ES2558544T3

ES2558544T3 - Implantes médicos revestidos en la superficie de nanoestructura y métodos de empleo de los mismos

Info

Publication number: ES2558544T3
Application number: ES08732362.2T
Authority: ES
Inventors: Tejal A. Desai; Ketul C. Popat; Craig A. Grimes
Original assignee: University of California; Penn State Research Foundation
Current assignee: University of California; Penn State Research Foundation
Priority date: 2007-03-16
Filing date: 2008-03-17
Publication date: 2016-02-05
Anticipated expiration: 2028-03-17
Also published as: US20180185549A1; US20120114734A1; US10426871B2; EP3000434A1; EP2164425A4; WO2008115883A1; EP2164425B1; EP2164425A1; US9775932B2

Abstract

Un implante médico que comprende una superficie o película que comprende una pluralidad de nanotubos que tienen diámetros de aproximadamente 3 nm a aproximadamente 300 nm y en una densidad mayor que 10.000.000 de nanotubos por centímetro cuadrado, donde dichos nanotubos comprenden un agente bioactivo de elución al tejido circundante por colocación en un sujeto, y en donde dicha pluralidad de nanotubos comprende además una película de cierre que se erosiona proporcionando una elución retardada del agente bioactivo.

Description

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DESCRIPCION

Implantes medicos revestidos en la superficie de nanoestructura y metodos de empleo de los mismos Antecedentes de la invencion

El reemplazo total de las articulaciones es un tratamiento eficaz para aliviar el dolor y restaurar la funcion de pacientes con articulaciones danadas o degenerativas. Aproximadamente 500.000 operaciones de reemplazo totales de caderas y rodillas se llevan a cabo cada ano en los Estados Unidos. Aun cuando muchos de los resultados tienen exito, todavfa existen problemas importantes con el desprendimiento y el fallo de los implantes. En efecto, el 25% de las cirugfas de reemplazos de caderas tuvieron revisiones debidas a fallos previos de los implantes. La cirugfa para reemplazar estos fallos es mas diffcil y costosa para realizar y tiene un resultado peor que la cirugfa de reemplazo de la articulacion. Si la fijacion no es suficiente puede tener lugar desprendimiento y osteolisis del implante. Para superar este problema se opina que los materiales de implante oseos necesitan estimular una regeneracion rapida de los huesos con objeto de llenarse en el hueso deficiente y fijar firmemente el implante con el hueso adyacente. La superficie del material debe ser capaz de restablecer las celulas que forman el hueso, tale como los osteoblastos, de modo que puedan colonizar y sintetizar el nuevo tejido oseo.

Con objeto de disenar mejores materiales de implante es importante entender los acontecimientos existentes en la interfase del material oseo. Como se ha citado previamente uno de los importantes enfrentamientos es inducir crecimiento oseo sobre la superficie del implante. El nivel de crecimiento del hueso depende de las caractensticas superficiales del implante. El primer acontecimiento que tiene lugar despues de la implantacion de un biomaterial es la adsorcion de protemas procedentes de la sangre y otros fluidos de los tejidos. Principalmente, un hematoma, hinchazon rellenada con sangre debida a una rotura del vaso sangumeo, esta presente entre el implante y el hueso. Las citoquinas y los factores de crecimiento estimulan la adquisicion de celulas mesenquimales que se diferencian en osteoblasto que son responsables de la formacion osea. A lo largo del tiempo, el hueso tejido madura dando

hueso laminar que endurece mas tarde la interfase de implante-oseo. Asf pues, las propiedades de la interfase

desempenan un papel cntico en la estabilidad y funcionalidad a largo plazo del implante.

En un intento de intensificar la estabilidad de implantes endoseosos, han sido empleados gran numero de materiales de implante y diseno. Ademas de materiales prosteticos a base de cementos, ha vuelto mucha atencion en los ultimos anos a implantes microentrelazados que poseen superficies microporosas que 'permiten el crecimiento del hueso. El trabajo primitivo que utiliza materiales ceramicos oxidados ha puesto de manifiesto que era necesario un diametro de poro interconectado, mmimo, de aproximadamente 100 |im para un crecimiento oseo adecuado (Hulbert et al., J. Biomed Mater Res 1972;6(5):347-74). Se opino que tamanos de poro mas pequenos permitfan una mineralizacion incompleta del tejido que se infiltraba. El empleo subsiguiente de implantes metalicos mostro crecimiento del hueso con tamanos de poro entre 50 y 500 |im (Bobyn et al., Clin Orthop Relat. Res

1980(150):265-70): Sin embargo, estudios recientes han revelado la posibilidad de que muchos poros mas

pequenos pueden permitir crecimiento hacia dentro del hueso cuando se presentaban en alta densidad dentro de sustratos de oxidos metalicos. Por ejemplo, revestimientos de Ca-.P nanoporosos en implantes han puesto de manifiesto aposicion de crecimiento oseo humano dentro de 2-3 semanas despues de la cirugfa (Lue et al., J Biomed Mater Res 2001;55(3):360-7). Los osteoblastos cultivados sobre materiales ceramicos de texturas diferentes a escala de nm, ponen de manifiesto tambien morfologfas y velocidades de crecimiento alteradas (Boyan et al., Biomaterials 1996, l7(2):137-46; Popat et al., J Orthop Res 2006. 24(4):619-27; Popat et al., Biomaterials 2005, 26(22):4516-22; Swan et al., Biomaterials 2005, 26(14): 1069-76; Swan et al., J Biomed Mater Res A 2005,72(3):299-95: Webster et al., Biomaterials 2004, 25(19):4731.9; Webster et al., J Biomed Mater Res A 2003, 67(3):975-80; Webster et al., Biomaterials 2000, 21(17):1803-10). No obstante, existen diversos problemas relacionados con la disolucion de revestimientos de nanoescalas a lo largo del tiempo, y el quebrantamiento y la separacion del sustrato metalico (Bauer et al., Clin Orthop Relat Res 1994, (298):11-8; y Bloebaum et al., Clin Orthop Relat Res 1994, (298):19-26). Estos estudios apuntan a la importancia de desarrollo de arquitecturas de nanoescalas mas robustas y flexibles para incrementar la yustaposicion de hueso desde las superficies oseas existentes y estimular nueva formacion osea.

Esta invencion describe mas adelante direcciones para estas necesidades asf como para otras.

Compendio de la invencion

La presente invencion proporciona un implante medico, que comprende una superficie o pelfcula que comprende una pluralidad de nanotubos que tienen diametros de aproximadamente 3 nm a aproximadamente 300 nm y en una densidad mayor que 10.000.000 de nanotubos por centfmetro cuadrado, donde dichos nanotubos comprenden un agente bioactivo para elucion al tejido circundante por colocacion en un sujeto, y en donde dicha pluralidad de nanotubos comprende, ademas, una pelfcula de cierre que puede erosionarse proporcionando una elucion retardada del agente bioactivo. En algunas realizaciones, el implante medico es un implante ortopedico, un implante dental, un implante cardiovascular, un implante neurologico, un implante neurovascular, un implante gastrointestinal, un implante muscular o un implante ocular. En algunas realizaciones, el implante medico es un parche para la distribucion localizada de dicho agente bioactivo a un tejido blando. En algunas realizaciones, la superficie o pelfcula se expande o despliega en la presencia de un lfquido hidratante. En algunas realizaciones, la superficie o pelfcula

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incluye ademas celulas, tales como una celula de tronco, una celula progenitora retinal, una celulas progenitora cardiaca, una celula osteoprogenitora, o una celula progenitora neuronal.

En algunas realizaciones la superficie o pelfcula esta comprendida por poli(DL-lactida-co-glicolida)(PLGA), poli(DL- lactida-co-e-caprolactona)(DLPLCL), poli(8-caprolactona)(PCL), cologeno, gelatina, agarosa, poli(metacrilato de metilo), galatm/e-caorolactona, colageno-GAG, colageno, fibrina, PLA, PGA, copolfmeros de PLA-PGA, poli(anfndridos),poli(hidroxi acidos),poli(orto esteres),poli(fumeratos de propilo),poli(caprolactonas),poli(hidroxivalera- to, poliamidas, poliaminoacidos, poliacetales, policianoacrilatos biodegradables, poliuretanos y polisacaridos biodegradables, polipirrol, polianilinas, politiofeno, poliestireno, poliesteres, poliuretanos no biodegradables, poliureas, poli(acetato de vinilo etileno), polipropileno, polimetacrilato, polietileno, policarbonatos, poli(oxido de etileno), copolfmeros de los anteriores, mezclas de los anteriores, y aductos de los anteriores, o combinaciones de los mismos..

En algunas realizaciones, la superficie o pelfcula esta compuesta de silicio, titania, circonia, cromo-cobalto, alumina, sflice, aluminato de bario, titanato de bario, oxido de hierro y oxido de zinc, nitinol, elastinita, tantalo, Elgiloy, finox, Ti6A14V, CoCr, TiC, TiN, L.605, 316, MP35N, MP20N, aleacion de acero inoxidable, aleacion de acero inoxidable 316L, aleacion de acero inoxidable 304, o sus combinaciones.

En algunas realizaciones, la superficie o pelfcula incluye, ademas, un agente bioactivo enlazado covalentemente. En algunas realizaciones, los nanotubos incluyen, ademas, un agente para facilitar la adhesion celular y el crecimiento celular, seleccionado del grupo que consiste en laminina, fibrina, fibronectina, proteoglicanos, glicoprotemas, glicosaminoglicanos, agentes quimiotacticos, y factores de crecimiento. En algunas realizaciones, el agente bioactivo se selecciona de un polipeptido, un factor de crecimiento, un agente esteroide, una terapia con un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo, un DNA, un RNA y siRNA, un agente antimicrobiano, un antibiotico, un farmaco antimicrobiano, un compuesto antiinflamatorio, un agente antitumoral, un agente antiangiogenico, y un agente quinioterapico..

En algunas realizaciones, los nanotubos vanan en longitud de aproximadamente 1 |im a aproximadamente 500 |im, tal como de aproximadamente 1 |im a aproximadamente 70 |im. En algunas realizaciones, los nanotubos tienen un diametro de poro que vana de aproximadamente 3 nm a aproximadamente 250 nm. En algunas realizaciones, la superficie o pelfcula comprende nanotubos en una densidad mayor que 25.000.000 de nanotubos por centfmetro cuadrado, en donde dicha densidad proporciona un adhesivo tisular compatible con una matriz extracelular.

Estos y otros objetos, y ventajas y caractensticas de la invencion llegaran a ser evidentes a las personas expertas en la tecnica al leer los detalles de la invencion que se describen mas completamente mas adelante.

Descripcion detallada de los dibujos

La invencion se comprende mejor partiendo de la siguiente descripcion detallada cuando se lee en conjuncion con los dibujos que se acompanan. Se hace hincapie en que, segun la practica comun, las diversas caractensticas de los dibujos no estan a escala. Por el contrario, las dimensiones de las diversas caractensticas estan expandidas o reducidas arbitrariamente para claridad. En los dibujos estan incluidas las siguientes figuras,

FIG, 1: es una serie de imagenes SEM (imagenes de Microscopfa Electronica de Barrido) de superficies nanotubulares de titania. La parte izquierda expone una vista en corte transversal de una muestra fracturada mecanicamente, la parte central es una vista en alzado de superficie nanotubular, y la parte de la derecha es una ampliacion alta de la vista de la parte superior de la superficie nanotubular. Los nanotubos tienen aproximadamente 80 mm de diametro y 400 mm de longitud..

FIG. 2: la parte a muestra la adhesion de celulas estromales medulares y la proliferacion sobre poliestireno, titanio y superficies nanotubulares de hasta 7 dfas de cultivo, superficies nanotubulares que exponen aproximadamente 40% de mas proliferacion de celulas al cabo de 7 dfas de cultivo comparada con superficie de titanio (p<0,05); la parte b expone la viabilidad celular medida como absorbancia utilizando un analisis MTT al cabo de 4 dfas de cultivo celular sobre poliestireno, titanio y superficie nanotubular.

FIG. 3: expone imagenes de microscopfa de fluorescencia (10X) de celulas estromales medulares vivas con calceina sobre (parte a) titanio y (parte b) superficies nanotubulares; las celulas parecen formar agrupaciones en la superficie nanotubular que esta ausente en las superficies de titanio.

F IG. 4: expone una serie de imagenes SEM de celulas estromales medulares de, la medula osea sobre superficies de titanio y nanotubulares de hasta 7 dfas de cultivo. Las celulas muestran morfologfa esferica sobre titanio (parte a) comparado con la morfologfa que se extiende en la superficie nanotubular (parte b) despues de 1 dfa de cultivo. Al cabo de 4 dfas de cultivo todavfa muestran morfologfa esferica sobre superficie de titanio (parte c) comparadas con la morfologfa en extension y en grumos en la superficie nanotubular (parte d). Despues de 7 dfas de cultivo, algunas

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de las celulas sobre titanio parecen estar extendidas (parte e), sin embargo las celulas exponen alto grado de extension y tienen una comunicacion comenzada en la superficie nanotubular (parte f). La imagen SEM con ampliacion alta al cabo de 7 dfas de cultivo (parte g) en superficie nanotubular muestra que extensiones celulares estan sobresaliendo en la arquitectura nanotubular.

FIG. 5: parte a, es una grafica que expone actividad ALP valorada hasta 3 semanas de cultivo de celulas estromales medulares sobre titanio y superficie nanotubular despues de la proporcion de medios completes, resultados normalizados con contenido total de protemas para tener en cuenta el efecto de diferente numero de celulas sobre cada superficie. La actividad ALP es aproximadamente 50% mayor al cabo de 3 semanas de cultivo en superficies nanotubulares (p<0,05); la parte b es una grafica que muestra la concentracion de Calcio valorada a 3 semanas de cultivo de celulas estromales medulares en titanio y superficie nanotubular, resultados normalizados con el contenido total de protemas para tener en cuenta el efecto de numero diferente de celulas sobre cada una de las superficies, el contenido de calcio es aproximadamente 50% mayor al cabo de 3 semanas sobre superficie nanotubular (p<0,05).

FIG. 6. es una serie de imagenes SEM de MSCs sobre superficies nanotubulares verificado hasta 3 semanas de cultivo. La formacion de agrupaciones de celulas (parte a) y la deposicion de material granular (parte b) sobre superficies nanotubulares despues de 1 semana. Al cabo de 2 semanas, la superficie esta casi totalmente cubierta por celulas (parte c) y los nanotubos estan, ademas, llenos con matriz (parte d). Despues de 3 semanas, la superficie entera esta cubierta con celulas que se extienden bien (parte e) y los nanotubos estan casi completamente llenos con constituyentes de la matriz (parte f).

FIG 7: es una serie de imagenes de analisis histologico de tejido (parte a). tejido sano control-normal, (parte b) que rodea al implante de titanio: (parte c) que circunda un implante nanotubular; los resultados indican que no hay formacion de tejido de cicatriz fibroso de ambos implantes el de titanio y el nanotubular, y los tejidos son muy similares con respecto al tejido control, la lmea de puntos muestra donde el implante estaba en contacto con tejidos.

FIG. 8: es una grafica que expone las eficacias de carga de albumina de suero bovino (BSA) y de lisozima (LYS) en nanotubos.

FIG. 9, es una serie de graficas que exponen la fraccion de protema total liberada desde nanotubos llenos con 200 mg (Parte A), 400 mg (Parte B) y 800 mg (Parte C) de BSA y 200 mg (Parte D), 400 mg (Parte E) y 800 g (Parte F) de LYS. El punto de tiempo en el que toda la protema ha sido liberada esta indicado por la lmea de puntos. Las concentraciones en estos puntos de tiempo son significativamente diferentes de los puntos de tiempo anteriores, sin embargo no significativamente diferentes de los puntos de tiempo despues, p<0,05, n=3.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona un implante medico, que comprende una superficie o pelteula que comprende una pluralidad de nanotubos que tienen diametros desde aproximadamente 3 nm a aproximadamente 300 nm en una densidad mayor que 10.000.000 de nanotubos por centfmetro cuadrado, donde dichos nanotubos comprenden un agente bioactivo de elucion al tejido circundante por colocacion en un sujeto, y en donde dicha pluralidad de nanotubos comprende, ademas, una pelteula de cierre que puede erosionarse para proporcionar un elucion retardada del agente bioactivo.

Antes de describir la presente invencion, ha de entenderse que esta invencion no se limita a realizaciones particulares descritas como podna ser, naturalmente, variar. Tambien ha de entenderse que la terminologfa empleada en esta memoria es con la finalidad de describir solamente realizaciones particulares, y no esta destinada a ser limitante, dado que el alcance de la presente invencion sera limitado solamente por las reivindicaciones incluidas-

Donde se proporciona un intervalo de valores, ha de entenderse que cada valor de intervencion, hasta la decima parte de la unidad del lfmite inferior a menos que el contexto dicte claramente otra cosa, entre los lfmites superior e inferior de tal intervalo, esta escrito tambien espedficamente. Cada intervalo mas pequeno entre cualquier valor establecido o valor de intervencion de un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o de intervencion en el intervalo establecido se encuentra incluido dentro de la invencion. Los lfmites superior e inferior de estos intervalos mas pequenos pueden ser incluidos o excluidos independientemente del intervalo, y que cada intervalo en que cualquiera de los dos, ninguno o ambos lfmites estan incluidos en los intervalos mas pequenos esta tambien incluido dentro de la invencion, sujeto a cualquier lfmite excluido espedficamente en el intervalo establecido. Donde el intervalo establecido incluye uno o ambos lfmites, las intervenciones que excluye uno cualquiera o ambos de los lfmites incluidos estan incluidos, asimismo, en la invencion.

A menos que se definen de otro modo, todos los terminos y expresiones tecnicos y cientfficos que se emplean en esta memoria tienen el mismo significado como se comprende comunmente por los expertos en la tecnica a que pertenece la invencion. Aun cuando cualesquiera metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria pueden emplearse en la practica o en el ensayo de la presente invencion, algunos metodos y materiales potenciales y preferidos se describen ahora. Todas las publicaciones citadas en esta memoria se incorporan a la misma por referencia a descripcion, y describen los metodos y/o materiales en relacion con los que

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se citan las publicaciones. Ha de entenderse que la presente descripcion supera cualquier descripcion de una publicacion incorporada en la extension en que haya una contradiccion.

Ha de anotarse que segun se emplea en esta memoria y en las reivindicaciones incluidas, las formas singulares "a", "uno o una" y "el o la"- incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Asf, por ejemplo, la referencia a "una celula" incluye una pluralidad de tales celulas y las referencias a "el compuesto" incluye referencias a uno o mas compuestos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la tecnica, y asf sucesivamente.

Las publicaciones descritas en la presente memoria se proporcionan solamente para su descripcion anterior a la fecha de publicacion de la presente solicitud. Nada de esta memoria ha de interpretarse como una admision a la que no esta titulada la presente invencion para anteceder tal publicacion en virtud de una publicacion previa. Ademas, las fechas de publicacion proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas actuales de publicacion que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.

Introduccion

La presente invencion se basa en la observacion de que las superficies nanotubulares proporcionan una plantilla favorable para el crecimiento y diferenciacion de celulas oseas y la adhesion, proliferacion y viabilidad de celulas superiores soportada, al tiempo que no causa respuesta inmunitaria adversa en condiciones in vivo. La biocompatibilidad de oxidos metalicos ya ha sido probada a medida que los materiales tienen aplicaciones clmicas actuales en protesis ortopedicas y en implantes dentales. Los inventores han descubierto que la actividad osteoblastica puede aumentarse significativamente utilizando nanotopograffas reguladas. Por tanto, la incorporacion de tales nanoarquitecturas en superficies de implantes medicos facilita, ademas, el cultivo y el mantenimiento de estados de celulas que se diferencian, y favorece la oseointegracion a largo plazo.

Los inventores han descubierto tambien que estos nanotubos pueden cargarse opcionalmente con medicamentos o agentes biologicos tales como protemas. Ademas, la liberacion o elucion de los medicamentos o agentes biologicos desde los nanotubos puede regularse variando la longitud, el diametro y el grosor de la pared del tubo. Cambiando el diametro el grosor de la pared y la longitud de los nanotubos, las caractensticas cineticas de liberacion pueden alterarse para medicamentos espedficos con objeto de conseguir una liberacion prolongada del farmaco a lo largo de un penodo de tiempo. Por tanto, estas superficies nanotubulares poseen diversas aplicaciones potenciales, espedficamente para implantes en que se desea una integracion mas rapida junto con una liberacion controlada de farmacos tales como antibioticos o factores de crecimiento.

La invencion se describe ahora con mayor detalle.

Metodos y composiciones

Como se ha indicado anteriormente la presente invencion proporciona un implante medico que comprende una superficie o pelfcula que comprende una pluralidad de nanotubos que tienen diametros de aproximadamente 3 nm a aproximadamente 300 nm y en una densidad mayor que 10.000.000 de nanotubos por centimetro cuadrado, donde dichos nanotubos comprenden un agente bioactivo de elucion al tejido circundante por colocacion en un sujeto, y en donde dicha pluralidad de nanotubos comprende, ademas, una pelfcula de cierre que puede desgastarse para proporcionar una elucion retardada del agente bioactivo. Los implantes medicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, un implante ortopedico, un implante dental, un implante cardiovascular, un implante neurologico, un implante neurovascular, un implante gastrointestinal, un implante muscular, un implante ocular, y similares. En algunas realizaciones, la superficie o pelfcula es un parche que puede utilizarse para la liberacion localizada del agente bioactivo a un tejido blando, tal como fngado, rinon, tracto gastrointestinal, pancreas, prostata, colon, y similares. El agente bioactivo ejemplar incluye, pero no se limita a, polipeptidos, acidos nucleicos tales como DNA, RNA y siRNA, factores de crecimiento, agentes esteroides, terapias de anticuerpo, agentes antimicrobianos, antibioticos, farmacos antirretrovirales, compuestos antiinflamatorios, agentes antitumorales, agentes antiangiogenicos, y agentes quimioterapicos. En ciertas realizaciones, la superficie o pelfcula incluye, ademas, un agente bioactivo enlazado covalentemente. En algunas realizaciones, la superficie o pelfcula incluye, ademas, celulas tales como celulas pluripotenciales, celulas progenitoras retinales, celulas progenitoras cardiacas, celulas osteoprogenitoras, celulas progenitoras neuronales, y similares.

En algunas realizaciones, la superficie o pelfcula se expande o desdobla en presencia de un lfquido hidratante, tal como agua presente en un sitio de insercion de un sujeto. Por "expande" se entiende que la superficie o pelfcula se hace mayor en tamano o volumen como resultado que rodea al lfquido que hidrata la superficie o pelfcula. Por "desdobla" se entiende que la superficie o pelfcula se despliega, se desarrolla, o se desenvuelve como resultado de rodeo del lfquido que hidrata la superficie o pelfcula.

Pueden producirse superficies y pelfculas que sirven de ejemplo a partir de una diversidad de materiales adecuados que proporcionan la capacidad de formar la pluralidad deseada de los nanotubos. Los materiales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, polfmeros biodegradables o biodesgastables, tales como poli(DL-lactida-co- glicolida)(PLGA), poli(DL-lactida-co-g-caprolactona)(DLPLCL), o poli(g-caprolactona)(PCL), asf como polfmeros naturales biodegradables, tales como cologeno, gelatina, agarosa, y similares. El PLGA es un copolfmero que se

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erosiona en bloques de polilactida (PLA) y poliglicolida (PGA), donde el ingreso de agua es mas rapido que la velocidad de degradacion. En este caso, la degradacion tiene lugar a traves del conjunto de la muestra de poUmero, y prosigue hasta alcanzar un peso molecular cntico, en cuyo punto los productos de degradacion se hacen lo bastante pequenos para ser solubilizados. En este punto, la estructura comienza a llegar a ser significativamente mas porosa e hidratada. La combinacion de PGA de reabsorcion rapida y de PLA de reabsorcion lenta permite que los copoKmeros de PLGA tengan una velocidad de resorcion de aproximadamente 6 semanas. Los poKmeros de PLGA de reabsorcion rapida tienen alta contraccion, que puede no presentar un sustrato estable para celulas que extienden la matriz extracelular. Ademas, la produccion de especies de degradacion acidas por polfmeros que se reabsorben rapidamente puede comprometer la reparacion de tejidos..

Ademas, la superficie o pelfcula puede producirse partiendo de una variedad de oxidos metalicos adecuados seleccionados del grupo que consiste en alumina, titania, Ti6A14V, mquel, circonia, cobalto-cromo (CoCr), alumina, sflice, aluminato de bario, titanato de bario, oxido de hierro, y oxido de zinc, as^ como tambien aleaciones de memoria confirmada, tales como nitinol, o sus combinaciones. En ciertas realizaciones, los nanotubos de fabrican de titania. Ademas, otros ejemplos de metales adecuados o de aleaciones de metales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, aceros inoxidables (p.ej., 316, 316L o 304), aleaciones de mquel-titanio que incluyen tipos de memoria configurada o superelastica (p.ej., nitinol o elastinita); inconel; metales nobles que incluyen cobre, plata., oro, platino, paladio e iridio; metales refractarios que incluyen Molibdeno, Wolframio, Tantalo, Titanio, Renio, o Niobio; aceros inoxidables aleados con metales nobles y/o refractarios; magnesio; metales amorfos; metales deformables plasticamente /p.ej. ,tantalo), aleaciones a base de mquel (p. ej., aleaciones que incluyen platino, oro y/o tantalo); aleaciones a base de hierro (p.ej., que incluyen aleaciones con platino, oro y/o tantalo), aleaciones a base de cobalto (p.ej., aleaciones que incluyen platino, oro y/o tantalo): aleaciones de cobalto-cromo (p. ej., Elgiloy): aleaciones de cobalto-cromo-mquel (p. ej. finox); aleaciones de cobalto, mquel, cromo y molibdeno (p.ej., MP35N o MP20N); aleaciones de cobalto-cromo-vanadio; aleaciones de cobalto-cromo-wolframio: aleaciones de platino-iridio: aleaciones de platino-wolframio; aleaciones de magnesio; aleaciones de titanio (p. ej, TiC, TiN); aleaciones de tantalo (p.ej., TaC, TaN); L605; materiales bioabsorbibles, que incluyen magnesio; u otros metales biocompatibles y/o aleaciones de los mismos. Preferiblemente, el marco implantable comprende un material de aleacion de mquel titanio (NiTi) que se autoexpande, acero inoxidable o una aleacion de cobalto-cromo. La aleacion de mquel titanio se vende bajo el nombre comercial Nitinol.

En algunas realizaciones, al menos un subconjunto de la pluralidad de nanotubos incluyen, ademas, una pelfcula de cierre que se erosiona evitando la elucion retardada del agente bioactivo al tejido circundante por colocacion del implante en un sujeto. Por ejemplo, la superficie o pelfcula pude incluir un primer subconjunto de nanotubos que incluye un agente bioactivo y un segundo subconjunto de nanotubos que incluye un agente bioactivo y cerrado con una pelfcula de cierre que se erosiona. En un ejemplo tal, el primer subconjunto de nanotubos carece de la pelfcula de cierre que se erosiona y puede eluir el agente bioactivo por colocacion en el sujeto, proporcionando con ello una liberacion precoz del agente bioactivo. A lo largo del tiempo, a medida que la pelfcula de cierre situada sobre el segundo subconjunto de nanotubos se erosiona, el agente bioactivo puede liberarse. Como resultado, la combinacion de estructuras cerradas y sin cerrar proporciona dos perfiles de elucion, una primera elucion precoz que procede del subconjunto sin cerrar y una segunda elucion mas tardfa que procede de la erosion de la pelfcula de cierre que procede del segundo subconjunto de cierre.

En general, los nanotubos se fabrican para tener un diametro que vana de aproximadamente 3 nm a aproximadamente 300 nm, que incluye aproximadamente 10 nm a aproximadamente 250 nm, aproximadamente 20 nm a aproximadamente 225 nm, aproximadamente 30 nm a aproximadamente 200 nm, aproximadamente 50 nm a aproximadamente 190 nm, aproximadamente 60 nm a aproximadamente 180 nm, aproximadamente 70 nm a aproximadamente 170 nm, aproximadamente 80 nm a aproximadamente 160 nm, y aproximadamente 90 nm a aproximadamente 150 nm. En algunas realizaciones los nanotubos se fabrican en una densidad mayor que al menos aproximadamente, 10.000.000 de nanotubos por centimetro cuadrado, que incluye al menos aproximadamente 25.000.000 de nanotubos por centimetro cuadrado, y al menos aproximadamente 50.000.000 de nanotubos por centfmetro cuadrado

En general, los nanotubos se fabrican para tener una longitud que vana de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 500 pm, que incluye aproximadamente 2 pm a aproximadamente 450 pm, aproximadamente 3 pm a aproximadamente 400 pm, aproximadamente 4 pm a aproximadamente 350 pm, aproximadamente 5 pm a aproximadamente 300 pm, aproximadamente 6 pm a aproximadamente 250 pm. aproximadamente 7 a

aproximadamente 200 pm, aproximadamente 8 pm a aproximadamente 100 pm, aproximadamente 9 pm a

aproximadamente 90 pm, aproximadamente 10 pm a aproximadamente 18 pm, aproximadamente 11 pm a

aproximadamente 70 pm. aproximadamente 12 pm a aproximadamente 60 pm. aproximadamente 13 pm a

aproximadamente 50 pm, aproximadamente 14 pm a aproximadamente 40 pm, aproximadamente 15 pm a

aproximadamente 30 pm, y aproximadamente 16 pm a aproximadamente 20 pm. En una realizacion ejemplar, los nanotubos tienen una longitud de aproximadamente 10 pm.

En general, los nanotubos se fabrican para tener poros que vanan en diametro de aproximadamente 3 nm a aproximadamente 250 nm, que incluye 4 nm a aproximadamente 225 nm, que incluye 5 nm a aproximadamente 200 nm, que incluye 6 nm a aproximadamente 175 nm, que incluye 7 nm a aproximadamente 150 nm, que incluye 8 nm

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a aproximadamente 125 nm, que incluye 9 nm a aproximadamente 100 nm,, que incluye 10 nm a aproximadamente 75 nm, que incluye 11 nm a aproximadamente 70 nm, que incluye 12 nm a aproximadamente 65 nm, que incluye 13 nm a aproximadamente 60 nm, que incluye 14 nm a aproximadamente 50 nm, que incluye 15 nm a aproximadamente 45 nm, aproximadamente 20 nm a aproximadamente 40 nm, aproximadamente 22 nm a aproximadamente 38 nm, aproximadamente 24 nm a aproximadamente 36 nm, aproximadamente 26 nm aproximadamente 34 nm, aproximadamente 28 nm aproximadamente 32 nm, y aproximadamente 29 nm a aproximadamente 31 nm, En una realizacion ejemplar, los poros tienen un diametro de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 40 nm.

En general, la superficie o pelmula se fabrica para tener un grosor que vana de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 2,5 mm, que incluye aproximadamente 2 pm a aproximadamente 2 mm, aproximadamente 3 pm a aproximadamente 1,5 mm, aproximadamente 3 pm a aproximadamente 1 mm, aproximadamente 4 pm a aproximadamente 750 pm, y aproximadamente 5 pm a aproximadamente 600 pm. En ciertas realizaciones, la superficie o pelmula tiene un grosor que vana de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 200 pm, que incluye aproximadamente 3 a aproximadamente 150 pm, aproximadamente 4 pm a aproximadamente 100 pm.

aproximadamente 5 pm a aproximadamente 80 pm, aproximadamente 6 pm a aproximadamente 70 pm,

aproximadamente 7 pm a aproximadamente 60 pm, aproximadamente 8 pm a aproximadamente 50 pm,

aproximadamente 9 pm a aproximadamente 40 pm, y aproximadamente 10 pm a aproximadamente 30 pm. En una

realizacion ejemplar, la superficie o pelmula tiene un grosor de aproximadamente 150 pm.

En ciertas realizaciones, la superficie o pelmula incluye ademas agentes biologicos y aditivos ventajosos para impartir, por ejemplo, propiedades adicionales osteoinductivas y osteoconductivas a los implantes modificados en la superficie. En realizaciones adicionales, los agentes biologicos y aditivos ventajosos se anaden a los nanotubos para elucion al tejido circundante por colocacion del implante en el paciente. Esto puede ser particularmente util para implantes de la presente invencion que son implantes oseos. En una realizacion ejemplar, pueden anadirse al implante uno o mas agentes biologicos o aditivos antes de la implantacion. Los agentes biologicos y aditivos pueden adsorberse e incorporarse en la superficie o pelmula que comprende los nanotubos sumergiendo el implante en una solucion o dispersion que contiene los agentes y/o aditivos, o mediante otros medios reconocidos por los expertos en la tecnica. En algunas realizaciones, los nanotubos pueden desprender los agentes biologicos y aditivos adsorbidos de un modo controlado en el tiempo. De este modo, las ventajas terapeuticas comunicadas por la adicion de agentes biologicos y aditivos pueden continuarse durante un penodo de tiempo extendido. Puede ser deseable incluir ciertos aditivos en la solucion electrolttica utilizada durante el proceso de anodizacion electroqmmica con objeto de aumentar las propiedades de adsorcion de los nanotubos formados sobre el implante nidificado en la superficie. Por ejemplo, la inclusion de sales en la solucion electrolttica empleada durante el proceso de anodizacion electroqmmica puede dar por resultado la incorporacion de sustancias ionicas en los nanotubos formados en la superficie o pelmula. La inclusion de sustancias ionicas en los nanotubos puede comunicar mayores propiedades de adsorcion a los nanotubos debido a las interacciones polares existentes entre los nanotubos que contienen sustancias ionicas y los agentes biologicos y aditivos.

Los agentes biologicos o aditivos pueden estar en una forma purificada, parcialmente en forma purificada, en forma recombinante, o en cualquier otra forma apropiada para su inclusion en el implante medico modificado en la superficie. Es deseable que los agentes o aditivos esten libres de impurezas y de contaminantes. Los agentes ejemplares para facilitar la adhesion celular y el crecimiento de celulas incluyen laminina, fibrina, fibronectina, proteoglicanos, glicoprotemas, glicosaminoglicanos, agentes quimiotacticos y factores de crecimiento, y similares.

Por ejemplo, pueden incluirse factores de crecimiento en el implante modificado en la superficie o en los nanotubos para elucion al tejido circundante por colocacion del implante en el paciente para mejorar el crecimiento de hueso o de tejido. Como ejemplos no limitadores de factores de crecimiento que pueden incluirse estan el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), el factor b de crecimiento de transformacion (TGF-b), el factor I de crecimiento relacionado con insulina (IGF-I), el factor II de crecimiento relacionado con insulina (IGF-II), el factor de crecimiento fibroblastico (FGF), beta-2-microglobulina (BDGF II) y factores morfogeneticos oseos. Los factores morfogeneticos oseos son factores de crecimiento cuya actividad es espedfica para el tejido oseo e incluyen, pero no se limitan a, protemas de hueso desmineralizado, matriz osea desmineralizada (DBM), y en protema osea particular (BP) o protema morfogenetica osea (BMP). Factores osteoinductivos tales como fibronectina (FN), osteonectina (ON), factor de crecimiento de celulas endoteliales (ECGF), extractos de fijacion de cemento (CAE), quetanserina, hormona de crecimiento humano (HGH). hormonas de crecimiento animal, factor de crecimiento epidermico (EGF), interleuquina-1 (IL-1) alfa trombina humana, factor de crecimiento de transformacion (TGF-beta), factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1), factores de crecimiento derivados de las plaquetas (PDGF), y factores de crecimiento fibroblasticos (FGF, bFGF, etc.) tambien pueden estar incluidos en el implante modificado en superficie.

Todavfa otros ejemplos de agentes y aditivos biologico que pueden incorporarse en la nanotopograffa del implante medico son azucares biocidas/bioestaticas tales como dextrano y glucosa; peptidos; secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos tales como antagonistas de leptina. antagonistas de receptores de leptina, y acidos nucleicos de leptina antisentido; vitaminas; elementos inorganicos; cofactores de smtesis de protemas; terapias de anticuerpos, tales como Herceptin®, Myllotarg®, y Erbitux®; hormonas; tejido endocrino o fragmentos de tejidos endocrinos;

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sintetizadores; enzimas tales como colagenasa, peptidasas y oxidasas; armazones de celulas de poKmeros con celulas parenquimales; agentes angiogenicos: agentes antigenicos; agentes citoesqueletales; fragmentos de cartflagos; celulas vivientes tales como condrocitos, celulas de medula osea, celulas pluripotenciales mesenquimales, extractos naturales, celulas vivientes geneticamente obtenidas, celulas vivientes modificadas de otro modo, tejidos autogenos tales como sangre, suero, tejido blando, y medula osea; bioadhesivos; factor quimotactico de ligamento periodontal (PDLGF); somatotropina; digestores oseos; agentes antitumorales y compuestos quimioterapicos tales como cis-platino, ifosfamida, metotrexato, e hidrocloruro de doxorrubicina; inmunosupresores; intensificadores de permeacion tales como esteres de acidos grasos que incluyen monoesteres laureato, miristato y estearato de polietilenglicol; bifosfonatos tales como alendronato, clodronato, etidronato, ibandronato, (3-amino-1-hidroxipropilideno)-1,1-bisfosfonato (APD), bisfosfonato de diclorometileno, aminobisfosfonatezolendronato, y pamidronato; analgesicos y antiinflamatorios tales como medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (NsAlD) similares a trometamina ketorolaco, hidrocloruro de lidocama, hidrocloruro de bipivacaina, e ibuprofeno; antibioticos y farmacos antirretrovirales tales como tetraciclina, vancomicina, cefalosporina, eritromicina, bacitracina, neomicina, penicilina, polimixina B, biomicina, cloromicetina, estreptomicina, cefazolina, ampicilina, azactam. tobramicina, clindamicina, gentamicina, y aminoglicosidos tales como tobramicina y gentamicina; y sales tales como sal de estroncio, sal fluoruro, sal de magnesio, y sal de sodio.

Los ejemplos de agentes antimicrobianos incluyen, pero no se limitan a, tobramicina, amoxicilina, amoxicilina/clavulanato, anfotericina B, ampicilina, ampicilina/sulbactam, atovaquona, azitromicina, cefazolina, cefepina, cefotaxima, cefotetan, cefpodoxima, ceftazidina, ceftizoxima, ceftriaxona, cefuroxima, axetil cefuroxima, cefalexina, cloranfenicol, clotrimazol, ciprofloxacina, claritromicina, clindamicina, dapsona, dicloxacilina, doxiciclina, eritromicina, fluconazol, foscamet, ganciclovir, atifloxacina, imipenem/cilastatina, isoniazida, itraconazol, ketoconazol, metronidazol, nafcilina, nistatina, penicilina, penicilina G, pentamidina, piperacilin/tazobactam, rifanpina, quinupristin- dalfopristina, ticarcilin/clavulanato, trimetoprima/sulfametoxazol, valaciclovir, vancomicina, mafenida, sulfadiazina de plata, mupirocina, nistatina, triamcinolona/nistatina, clotrimazol/betametasona, clotrimazol, ketoconazol, butoconazol, miconazol, y tioconazol.

Los agentes antiangiogenicos incluyen, pero no se limitan a, interferon-a, inhibidores de COX-2, antagonistas de integrina, angiostatina, endostatina, trombospondm-1, vitaxina, celecoxib, rofecoxib, ITE-522, EMD-121974, y D-2163, inhibidores de quinasa FGFR, inhibidores de quinasa EGFR, inhibidores de quinasa VEGFR, inhibidores de metaloproteinasa de la matriz, marmiastat, prinomastat, BMS275291, BAY12-9566, neovastat, rhuMAb VEGF, SU5416, SU6668, ZD6474, CP-547, CP-632, ZD4190, talidomida y analogos de talidomida, escualamina, celecoxib, ZD6126, TNP-470, y otros farmacos inhibidores de angiogenesis.

En general el agente bioactivo que eluyen los nanotubos puede eluir el agente bioactivo al tejido circundante por colocacion del implante en el paciente durante un penodo que vana de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 3 meses o mas, que incluye 5 minutos a aproximadamente 14 semanas, tales como aproximadamente 24 horas, 72 horas, aproximadamente 3 dfas, aproximadamente 7 dfas, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas,, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 12 semanas, o mas.

En realizaciones mas nuevas, en que es deseable modular las cineticas de liberacion de los agentes bioactivos que se eluyen desde los nanotubos, un polfmero adecuado sintetico o natural se combina con el agente bioactivo antes o al mismo tiempo en que los nanotubos se cargan con el agente bioactivo. Los polfmeros adecuados sinteticos y naturales incluyen, pero no se limitan a, polfmeros biodegradables o bioerosionables, tales como poli(DL-lactida-co- glicoda) (PLGA), poli(DL-lactida-co-g-caprolactona) (DLPLCL), o poli(g-caprolactona)(PLC), colageno, gelatina, agarosa, y otros materiales naturales biodegradables.

Las superficies de nanotubos minerales con o sin peptidos que favorecen la adhesion y/u otros agentes biologicos, pueden ser densificados o estructurados y utilizados solos para formar un implante. Alternativamente, un sustrato estructurado puede revestirse con una composicion que comprende los nanotubos con o sin peptidos que favorecen la adhesion. Los sustratos incluyen cualesquiera sustratos convencionales para implantes medicos o para otros tipos de implantes conocidos en la tecnica.

Tambien se proporciona (no segun la invencion) un metodo de tratamiento de un paciente necesitado de un implante medico que comprende las etapas de seleccionar el implante medico en donde el implante comprende nanotubos revestidos en la superficie y colocando el implante en el paciente. Los Implantes ejemplares incluyen, implantes ortopedicos, implantes dentales, implantes cardiovasculares, tales como un marcapasos artificial, implantes neurologicos, implantes neurovasculares, implantes gastrointestinales, implantes musculares, implantes oculares, y similares.. En esta realizacion de la invencion el termino "seleccionar" significa, por ejemplo, adquisicion, eleccion o proporcion del implante en vez de preparacion del implante.

El metodo puede emplearse tanto para medicina clmica humana como para aplicaciones veterinarias. Por tanto, el paciente puede ser humano o, en el caso de aplicaciones veterinarias, puede ser un animal de laboratorio, agncola, domestico o un animal salvaje. La presente invencion puede aplicarse a animales que incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, animales de laboratorio tales como simios y chimpances, animales domesticos tales como perros y

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gatos, animales agncolas tales como vacunos, caballos, cerdos, ovejas, cabras, y animales salvajes en cautividad tales como osos, pandas, leones, tigres, leopardos, elefantes, cebras, jirafas, gorilas, defines, y ballenas.

En otra realizacion (no segun la invencion) se proporciona un metodo para intensificar la oseointegracion de un implante ortopedico. El metodo comprende las etapas de seleccionar el implante ortopedico en donde el implante comprende nanotubos revestidos en la superficie y la colocacion del implante en un paciente. En esta realizacion de la invencion el termino "seleccionar" significa, por ejemplo, adquisicion, eleccion, o proporcion del implante en vez de la preparacion del implante. El paciente puede ser un ser humano o, en el caso de aplicaciones veterinarias, puede ser un animal de laboratorio, agncola, domestico o un animal salvaje.

La intensificacion de la oseointegracion es el aumento de oseointegracion comparado con el obtenido con materiales de implante convencionales. La oseointegracion intensificada puede demostrarse por la adhesion aumentada de osteoblastos, la proliferacion aumentada de osteoblastos, la deposicion aumentada de calcio, los ensayos de la actividad enzimatica, o mediante cualquier otro metodo reconocido en la tecnica empleado para detectar oseointegracion.

Todavfa en otra realizacion se proporciona un metodo de preparacion de un implante medico. El metodo comprende la etapa de formacion de una composicion que comprende nanotubos. El metodo puede comprender, ademas, la etapa de revestir un sustrato con la composicion que contiene nanotubos. La composicion formada puede ser una composicion que contiene los nanotubos solos, una composicion de nanocompuestos, una composicion de nanocompuestos que contiene un peptido que favorece la adhesion, o cualquier otra composicion que contiene nanotubos que es adecuada para emplear segun la presente invencion.

Kits

Se proporcionan tambien kits de empleo en relacion con la invencion sujeto. La superficie o pefcula anteriormente descrita que comprende nanotubos que comprenden un agente bioactivo para elucion al tejido circundante por colocacion en un sujeto, asf como tambien implantes medicos que incluyen la superficie o pefcula, pueden proporcionarse en kits, con instrucciones adecuadas con objeto de llevar a cabo los metodos descritos anteriormente. El kit contendra normalmente en recipientes separados los nanotubos o los materiales necesarios para proporcionar el revestimiento nanotubular sobre una superficie. Las instrucciones (p.ej., escritas, en cinta, VCR, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo los metodos, habitualmente estaran incluidas en el kit. El kit puede contener asimismo, dependiendo del metodo particular, otros reactivos y materiales envasados (es decir, tampones y similares).

Las instrucciones se registran generalmente en un medio de registro adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden imprimirse en un sustrato, tal como papel o plastico, etc. Por tanto, las instrucciones pueden estar presentes en los kits como una insercion del envase, en la etiqueta del recipiente del kit o componentes del mismo (p.ej., asociadas con el envasado o subenvasado), etc. En otras realizaciones, las instrucciones estan presentes como un archivo de datos de almacenamiento electronico presente en un medio de almacenamiento legible de un ordenador adecuado, p.ej., CD-ROM, disquete, etc., incluyendo el mismo medio sobre el que se presenta el programa. .

Todavfa en otras realizaciones, las instrucciones no estan por sf mismas presentes en el kit, si no medios para obtener las instrucciones procedentes de una fuente remota, p.ej., via Internet. Un ejemplo de esta realizacion es un kit que incluye una direccion web donde las instrucciones pueden verse de o de donde las instrucciones pueden descargarse.

Todavfa mas, el kit puede ser uno en el que se obtienen las instrucciones descargadas de una fuente remota, como en Internet o www (world wide web). Puede emplearse alguna forma de protocolo de seguridad o de identificacion de acceso, para limitar el acceso a aquellos autorizados para el uso de la invencion sujeto. Como con las instrucciones, los medios de obtener las instrucciones y/o la programacion se registran generalmente en un medio de registro adecuado.

Ejemplos

Los ejemplos que siguen no estan segun la invencion. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud en lo que respecta a los numeros utilizados (p.ej., cantidades, temperatura etc.) pero deben tenerse en cuenta para ello algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio, la temperatura esta en grados Centfgrados, y la presion esta en la presion atmosferica o cerca de ella.

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Metodos y materiales

En los Ejemplos que figuran mas adelante se emplearon los siguientes metodos y materiales.

Fabricacion de superficies nanotubulares de titania.

Se fabricaron superficies nanotubulares de titania utilizando un proceso de anodizacion descrito en otro lugar (Mor et al., Advanced Functional Materials 2005, 15:1291-96; Varghese et al., Journal of Materials Research 2003, 18:156155). Brevemente, hojas de titanio (Alfa Aesar) de grosor 0,25 mm y pureza 99,8% se emplearon para fabricar nanotubos de titania. El electrolito estaba constituido por acido fluorhudrico al 0,5% en volumen (J. T. Baker) en agua, y un electrodo de platino (Alfa Aesar) que sema de catodo. La anodizacion se realizo con un voltaje constante de 20 V durante 45 minutos. Las muestras se limpiaron utilizando agua desionizada despues de completar el proceso de anodizacion. Los nanotubos se sometieron luego a sinterizacion a 500°C en oxfgeno anhidro como es sabido que esos ambientes influyen en la transformacion de fase de titania. Las morfologfas de las superficies de las muestras se estudiaron utilizando un Microscopio Electronico de Barrido Sirion,(SEM). .

Aislamiento y cultivo de celulas estromales medulares (MSC)

Se obtuvieron ratas Lewis macho del Laboratory of Animal Resource Center (LARC) de la Universidad de California, San Francisco. Los animales se sometieron a eutanasia segun un protocolo aprobado por IACUC. Se separaron los limbos asepticamente y se colocaron en solucion tamponada de fosfato fria (PBS) en tubos Falcon de 50 ml. Se diseccionaron huesos procedentes de los tejidos blandos en una cabina de cultivo celular. Los extremos metaffsicos de los huevos se separaron para permitir el acceso a la cavidad medular. Los contenidos de cavidad medular se pusieron al descubierto utilizando una aguja de calibre 25 fijada a una jeringuilla de 10 ml que contema MEM modificado en alfa (aMEM) suplementado con FBS al 10% y penn/strep (penicilina/estreptomicina) al 1%.. La suspension celular descubierta se filtro luego a traves de un filtro de nilon de 70 |im. Con objeto de sembrar celulas sobre superficies nanotubulares (1 cm X 1 cm), las superficies se adhirieron al fondo de placas de 12 pocillos, con silicona de calidad medica (Dow) y se curaron durante la noche, Las placas se colocaron luego bajo luz ultravioleta en una cabina biologica durante 30 minutos. Antes de sembrar las celulas, las superficies fueron humedecidas con etanol de 70% durante 30 minutos para esterilizacion. Las superficies se lavaron entonces dos veces con PBS a baja temperatura y las celulas se depositaron en placa en una densidad de 5 X 106 por pocillo. El dfa 4 de cultivo, la mitad de los medios se separo y se reemplazo con aMEM de nueva aportacion suplementado con FBS al 10% y penn/strep al 1%. El dfa 7 de cultivo todos los medios se retiraron y las celulas se suministraron con los medios completos. Los Medios completos incluyen aMEM suplementado con FBS al 10%, Penn/Strep al 1%, Dexametasona (concentracion final 10-8M), acido Ascorbico (50 |ig/ml final) y fosfato de beta-glicerol (8 mmol final). El medio se cambio despues cada dos dfas para la duracion del experimento. La respuesta celular se investigo en dos etapas (a) adhesion y proliferacion celular hasta 7 dfas despues de la fase de cultivo inicial, y (b) diferenciacion celular durante hasta 3 semanas despues de proporcionar medios completos (es decir, despues de 7 dfas desde el cultivo inicial). Se utilizaron como tipos titanio y poliestireno de cultivo de tejidos de que se dispone en el comercio.

Adhesion y proliferacion de MSC

Se investigo la adhesion de MSC 1 dfa despues de sembrar las celulas y la proliferacion se investigo despues de los dfas 4 y 7. Las celulas adheridas y proliferadas se cuantificaron tripsinizando las celulas situadas en las superficies y contandolas utilizando un hemacitometro

Viabilidad celular

La viabilidad celular se investigo 4 dfas despues de sembrar las celulas utilizando un ensayo de MTT de que se dispone en el comercio (Sigma). El metodo MTT es sencillo, exacto y rinde resultados reproducibles. El componente fundamental es (bromuro de (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio) o MTT. Las soluciones de MTT, disueltas en soluciones salinas medias o equilibradas sin rojo de fenol. tienen un color amarillento. Las deshidrogenasas mitocondriales de las celulas viables dividen el anillo de tetrazolio, produciendo cristales de formazan de color purpura. Se siguio el protocolo tipo proporcionado con el kit de MTT. La solucion de color purpura que resulto se midio espectrofotometricamente a 570 nm empleando un espectrofotometro, Un aumento o una disminucion del numero de celulas dio por resultado un cambio concomitante con la cantidad de formazan formado, lo que indica el grado de citotoxicidad ocasionado por las superficies.

Tincion con calceina

Al cabo de 7 dfas de cultivo, las celulas existentes sobre las superficies se tineron con calceina. La calceina, colorante polianionico, queda bien retenida dentro de las celulas vivas, produciendo asf una fluorescencia verde uniforme intensa en las celulas vivas. Las superficies se lavaron dos veces con PBS antes de la tincion. Se incubaron en solucion de calceina 2 |iM durante 30-45 minutos. Las superficies se sometieron a formacion de imagenes empleando un microscopio de fluorescencia despues de lavar con PBS.

Contenido total de protema intracelular

El contenido total de protema de MSCs es sumamente importante dado que es la indicacion de crecimiento conveniente y de respuesta normal de las celulas en medios ambiente nanotubulares. Por tanto, se midio la cantidad de protema producida por las celulas a las 3 semanas de cultivo despues de proporcionar medios completes. Con 5 objeto de liberar la protema intracelular, las celulas adheridas sobre los sustratos se sometieron a lfsis en agua desionizada empleando un metodo estandar de cuatro ciclos de congelacion-descongelacion La solucion de lisado que resulto se utilizo despues para el analisis- El contenido total de protema se determino mediante un kit de ensayo con BCA (acido bicinconmico) (Pierce) y la absorbancia de la solucion se midio empleando un espectrofotometro en una longitud de onda de 570 nm. La absorbancia se convirtio luego en contenido de protema utilizando una curva 10 tipo de albumina para determinar la cantidad de protema intracelular.

Actividad de fosfatasa alcalina

La actividad ALP es un parametro importante para tener acceso a la funcionalidad normal de celulas situadas sobre una superficie; por tanto la actividad se valoro a 3 semanas despues de la provision de medios completos. La solucion de lisado que resulta se empleo para medir la actividad ALP utilizando un ensayo colorimetrico del que se 15 dispone en el comercio (Teco). La absorbancia de la solucion se midio utilizando un espectrofotometro en una

longitud de onda de 590 nm. La absorbancia se convirtio luego en concentracion empleando un patron de ALP y todos los resultados obtenidos se normalizaron con contenido total de protema para tener en cuenta los cambios en el numero de celulas presentes en cada superficie.

Analisis de contenido de calcio

20 El contenido de calcio se valoro a las 3 semanas del cultivo empleando un ensayo colorimetrico (Teco). Una vez

desprendido el lisado. las superficies se remojaron durante la noche en solucion de HCl 6N para disolver el calcio

precipitado. La solucion de calcio se hizo reaccionar luego con reactivos para el ensayo y la solucion se midio fotometricamente a 570 nm. La absorbancia se convirtio despues en concentracion utilizando patrones de calcio y todos los resultados obtenidos se normalizaron con contenido total de protema l para tener en cuenta los cambios 25 en el numero de celulas presentes en cada superficie.

Produccion de matriz extracelular

El calcio y el fosforo son los componentes principales de la matriz osea. Si las celulas se han diferenciado en las superficies, comenzaran a depositar matriz osea. Con objeto de detectar la presencia de calcio y fosforo sobre nuestras superficies, las muestras fueron secadas al aire para el analisis XPS. XPS es una tecnica sensible a las 30 superficies y detecta niveles indicio de elementos presentes en la superficie. Se recogieron espectros de estudio desde 0 a 1100 eV utilizando un espectrometro de XPS Monocromatizado S-Probe de SSI con una fuente de cota pequena de rayo de Al-Ka-X (1486, 6 eV) y un detector de multicanales con una energfa de paso de 160 eV. Los resultados obtenidos por ciento de composicion atomica y de razones atomicas del calcio y fosforo depositados sobre superficies de alumina durante hasta tres semanas de cultivo, se calcularon de las exploraciones estudiadas 35 utilizando el software suministrado por el fabricante.

Morfologfa de las celulas

La morfologfa de las celulas sobre superficies nanotubulares y testigo se examino empleando SEM. Las superficies se sometieron a formacion de imagenes al cabo de 1, 4 y 7 dfas de cultivo para investigar la etapa de adhesion y proliferacion; y despues de 1, 2 y 3 semanas de cultivo despues de proporcionar los medios completos. Antes de 40 formar las imagenes las celulas se fijaron y deshidrataron. Las superficies se lavaron dos veces en PBS y luego se remojaron en el fijativo primario de glutaraldetedo al 3% (Sigma), cacodilato sodico 0,1 M (Polysciences), y sacarosa 0,1 M (Sigma, ST. Louis MO) durante 45 minutos. Las superficies se sometieron a dos lavados de cinco minutos con un tampon que conterna cacodilato sodico 0,1 M y sacarosa 0,1 M. Despues las celulas se deshidrataron reemplazando el tampon con concentraciones crecientes de etanol (35, 50, 70, 95 y 100 %) durante diez minutos 45 cada una. Despues, las celulas se secaron reemplazando el etanol por hexametildisilazano (HMDS) (Polysciences) durante 10 minutos. El HMDS se retiro y las superficies se secaron al aire durante 30 minutos. La obtencion de imagenes SEM se realizo en el Microscopio Electronico de Barrido Sirion en voltajes que variaban de 10-20 kV despues de que las superficies se revistieran por chisporroteo en oro. El revestidor de chisporroteo se fijo en una corriente de 20 mA y una presion de 0,05 mbar durante veinte segundos para depositar una capa de oro de 10 nm.

50 Respuesta inmunitaria in vivo de superficies nanotubulares de titania

Dos ratas Lewis macho. de aproximadamente 225 g, fueron anestesiadas en una camara de induccion con isoflurano al 3% y se mantuvieron entonces en isoflurano al 1,5% en una mascara olfativa ajustada durante el curso de la cirugfa. Los animales se pinzaron y prepararon siguiendo tecnicas asepticas descritas en las pautas de IACUC. Se hizo una incision de 1 cm de lmea media de la region de pescuezo del cuello. Los discos de implante de 55 muestras (5 mm de diametro y 1 mm de grosor) fueron esterilizados por calentamiento en autoclave. La capa de piel se desprendio de la capa muscular formando un bulto sobre cada lado de la incision, donde estaban colocadas las superficies. Se implantaron dos muestras en cada animal haciendo un total de 4 muestras (2 de titania nanotubular y

2 de testigo de titania). La capa de piel se suturo luego con sutura de nilon 4,0. Se dejo que los animales se recuperaran antes de devolverles a la instalacion de animales. Los animales fueron monitorizados cada d^a durante la primera semana y dos veces por semana despues hasta 4 semanas. Se separaron los puntos de sutura de nilon despues de una semana. Al cabo de 4 semanas, los animales se anestesiaron segun se ha descrito anteriormente. 5 Se hizo una incision en la lmea media en la region del pescuezo del cuello. La capa de piel se levanto para exponer los implantes que luego se recuperaron juntamente con el tejido circundante. Los animales se sacrificaron por separacion cardiaca.

Directamente, despues de la eutanasia, los implantes recuperados con los tejidos circundantes fueron fijados en solucion de formaldehudo tamponada con fosfato al 4%. Seguidamente, las muestras se deshidrataron e incrustaron 10 en medios de incrustacion de Spurr. Despues de la proliferacion, se obtuvieron secciones de 300 |im de grosor que conteman interfase de tejido/implante utilizando una sierra de diamante de velocidad lenta (sierra Isomet de Buehler) Las secciones se molieron luego utilizando papel de lija de 400 y 600 polvos en un molino de ruedas (molino Ecomet III de Buehler) hasta obtener un grosor final de 50 |im y se tineron con hematoxilina y eosina..

Analisis estadfstico

15 Cada uno de los experimentos se reconfirmo al menos tres veces empleando celulas procedentes de diferentes preparaciones estromales medulares. Todos los resultados se analizaron utilizando analisis de varianza /ANOVA). La significacion estadfstica se considero en p<0,05.

Relleno de nanotubos

Los nanotubos se rellenaron empleando un metodo simplificado de liofilizacion (Foraker et al.,Pharm Res 20 20(1):110-6 (2003); Salonen et al., J Control Release 108(2-3):362-74 (2005). En breve, se prepararon 100 mg/ml de

soluciones de BSA en PBS (pH 7.1) y de LYS en tampon de acetato sodico (50 mM, pH 4,5). Las superficies de titania de los nanotubos (0,5 cm X 0,5 cm) se limpiaron con agua desionizada antes de la carga de BSA y LYS. Se midio con pipeta 1 |il de la solucion de protema existente sobre la superficie de los nanotubos y se esparcio suavemente para asegurar un revestimiento uniforme. Las superficies se dejaron secar despues en vado a 25 temperatura ambiente durante 2 horas. Despues de secar, se repitio la etapa de carga hasta que estaba presente la cantidad apropiada de protema en la serie de nanotubos. De este modo las superficies se cargaron con 200, 400 y 800 |ig de protema. Despues de la etapa final de secado las superficies se enjuagaron rapidamente pipeteando 500 |il de PBS sobre la superficie para retirar el exceso de protema existente sobre la superficie. Las soluciones de lavado se recogieron y se guardaron para su analisis posterior. Se utilizaron como testigo superficies de los

30 nanotubos que habfan adsorbido la misma concentracion de protema. La adsorcion se efectuo incubando las

superficies durante 20 minutos siguiendo con limpieza con PBS.

Espectroscopfa fotoelectronica de rayos X.

Para evaluar las diferencias en cantidades de protema en los nanotubos, se llevo a cabo un analisis por espectroscopfa fotoelectronica de rayos X (XPS). XPS es una tecnica sensible de las superficies que puede 35 detectar cambios en la composicion de una superficie de hasta 2-20 capas atomicas, dependiendo del material. Dado que los nanotubos tienen aproximadamente una longitud de 400 nm, pudo utilizarse XPS para verificar las diferencias en las concentraciones de las superficies debidas a diferentes cantidades de BSA y LYS cargadas.. Las superficies de los nanotubos cargadas junto con las superficies adsorbidas se montaron en una fase de XPS. Se analizaron tres lugares por muestra. Los analisis se realizaron en un espectrometro de XPS monocromatizado 40 S-Probe de SSI que emplea una fuente de rayos Al-Ka-X (1.486,6 eV) con una lente de area pequena Focus III de

Omni y un detector multicanales. Un analizador hemisferico concentrico (CHA) se hizo actuar en el modo de

transmision constante del analizador para medir las energfas de union de los fotoelectrones emitidos. La escala de energfas de union se calibro mediante el pico Au4f7/2 en 83,9 eV, y la linealidad se verifico mediante los picos Cu3p-i/2 y Cu2pa/2 en 76,5 y 932,5 eV, respectivamente. Se recogieron espectros de estudio desde 0 a 1100 eV con 45 energfa de paso de 160 eV, y se recogieron tambien espectros C1s de resolucion alta para cada elemento detectado con energfa de paso de 10 eV. Se recogieron espectros de estudio y de resolucion alta se recogieron en un angulo limitado de 65°, definido como el angulo de luz diseminado por el parche electronico para el analizador y la superficie de la muestra. A todos los espectros se dio referencia fijando el pico C1s de hidrocarburo en 285,0 eV para compensar los efectos residuales de la carga. Los resultados de la composicion atomica y de las razones atomicas 50 se calcularon utilizando el factor de sensibilidad suministrado por el fabricante.

Liberacion de nanotubos

Con objeto de liberar las protemas procedentes de los nanotubos, las superficies se sumergieron en 500 |il de PBS en una placa de 24 pocillos, a temperatura ambiente, con agitacion orbital a 70 rpm. Se tomaron 200 |il de muestras despues de intervalos espedficos de tiempo para determinar las cineticas de la liberacion. Se recogieron muestras 55 periodicamente durante hasta 120 minutos. La solucion se reemplazo con 200 |il de PBS de nueva aportacion cada vez que se tomaban las muestras. Las muestras se analizaron por el contenido de protema utilizando un kit de ensayo Micro-BCA del que se dispone en el comercio, y la concentracion se ajusto segun las diluciones debido al reemplazo de PBS de nueva aportacion.

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Ejemplo 1

Fabricacion de implantes revestidos en la superficie nanotubular

Los resultados exponen el desarrollo de superficies nanotubulares que pueden aplicarse a implantes que existen, proporcionando con ello una estrategia que puede aplicarse bastante rapidamente en el medio ambiente medico. El enfoque para conseguir una nanoarquitectura optima del material utiliza una tecnica de anodizacion sencilla para fabricar disposiciones de nanotubos de titania orientados verticalmente, inmovilizados, de razon de aspecto elevado, La FIG. 1 muestra una imagen SEM de nanotubos de titania con un tamano de poro de aproximadamente 80 nm y una longitud de 400 nm, preparados utilizando un voltaje de anodizacion de 20 V durante 20 minutos. Puede apreciarse que la disposicion de nanotubos es sustancialmente uniforme a lo largo de la superficie de sustrato. Existe una correlacion precisa entre el voltaje de anodizacion y el tamano de los poros, por lo que variando el voltaje y el tiempo de anodizacion pueden obtenerse sustratos con escalas de tamanos diferentes (Mor et al., Journal of Materials Research 2003, 18(11);2588-93; Rougraff et al., J Bone Joint Surg Am 2002, 84-A(6):921-9). La zona superficial grande de la estructura de la disposicion de los nanotubos y la aptitud para afinar precisamente el tamano de los poros, el grosor de la pared, y la longitud de los nanotubos para optimizar las propiedades de las medidas biologica estan entre las muchas propiedades deseables de esta arquitectura para poder emplearles en aplicaciones ortopedicas.

Las superficies de titania nanotubulares producidas se sembraron con celulas estromales medulares obtenidas de ratas Lewis macho. Los extractos de medula osea que contienen osteoprogenitores combinados con varias matrices han puesto de manifiesto que aceleran e intensifican la formacion de hueso sin defectos oseos en comparacion con la matriz aislada (Rougraff et al., J Bone Joint Surg Am 2002, 84-A(6):021-9; Tiedeman et al., Orthopedics 1995, 18(12):1153-8). Las MSCs contienen una poblacion pluripotente de celulas capaces de diferenciacion a lo largo de linajes mesenquimatosos multiples (p.ej., hueso (Haynesworth et al., Bone 1992, 13(1):81-8; Prockop et al., Science 1997, 276(5309):71.4), ligamentos (Altman et al., Faseb J 2002:16(2):270-2), tejido adiposo (Beresford et al., J Cell Sci 1992;192(Pt 2):341.51); cartflagos (Wakitani et al., J Bone Joint Surg A 1994, 76(4):579-92) y tejido muscular ((Seshi et al., Blood Cells Mol Dis 2000; 26(3):234-46)). Debido a que las tecnicas de cultivo de tejidos manifiestan el aislamiento y expansion ex vivo de esta poblacion de celulas procedente de animales, estas celulas representan una fuente celular osteogenica para emplear para evaluar su interaccion con superficies nanoestructuradas. La capacidad de MSCs para inducir formacion osea in vivo se opina que es debido a la interaccion de osteoprogenitores presentes dentro de las poblaciones de celulas con factores osteoinductivos, tales como protemas morfogeneticas de hueso y diversos factores de crecimiento y citoquinas que les hacen diferenciarse, en celulas que forman hueso, es decir, osteoblastos, que eventualmente despues forman una matriz osea. Se utilizaron como testigos titanio puro y poliestireno de cultivo de tejidos de que se dispone en el comercio.

Es necesaria una union importante a las superficies con objeto de que las MSCs se desplieguen y se diferencien. Determinando la union inicial de MSCs en las superficies nanotubulares, puede examinarse la correlacion de la union celular y las propiedades ffsicas y mecanicas de la armazon. El contacto y las interacciones entre celulas afectaran eventualmente al proceso de diferenciacion. Por tanto, se investigo la adhesion y proliferacion de las celulas sobre superficies de titania nanotubulares, y se comparo con las procedentes de titanio y poliestireno. La FIG. 2, parte a, expone los resultados de adhesion de MSC despues de 1 dfa y la proliferacion despues de 4 y 7 dfas de cultivo de las celulas. Como era de esperar, el poliestireno apoyo la maxima adhesion y proliferacion de las celulas. No obstante, los resultados indicaron un aumento de 40% en el numero de celulas presentes en superficies de titania nanotubulares en comparacion con superficies de titania planas (p<0,05) al cabo de 7 dfas de cultivo. Los resultados ponen de manifiesto que las indicaciones topograficas en nivel de nanoescalas presentes sobre las superficies de titania nanotubulares favorecen la adhesion y proliferacion de las celulas.

La mayor adhesion sobre la superficie no sugiere necesariamente que las celulas sean viables y funcionales. Por tanto, la viabilidad celular se determino tambien utilizando el ensayo de MTT. La FIG.2, parte b, muestra los valores de absorbancia obtenidos para celulas adheridas a superficies durante 4 dfas. Los resultados muestran que las celulas son viables sobre superficies de titania nanotubulares asf como sobre superficies de titanio y poliestireno.. Los valores de las absorbancias para superficies nanotubulares y de titanio son similares a los obtenidos de poliestireno. El poliestireno se emplea comunmente como control positivo del cultivo de celulas. Por tanto la semejanza entre los valores de las absorbancias manifiesta que las celulas estan sanas y son viables sobre las tres superficies. Despues de 7 dfas de cultivo (justamente antes de proporcionar los medios completos) las celulas se tineron con calceina. La tincion con calceina es fluorescente basado el metodo de tincion para determinar la viabilidad celular. Es un indicador mas rapido, menos costoso y mas sensible de acontecimientos citotoxicos. Las celulas vivas se distinguen por la presencia de actividad de esterasa intracelular, determinada por la conversion enzimatica de la calceina que penetra en las celulas virtualmente no fluorescentes para la calceina intensamente fluorescente. La calceina colorante polianionico es bien retenida dentro de las celulas vivas, produciendo en las celulas vivas una fluorescencia verde uniforme. La FIG. 3, partes a y b, expone imagenes de MSCs de microscopfa de fluorescencia sobre superficies de titanio y nanotubulares, respectivamente, tenidas con calceina. Las imagenes muestran que las celulas son viables sobre estas superficies despues de 7 dfas de cultivo. Ademas, una inspeccion mas estrecha de celulas sobre superficies nanotubulares revela la formacion de agrupaciones, que es un comportamiento fenotfpico normal de MSCs. Este comportamiento esta ausente en superficies de titanio lisas, lo que muestra que las superficies nanotubulares estan proporcionando un microambiente favorable para las MSCs.

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Se investigo la morfologfa de MSC sobre superficies de titanio y superficies de titania nanotubulares utilizando SEM. La FIG. 4 muestra imagenes SEM despues de 1, 4 y 7 dfas de cultivo sobre superficies de titanio y nanotubulares. Como era de esperar, las celulas eran esfericas despues del dfa 1 tanto sobre superficies de titanio como sobre superficies nanotubulares (FIG. 4, partes a y b, respectivamente(. Despues de 4 dfas de cultivo las MSCs ponen de manifiesto todavfa una morfologfa esferica sobre superficies de titanio (FIG, 4, parte c); sin embargo exponen una morfologfa que se extiende sobre las superficies nanotubulares (FIG. 4, parte d). El dfa 7, las MSCs sobre superficies de titanio estan aisladas todavfa con una propagacion minima (FIG. 4, parte e), mientras que las MSCs sobre superficies de nanotubos han formado un enrejado indicativo de comunicacion de celula con celula (FIG. 4, parte f). Estos resultados exponen que las MSCs son capaces de propagarse mas rapidamente sobre superficies nanotubulares en comparacion con las superficies de titanio dentro de 7 dfas de cultivo. Se tomaron imagenes SEM con ampliacion alta al cabo de 7 dfas sobre superficies nanotubulares para visualizar las extensiones celulares. La FIG. 4, partes g y h, muestran imagenes SEM de la ampliacion alta de una extension de MSC que investiga la arquitectura nanotubular. La longitud de la extension es muchas veces mayor que el diametro de las celulas. Estas extensiones ayudan al propio anclaje de las celulas a la estructura nanotubular. Haciendo esto, las celulas pueden adherirse y propagarse sobre la superficie, dando por resultado una diferenciacion intensificada a largo plazo.

Despues de 7 dfas de cultivo sobre superficies de titanio y de titania nanotubulares, las MSCs fueron provistas de medios completos para iniciar diferenciacion y deposicion de matriz. Se midio la actividad de fosfatasa alcalina (ALP) durante hasta 3 semanas de cultivo despues de proporcionar medios completos. Los niveles de ALP son dependientes de la edad; no obstante, los niveles se elevan durante el penodo de crecimiento oseo activo, y por tanto se midieron. Se empleo un ensayo colorimetrico para medir los niveles de ALP. La FIG. 5. parte a, expone la actividad de ALP normalizada con contenido total de protema para tener en cuenta la diferencia en el numero de celulas presentes sobre cada superficie. Las celulas presentes sobre superficies nanotubulares muestran niveles mayores de ALP en comparacion con los de las superficies de titanio. Hay, aproximadamente, un aumento de 50% en los niveles de ALP sobre las superficies nanotubulares despues de 3 semanas de cultivo (p<0,05).

A medida que las celulas se diferencian, empiezan a depositar matriz osea sobre la superficie. La matriz osea consiste predominantemente de fosfato de calcio. Por tanto, la cantidad de calcio y de fosforo de las superficies puede medirse utilizando espectroscopfa fotoelectronica de rayos X (XPS). XPS es una tecnica sensible a las superficies y detecta la presencia de cantidades indicio de elementos sobre la superficie. La Tabla 1 muestra las razones de concentraciones atomicas de calcio y fosforo con respecto a las de titanio obtenidas por exploraciones de inspeccion de superficies de titanio y nanotubulares durante hasta 3 semanas de cultivo. Los resultados exponen un aumento regular de las cantidades de calcio y fosforo sobre superficies nanotubulares. comparado con un aumento insignificante sobre superficies de titanio Este hecho corresponde a una mayor deposicion de matriz osea sobre superficies nanotubulares en comparacion con superficies de titanio. Ademas, el calcio depositado en todas las superficies se disolvio en acido clorhudrico y su concentracion se midio haciendo uso de un ensayo colorimetrico. El calcio reacciona con complexona de cresolftalema en el seno de 8-hidroxiquinolina formando una coloracion purpura que despues se midio fotometricamente. La FIG. 5, parte b, muestra la concentracion de calcio normalizada con respecto al contenido total de protema teniendo en cuenta la diferencia del numero de celulas sobre cada superficie. Estos resultados se correlacionan estrechamente con los resultados obtenidos procedentes de XPS. De nuevo, existe aproximadamente un aumento de 50% en el contenido de calcio sobre superficies nanotubulares comparado con el de las superficies de titanio durante hasta 3 semanas de cultivo (p<0,05). Estos resultados ponen de manifiesto que las superficies nanotubulares proporcionan una interfase favorable de diferenciacion de MSC y la produccion de matriz.

Tabla 1

: Ca/Ti P/Ti

Titanio: Nanotubos Titanio Nanotubos

Semana 1: 0,31 0,32 0,37 0,41

Semana 2: 0,32 0,56 0,42 0,78

Semana 3: 0,34 1,21 0,44 1,65

Se investigo la morfologfa de MSCs durante la fase de diferenciacion en superficies nanotubulares empleando SEM. La FIG. 6 muestra imagenes SEM de MSCs sobre superficies nanotubulares de hasta 3 semanas de cultivo. Las celulas manifiestan una morfologfa de propagacion y una formacion reticular en la superficie al cabo de 1 semana de cultivo (FIG. 6, parte a). Las imagenes sEm de ampliacion alta muestran la presencia de un material granular sobre la superficie nanotubular (FIG.6, parte b). Despues de 2 semanas las imagenes SEM muestran que la superficie completa esta revestida con un retmulo de celulas que se propagan bien (FIG. 6, parte c). Un examen mas completo de las zonas que rodean las celulas confirma que los nanoporos se estan llenado con matriz (FIG. 6, parte d). Al

cabo de 3 semanas de cultivo, las imagenes SEM muestran que la superficie completa esta recubierta completamente con celulas y con componentes de matriz mineralizados (FIG.6, parte e) De nuevo una imagen SEM de ampliacion alta de la zona que rodea las celulas muestra que las estructuras nanotubulares estan completamente rellenas con un material poroso. Como se ha indicado previamente, el analisis XPS muestra que este material 5 depositado estaba constituido predominantemente por calcio y fosforo, constituyentes importantes de la matriz osea.

Es crucial el que cualquier material nuevo empleado para aplicaciones ortopedicas debe demostrar una biocompatibilidad apropiada. Por tanto, de investigo la biocompatibilidad in vivo de superficies de titanio y nanotubulares implantando subcutaneamente discos de titanio y de titania nanotubulares. Al cabo de 4 semanas, los implantes se separaron y se evaluo la biocompatibilidad por analisis histologico del tejido que rodea el implante. La 10 FlG. 7 muestra una imagen microscopica clara de secciones de tejido sano y del tejido que rodea el implante tenidos con hematoxilina y eosina. La FIG. 7, parte a, muestra secciones de histologfa de tejido sano. No hay tejido de cicatrices fibroso presente en los tejidos que rodean el implante de titanio y comparable con tejido sano (FIG. 7, parte b). Se sabe que el titanio es biocompatible y, por tanto, no debe ocasionar respuesta alguna inmunitaria indeseable in vivo. La FIG. 7, parte c, muestra imagenes microscopicas claras de secciones de tejidos que rodean el 15 implante de titania nanotubular. Con semejanza al titanio, no hay formacion de tejido de cicatriz fibroso en torno al implante. El tejido aparece como sano y normal. Por tanto, estos resultados preliminares in vivo ponen de manifiesto que las superficies nanotubulares no causan respuesta inmunitaria adversa en condiciones in vivo.

El desarrollo de plataformas nanoestructuradas basado en nuevas pelmulas de oxidos metalicos puede proporcionar discernimiento de las interacciones de material celular para el desarrollo de superficies de implantes mejoradas. Los 20 resultados que se proporcionan en esta memoria, muestran que las superficies de titania nanotubulares proporcionan un molde favorable para el crecimiento y la diferenciacion de celulas oseas. Se prepararon superficies de titania nanotubulares mediante un procedimiento sencillo de anodizacion y se utilizaron para investigar el comportamiento a corto y plazo largo de MSCs. Los resultados exponen que esas superficies apoyaron una mayor adhesion, proliferacion y viabilidad de celulas hasta 7 dfas de cultivo en comparacion con superficies de 25 titanio. Las celulas cultivadas sobre superficies nanotubulares demostraron una mayor actividad ALP. Ademas. las concentraciones de calcio y fosforo eran 50% mayores sobre esas superficies mostrando que la deposicion de la matriz estaba sobrerregulada en las superficies nanotubulares. Ademas, las superficies nanotubulares no ocasionan respuesta inmunitaria adversa en condiciones in vivo. Por tanto, los resultados exponen que la actividad osteoblastica puede intensificarse de modo importante utilizando nanotopograffas controladas. Por consiguiente, la 30 incorporacion de tales nanoarquitecturas en superficies de implantes facilitara, ademas, el cultivo y el mantenimiento de estados de celulas diferenciadas, y favorecen la oseointegracion a largo plazo.

Ejemplo 2

Fabricacion de implantes nanotubulares revestidos en superficie que eluyen farmacos.

Se determino seguidamente si los nanotubos pueden llenarse con antibioticos que podnan defender infecciones 35 inmediatamente despues de implantacion (p.ej., gentamicina, diacetato de clorhexidina, ciprofloxacina) o con factores de crecimiento o protemas terapeuticas (p.ej., TGF-p, IGF, BMP) que pueden ayudar a estimular la los procesos de diferenciacion celular y de reparacion osea- En este estudio se emplearon albumina de suero bovino (BSA) y lisozima (LYS) como protemas modelo para investigar sus cargas y eficacias de liberacion procedentes de arquitecturas de nanotubos. BSA es una molecula mas grande con una carga negativa neta a pH neutro en 40 comparacion con LYS que es mas pequena de tamano con una carga positiva neta a pH neutro (Tabla 2).

Tabla 2

: Peso molecular (KDa) Punto isoelectrico pI Carga neta a pH 7,0

Albumina de suero bovino: 67 4,7 -18

Lisozima: 14 11 +7

Antes de realizar los estudios de liberacion, fue importante evaluar la eficacia de carga de las protemas sobre la superficie de los nanotubos. Las concentraciones de las soluciones original y de lavado se midieron empleando un 45 kit de ensayo Micro-BCA de que se dispone en el comercio. La eficacia de carga se expreso como tanto por ciento de protema cargada despues de lavado. La eficacia de carga se calculo mediante la ecuacion que sigue

Co - Cl

^ =---------------------(1)

Co

50 donde ^ es la eficacia de carga

Co: concentracion de protema en la solucion original

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Cl : Concentracion de protema en la solucion de lavado.

La FIG. 8 expone eficacias de carga de nanotubos cargados con 200, 400 y 800 |ig de ambos, BSA y LYS. Los resultados muestran que aproximadamente 60-80% de protema esta retenida en los nanotubos despues de lavado con independencia de la carga inicial.

Para evaluar las diferencias de cantidades de protema en los nanotubos, se llevo a cabo un analisis por espectroscopfa fotoelectronica de rayos X (XPS). La Tabla 3 muestra las razones de N/C computadas partiendo de barridos de estudio de XPS. Se emplearon como testigos superficies con LYS y BSA adsorbidas. Existe un aumento estacionario de razones de N/C con cantidades crecientes de protema cargadas en los nanotubos. Un modo mas preciso para caracterizar protema sobre la superficie, consiste en determinar la fraccion de picos de C-N y de N-C=O en el pico C1s global. Los picos de C-N y de N-C=O son caractensticos de las protemas que estan en un desplazamiento de 0,8 eV y 1,8 eV, respectivamente, del pico de C-C (285 eV).Por tanto, se realizaron exploraciones de C1s y el software de analisis de ajuste del pico, proporcionado con el instrumento XPS, se utilizo para determinar el % de C-N y de N-C=O del pico Cls global (Tabla 3). Se supuso una convolucion de componentes de Gaussian para todos los picos. Existe un aumento de la intensidad de los picos de C-C, C-N y N-C=O con cantidades crecientes de protemas cargadas en los nanotubos. Sin embargo, el estudio y barridos de C1s de alta resolucion para superficies con BSA y LYS adsorbidas, ponen de manifiesto concentraciones de protemas en la superficie significativamente mas pequenas. Estos resultados muestran que los nanotubos pueden cargarse con exito con cantidades medidas de protemas utilizando la tecnica descrita en esta memoria.

Tabla 3

: Albumina de suero bovino Lisozima

Adsorbida: 200 mg 400 mg 800 mg Adsorbida 200 mg 400 mg 800 mg

N/C: 0,123 0,188 0,233 0,268 0,215 0,245 0,268 0,297

C-C: 0,81 0,71 0,51 0,40 0,73 0,53 0,32 0,21

C-N: 0,11 0,18 0,24 0,20 0,22 0,29 0,35 0,40

N-C=O: 0,08 0,11 0,25 0,40 0,03 0,18 0,31 0,30

La FIG. 9 expone los resultados de liberacion obtenidos con nanotubos cargados con 200, 400 y 800 |ig de BSA y LYS. La cantidad de protema que eluyo se expresa en terminos de fraccion de protema total liberada. Los resultados exponen que dos protemas diferentes, una molecula negativa mas grande (BSA, FIG: 9, partes A, B y C) y una molecula positiva mas pequena (LYS, FIG, 9, partes D, E y F), pueden liberarse facilmente desde los nanotubos. Ademas, las cineticas de liberacion pueden alterarse cambiando la cantidad de protema cargada. La Tabla 4 muestra los puntos de tiempo en que toda la protema se ha liberados de los nanotubos.

Como era de esperar, hay una liberacion mas lenta y sostenida desde los nanotubos cargados con una cantidad mayor de protema, comparada con las cargadas con cantidades menores de protema. Asimismo, los datos de los resultados obtenidos exponen que la liberacion de LYS desde los nanotubos es mucho mas lenta en comparacion con el de BSA. Se opina que esto es debido a l< diferencia que existe entre las protemas cargadas negativa y positivamente que interaccionan con la carga superficial de la interfase de los nanotubos. Las superficies de la mayor parte de pelroulas de oxidos metalicos estan cargadas intrmsecamente como consecuencia de la equilibracion de defectos de enrejados cristalinos cargados de dentro de la superficie. Dependiendo de la concentracion neta de defectos de enrejado, la superficie puede cargarse negativa o positivamente. La superficie de los nanotubos de titania consiste en grupos hidroxilados terminales que dan por resultado carga negativa suave sobre la superficie. Por tanto, el hecho de que la liberacion de LYS, que esta cargada positivamente, sea mucho mas lenta comparada con la de BSA que esta cargada negativamente, puede deberse a una interaccion electroestatica mas fuerte entre la LYS y la superficie de titania.

Tabla 4

: Albumina de suero bovino Lisozima

200 |ig: 25 36

400 |ig: 50 85

800 |ig: 65 110

Este estudio expone que pueden fabricarse facilmente nanotubos de titanio con un proceso de anodizacion y que estos nanotubos pueden cargarse tambien, opcionalmente, con farmacos o agentes biologicos tales como protemas. Ademas, la liberacion o elucion de los farmacos o agentes biologicos que proceden de los nanotubos, pueden regularse variando la longitud del tubo, el diametro y el grosor de la pared de los mismos. En esta memoria, se ha 5 puesto de manifiesto que pueden regularse las velocidades de liberacion de BSA y LYS variando sus cargas en los propios nanotubos, las cantidades cargadas en nanotubos. Ademas, cambiando el diametro de los nanotubos, el grosor de la pared y la longitud de los mismos, las caractensticas cineticas de liberacion pueden alterarse para farmacos espedficos con objeto de conseguir una liberacion sostenida del farmaco a lo largo de un penodo de tiempo. Por tanto, estas superficies nanotubulares tienen aplicaciones potenciales en ortopedia, espedficamente 10 para implantes en que se desea una oseointegracion mas rapida junto con una liberacion controlada de farmacos tales como antibioticos o factores de crecimiento.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. - Un implante medico que comprende una superficie o pelreula que comprende una pluralidad de nanotubos que tienen diametros de aproximadamente 3 nm a aproximadamente 300 nm y en una densidad mayor que 10.000.000 de nanotubos por centimetre cuadrado, donde dichos nanotubos comprenden un agente bioactivo de elucion al tejido circundante por colocacion en un sujeto, y en donde dicha pluralidad de nanotubos comprende ademas una pelreula de cierre que se erosiona proporcionando una elucion retardada del agente bioactivo.
2. - El implante medico segun la reivindicacion 1, en donde dicho implante medico es un implante gastrointestinal.
3. - El implante medico segun la realizacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el dispositivo medico proporciona la distribucion localizada de dicho agente activo a un tracto gastrointestinal.
4. - El implante medico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha superficie o pelreula esta comprendida por poli(DL-lactida-co-glicolida) (PLGA), poli(DL-lactida-co-g-caprolactona) (DLPLCL), poli(g-capro- lactona) (PCL), cologeno, gelatina, agarosa, poli(metacrilato de metilo), galatin/g-caprolactona, colageno-GAG, colageno, fibrina, PLA, PGA, copolfmeros de PLA-PGA, poli(anftidridos), poli(hidroxi acidos), poli(orto esteres), poli(fumeratos de propilo) poli(caprolactonas) poli(hidroxivalerato), poliamidas, poliaminoacidos, poliacetales, policianoacrilatos biodegradables, poliuretanos y polisacaridos biodegradables, polipirrol, polianilinas, politiofeno, poliestireno, poliesteres, poliuretanos no biodegradables, poliureas, poli(acetato de vinilo etileno), polipropileno, polimetacrilato, polietileno, policarbonatos, poli(oxido de etileno), copolfmeros de los anteriores, mezcla de los anteriores, y aductos de los anteriores, o combinaciones de los mismos.
5. - El implante medico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho agente bioactivo se selecciona de un polipeptido, un factor de crecimiento, un agente esteroide, una terapia con anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un DNA, un RNA y siRNA, un agente antimicrobiano, un antibiotico, un farmaco antirretroviral, un compuesto antiinflamatorio, un agente antitumoral, un agente antiangiogenico, y un agente quimioterapico.
6. - El implante medico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha superficie o pelreula comprende un polipeptido enlazado covalentemente.
7. - El implante medico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dichos nanotubos varian en longitud de aproximadamente 1 |im a aproximadamente 500 |im.
8. - El implante medico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dichos nanotubos tienen un diametro de poro que varia de aproximadamente 3 nm a aproximadamente 250 nm.
9. - El implante medico segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha superficie o pelreula vana en grosor de aproximadamente 1 |im a aproximadamente 2,5 mm...