcio y magnesio.

Ejemplo comparativo 2: Produccion de osteoprotegerina en la superficie de referencia 1

Se comparo la produccion de osteoprotegerina (OPG) entre monedas de Ti con superficie de referencia 1 que contema litio, calcio y magnesio, respectivamente.

La cantidad de OPG se determino mediante DuoSet ELISA OPG humana/TNFRSF11 B (R&D Systems, Reino Unido). Se centrifugo el sobrenadante de cada pocillo exento de celulas (5 min en 400g) y despues se se utilizo para investigacion. Las concentraciones de las muestras de OPG se determinaron correlacionando las cantidades con la curva estandar provista por el fabricante. La sensibilidad de la prueba (MDD, dosis minima detectable) fue de 50 pg/ml. Se siguieron las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Reino Unido).

Como se ilustra en la figura 12, la mayor produccion de OPG se observo con la superficie de referencia 1 que contema litio despues de 7 y 14 dfas de cultivo celular.

Comparativo ejemplo 3: Respuesta del tejido oseo in vivo

La integracion de los implantes segun la invencion se probo en un modelo de conejo. El objetivo fue estudiar cualitativamente y cuantitativamente la respuesta in vivo del tejido oseo a las modificaciones de la superficie del implante segun la invencion en comparacion con un implante de control comercial.

Implantes para el estudio de torque de remocion

Se compararon accesorios de torque (diseno para torque de remocion de cabeza cuadrada, 3.5 x 8.2 mm) con una superficie de referencia 1 que contema litio, con accesorios de torque de control (3.5 x 8.2 mm) con la superficie Osseospeed™ comercial.

Insercion del implante

Se programaron para cirugfa doce conejos machos, maduros, blancos, New Zeland. Dos conejos murieron durante la anestesia inicial (N° 9, 10). La cirugfa fue sin incidentes. Se hizo una perforacion a baja velocidad (1500 rpg para

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la perforacion de los orificios y 20 rpm para la insercion del implante) con enfriamiento continuo con NaCl. La primera broca fue un buril redondo pequeno y por lo tanto se utilizo como un marcador para las proximas brocas en espiral mas grandes (en conjunto 6 brocas con diametros en el intervalo de 1.2 a 3.35 mm).

Se insertaron tres implantes ("diseno para torque de remocion de cabeza cuadrada"; 3.5 x 8.2 mm) en cada tuburositas tibia. Se programaron implantes de tibia para pruebas de torque de remocion.

Resultados del torque de remocion

Despues de seis semanas el estudio culmino y los conejos se sacrificaron. Se examinaron los implantes y el tejido circundante. Los implantes de tibia rtq fueron faciles de localizar y todos ellos mostraron signos de crecimiento de tejido oseo periostico. La prueba biomecanica de la interfaz hueso-implante se realizo con la prueba de torque de remocion (RTQ). El instrumento de RTQ es un equipo electronico (Detektor AB, Gotemburgo, Suecia) que involucra un transductor de galga extensiometrica utilizado para probar la estabilidad del implante (el torque de aflojamiento maximo en Ncm) en el lecho oseo y puede asf considerarse como una prueba tridimensional que refleja mas o menos la resistencia a la cizalladura interfacial entre el tejido oseo y el implante (Johansson C. B., Albrektsson T. Clin Oral implants Res 1991; 2:24-9). Se aplico un torque lineal creciente sobre el mismo eje del implante hasta que se obtuvo un fracaso de la integracion y se observo el valor maximo.

Como se ilustra en la figura 13, el valor del torque de remocion para el implante que contiene litio segun la invencion mejoro en comparacion con la superficie Osseospeed™ comercial.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un implante para la implantacion en el tejido oseo dotado de una superficie; dicho implante es un implante metalico o un implante no metalico provisto de una superficie metalica; dicha superficie esta cubierta por una capa de oxido que contiene iones de litio que se caracteriza porque dicha capa de oxido tiene un espesor del orden de 2 a 100 nm.
2. Un implante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha capa de oxido tiene un espesor del orden de 2 a 18 nm, por ejemplo de 2 a 6 nm.
3. Un implante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha capa de oxido es una capa de oxido metalico formada a partir de dicha superficie de dicho implante.
4. Un implante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que contiene ademas un deposito por encima de dicha capa de oxido, donde dicho deposito contiene un agente estimulante oseo.
5. Un implante de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que dicho agente estimulante oseo se elige del grupo que consiste en litio, estroncio, magnesio y calcio o una combinacion de estos.
6. Un implante de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5, en el que dicho deposito es una precipitacion de sal que contiene cualquiera o una combinacion de iones elegidos entre litio, estroncio, magnesio y calcio.
7. Un implante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha superficie de dicho implante contiene fluor.
8. Un metodo para fabricar un implante de tejido oseo dotado de una superficie de implante, donde dicho implante es un implante metalico o un implante no metalico provisto de una superficie metalica, donde dicha superficie metalica esta cubierta por una capa de oxido que tiene un espesor del orden de 2 a 100 nm y contiene iones de litio, donde dicho metodo comprende los pasos de:

a) proporcionar un implante dotado de una superficie de implante;

b) formar una capa de oxido que recubra dicha superficie del implante;

c) formar iones cargados negativamente sobre dicha capa de oxido; y

d) poner en contacto dicha capa de oxido con iones de litio.
9. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que dicha capa de oxido se forma espontaneamente.
10. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 8 o 9, en el que dichos iones cargados negativamente sobre dicha capa de oxido se forman sometiendo dicha superficie del implante a un ambiente alcalino.
11. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que dicho paso c y dicho paso d se realizan simultaneamente.
12. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que dicha capa de oxido se pone en contacto con iones de litio sometiendo dicha capa de oxido a una solucion que contiene iones de litio.
13. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, que comprende ademas el paso de formar un deposito que contenga un agente estimulante oseo por encima de dicha capa de oxido.
14. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 13, en el que dicho agente estimulante oseo se elige del grupo que consiste en litio, estroncio, calcio y magnesio o una combinacion de estos.
15. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 13 o 14, donde dicho deposito se forma mediante precipitacion de una sal que contenga cualquiera o una combinacion de los iones elegidos entre litio, estroncio, calcio y magnesio sobre dicha capa de oxido.
16. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, que comprende ademas el paso de aplicar fluor a dicha superficie de dicho implante.