JP5487101B2

JP5487101B2 - リチウムイオンを含む骨組織インプラント

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Publication number: JP5487101B2
Application number: JP2010515494A
Authority: JP
Inventors: スティーグ・ハンソン; インイェラ・ペーターション
Original assignee: アストラ・テック・アクチエボラーグ
Priority date: 2007-07-09
Filing date: 2008-07-08
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2028-07-08
Also published as: CA2692589A1; JP2010533011A; KR20100055408A; US20120315310A1; US20110151026A1; EP2178467B1; EP2014259A1; BRPI0813639A2; BRPI0813639B1; WO2009007371A1; EP2178467A1; AU2008274301A1; AU2008274301B2; CN101686861B; ES2563168T3; US8597676B2; CN101686861A

Description

本発明は、骨組織内への埋め込みのためのインプラント、及びその製造方法に関する。

本発明は、また、ブラスチング粉末及び骨形成を局所的に増大させる方法に関する。

今日では、一段階手順が、概して金属製のインプラントである、整形外科用又は歯科用インプラントの骨組織内への埋め込みのために、しばしば使用される。

この一段階手順においては、歯科用固定具のような第一インプラント部分が骨組織内に外科的に置かれ、そして次に、ヒーリングキャップ（healing cap）又は橋脚歯のような第二インプラント部分が、外科手術後、第一インプラント部分に直接取り付けられる。次に、軟組織がヒーリングキャップ又は第二インプラント部分の周りの治癒を可能にする。ヒーリングキャップが使用される場合、数週間後又は数ヶ月後に、外科的手順を全く用いないでキャップが取り外され、そして橋脚歯及び暫定的歯冠のような第二インプラント部分が第一インプラント部分に取り付けられる。この一段階手順は、例えば非特許文献１に記載されている。

別の公知の埋め込み手順である二段階手順は、歯科用固定具のような第一インプラント部分を骨組織内に第一段階で外科的に置くことを含み、ここで、次いで、骨組織をインプラント表面上に成長させて、インプラントが骨組織に良く付着されるように、３ヶ月又はそれより長い治癒期間、負荷をかけず動かさない状態でそれを休ませ、インプラント部位を覆う軟組織の切開部をインプラント上で治癒させ、そして第二段階において、インプラントを覆う軟組織を開き、そして歯科用橋脚歯及び／又は修復歯のような第二インプラント部分を、該固定具のような第一インプラント部分に取り付けて、最終的なインプラント構造を形成する。この手順は、例えば、非特許文献２に記載されている。

しかしながら、治癒期間中、インプラントに負荷をかけるべきではないという事実は、第二インプラント部分を第一インプラント部分に取り付けできないこと、及び／又は３ヶ月の治癒期間中第二インプラント部分を使用できないことを意味する。これに伴う不快さの観点から、上記第一段階に要する期間を最短化すること、又は全体の埋め込み手順を１つの操作で実行すること、つまり一段階手順を使用することさえ望ましい。

患者によっては、一段階及び二段階手順の両方について、インプラントに機能的に負荷をかける前に、少なくとも三ヶ月待つことがより好ましいと考えられることもあり得る。しかしながら、一段階手順を使用する代替法は、埋め込み直後にインプラントを機能させること（即座に負荷をかける）又は埋め込みの数週間後にインプラントを機能させること（早めに負荷をかける）である。これらの手順は、例えば、非特許文献３に記載されている。

上に開示されたインプラントに即座に又は早めに負荷をかけることを可能ならしめるためには、インプラントが、インプラント及び骨組織の間の十分な安定性及び結合を確立することが重要である。また、インプラントに即座に又は早めに負荷をかけることは骨の形成のために有益な場合であることに気づくであろう。

骨のインプラントのために使用される、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、タンタル、ニオブ又はそれらの合金のような一部の金属又は合金は、骨組織との比較的強い結合、つまり、骨組織自体と同じ強度の、そして時にはそれよりも強い結合でさえも形成することができる。この種の金属製インプラント材料の最も注目すべき例は、この点に関するその性質が１９５０年頃以来知られている、チタン及びチタン合金である。金属及び骨組織の間の結合は、「オッセオインテグレーション」と名付けられている（非特許文献４）。

尚、酸素と接触すると、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、タンタル、ニオブ又はそれらの合金は瞬間的に薄い酸化物層で覆われることに注目され得る。チタン・インプラント上のこの自然酸化物は、少量のＴｉ₂Ｏ₃、ＴｉＯ及びＴｉ₃Ｏ₄を有する、主として二酸化チタン（ＩＶ）（ＴｉＯ₂）から成る。

（酸化された）金属、例えばチタン及び骨組織の間の結合は比較的に強いものの、この結合を向上させることが望ましい。

今日まで、インプラントのより良い付着、従って改質されたオッセオインテグレーションを得るために、金属製インプラントを処理する幾つかの方法がある。これらの幾つかには、例えば、未処理の表面と比較して表面の粗さを増すために、インプラント表面上に凹凸を作出することによってインプラントの形態を変えることが含まれる。表面の粗さを増すことによって、インプラント及び骨組織の間の接触及び付着面積がより大きくなり、インプラント及び骨組織の間のより良い機械的保持と強度が与えられるものと考えられている。表面の粗さを、例えばプラズマ溶射、ブラスチング又は酸エッチングによって備えつけ得ることは、当該技術の範囲内でよく知られていることである。

インプラントの骨組織へのより良い付着を達成するための他の方法には、インプラント表面の化学的性質を変えることが挙げられる。

幾つかの方法には、ヒドロキシアパタイトが骨と化学的に関連がある故に、特にインプラントの骨への結合を改善するために、ヒドロキシアパタイトのようなセラミック材料の層をインプラント表面上に塗布することが挙げられる。しかしながら、ヒドロキシアパタイトを含む被覆に伴う不利な点は、被覆が脆弱であり、そしてインプラント表面から剥がれ落ちるか破れ落ちるかもしれなく、それによって最終的にインプラントの失敗につながるかもしれない。

インプラントの化学的性質を変えるための他の方法には、インプラント表面上へのフッ素及び／又はフッ化物の塗布が挙げられる（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。

特許文献５には、その上に形成される、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｆｒ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｒａ、Ｓｃ、Ｙ、Ｌｕ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ｈｆ、Ｎｂ、Ｔａ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｗ、Ｍｎ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｃｏ、Ｒｈ、Ｉｒ、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ、Ｚｎ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｉ、Ｓｎ及びＢｉの任意の１つ又はそれ以上から構成される金属酸化物の層及び生物活性材料の層を含む、チタン又はその合金のような骨誘導性（osseoinductive）金属インプラントが開示されている。しかしながら、実施例には、生物活性層としてカルシウムを含むチタン・インプラントのみが記載されている。

酸化チタン層中にカルシウム、リン又は硫黄を含むチタン・インプラントに言及している特許文献６、及び酸化チタン層中にマグネシウムを含むチタン・インプラントに言及している特許文献７についても述べることができる。

インプラント表面と骨との間の比較的強い結合を与えるインプラントが存在するものの、この結合を増強する、つまり骨組織中へのインプラントの「オッセオインテグレーション」プロセスを改善するニーズが当該技術において存在する。

従って、骨組織においてその埋め込みの際に、所望の付着速度を有し、そして骨とインプラント間の機械的に強い結合を形成する能力を有するインプラントを提供するニーズが、当該技術において存在する。

ＷＯ９４／１３３３４ＷＯ９５／１７２１７ＷＯ０４／００８９８３ＷＯ０４／００８９８４ＷＯ２００６／００４２９７ＷＯ２００２／０９６４７５ＷＯ２００５／０８４５７７

L Cooperら:（A multicenter 12-month evaluation of single-tooth implants restored 3 weeks after 1-stage surgery）、The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants, Vol 16, No 2 (2001) Branemark ら:（Osseointegrated Implants in the Treatment of the Edentulous Jaw, Experience from a 10-year period）、Almquist & Wiksell International, ストックホルム, スウェーデン D M Esposito, pp 836-837,（Titanium in Medicine, Material Science, Surface Science, Engineering, Biological Responses and Medical Application）中, Springer-Verlag (2001) Albrektsson T, Branemark P I, Hansson H A, Lindstrom J,（Osseointegrated titanium implants. Requirements for ensuring a long-lasting, direct bone anchorage in man）、Acta Orthop Scand, 52:155-170 (1981))

本発明の目的は、上記ニーズを満たすことである。
したがって、骨組織内への埋め込みを目的とした生体適合性インプラントを提供しようとするものである。

本発明者らは、骨組織中に局所的に投与されたリチウムイオンが、該骨組織における骨の成長及び骨量に対する局所的効果を有することを見出した。

更に、見出されたことは、リチウムイオンを含み及び／又は放出する表面酸化物層を含むインプラントが、更なる分化及び石灰化に重要である、骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼの産生の増強を誘導することである。従って、骨形成の改善された速度、並びに骨組織とインプラント間の改善された付着速度が達成でき、更にインプラントを直ちに又は早期にローディングする可能性が改善される。

更に、リチウムイオンを含み及び／又は放出する表面酸化物層を含むインプラントが、例えば、カルシウム又はマグネシウムイオンを含有する表面酸化物層を含む金属インプラントと比べて、骨芽細胞増殖の増強及びオステオプロテゲリン産生の増強を与えることが見出された。それによって、インプラントと骨組織間の機械的により強い結合を示唆する改善された骨量が与えられる。

従って、局所的に投与されたリチウムイオンが、骨組織中のインプラントのオッセオインテグレーションプロセスを改善することが見出された。

本発明の第一の側面によると、上記目的は、酸化物層によって被覆される表面を有する、骨組織内への埋め込みのためのインプラントであって、ここで該酸化物層がリチウムイオンを含むインプラントによって達成される。

本発明の第二の側面によると、上記特性を有する骨組織インプラントの製造方法が提供される。本方法は以下の工程：
ａ）インプラント表面を有するインプラントを備えること；
ｂ）該インプラント表面を被覆する酸化物層を形成すること；
ｃ）該酸化物層上に負に荷電したイオンを形成すること；及び
ｄ）該酸化物層をリチウムイオンと接触させること；
を含む。

本発明の方法は安価であり、そして実行し易いため、それによって大量生産が可能である。更に、それは滅菌及び貯蔵がし易い。

本発明の第三の側面によると、リチウムイオンを含む金属酸化物を含むブラスチング粉末が提供される。

本発明の第四の側面によると、骨形成を局所的に増大させる方法が提供される。該方法は、リチウムイオン又はその塩、及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物を投与が必要な人に投与することを含む。

本発明の第五の側面は、骨形成を局所的に増大させるための薬学的組成物を製造するためのリチウムイオン又はその塩の使用に関する。

本発明の第六の側面は、インプラントを含む骨組織内へのインプラントの埋め込みのためのキット、及びリチウムイオン又はその塩及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物に関する。

本発明の他の特徴及び利点は、本発明の以下の記述から明らかになるであろう。

ＬｉＮＯ₃中での還元後の滅菌されたチタンサンプルに対するリチウムイオンの存在及び分布を示しているＴＯＦ−ＳＩＭＳ画像である（リチウムは白い点として示されている）。シュウ酸で処理された滅菌されたチタンサンプルの参照サンプル（図２ｂ）と比較した、滅菌されたチタンサンプル上のリチウムの存在（ピークＮｏ．７）（図２ａ）を示している（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ測定から）。ＬｉＯＨ中での陽極酸化後の滅菌されたチタンサンプルに対するリチウムイオンの存在及び分布を示しているＴＯＦ−ＳＩＭＳ画像である。種々の濃度でリチウムを有する及びリチウムを有しない細胞処理ポリスチレン上での培養３、７、及び１４日後のＭＧ−６３細胞の増殖度を示している。種々の濃度でリチウムを有する及びリチウムを有しない細胞処理ポリスチレン上での培養３、７、及び１４日後の細胞培地中のアルカリホスファターゼの産生を示している。種々の濃度でリチウムを有する及びリチウムを有しない培養１、２、及び７日後の参照表面上のＭＧ−６３細胞の増殖度を示す。リチウムを含まない非刺激表面と比較して、１ｍＭの濃度でリチウムを含む参照表面１上でのアルカリホスファターゼの産生を示す。参照表面１上で培養された３６時間後のＭＧ−６３細胞の形態を示す走査型電子顕微鏡の画像である。参照表面２上で培養された３６時間後のＭＧ−６３細胞の形態を示す走査型電子顕微鏡の画像である。リチウムを含む参照表面１上で培養された３６時間後のＭＧ−６３細胞の形態を示す走査型電子顕微鏡の画像である。リチウム、カルシウム及びマグネシウムを各々含む参照表面１、参照表面２、及び参照表面１の間でのＭＧ−６３細胞の増殖における差異を示している。リチウム、カルシウム及びマグネシウムを各々含む参照表面１上での細胞培養の７及び１４日後に測定されたオステオプロテゲリンの量を示す。市販のOsseospeed（商標）表面を用いたインプラントと比較した、本発明に記載のリチウムイオンを含むインプラントのウサギ脛骨における埋め込み６週間後の除去トルク試験（ＲＴＱ）の値を説明している。

本明細書で使用されるように、用語「インプラント」は、脊椎動物、特にヒトのような哺乳類の体内にインプラントされることが意図された、任意のデバイスを、その範囲内に含む。インプラントは、体の解剖学的構造を代替するために及び／又は体の任意の機能を修復するために使用され得る。

一般に、インプラントは１つ又は幾つかのインプラント部分から構成される。例えば、歯科用インプラントは通常、橋脚歯及び／又は修復歯のような二次的インプラント部分と結合している歯科用固定具を含む。しかしながら、埋め込みを目的とする歯科用固定具のような任意のデバイスは、他の部分がそこに結合されることになる場合であっても単独でインプラントという場合がある。

本明細書で使用される用語「骨組織内への埋め込みのための（意図された）インプラント」は、歯科用インプラント、例えばワンピースインプラント、整形外科用インプラント等のような、骨組織内への少なくとも部分的な埋め込みを意図したインプラントのことをいう。骨組織内への埋め込みのためのインプラントは骨組織インプラントともいう。

本明細書で使用される用語「インプラント表面」は、インプラントの少なくとも１つの画成された表面領域を称する。このように、画成された表面領域はインプラントの全表面積又はその部分を含んでもよい。

骨組織内への埋め込みのために意図されたインプラント表面の例は、患者の顎骨内への埋め込みのために意図されたそして骨組織と接触させる歯科固定具の表面である。

骨組織内への埋め込みのために意図されたインプラント表面の別の例は、患者の大腿骨内への埋め込みのために意図された股関節インプラントの表面である。

本発明は、表面を有する骨組織内への埋め込みのための；該表面が酸化物層によって被覆されているインプラントであって、ここで該酸化物層はリチウムイオンを含む、インプラントに関する。

本発明に記載のインプラントは生体適合性であり、そして骨組織における骨形成及び骨量に対する局所的効果を有する。更に、本発明のインプラントは、骨組織における骨芽細胞増殖の増強並びにアルカリホスファターゼ及びオステオプロテゲリン産生の増強を引起す。アルカリホスファターゼは、骨の石灰化において主要な役割を演じる骨芽細胞によって産生される酵素であり、そしてオステオプロテゲリンは、骨組織における骨密度及び骨量を増すと知られているサイトカインである。アルカリホスファターゼ及びオステオプロテゲリンの産生は、本発明のインプラントが骨の再モデリングにプラス効果を有することを明らかに示している。

本発明のインプラントは、除去トルク（ＲＴＱ）試験（図１３）によって測定される改善されたインプラントの安定性及び骨組織応答を与える。

インプラント表面を被覆する酸化物層は、酸化物層の少なくとも部分中に分散されるリチウムイオンを含む。

リチウムは、小さく、正に荷電した、非毒性で、軽量のイオンであり、これはインプラントの表面を被覆する酸化物層中に容易に分散されることが見出されている。

リチウム塩の治療効果が躁うつ病に対して知られているものの、複数の研究によれば、リチウム治療は骨ミネラルの代謝にも影響することが示されている（例えば、Baranら、（Lithium Inhibition of Bone Mineralization and Osteoid Formation9)、J Clin Invest, pp 1691-1696 (1978);Nordenstromら、（Biochemical Hyperparathyroidism and Bone Mineral Status in Patients Treated Long-Term with Lithium)、Metabolism, vol 43, No 12, pp 1563-1567 (1994)；及びMakら、（Effects of Lithium Therapy on Bone Mineral Metabolism:A Two-Year Prospective Longitudinal Study)、J Clin Endocrin and Metabol, vol 83, No 11, pp 3857-3859(1998)）。

最近、正規Wnt経路の活性化を介してリチウムが骨の形成を向上させ、そして骨量を改善し、その結果、例えば、前骨芽細胞複製の刺激、骨芽細胞発生の誘導、及び骨芽細胞及び骨細胞アポトーシスを阻害すると結論付けられた故に、骨粗鬆症のような低骨量疾患の治療のために塩化リチウムの経口投与が示唆されている（Clement-Lacroixら、（Lrp5-independent Activation of Wnt Signalling by Lithium Chloride Increases Bone Formation and Bone Mass in Mice)、PNAS, vol 102, No 48, pp 17406-17411(2005)及びKrishnanら、（Regulation of Bone Mass by Wnt Signaling)、J Clin Invest, vol 116, No 5, pp 1202-1209 (2006) ）。

Wntシグナリング経路は、骨粗鬆症の治療のための及び一般的に骨蛋白同化薬発見のための魅力的な標的である（Rawadi Gら、（Wnt signalling pathway:a new target for the treatment of osteoporosis)、Expert. Opin. Ther. Targets, Vol 9, pp 1063-1077(2005)）。リチウムがWntシグナリング経路を活性化するという事実によって、骨組織内への埋め込みのために本発明が非常に適切なものになる。

更に、リチウムが以前に躁うつ病の治療に使用されてきたという事実は、全身投与の際の毒物学的な像及び副作用がよく知られていることを含意している。

また、リチウムは相対的に単純な化学的性質を有し、そして一般に例えば滅菌によって破壊されず且つ影響されない。

リチウムイオンを酸化物層内に組み込むと、酸化物構造が乱れ、それによって酸化物の反応性がより高まる。酸化物層に正に荷電したリチウムイオンが組み込まれると、酸化物表面（インプラント表面）上に、増大した表面正荷電密度が与えられる。従って、骨組織中の電子に富んだ蛋白質が表面に電気的に引き付けられ得る。組み込まれたイオンは、酸化物の電気伝導率にも影響を及ぼし得て、それはオッセオインテグレーション及び血液適合性にプラス効果を有し得る。

酸化物層の少なくとも部分はリチウムイオンを含むべきであり、そして本発明のインプラントにおいてリチウムの所望の骨誘導（osseoinductive）効果が、酸化物層中のイオンの存在によって達成され得る。しかしながら、それは酸化物層からインプラントを囲む生理学的液体内へのリチウムイオンの放出によっても達成され得る。

好ましくは、リチウムイオンは酸化物層中に均質に分布される。そのような均質な分布が図１に示されている。

本発明のインプラントは、適切には、チタン又はチタンの合金でできたインプラントのような金属インプラントである。

しかしながら、実施態様において、インプラントは、例えば、セラミック、プラスチック、又は複合材料を含む非金属インプラントであり得る。そのような実施態様において、インプラント表面は、非金属インプラント上に塗布された金属インプラント層であり、そのことによって部分的に金属のインプラント表面が供される。金属インプラント層は好ましくはチタン又はチタンの合金を含む。

しかしながら、金属インプラント及び金属インプラント層は、特定の金属に限定されるものではなく、ジルコニウム又はその合金、ハフニウム又はその合金、ニオブ又はその合金、タンタル又はその合金、クロム−バナジウム合金、又はこれらの材料の任意の組合せのような任意の生体適合性金属材料で作られていてもよい。

インプラントの表面を被覆する酸化物層は２から１００ｎｍの範囲内の厚みを有する。

酸素と接触すると、チタン、ジルコニウムハフニウム、ランタル、ニオブ又はそれらの合金は瞬間的に薄い自然酸化物で覆われる。チタン・インプラント上のこの自然酸化物は、少量のＴｉ₂Ｏ₃、ＴｉＯ及びＴｉ₃Ｏ₄を有する、主として二酸化チタン（ＩＶ）（ＴｉＯ₂）から成る。

好ましい実施態様において、酸化物層は、自然に、例えば、空気と接触して形成される酸化物層である。そのような自然に形成された酸化物層の厚みは２から１８ｎｍの範囲内、例えば、２から６ｎｍの範囲内である。

本発明の酸化物層は時間が経っても実質的により厚く成長せず、そして下に位置する金属表面が如何なる周囲の試薬とも反応することを防ぐ。

酸化物層によって被覆された金属インプラント表面は当該技術において公知である。しかしながら、幾つかの先行文献は、好ましくは約６００ｎｍを超える厚い酸化物層をインプラント表面上に供することの重要性を強調している。（Sulら、（Resonance frequency
and removal torque analysis of implants with turned and anodized surface oxides)、Clin. Oral. Impl. Res., Vol 13, pp252-259(2002); Sulら、（Qualitative and quantitative observations of bone tissue reactions to anodised implants)」、Biomaterials,Vol23, No8,pp1809-1817(2002)）。上述の厚みの酸化物層が自然に得られない故に、そのようなインプラントは追加の酸化工程を必要とする。

本発明者らは、厚い酸化物層が非常に脆弱であり得る故に、１００ｎｍ未満の厚みを有する酸化物層、好ましくは自然の酸化物層の厚みを有する酸化物層、つまり、１８ｎｍ未満の自然に形成された酸化物層が骨組織内への埋め込みに適していることを見出した。更に、厚い酸化物層は、骨組織におけるインプラントのより長期間の埋め込み中に亀裂及び剥離をもたらし得る。

この知見は、自然の酸化物層を有するチタン・インプラントがより低い骨伝導性（osseoconductive）であると考えられると述べているXiropaidisらとは対照的である（Xiropaidisら、（Bone-implant contact at calcium phosphate-coated and porous titanium oxide（TiUnite（商標））-modified oral implants)」、Clin.Oral.Impl.Res,No 16,pp532-539(2005)）。

本発明の酸化物層は、インプラント表面のトポグラフィーに干渉したり又はそれを修飾したりしない。更に１００ｎｍ未満、例えば、１８ｎｍ未満、例えば、２及び６ｎｍの間の厚みを有する酸化物層を含むインプラントは生体適合性であり、ヒトの体内への組込みに適するものにする。

従って、本発明のリチウムイオンを含む酸化物層は、如何なる幾何形状又は如何なる基体に対しても適している。

本発明のインプラントのインプラント表面は、好ましくはその表面上に金属酸化物層を含む金属インプラント表面である。

特に、インプラント、特に、本発明のインプラントの表面は、チタン又はその合金を含む。従って、そのようなインプラント表面は酸化チタン層によって被覆される。

従って、本発明のインプラントにおいては、インプラント表面を被覆する酸化物層は、インプラントの金属表面上に形成される金属酸化物層である。

実施態様において、本発明のインプラントは、沈着物を酸化物層の上面に更に備えていてもよい。そのような沈着物は、骨刺激効果を有するリチウム、ストロントウム、カルシウム、マグネシウム又は任意の他のイオンのような骨刺激剤を含んでもよい。一般的には、沈着物はリチウムイオンを含む。

本明細書で使用されるように、用語「沈着物」は、酸化物層の上面に備えられる連続又は不連続なフィルムを称する。そのような沈着物は、如何なる厚みを有してもよく、そして酸化物層内に組込まれず、その上に備えられる。

一般的には、沈着物は、リチウム、ストロントウム、マグネシウム及びカルシウムから選ばれたイオンの任意の１つ又は組合せを含む塩析沈殿（salt precipitation）である。

通常、沈着物はリチウム塩析沈殿、つまりインプラント表面の酸化物層の上面に沈殿するリチウム塩である。

適切なリチウム塩の例は、水酸化リチウム、フッ化リチウム、塩化リチウム、硫酸リチウム、硝酸リチウム、炭酸リチウムである。しかしながら、インプラントを囲む生理学的液体中に少なくとも部分的に溶解され得る如何なるリチウム塩も使用され得る。そのような塩は当業者に公知である。

埋め込みの際に、塩析沈殿を含む沈着物は、骨刺激イオンがインプラントから放出されるように、周囲の液中に容易にかつ迅速に溶解する。そのような沈着物をその表面上に備えたインプラントは、インプラントがより迅速に一体化する必要がある場合に、例えば、質及び量に劣る骨において、特に有益である。

上記の種類の沈着物をその表面上に含むインプラントに伴う利点は、骨刺激イオン例えばリチウムイオンが容易にかつ効率的に、インプラントを囲む生理学的液体内に放出されることである。従って、より高い用量の骨刺激イオン、例えばリチウムイオンが、周囲の液内に放出され得る。

従って、インプラント表面上の酸化物層中の酸化物中に存在するイオン及びそこから放出されるイオンの両方からリチウムの所望の効果が得られ得る。

本発明のインプラントは、リン酸カルシウム化合物を含む被覆を欠くのが適切である。導入部で概述した通り、そのようなインプラントは、インプラント表面からより剥がれ落ち易く又は破れ落ちる傾向があり、インプラントの究極的な失敗に繋がり得る。

本発明の実施態様において、インプラント表面は、２５０ｎｍ以下の二乗平均平方根の粗さ（Ｒ_q及び／又はＳ_q）を有するミクロ−粗さ（つまり、孔直径≦１μｍ、かつ孔深さ≦５００ｎｍを有する孔を含むミクロ−粗さ）をインプラント表面の少なくとも一部分上に更に含む。本明細書で使用されるように、用語「ナノ−又はミクロ−粗さ」は１μｍよりも小さな寸法を有する表面凹凸を含む表面粗さを称する。

そのような表面粗さは、インプラント及び骨組織の間のより大きな接触及び付着領域を与えるようであり、そしてインプラント及び骨の間のよりよい機械的保持力及び強度を提供するようである。代替の実施態様において、インプラント表面は０．２〜２０ａｔ％のようなフッ素及び／又はフッ化物、そして場合により、２５０ｎｍ以下の二乗平均平方根粗さを有するミクロ−粗さ（Ｒ_q及び／又はＳ_q）をインプラント表面の少なくとも一部分上に含む。

場合により、本発明のインプラントの表面はマクロ−粗さを含んでもよい。本明細書で使用されるように、用語「マクロ−粗さ」は１μｍよりも大きな寸法を有する表面凹凸を含む表面粗さをいう。

尚、インプラント表面はネジ式（threaded）であるか又はネジ山が無い状態（unthreaded）であってよく、又は他の使用依存性のトポグラフィックな特徴が与えられてもよい。

更に、本発明は、上に概述された特性を有する骨組織インプラントの製造方法であって、以下の工程：
ａ）インプラント表面を有するインプラントを備えること；
ｂ）該インプラント表面を被覆する酸化物層を形成すること；
ｃ）該酸化物層上に負に荷電したイオンを形成すること；及び
ｄ）該酸化物層をリチウムイオンと接触させること；
を含む、方法に関する。

先に述べた通り、インプラントは金属インプラントであってよく、また金属表面を備えられた非金属インプラントであってもよい。本発明において非金属インプラントが使用される場合、金属インプラント表面が、当業者に公知の任意の適切な技術で与えられてもよい。例えば、任意の適切な電気化学的処理を使用できる。

インプラントの表面を被覆する酸化物層は好ましくは自然に、例えば空気に接触して形成される。そのような層は不動態かつ不活性であり、つまりそれは安定であり、そして下に位置する金属表面が更に反応することを防ぐ。

しかしながら、上記方法においては如何なる従来の酸化技術も使用可能である。従って、本方法は酸化物層の自発的形成に限定されるものではない。例えば、酸化物層は、有機酸の水溶液のような電解質中でのインプラントの陽極酸化によって金属インプラント表面上に形成できる。酸化物層は金属インプラント表面上で、空気中における、例えば１５０〜１３００℃での加熱によっても形成できる。更に、酸化物層は、金属インプラント表面上で適切な溶液から酸化物をインプラント表面上に沈殿させることによって形成できる。

既に述べた通り、前記インプラント表面を被覆する酸化物層は好ましくは自然に形成され、それは追加の酸化工程が実際に不要であるので有利である。

上に概述された方法における工程ｃ）に関しては、インプラント表面をアルカリ性環境に晒すことによって、負に荷電したイオンが前記酸化物層上に形成され得る。

水溶液に接触して、金属酸化物、例えば酸化チタンの表面は、そのごく近傍において水の分子構造を乱し、そしてｐＨに依存して、正に又は負に荷電するようになる。表面が荷電されず、そしてイオンが表面上に吸着されない場合、そのｐＨはゼロ荷電点ｐＨ_pzcと呼ばれる。酸化チタンに対するこのｐＨ_pzcは５から７の間である。

従って、酸化チタンの表面がアルカリ水性環境、例えば、７を超えるｐＨを有するアルカリ性溶液で囲まれる場合、表面に結合された負に荷電したヒドロオキシド基が形成する故に、その表面は少し負に荷電することになる。周囲の溶液中に存在し得る正に荷電したリチウムイオンを、このようにヒドロオキシド表面（インプラント表面）に電気的に引き寄せることができ、そしてそのことによって、リチウムイオンが金属酸化物層の少なくとも部分内に、一般には酸化物層の上部に組み込まれるようになる。好ましくは、リチウムイオンは酸化物層中に均質に分布される。

アルカリ性環境は、酸化物の表面上に局所的に達成することができ、つまり−０．５Ｖより負の；一般的には−０．５から−３．５Ｖの範囲で電位を印加することによって、負に荷電したイオンが酸化物層上に形成され得る。そのような電位を印加することによって水分子の乱れが増大し、そしてインプラント表面上で水素ガス及び表面に結合された負に荷電したヒドロキシド基の形成が生じる。

あるいは、アルカリ性環境はインプラント表面をアルカリ性溶液に晒すことによって、例えば、インプラント表面をアルカリ性溶液に浸漬することによって達成される。そのようなアルカリ性溶液は７より高い、例えば１０より高い；そして一般的には１１より高いｐＨを有するべきである。浸漬時間は３０分より短く、例えば２０分より短くてよく、一般的には１０分及び１５分の間であってよい。

次いで、例えばインプラント表面を、リチウムイオンを含む溶液に晒すことによって、インプラント表面を正に荷電したリチウムイオンと接触させる。前記酸化物層をリチウムイオンと接触させる工程は、負に荷電したイオンを該酸化物層上に形成させる工程と同時に又はその後に実施されてもよい。好ましくは、本発明の方法の工程ｃ）及びｄ）は同時に実施される。

例えば、リチウムを含む溶液中に−０．５Ｖから−３．５Ｖの範囲内の電位を印加することによって、負に荷電したヒドロキシド基が形成され、表面に結合されたヒドロキシド基と溶液中に存在するリチウムイオンとの間で静電相互作用をもたらす。この静電相互作用によって、リチウムイオンが酸化物層内に取り込まれることになる。これについて実施例１において更に述べる。

リチウムイオンを含む溶液は、５．３Ｍ以下の濃度で水酸化リチウムを含む溶液であってよい。水酸化リチウムの濃度は、水酸化リチウムの溶解度積を表す５．３Ｍ超えるべきではない。ＬｉＯＨの濃度が５．３Ｍを超えた場合、塩結晶が形成され、そして酸化物の表面上に沈殿するであろう。本発明の方法の工程ｃ）においては、イオンが酸化物内に組み込まれることが望ましく、そしてそのためにＬｉＯＨの濃度は溶解度積を超えるべきではない。

水酸化リチウムの好ましい濃度は０．０５から２Ｍの範囲内である。

酸化物表面上に負に荷電したイオンを形成し、そして該酸化物層をリチウムイオンと接触させ、そのことによって、インプラントの表面を被覆する金属酸化物層内にリチウムイオンを組み込む工程は特定の方法に限定されるものではなく、如何なる適切な方法によっても又は如何なる方法の組合せによっても達成され得る。例えば、インプラント表面を、リチウムイオンを含むアルカリ性溶液中で陽極酸化させてもよい。実施例１は水酸化リチウム中で陽極酸化することによるリチウムイオンの組み込みを示す。

インプラント表面を陽極酸化工程にかけることによって、酸化物層の厚みが影響を受けるであろう。しかしながら、陽極酸化は、好ましくは、比較的低い走査速度、例えば８Ｖに到達するまで６ｍＶ／ｓ未満の速度で実行されるので、酸化物の厚みは１００ｎｍより厚くは成長しないことになる。

従って、インプラント表面上に形成された負に荷電したヒドロキシド基と、周囲の溶液中に存在する正に荷電したリチウムイオンとの間の静電相互作用を用いて、リチウムイオンが酸化物層内に組込まれる。

場合により、本発明の方法は、工程ｄ）の後に、前記インプラント表面をすすぐ及び／又は洗浄する工程を含んでよい。更に、インプラント表面は該すすぎ工程の後、乾燥され、そして滅菌されてよい。

実施態様において、本発明の方法は、例えば、インプラントの表面上に、つまり外表面を被覆する酸化物層上に、上記イオンを含む塩を沈殿させることによって、リチウム、ストロントウム、カルシウム、マグネシウムのような骨刺激材を含む沈着物を、該酸化物層の上面に形成する工程を更に含む。

この塩は、インプラントを取り囲む生理学的液体中に少なくとも部分的に溶解する上記イオンの如何なる適切な塩であってもよい。インプラント表面上での塩析沈殿によって連続又は不連続フィルムが表面上に形成されるであろう。沈着物の厚みは沈殿した塩の量に依存することになる。

そのような塩の沈着物は、インプラントを取り囲む生理学的液体と接触すると容易にかつ迅速に溶解し、その結果、インプラント表面からの骨刺激イオンの放出によって所望の骨刺激効果が達成される。

沈着物がリチウム塩析沈殿である場合、そのような沈着物の形成工程は、酸化物層表面上に負に荷電したイオンを形成する上記方法を改変することによって達成されてもよい。例えば、−３．５Ｖよりもっと負の電位を印加することができる。そのような負の電位によって、水素ガスの発生が著しく高まり、そして水分子の乱れが増大する。従って、過剰の負に荷電した、表面に結合したヒドロキシド基が酸化物表面で形成され、そして沈着、つまり水酸化リチウムの沈殿が酸化物層の上面で起こる。更なる記述については実施例２を参照のこと。

更に、インプラント表面を、溶解度積の５．３Ｍを超える濃度で水酸化リチウムを含む溶液に晒すによって、リチウム塩の沈着物が酸化物表面（インプラント表面）上に形成されることになる。これはまた周囲における過剰なヒドロキシド基のせいでもある。

しかしながら、沈着物、例えばリチウム塩を形成する工程は如何なる特定の方法に限定されるものではなく、如何なる方法も使用され得る。それは特定のリチウム塩に限定されるものでもなく、インプラントを囲む生理学的液体中に少なくとも部分的に溶解し得る如何なる塩も使用され得る。

更に、リチウム、ストロントウム、マグネシウム及びカルシウムから選ばれる任意のイオン又は組合せをも含む塩析沈殿を形成するための如何なる方法も使用でき、例えば、リチウムを含む溶液は上述のイオンの任意のもの又は組合せをも含み得る。そのような場合、酸化物層内に少量のこれらのイオンも組込まれるようになり得る。

沈着物を形成する工程も、上記の方法の組合せによって実施され得る。

尚、しかしながら、インプラント表面上でのイオンの組み込み及び沈着物の形成のための既知の方法も本発明において使用され得る。そのような方法には例えば：
−例えばプラズマ源イオン埋め込み又は金属プラズマ浸漬イオン埋め込みを使用したプラズマ溶着（deposition）、
−如何なる電気化学的処理、例えば、リチウムイオンを含む電解質中でのボルタメトリー、
−リチウムイオンを含む水溶液及び／又は非水溶液を用いたインプラントの処理、例えば、該インプラントの該溶液中への浸漬、
−ゾル−ゲル技術を用いたインプラントの処理、
−ビームイオン埋め込み、
−真空アーク、
−濾過された真空アーク、
−金属蒸気真空アーク、
−インプレーティング、
−化学蒸着、
−プラズマ支援化学蒸着、
−スパッタリング、
−レーザー焼灼術、
−インプラント表面中にリチウムイオンが組込みできるか又はそこに付着できるインプラント表面上へのリン酸カルシウム含有被覆、又はシラン被覆のような被覆を与えること、
これらの方法の如何なる組合せ等が挙げられる。本発明の方法は、インプラント表面上にミクロ粗さを作出する工程を更に含み得る。

リチウムイオン又はその塩をインプラント表面上に備える前、同時に及び／又は後に、場合により例えば穏やかなエッチング、ミクロ加工、陽極酸化、火炎溶射、電気化学的処理、レーザー、スパーク浸食、又は表面改質の任意の他の適切な方法を用いて、インプラント表面上にナノ−及び／又はミクロ−粗さを備えることができる。そのようなインプラント表面を得るための適切な方法が開示されているＷＯ０４／００８９８３及びＷＯ０４／００８９８４が参照できる。しかしながら、ナノ−及び／又はミクロ−粗さが、本発明の方法における工程ａ）の後で供されることが好ましい。

本発明の方法は、インプラント表面にフッ素を塗布する工程を含んでもよい。そのようなインプラント表面を得るための適切な方法が開示されているＷＯ０４／００８９８３が参照できる。

ＷＯ０４／００８９８３による、フッ素及び／又はフッ化物、及び少なくともインプラント表面の一部において、２５０ｎｍ以下の二乗平均平方根の粗さ（Ｒ_q及び／又はＳ_q）を有するミクロ−粗さを備えるための適切な方法は、０．１Ｍのような、０．５Ｍ未満の濃度を有するフッ化水素酸の水溶液を用いて、６０秒のような、１８０秒までのエッチング時間でインプラントを室温で処理することによるものである（より多くの情報のためにはＷＯ０４／００８９８３を参照のこと）。

また、リチウムイオン又はその塩を備える前に、そしてその上にミクロ−粗さを場合により備える前に、場合によりインプラント表面上にマクロ−粗さを備えることができる。例えば、マクロ−粗さは、例えば酸化チタン粒子を用いるブラスチング、エッチング、ミクロ加工、陽極酸化、火炎溶射、如何なる電気化学的処理、レーザー、スパーク浸食、機械加工、刻み付け、又は如何なる他の適切な表面改質方法によっても備え得る。

尚、インプラント表面はネジ式であるか又はネジ山が無い状態であってよく、又は他の使用依存性のトポグラフィックな特徴が与えられてもよい。

本発明の骨組織インプラントの製造方法は、リチウムイオンの組み込みに限定されるものではなく、一般にインプラント表面内に正に荷電したイオンを組み込むことも適用され得る。

従って、そのような方法は、以下の工程を含む：
ａ）インプラント表面を有するインプラントを備えること；
ｂ）該インプラント表面を被覆する酸化物層を形成すること；
ｃ）該酸化物層上に負に荷電したイオンを形成すること；及び
ｄ）該酸化物層をリチウムイオンと接触させること。

本発明は更に金属酸化物を含むブラスチング粉末に関し、ここで金属酸化物がリチウムイオンを含む。

金属酸化物は、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化ハフニウム、酸化タンタル、及び酸化ニオブから成るグループから選ばれた金属酸化物であってよい。好ましくは、ブラスチング粉末は、その内にリチウムイオンが組み込まれる酸化チタンを含む。

本発明のブラスチング粉末として酸化リチウムを簡単に使用することも可能である。

インプラント表面を被覆する酸化物層内へのリチウムイオンの組み込みを更に向上させるために、本発明の方法において該ブラスチング粉末を使用することが可能である。しかしながら、任意のインプラント表面上に備えた任意の酸化物層内にリチウムイオンを組み込むために、ブラスチング粉末が単独で使用され得る。

本発明はまた骨形成を局所的に増大させる方法にも関する。そのような方法は、リチウムイオン又はその塩、及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物を投与が必要なヒトに投与することを含む。好ましくは、埋め込み部位で、骨組織における空洞中に、前記インプラントが置かれる前に、同時に及び／又は後で、該埋め込み部位で骨組織内へのインプラントを埋め込む際に、該埋め込み部位で、リチウムイオン又はその塩及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物が投与される。

リチウムイオン又はその塩を含む組成物は、骨組織における該空洞中に及び／又は近傍に投与できる。

前記組成物において使用される適切な薬学的に許容可能な担体の例は、生理食塩水；崩壊された自家骨；脱ミネラルされた骨マトリックス；リポソーム；ポリ乳酸（ＰＬＡ）及びポリグリコール酸（ＰＧＡ）のような生分解性高分子のナノ−又はミクロ粒子；ヒアルロン酸；コラーゲン；コンドロイチン硫酸；アルギネートのようなヒドロゲル；キトサン；ポリエステル及びリン酸三カルシウムのスキャフォールド等である。

適切な担体の具体例はPepGen P-15 PUTTY（商標）であり、これは、ヒアルロン酸ナトリウム中に懸濁した、タイプ−１コラーゲンの細胞結合領域を模した合成ペプチドであるP-15で増強されたヒドロキシアパタイトの粒子である。

本発明の組成物は、即時放出、遅延放出又は制御放出製剤のどれかであり得る。

本発明はまた骨形成を局所的に増大させる（上に開示された通りの）薬学的組成物を製造するためのリチウムイオン又はその塩の使用にも関する。

本組成物は、埋め込み部位で、骨組織内へのインプラントを埋め込む際に、該埋め込み部位で局所的に投与され得る。

本発明者達によると、リチウムイオン又はその塩を直接、骨組織内に局所的に投与することが、全身に投与するより好ましい。外来薬剤は人体に対してしばしば種々の作用を有し、それは既知の場合もあれば未知の場合もある。リチウム又はその塩を骨組織中に局所的に投与することは、骨刺激効果が達成されることになり、一方で副作用が避けられる故に有益である。

また、本発明は、骨組織内へのインプラントの埋め込みのためのインプラントを含むキット、及びリチウムイオン又はその塩及び薬学的に許容可能な担体を含む（上に開示された通りの）組成物にも関する。

本発明を詳細に、且つその具体的実施態様を参照して述べたが、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、その中で種々の変更及び改変がなされ得ることは当業者にとって明白であろう。

ここで本発明を以下の非限定的実施例を用いて説明する。

実施例
実施例１：酸化チタン層内へのリチウムイオンの組込み
ＬｉＮＯ₃中での還元
チタンサンプルを、０．１ＭのＬｉＮＯ₃、ｐＨ５〜６において、電位ステップ技法によって還元した。−３Ｖの電位ステップ（全ての電位は、二重接合Ａｇ／ＡｇＣｌ／ＫＣｌ参照電極、ＳＨＥに対して１９７ｍＶについて述べられている）をサンプル全体に５分間印加した結果、連続して水素が発生した。還元プロセスの後、乾燥し及び滅菌する前に、サンプルを超音波浴中のＭＱ水中で２分間、すすいだ。リチウムの存在及び分布を、飛行時間二次イオン質量分光法（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）によって同定した（図１）。

アルカリ性溶液中での陽極酸化
チタンサンプルを、０．１ＭのＬｉＯＨ、ｐＨ＞１１において、ＬＳＶ（線形掃引ボルタメトリー）によって、ＯＣ（オープン回路）から７Ｖ（全ての電位は、二重接合Ａｇ／ＡｇＣｌ／ＫＣｌ参照電極、ＳＨＥに対して１９７ｍＶについて述べられている）で、２及び／又は５ｍＶ／ｓの走査速度及び９００ｒｐｍの回転数で陽極酸化した。陽極酸化プロセスの後、乾燥し及び滅菌する前に、サンプルを超音波浴中のＭＱ水中で２分間、すすいだ。滅菌されたチタンサンプルの表面上のリチウムの存在を図２ａの質量スペクトル（ピーク７）によって示し、そしてシュウ酸処理され、滅菌されたチタンサンプルである参照サンプルと比較する（図２ｂ）。

リチウムの存在及び分布を、ＴＯＦ−ＳＩＭＳによって同定した（図３）。

実施例２：チタン・インプラント表面からのリチウムの放出
チタンサンプルを、０．１ＭのＬｉＮＯ₃、ｐＨ５〜６において、電位ステップ技法によって還元した。−４Ｖより負の電位ステップ（全ての電位は、二重接合Ａｇ／ＡｇＣｌ／ＫＣｌ参照電極、ＳＨＥに対して１９７ｍＶについて述べられている）をサンプル全体に５分間印加した結果、激しく水素が発生した。還元プロセスの後、サンプルを水中ですすぎ、そして乾燥した。

リチウムの放出をＩＳＥ（イオン選択電極）及びＩＰＣ（誘導結合プラズマ）によって同定した。上述のようにして調製された４つのコイン形状をしたサンプルを１５ｍｌのＭＱ水を有するビーカー中に置いた。この水を２０ｍＭのＨＮＯ₃を用いてｐＨ４に酸性化し、そしてその後、解析前に中程度の撹拌下で９０分放置した。ＩＳＥ及びＩＰＣを用いて溶液を解析したところ、両方の解析で、０．４μｇのリチウム／サンプルｍｌという同じ結果が得られた。

参考例１：ＭＧ−６３細胞の培養
ＭＧ−６３は、骨芽細胞のインビトロ研究のために当該技術において従来から使用されているヒト細胞株（ATCC No CRL-1427,US）である。ＭＧ−６３は、ヒト骨肉腫に由来するものであり、そしてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）及びオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）のようなヒト骨芽細胞の多くの形質特性を示す。

この研究において、ＭＧ−６３細胞は、冷凍細胞からの第二継代から得られ、更に５％のＦＣＳ、１％のＰＥＳＴ、（Gibco、英国）を含むダルベッコ最少必須培地（Dulbecco's modified Eagle's Medium）（ＤＭＥＭ）中で、３７℃、５％のＣＯ₂雰囲気中及び湿度１００％で、培養した。細胞がコンフルエンスに達したら、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、英国）を用いて、細胞数が得られるまで継代培養した。

細胞生存率は全ての実験において高かった（＞９８％）そしてトリパンブルーの使用によって調べられた；ここで死亡した細胞による汚れの吸収を光学顕微鏡（ＬＭ）におけるBuerkerchamber中で調べた。

参考例２：ＭＧ−６３細胞の増殖及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の産生
ＭＧ−６３細胞の増殖及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の産生に及ぼすリチウムの効果を調べるために、参考例１において調製されたＭＧ−６３細胞を、１００００細胞／ｃｍ²、合計２００００細胞／ウエルのプレーティング密度で、２４ウェルプレート内で継代培養した。各々１０ｍＭ、５ｍＭ、３ｍＭ、及び１ｍＭの最終濃度（ｐＨ５．２）で無菌濾過されたＬｉＮＯ₃を板の各々のウエルに添加した。未処理の細胞をコントロールとして使用した。細胞を３日、７日及び１４日、３７℃、５％のＣＯ₂雰囲気中及び湿度１００％で培養した。

各時間後の各々のウエル中の合計細胞数（×１０⁵）を、NucleoCounter（ChemoMetec A/S、デンマーク）によるNucleoCassette法によって求めた。

１．２５のｐＨを有する「試薬Ａ」中の細胞の溶解、続いて、「試薬Ｂ」による安定化によって細胞数を調べた。NucleoCassetteにおいて、放出されたＤＮＡの量を標的とするプロピジウムヨージドを組み込んだ。本カセットをNucleoCounter中に置き、そして測定された蛍光色素の量はＤＮＡ量と対応した。メーカーの取扱い説明書に従った（ChemoMetec A/S、デンマーク）。

採取時に、細胞培地をＡＬＰ含有量に関して分析した。細胞内ＡＬＰを、メーカーの取扱い説明書に従い（SenzoLyte^TM pNPP Alkaline Phosphatase Assay Kit Colorimetric BioSite、スウェーデン）、細胞溶解によって測定した。吸収は自動プレートリーダー（Vmax, Molecular Device、英国）によって４０５ｎｍに設定された。サンプルの光学密度を、キットに備わっている標準と比較して、ＡＬＰ濃度を求めることができる。メーカーの取扱い説明書に従った（BioSite、スウェーデン）。

図４に関しては、ＭＧ−６３細胞の増大した増殖が、５、３及び１ｍＭのリチウムを用いた３つの時点の全てで達成された。最高の検出された細胞数が７日後に観察された。

ＡＬＰの産生は、全てのリチウム濃度で、コントロール（非刺激細胞）と比べて最初はゆっくりであった。７日後に、コントロールと比べて少しの増加が検出された。しかしながら、１４日後に、全てのリチウム濃度；１ｍＭ、３ｍＭ、５ｍＭ及び１０ｍＭで、ＡＬＰレベルの増加が検出された。最高のＡＬＰ量が、１ｍＭのリチウムで、１４日後に観察された。これらの結果を図５に示す。

参考例３：参照表面の調製
コインの形状を有するチタンサンプルを洗浄し、次いで１Ｍのシュウ酸水溶液中に浸漬し、そして８０℃で３０分間、激しい撹拌下に置いた。３０分後シュウ酸水溶液から、サンプルを取出して水中ですすぎ、続いて超音波浴中の水中で２分間、すすいだ。得られた表面を「参照表面１」と称する。

サンプルの幾つかを第二次のフッ化水素酸処理にかけた。すすぎの約１０分後、サンプルを０．１ＭのＨＦ水溶液中に室温で浸漬し、活発な溶解が始まるまで撹拌し、引続いて追加の活性化処理を４０秒間、行った。次に、ＨＦ溶液からサンプルを取出して水中ですすぎ、引き続いて超音波浴中の水中で２分間、すすいだ。これらのサンプルを、滅菌前に室温で空気中において約６０分間、乾燥した。得られた表面を「参照表面２」と称する。

参考例４：参照表面上でのＭＧ−６３の増殖
参照表面１及び２を有する滅菌された（β線−照射）Ｔｉコインをそれぞれ２４ウェルプレート中に置いた。ＭＧ−６３細胞を、１００００細胞／ｃｍ²、合計２００００細胞
／ウエルのプレーティング密度で、２４ウェルプレート中のコイン上に継代培養した。５ｍＭ、及び１ｍＭ（ｐＨ５．２）の最終濃度で無菌濾過されたＬｉＮＯ₃をそれぞれのウエルに添加した。未処理の細胞をコントロールとして使用した。細胞を７日間、３７℃、５％のＣＯ₂雰囲気中及び湿度１００％で培養した。

１ｍＭの濃度でリチウムを含む参照表面１は、培養７日後に、ＭＧ−６３細胞の増大した増殖を引き起した。１ｍＭの濃度でリチウムを含む参照表面２は、非刺激参照表面２と比べて、培養７日後に高い細胞増殖を引き起した。５ｍＭのリチウム最終濃度では、中程度に増加した増殖を引き起した。これら結果を図６に示す。

参考例５：参照表面１上でのＡＬＰの産生
１ｍＭのリチウム濃度を含む参照表面１上でのＡＬＰの産生を、リチウムを含まない非刺激参照表面１と比較した。

図７に示されるように、ＡＬＰの産生は、細胞培養７日目後に、１ｍＭのリチウムを用いた場合に増加した。

参考例６：形態
（ｉ）参照表面１、（ｉｉ）参照表面２、及び（ｉｉｉ）参照表面１＋リチウムを有するチタンサンプルを走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察のために調製した。これらのサンプルを４℃にてグルタルアルデヒドによって固定し（Kanowsky's）、続いて標準技術に従って四酸化オスミウム処理、脱水及び最終的に金スパッタリングを行った。

図８、９、及び１０は３６時間後のそれぞれの表面の形態を示す。リチウムを含む参照表面１は、増殖の段階でより大量の細胞を有し（図１０）（丸くて、広がりのない細胞）、そして同様に、リチウムを含まない参照表面１及び２上の細胞と比べて大量の粘着細胞を有する。参照表面１（図８）及び参照表面２（図９）の両方の上では、細胞がより薄く、より平らで、そしてより外へ広がっている。

参照表面１及び２上での細胞の間のスペースは、おそらく固定の困難さのせいであり、そして細胞が非常に薄く外へ広がっている場合にしばしば見られる。

リチウムを含む参照表面１上で培養された細胞の形態は、細胞が高い活性を示して、よく外へ広がり、増殖し、そして表面上でマトリックス及び偽足を形成することを示す。これは、そのような表面が骨伝導性でもあり骨誘導性でもあり、かつ細胞の接着、増殖及びマトリックス形成に好ましいことを示す。

比較例１：リチウム、カルシウム及びマグネシウムをそれぞれ含む参照表面上でのＭＧ−６３の増殖
参照表面１及び２を有する滅菌された（β線−照射）Ｔｉコインを、リチウム、カルシウム及びマグネシウムをそれぞれ含む参照表面１を有するＴｉコインと比較し、そしてこれらのコインを２４ウェルプレート中に置いた。ＭＧ−６３細胞を、１００００細胞／ｃｍ²、合計２００００細胞／ウエルのプレーティング密度で、２４ウェルプレート中のコイン上で継代培養した。細胞を７日間、３７℃、５％のＣＯ₂雰囲気中及び湿度１００％で培養した。

細胞数を、１．２５のｐＨを有する「試薬Ａ」中の細胞の溶解、それに続く「試薬Ｂ」による安定化によって調べた。NucleoCassetteにおいて、放出されたＤＮＡの量を標的とするプロピジウムヨージドを組み込んだ。カセットをNucleoCounter中に置き、そして測定された蛍光色素の量はＤＮＡ量と対応した。メーカーの取扱い説明書に従った（ChemoMetec A/S、デンマーク）。

図１１に関しては、リチウムを含む参照表面１での増殖が、細胞培養７日後に最高のＭＧ−６３細胞増殖を示した。細胞増殖は、カルシウム及びマグネシウムを含む参照表面よりも著しく高かった。

比較例２：参照表面上でのオステオプロテゲリンの産生
リチウム、カルシウム及びマグネシウムをそれぞれ含む参照表面１を有するＴｉコインの間で、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）の産生を比較した。

DuoSet ELISA ヒト OPG/TNFRSF11B(R&D Systems、英国）によってＯＰＧの量を求めた。各々のウエルからの上澄み液を、細胞がなくなるまで遠心分離し（４００Ｇで５分）、更に調査のために使用した。その量をメーカーによって提供された標準曲線に関連付けることによってサンプルＯＰＧの濃度を求めた。試験の感度（ＭＤＤ、最小検出用量）は５０ｐｇ／ｍｌであった。メーカーの取扱い説明書に従った（R&D Systems、英国）。

図１２に示されている通り、細胞培養の７日後及び１４日後に、リチウムを含む参照表面１で最高のＯＰＧ産生が観察された。

比較例３：インビボの骨組織応答
本発明のインプラントの完全性をウサギモデルにおいて試験した。その目的は、市販のコントロールインプラントと比較して、本発明のインプラント表面改質に対するインビボの骨組織応答を定性的に及び定量的に調べることであった。

除去トルク試験用インプラント
リチウムを含む参照表面１を有するトルク固定具（四角形の頭をした除去トルク設計、３．５×８．２ｍｍ）を、市販のOsseoSpeed（商標）表面を有するコントロールトルク固定具（３．５×８．２ｍｍ）と比較した。

インプラントの挿入
１２把の成体の雄のニュージーランド白ウサギを手術用として予定した。二把のウサギは初期の麻酔で死んだ（＃９、１０）。手術は平穏に進んだ。連続食塩冷却を用いて、低速穴開け（穴開けのために１５００ｒｐｇ、そしてインプラント挿入のために２０ｒｐｍ）を行った。最初の穴開けは小さく丸いぎざぎざであり、そして、その次に開けるより大きな螺旋穴開け（１．２から３．３５ｍｍの範囲の直径を有する全部で６個の穴開け）のための目印として使用された。

三つのインプラント（「四角形の頭をした除去トルク設計」；３．５×８．２ｍｍ）を各々脛骨粗面中に挿入した。脛骨インプラントを除去トルク試験用に予定した。

除去トルク結果
６週間後に、試験を終了し、そしてウサギを犠牲にした。インプラント及び周囲の組織を調べた。脛骨インプラントは容易に位置が分かり、それらの全てで、骨膜骨組織成長の兆候が見られた。除去トルク試験（ＲＴＱ）を用いて、インプラント−骨界面の生体力学的試験を実施した。ＲＴＱ装置（Detektor AB、Goteborg、スウェーデン）は、骨層におけるインプラントの安定性（Ｎｃｍを単位とするピークゆるみトルク）を試験するために使用される歪ゲージトランスジューサーを含む電子機器であり、従って、骨組織及びインプラントの間の界面せん断力を大まかに反映する三次元試験と見なすことができる（Johansson C. B.,Albrektsson T.,Clin Oral implants Res 1991;2:24-9）。直線的に増大するトルクがインプラントの同じ軸上に、一体化が破壊されるまでかけられ、そしてピーク値が記録された。

図１３に示されている通り、本発明のリチウムを含むインプラントに対する除去トルク値は、市販のOsseoSpeed（登録商標）表面と比べて改善されていた。

Claims

表面を有する骨組織内への埋め込みのためのインプラントであって、該表面がインプラントの表面から形成された酸化物層によって被覆されており、酸化物層が該酸化物層中に均質に分布しているリチウムイオンを含むことを特徴とするインプラント。
インプラントが金属インプラントである、請求項１に記載のインプラント。
金属インプラントがチタン又はチタンの合金を含む、請求項２に記載のインプラント。
インプラントが非金属インプラントであって、表面が塗布された金属インプラント層である、請求項１に記載のインプラント。
金属インプラント層がチタン又はチタンの合金を含む、請求項４に記載のインプラント。
酸化物層が２から１００ｎｍの範囲内の厚みを有する、請求項１〜５の何れか１項に記載のインプラント。
酸化物層が２から１８ｎｍの範囲内の厚みを有する、請求項６に記載のインプラント。
酸化物層が２から６ｎｍの範囲内の厚みを有する、請求項６又は７に記載のインプラント。
酸化物層の上面に更に沈着物を含み、ここで該沈着物が骨刺激剤を含む、請求項１〜８の何れか１項に記載のインプラント。
骨刺激剤が、リチウム、ストロンチウム、マグネシウム及びカルシウム又はその組合せから成るグループから選ばれる、請求項９に記載のインプラント。
沈着物が、リチウム、ストロンチウム、マグネシウム及びカルシウムから選ばれるイオンの任意の１つ又は組合せを含む塩析沈殿である、請求項９又は１０に記載のインプラント。
塩析沈殿がリチウム塩析沈殿である、請求項１１に記載のインプラント。
インプラントが、リン酸カルシウム化合物を含む被覆を有しない、請求項１〜１２の何れか１項に記載のインプラント。
インプラントの表面がミクロ粗さを含む、請求項１〜１３の何れか１項に記載のインプラント。
インプラントの表面がフッ素を含む、請求項１〜１４の何れか１項に記載のインプラント。
均質に分布しているリチウムイオンを含む酸化物層によって被覆されたインプラント表面を有する骨組織インプラントの製造方法であって、以下の工程：
ａ）インプラント表面を有するインプラントを備えること；
ｂ）該インプラント表面を被覆する酸化物層を該インプラントの表面から形成すること；
ｃ）該酸化物層上に負に荷電したイオンを形成すること；及び
ｄ）該酸化物層をリチウムイオンと接触させること；
を含む方法。
酸化物層が自然に形成される、請求項１６に記載の方法。
酸化物層上の負に荷電したイオンが、インプラント表面をアルカリ性環境に晒すことによって形成される、請求項１６又は１７に記載の方法。
アルカリ性環境が、インプラント表面をアルカリ性溶液に晒すことによって形成される、請求項１８に記載の方法。
酸化物層上の負に荷電したイオンが、−０.５Ｖから−３.５Ｖの範囲内の電位を印加することによって形成される、請求項１６〜１８の何れか１項に記載の方法。
工程ｃ及び工程ｄが同時に行われる、請求項１６〜２０の何れか１項に記載の方法。
酸化物層を、リチウムイオンを含む溶液に晒すことによって、該酸化物層がリチウムイオンと接触する、請求項１６〜２１の何れか１項に記載の方法。
溶液が水酸化リチウムを含む、請求項２２に記載の方法。
溶液が５.３Ｍ又はそれ以下の濃度で水酸化リチウムを含む、請求項２３に記載の方法。
溶液が０.０５から２Ｍの範囲の濃度で水酸化リチウムを含む、請求項２４に記載の方法。
酸化物層の上面に骨刺激剤を含む沈着物を形成する工程を更に含む、請求項１６〜２５の何れか１項に記載の方法。
骨刺激剤が、リチウム、ストロンチウム、カルシウム及びマグネシウム、又はその組合せから成るグループから選ばれる、請求項２６に記載の方法。
沈着物が、リチウム、ストロンチウム、カルシウム及びマグネシウムから選ばれるイオンの任意の１つ又は組合せを含む塩を、酸化物層の上に沈殿させることによって形成される、請求項２６又は２７に記載の方法。
塩が水酸化リチウムである、請求項２８に記載の方法。
沈着物が−３.５Ｖより負の電位を印加することによって形成される、請求項２８又は２９に記載の方法。
インプラント表面を、５.３Ｍより高い濃度で水酸化リチウムを含むアルカリ性溶液に晒すことによって、沈着物が形成される、請求項２８又は２９に記載の方法。
工程ａ）の後で、インプラントの表面上にミクロ粗さを作出する工程を更に含む、請求項１６〜３１の何れか１項に記載の方法。
インプラントの表面にフッ素を塗布する工程を更に含む、請求項１６〜３２の何れか１項に記載の方法。