CN115382016B - 一种抗癌用仿生骨材料以及包含该仿生骨材料的药用组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种抗癌用仿生骨材料，其能显著抑制骨肉瘤细胞的活性。该仿生骨材料具有良好的生物降解性和生物相容性，能够作为局部用药物的载体，实现生物活性物质的缓慢释放。本申请还涉及包含该仿生骨材料的药用组合物，并且通过共沉淀技术，制备了本申请的药用组合物。

Description

一种抗癌用仿生骨材料以及包含该仿生骨材料的药用组合物 及其制备方法
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种抗癌用仿生骨材料以及包含该仿生骨材料的药用组合物及其制备方法。
背景技术
自体骨移植具有优异的成骨性和成骨诱导性，但是它们在住院治疗中耗时较长，且可获得的数量有限。它们会导致慢性疼痛，并可能导致不可预测的结果。另外，骨移植手术需要第二次手术，易发并发症，而且植骨的数量有限。此外，自体骨移植物可能吸收过快，因为它们可能在骨形成之前就被降解。尽管如此，自体骨移植目前还是临床治疗的金标准，科研工作者和临床医生仍然不断寻找自体骨的替代物。
异体骨替代品已被提出，并且在临床上获得了一些应用。但是病毒传播和天然骨的缺乏导致了其临床应用的局限性。
在人类医学中，已经清楚地表明，仿生骨材料的临床等价性要优于自体骨移植。其中，磷酸钙(CaPs)生物材料已被证明在许多临床适应症中有效。它们特定的物理化学性质(HA/TCP比例，双重孔隙度和随后的相互连接的结构)控制渐进的再吸收和骨替代过程。合成磷酸钙按组成成分为羟基磷灰石(HAP)、钙羟基磷灰石或磷酸三钙等。其中，羟基磷灰石是人体的骨骼和牙齿的最主要的无机组成成份，由于HAP具有良好的生物活性和骨传导性，HAP被植入人体内后，Ca2+和P3+会游离出HAP的表面，从而被身体组织吸收，并生长出新的组织。但是，羟基磷灰石材料合成和筛选过程比较复杂，每种元素的掺杂需要制备大量的梯度浓度掺杂样品来选择出最佳的掺杂量，多种元素的组合方式则更多，需要大量的时间。
另一方面，通过用各种结晶或无定形形式的能够降解的磷酸钙成分作为各种药物的载体，应用于病灶的局部，可以减少药物的浪费及全身的毒副作用。在骨科和口腔科，尝试通过添加骨生长因子(例如转化生长因子β或骨形态发生蛋白)使这些材料呈骨诱导性。这就需要有生物仿生的技术，即用于在生物物理环境下混合药物过程的大多数技术在适合的温度下和在生理物理条件下进行，这样就不会妨碍在准备过程中降低生物活性蛋白质分子及各种药物的生物活性。
研究人员试图通过将抗癌药物或骨生长因子(促进骨的再生)直接吸附到预成型无机层的表面上来克服这种困难。
近年来，已经提出了几种方法在各种基底材料上沉积涂层。这些方法已在K.deGroot等人的Proc Instn Mech Engrs Vol 212 part H的论文中进行了综述。在该综述论文中，描述了几种技术，例如等离子喷涂、真空等离子喷涂、高速氧燃料喷涂和进一步的湿法技术，例如电泳沉积、电化学沉积、仿生沉积和最后的溅射技术，即标准溅射沉积、离子辅助沉积、脉冲激光沉积、磁控管沉积、热等静压和玻璃料搪瓷。
最引人注目的是仿生沉积方法，其涉及通过浸入Hank's平衡盐(过饱和)溶液或模拟体液中，在基底上形成生物活性骨状磷灰石层。
欧洲专利EP 0 987 031描述了一种涂覆基底的方法。美国专利US 6 569 489描述了涂覆的基底和涂覆基底的方法，特别是具有仿生组合物的医疗装置。美国专利US 2003/00113438描述了涂覆的基底，包含生物活性物质的涂层和涂覆所述基底的方法，特别是具有包含生物活性剂的仿生组合物的医疗装置。
但是这种表面吸附是二维的，载药量有限，且暴露于生理环境容易形成爆发式释放。因此，这些药物的骨诱导作用在时间和空间上都受到限制。研究人员试图通过将吸附的生长因子的浓度增加到非生理水平来克服这个问题。然而，药物快速释放问题依旧存在，产生局部高浓度导致与植入物附近的胶原原纤维和其他细胞外基质分子的不期望的非特异性结合。
因此，目前临床上亟需开发一种既具有更好成骨诱导性、骨传导性，又能用作各种药物的载体的仿生骨材料。
发明内容
针对现有技术存在的各种问题，本申请提供了一种仿生骨材料(本文中也称为BioCaP)，该仿生骨材料具有出色的骨传导性，并且在掺入骨形成蛋白—2(BMP—2)后具有出色的成骨诱导性，能够代替临床现有的骨粉及自体骨。另一方面，该仿生骨材料具有良好的生物降解性和生物相容性，可以用作各种局部用药物的载体。
具体的，本申请提供了一种仿生骨材料，所述仿生骨材料包括颗粒状无定形磷酸钙芯、涂覆在所述无定形磷酸钙芯的表面的第一涂层和涂覆在所述第一涂层的表面的第二涂层，其中：
所述第一涂层为无定形磷酸钙种子层，该无定形磷酸钙种子层能够促进磷酸八钙晶体的生长；且
所述第二涂层为磷酸八钙(简称为OCP)涂层。
在一个实施方案中，本申请的仿生骨材料由颗粒状无定形磷酸钙芯、涂覆在所述无定形磷酸钙芯的表面的第一涂层和涂覆在所述第一涂层的表面的第二涂层组成。
本申请制备的BioCaP特别适用于软骨和骨组织，或者需要骨再生及修复的领域，例如骨科、外科、整形科、口腔科等，例如可将本申请的BioCaP制成骨粉或者牙种植体植入人体缺牙部位的上下颌骨内，或者制成人工髋关节来取代受损的髋关节。另外，其还可以作为个体化的植入体，并采用3D打印技术来实现。
以本申请的仿生骨材料作为载体，本申请还提供了一种药用组合物，所述药用组合物包括颗粒状无定形磷酸钙芯、涂覆在所述无定形磷酸钙芯的表面的第一涂层和涂覆在所述第一涂层的表面的第二涂层，其中：
所述第一涂层为无定形磷酸钙种子层，该无定形磷酸钙种子层能够促进磷酸八钙晶体的生长；且
所述第二涂层为掺入生物活性物质的磷酸八钙涂层。
优选，本申请药用组合物的第二涂层中的生物活性物质是通过共沉淀掺入到磷酸八钙涂层的。
在本申请药用组合物的一个实施方案中，所述药用组合物由颗粒状无定形磷酸钙芯、涂覆在所述无定形磷酸钙芯的表面的第一涂层和涂覆在所述第一涂层的表面的第二涂层组成。
本申请的药用组合物为颗粒形式，一般具有数微米至数毫米的粒径，例如2μm-5.0mm的粒径，一般来讲，应用在骨科时会选择采用较大的颗粒，而口腔科及美容科一般采用较小的颗粒。在用于预防或治疗癌症时，一般采用粒径更小的药用组合物颗粒，优选粒径为2-200μm，例如3-5μm、5-30μm、30-60μm、60-100μm、100μm-200μm。
在本申请中，通过将生物活性物质和磷酸八钙晶体共沉淀至所述仿生骨材料的无定形磷酸钙种子层上，并在能够促进磷酸八钙晶体生长的磷酸钙种子层的作用下，在磷酸钙种子层的表面生长形成掺入生物活性物质的磷酸八钙涂层，从而得到了本申请药用组合物。
具体的，本文提供了一种制备本申请药用组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
1)制备无定形磷酸钙芯
在搅拌下，在pH 5.0-6.6的无机酸水溶液中，使含钙无机盐、磷酸盐、氯化钠和三羟甲基氨基甲烷在18-50℃保持10-30小时之后，产生沉淀，得到颗粒状无定形磷酸钙芯；
2)干燥无定形磷酸钙芯
将步骤1)得到的颗粒状无定形磷酸钙芯分离并干燥，得到干燥的颗粒状无定形磷酸钙芯；
3)沉淀生成种子层
在搅拌下，向pH 5.0-6.6的无机酸水溶液中分别加入氯化钠、含钙无机盐、磷酸盐以及步骤2)得到的干燥的颗粒状无定形磷酸钙芯，并且在18-50℃保持10-30小时，使得能够促进磷酸八钙晶体生长的无定形磷酸钙种子层沉淀在所述颗粒状无定形磷酸钙芯表面上，得到具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯；
4)将具有磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯干燥并灭菌
将步骤3)得到的具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯分离、干燥，然后灭菌，得到干燥的具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯；
5)共沉淀形成掺入生物活性物质的磷酸八钙涂层
在搅拌下，向pH 5.0-6.6的无机酸水溶液中分别加入含钙无机盐、磷酸盐、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、步骤4)得到的干燥的具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯以及生物活性物质，并且在18-50℃保持10-30小时，使得所述生物活性物质与磷酸八钙晶体共沉淀至所述磷酸钙种子层上，并在所述磷酸钙种子层的表面生长形成掺入生物活性物质的磷酸八钙涂层，得到湿的颗粒状药用组合物；
6)干燥湿的药用组合物
将步骤5)得到的湿的颗粒状药用组合物分离并干燥，得到干燥的药用组合物。
本申请的制备方法条件温和、工艺简单、且原料成本很低，特别适用于大规模工业化生产。
本申请制备方法的整个过程可以在无菌条件下进行，也可以在步骤4)，将具有磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯灭菌，一般采用高压灭菌，灭菌时间一般为10-30分钟，例如，利用高压灭菌器在120℃灭菌25分钟。
根据本申请的制备方法，各步骤的沉淀反应是在搅拌下进行的。搅拌器的搅拌速度一般为25-100rpm，优选25-75rpm，例如50rpm。
无机酸水溶液可以按照本领域常规方法制备，例如，可以通过将适量的无机酸加入去离子水中而制备。
根据本申请的制备方法，在制备无定形磷酸钙芯的步骤1)中，所用含钙无机盐的最终浓度一般为2.5-5.0克/升，优选2.5-3.5克/升，例如3.0克/升；所用磷酸盐的最终浓度一般为1.0-5.0克/升，优选1.0-2.5克/升，例如2.0克/升；所用氯化钠的最终浓度一般为20-100克/升，优选20-50克/升，例如40克/升；所用三羟甲基氨基甲烷的最终浓度一般为10-100克/升，优选10-50克/升，例如30克/升。
根据本申请的制备方法，在沉淀生成种子层的步骤3)中，所用氯化钠的最终浓度一般为2.0-19.0克/升，优选5.0-10.0克/升，例如8.0克/升；含钙无机盐的最终浓度一般为0.2-0.9克/升，优选0.25-0.75克/升，例如0.60克/升；所用磷酸盐的最终浓度一般为0.2-1.0克/升，优选0.2-0.5克/升，例如0.4克/升；且以1升溶液2.0-10.0克的比例，优选以1升溶液2.5-7.5克的比例加入步骤2)得到的干燥的颗粒状无定形磷酸钙芯，例如以1升溶液5.0克的比例加入步骤2)得到的干燥的颗粒状无定形磷酸钙芯。
根据本申请的制备方法，在共沉淀形成掺入生物活性物质的磷酸八钙涂层的步骤5)中，所用含钙无机盐的最终浓度一般为0.2-0.9克/升，优选0.25-0.75克/升，例如0.60克/升；所用磷酸盐的最终浓度一般为0.2-1.0克/升，优选0.2-0.5克/升，例如0.4克/升；所用氯化钠的最终浓度一般为2.0-19.0克/升，优选5.0-10.0克/升，例如8.0克/升；所用三羟甲基氨基甲烷的最终浓度一般为2.0-15.0克/升，优选2.5-10.0克/升，例如6.5克/升；以1升溶液2.0-10.0克的比例，优选以1升溶液2.5-7.5克的比例加入步骤4)得到的干燥的具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯，例如以1升溶液6.0g比例加入步骤4)得到的干燥的具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯；并以1升溶液5-20毫克/升的比例加入所述生物活性物质，优选以1升溶液5-15毫克/升的比例加入所述生物活性物质，例如以1升溶液10毫克的比例加入所述生物活性物质。
在本申请制备方法的一个替代实施方案中，按以下方法制备具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯：
在搅拌下，向pH 5.0-6.6的无机酸水溶液中分别加入氯化钠、氯化钾、含钙无机盐、含镁无机盐、磷酸盐、碳酸盐以及步骤2)得到的干燥的颗粒状无定形磷酸钙芯，并且在18-50℃保持10-30小时，使得无定形磷酸钙沉积在所述颗粒状无定形磷酸钙芯表面上，并在无定形磷酸钙芯表面上形成无定形磷酸钙种子层，得到具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯。
在上述替代实施方案中，在制备具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯的过程中，使用最终浓度为20-100克/升的氯化钠，优选20-50克/升，例如40.0克/升的氯化钠，使用最终浓度为0.5-2.0克/升的氯化钾，优选0.5-1.5克/升，例如1.00克/升的氯化钾，使用最终浓度为1.0-2.4克/升的含钙无机盐，优选1.5-2.0克/升，例如1.32克/升的含钙无机盐，使用最终浓度为0.2-2.0克/升的含镁无机盐，优选1.0-1.5克/升，例如1.07克/升的含镁无机盐，使用最终浓度为0.2-1.0克/升的磷酸盐，优选0.2-0.5克/升，例如0.37克/升的磷酸盐，使用最终浓度为2.0-10.0克/升的碳酸盐，优选2.5-7.5克/升，例如5.0克/升的碳酸盐，且以1升溶液2.0-10.0克的比例加入步骤2)得到的干燥的颗粒状无定形磷酸钙芯，优选以1升溶液2.5-5.0克，例如4克的比例加入步骤2)得到的干燥的颗粒状无定形磷酸钙芯。
可用于本申请的无机酸为盐酸、硫酸、磷酸或其组合，优选盐酸，例如浓度为0.5-2.0M的盐酸，优选浓度为1M的盐酸。
可用于本申请的含钙无机盐为氯化钙、硫酸钙、硝酸钙或它们的水合物，优选含钙无机盐为氯化钙，更优选氯化钙二水合物。
可用于本申请的磷酸盐为磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或它们的水合物，优选磷酸盐为磷酸氢二钠，更优选为磷酸氢二钠二水合物。
可用于本申请的含镁无机盐为氯化镁、硫酸镁、硝酸镁或它们的水合物，优选所述含镁无机盐为氯化镁，更优选为氯化镁六水合物。
可用于本申请的碳酸盐为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾，优选所述碳酸盐为碳酸氢钠。
可用于本申请的生物活性物质是本领域已知的任何生物活性物质，包括但不限于促血管生成因子、骨生长因子、生脂因子、抗生素药物、降压药物、抗糖尿病药物、镇疼药物、消炎药物、抗癌药物、蛋白质(例如酶)、维生素、激素、抑制剂、基因或基因片段等等，优选所述生物活性物质选自骨生长因子、促血管生成因子、生脂因子、抗生素药物、镇疼药物、抗癌药物及其组合，更优选所述生物活性物质选自骨生长因子、抗癌药物及其组合。在将骨生长因子掺入至所述仿生骨材料颗粒时，可以产生出色的成骨诱导性，在将抗癌药物掺入至所述仿生骨材料颗粒时，可以用于预防和/或治疗癌症。
优选，所述促血管生成因子为血管内皮生长因子(VEGF)。
在本申请中，所述骨生长因子可选自骨形成蛋白(BMP)、转化生长因子—β(TGF—β)、类胰岛素生长因子(IGF)、骨骼生长因子(SGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生性生长因子(PDGF)、造血生长因子(HGF)、结缔组织生长因子(CTGF)及其组合，所述抗癌药物可选自PEG分子量为550的PEG化姜黄素(简称为mCur)、依托泊苷、拓扑替康、唑来膦酸、多柔比星及其组合。
在本申请药用组合物的一个实施方案中，所述生物活性物质为骨生长因子，优选骨生长因子为骨形成蛋白(BMP)，更优选BMP为BMP-2。
在本申请药用组合物的另一个实施方案中，所述生物活性物质为抗癌药物，优选抗癌药物为PEG分子量为550的PEG化姜黄素、依托泊苷、拓扑替康、唑来膦酸或多柔比星。
在本申请中，还可以将多于一种的生物活性物质掺入至所述仿生骨材料。例如，可以通过将两种不同的生物活性物质与磷酸八钙晶体一起共沉淀来掺入至所述仿生骨材料，或者通过依次与磷酸八钙晶体共沉淀来掺入至仿生骨材料。
因此，本文还涉及本申请药用组合物的一个变型，在该变型中，所述第二涂层由多于一种的生物活性物质和磷酸八钙组成。
本文还涉及本申请药用组合物的另一个变型，在该变型中，所述药用组合物还包括第三涂层，第三涂层涂覆在第二涂层的表面，且所述第三涂层含有与第二涂层不同的生物活性物质。
在本申请药用组合物制备方法的一个实施方案中，在制备无定形磷酸钙芯的步骤1)中：所用含钙无机盐为氯化钙二水合物，且最终浓度为2.94克/升；所用磷酸盐为磷酸氢二钠，且最终浓度为1.8克/升；所用氯化钠的最终浓度为40克/升；所用三羟甲基氨基甲烷的最终浓度为30.28克/升；
在沉淀生成种子层的步骤3)中：所用氯化钠的最终浓度为8.0克/升；所用含钙无机盐为氯化钙二水合物，且最终浓度为0.59克/升；所用磷酸盐为磷酸氢二钠二水合物，且最终浓度为0.36克/升；且以1升溶液4.0克的比例，加入步骤2)得到的干燥的颗粒状无定形磷酸钙芯；
在共沉淀形成掺入生物活性物质的磷酸八钙涂层的步骤5)中，所用含钙无机盐为氯化钙二水合物，且最终浓度为0.59克/升；所用磷酸盐为磷酸氢二钠，且最终浓度为0.36克/升；所用氯化钠的最终浓度为8克/升；所用三羟甲基氨基甲烷的最终浓度为6.05克/升；以1升溶液6克的比例加入步骤4)得到的干燥的具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯；并以1升溶液10毫克的比例加入所述生物活性物质。
根据本申请的制备方法，在制备无定形磷酸钙芯的步骤1)中，在18-50℃保持10-30小时之后，溶液的pH逐渐升高至7.5-8.5，优选在25-50℃保持15-25小时之后，溶液的pH逐渐升高至7.5-8.5，例如在37℃保持24小时之后，pH逐渐升高至8.0；在沉淀生成种子层的步骤3)中，在18-50℃保持10-30小时之后，溶液的pH逐渐升高至7.5-8.5，优选在25-50℃保持15-25小时之后，溶液的pH逐渐升高至7.5-8.5，例如在37℃保持24小时之后，pH逐渐升高至8.0；在共沉淀形成掺入生物活性物质的磷酸八钙涂层的步骤5)中，在18-50℃保持10-30小时之后，溶液的pH逐渐升高至7.5-8.5，优选在25-50℃保持15-25小时之后，溶液的pH逐渐升高至7.5-8.5，例如在37℃保持24小时之后，pH逐渐升高至8.0。
在本申请药用组合物制备方法的一个优选实施方案中，所述生物活性物质为骨生长因子，优选骨生长因子为骨形成蛋白(BMP)，更优选BMP为BMP-2。
在本申请药用组合物制备方法的另一个优选实施方案中，所述生物活性物质为抗癌药物，优选抗癌药物为PEG的分子量为550的PEG化姜黄素、依托泊苷、拓扑替康、唑来膦酸或多柔比星。
将本申请制备的仿生骨材料(BioCaP)颗粒与MG 63人骨肉瘤细胞(MG-63,ATCC,CRL-1427,USA)一起培养，结果意外的发现，BioCaP能在2天内显著抑制MG 63骨肉瘤细胞的生存力，这表明此仿生骨材料本身具有抑制骨肉瘤细胞活性的作用。
因此，本申请还涉及仿生骨材料在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途，所述仿生骨材料由颗粒状无定形磷酸钙芯、涂覆在所述无定形磷酸钙芯的表面的第一涂层和涂覆在所述第一涂层的表面的第二涂层组成，其中：
所述第一涂层为无定形磷酸钙种子层，该无定形磷酸钙种子层能够促进磷酸八钙晶体的生长；且
所述第二涂层为磷酸八钙涂层。
在一个实施方案中，所述癌症为骨肉瘤。
在仿生骨材料用于预防或治疗癌症或者作为抗癌药物的载体时，仿生骨材料颗粒优选具有2-200μm的粒径。
本领域技术人员很容易理解，本申请仿生骨材料的无定形磷酸钙芯起到基底的作用。因此，作为骨替代品，本申请制备的仿生骨材料可以直接施用于受试者来诱导成骨活性，而无需采用另外的基底。
本申请仿生骨材料属于磷酸钙(CaPs)类生物材料，并且具有独特的多层结构，因此，本申请的仿生骨材料具有良好的生物降解性和生物相容性，可以作为各种局部用药物的载体。
本申请还涉及一种植入物，所述植入物包括支架和本申请的仿生骨材料，并且所述仿生骨材料装填到该支架中。所述支架优选为3D打印的支架。
当然，在应用本发明时，可以采用另外的基底。因此，本申请还涉及另一种植入物，所述植入物包括基底、涂覆在所述基底的表面的第一涂层和涂覆在所述第一涂层的表面的第二涂层，其中：
所述第一涂层为无定形磷酸钙种子层，该无定形磷酸钙种子层能够促进磷酸八钙晶体的生长；且
所述第二涂层为磷酸八钙涂层。
以下物质均可作为基底用于本发明：金属材料，例如钛钉、不锈钢圆盘等；陶瓷或者软质或硬质聚合物，例如胶原蛋白、聚乳酸明胶膜等。基底还可以是假体，例如骨假体、牙齿假体或乳房假体。
基底材料可以是生物降解材料，也可以是不可生物降解的材料。
根据本公开的以下描述并结合附图，本公开的这些和其他目的、方面和优点将变得显而易见。
附图说明
图1是实施例1所制备磷酸钙芯的扫描电子显微镜(SEM)照片。
图2是实施例3所制备仿生骨材料的磷酸八钙涂层的傅立叶变换红外光谱图，其中横坐标表示波数，单位为cm-1，纵坐标表示强度，单位为a.u。
图3的左侧小图A表示实施例3所制备仿生骨材料的磷酸八钙涂层的SEM照片，右侧小图B表示实施例4所制备的BMP-2和仿生骨材料的组合物第二涂层的SEM照片。
图4是实施例6所制备钛钉植入物的磷酸八钙涂层的SEM照片。
图5是实施例7所制备掺有BSA的钛钉植入物的第二涂层的SEM照片。
图6是大鼠背侧皮下植入本申请仿生骨材料和BMP-2的组合物5周后的组织学照片，其中左侧小图是50μm的照片，右侧小图是100μm的照片。
图7是大鼠背侧皮下植入本申请仿生骨材料颗粒5周后的组织光学显微镜照片。
图8是插入本申请钛钉植入物的大鼠胫骨干骨照片，左侧小图是正面照片，右侧小图是左侧照片。
图9显示了本申请的BioCaP对MG 63人骨肉瘤细胞的活性抑制作用，其中X轴表示BioCaP的用量，以mg/孔为单位；Y轴表示MG 63骨肉瘤细胞的生存力。
图10是实施例8所制备本申请仿生骨材料和PEG化姜黄素组合物(mCurCaP)的第二涂层的SEM照片。
图11是mCur从mCurCaP中的释放动力学曲线，其中横坐标表示时间，以天计；纵坐标表示mCur从mCurCaP中释放的百分比。
图12是大鼠胫骨致密骨处新生骨与植入物之间的接触百分比(BIC)柱状图，其中横坐标表示时间，单位为天；纵坐标表示BIC。
具体实施方式
在本文中，术语“室温”是指18-25℃的温度。
在本文中，缩写“TRIS”是指三羟甲基氨基甲烷。
在本文中，缩写“BMP-2”是指骨形成蛋白-2。
在本文中，缩写“BSA”是指无活性牛血清白蛋白，其用作蛋白质的替代物。
实施本申请制备方法的反应器优选在无菌或几乎无菌的条件下操作。实现此目的的方式和方法在本领域中是公知的。例如，可以使用细菌过滤器(0.2微米)，并且在可能的情况下，可以对设备用约100℃-110℃左右的高温溶液进行热处理，也可以使用消毒气体进行灭菌，随后将所得混合物风干，或在惰性气体下干燥或在无菌条件下冻干。
然而，也可以在不是无菌的条件下实施，后期使用高温高压灭菌或使用γ辐射进行灭菌。
在本申请中，反应器可以设计为封闭系统，反应器可以由密封的容器组成，其最简单的形式可以是玻璃瓶。
在根据本申请的制备方法中，考虑到工业化生产，反应器可以在必要时增加数量和增大体积。
在本申请的制备方法中，为了增强混合物中所有成分的溶解，初始pH值范围为5.0-7.0，优选范围是5.8-6.6，随后，使混合物保持足够长的时间，使pH逐渐升高，优选在搅拌下，使pH达到7.0-8.8的值，并实现充分沉淀。pH的增加可以诱导以下阶段：欠饱和、超饱和或亚稳态、成核和晶体生长。当溶液达到超饱和极限或亚稳态时，发生异相成核。在过饱和时，晶体可以从亚稳态溶液中生长。在较高浓度下，可发生均匀的成核或沉淀。可通过改变pH来调节上述变化。
在实践中，发现加入适量的氯化钠非常有用，其会影响最终产物的结晶度或无定形形态。
另外，在实践中还意外的发现，种子层的设置对本发明非常重要，种子层为无定形磷酸钙，能够促进磷酸八钙晶体的生长。如果没有种子层，在含钙无机盐、磷酸盐、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷以及无机酸组成的水溶液系统中，在磷酸钙芯或者基底的表面几乎没有磷酸八钙晶体的生长发生。
制备实施例
实施例1制备磷酸钙芯
在室温下，在无菌条件下，向体积为1000ml的封闭式微反应器中加入去离子水800ml，在磁力搅拌下，转速为50rpm，加入200ml的1M HCl水溶液酸化，pH为6.0，然后分别加入CaCl2·2H2O 2.94g、Na2HPO4 1.8g、NaCl 40g和TRIS 30.28g，得到盐混合物水溶液。然后，在磁力搅拌下，在37℃的恒温保持24小时，使pH逐渐升高至8.0，产生颗粒状沉淀物。用水泵将液态部分抽吸掉，然后用去离子水冲洗两遍。
将得到的沉淀物风干，得到4.0g颗粒状磷酸钙芯。
实施例2制备具有种子层的无定形磷酸钙芯
在室温下，在无菌条件下，向体积为1000ml的封闭式微反应器中加入去离子水800ml，然后加入20ml的1M HCl水溶液酸化，在磁力搅拌下，转速为50rpm，分别加入NaCl8.0g、CaCl2·2H2O 0.59g、Na2HPO4·2H2O 0.36g，然后加入去离子水和1M HCl水溶液，使溶液总体积达1000ml，并保持水溶液的pH为6.0。然后，加入实施例1制备的干燥的颗粒状磷酸钙芯4.0g。然后，在磁力搅拌下，转速为50rpm，在37℃的恒温保持24小时，使pH逐渐升高至8.0，然后，用水泵将液态部分抽吸掉，然后用去离子水冲洗两遍，得到颗粒状沉淀物。
将得到的颗粒状沉淀物风干，得到4.7g具有磷酸钙种子层的颗粒状无定形磷酸钙芯。
经标准筛筛选得到粒径为0.2-1.0mm的颗粒，用于下面BMP-2和仿生骨材料的组合物的制备以及BSA和仿生骨材料的组合物的制备。
再经标准筛筛选得到粒径为2-200μm的颗粒，用于下面仿生骨材料的制备以及含抗癌药物(如PEG化姜黄素、依托泊苷、拓扑替康、唑来膦酸、多柔比星)的药用组合物的制备。
用磁感应探针(Electrophysik minitest 2100，德国)测量种子层的厚度为约2.1微米。
实施例3制备仿生骨材料
在室温下，在无菌条件下，向体积为1000ml的封闭式微反应器中加入去离子水800ml，在磁力搅拌下，转速为50rpm，加入100ml的1M HCl水溶液酸化，然后分别加入CaCl2·2H2O 0.59g、Na2HPO40.36g、NaCl 8g和TRIS 6.05g。然后，加入去离子水和1M HCl水溶液，使水溶液总体积达到1000ml，并保持水溶液的pH为6.0。然后，加入实施例2制备的干燥的具有种子层的颗粒状无定形磷酸钙芯(粒径为2-200μm)4.7g。
在磁力搅拌下，在37℃的恒温保持24小时，使pH逐渐升高至8.0，形成颗粒状沉淀物。用水泵将液态部分抽吸掉，然后用去离子水冲洗两遍。
将沉淀物风干，得到5.4g仿生骨材料，其无定形磷酸钙芯的表面上依次涂覆有磷酸钙种子层和磷酸八钙涂层。
用高压灭菌器，将所得材料颗粒在121℃下灭菌25分钟，干燥后包装备用。
经标准筛筛选得到粒径为2-200μm的颗粒，用于后续对骨肉瘤细胞的活性抑制研究。
用磁感应探针(Electrophysik minitest 2100，德国)测量磷酸八钙涂层的厚度为约2.1微米。
实施例4制备BMP-2和仿生骨材料的组合物
在室温下，在无菌条件下，向体积为1000ml的封闭式微反应器中加入去离子水800ml，在磁力搅拌下，转速为50rpm，加入100ml的1M HCl水溶液酸化。然后分别加入CaCl2·2H2O 0.59g、Na2HPO40.36g、NaCl 8g和TRIS 6.05g。然后，加入去离子水和1M HCl水溶液，使溶液总体积达1000ml，并保持水溶液的pH为6.0。使用0.2μm细菌过滤器过滤。然后，向滤液中加入实施例2制备的干燥的具有磷酸钙种子层的颗粒状无定形磷酸钙芯(粒径为0.2-1.0mm)4.7g，同时加入10.0mg BMP-2。
在磁力搅拌下，转速为50rpm，并且在37℃的恒温保持24小时，使pH逐渐升高至8.0，形成颗粒状沉淀物。用水泵将液态部分抽吸掉，然后用去离子水冲洗两遍。
将沉淀物风干，得到5.42g颗粒状组合物，其无定形磷酸钙芯上依次涂覆有磷酸钙种子层和掺有BMP-2的磷酸八钙涂层。
经标准筛筛选得到粒径为0.2-1.0mm的颗粒。
用磁感应探针(Electrophysik minitest 2100，德国)测量掺有BMP-2的磷酸八钙涂层的厚度为约2.1微米。
实施例5制备BSA和仿生骨材料的组合物
实验过程与实施例4基本相同，不同之处在于用BSA替代BMP-2，其他操作完全相同。
风干得到5.41g颗粒状组合物，其无定形磷酸钙芯上依次涂覆有磷酸钙种子层和掺有BSA的磷酸八钙涂层。
经标准筛筛选得到粒径为0.2-1.0mm的颗粒。
用磁感应探针(Electrophysik minitest 2100，德国)测量掺有BSA的磷酸八钙涂层的厚度为约2.1微米。
实施例6钛钉植入物的制备
首先，使钛钉的表面涂覆磷酸钙种子层，实验过程同实施例2基本相同，区别在于在“使溶液总体积达1000ml并保持水溶液的pH为6.0”之后，将钛钉(长约5.0mm)浸没在水溶液中，并且不加实施例1制备的颗粒状磷酸钙芯，其他操作完全相同。
风干得到带有磷酸钙种子层的钛钉，用磁感应探针(Electrophysik minitest2100，德国)测量种子层的厚度为约2.1微米。
其次，使钛钉磷酸钙种子层的表面涂覆磷酸八钙涂层，实验过程同实施例3基本相同，区别在于在“使水溶液总体积达到1000ml并保持水溶液的pH为6.0”之后，将上文得到的干燥的带有磷酸钙种子层的钛钉浸没在水溶液中，并且不加实施例2制备的具有种子层的颗粒状无定形磷酸钙芯，其他操作完全相同。
风干得到钛钉植入物，其钛钉上依次涂覆有磷酸钙种子层和磷酸八钙涂层。
用磁感应探针(Electrophysik minitest 2100，德国)测量磷酸八钙涂层的厚度为约2.1微米。
实施例7掺有BSA的钛钉植入物的制备
首先，使钛钉的表面涂覆磷酸钙种子层，实验过程同实施例2基本相同，区别在于在“使溶液总体积达1000ml并保持水溶液的pH为6.0”之后，将钛钉(长约5.0mm)浸没在水溶液中，并且不加实施例1制备的颗粒状磷酸钙芯，其他操作完全相同。
风干得到带有磷酸钙种子层的钛钉，用磁感应探针(Electrophysik minitest2100，德国)测量种子层的厚度为约2.1微米。
其次，使钛钉磷酸钙种子层的表面涂覆掺有BSA的磷酸八钙涂层，实验过程同实施例4基本相同，区别在于：在“使用0.2μm细菌过滤器过滤”之后，将上文得到的干燥的带有磷酸钙种子层的钛钉浸没在滤液中，不加实施例2制备的具有种子层的无定形磷酸钙芯，并且用BSA替代BMP-2，其他操作完全相同。
风干得到掺有BSA的钛钉植入物，其钛钉上依次涂覆有磷酸钙种子层和掺有BSA的磷酸八钙涂层。
用磁感应探针(Electrophysik minitest 2100，德国)测量掺有BSA的磷酸八钙涂层的厚度为约2.1微米。
实施例8制备PEG化姜黄素和仿生骨材料的组合物(mCurCaP)
实验过程与实施例4基本相同，不同之处在于用PEG分子量为550的PEG化姜黄素替代BMP-2，其他操作完全相同。
风干得到5.41g颗粒状组合物，其无定形磷酸钙芯上依次涂覆有磷酸钙种子层和掺有PEG化姜黄素的磷酸八钙涂层。
经标准筛筛选得到粒径为2-200μm的颗粒。
用磁感应探针(Electrophysik minitest 2100，德国)测量掺有PEG化姜黄素的磷酸八钙涂层的厚度为约2.1微米。
实施例9制备依托泊苷和仿生骨材料的组合物
实验过程与实施例4基本相同，不同之处在于用依托泊苷替代BMP-2，其他操作完全相同。
风干得到5.41g颗粒状组合物，其无定形磷酸钙芯上依次涂覆有磷酸钙种子层和掺有依托泊苷的磷酸八钙涂层。
经标准筛筛选得到粒径为2-200μm的颗粒。
用磁感应探针(Electrophysik minitest 2100，德国)测量掺有依托泊苷的磷酸八钙涂层的厚度为约2.1微米。
实施例10制备拓扑替康和仿生骨材料的组合物
实验过程与实施例4基本相同，不同之处在于用拓扑替康替代BMP-2，其他操作完全相同。
风干得到5.41g颗粒状组合物，其无定形磷酸钙芯上依次涂覆有磷酸钙种子层和掺有拓扑替康的磷酸八钙涂层。
经标准筛筛选得到粒径为2-200μm的颗粒。
用磁感应探针(Electrophysik minitest 2100，德国)测量掺有拓扑替康的磷酸八钙涂层的厚度为约2.1微米。
实施例11制备唑来膦酸和仿生骨材料的组合物
实验过程与实施例4基本相同，不同之处在于用唑来膦酸替代BMP-2，其他操作完全相同。
风干得到5.41g颗粒状组合物，其无定形磷酸钙芯上依次涂覆有磷酸钙种子层和掺有唑来膦酸的磷酸八钙涂层。
经标准筛筛选得到粒径为2-200μm的颗粒。
用磁感应探针(Electrophysik minitest 2100，德国)测量掺有唑来膦酸的磷酸八钙涂层的厚度为约2.1微米。
实施例12制备多柔比星和仿生骨材料的组合物
实验过程与实施例4基本相同，不同之处在于用多柔比星替代BMP-2，其他操作完全相同。
风干得到5.41g颗粒状组合物，其无定形磷酸钙芯上依次涂覆有磷酸钙种子层和掺有多柔比星的磷酸八钙涂层。
经标准筛筛选得到粒径为2-200μm的颗粒。
用磁感应探针(Electrophysik minitest 2100，德国)测量掺有多柔比星的磷酸八钙涂层的厚度为约2.1微米。
结构分析
对实施例1制备的干燥磷酸钙芯颗粒用碳颗粒溅射，厚度为12-16μm，用扫描电子显微镜(型号525，Philips，Eindhoven；荷兰)进行检测，结果见图1，显示本申请制备的磷酸钙芯颗粒具有典型的无定形球形形态，因此本申请制备的磷酸钙芯颗粒是无定形的。
另外，还用扫描电子显微镜检测实施例2制备的具有磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯的磷酸钙种子层，其SEM照片(未显示)表明，与磷酸钙芯相同，磷酸钙种子层也具有典型的无定形球形形态，证明颗粒状无定形磷酸钙芯表面的磷酸钙种子层是无定形的。
对实施例3制备的仿生骨材料样品的第二涂层用碳颗粒溅射，厚度为12-16μm，用扫描电子显微镜(型号525，Philips，Eindhoven；荷兰)进行检测，结果见图3的左侧小图A，显示本申请制备的仿生骨材料的第二涂层为具有尖锐边缘的直板状晶体形态。
另外，还采用傅立叶变换红外光谱仪(型号1000，Perkin-Elmer，UK)，对实施例3制备的仿生骨材料样品的第二涂层进行检测，结果见图2，显示本申请的仿生骨材料的第二涂层在960-1030cm-1具有强吸收峰，这是磷酸八钙晶体结构的特征峰。
另外，还采用能量色散X射线谱仪(EDAX,phoenix system,Tilburg,TheNetherlands)，对实施例3制备的仿生骨材料颗粒的第二涂层进行分析，结果表明Ca/P比为1.37，这是磷酸八钙晶体结构的最典型特征。
综上，可以证明，在本发明制备的仿生骨材料中，涂覆在无定形磷酸钙种子层表面的涂层是磷酸八钙涂层。
对实施例4制备的BMP-2和仿生骨材料组合物的第二涂层用碳颗粒溅射，厚度为12-16μm，用扫描电子显微镜(型号525，Philips，Eindhoven；荷兰)进行检测，结果见图3的右侧小图B，显示本申请的骨形成蛋白(BMP-2)和仿生骨材料组合物的第二涂层呈现具有尖锐边缘的直板状晶体形态，并且BMP-2的掺入并没有引起这种几何形态的变化。
另外，还对实施例4获得的BMP-2和仿生骨材料组合物进行ELISA测试，结果表明本申请的BMP-2和仿生骨材料组合物的第二涂层中有大量的BMP-2沉积在其中。
另外，还对实施例6所制备钛钉植入物以及实施例7所制备掺有BSA的钛钉植入物的第二涂层用碳颗粒溅射，厚度为12-16μm，用扫描电子显微镜(型号525，Philips，Eindhoven；荷兰)进行检测，结果分别见图4-5，由图可以看出本申请的钛钉植入物(图4)的第二涂层为具有尖锐边缘的直板状晶体形态，与钛钉植入物的第二涂层晶体形态相比，掺有BSA的钛钉植入物(图5)的第二涂层晶体形态由常规的直板状晶体形态变成蜷缩的板状形态，仍然维持了板状晶体形态。
同样，用扫描电子显微镜检测实施例6所制备钛钉植入物以及实施例7所制备掺有BSA的钛钉植入物的第一涂层，即磷酸钙种子层，其SEM照片(未显示)表明，钛钉基底上涂覆的磷酸钙种子层具有典型的无定形球形形态，证明钛钉基底表面的磷酸钙种子层是无定形的。
另外，还对实施例8所制备mCurCaP颗粒的第二涂层用碳颗粒溅射，厚度为12-16μm，用扫描电子显微镜(型号525，Philips，Eindhoven；荷兰)进行检测，结果见图10所示，mCurCaP颗粒的第二涂层形态为花样结构，仍然维持了板状晶体形态，这意味着mCur已经结合至磷酸八钙的晶体结构中。
药理实验
一、本申请仿生骨材料和BMP-2的组合物在大鼠体内的成骨活性研究
采用骨诱导金标准的大鼠皮下异位成骨模型进行研究。给6只年轻成年雄性Wistar大鼠(重185-250g)喂食标准饮食，并且无限制地获取水，然后使用盐酸氯胺酮进行全身麻醉，麻醉后将每只大鼠的左右背部区域剃毛，消毒并切开皮肤。
将实施例3获得的仿生骨材料样品和实施例4获得的仿生骨材料和BMP-2的组合物样品分成两组，一组是仿生骨材料组，另一组是仿生骨材料和BMP-2的组合物组，每组样品分成6份，均为0.3mg，将每份样品植入大鼠的背部皮下。每只大鼠在背部都植入仿生骨材料和仿生骨材料和BMP-2的组合物两个样品，一个在背部左侧，为a组，另一个在背部右侧，为b组，然后通过缝合来闭合手术切口。
5周后，通过给予过量的气态二氧化碳来杀死大鼠，解剖取出的植入物质以及最小量的周围组织，并在光学显微镜下进行组织切片分析。
组织形态学评估
通过组织形态学评估骨形成以及骨诱导性和材料的生物相容性。在Nikon-Eclipse光学显微镜中获得每个部分(即，每个样品拍摄的五个部分中的每一个)8个数字图像并打印成颜色。使用Cruz-Orive和Gunderson等人详述的数点计数方法对这些彩色印刷品进行组织形态学分析。每个样品在5周时间点的骨组织的体积密度，以及存在材料的体积密度均使用文献中描述的Cavalieri方法进行估算。
结果表明，在仿生骨材料和BMP-2的组合物组的6只大鼠中，背部皮下均有新生骨形成(见图6)，同时，也测量了骨在远离植入物质表面的最大距离，在该最大距离处在每个切片上也观察到新骨的形成。而在仿生骨材料组的6只大鼠中，背部皮下均没有新生骨出现(见图7)。
TRAP的组织化学染色
使用McNeil的Tetrachrome、碱性品红和甲苯胺蓝进行切片的表面染色，通过交叉计数，使用线系统估计覆盖有多核细胞(即，异物巨细胞加破骨细胞)的植入物质或材料的表面百分比。完成上述部分和前一部分中描述的其他形态计量分析后，使用标准方案，根据抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)反应，将组织样本抛光约20-30μm用于组织化学染色。只有破骨细胞是TRAP阳性的，多核巨细胞仍未染色。使用与上述相同的交叉计数技术，估计用TRAP阳性细胞(即破骨细胞)覆盖的植入物质表面的百分比。通过从多核细胞的总数中减去TRAP阳性细胞(即，破骨细胞)的数量(使用常规染色的切片估计)来确定覆盖有多核巨细胞的表面的百分比。
统计分析
对各组中多核巨细胞的表面覆盖率进行了比较，使用ANOVA检验，对二组之间的差异进行统计学分析，显著性水平设定为P<0.05。运用SAS统计软件(版本8.2)。然后使用Bonferroni校正进行事后比较。
结果
植入5周后，仿生骨材料组仅观察到巨噬细胞的轻微炎症反应，材料经血管结缔组织包裹。如图7所示，仿生骨材料组的材料被多核巨细胞覆盖，没有新生骨形成。而在仿生骨材料和BMP-2的组合物组中则有明显的新生骨形成，见图6所示。这证明了本申请的仿生骨材料不仅可以作为药物载体，而且在掺入BMP-2之后具有显著的成骨诱导性。
讨论
组织学和组织形态学发现证明：BMP-2掺入到本申请可以降解的仿生骨材料中不仅可以在非常低的药理水平(微克级)诱导异位骨形成，而且在整个5周的随访期间维持了该过程。
通过直接而非通过软骨机制铺设的骨组织是研究的意外发现。在使用这种异位骨化大鼠模型的其他研究中，BMP-2诱导了软骨内骨化级联，持续时间不超过12-14天，在此之后，骨吸收开始并在第三周完成。已知直接骨化仅在没有剪切应力的情况下在机械稳定的区域内发生，而在我们的研究中，这种环境显然是由仿生骨材料和BMP-2的组合物提供的。在现有技术中，BMP-2与小颗粒或胶原蛋白或玻璃基质结合，在大鼠皮肤运动过程中，它们会发生摩擦接触。
在研究中还发现，骨组织在5周后没有开始再吸收，大约40％的材料未降解，这个比例与未释放的BMP-2相近。这意味着成骨活动可能会在实验终止后持续数周。BMP-2释放和成骨活性的维持是骨诱导的目的，并且这种性质对于植入物的最佳骨整合非常重要。
BMP-2的骨诱导功效也已在其他系统中进行了测试。然而，其引起成骨反应所需的BMP-2浓度比本发明中使用的浓度高几个数量级。实际上，当BMP-2通过胶原海绵被递送到大鼠的异位部位时，需要更高浓度的药物来诱导成骨活性。
总之，BMP-2与磷酸八钙共沉淀产生的本申请仿生骨材料和BMP-2的组合物具有高度生物相容性和骨诱导性。此外，BMP-2不仅以足以诱导骨生成的水平释放，而且还是逐渐地以细胞介导的方式释放，使得成骨活性持续相当长的一段时间。
二、本申请的钛钉植入物在大鼠体内的骨传导性研究
实验材料和方法
使用大鼠原位模型。如图8所示，将长约5.0mm的钛钉植入物插入到成年雄性大鼠(重185-250g)胫骨干骨后端的松质骨内。
将大鼠分成三组，分别是未涂覆的钛钉组、本申请的钛钉植入物(实施例6)组和本申请掺入BSA的钛钉植入物(实施例7)组，每组6只大鼠。
分别于第3天、第1周、第2周和第4周，测量了在致密骨处新生骨与植入物之间的接触百分比(BIC)，测量结果见图12。
在图12中，实心矩形框
Figure BDA0003073956200000241
表示未涂覆钛钉植入物组，无涂层、无BSA；虚心矩形框
Figure BDA0003073956200000242
表示本申请钛钉植入物(实施例6)组，钛钉植入物第二涂层为磷酸八钙(OCP)涂层，空心矩形框/>
Figure BDA0003073956200000243
表示本申请掺入BSA的钛钉植入物(实施例7)组，植入物的第二涂层为掺入BSA的磷酸八钙(OCP)涂层。从图12可以看出，所有组均显示有新骨形成并且存在不同程度的与植入物之间的接触。在第3天，骨细胞样细胞就已经广泛存在，但是新骨形成有限。
在未涂覆的钛钉组中，第3天至第2周的BIC数值逐渐增加，但是，第4周的BIC数值显著低于第2周的BIC数值。在本申请的钛钉植入物组和本申请掺入BSA的钛钉植入物组中，虽然第4周的BIC数值均显著高于第2周的BIC数值，但是本申请掺入BSA的钛钉植入物组中，第1周和第2周的BIC数值相差很小。在所有三组中，只有本发明的钛钉植入物组中，BIC数值呈现出时间依赖性递增，由此可以说明，本申请的仿生骨材料具有出色的骨传导性，能够代替临床现有的骨粉及自体骨。
三、本申请仿生骨材料(BioCaP)对骨肉瘤细胞的活性抑制作用
通过使仿生骨材料(BioCaP)和MG 63人骨肉瘤细胞(MG-63,ATCC CRL-1427,USA)直接接触的方式评估了BioCaP对骨肉瘤细胞的活性抑制作用。
取24孔细胞培养板，将0.5ml含有10％FBS的细胞生长培养基(alpha-MEM液体培养基，Gibco，Cat 22561-021)分别加入各孔，然后以5000细胞/cm2的密度，将MG 63骨肉瘤细胞接种到相应各孔的细胞生长培养基中，24小时后，分别按0、0.5、1、2和4毫克的量，一式三份，向相应的各孔中加入实施例3制备的灭菌的BioCaP，进行共培养。
共培养48小时后，加入阿尔玛蓝(AlamarBlue,Invitrogen公司，Cat DAL 1025)。4小时后，用微量板阅读器在530nm处测定荧光值，测定骨肉瘤细胞的生存力，并作图，其中横坐标表示BioCaP的用量，以mg/孔计，纵坐标表示MG 63骨肉瘤细胞的生存力变化。结果见图9。
在图9中，空白矩形框
Figure BDA0003073956200000251
表示对照，虚心矩形框/>
Figure BDA0003073956200000252
表示BioCaP。从图9可以看出，BioCaP能在2天内使MG 63骨肉瘤细胞的生存力显著降低，这表明本申请仿生骨材料(BioCaP)有抑制骨肉瘤细胞活性的作用。
四、mCur从mCurCaP中的体外释放动力学研究
在37℃，将实施例8所制备的mCurCaP颗粒分别分散在1mL pH7.4(模拟健康骨组织的pH环境)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)和1mL pH6.5(模拟骨肿瘤组织的pH环境)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，用Synergy HT分光光度计(Synergy HT,Bio-Tek Instruments,Inc.,Winooski,Vt.,USA)测量mCur的浓度，每周一次，一直到第6周。具体的测量时间点为第10天、第20天、第30天和第40天。在每个时间点，将溶液在5000相对离心场(RCF)下离心5分钟，然后取300μl上清液，并通过分光光度计在405nm波长处测量上清液的光密度，然后重新加入300μl新鲜PBS，以确保分散液的总体积不变。
计算每个时间点测量的mCur浓度(微克/毫升)占累积释放的总mCur浓度的百分比，并作图，其中横坐标表示时间，以天计；纵坐标表示mCur从mCurCaP中释放的百分比，以％计。
结果如图11所示，mCurCaP颗粒在pH 6.5和pH 7.4下实现了mCur的缓慢释放，并且在6周内(Mann-Whitney U,n＝3,p<0.05)，相对于在模拟正常组织的环境(pH 7.4，释放28.5±1.1％)，mCurCaP颗粒在模拟骨肿瘤组织的环境(pH 6.5，释放76.4±4.9％)中释放速率更快。
应当理解的是，本发明并不限于上述示例性实施方案和实施例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种制备药用组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
1)制备无定形磷酸钙芯
在搅拌下，在pH 5.0-6.6的无机酸水溶液中，使含钙无机盐、磷酸盐、氯化钠和三羟甲基氨基甲烷在37℃保持10-30小时之后，使pH逐渐升高至8.0-8.5，产生沉淀，得到颗粒状无定形磷酸钙芯；
2)干燥无定形磷酸钙芯
将步骤1)得到的颗粒状无定形磷酸钙芯分离并干燥，得到干燥的颗粒状无定形磷酸钙芯；
3)沉淀生成种子层
在搅拌下，向pH 5.0-6.6的无机酸水溶液中分别加入氯化钠、含钙无机盐、磷酸盐以及步骤2)得到的干燥的颗粒状无定形磷酸钙芯，并且在37℃保持10-30小时，使pH逐渐升高至8.0-8.5，使得能够促进磷酸八钙晶体生长的无定形磷酸钙种子层沉淀在所述颗粒状无定形磷酸钙芯表面上，得到具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯；
4)将具有磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯干燥并灭菌
将步骤3)得到的具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯分离、干燥，然后灭菌，得到干燥的具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯；
5)共沉淀形成掺入生物活性物质的磷酸八钙涂层
在搅拌下，向pH 5.0-6.6的无机酸水溶液中分别加入含钙无机盐、磷酸盐、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、步骤4)得到的干燥的具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯以及生物活性物质，并且在37℃保持10-30小时，使pH逐渐升高至8.0-8.5，使得所述生物活性物质与磷酸八钙晶体共沉淀至所述磷酸钙种子层上，并在所述磷酸钙种子层的表面生长形成掺入生物活性物质的磷酸八钙涂层，得到湿的颗粒状药用组合物；
6)干燥湿的药用组合物
将步骤5)得到的湿的颗粒状药用组合物分离并干燥，得到干燥的药用组合物，所述药用组合物为具有2μm-5.0mm的粒径的颗粒；
在步骤1)中，所用含钙无机盐的最终浓度为2.5-5.0克/升，所用磷酸盐的最终浓度为1.0-5.0克/升，所用氯化钠的最终浓度为20-100克/升，所用三羟甲基氨基甲烷的最终浓度为10-100克/升；
在步骤3)中，所用氯化钠的最终浓度为2.0-19.0克/升，所用含钙无机盐的最终浓度为0.2-0.9克/升，所用磷酸盐的最终浓度为0.2-1.0克/升，且以1升溶液2.0-10.0克的比例加入步骤2)得到的干燥的颗粒状无定形磷酸钙芯；
在步骤5)中，所用含钙无机盐的最终浓度为0.2-0.9克/升，所用磷酸盐的最终浓度为0.2-1.0克/升，所用氯化钠的最终浓度为2.0-19.0克/升，所用三羟甲基氨基甲烷的最终浓度为2.0-15.0克/升，以1升溶液2.0-10.0克的比例加入步骤4)得到的干燥的具有所述磷酸钙种子层的无定形磷酸钙芯，并以1升溶液5-20毫克的比例加入所述生物活性物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述无机酸为盐酸、硫酸或磷酸，所述含钙无机盐为氯化钙、硫酸钙、硝酸钙或它们的水合物，所述磷酸盐为磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或它们的水合物，且所述生物活性物质选自骨生长因子、促血管生成因子、生脂因子、抗生素药物、镇疼药物、抗癌药物及其组合。
3.根据权利要求1所述的方法制备的药用组合物，所述药用组合物包括颗粒状无定形磷酸钙芯、涂覆在所述无定形磷酸钙芯的表面的第一涂层和涂覆在所述第一涂层的表面的第二涂层，其中：
所述第一涂层为无定形磷酸钙种子层，该无定形磷酸钙种子层能够促进磷酸八钙晶体的生长；且
所述第二涂层为掺入生物活性物质的磷酸八钙涂层。
4.根据权利要求3所述的药用组合物，其中所述药用组合物还包括第三涂层，所述第三涂层涂覆在所述第二涂层的表面，并且含有与第二涂层不同的生物活性物质。
5.根据权利要求3所述的药用组合物，其中所述药用组合物由颗粒状无定形磷酸钙芯、涂覆在所述无定形磷酸钙芯的表面的第一涂层和涂覆在所述第一涂层的表面的第二涂层组成。
6.根据权利要求3所述的药用组合物，其中所述生物活性物质选自骨生长因子、促血管生成因子、生脂因子、抗生素药物、镇疼药物、抗癌药物及其组合。
7.根据权利要求6所述的药用组合物，其中所述骨生长因子选自骨形成蛋白、转化生长因子—β、类胰岛素生长因子、骨骼生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生性生长因子、造血生长因子、结缔组织生长因子及其组合。
8.根据权利要求7所述的药用组合物，其中所述骨生长因子为骨形成蛋白，且所述骨形成蛋白为骨形成蛋白—2。
9.根据权利要求6所述的药用组合物，其中所述抗癌药物选自PEG分子量为550的PEG化姜黄素、依托泊苷、拓扑替康、唑来膦酸、多柔比星及其组合。
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